DE69230144T2

DE69230144T2 - Röntgenkontrastmittel

Info

Publication number: DE69230144T2
Application number: DE69230144T
Authority: DE
Inventors: Stig Bengmark; Bengt Hersloef; Kare Larsson
Original assignee: Scotia LipidTeknik AB
Current assignee: Scotia Holdings PLC
Priority date: 1991-06-03
Filing date: 1992-06-03
Publication date: 2000-05-25
Anticipated expiration: 2012-06-04
Also published as: EP0588869A1; NO934383L; SE9101709D0; JPH06510276A; WO1992021384A1; US5550263A; SE9101709L; FI935386A0; FI935386A7; FI935386L; CA2103462A1; NO934383D0; AU1903392A; DK0588869T3; EP0588869B1; ES2140409T3; CA2103462C; AU652260B2; NO308126B1; DE69230144D1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Phospholipid-basierte Verbindung, welche einen Röntgenkontrast-gebenden Anteil umfasst, welche Verbindung in der Form von Liposomen in einer wässrigen Formulierung nach intravenöser Verabreichung zur Röntgenuntersuchung des reticuloendothelischen Systems (RES), insbesondere der Leber verwendet werden kann.

Hintergrund

In der Medizin besteht ein großer Bedarf für ein nichttoxisches Kontrastmittel für die Leber. In der Leber und auch in der Milz, die Teile des reticuloendothelischen Systems sind, gibt es sogenannte Kupffer-Zellen, deren übliche Aufgabe ist, das Blut frei von fremden Teilchen zu halten. Es ist eine wohlbekannte Tatsache, dass kolloidale Teilchen, wie Liposome, wenn sie in den Körper injiziert werden, in den Kupffer-Zellen konzentriert werden. In einer Anzahl von Krankheiten wie Krebs gibt es jedoch keine solchen Zellen in dem gestörten Gewebe. Durch Verwendung eines besonderen Kontrastmittels, welches nur durch das gesunde Gewebe aufgenommen werden wird, gibt es deshalb eine Möglichkeit, zwischen gestörtem und gesundem Gewebe zu unterscheiden.
Um Thorotrast zu ersetzen, welches im Jahre 1929 eingeführt und aufgrund der Entwicklung von histologischen Veränderungen verworfen wurde, wurden viele Versuche durchgeführt, um ein Kontrastmittel für die Leber zu finden, welches nichttoxisch ist. All diese Experimente haben gemein, dass die Resultate oft diagnostisch befriedigend aber trotzdem enttäuschend waren, da alle Bemühungen zur unvermeidlichen Toxizität führten. Eine Anzahl partikulärer Kontrastmittel ist entwickelt und untersucht worden, welche auf Polymerwerkstoffen oder auf Lipiden kombiniert mit einer kontrastgebenden Verbindungen basierten. Besagte Kontrastmittel waren von verschiedenem Typus wie jodierte Verbindungen zur Verwendung in Röntgendiagnostik, herkömmlicher und auch Computer-Tomographie (CT), magnetische Werkstoffe zur Verwendung in magnetischer Resonanzabbildung (MRI) und radioaktive Isotope.
Für toxikologische Gründe, d. h. zur Vermeidung des Strahlungsrisikos und auch der Einführung fremder Substanzen, wäre es von Vorteil, ein konventionelles Röntgenkontrastmittel des Typus einer jodierten Carbonsäure zu verwenden, die bekannt und höchstverträglich mit dem menschlichen Körper ist.
Da es nur ungefähr 1% Kupffer-Zellen in der Leber gibt, darf die kontrastgebende Komponente des Kontrastmittels nicht zu klein sein; es wurde geschlossen, dass üblicherweise die kontrastgebende Komponente nicht kleiner als ungefähr 25% (G/G) sein sollte, damit eine Aufnahme diagnostisch dedektierbar ist. Außerdem sollte die Größe der Teilchen innerhalb des Intervalls von 0,05-5 um sein, da größere Teilchen zu einem großen Teil in der Lunge gefangen werden und kleinere Teilchen nicht durch die Kupffer-Zellen aufgenommen werden.
Ein anderes Problem mit einem partikulären Kontrastmittel, welches für parenterale Verabreichung und insbesondere intravenöse Verabreichung verwendet werden soll, ist die Forderung nach Sterilisation. Wenn ein Kontrastmittel in einem großen Maßstab für eine medizinische Anwendung hergestellt werden soll, ist eines der wichtigsten Schritte im Herstellungsprozess die Sterilisation. Um kleine Viren und pathogenes Material zu entfernen, ist Hitzesterilisation immer noch das einzig verlässliche Verfahren. Die Teilchenstruktur vieler der früher bekannten partikulären Träger für Kontrastmittel wie Liposome und auf Stärke basierende Teilchen können im allgemeinen diese Behandlung nicht aushalten.

