DE69227200T2

DE69227200T2 - Proteinherstellung

Info

Publication number: DE69227200T2
Application number: DE69227200T
Authority: DE
Inventors: Per Linaa Dk-1302 Copenhagen K Joergensen; Jan Moeller Dk-2820 Gentofte Mikkelsen; Torben K. Dk-4000 Roskilde Nielsen; Poul Erik Dk-Soeborg Pedersen; Joergen Dk-3450 Alleroed Petersen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1991-12-16
Filing date: 1992-12-11
Publication date: 1999-05-20
Anticipated expiration: 2012-12-12
Also published as: CA2125853A1; FI942835L; EP0631585A1; DE69227200D1; ATE171707T1; JPH07503458A; FI942835A0; US5371198A; WO1993013125A1; FI942835A7; EP0631585B1; ES2124782T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung und Isolierung von Proteinen und besonders von rekombinanten Proteinen. Diese Verfahren sind besonders für die mikrobielle Herstellung und anschließende Isolierung der Proteine aus dem Wachstumsmedium geeignet.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bei der Herstellung und besonders der mikrobiellen Herstellung von Proteinen ist die Instabilität dieser Proteine während des Herstellungsprozesses, besonders des Fermentationsprozesses, von großer Bedeutung, um die Rentabilität der Produktion sicherzustellen.
Bei der Anwendung rekombinanter Techniken für die Herstellung von heterologen Proteinen wurde gefunden, daß die Proteinprodukte oftmals Aggregate bilden, die innerhalb der Zelle als "Einschlußkörper" ("inclusion bodies ") erkennbar sind (Williams et al. Science 215 (1982) 687-689).
Es wurde gefunden, daß viele Proteine infolge der Akkumulation des Proteins im Cytoplasma oder im periplasmatischen Raum entweder als Einschlußkörper oder in einem anderweitig aggregierten oder komplexierten Zustand gegenüber Proteolyse oder anderen Modifikationen im produzierenden Organismus geschützt sind.
In dem flüssigen Produktionsmedium wurden Proteaseinhibitoren, wie Rinder- Aprotinin zugesetzt, um heterologe Produkte, wie Insulin gegen proteolyti schen Verdau in einer Säugerkultur zu schützen (Johnson et al. in Kininogenases-Kallikrein 4, Hrsg. Haberland et al. (1977) 113-118, Schattauer-Verlag), und ein ähnliches Resultat wurde von Novikov et al. (Biotech. Lett. 12 (1990) 547-550) mit der Zugabe von synthetischen Serin-Proteinase- Inhibitoren zum Wachstumsmedium in einer Fermentation eines Bacillus subtilis-Stammes erhalten, der Proinsulin exprimierte.
Es wurde gezeigt, daß Autoproteolyse ein ziemlich übliches Ereignis in biologischen Systemen ist. Durch die Verwendung eines Inhibitors von Cysteinproteinasen wurde ein höherer Spiegel der Proteinasen Cathepsin B, H und C in Ratten gefunden (Kominami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 144 (1987) 749-756). Connor (Biochem. J. 263 (1989) 601-604) hat gezeigt, daß Procathepsin D autoproteolytischen Veränderungen zum reifen Cathepsin D sogar bei niedrigen Konzentrationen (< 1 g/ml) unterliegt. Im Rinderherz scheint die Calcium-abhängige Protease II durch autoproteolytische Spaltung einer Unterheit aktiviert zu werden, und durch weitere aufeinanderfolgende Spaltungen wird die Calcium-Abhängigkeit der Protease gesenkt (Demartino et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 12047-12052).
Es wurde gezeigt, daß in Mikroorganismen die Autoproteolyse die wahrscheinlichste Ursache für die Reifung einer Subtilisin-Typ-Protease in Bacillus subtilis während der Sekretierung der Pro-Form ist (Power et al., PNAS 83 (1986) 3096-3100). Spätere Untersuchungen durch Zhu et al. (Nature 339 (1989) 483-484) und Egnell und Flock (Gene 97 (1991) 49-54) haben gezeigt, daß die Pro-Form, um autoproteolytische Reifung zu erreichen, Subtilisin in die richtige Konformation steuert.
Bei gereinigten Proteasen ist Selbstverdau eine übliche Ursache für die Inaktivierung des Enzymes. Drückner und Borchers (Arch. Biochem. Biophys. 147 (1971) 242-248) haben den limitierten Selbstverdau von Thermo lysin von Bacillus stearothermophilus bei hoher Temperatur und geringer Calciumkonzentration beschrieben. Van den Burg et al. (Biochem. J. 272 (1990) 93-97) haben den autokatalytischen Abbau einer neutralen Protease von Bacillus subtilis untersucht, und Kim et al. (Han'guk Saenghwa Hakhoechi 23 (1990) 58-61) haben die hauptsächlichen Spaltstellen von Subtilisin Carlsberg identifiziert. Autoproteolyse kann ein limitierender Faktor beim Erhalt hoher Fermentationsausbeuten von Proteasen sein.
Während der Fermentation werden herkömmlicherweise die Probleme hinsichtlich des proteolytischen Abbaus von Produkten minimiert, indem die Wachstumsbedingungen wie Temperatur, pH und die Menge der verfügbaren Stickstoffquelle angepaßt werden oder durch Zugabe von Proteaseinhibitoren (PCT/DK 89/00194), aber der proteolytische Abbau des Produktes setzt dennoch sehr oft die Grenzen für die Ausbeute.
Auf der anderen Seite fanden Coxon et al. (Letters in Appl. Microbiol. 12 (1991) 91-94), daß bei Verwendung eines Bacillus subtilis-Stammes, der arm an extrazellulärer Protease ist, eine gesteigerte Neigung zur Zellyse besteht, wenn die Zellen sich der stationären Wachstumsphase nähern.
Daher sind Verfahren zur Minimierung des Kontaktes zwischen dem Produkt und dem Rest des Wachstumsmediums, besonders Proteasen, während der Fermentation ein nützliches Mittel zur Prozeßoptimierung. Dies macht es möglich, Fermentationsbedingungen anzuwenden, die die Produktivität des Proteins erhöhen, wobei es keinen Einfluß hat, wenn mehr Protease produziert wird. Die Verwendung eines Minimalmediums ergibt als Hauptvorteil eine bessere Produktqualität, da sie ein verbessertes Isolierungsverfahren zur Folge hat. Jedoch ist die Ausbeute an Protease oft ziemlich niedrig, was in einem gewissen Umfang einer gesteigerten Tendenz zur autoproteolytischen Spaltung der Protease zuzuschreiben ist.
In dieser Beschreibung und - in den Ansprüchen werden die Proteinvarianten, die verwendet werden sollen oder deren Verwendung in der vorliegenden Erfindung beabsichtigt ist, unter Anwendung folgender Nomenklaturregeln zum Zweck der einfachen Bezugnahme beschrieben:
Ursprüngliche Aminosäure(n) Position(en) substituierte Aminosäure(n)
Demzufolge wird die Substitution von Glutaminsäure für Glycin in Position 195 beschrieben als:
Gly 195 Glu oder G195E
Eine Deletion von Glycin in derselben Position ist:
Gly 195* oder G195*
und eine Insertion eines zusätzlichen Aminosäurerestes, wie Lysin ist
Gly 195 GlyLys oder G195GK.
Wo eine Deletion angezeigt wird, wird eine Insertion in einer solchen Position angezeigt als:
*36 Asp oder *36D
für die Insertion von Asparaginsäure in Position 36.
Multiple Varianten werden durch Plus-Zeichen getrennt, d. h.:
Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu oder R170Y+G195E,
was eine multiple Variante bedeutet, die in Positionen 170 und 195 durch Substitution von Arginin bzw. Glycin durch Tyrosin und Glutaminsäure "mutiert ist".

