DE69229103T2

DE69229103T2 - Verfahren zur herstellung und verwendung von 1alpha,24-dihydroxy vitamin-d2

Info

Publication number: DE69229103T2
Application number: DE69229103T
Authority: DE
Inventors: Charles Bishop; Glenville Jones; Joyce Knutson; Robert Moriarty; Raju Penmasta; Stephen Strugnell
Original assignee: Bone Care International Inc
Current assignee: Bone Care International Inc
Priority date: 1991-01-08
Filing date: 1992-01-07
Publication date: 1999-10-14
Anticipated expiration: 2012-01-08
Also published as: CN1071574C; CN1078072C; PT99998B; DK0550702T3; AU1247592A; ATE240736T1; EP0550702B1; PT99998A; WO1992012165A1; CN1032256C; EP0550702A1; DE69229103D1; ES2200238T3; EP0914825A2; DE69233074D1; US6211168B1; MX9200070A; EP0914825B1; CN1133712A; CN1067243A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft biologisch aktive Vitamin D&sub2;-Verbindungen. Genauer gesagt betrifft sie den hormonell aktiven, natürlichen Metaboliten 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; und Verfahren zur Herstellung dieses Metaboliten. Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine pharmazeutisch wirksame Menge an 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; enthält, und ein Verfahren zur Regulierung von abnormalem Calciumstoffwechsel durch Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge der Verbindung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es ist bekannt, daß Vitamin D und seine aktiven Metaboliten wichtige Regulatoren des Calciumstoffwechsels von Tieren und Menschen sind. Die natürlich vorkommende Form von Vitamin D bei Tieren und Menschen ist Vitamin D&sub3;. Es wurde gezeigt, daß bei Tieren und Menschen Vitamin D&sub3; aktiviert wird, indem es in der Leber an der C&sub2;&sub5;- Position hydroxyliert wird, gefolgt von 1α-Hydroxylierung in der Niere, um das Hormon 1α,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; zu produzieren [1,25-(OH)&sub2;D³"]; siehe US-A-3.880.894. Der wesentliche physiologische Weg für den Katabolismus der Vitamin D&sub3;-Metaboliten, 25-Hydroxyvitamin D&sub3; und 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;, wird durch C&sub2;&sub4;-Oxidation eingeleitet. Holick, M. F., Kleiner-Bossallier, A., Schnoes, H. K., Kasten, P. M., Boyle, I.T., und DeLuca, H. F., J. Biol. Chem. 248, 6691-6696 (1973).
Vitamin D&sub2; ist die wesentliche natürlich vorkommende Form von Vitamin D bei Pflanzen. Vitamin D&sub2; unterscheidet sich insofern strukturell von Vitamin D&sub3;, als Vitamin D&sub2; eine Methylgruppe an C&sub2;&sub4; und eine Doppelbindung zwischen C&sub2;&sub2; und C&sub2;&sub3; besitzt.
Kurz nach ihrer Entdeckung schien es offensichtlich, daß Vitamin D&sub3; und Vitamin D&sub2; eine ähnliche, wenn nicht sogar äquivalente biologische Aktivität aufwiesen. Man ging auch davon aus, daß der Metabolismus (d. h. Aktivierung und Katabolismus) von Vita min D&sub2; mit jenem von Vitamin D&sub3; identisch ist. Siehe Harrison's Principles of Internal Medicine: Part Seven, "Disorders of Bone and Mineral Metabolism: Chap. 35," bei E. Braunwald, K.]. Isselbacher, R. G. Petersdorf, J. D. Wilsdon, J.B. Martin und H. S. Fauci (Hrsg.), Calcium, Phosphorus and Bone Metabolism: Calcium Regulating Hormones, McGraw-Hill, New York, S. 1860-1865. Man nimmt an, daß die aktive Form von Vitamin D&sub2; 1α,25-Dihydroxyvitamin D&sub2; ["1,25-(OH)&sub2;D&sub2;"] ist. Außerdem sind 24-Hydroxy- Derivate von 25-Hydroxyvitamin D&sub2; und 1,25-(OH)&sub2;D&sub2;, d. h. 24,25-Dihydroxyvitamin D&sub2; und 1α,24,25-Trihydroxyvitamin D&sub2;, bekannt, was nahelegt, daß der Katabolismus von Vitamin D&sub2; wie Vitamin D&sub3; den gleichen C&sub2;&sub4;-Oxidationsschritt durchläuft. Jones, G., Rosenthal, D., Segev, D., Mazur, Y., Frolow, F., Halfon, Y., Robinavich, D. und Shakked, Z., Biochemistry 18, 1094-1101 (1979).
Es stellte sich jedoch kürzlich heraus, daß ein aktives Analog von Vitamin D&sub2;, 1α-Hydroxyvitamin D&sub2; ["1α-(OH)D&sub2;"] pharmakologische Eigenschaften aufweist, die sich von jenen seines Vitamin D&sub3;-Gegenstücks, 1α-Hydroxyvitamin D&sub3; ["1α-(OH)D&sub3;"] deutlich unterscheiden. US-A-07/569.412 offenbart, daß 1α-(OH)D&sub2; den Verlust von Knochenmasse bei menschlichen Osteoporose-Patienten umkehrt, wenn es in Dosierungen von 2,0 ug/Tag oder mehr verabreicht wird. Aufgrund von Toxizität werden Dosierungsmengen von 2,0 ug/Tag oder mehr mit 1α-(OH)D&sub3; nicht zuverlässig erreicht.
Solche auffälligen pharmakologischen Eigenschaften lassen sich durch die Entdeckung der Anmelder erklären, daß pharmakologische Dosierungen von an Menschen verabreichtem 1α-(OH)D&sub2; teilweise zu biologisch aktivem 1α-24-Dihydroxyvitamin D&sub2; ["1α,24-(OH)&sub2;D&sub2;"] umgesetzt werden. Wie ausführlicher weiter unten erklärt, stellt die Hydroxylierung an der 24-Kohlenstoff-Position des 1-hydroxylierten Vitamin D&sub2;-Moleküls einen für das Vitamin D&sub2;-Molekül typischen Aktivierungsweg dar.
Obwohl 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub3; ["1α,24-(OH)&sub2;D&sub3;"] chemisch synthetisiert wurde (US-A-4.022.891), wurde es bislang noch nicht als natürliche Verbindung in biologischen Systemen gefunden. Außerdem erkannten die Anmelder, daß 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; deutlich andere biologische Aktivität aufweist als 1α,24-(OH)&sub2;D&sub3;. Beispielsweise stellten Ishizuka et al. fest, daß 1α,24-(OH)&sub2;D&sub3; die 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;-Rezeptorstelle fester bindet als 1,5-(OH)&sub2;D&sub3; selbst. Ishizuka, S., Bannai, K., Naruchi, T. und Hashimoto, Y., Steroids 27, 1, 33-42 (1981); Ishizuka, S., Bannai, K., Naruchi, T. und Hashimoto, Y., Steroids 39, 1, 53-62 (1982). Horst, R. L., Koszewski, N. J. und Reinhardt, T. A. schlugen vor, daß 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; zur Behandlung von mit Calcium in Zusammenhang stehenden Krankheiten verwendet werden kann. Biochemistry 29(2), 578-82 (1990). Unter Anwendung eines ähnlichen Assays entdeckten die Anmelder, daß das 1α,24(OH)&sub2;D&sub2; bei der Bindung der 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;-Rezeptorstelle zweimal weniger kompetitiv ist als 1,25- (OH)&sub2;D&sub3;. Die Anmelder entdeckten, daß 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; eine relativ schlechte Bindeaffinität für das Vitamin D-Serumbindeprotein von Blut zeigt - ein Beweis für die eher kurze Halbwertszeit, die ein Anzeichen niedriger Toxizität ist.
Die Anmelder zeigten die Gegenwart von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; im Kreislauf von Menschen, an die 1α-(OH)D&sub2; verabreicht wurde. Dies zeigt, daß bei Tieren und Menschen Vitamin D&sub2; sowohl zu 1,25-(OH)&sub2;D&sub2; als auch 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; natürlich umgesetzt wird. Die relativen Verhältnisse der zwei Vitamin D&sub2;-Hormone scheinen je nach Vorläufer und der Menge an Vorläufer zu variieren, die dem C&sub2;&sub4;-Weg angeboten wird. Es scheint, daß mit zunehmenden Dosen von 1α-(OH)D&sub2; das Verhältnis zwischen 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; und 1,25-(OH)&sub2;D&sub2; zunimmt.