Stand der Technik

Partikuläre Kontrastmittel auf der Basis von Lipiden können in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden. Einerseits kann ein geeignetes Kontrastmittel in ein Trägerteilchen, z. B. ein Liposom, eingeschlossen werden, andererseits kann das Kontrastmittel an ein Lipid als solches gebunden werden, und anschließend durch Arzneimittelträger in Teilchen wie Liposomem oder Emulsionströpfchen gebildet werden. In diesem Zusammenhang bezieht sich Liposom auf ein sphärisches Teilchen umfassend zwei oder mehr Bilagen von hauptsächlich Phospholipiden, in deren Zwischenraum hydrophile Substanzen, z. B. Wasser, eingeschlossen werden können. Emulsion bezieht sich auf Lipidtropfen, die hauptsächlich aus Triglyceriden, die bevorzugt mit Phospholipiden stabilisiert wurden, in einer wässrigen kontinuierlichen Phase bestehen.
Verschiedene Verfahren wurden in der Herstellung von Lipidsystemen, die auf Emulsionen basieren, untersucht. Lipoidal® UF (Laboratoire Guerbert, Aulnay-sous-Bois, Frankreich) ist ein jodierter Ethylester von Fettsäuren, welcher emulgiert und als ein partikuläres System verwendet wurde.
EP-A1-294 534 bezieht sich auf eine Röntgenkontrastmittel-Emulsion für parenterale, insbesondere intravenöse Verabreichung, enthaltend jodierte Lipide wie Triglyceride oder Alkylester von Fettsäuren, die in einer wässrigen Phase emulgiert sind, zu der ein stabilitätserhöhendes Mittel und wahlweise ein Öl oder ein Fett gegeben wurde. Diese Emulsion basiert auf dem Intralipid®-Konzept; Lipidemulsionen, die klinisch als Nahrungsmittellösung für viele Jahre verwendet wurden. Die Emulsion besteht hauptsächlich aus Triglyceriden von Sojabohnenöl und Phospholipiden von Eiern, welche zu einer stabilen Emulsion mit einer sehr niedrigen Toxizität emulgiert wurden.
Es wurde jedoch bewiesen, dass jodierte Alkylverbindungen unter bestimmten Umständen als Alkylierungsmittel in vivo fungieren und auch makrophage Aktivierung hervorrufen. Dies ist nicht überraschend, da erwartet werden konnte, dass jodierende Acylketten in der Zellmembran zu Veränderungen führen sollten, die allgemeine Membranfunktionen wie Fluidität usw. beeinflussen, welche wiederum regulierende Funktionen besitzen. Es konnte deshalb geschlossen werden, dass jodierende Lipide Jod nicht in der Kohlenwasserstoffkette beinhalten sollten.
DE 29 35 195 bezieht sich auf ein Röntgenkontrastmittel für die Leber und Milz, welches aus einer Jod enthaltenden Röntgenkontrast-gebenden Verbindung des Typs 2,4,6-Trijodbenzoesäure-Derivat eingeschlossen in sphärischen Phospholipiden besteht, d. h. Liposome mit einer Multilagenstruktur.
US 4 192 859 bezieht sich auch auf Röntgenkontrastmittel, umfassend ein Röntgenkontrastmittel und ein Liposom als ein Träger dafür. Das Liposom umfasst Lecithin und ein Sterin, und es wird angenommen, dass es Löcher einschließt, die das Kontrastmittel darin beinhalten, d. h. das Kontrastmittel ist nicht chemisch an das Liposom gebunden.
WO 88/09165 bezieht sich auf eine injizierbare wässrige Zusammensetzung, die für opazifierende Organe zur Röntgenuntersuchung entwickelt wurde, welche mindestens eine jodierte organische Verbindung, die undurchlässig für Röntgenstrahlen ist, eingeschlossen in Liposomvesikel, umfasst. Es wird dargelegt, dass die Teilchengröße der Liposomvesikeln 0,15-3 um und das Verhältnis von eingeschlossenem Jod zu Lipiden in den Liposomvesikeln 1,5-6 g/g sein sollte.
Ein allgemeiner Nachteil mit den oben zitierten Referenzen betreffend Liposome als Träger für Kontrastmittel ist, dass die Substanzen, die in die Bilagenmembranen eingeschlossen sind, in Gewebeflüssigkeiten aus treten. Dieses Bilagenmembran-Austreten verhindert auch, dass die Liposomträger hitzesterilisierbar sind. Folglich gibt es einen Bedarf für kontrastgebende Komponenten, die mit dem Trägerteilchen, z. B. einem Liposom, in dem Körper assoziiert bleiben.
Eine andere Schwierigkeit mit den oben zitierten Liposomsystemen ist, dass die Techniken zur Herstellung der endgültigen Dispersion oft kompliziert sind und Stabilitätsprobleme mit sich bringen.