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Folglich ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Herstellung von Proteinen, besonders solchen, die durch rekombinante Verfahren hergestellt werden, bereitzustellen. Durch das Verfahren der Erfindung wird der Erhalt von im Vergleich mit bekannten Verfahren außerordentlich gesteigerten Ausbeuten des interessierenden Proteins infolge der gesteigerten Stabilität im Wachstumsmedium ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren für die mikrobielle Herstellung eines gegenüber Inaktivierung im flüssigen Produktionsmedium empfindlichen Proteins durch kontinuierliches und reversibles Schützen des Proteins gegen die Inaktivierung während der Herstellungsphase, Trennung des Proteins vom Produktionsmedium, Aufheben des Schutzes für das Protein und Isolierung des Proteinproduktes.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung detailliert beschrieben. Es zeigen
Fig. 1a und Fig. 1b die Ausbeuten nach dem Stand der Technik, verglichen mit einem erfindungsgemäßen Verfahren in einem komplexen Wachstumsmedium, und
Fig. 2a und 2b dieselbe Art von Ergebnissen in einem minimalen Wachstumsmedium.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt für die Herstellung eines gegenüber Inaktivierung oder Abbau in einem flüssigen Produktionsmedium empfindlichen Proteins durch kontinuierliches und reversibles Schützen des Proteins gegenüber der/dem Inaktivierung oder Abbau während der Herstellungsphase, Trennung des Proteins vom Produktionsmedium, Aufheben des Schutzes für das Protein und Isolierung des Proteinproduktes.
Gemäß der Erfindung wird das interessierende Protein während der Fermentation geschützt. Der Begriff "Schutz" umfaßt hierbei eine ganze Reihe möglicher Methoden, von denen die Entfernung des Proteins aus dem Medium durch Präzipitation durch Zugabe eines Präzipitierungsagens eine Methode, und die Entfernung durch Extraktion in eine andere Phase, wobei die für den Abbau des Proteins verantwortliche Protease weitgehend zurückbleibt, eine andere Methode darstellt.
Eine weitere Lösung besteht darin, die Löslichkeit des Proteins im Fermentationsmedium zu verändern. Ein Weg, dies zu tun, ist, Mutationen in dem Protein durch genetische Techniken durchzuführen, um die Löslichkeit zu vermindern.
Noch eine weitere Lösung besteht in der Verwendung von Aggregation mit Hilfe eines anderen Proteins, z. B. eines Inhibitors oder eines Antikörpers, der reversibel entfernt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Schutz durch Entfernung des Proteins vom Produkt und insbesondere durch Präzipitation erreicht.
Die Präzipitation kann durch die Zugabe eines Präzipitierungsagens zum Produktionsmedium erreicht werden, wobei dies durch diskontinuierliche Zugabe oder, bevorzugt, durch kontinuierliche Zugabe des Präzipitierungsagens zum Produktionsmedium erfolgen kann.
Das Präzipitierungsagens kann ein Salz sein, z. B. ausgewählt aus den Gruppe(I)-Metallsalzen, den Gruppe(II)-Metallsalzen, den entsprechenden Ammonium-Salzen, oder Gemischen hiervon, vorzugsweise ein Salz, bei welchem die Valenz des Anions des Salzes zwei oder höher ist, bevorzugt Phosphate, Sulfate und Citrate, insbesondere Natriumphosphat, Ammoniumphosphat, Natriumcitrat, Natriumsulfat und Ammoniumsulfat, oder die entsprechenden Kalium- oder Cäsium-Salze, besonders bevorzugt die Sulfate. Gewisse Halogenide und Acetate sind auch anwendbar, insbesondere die Chloride.
In einer anderen Ausführungsform ist das Präzipitierungsagens ein organisches Lösungsmittel mit geringem Molekulargewicht wie Methylethylketon, Aceton, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, Isopropanol, tert.-Butanol, n-Butanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, der Monoethylether von Ethylenglykol, der Monomethylether von Ethylenglykol und dergleichen.