Diese Ergebnisse, die weiter unten ausführlich erläutert werden, zeigen, daß 1α,24- (OH)&sub2;D&sub2; die gewünschte Eigenschaft hoher biologischer Aktivität bei niedriger Toxizität aufweist. Die Tatsache, daß 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; ein signifikanter Metabolit ist, wenn pharmakologische Mengen an 1α-(OH)D&sub2; verabreicht werden, veranschaulicht, daß 1α,24- (OH)&sub2;D&sub2; die gewünschten pharmakologischen Effekte von 1α-(OH)D&sub2; vermitteln kann und zur Behandlung verschiedener Störungen des Calciumstoffwechsels ein nützliches Therapeutikum ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bietet 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2;, das eine bioaktive Form von Vitamin D&sub2; ist. Das Hormon kann auch als 1α,24-Dihydroxyergocalciferol bezeichnet werden und wird durch die weiter unten angeführte Struktur dargestellt. Die Verbindung besitzt hochwirksame biologische Aktivität und rasche systemische Clearance - ein Anzeichen für niedrige Toxizität.
Ein neuartiges Verfahren zur Herstellung von 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; umfaßt die Verwendung von Ergosterol als Ausgangsmaterial, die Bildung des 24-Hydroxyvitamins D&sub2; und dann das 1α-Hydroxylieren der 24-Hydroxyverbindung. Im Verlauf dieser Synthese werden auch neuartige Zwischenprodukte erzeugt.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe oder Behandlung verschiedener Krankheiten, die durch Vitamin D-Defizienz gekennzeichnet sind, sowie renale Osteodystrophie, Hautstörungen und verschiedene Knochen-Verarmungserkankungen, insbesondere die Behandlung ohne damit einhergehendes Auftreten von Hyperkalzämie oder Hyperkalziurie. Die Verbindungen der Erfindung werden günstigerweise als Wirkstoffe pharmazeutischer Zusammensetzungen für Krankheiten der Vitamin D-Defizienz verwendet, um den Verlust an Knochenmasse oder Knochenmineralanteil bei Menschen, die eine Prädisposition für einen solchen Verlust aufweisen, umzukehren oder zu verhindern und um die Knochendichte bei Menschen zu stabilisieren, die an renaler Osteodystrophie leiden.
Die Verbindung der Erfindung eignet sich auch als topisches Mittel zur Behandlung bestimmter Hautstörungen. Die Verbindung der Erfindung wird günstigerweise als Wirkstoff für topische Zusammensetzungen verwendet, die auch andere Mittel, die Hautstörungen lindern können, enthalten können.
Andere Vorteile und umfassende Informationen über die spezifischen Anpassungen, Variationen der Zusammensetzung sowie die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Erfindung ergeben sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den beiliegenden Abbildungen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Es folgt eine Beschreibung der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen, worin gleiche Bezeichnungen gleiche Elemente identifizieren und worin:
Fig. 1 Herstellungsstufen zur Synthese von 24-Hydroxyvitamin D&sub2; darstellt; und
Fig. 2 Herstellungsstufen zur Synthese von 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2;, ausgehend von 24-Hydroxyvitamin D&sub2;, zeigt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung liefert synthetisches 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; [1α,24- (OH)&sub2;-D&sub2;].
Die Ausdrücke "biologische Aktivität", "biologisch aktiv", "bioaktiv" oder "biopotent" beziehen sich hierin auf biochemische Eigenschaften von Verbindungen, z. B. den Einfluß auf den Metabolismus, z. B. auf die Serumcalcium-Konzentration, oder die Bindung an ein zweckmäßiges Rezeptorprotein, z. B. an Vitamin D-Rezeptorprotein.
In einem ihrer Aspekte umfaßt die Erfindung die biologisch aktive Verbindung der allgemeinen Formel (I):
die 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; ist.
Die Synthese von 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; wird gemäß dem in den Fig. 1 und 2 dargestellten Schema durchgeführt. Wie aus Fig. 1 ersichtlich, verwendet die Synthese Ergosterol als Ausgangsmaterial. Ergosterol wird in einem 6 Stufen-Verfahren in 24-Hydroxyergosterol (5,7,22 Ergostatrien-3β,24-diol (7)) übergeführt. Das 24-Hydroxyergosterol wird dann nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren bestrahlt und thermisch umgewandelt, um 24-Hydroxyvitamin D&sub2; zu ergeben. Wie aus Fig. 2 ersichtlich, wird 24- Hydroxyvitamin D&sub2; dann in einem 6 Stufen-Verfahren hydroxyliert, um 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; zu ergeben, wobei hier ein ähnliches Verfahren wie jenes von Paaren et al., J. Org. Chem. 45, 3253 (1980), zur Anwendung kommt.
Genauer gesagt wird Ergosterol acetyliert, um das 3β-Acetat (2) zu bilden. Ein Addukt (3) wird dann durch Reaktion des 3β-Acetats mit einem Triazolindion mit dem B-Ring der Ergosterol-Struktur gebildet. Das Addukt (3) wird anschließend ozoniert, um die Seitenkette zu kürzen und ein C-21-Aldehyd (4) zu bilden. Die Seitenkette wird durch Reaktion des resultierenden Aldehyds mit der geeigneten Ketoverbindung wiederhergestellt, um das 24-Enon (5) zu ergeben. Das Enon wird dann in das 24-Methyl-3β,24-dihydroxyaddukt (6) übergeführt. Dieses Addukt wird anschließend mit Lithiumaluminiumhydrid umgesetzt, um das Addukt von Schutzgruppen zu befreien und 24-Hydroxyergosterol (7) zu ergeben. Das 24-Hydroxyergosterol wird dann bestrahlt und thermisch behandelt, um 24-Hydroxyvitamin D&sub2; zu bilden. Das 24 Hydroxyvitamin D&sub2; wird dann toxyliert, um 3β-Tosylat des 24-Hydroxyvitamins D&sub2; zu ergeben. Das Tosylat wird durch Solvolyse umgelagert, um das 6-Methoxy-24-hydroxy-3,5-cyclovitamin D&sub2; zu liefern. Das Cyclovitamin D&sub2; wird dann allylischer Oxidation unterzogen, um das 1α,24-Dihydroxycyclovitamin-Derivat zu bilden. Das 1α,24-Dihydroxycyclovitamin-Derivat wird nacheinander solvolysiert und einer Diels-Alder-Reaktion unterzogen, welche die 6-Methoxygruppe entfernt und das 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; (5,6-cis) vom 5,6- trans-1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; trennt.
Die Verbindung der Erfindung kann im klinischen und veterinären Bereich eingesetzt werden und eignet sich insbesondere zur Behandlung von abnormalem Metabolismus von Calcium und Phosphor. Insbesondere kann die Verbindung der Formel (I) beispielsweise dazu verwendet werden, Osteoblasten-Aktivität zu stimulieren (gemessen anhand der Serumspiegel von Osteocalcin). Osteocalcin ist eines der Hauptproteine in der Knochenmatrix. Die Verbindung der Formel (I) bindet sich schwächer an das Vitamin D- Serumbindeprotein als 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; - ein Anzeichen für die rasche Ausscheidung und geringe Toxizität, was seine pharmazeutischen Eigenschaften verbessert.
In einem weiteren Verfahren umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Regulierung des Kalkstoffwechsels, z. B. zur Behandlung von abnormalem Kalkstoffwechsel infolge von z. B. Leber-, Nieren- oder gastrointestinalem Versagen usw. Die Verbindungen der Formel (I) können zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Vitamin D- Defizienz-Erkrankungen und verwandten Krankheiten verwendet werden; Beispiele sind renale Osteodystrophie, Steatorrhoe, antikonvulsive Osteomalazie, hypophosphatemische Vitamin D-resistente Rachitis, Osteoporose, z. B. postmenopausale Osteoporose, senile Osteoporose, durch Steroide hervorgerufene Osteoporose und andere Krankheitszustände, die für Verlust von Knochenmasse charakteristisch sind, Pseudodefizienz-Rachitis (von Vitamin D abhängig), Nährstoff- und Absorptionsmangel-Rachitis, Osteomalazie und Osteopenie als Folge von Hypoparathyroidismus, postoperativem Hypopara thyroidismus, idiopathischem Hypothyroidismus, Pseudoparattlyroidismus und Alkoholismus.