Offenbarung der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist, ein nichttoxisches Röntgenkontrastmittel für das reticuloendothelische System zur Verfügung zu stellen, welches nach intravenöser Verabreichung eine zufriedenstellende Sichtbarmachung der Leber ergibt, und außerdem genügend stabil ist, um es einfach herzustellen und zu sterilisieren.

Die Phospholipid-basierte Verbindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Phospholipid-basierte Verbindung, genauer ein Phospholipid, an die eine Röntgenkontrast-gebende Komponente kovalent gebunden wurde.
Die Phospholipid-basierte Verbindung der Erfindung kann durch die folgende Formel dargestellt werden:
worin R' der Lipidteil des Phospholipids und R" eine jodierte Röntgenkontrast-gebende Komponente ist, die kovalent an eine endständige Amino- oder Hydroxygruppe des Phospholipids gebunden ist, mit der Fähigkeit, Liposome durch spontanes Quellen in Wasser ohne Zusatz irgendeiner anderen Substanz zu bilden.
Die Phospholipide gemäß der Erfindung sind aus polaren und nichtpolaren Gruppen an einem Grundgerüst-Molekül, üblicherweise Glycerin, zusammengesetzt. Es können auch andere Grundgerüst-Moleküle verwendet werden, z. B. die natürlichen Sphingosinbasen und Sterine. Ähnliche Strukturen können auch aus natürlichen oder synthetischen Alkoholen und Aminen synthetisiert werden. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung sollten die Phospholipide natürlichen Ursprungs sein, bevorzugt Membranphospholipide.
Glycerophospholipide, d. h. Phospholipide mit einem Glycerolgrundgerüst, können durch die Formel II dargestellt werden
worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig R&sub4; oder OCR&sub4; darstellen, worin R&sub4; eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradkettige Alkyl- oder Alkylengruppe mit 7 bis 23 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 11 bis 19 Kohlenstoffatomen, darstellt; und R&sub3; eine Amid- oder Esterbindungsgruppe darstellt.
R&sub1; und R&sub2; sind üblicherweise Fettsäurereste von variabler Länge. Als bevorzugte Beispiele von Fettsäuren können natürlich vorkommende Fettsäuren wie die gesättigten Fettsäuren Palmitin(C&sub1;&sub5;H&sub3;&sub1;CO)- und Sterin(C&sub1;&sub7;H&sub3;&sub5;CO)- säure; die mono-ungesättigte Säure Oleinsäure (C&sub1;&sub7;H&sub3;&sub3;CO) und die polyungesättigten Säuren Linoleinsäure (C&sub1;&sub7;H&sub3;&sub1;CO) und Linolensäure (C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub9;CO) genannt werden.
Wenn ein Phospholipid natürlichen Ursprungs gewählt wird, werden Acylketten hinsichtlich der Länge und Zahl von Doppelbindungen im Gegensatz zu Phospholipiden synthetischen Ursprungs variieren, in welchem Fall es möglich ist, die Phospholipide mit bestimmten Acylketten herzustellen. Als ein Beispiel davon kann erwähnt werden, dass z. B. Phosphatidylethanolamin (PE) aus Sojabohnen bzw. Eiern das Fettsäuremuster gemäß Tabelle I haben, wohingegen ein synthesisches PE aus bis zu 100% C 16 : 0 bestehen kann. Tabelle 1