In obigen Ausführungsformen wird ein Präzipitierungsagens, wie ein Salz oder ein organisches Lösungsmittel mit geringem Molekulargewicht, zum Protein produzierenden Medium während der Fermentation zugegeben. Die Zugabe des Präzipitierungsagens bewirkt, daß das Protein und/oder der Proteinkomplex präzipitiert, und ein "Schlamm" oder "Kuchen" wird gebildet. In der Beschreibung und den Ansprüchen werden die Begriffe "Kuchen" und "Schlamm" wechselseitig verwendet, wobei der Fall eingeschlossen werden soll, wo der "Kuchen" so naß ist, daß er als "Schlamm" angesehen würde. Der das Protein oder den Proteinkomplex enthaltende Kuchen wird von der verbleibenden Lösung entweder kontinuierlich, oder am Ende der Fermentation, abgetrennt. Üblicherweise wird diese Trennung durch Filtration erreicht, und das die Verunreinigungen enthaltende Filtrat kann als Abfall betrachtet werden. Wenn in dem Kuchen noch überschüssige Mutterflüssigkeit ist, kann diese durch Anwendung geeigneter Methoden aus dem Schlamm oder Kuchen im wesentlichen entfernt werden. Zum Beispiel kann die überschüssige Mutterflüssigkeit durch zusätzliche Filtration entfernt werden, z. B. durch eine Druckdifferenz (z. B. Saugfiltration); Schwerkraft-Sedimentation oder Zentrifugation. Die Entfernung kann von einer Wasserwäsche und Aufblasen von Luft gefolgt werden, was einen relativ trockneren Kuchen ergibt.
Die Präzipitierungsagenzien, die in der vorliegenden Erfindung angewendet werden, sind unschädlich. Der Begriff "unschädlich" bedeutet, daß das erfindungsgemäß verwendete Präzipitierungsagens (I) das interessierende Protein nicht zerstört, (2) den End-Zweck des Proteinproduktes nicht negativ beeinflußt, und (3) keinen extensiven zusätzlichen Aufwand zu seiner Entfernung erfordert. In einigen Fällen ist es sogar unnötig, daß das Proteinprodukt frei von Präzipitierungsagens ist. Die erfindungsgemäß verwendeten Präzipitierungsagenzien sind im allgemeinen für viele Proteine verwendbar.
Erfindungsgemäß wird als Präzipitierungsagens vorzugsweise ein Salz verwendet, jedoch sind organische Lösungsmittel mit geringem Molekulargewicht auch gut geeignet, soweit sie kompatibel mit dem speziellen Polyol sind, der später zum Solubilisieren des Proteins eingesetzt wird. Bevorzugte Präzipitierungsagenzien auf der Basis organischer Lösungsmittel sind Methylethylketon, Aceton, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, Isopropanol, tert.-Butanol, n-Butanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, der Monoethylether von Ethylenglykol, der Monomethylether von Ethylenglykol und dergleichen.
Präzipitierungsagenzien auf der Basis organischer Lösungsmittel können dem das Protein enthaltenden Medium in einer Volumen-Menge von 2 bis 3 mal dem Volumen der Protein enthaltenden Lösung zugegeben werden, wobei darauf zu achten ist, daß die das interessierende Protein produzierenden Zellen nicht vergiftet werden.
Wenn ein Salz als Präzipitierungsagens benutzt wird, sollte es ausgewählt werden aus den Gruppe(I)-Metallsalzen, den Gruppe(II)-Metallsalzen, den entsprechenden Ammonium-Salzen, oder Gemischen hiervon. Vorzugsweise ist die Valenz des Anions des Salzes zwei oder höher. Bevorzugt sind die Phosphate, Sulfate und Citrate. Besonders bevorzugte Salze sind Natriumphosphat, Ammoniumphosphat, Natriumcitrat, Natriumsulfat und Ammoniumsulfat. Kalium- und Cäsium-Salze können auch eingesetzt werden, jedoch sind diese natürlich teurer. Sulfate sind am stärksten bevorzugt. Das Präzipitierungsagens auf Salzbasis kann einfach der Lösung zugesetzt werden, die das Protein enthält, in einer Menge von 5-50% Gewicht/ Volumen von - Salzagens zur Protein enthaltenden Lösung. Besonders bevorzugt wird das Salzagens in einer Menge von 12-25% Gewicht/Volumen zugegeben. Das Salzagens kann auch in Wasser gelöst und die wäßrige Lösung zugegeben werden. Wie oben, muß die Zugabe des Präzipitierungsagens mit Vorsicht durchgeführt werden, daß nicht die Protein produzierenden Zellen oder Mikroorganismen vergiftet werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Präzipitation dadurch durchgeführt, daß die Herstellungsphase unter Bedingungen von pH und/oder Ionenstärke im Produktionsmediums durchgeführt wird, bei welchen das Protein aus dem Produktionsmedium präzipitiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Präzipitation durch Modifikation des Proteins durch gentechnische Veränderungen des Genes, welches für das Protein kodiert, durchgeführt, wodurch das Protein von selbst präzipitiert, wenn es in das Produktionsmedium eintritt.