1α,24-Diydroxyvitamin D&sub2; eignet sich auch zur Behandlung hyperproliferativer Hautstörungen, wie z. B. Psoriasis, Ekzem, mangelnde Hautstraffheit, dermale Hydratation und Sebumsekretion.
Die Verbindung der Formel (I) kann als aktive Verbindung in pharmazeutischen Zusammensetzungen mit gemilderten Nebenwirkungen und geringerer Toxizität als die bekannten Analoge aktiver Formen von Vitamin D&sub3; verwendet werden, wenn sie z. B. für Krankheiten angewendet wird, die durch abnormalen Calciumstoffwechsel hervorgerufen werden. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Die pharmakologisch aktive Verbindung der Erfindung kann gemäß herkömmlichen pharmakologischen Verfahren verarbeitet werden, um Medikamente zur Verabreichung an Patienten, z. B. an Säugetiere wie etwa den Menschen, herzustellen. Die Verbindung der Formel (I) kann z. B. in Gemischen mit herkömmlichen Exzipienten wie etwa pharmazeutisch annehmbaren, für enterale (z. B. orale), parenterale oder topische Anwendungen geeigneten Trägersubstanzen verwendet werden, die mit der aktiven Verbindung in nicht nachteiliger Weise reagieren.
Geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger sind beispielsweise Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Gummiarabikum, Pflanzenöle (z. B. Mandelöl, Maisöl, Baumwollsamenöl, Erdnußöl, Olivenöl, Kokosöl), Mineralöl, Fischleberöle, ölige Ester, wie etwa Polysorbat 80, Polyethylenglykole, Gelatine, Kohlenhydrate (z. B. Lactose, Amylose oder Stärke), Magnesiumstearat, Talk, Silicinsäure, viskoses Paraffin, Fettsäuremonoglyceride und -diglyceride, Pentaerythritfettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon usw.
Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert und gegebenenfalls mit Zusatzstoffen, wie z. B. Schmiermitteln, Konservierungsstoffen, Stabilisatoren, Benetzern, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Drucks, Puffern, Farbstoffen, Geschmacksverstärkern und/oder einer oder mehreren anderen Wirkstoffen vermischt werden, z. B. Vitamin D&sub3; und dessen 1α-hydroxylierten Metaboliten, konjugierten Östrogenen oder deren Äquivalenten, Anti-Östrogenen, Calcitonin, Biphosphonaten, Calcium- Ergänzungsstoffen, Cobalamin, Pertussis-Toxin und Bor.
Für parenterale Anwendungen eignen sich insbesondere injizierbare sterile Lösungen, vorzugsweise ölige oder wäßrige Lösungen sowie Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, einschließlich von Suppositorien. Die parenterale Verabreichung umfaßt günstigerweise subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, nasopharyngeale oder mukosale Absorption oder transdermale Absorption. Ampullen sind geeignete Dosierungseinheiten.
Für enterale Anwendungen kommen vor allem Tabletten, Dragees, Flüssigkeiten, Tropfen, Suppositorien, Pastillen, Pulver oder Kapseln in Frage. Ein Sirup, Elixier oder dergleichen kann verwendet werden, wenn ein gesüßtes Vehikel gewünscht ist.
Für topische Anwendungen können geeignete, nicht-sprühbare, viskose, halbfeste oder feste Formen verwendet werden, umfassend einen Träger, der mit topischer Anwendung vereinbar ist und eine dynamische Viskosität aufweist, die vorzugsweise höher als jene von Wasser ist, z. B. Mineralöl, Mandelöl, selbstemulgierendes Bienenwachs, Pflanzenöl, Rohvaseline und Propylenglykol. Zweckmäßige Formulierungen sind beispielsweise Cremen, Salben, Lotionen, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Pulver, Linimente, Aerosole, Hautpflaster, die gegebenenfalls sterilisiert oder mit Zusatzstoffen vermischt sind, z. B. mit Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Demulgatoren, Netzmitteln usw. Ein Cremepräparat gemäß der Erfindung umfaßt z. B. günstigerweise ein Gemisch von Wasser, Mandelöl, Mineralöl und selbstemulgierendem Bienenwachs; ein Salbenpräpa rat umfaßt günstigerweise z. B. Mandelöl und Rohvaseline; und ein Lotionpräparat um faßt günstigerweise z. B. trockenes Propylenglykol.
Topische Präparate der erfindungsgemäßen Verbindung, die sich zur Behandlung von Hautstörungen eignen, können auch Epithelbildung hervorrufende Mittel enthalten, z. B. Retinoide (z. B. Vitamin A), Chromanole wie etwa Vitamin E, β-Agonisten wie etwa Isoproterenol oder zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), entzündungshemmende Mittel wie etwa Corticosteroide (z. B. Hydrocortison oder dessen Acetat oder Dexamethason) und keratoplastische Mittel wie etwa Kohleteer oder Anthralin. Wirksame Mengen solcher Mittel sind beispielsweise: Vitamin A 0,003 bis 0,3 Gew.-% der Zusammensetzung; Vitamin E 0,1 bis 10 Gew.-%; Isoproterenol 0,1 bis 2 Gew.-%; cAMP 0,1 bis 1 Gew.-%; Hydrocortison 0,25 bis 5 Gew.-%; Kohleteer 0,1 bis 20 Gew.-%; und Anthralin 0,05 bis 2 Gew.-%.
Zur rektalen Verabreichung wird die Verbindung zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung geformt, die eine Suppositorienbasis, wie z. B. Kakaoöl, oder andere Triglyceride enthält. Um die Lagerbeständigkeit zu verlängern, enthält die Zusammensetzung günstigerweise ein Antioxidans, wie z. B. Ascorbinsäure, butyliertes Hydroxyanisol oder Hydrochinon.
Zur Behandlung von Calciumstoffwechselstörungen ist die orale Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung bevorzugt. Im allgemeinen wird die Verbindung der Erfindung in Form von Dosierungseinheiten abgegeben, umfassend 0,5 bis 25 ug in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger pro Dosierungseinheit. Die Dosierung der Verbindung der Erfindung ist im allgemeinen 0,01 bis 1,0 ug/kg/Tag, vorzugsweise 0,04 bis 0,3 ug/kg/Tag.
Zur topischen Behandlung von Hautstörungen beträgt die Dosis der Verbindung der Erfindung in einer topischen Zusammensetzung im allgemeinen 0,01 bis 10 ug pro g der Zusammensetzung.
Man beachte, daß die tatsächlich bevorzugten Mengen der aktiven Verbindung im konkreten Fall variieren und von der Wirksamkeit der jeweils verwendeten Verbindung, den jeweils formulierten Zusammensetzungen, der Art der Verabreichung sowie von der jeweiligen Behandlungsstelle und dem behandelten Organismus abhängen. Die jeweilige Dosis für einen bestimmten Patienten ist abhängig vom Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand und dem Geschlecht, der Ernährung, der Art und dem Zeitplan der Verabreichung, der Ausscheidungsrate sowie von in Kombination verwendeten Medikamenten und dem Schweregrad der jeweils durch Therapie behandelten Störung. Dosierungen für einen bestimmten Patienten können durch herkömmliche Überlegungen festgelegt werden, z. B. durch übliche Vergleiche zwischen den unterschiedlichen Aktivitäten der vorliegenden Verbindung und einem bekannten Mittel, beispielweise durch eine geeignete herkömmliche pharmakologische Arbeitsvorschrift.
In einem weiteren Aspekt kann die Verbindung der Erfindung günstigerweise auch in veterinären Zusammensetzungen verwendet werden, z. B. in Futterzusammensetzungen für Haus- und Nutztiere zur Behandlung oder Prophylaxe von Hypokalzämie. Im allgemeinen wird die Verbindung der Erfindung solcherart in Tierfutter abgegeben, daß das Fressen dieses Futters dem Tier normalerweise 0,01 bis 1,0 ug/kg/Tag liefert.
Die folgenden Beispiele sind lediglich veranschaulichend und schränken den übrigen Teil der Offenbarung in keiner Weise ein. In den folgenden Beispielen wurden Protonen-Magnetresonanz-(¹H-NMR-)Spektren mit einem Bruker AM-400 (400 MHz) mit Aspekt 3000 Computer in CDCl&sub3;-Lösungen mit CHCl&sub3; als innerem Standard aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm angegeben. UV-Spektren wurden mit einem Hitachi U-2000-Spektralphotometer aufgenommen und für Ethanollösungen angegeben.