R&sub3; in der Formel II kann dargestellt werden durch C&sub1;-C&sub5; Alkylen, welches substituiert oder nicht substituiert sein kann, mit einer endständigen NH&sub2;- oder OH-Gruppe, bevorzugt eine C&sub1;-C&sub2;- Alkylenaminogruppe, wahlweise substituiert durch eine Hydroxymethyl- oder Carboxyethylgruppe. Als Beispiele können die Ethanolamin- oder Serinreste erwähnt werden, welche beide endständige NH&sub2;-Gruppen haben, die zur Kupplung des kontrastgebenden Substituenten geeignet sind. Beide besagte Reste sind wichtige Bestandteile von Zellmembranen in Säugern. Beispiele anderer Gruppen sind Reste von anderen Aminosäuren; z. B. Tyrosin und Threonin mit endständigen OH-Gruppen in der Struktur, wie Serin, welche mit der Phosphatgrupe assoziiert werden können. Für den Fachmann wird es einfach sein, diese Art von Gruppen in Übereinstimmung mit der Erfindung zu verändern.
Sphingophospholipide wie Sphingomyelin-Analoge können zwei Aminogruppen enthalten und zwei verschiedene Amide bilden. Sphingophospholipide können auf verschiedenen Basen basieren, wie Sphingosin, Sphingenin, Sphinganin und Hydroxysphinganin.
Eine bevorzugte Art von Phospholipiden wird aus natürlichen Lipiden wie Membranphospholipiden erhalten. Als Beispiele von Glycerophospholipiden können Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin und auch Phosphatidylinositol und Phosphatidylglycerin genannt werden. Die natürlich vorkommenden Verbindungen dieser Art haben üblicherweise Fettsäurereste im nichtpolaren Teil des Moleküls und sind in der Literatur beschrieben (Schmid et al. Progress in Lipid Research 29, 1990, 1). Natürliches N-Acylphosphatidylethanolamin kann z. B. in Mikroorganismen, Pflanzen (insbesondere Getreide), Fisch und Säugern, und also auch in Nahrungsmitteln gefunden werden.
Die kontrastgebende Komponente der Phospholipid-basierten Verbindung gemäß der Erfindung wird von einer üblichen jodierten Röntgenkontrastgebenden Verbindung abgeleitet, d. h. eine jodierte Carbonsäure, bevorzugt umfassend eine Trijodphenylgruppe, wie eine trijodierte Benzoesäure oder Trijodphenylpropionsäure. Weitere jodierte kontrastgebende Komponenten können z. B. in Hoey et al. Handb. Exp. Pharmacol, vol 73 (Radiocontrast Agents), 1984, S. 23-125, gefunden werden.
Die neuen Verbindungen der Erfindung der Formel I können durch Verfahren, die im Stand der Technik für die chemische Kupplung einer Säure an eine Amino- oder Hydroxy-terminierte Verbindung bekannt sind, hergestellt werden. Amidisierung von Phosphatidylethanolamin wird z. B. von Dawson et al. Biochem. J. 114, 1969, 265, beschrieben.
Die Phospholipid-Verbindungen der Formel I quellen in Wasser, eine Eigenschaft, die für die Fähigkeit, Liposome spontan zu bilden, notwendig ist. Damit ein Phospholipid ein Liposom in einem Überschuss von Wasser bilden kann, ist es notwendig, dass eine lamellare flüssigkristalline Phase gebildet wird, wie mit Phosphatidylcholin (PC). Phosphatidylethanolamin (PE) bevorzugt andererseits üblicherweise die umgekehrte hexagonale Phase.
Die Verbindungen der Formel III
worin R&sub4; und R&sub4;, wie oben definiert sind, und X und Y Wasserstoff oder Substituentengruppen sind, bilden eine bevorzugte Art von Phospholipid-basierten Verbindungen der Erfindung.
Auch andere Verbindungen zwischen dem Phospholipid und dem kontrastgebenden Teil des Moleküls können in einer einfachen Weise durch den Fachmann hergestellt werden, um Kombinationen herzustellen, welche, wenn sie im Körper aufgespalten werden, vorher bekannte Verbindungen ergeben, bevorzugt von natürlichem Ursprung. Solch ein Beispiel ist Acylornithin und andere Ornithinlipide.