Für die obigen Ausführungsformen der Erfindung werden die Trennung und die Aufhebung des Schutzes für das Protein üblicherweise durchgeführt durch Filtration und anschließendes Waschen des Präzipitates mit Wasser, um Verunreinigungen zu entfernen, Extraktion/Resolubilisierung des Proteins aus dem Präzipitat, und Trennung des/der Protein enthaltenden Extraktes/Lösung von den zurückbleibenden Feststoffen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die Extraktion/- Resolubilisierung durchgeführt unter Verwendung eines Polyols, wie eines Polyethylenglykols mit geringem Molekulargewicht und von C&sub2;- bis C&sub8;- Alkoholen, die wenigstens zwei OH-Gruppen besitzen, vorzugsweise nur zwei OH-Gruppen, besonders bevorzugt Polyole, bei welchen sich zwei OH- Gruppen in der Kette an benachbarten Kohlenstoffatomen befinden, und der C&sub2;-C&sub8;-Alkohol aliphatisch ist und eine gerade Kohlenstoffkette besitzt.
In der obigen Ausführungsform ist es besonders vorteilhaft, das Polyol auszuwählen aus Ethylenglykol, Propylenglykol, Glycerin, Polyethylenglykolen mit geringem Molekulargewicht (etwa 900 oder weniger), und Gemischen hiervon.
Dann wird ein Polyol-Lösungsmittel, vorzugsweise Mono-propylenglykol (MPG), durch den Kuchen zirkuliert, um das Protein und/oder den Proteinkomplex aus dem Kuchen zu solubilisieren und zu isolieren. Der Begriff "solubilisieren" bedeutet hier dasselbe wie "auflösen" oder "extrahieren", wobei diese Begriffe austauschbar sind. Der Begriff "Polyol-Lösungsmittel" umfaßt 100% Polyol, im wesentlichen 100% Polyol oder eine Polyol-enthaltende Lösung, in der das Polyol in Kombination mit einem kompatiblen Co- Lösungsmittel vorliegt.
Erfindungsgemäß geeignete Polyole sind z. B. Polyethylenglykole mit geringem Molekulargewicht und C&sub2;-C&sub8;-Alkohole, die wenigstens zwei OH-Gruppen haben. C&sub2;-C&sub8;-Alkohole mit mehr als zwei OH-Gruppen, wie Glycerin, können eingesetzt werden, vorzugsweise sind jedoch nur zwei OH-Gruppen anwesend. Es ist besonders bevorzugt, daß diese zwei OH-Gruppen sich in der Kette an zwei benachbarten Kohlenstoffatomen befinden und daß der C&sub2;- C&sub8;-Alkohol aliphatisch ist und eine gerade Kohlenstoffkette besitzt. Geeignete Polyole sind z. B. Ethylenglykol, Propylenglykol, Mono-propylenglykol, Glycerin, Polyethylenglykole mit geringem Molekulargewicht (etwa 900 oder weniger), und Gemische hiervon.
Das Polyol kann in Lösung mit einem Co-Lösungsmittel für das Protein vorliegen, wobei das Co-Lösungsmittel kompatibel mit dem Polyol ist. Das Co-Lösungsmittel kann natürlich Wasser sein, aber auch ausgewählt sein aus organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Methylethylketon, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, Isopropanol, tert.-Butanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, dem Monomethylether von Ethylenglykol, dem Monoethylether von Ethylenglykol und dergleichen. Wenn das Polyol in Lösung mit einem Co- Lösungsmittel verwendet wird, ist das Polyol vorzugsweise in einer Menge von mindestens 20 Vol.-% und, besonders bevorzugt, 50% anwesend. Höhere Polyol-Konzentrationen bis zu 100% Polyol ohne Co-Lösungsmittel können auch vorteilhafterweise eingesetzt werden. Darüber hinaus kann die Menge an Co-Lösungsmittel vom benutzten Co-Lösungsmittel abhängen. Zum Beispiel kann auch Ethanol als Präzipitierungsagens benutzt werden, z. B. in Schritt (a) der oben erwähnten Zusammenfassung der Erfindung. Folglich kann zuviel Ethanol als Co-Lösungsmittel mit dem Polyol eher Präzipitation als Solubilisierung des Proteins verursachen.
Das Polyol-Lösungsmittel kann einmal durch den Protein enthaltenden Kuchen zirkuliert werden, vorzugsweise wird es jedoch mindestens zweimal durch den Kuchen re-zirkuliert, um die Extraktion des Proteins zu verbessern. Es ist besonders bevorzugt, mindestens 5 Re-Zirkulationen durchzuführen, und bis zu 100 oder mehr Re-Zirkulationen können vorteilhafterweise durchgeführt werden. Das Resultat ist ein flüssiges Proteinprodukt, das eine Polyol-Lösung des Proteins oder des Proteinkomplexes ist. Wenn ein Präzipitierungsagens auf Salzbasis benutzt wurde, kann die resultierende Polyol- Lösung des Proteins oder Proteinkomplexes auf eine Temperatur in einem Bereich zwischen Raumtemperatur und Gefrierpunkt dieser Lösung abgekühlt werden, um überschüssiges Salz zu präzipitieren. In einer bevorzugten Ausführungsform mit alkalischer Protease wird auf etwa 16ºC abgekühlt.
Abhängig vom gewünschten Endgebrauch kann die Polyol-Lösung des Proteins oder Proteinkomplexes so, wie sie ist, gebraucht werden als flüssiges Proteinprodukt, oder das Lösungsmittel kann im wesentlichen entfernt werden, so daß das Protein als solches benutzt werden kann. Die Entfernung des Lösungsmittels kann durch übliche Methoden erfolgen, wobei man ein im wesentlichen Lösungsmittel-freies Proteinprodukt erhält.