Beispiel 1: Erzeugung, Reinigung und Identifizierung von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; in mit 1α-(OH)D&sub2; inkubierten menschlichen Leberzellen

Im wesentlichen reines 1α-(OH)D&sub2; stammte von Bone Care International, Inc. aus Madison, Wisconsin, USA. Das 1α-(OH)D&sub2; wurde mit Hep 3B-Zellen aus einem menschlichen Hepatom nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren kultiviert.
Lipidextrakte wurden nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren erzeugt und HPLC auf Zorbax-S1L, entwickelt mit Hexan/Isopropanol/Methanol (91 : 7 : 2), unterzogen. Der vermeintliche 1α,23-(OH)&sub2;D&sub2;-Metabolit eluierte zwischen dem Stamm-1α-(OH)D&sub2; und dem Standard 1,25-(OH)&sub2;D&sub2; (stammte ebenfalls von Bone Care International, Inc. aus Madison, Wisconsin, USA). Das 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; wurde durch dieses HPLC-System weiter gereinigt, bevor die Identifizierung des Metaboliten durch Massenspektrometrie-Analyse vorgenommen wurde.
Der gereinigte Metabolit war polarer als das Ausgangsmaterial 1α-(OH)D&sub2;, wodurch man vorläufig den Schluß zog, daß er ein Dihydroxyvitamin D&sub2;-Metabolit ist. Dieser Metabolit besaß auch das Vitamin D-Chromophor, was auf die Bewahrung des cis-Trien- Systems von Vitamin D hindeutet. Da der Metabolit aus 1α-(OH)D&sub2; stammte, war seine Struktur somit 1α,X-(OH)&sub2;D&sub2;.
Das Trimethylsilyl-Derivat von 1α,X-(OH)&sub2;D&sub2; wurde nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren hergestellt und Massenspektrometrie am TMS-Derivat und der nativen Verbindung durchgeführt. Das TMS-Derivat wurde mittels GC-MS analysiert, wobei die Identifizierung vor allem auf der Interpretation des Fragmentationsmusters des Pyrometaboliten beruhte. Das Molekül von besaß ein m/z von 644 - ein Anzeichen für ein Dihydroxyvitamin D&sub2; mit Addition von drei TMS-Gruppen, die 216 zusätzliche Masse-Einheiten ausmachen. Da 1α-(OH)D&sub2; 3β-Gruppen und 1α-Gruppen aufweist und der vermeintliche Metabolit ein zusätzliches Hydroxyl aufweist, waren somit alle drei Hydroxyle derivatisiert. Unterscheidbare Fragmente wurden bei m/z 601, 511, 421, 331 festgestellt, was einen Verlust einem 43-Masseeinheiten-Fragment alleine oder zusätzlich zu einer, zwei oder drei TMS-Gruppen mit jeweils 90 Einheiten darstellt. Dieses Muster wurde am wahrscheinlichsten mit dem durch Spaltung der C-24-C25-Bindung erlittenen Verlust von C&sub3;H&sub7; erklärt (machte 43 Masseeinheiten aus). Dies stellt den Verlust des C&sub2;&sub6;- C&sub2;&sub5;-C&sub2;&sub7;-Fragments dar. Außerdem fehlte dem Massenspektrum das m/z 131-Fragment, einem Charakteristikum aller 25-hydroxylierten Vitamin D-Verbindungen.
Das Massenspektrum zeigt das m/z 513-Fragment, das den Verlust von 131 Masseeinheiten aufgrund von A-Ring-Spaltung mit Verlust von C&sub2;-C&sub3;-C&sub4; zeigt (ebenfalls für Vitamin D-Verbindungen charakteristisch). Das Massenspektrum enthielt auch m/z 143, das wahrscheinlich aus der C-24-C23-Spaltung und einem Verlust einer Methylgruppe stammte. Der ungewöhnliche Verlust von 43 Einheiten, der eine C&sub2;&sub4;-C&sub2;&sub5;-Spaltung gekoppelt mit dem Verlust eines Fragments infolge von C&sub2;&sub3;-C&sub2;&sub4;-Spaltung zeigte, wies darauf hin, daß das zusätzliche Hydroxyl in 1α,X-(OH)&sub2;D&sub2; an Kohlenstoff-24 positioniert war. Somit war die identifizierte Struktur 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2;.
Der native Metabolit wurde durch Direktsonden-Massenspektrometrie analysiert. Diese Analyse stimmte mit einem Hydroxyl an der 24-Position und auch mit der GC-MS-Analyse des obigen TMS-Derivats überein. Der native Metabolit zeigte das erwartete Molekülion an m/z 428 und ein charakteristisches Fragment an m/z 367 - ein Anzeichen für den Verlust eines Wasser- und des C&sub2;&sub5;-C&sub2;&sub6;-C&sub2;&sub7;-Fragments von 43 Masseeinheiten.

Beispiel 2: Synthese von 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2;

(22E)-5,7,22-Ergostatrien-3β-yl-acetat (2)

Zu einer Lösung von 50 g (0,13 Mol) Ergosterol (1) in 300 ml wasserfreiem Pyridin wurden 33,3 ml (0,35 Mol) Säureanhydrid zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, bevor 600 ml Wasser zugegeben wurden. Der Überstand wurde filtriert und dreimal mit je 200 ml Acetonitril gewaschen und dann luftgetrocknet, um 42,0 g (74%) von (2) zu ergeben.

22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1.2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β- yl-acetat (4)

Zu einer Lösung von 33,0 g (0,075 Mol) Ergosterolacetat (2) in 1000 ml Chloroform wurden 13,2 g (0,075 Mol) 4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion zugegeben. Die Lösung des so gebildeten (3) wurde 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor 5 ml Pyridin zugegeben wurden. Die Lösung wurde auf -78ºC gekühlt, bei -78ºC mit einem Ozon-Sauerstoff-Gemisch 2 Stunden lang behandelt und anschließend gründlich mit Stickstoff ausgewaschen. Dann wurden 50 ml Dimethylsulfid zugegeben und das Gemisch mit 300 ml Wasser, dann zweimal mit 200 ml 2 n HCl und schließlich mit 300 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der Rest wurde auf einer Kieselgelsäule unter Verwendung von 30% Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 16,0 g (39%) der vorliegenden Verbindung als schaumartigen Feststoff zu ergeben.
¹H-NMR: (400 MHz; CDCl&sub3;) δ, ppm: 0,85 (3H, s, 18-CH&sub3;), 1,10 (3H, s, 19-CH&sub3;), 1,15 (3H, d, 21-CH&sub3;), 1,99 (3H, s, 3β-CH&sub3;CO), 5,45 (1H, m, 3α-H), 6,26 (1H, d, 7-H), 6,40 (1H, d, 6-H), 7,42 (5H, m, Ph), 9,58 (1H, d, HCO)

(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β- yl-acetat (5)