Die Phospholipid-basierten Liposome

Diese Erfindung betrifft auch Phospholipid-basierte Liposome, d. h. multilamellare Vesikel, umfassend eine Phospholipid-basierte Verbindung der Formel I oben, d. h. ein Phospholipid, an das eine Röntgenkontrast-gebende Komponente kovalent gebunden wurde.
Die Liposome sind üblicherweise in der Größe von 0,05-10 um, bevorzugt 0,1-1 um.
Die Bildung der Liposome der Verbindung gemäß der Erfindung wird durch die Verbindung, die spontan in Wasser quillt und eine lamellare flüssigkristalline Phase mit einem maximalen Wassergehalt von ungefähr 35 Gew.-% bildet, erleichtert. Abhängig von der verwendeten Verbindung und anderen Bedingungen kann eine spontane Bildung von Liposomen erhalten werden, wenn Wasser zu dieser lamellaren Phase gegeben wird. Wenn nicht, kann die Bildung von Liposomen durch mechanische Dispersion der lamellaren flüssigkristallinen Phase in Wasserüberschuss erreicht werden, wobei die Lipid-Bilagen geschlossene sphärische Aggregate, d. h. Liposome, bilden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Dispersion ist Rühren, z. B. durch einen Ultraturrax, aber Schütteln, Vortexieren und Walzen können auch ausgeführt werden. Wenn Liposome mit einer kleineren Größe erzielt werden sollen, könnte die Dispersion bevorzugt mit Ultraschall behandelt werden.
Es sollte beachtet werden, dass die Herstellung der Liposome gemäß der Erfindung keine Behandlung mit organischen Lösungsmitteln wie Chloroform oder Dichloromethan benötigt, welche in üblichen Verfahren verwendet werden.
Die Liposombildung kann bei Raumtemperatur oder irgendeiner anderen Temperatur über 0ºC ausgeführt werden, wenn die Phasenübergangstemperatur der Acylketten (Kettenschmelzen; Gel-zu-Flüssigkristallen) unter dem Gefrierpunkt des Wassers liegt, was der Fall für natürliche Phospholipide ist.
Um eine homogenere Größenverteilung der Liposome zu erhalten, kann die Liposomdispersion durch ein Membranfilter extrudiert werden.
Gemäß der Erfindung können Liposome durch direktes Quellen der Phospholipid-basierten Verbindung in einem wässrigen Medium ohne Zugabe irgendwelcher anderer Substanzen wie Stabilisatoren usw., welche üblicherweise benötigt werden, hergestellt werden.
Eine bevorzugte Phospholipid-basierte Verbindung der Formel I, worin R' der Lipidteil eines Phosphatidylethanolamins und R" ein Derivat der Trijodbenzoyl-Gruppe ist, kann überraschenderweise spontan Liposome in einem wässrigen Medium bilden. Dies spiegelt die ausgeglichene Eigenschaft des Jod enthaltenden Lipids mit Bezug auf Hydrophilie-Lipophilie wider. Es könnte angemerkt werden, dass "normale" Bilagen-bildende Lipide, wie z. B. Phosphatidylcholin, mechanische Energie benötigen, um in Liposome zu dispergieren.
Ein bevorzugtes wässriges Medium ist ein isotonisches Medium, z. B. 2,6% (G/G) Glycerol in Wasser, 5% (G/G) Glucose oder 10% (G/G) Sucrose. Salzlösung, Phosphat-gepufferte Salzlösung oder irgendeine andere Elektrolytlösung sollte als Dispersionsmedium vermieden werden, da diese zur Bildung von umgekehrten hexagonalen Flüssigkristallen führen.