Zwei Beispiele für geeignete Methoden sind die Ultrafiltration und die Re- Präzipitation des Proteins, gefolgt von Filtration und/oder Zentrifugation, um die Flüssigkeit zu entfernen.
Abhängig vom Protein kann die Einstellung des pH in den sauren Bereich während der Re-Zirkulation oder dem Wiederaufschlämmen die Extraktion verbessern. Eine kleine Menge an Säure, wie Essigsäure, Schwefelsäure oder Salzsäure, kann vorteilhaft zur pH-Einstellung eingesetzt werden.
Falls gewünscht, kann ein beliebeiger Polyol-Extrakt formuliert werden. Ein bevorzugtes Verfahren umfaßt die Extraktion mit Propylenglykol als Polyol- Lösungsmittel, und dann die Formulierung des PG-Extraktes durch Ver dünnung mit einem Co-Lösungsmittel, z. B. mit Wasser zu einem 30 Vol.-% PG-Extrakt und 70 Vol.-% H&sub2;O.
Beliebige andere oben genannte Co-Lösungsmittel können bei der Formulierung des Extraktes ebenfalls eingesetzt werden. Der Grund für die Formulierung besteht darin, die Proteinaktivität nach Maßgabe des Endgebrauchs des flüssigen Proteinprodukts im gewünschten Umfang herabzusetzten. Es muß darauf geachtet werden, daß nicht zuviel Co-Lösungsmittel während der Formulierung benutzt wird, sonst könnte das Protein präzipitieren, anstatt in Lösung zu verbleiben.
In einer anderen Ausführungsform wird die Entfernung des Proteins aus dem Produktionsmedium durch Transfer des Proteins zu einem anderen flüssigen Medium durchgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der Schutz durch Bildung eines Komplexes zwischen dem interessierenden Protein und wenigstens einem Gegenstück hergestellt. In dieser Ausführungsform wird es weiter bevorzugt, daß das Gegenstück mit dem Protein co-exprimiert wird, was bedeutet, daß das Gegenstück entweder durch den das interessierende Protein exprimierenden Wirt natürlich exprimiert wird oder, daß der Wirt durch Protein-Techniken (protein engineering) so modifiziert worden ist, daß er ein oder beide Komplex-bildende Gegenstücke produziert.
Nach der obigen Ausführungsform ist das Gegenstück vorzugsweise ein Inhibitor des Proteines oder ein Antikörper für das Protein.
In Verbindung mit den unten erwähnten Subtilisin-Proteasen wird in dieser Ausführungsform die Verwendung eines Proteaseinhibitors bevorzugt, wie eines CI-1-, CI-2-, PSI-, Eglin C-, Eglin B-, TSI-1-, SSI- oder VSI-Inhibi tors, von Varianten hiervon, oder eines beliebigen Gemisches hiervon, um die Subtilisin-Protease zu schützen.
In der obigen Ausführungsform wird die Aufhebung des Schutzes für das vorliegende Protein, wie einer Protease, üblicherweise durch die Auflösung des Komplexes bewerkstelligt, wenn die Protease in z. B. einem Detergenz- Gemisch verwendet wird, das aufgelöst wird, wenn die Waschflüssigkeit zubereitet wird.
Im allgemeinen ist die vorliegende Erfindung auf beliebige extrazellulär produzierte Proteine anwendbar, welche durch Fermentation in einem Nähr/- Wachstumsmedium durch Protein-sekretierende prokaryotische oder eukaryotische Zellen erhältlich sind, wie Pflanzen- oder Tierzellen, oder Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen oder Pilze. Die Erfindung funktioniert besonders gut mit Enzymen, ausgewählt aus Proteasen, Amylasen, Amyloglucosidasen, Lipasen, Oxidoreduktasen und Oxidasen. In der bevorzugten Ausführungsform dient als Fermentationsprodukt alkalische Protease, die in verschiedensten Industriezweigen Verwendung findet, besonders in der Waschmittelindustrie.
Als besonders bevorzugte alkalische Proteasen können Subtilisin-Proteasen erwähnt werden, besonders die unten aufgeführten:
Subtilisin 309, Subtilisin 309, modifiziert in wenigstens einer Position 36 oder 136, und Subtilisin 309, modifiziert wie hier beschrieben:
*36D,
*36D+R170Y+G195E+K251E,
*36D+H120D+R170Y+G195E+K235L,
*36D+H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E,
*36D+H120D+G195E+K235L,
*36D+N76D,
*36D+N76D+H120D+G195E+K235L,
*36Q,
*36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R+R170Y+ G195E+K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, und
*36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R+S156E+ A158R+A172D+N173K+K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+A 272R.
Die folgenden Beispiele beschreiben einige bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung; sie stellen keinerlei Beschränkung dar.