Butyllithium (1,6 M-Lösung in Hexan 8,94 ml, 0,014 Mol) wurde zu einer gerührten, gekühlten (0ºC) Lösung von Diisopropylamin (1,45 g, 0,014 Mol) in trockenem Tetrahydrofuran (20 ml) unter Stickstoff zugegeben. 3-Methylbutan-2-on (1,23 g, 0,014 Mol) in trockenem Tetrahydrofuran (6 ml) wurde bei 0ºC 15 min lang zugetropft. Die Lösung wurde 1 h lang bei 0ºC gerührt, dann auf -70ºC abgekühlt und eine Lösung des Alde hyds (4) (6,0 g, 0,011 Mol) in trockenem Tetrahydrofuran (60 ml) zugegeben. Die Temperatur wurde auf -20ºC erhöht und 3 h lang bei diesem Wert gehalten. Dann wurde Eisessig (20 ml) bei -20ºC zugegeben und die Lösung auf Raumtemperatur gebracht. Ether (800 ml) und Wasser (400 ml) wurden zugegeben, die organische Schicht abgetrennt und mit 10%-iger Salzsäure (2 · 300 ml), gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung (2 · 300 ml) und Wasser (2 · 300 ml) gewaschen. Einengen lieferte das Rohprodukt (7,5 g), das in Tetrahydrofuran (100 ml) mit 1,5 n Salzsäure (12 ml) gelöst war. Nach 1,5- stündigem Halten am Rückfluß wurde das Gemisch mit Ether (600 ml) verdünnt, mit einer 5%-igen Natriumcarbonat-Lösung (2 · 200 ml) und Wasser (2 · 200 ml) gewaschen und getrocknet (wasserfreies MgSO&sub4;). Einengen unter reduziertem Druck ergab das Rohprodukt (7,0 g). Chromatographie auf Kieselgel (50% Ethylacetat in Hexan) ergab das Enon (5) (4,0 g, 59%).
H-NMR: (400 MHz) δ, ppm: 0,83 (3H, s, 18-CH&sub3;), 0,99 (3H, s, 19-CH&sub3;), 1,09 (6H, dd, 26- und 27-CH&sub3;), 1,12 (3H, d, 21-CH&sub3;), 2,0 (3H, s, 3β-CH&sub3;CO), 2,84 (1 H, m, 25-H), 5,45 (1H, m, 3α-H), 6,06 (1H, d, 23-H), 6,24 (1H, d, 7-H), 6,39 (1H, d, 6-H), 6,71 (1H, dd, 22-H), 7,42 (5H, m, Ph).

(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol (6)

Das Enon (5) (3,5 g, 5,7 mMol) in trockenem Ether (100 ml) wurde auf 0ºC gekühlt und Methylmagnesiumbromid (3,0 m Lösung in Ether (6,8 ml, 0,02 Mol)) zugetropft. Nach 1 h bei 0ºC wurde gesättigtes Ammoniumchlorid (100 ml) zugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt. Die wäßrige Schicht wurde mit Ether (2 · 200 ml) extrahiert. Die vereinigten Etherphasen wurden über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, um das Rohprodukt (3,0 g, 90%) von (6) zu ergeben.

(22E)-5,7,22-Ergostatrien-3β,24-diol (7)

Zu einer Lösung von 3,0 g (5,1 mMol) von (6) in trockenem Tetrahydrofuran (250 ml) wurden 3,6 g (0,09 Mol) Lithiumaluminiumhydrid zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rückfluß 3 Stunden lang erhitzt, mittels Eiswasserbad gekühlt und das Reaktionsgemisch durch vorsichtiges Zutropfen von Eiswasser (5 ml) zersetzt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt, um das meiste Tetrahydrofuran zu entfernen. Der Rückstand wurde in 200 ml Ethylacetat gelöst und zweimal mit gesättigter NaCl-Lösung (2 · 200 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rest wurde auf einer Kieselgelsäule unter Verwendung von 30% Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 1,5 g (71%) von (7) zu erhalten.
¹H-NMR: (400 MHz, CDCl&sub3;) δ, ppm: 0,64 (3H, s, 18-H), 0,88 (6H, dd, 26- und 27-CH&sub3;), 0,93 (3H, s, 19-CH&sub3;), 1,06 (3H, d, 21-CH&sub3;), 1,19 (3H, s, 28-CH&sub3;), 3,55 (1H, m, 3α-H), 5,36 (1H, d, 7-H), 5,42 (2H, m, 22- und 23-H), 5,52 (1H, d, 6-H).
UV (Ethanol) λmax: 282 nm.

24-Hydroxyvitamin D&sub2; (8)

1 g (2,4 mMol) von (7) wurde in 250 ml Ether und Benzol (4 : 1) gelöst und unter Rühren und Stickstoff in einem wassergekühlten Quarz-Eintauchnapf unter Verwendung einer Hanovia-Mitteldruck-UV-Lampe 2 h lang bestrahlt. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt, in 100 ml Ethanol erneut gelöst und über Nacht rückflußerhitzt. Die Lösung wurde im Vakuum bis zur Trockene eingeengt und der Rückstand auf einer Kieselgelsäule unter Verwendung von 30% Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 0,55 g (55%) an (8) zu ergeben.
¹H-NMR: (400 MHz, CDCl&sub3;) δ, ppm: 0,57 (3H, s, 18-CH&sub3;), 0,92 (6H, dd, 26- und 27- CH&sub3;), 1,06 (3H, d, 21-CH&sub3;), 1,20 (3H, s, 28-CH&sub3;), 3,93 (1H, m, 3-H), 4,79 (1H, m (scharf), 19-H), 5,01 (1H, m, (scharf), 19-H), 5,43 (2H, m, 22- und 23-H), 6,02 (1H, d, 7- H), 6,22 (1H, d, 6-H).
UV (Ethanol) λmax: 265 nm.

24-Hydroxyvitamin D&sub2;-tosylat (9)

Zu einer Lösung von 0,55 g (1,3 mMol) von (8) in 5 ml wasserfreiem Pyridin wurden 0,6 g (3,2 mMol) Tosylchlorid zugegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff bei 5ºC 20 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml kalte gesättigte NaHCO&sub3;-Lösung gegossen und mit Ether (3 · 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit 5%-iger HCl-Lösung (2 · 200 ml), gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung (2 · 200 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (2 · 200 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum eingeengt, um 0,62 g (84%) an (9) zu ergeben.
¹H-NMR: (400 MHz, CDCl&sub3;) δ, ppm: 0,57 (3H, s, 18-CH&sub3;), 0,92 (6H, dd, 26- und 27- CH&sub3;), 1,08 (3H, d, 21-CH&sub3;), 1,24 (3H, s, 28-CH&sub3;), 2,43 (3H, s, CH&sub3; (Tosylat)), 4,69 (1H, m, 3-H), 4,77 (1H, m (scharf), 19-H), 5,0 (1H, m (scharf), 19-H), 5,42 (2H, m, 22- und 23-H), 6,03 (1-H, d, 7-H), 6,25 (1-H, d, 6-H), 7,31 und 7,83 (4H, d, aromatisch).

24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D&sub2; (10)

Zu einer Lösung von 0,6 g (1,06 mMol) von (9) in 50 ml wasserfreiem Methanol wurden 4,0 g (0,047 Mol) Natriumbicarbonat zugegeben. Das Gemisch wurde 6 h lang rückflußerhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt. Wasser (100 ml) wurde zugegeben, gefolgt von Extraktion mit Ether (2 · 200 ml). Die vereinigten Etherextrakte wurden über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, um 450 mg (100%) an (10) als Öl zu ergeben.