Röntgenkontrastmittel

Die Phospholipid-basierten Liposome der Erfindung können als ein Röntgenkontrastmittel verwendet werden. Eine Liposomdispersion einer Konzentration von 0,25-20% (G/G) ist nicht toxisch und ist genügend stabil bezüglich Hitzesterilisation. Liposome mit einem Jodgehalt von ungefähr 32 ö können hergestellt werden, welches diese zur Röntgendiagnostik geeignet macht. Durch intravenöse Injektion in Kaninchen, gefolgt von Röntgen-Computertomographie der Leber, wurde ein guter Kontrasteffekt erhalten.
Eine geeignete Konzentration der Liposomdispersion ist 10-20%. Eine übliche Dosis von Jod in einer Leberuntersuchung ist ungefähr 5-15 g/Subjekt, die gesamte zu verabreichende Dosis wird 80-470 ml sein.
Wenn das Röntgenkontrastmittel gemäß der Erfindung in vivo metabolisiert ist, wird eine wasserlösliche jodierte Substanz durch enzymatische Reaktion gebildet. Diese Verbindung ist vom gleichen Typ wie die Röntgenkontrastmittel, die heute, vom Typ Trijodbenzoyl-Derivate, verwendet werden. Es ist ein wichtiger Aspekt der Erfindung, dass die Phospholipidbasierten Liposome auf solch eine Weise konstruiert werden, dass, wenn sie im Körper aufgespalten werden, vorher bekannte Substanzen, bevorzugt natürlichen Ursprungs, gebildet werden. Im allgemeinen werden sie durch Phospholipasen zersetzt, wobei Phospholipase D insbesondere die N-Acylethanolamin- Verbindung aus der Phosphatgruppe freisetzt. Das freigesetzte N-Acylethanolamin wird durch Amidasen metabolisiert, welche häufig z. B. in der Leber von Säugern vorkommen.

Beschreibung der Zeichnung

Die Figur zeigt ein Mikrophoto-Muster in polarisiertem Licht von 5% (G/G) Jod enthaltenden Phosphatidylethanolamin-Liposomen gemäß Beispiel 5 in einer Vergrößerung von x100. Die sphärischen Muster mit den Malteserkreuzen sind charakteristische Merkmale für Liposome.

Beispiele

Diese Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden. Beispiel 1 bezieht sich auf die Synthese einer Phospholipid-basierten Verbindung der Erfindung, Beispiele 2 bis 3 auf die Herstellung von Liposomen besagter Verbindung und Beispiele 4 bis 6 auf die physikochemische Charakterisierung besagter Liposome.
Die Dispersionen von Liposomen wurden hitzesterilisiert und wie folgt charakterisiert:
Hitzesterilisierung: 2-5 ml der Dispersion wurden in eine Glasphiole übergeführt, welche mit einem Gummistopfen und einem Aluminiumdeckel verschlossen wurde. Die Dispersion wurde dann bei 121ºC für 20 Min hitzesterilisiert.
Visuelle Erscheinung: Nach der Hitzesterilisation wurden die Liposomdispersionen visuell hinsichtlich Aggregation, Sedimentation und Farbe charakterisiert.
Photomikrographie: Es wurde ein Olympus CH-2 Polarisations-Mikroskop verwendet, welches an einem automatischen Belichtungs-photomikro graphischen System mit einer Großformat-Polaroid-Kamera-Rückseite befestigt wurde. Eine kleine Menge der Liposomdispersion wurde auf einen Glasobjektträger transferiert und mit einer Objektträger-Abdeckplatte bedeckt. Das Aussehen der Probe wurde dann zwischen gekreuzten Polarisatoren untersucht.
Trübungsmessung: Die Trübung, d. h. die Extinktion, nach und vor der Hitzesterilisation wurde bei 600 nm mit einem Hitachi U-1100 Spektrophotometer bei Umgebungstemperatur aufgezeichnet. Es wurden 1-cm-Küvetten verwendet und keine Rührung der Dispersion durchgeführt.
Partikelgrößenmessungen: Die durchschnittlichen Partikelgrößen der Liposomen vor und nach der Hitzesterilisation wurden durch dynamische Lichtstreuungsmessungen unter Verwendung eines Zetasizer 4 (Malvern Instruments, England), ausgerüstet mit einer A2 110-Zelle, bestimmt. Der Streuwinkel war 90º und die Temperatur war 25ºC. Die Daten sind als kumulante z-Durchschnittswerte ausgedrückt, Beispiel 1 N-(2,3,5-Trijodbenzoyl)-phosphatidylethanolamin
worin R&sub1; und R&sub2; 80% C&sub1;&sub7;H&sub3;&sub1; und 20% C&sub1;&sub5;H&sub3;&sub1; sind.
Synthese: 2,5 g 2,3,5-Trijodbenzoesäure wird mit 5 ml Thionylchlorid für 45 min unter Rückfluss erhitzt. Der Überschuss Thionylchlorid wird destilliert und der Rückstand in CCl&sub4; umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 2,3 g mit einem Schmelzpunkt von 90-91ºC.
0,5 g PE, Phosphatidylethanolamin aus Sojabohnen (Karlshamns Lipidteknik AB) wurden in 200 ml Chloroform gelöst, dann wurden 20 ml Triethylamin zugegeben und 0,8 g destilliertes 2,3,5-Trijodbenzoylchlorid zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 24 h bei Umgebungstemperatur gerührt und die Reaktion wurde mit Dünnschicht-Chromatographie bis zur Vollendung verfolgt. Die Reaktionsmischung wurde vorsichtig mit einer gesättigten Lösung von Natriumbicarbonat gewaschen, Die Chloroform-Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Das resultierende Produkt wurde in Hexan umkristallisiert. Die Ausbeute des Endprodukts war 75% mit einer Reinheit größer als 99,5% (bestimmt mit HPLC). Die Struktur der Endverbindung wurde bestätigt mit ¹³C-NMR (CHCl&sub3;, TMS, 101 MHz); 173.33 und 172.93 (C = O Ester), 168,29 (C = O Amid); 151,12 (C&sub1; in aromatischem Ring), 147,3 (C&sub5; in aromatischem Ring), 135,40 (C&sub6; in aromatischem Ring), 130,27/130,04/128,17/127,98 (ungesättigt in aliphatischer Kette), 112,10 (C&sub4; in aromatischem Ring); 106,55 (C&sub3; in aromatischem Ring); 93, 93 (C&sub2; in aromatischem Ring); 70,53 (CHO Glycerin); 64,02 (CH&sub2;OP Glycerin); 62,68 (CH&sub2;O Glycerin); 45,86 (POCH&sub2;); 41,7 (CH&sub2; N); 34,34-14,01 (aliphatische Kette).