BEISPIELE

Bemerkungen

Durch das Verfahren der Erfindung wurde gefunden, daß es möglich ist, Enzymausbeuten von 100 bis 200% und sogar bis 400% oder mehr, bezogen auf die Ausbeute, die typischerweise durch herkömmliche Methoden erzielt wird, zu erhalten.
Durch Ausnützen der geringen Löslichkeit eines durch Präzipitation geschützten Proteins in Wasser, und der hohen Löslichkeit in einem organischen Lösungsmittel, wie Mono-propylenglykol (MPG), ist es möglich, einfach unter Verwendung der typischen Ausrüstung zur Isolierung von Enzymen flüssige Formulierungen von hoher Qualität zu produzieren, die 2 bis mehr als 10% Protein mit einer enzymatischen Reinheit über 90% enthalten.
Das Isolierungsverfahren wird in drei Phasen eingeteilt:
i) - Waschen der das Enzym enthaltenden Schlamm-Phase.
ii) - Extraktion/Resolubilisierung des Enzyms.
iii) - Konzentrierung und Standardisierung.
i) Die Schlammphase, die etwa 90% der gesamten Enzymmenge enthält, wird gesammelt und mit Wasser gründlich gewaschen. Alle wasserlöslichen Verunreinigungen, z. B. Färbemittel oder Polysaccharid-Proteine, werden ohne signifikanten Enzymverlust entfernt.
ii) Die folgende Extraktion des Enzyms aus der Schlammphase mit MPG hat einen hellen Extrakt zur Folge, der nahezu nur einen polymeren Bestandteil enthält - das Enzym.
Weil die Löslichkeit eines solchen Proteins in einem Wasser-MPG- System positiv korreliert ist mit der MPG-Konzentration, und ein minimaler Verbrauch an MPG ein Muß ist, ist es wichtig, MPG so zu dosieren, daß das gesamte präzipitierte Enzym in einem System knapp unterhalb des Sättigungspunktes wiederaufgelöst wird.
Die Gesamt-Extraktionsausbeute beträgt typischerweise 90% oder mehr, und das Volumen des zur Extraktion benutzten MPG entspricht etwa 40% des Kulturmediumvolumens.
iii) Die Endkonzentrierung wird typischerweise in zwei Schritten durchgeführt: (a) eine optionale Ultrafiltration (siehe unten) und (b) Eindampfen.
(a) Das Ultrafiltrationsverfahren ermöglicht es, die Konzentration des Enzyms auf ein relativ hohes Niveau ohne RekristallisationlRepräzipitation zu erhöhen (mit gleichbleibender MPG-Wasser-Zusammensetzung). Das Aus maß der Konzentration wird in erster Linie durch das MPG/Enzym-Verhältnis im Endprodukt bestimmt.
Das MPG im Permeat enthält sehr geringe Verunreinigungsmengen und kann daher nach Eindampfen (auf 70%-75% MPG) ohne Probleme im Extraktionsschritt wiederverwendet werden.
(b) Die Endstandardisierung wird durch ein einfaches Eindampfen erreicht, und die Reinheit des Produkts liegt typischerweise über 90%.
Das Extraktionsverfahren von Schritt (ii) kann durch die Zugabe eines chaotropen Bestandteiles, z. B. Harnstoff zusammen mit dem MPG, modifiziert werden. Hierdurch wird die Extraktionskapazität (Löslichkeit des präzipitierten Enzyms) des MPG-Wasser-Systems erhöht und hierdurch das MPG/ Enzym-Verhältnis erniedrigt.
Ein niedrigeres MPG/Enzym-Verhältnis macht es möglich, das erwünschte Endkonzentrat ohne Ultrafiltrationsschritt zu erhalten.