1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamin D&sub2; (11)

t-Butylhydroperoxid (870 ul (2,61 mMol); 3 m in Toluol) wurde zu einer Suspension von 73 mg (0,66 mMol) Selendioxid in 50 ml wasserfreiem Dichlormethan unter Stickstoff zugegeben. Das Gemisch wurde 3 h lang unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurden 0,1 ml wasserfreies Pyridin zugegeben, gefolgt von einer Lösung von 450 mg (1,06 mMol) (10) in 15 ml wasserfreiem Dichlormethan. Das Gemisch wurde 10 min lang unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt, bevor 25 ml 10%-ige NaOH-Lösung zugegeben und das Gemisch mit Ether (3 · 100 ml) extrahiert wurde. Die vereinigten Etherextrakte wurden mit 10%-iger NaOH-Lösung (2 · 100 ml), Wasser (2 · 100 ml) und gesättigter Natriumchlorid-Lösung (2 · 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule unter Verwendung eines Gemisches aus 30% Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 110 mg (24%) von (11) zu ergeben.
¹N-NMR: (400 MHz, CDCl&sub3;) δ, ppm: 0,55 (3H, s, 18-CH&sub3;), 0,90 (6H, dd, 26- und 27- CH&sub3;), 1,03 (3H, d, 21-CH&sub3;), 1,19 (3H, s, 28-CH&sub3;), 3,25 (3H, s, -OCH&sub3;), 4,19 (1H, d, 6- H), 4,19 (1H, m, 1-H), 4,92 (2H, d, 7-H), 5,15 (1H, m (scharf), 19-H), 5,2 (1H, m (scharf), 19-H), 5,42 (2H, m, 22- und 23-H).

5,6-cis- und 5,6-trans-1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; (12, 13)

1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamin D&sub2; (11) (110 mg (0,25 mMol) wurde in 2,0 ml Dimethylsulfoxid und 1,5 ml Essigsäure gelöst und 1 h lang bei 50ºC unter Stickstoff erhitzt. Die Lösung wurde über Eis und 50 ml gesättigte NaHCO&sub3;-Lösung gegossen. Das Gemisch wurde mit Ether (3 · 100 ml) extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden mit gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung (3 · 100 ml), Wasser (2 · 100 ml) und gesättigter NaCl- Lösung (2 · 200 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum eingeengt, um das Rohprodukt von (12) und (13) (100 mg, 93%) zu ergeben.

5,6-cis-1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; (12)

Zu einer Lösung von (12) und (13) in 5 ml Ethylacetat wurden 20 mg (0,2 mMol) Maleinsäureanhydrid zugegeben und das Gemisch 24 h lang unter Stickstoff bei 35ºC gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule unter Verwendung von 50% Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 20 mg (22%) an (12) zu ergeben.
¹H-NMR: (400 MHz, CDCl&sub3;) δ, ppm: 0,57 (3H, s, 18-CH&sub3;), 0,89 (6H, dd, 26- und 27- CH&sub3;), 1,04 (3H, d, 21-CH&sub3;), 1,21 (3H, s, 28-CH&sub3;), 4,23 (1H, m, 3-H), 4,40 (1H, m, 1-H), 5,0 (1H, m (scharf), 19-H), 5,33 (1H, m (scharf), 19-H), 5,44 (2H, m, 22- und 23-H), 6,01 (1H, d, 7-H), 6,37 (1H, d, 6-H).
UV (Ethanol) λmax: 265 nm.

Beispiel 3: Bevorzugte in vitro-Produktion von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; mit erhöhten Substrat-Konzentrationen

Hep 3B-Zellen wurden wie oben beschrieben in Endkonzentrationen von 1, 10 oder 100 nM (Versuch 1) sowie 1 oder 10 uM (Versuch 2) mit 1α-OH-D&sub2; inkubiert, und 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; wurde extrahiert und gereinigt. Die 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2;- und 1,25-(OH)&sub2;D&sub2;- Metaboliten wurden anhand von wiedergefundenem Radiomarker (Versuch 1) oder durch Photodiodenarray-Spektralphotometrie (Versuch 2) quantifiziert. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, nahm die Menge an 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; im Verhältnis zur Menge an 1,25- (OH)&sub2;D&sub2; mit erhöhter Substratkonzentration zu. Dies zeigt, daß in diesem System 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; bei höheren Substratkonzentrationen der vorherrschende natürliche aktive Metabolit von 1α-OH-D&sub2; war. Tabelle 1
* N. D. bedeutet "nicht detektierbar".

Beispiel 4: Produktion von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; bei an Osteoporose leidenden Frauen, denen 1α-(OH)&sub2;D&sub2; verabreicht wurde

Eine Zunahme der Produktion von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; im Verhältnis zu 1,25-(OH)&sub2;D&sub2;&sub3; wurde von den Anmeldern auch bei Frauen beobachtet, die 1α-OH-D&sub2; erhielten; dies erfolgte im Rahmen einer Untersuchung dieses Arzneimittels zur Behandlung von Osteoporose. Entweder nach einer Einzeldosis von 2 ug 1,α-OH-D&sub2; oder täglichen Dosen von 8 ug/Tag über eine Woche wurde Blut abgenommen und auf die Metaboliten 1α,24- (OH)&sub2;D&sub2; und 1,25-(OH)&sub2;D&sub2; analysiert. Lipid wurde aus dem Blut extrahiert, und die Metaboliten wurden mittels HPLC unter Anwendung herkömmlicher Verfahren gereinigt und mit dem Radiorezeptor-Assay von Incstar (Stillwater, Minnesota, USA) quantifiziert. 1 Tag nach einer 2 ug-Einzeldosis war die Menge an 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; nicht nachweisbar, wobei der 1,25-(OH)&sub2;D&sub2;-Spiegel etwa 11 pg/ml betrug. Im Gegensatz dazu betrug 1 Tag nach der letzten Dosis von 8 ug die Menge an 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; im Mittel 9 pg/ml, die Menge an 1,25-(OH)&sub2;D&sub2; im Mittel 30 pg/ml.

Beispiel 5: Affinität von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; für Vitamin D-Rezeptor

Die Affinität von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; für den Säugetiervitamin D-Rezeptor (VDR) wurde mittels eines im Handel erhältlichen Sets von Rinderthymus-VDR und herkömmlicher 1,25- (OH)&sub2;-D&sub3;-Lösungen von Incstar (Stillwater, Minnesota, USA) untersucht. Gereinigtes 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; wurde durch Photodiodenarray-Spektralphotometrie quantifiziert und mit Radiorezeptor-Assay untersucht. Die halbmaximale Bindung von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; betrug etwa 150 pg/ml, während jene von 1α,25-(OH)&sub2;D&sub2; 80 pg/ml betrug. Somit besaß der Rinderthymus-VDR eine zweifach niedrigere Affinität für 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; als für 1α,25-(OH)&sub2;D&sub3;, was darauf hindeutete, daß 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; hochwirksame biologische Aktivität aufwies.

Beispiel 6: Affinität von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; für das Vitamin D-Serumbindeprotein

Die Affinität von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; für das Vitamin D-Serumbindeprotein (DBP) wurde mit Rattenserum ohne Vitamin D nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren untersucht. Die Daten zeigten, daß die DBP-Bindung von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; zumindest 1000 Mal schwächer war als für 25-OH-D&sub3;. Angesichts der starken Bindung von 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; an den VDR und der schwachen Bindung an das DBP wird diese Verbindung verstärkt von Zielzellen aufgenommen, wodurch sie eine hochwirksame biologische Aktivität besitzt. Darüber hinaus war die schwache Bindung durch das DBP ein Indikator rascherer Clearance und somit geringe Toxizität.
Somit zeigten die obigen Assays, daß das neue 1α,24-(OH)&sub2;D&sub2; ein charakteristisches und einzigartiges Spektrum von Aktivitäten aufweist, d. h. hohe biologische Wirksamkeit und geringe Toxizität, welche die Verbindung deutlich von jenen des Stands der Technik unterscheiden.