Beispiel 2

150 g der Verbindung von Beispiel 1 wurden mit 850 g 2,6% (G/G) Glycerin in destilliertem Wasser gemischt. Die Mischung wurde 2 Std. ohne Rühren equilibriert, um das Lipid zu quellen. Das gequollene Lipid wurde dann bis zur Homogenität gerührt und durch fünfminutiges Erhitzen bei 95ºC sterilisiert, gefolgt von aseptischem Verpacken in Glasampullen.

Beispiel 3

100 g der Verbindung von Beispiel 1 wurden mit 900 g destilliertem Wasser gemischt, zu welchem 2,6% (G/G) Glycerol gegeben wurden, um eine isotonische Lösung zu erhalten. Das Lipid wurde in der wässrigen Phase 2 Stunden quellen gelassen. Die Mischung wurde durch Ultraschall homogenisiert. 5 ml der resultierenden Dispersion wurden in Glasampullen verschlossen und in kochendem Wasser für fünf Minuten hitzesterilisiert.

Beispiel 4

70 mg der Verbindung von Beispiel 1 wurden mit 6,9 g Membran-gefiltertem Wasser gemischt. Die Mischung wurde 2 Std. während langsamer Bewegung quellen gelassen, was eine homogene Dispersion ergab.
Ein Teil der Dispersion wurde durch ein 0,45-um-Membranfilter (A) gefiltert. Ein anderer Teil der Dispersion wurde durch ein 0,45-um-Membranfilter gefiltert, gefolgt von Hitzesterilisation (B). Der letzte Teil wurde nicht behandelt (C).
Die Trübung wurde dann gemessen und die folgenden Resultate wurden erhalten:
Probe Trübung/Extinktionseinheiten
A 0,657
B 0,652
C 0,780
Die Küvettenzellen wurden bei Umgebungstemperatur einen Monat stehen gelassen. Keine nennenswerte Sedimentierung konnte bei visueller Untersuchung beobachtet werden.

Beispiel 5

3,03 g der Verbindung von Beispiel 1 wurden mit 11,79 g Membrangefiltertem Wasser und 0,38 g 99,5-%igem Glycerin gemischt. Die Mischung wurde über Nacht unter langsamer Bewegung quellen gelassen. Ein Teil der resultierenden homogenen Dispersion wurde mit 2,50% (G/G) Glycerin in Wasser verdünnt, was eine Endlipidkonzentration von 5,00% (G/G) ergab.