BEISPIEL 1

Komplexes Wachstumsmedium

Eine Subtilisin 309-Proteasevariante, hergestellt wie beschrieben in WO 89/06279 und WO 91/00345 und die folgenden Modifikationen aufweisend: *36D+N76D+H120D+G195E+K235L (SO&sub3;&sub5;), wurde durch einen Bacillus- Stamm produziert, zur Herstellung dieser Variante transformiert, in paralleler Fermentation mit einem Bacillus-Stamm, der Wildtyp Subtilisin 309-Protease produziert.
Die S035-Variante präzipitiert kontinuierlich während der Fermentation aus dem Produktionsmedium, und die verbesserte Stabilität der präzipitierten Protease wird nach Inkubation des Fermentationsmediums, nachdem die Proteinsynthese durch Zugabe von Chloramphenicol (CAM) zur Kultur gestoppt wurde, ersichtlich.
Die Produktionen wurden bei 30ºC auf einem rotierenden Schütteltisch (300 U/min) in 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen durchgeführt, die 100 ml Protease-Produktionsmedium folgender Zusammensetzung (pro Liter) enthielten:
Kartoffelstärke 100 g
gemahlene Gerste 50 g
Sojabohnenmehl 20 g
Na&sub2;HPO&sub4; · 12 H&sub2;O 9 g
Pluronic 0,1 g
Natriumcaseinat 10 g
Die Stärke im Medium wird mit α-Amylase verflüssigt, und das Medium wird durch Erhitzen auf 120ºC / 45 Minuten sterilisiert. Nach der Sterilisation wird der pH des Mediums durch Zugabe von NaHCO&sub3; auf 0,1 M auf pH 9 eingestellt.
Der den Wildtyp produzierende Stamm für Subtilisin 309 wurde parallel mit dem S035-Mutantenstamm fermentiert. Verwendet wurden 2 · 3 Schüttelkolben für jeden Stamm. Nach 74 Stunden Kultivierung wurden 200 ug/ml CAM zum ersten der drei Schüttelkolben zugegeben (A). Nach weiteren 20 Stunden bei 94 Stunden wurden 200 ug/ml CAM zum zweiten Kolben zugegeben (B). Der dritte Kolben (C) wurde parallel ohne CAM-Zugabe betrieben. Die Kultivierung wurde fortgeführt und nach 168 Stunden ge stoppt. Fig. 1a und 1b zeigen den Proteasespiegel nach verschiedenen Inkubationszeiten. Der höchste Proteasespiegel des normalen Subtilisin 309- Referenzstammes (C) wird 100 Prozent gesetzt.
Der Proteasespiegel wurde, wie beschrieben in AF 220/l-GB (eine Publikation, erhältlich von NOVO NORDISK A/ S. Bagsvaerd, Dänemark) bestimmt.
Die Ergebnisse aus der Fermentation des Wildtyp-Subtilisin 309 sind in Fig. 1a und entsprechend für die S035-Variante in Fig. 2b gezeigt, wobei die Proteaseausbeute als Funktion der Zeit angezeigt wird.
Der ansteigende Proteasespiegel nach Zugabe von CAM wird wahrscheinlich durch Verdunstung aus den Schüttelkolben verursacht.
Der Proteasespiegel der S035-Variante wurde untersucht, nachdem das präzipitierte Enzym in 75 Prozent Mono-propylenglykol (MPG) wiederaufgelöst worden war. Der Proteasespiegel im Überstand vor der Resuspendierung betrug 15 bis 20 Prozent.