Beispiel 7: Biologische Tests

20 postmenopausale Frauen mit Osteoporose nehmen an einer offenen Markerstudie teil. Die ausgewählten Patientinnen waren zwischen 55 und 75 Jahren alt und zeigen eine L2-L3-Wirbelknochen-Mineraldichte zwischen 0,7 und 1,05 g/cm² (bestimmt durch Messungen mit einem LUNAR Knochen-Dichtemesser von Lunar Corporation, Madison, Wisconsin, USA).
Nach Zulassung zur Studie erhalten alle Patientinnen Instruktionen über die Wahl einer täglichen Diät mit 400 bis 600 mg Calcium. Die diesbezügliche Compliance wird in wöchentlichen Intervallen durch 24-Stunden-Nahrungsmittelaufzeichnungen und Interviews mit jeder Patientin überprüft.
Alle Patientinnen vollenden eine einwöchige Eingangsperiode, eine fünfwöchige Behandlungsperiode und eine einwöchige Nachbehandlungs-Beobachtungsperiode. Während der Behandlungsperiode nehmen die Patientinnen in der ersten Woche oral 1α,24- Dihydroxyvitamin D&sub2; in einer Anfangsdosis von 0,5 ug/Tag selbst ein, und in den folgenden vier Wochen immer höhere Dosen von 1,0, 2,0, 4,0 und 8,0 ug/Tag. Alle Dosen werden vor dem Frühstück eingenommen.
Die Blut- und Harnspiegel werden im gesamten Untersuchungsverlauf wöchentlich überwacht. Die wesentlichen blutchemischen Indikatoren sind Serumspiegel von Calcium, Phosphor, Osteocalcin, Kreatinin und Harnstoffstickstoff in Blut in nüchternem Zustand. Die wesentlichen harnchemischen Indikatoren sind die Ausscheidung von Calcium, Phosphor und Kreatinin im Verlauf von 24 Stunden.
Die Blut- und Harndaten aus dieser klinischen Studie zeigen, daß diese Verbindung die Nierenfunktion nicht beeinträchtigt, wie durch Kreatinin-Clearance und Blutspiegel an Harnstoffstickstoff bestimmt wird; auch die Harnausscheidung von Hydroxyprolin war nicht erhöht, was auf das Fehlen eines die Knochenresorption stimulierenden Effekts hindeutet. Die Verbindung übt auch keinen Einfluß auf routinemäßig überwachte Serumparameter aus, was auf das Fehlen nachteiliger metabolischer Wirkungen schließen läßt.
Eine positive Wirkung von 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; auf Calcium-Homöostase ergibt sich deutlich aus mäßigen Zunahmen der 24-Stunden-Calciummengen im Harn, die bestätigen, daß die Verbindung die Darm-Calciumabsorption steigert, und aus höheren Serumosteocalcin-Werten, die anzeigen, daß die Verbindung die Osteoblasten stimuliert.

Beispiel 8:

Eine klinische Studie wird mit postmenopausalen ambulanten Osteoporose-Patientinnen im Alter zwischen 55 und 75 Jahren durchgeführt. Die Studie umfaßt bis zu 120 Patientinnen, die willkürlich in drei Behandlungsgruppen aufgeteilt werden, und erstreckt sich über 24 bis 36 Monate. Zwei der Behandlungsgruppen erhalten konstante Dosen an 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; (u. i. d.; zwei unterschiedliche Dosismengen bei oder über 1,0 ug/Tag) und die andere Gruppe ein entsprechendes Plazebo. Alle Patientinnen nehmen normale Calciummengen (500 bis 800 mg/Tag) und keine Calcium-Ergänzungsstoffe ein. Die Wirksamkeit wird durch Vor- und Nachbehandlungsvergleiche der Patientinnengruppen hinsichtlich der (a) gesamten Calciumretention im Körper und (b) der radialen und spinalen Knochenmineraldichte mittels Dualphoton-Absorptiometrie (DPA) oder Dualenergie-Röntgen-Absorptiometrie (DEXA) bewertet. Die Sicherheit wird durch Vergleiche von Hydroxyprolin-Harnausscheidung, Calciumwerte in Serum und Harn, Kreatinin-Clearance, Harnstoffstickstoff im Blut und andere herkömmliche Bestimmungen bewertet.
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß mit 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; behandelte Patientinnen deutlich höhere Gesamtmengen an Körpercalcium sowie deutlich höhere radiale und spinale Knochendichten als mit Plazebo behandelte Patientinnen aufweisen.
Die überwachten Sicherheitsparameter bestätigen in der 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2;- Therapie eine insignifikante Inzidenz von Hyperkalzämie oder Hyperkalziurie oder anderer metabolischer Störungen.

Beispiel 9:

Eine klinische Studie wird mit gesunden postmenopausalen Frauen im Alter von 55 bis 60 Jahren durchgeführt. Die Studie umfaßt bis zu 80 Patientinnen, die willkürlich in 2 Behandlungsgruppen unterteilt werden, und erstreckt sich über 24 bis 36 Monate. Eine Behandlungsgruppe erhält eine konstante Dosis 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; (u.i.d.; eine Dosismenge bis oder über 1,0 ug/Tag), die andere ein entsprechendes Plazebo. Die Studie wird wie in obigem Beispiel 2 durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, daß mit 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; behandelte Patientinnen im Vergleich zu Ausgangswerten geringere Verluste an Gesamt-Körpercalcium und radialen oder spinalen Knochendichten aufweisen. Im Gegensatz dazu zeigen mit Plazebo behandelte Patientinnen im Vergleich zu Ausgangswerten signifikante Verluste hinsichtlich dieser Parameter. Die überwachten Sicherheitsparameter bestätigen die Sicherheit der langfristigen Verabreichung von 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; bei diesen Dosismengen.

Beispiel 10:

Ein 12 Monate dauernder, klinischer Doppelblind-Versuch mit Plazebovergleich wird mit 30 Männern und Frauen mit Nierenerkrankung durchgeführt, die sich chronischer Hämodialyse unterziehen. Alle Patienten durchlaufen eine 8-Wochen-Kontrollperiode, während der sie eine Erhaltungsdosis an Vitamin D&sub3; erhalten (400 IU/Tag) verabreicht bekommen. Nach dieser Kontrollperiode werden die Patienten in zwei Behandlungsgruppen randomisiert: eine Gruppe erhält eine konstante Dosis von 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; (u.i.d.; eine Dosierung von mehr als 3,0 ug/Tag), die andere Gruppe ein entsprechendes Plazebo. Beide Behandlungsgruppen erhalten eine Erhaltungsdosis an Vita min D&sub3;, sie nehmen weiterhin normal Calcium in ihrer Nahrung auf und nehmen keine Calcium-Ergänzungsstoffe zu sich. Die Wirksamkeit wird durch Vor- und Nachbehandlungsvergleiche der 2 Patientengruppen hinsichtlich (a) direkter Messungen intestinaler Calciumabsorption, (b) der gesamten Calciumretention im Körper, (c) radialer und spinaler Knochenmineraldichte und (d) Bestimmungen von Serumcalcium bewertet. Die Sicherheit wird durch regelmäßige Überwachung von Serumcalcium bewertet.
Die Analyse der klinischen Daten zeigt, daß 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; die intestinale Calciumabsorption deutlich steigert (bestimmt durch direkte Messungen mittels eines Doppelisotopen-Verfahrens). Mit dieser Verbindung behandelte Patienten zeigen normalisierte Serumcalcium-Spiegel, stabile Mengen des Gesamt-Körpercalciums sowie stabile radiale und spinale Knochendichten im Verhältnis zu den Ausgangswerten. Im Gegensatz dazu zeigen mit Plazebo behandelte Patienten häufige Hypokalzämie, signifikante Reduktionen des Gesamt-Körpercalciums sowie radiale und spinale Knochendichte. Eine insignifikante Inzidenz von Hyperkalzämie wird in der behandelten Gruppe beobachtet.

Beispiel11: Medikamentenpräparate

Eine topische Creme wird durch Lösen von 1,0 mg 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; in 1 g Mandelöl hergestellt. Dieser Lösung werden 40 g Mineralöl und 20 g selbstemulgierendes Bienenwachs zugegeben. Das Gemisch wird erhitzt, um flüssig zu werden. Nach der Zugabe von 40 ml heißem Wasser wird das Gemisch gut vermischt. Die resultierende Creme enthält etwa 10ug 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; pro g Creme.

Beispiel 12:

Eine Salbe wird durch Lösen von 1,0 mg 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; in 30 g Mandelöl hergestellt. Dieser Lösung werden 70 g Rohvaseline zugegeben, die gerade genug er wärmt wurde, um flüssig zu werden. Die Salbe wird gut vermischt und abgekühlt. Diese Salbe enthält etwa 10ug 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; pro g Salbe.