Beispiel 6

Die Dispersion von Beispiel 5 wurde mit 2,6% (G/G) Glycerin in Wasser verdünnt, was eine Konzentration von 0,25% (G/G) ergab, und wurde durch ein 0,45-um-Polycarbonat-Membranfilter gefiltert, um Staubteilchen zu entfernen. Ein Teil der Dispersion wurde hitzesterilisiert (A), während ein anderer Teil nicht behandelt wurde (B). Die Größenverteilungen der Proben wurden dann gemessen.
Probe durchschnittliche Teilchengröße, nm
A 184
B 199
Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Liposome gemäß der Erfindung mehr oder weniger unbeeinflusst durch die Hitzesterilisation waren, d. h. die Liposomstruktur wurde ohne Aggregation und nachfolgender Sedimentation beibehalten. Im allgemeinen wurde die Größe der Teilchen etwas reduziert nach der Hitzebehandlung. Weiterhin wurde die Fraktion der Teilchen größer als 1000 nm von ca. 5% der Gesamtteilchen auf weniger als 0,1% nach Hitzesterilisation reduziert.

Biologischer Test

Um die Wirksamkeit der neuen jodenthaltenden Phospholipid-basierten Liposome als ein Leber-spezifisches Kontrastmittel bei Röntgen-Computertomographie zu bewerten, wurden Studien in Kaninchen durchgeführt. Scans wurden unmittelbar vor und 30 Min. nach der intravenösen Injektion der Dispersion (enthaltend 50 mg Jod pro ml Lösung) erhalten. Die Konzentration in dem Kaninchen war ungefähr 50 ml Jod pro kg Körpergewicht. Die Injektionsrate war 20 ml pro Minute. Der durchschnittliche Anstieg der Abschwächung war 34,5 Hounsfield-Einheiten (HU), was 3 Mal größer ist als durch Ivancek gefunden wurde, wenn Intraiodole in ungefähr der gleichen Konzentration verwendet wurde, und auf dem gleichen Niveau mit dem ist, was mit Intraiodole enthaltend 300 Gew.-% mehr Jod erreicht wurde (Acta Radiologica 30, 1989, 409). Tabelle 2 Abschwächung im Kaninchen, in HU
Standardabweichung
Die obigen Daten zeigen, dass es einen Anstieg der Abschwächung um 34,5 HU 30 Minuten nach der Verabreichung gibt, was ein zufriedenstellender Anstieg, um Lebertumore zu beurteilen, ist.

Claims

1. Phospholipid-basierte Verbindung der Formel I:

worin R' der Lipid-Teil eines Phospholipids und R" ein jodierter, einen Röntgenstrahlkontrast ergebender Rest sind, der kovalent an eine endständige Amino- oder Hydroxygruppe des Phospholipids gebunden ist, wobei die Verbindung die Befähigung aufweist, durch spontane Quellung in Wasser, ohne Zugabe einer weiteren Substanz, Liposome zu bilden.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid ein Glycerophospholipd, wie Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylserin, ist.

3. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der einen Röntgenstrahlkontrast ergebende Rest eine trijodierte Carbonsäure, wie trijodierte Benzoe- oder Trijodphenylpropionsäure, ist.

4. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie N-(2,3,5-Trijodbenzoyl)phosphatidylethanolamin ist.

5. Röntgenstrahlkontrastmittel zur Sichtbarmachung des Retikuloendothelialsystems, wobei das Mittel eine Dispersion aus Liposomen mit einer Größe von 0,05 bis 10 um in einem wässrigen Medium ist, deren Liposome durch spontane Quellung in Wasser einer Phospholipid-basierten Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 gebildet werden.

6. Kontrastmittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das wässrige Medium eine isotonische wässrige Lösung ist.

7. Kontrastmittel gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die isotonische Lösung eine Nicht-Elektrolyt-Lösung ist.

8. Kontrastmittel gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposome eine Größe von 0,1 bis 1 um aufweisen.

9. Verwendung einer Phospholipid-basierten Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Mittels gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Sichtbarmachung der Leber zur Bewertung von Lebergeschwüren.