Beispiel 13:

Der Salbe aus Beispiel 12 werden durch gründliches Vermischen 0,5 g Adenosin und 2,0 g Papaverinbase zugegeben (beide in der Mindestmenge an Dimethylsulfoxid gelöst). Die zusätzlichen Komponenten sind zu etwa 0,5 Gew.-% (Adenosin) und 2 Gew.- % (Papaverinbase) vorhanden.

Beispiel 14:

Der Salbe aus Beispiel 12 werden unter gründlichem Vermischen 10.000 U Vitamin A zugegeben (gelöst in der Mindestmenge an Pflanzenöl). Die resultierende Salbe enthält etwa 100 U Vitamin A pro g Salbe.

Beispiel 15:

Eine dermatologische Lotion wird durch Lösen von 1,0 mg 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; in 100 g trockenem Propylenglykol hergestellt. Die Lotion wird in einem Kühlschrank in einem braunen Fläschchen aufbewahrt und enthält etwa 10 ug 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; pro g Lotion.

Beispiel 16:

In 1 g Mandelöl werden 0,2 mg 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; gelöst. Der Lösung werden 40 g Mineralöl und 20 g selbstemulgierendes Bienenwachs zugegeben, gefolgt von 40 ml heißem Wasser. Das Gemisch wird gut gemischt, um eine kosmetische Creme zu erhalten, die etwa 2,0 ug 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; pro g Creme enthält.

Beispiel 17:

Einer kosmetischen Creme, die gemäß Beispiel 16 hergestellt wurde, werden 100 mg Adenosin zugegeben. Die Creme wird gut vermischt und enthält etwa 0,1 Gew.-% Adenosin.

Beispiel 18:

Eine Salbe wird durch Lösen von 100 ug 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; in 30 g Mandelöl hergestellt. Der resultierenden Lösung werden 70 g Rohvaseline zugegeben, die gerade genug erwärmt wurde, um flüssig zu werden. Die Salbe wird gut vermischt und abgekühlt. Die resultierende Salbe enthält etwa 1,0 ug 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; pro g Salbe.

Beispiel 19:

Der kosmetischen Salbe aus Beispiel 18 werden unter gründlichem Vermischen 200 U/g Vitamin A zugegeben (gelöst in der Mindestmenge an Pflanzenöl).

Beispiel 20:

Eine kosmetische Lotion wird durch Lösen von 300 ug 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; in 100 g trockenem Propylenglykol hergestellt. Die Lotion wird in einem Kühlschrank in einem braunen Fläschchen aufbewahrt und enthält etwa 3,0 ug 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; pro g Lotion.

Beispiel 21: Dermatologische Tests

1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; enthaltende Zusammensetzungen werden hinsichtlich therapeutischer Wirksamkeit der Zusammensetzung bei der topischen Behandlung von Dermatitis (Kontakt- oder ektopisch) bewertet. Die bewertete Zusammensetzung ist eine Salbe mit 10 ug 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; pro g Salbe in einer Petrolatum-Mandelöl- Basis. Die Vergleichszusammensetzung ist identisch, außer daß sie den Wirkstoff 1α,24- Dihydroxyvitamin D&sub2; nicht enthält. Die Patienten werden in einem Ambulatorium behandelt. Sie werden instruiert, das Präparat zweimal täglich anzuwenden.
Die Salbe wird - so weit dies möglich ist - auf eine einzige Läsion oder den Bereich der Krankheit aufgetragen. Die Salbe und ihr Behälter werden vor Beginn der Behandlung gewogen und am Behandlungsende mit dem übrig gebliebenen Inhalt nochmals gewogen.
Der Bereich der behandelten Läsion wird bestimmt und aufgezeichnet und die Läsion bedarfsgemäß zusammen mit geeigneten "Vergleichs"-Läsionen fotografiert. Die letzteren sind vorzugsweise Läsionen ähnlicher Größe und Entwicklungsstufe, die sich entweder in der Nähe der behandelten Läsion oder symmetrisch kontralateral befinden. Relevante Details der Fotografien werden aufgezeichnet, um reproduziert zu werden, wenn die Läsionen erneut fotografiert werden (Abstand, Öffnung, Winkel, Hintergrund, usw.). Die Salbe wird zweimal täglich aufgetragen und bleibt vorzugsweise unbedeckt. Die "Vergleichs"-Läsionen werden nicht behandelt, doch wenn dies nicht möglich ist, wird die auf sie angewandte Behandlung notiert.
Bewertungen von Erythem, Abschuppung und Dicke erfolgen in wöchentlichen Abständen durch einen Arzt, wobei der Schweregrad der Läsion von 0 bis 3 reichen kann. Die Endbewertung wird üblicherweise am Ende der vier- bis sechswöchigen Behandlung durchgeführt. Mit 1,24-(OH)&sub2;D&sub2; behandelte Läsionen zeigen geringere Werte als die Vergleichsläsionen. Eine insignifikante Inzidenz von Hyperkalzämie wird ebenfalls beobachtet.

Beispiel 22: Versuche auf epidermale Zelldifferenzierung und -proliferation

Menschliche Keratinozyten werden gemäß bekannter Modifikationen des ursprünglich von Rheinwald und Green beschriebenen Verfahrens (Cell 6, 331 (1975) kultiviert. Das in Ethanol gelöste 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; wird Zellen zugegeben, um eine Vielfalt von Konzentrationen zwischen 0,05 und 5 ug/ml zu ergeben, wobei die Ethanolkonzentration 0,5 Vol.-% nicht übersteigen soll. Vergleichskulturen werden mit Ethanol in einer Endkonzentration von 0,5 Vol.-% ergänzt.
Die Differenzierung und Proliferation epidermaler Zellen in Kultur wird folgendermaßen untersucht:
1. Quantifizierung verhornter Hüllen;
2. Quantifizierung von Zelldichte von an Scheiben anhaftenden Zellen;
3. Überwachung von Transglutaminase-Aktivität; und
4. Überwachung von DNA-Synthese durch Einbau von ³H-Thymidin.
Mit 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; inkubierte Kulturen besitzen mehr verhornte Hüllen, weniger anhaftende Zellen, höhere Transglutaminase-Aktivität und geringere DNA-Synthese als Vergleichskulturen.
Die vorliegende Erfindung wurde zwar ausführlich beschrieben und mit Beispielen dargelegt, doch sind für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung zahlreiche Modifikationen offenkundig.

Claims

1. Verwendung von 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von Krankheiten, die durch Vitamin D-Mangel hervorgerufen werden.

2. Verwendung 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von renaler Osteodystrophie.

3. Verwendung 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; für die Herstellung eines topischen Medikaments zur Behandlung von Hauterkrankungen.

4. Verwendung 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von verarmenden Knochenerkrankungen.

5. Prophylaktische oder therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung für Vitamin D-Mangelerkrankungen, umfassend ein physiologisch annehmbares Vehikel und eine wirksame Menge an 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2;.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine für die Vorbeugung gegen oder Behandlung des Verlusts von Knochenmasse oder Knochenmineralgehalts bei einem Menschen, der an einer verarmenden Knochenerkrankung leidet oder zu dieser neigt, wirksame Menge an 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren Expedienten.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine zur Stabilisierung radialer und spinaler Knochendichte bei einem Menschen, der an renaler Osteodystrophie leidet, wirksame Menge an 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren Expedienten.

8. Zusammensetzung zur Verwendung bei der topischen Behandlung von Hauterkrankungen, umfassend einen Träger, der sich zur topischen Anwendung eignet, sowie 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2;.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin die Menge an 1,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; zwischen 0,01 ug und 10ug ausmacht.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 8, die weiters ein Mittel aus der Gruppe umfaßt, die aus Epithelisierung herbeiführenden Mitteln, Chromanolen, β-Agonisten, entzündungshemmenden Mitteln und keratoplastischen Mitteln besteht.

11. Nahrung für Säugetiere, umfassene 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2;, worin bei normalem Konsum der Nahrung durch die Säugetiere etwa 0,01 bis 1,0 ug/kg/Tag an 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2; bereitgestellt wird.

12. 1α,24-Dihydroxyvitamin D&sub2;, das am C&sub2;&sub4;-Kohlenstoffatom racemisch ist.