BEISPIEL 2

Minimales Wachstumsmedium

Üblicherweise werden billige komplexe Quellen für Proteine und Kohlehydrate, wie gemahlene Gerste, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl und Mais- oder Weizenstärke bei der Fermentierung von Enzymen verwendet (Atkinson und Mavitung, 1983, Biochemical Engineering und Biotechnology Handbook, The Nature Press, S. 998-1015). Der Gehalt an Unlöslichem, wie nicht-abbaubare Proteine und Kohlehydrate und Inosidhexaphosphat- Komplexe (Phytat-Komplexe), ist ziemlich hoch in diesen Substraten. Dies bedeutet für die Isolierung einige Beschränkungen, insbesondere was die Solubilisierung des präzipitierten Proteins betrifft. Dies kann durch die Fermentation in minimalem Salzmedium umgangen werden.
In diesem Beispiel werden zwei Stämme von Beispiel 1 in 2,5 l-Topf- Fermentern (MBR mini) bei 36ºC mit einem pH, kontrolliert auf pH 8,0 durch Zugabe von S N NaOH, unter heftigem Rühren und einer Belüftung von 1,5 vvm hochgezogen. Die Zusammensetzung des Wachstumsmediums war wie folgt (in g/l):
Maltodextrin (Glucidex 6) 40
Hefeextrakt 1
KH&sub2;PO&sub4; 4
KOH 0,5
NaCl 0,6
Zitronensäure · H&sub2;O 6
CaCl&sub2; · 2H&sub2;O 0,8
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 4
Pluronic (Antischaummittel) 0,4
Spurenmetallösung* 7
Vitaminlösung** 4
*Zusammensetzung: (in g/l): H&sub3;BO&sub3; 0,82; MnCl&sub2; · 4H&sub2;O 0,58; FeCl&sub3; · 6H&sub2;O 1,95; CuSO&sub4; · 5H&sub2;O 0,2;, BaCl&sub2; 0,1; ZnCl&sub2; 0,2; (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; · 4H&sub2;O 0,1; CoCl&sub2; · 6H&sub2;O 0,3: Zitronensäure · H&sub2;O 10.
**Zusammensetzung: Thiamin-HCl 150 mg/l und Biotin 5 mg/l.
Von 24 Stunden an und in der restlichen der Fermentation wurden zwei Dosierungsmedien, die Saccharose 60% (w/v) und (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 12% (w/v) enthielten, in einer Menge von etwa 4 bzw. 2 - 2,5 g/(l·h) eingespeist.
Die Wachstumskurven (gezeigt als OD650nm) und die Kurven der Proteasekonzentrationen (in % der höchsten Konzentration, die mit dem Wildtypproduzierenden Stamm erhalten wurde) sind in Fig. 2a und 2b für den Wildtyp bzw. die S035-Variante gezeigt.
Der Proteasegehalt wurde gemäß AF 220/1GD bestimmt. Für S035 wird zusätzlich der Anteil der Protease in Lösung als % der gesamten Proteasekonzentration gezeigt. Die bemerkenswert höhere Expression von S035 (Fig. 2b), verglichen mit Subtilisin 309 (Fig. 2a), zeigt einen noch größeren Vorteil der Präzipitation während der Fermentation in einem minimalen Wachstumsmedium als in einem komplexen Wachstumsmedium. Der sehr geringe Anteil an löslichem S035 im Minimalmedium muß als hauptsächliche Erklärung für diese Differenz in der Proteasekonzentration gelten. Ohne Präzipitation ist der Gebrauch eines Minimalmediums keine Alternative für ein komplexes Medium.
Als Vorteil der folgenden Reinigung der präzipitierten Protease ist das Volumen an unlöslicher Substanz nur halb so groß, verglichen mit einer Fermentation im komplexen Medium derselben Zellmasse.

BEISPIEL 3

Reinigung

Das Kulturmedium wurde mit Calciumchlorid und Wasser (pro kg Kulturmedium: 25 g CaCl&sub2; · 2H&sub2;O und 1 l Wasser) vorbehandelt und der pH mit Natriumhydroxid auf 8,0 eingestellt. Die Suspension wurde dann durch Zugabe von kationischen und anionischen Flockungsmitteln (pro kg Kulturmedium: 8 g Superfloc C 521 bzw. 250 mg Superfloc A 130) flockuliert.
Die das Enzym enthaltende Schlammphase wurde vom klaren Überstand durch Zentrifugation getrennt und dann zweimal bei pH 5,5 mit Wasser, enthaltend 4% w/w CaCl&sub2;, gewaschen.
Der das präzipitierte Enzym enthaltende Schlamm wurde dann gründlich mit Mono-propylenglykol (MPG) bei pH 7,5 und Raumtemperatur (20ºC bis 25ºC) etwa 1 Stunde gemischt. Das für die Resolubilisierung verwendete MPG entspricht etwa dem 1,1-fachen des Schlammgewichts. Der MPG- Wasser-Extrakt wurde durch Zentrifugieren vom Schlamm getrennt.
Das im Schlamm verbleibende lösliche Enzym wurde mit Leitungswasser ausgewaschen und die Suspension zentrifugiert. Die MPG- und Wasser- Extrakte wurden vereinigt, filtriert und ultrafiltriert. Die Ultrafiltration wurde bei pH 5,5-6,0 und von 5ºC bis 25ºC ansteigender Temperatur (proportional zum Konzentrationsfaktor) durchgeführt. Sobald ein Enzym-MPG-Verhältnis entsprechend etwa 3,5 g Enzym/100 g MPG erreicht war, wurde die Ultrafiltration abgebrochen und die Endstandardisierung durch Eindampfen durchgeführt. Das Endprodukt enthielt typischerweise 65% MPG und 2, 3% Enzym.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das gegenüber Inaktivierung oder Abbau durch Proteolyse in einem flüssigen Produktionsmedium empfindlich ist, umfassend:

(a) kontinuierliches und reversibles Schützen des Proteins gegenüber Inaktivierung oder Abbau während der Herstellungsphase durch Präzipitieren des Proteins aus dem flüssigen Produktionsmedium durch kontinuierliche Zugabe eines Präzipitierungsagens zum flüssigen Produktionsmedium und/oder Durchführung der Herstellungsphase unter geeigneten Bedingungen von pH und/oder Ionenstärke;

(b) Abtrennung des Proteins von dem Produktionsmedium;

(c) Aufheben des Schutzes für das Protein; und

(d) Isolierung des Proteins.

2. Verfahren nach Anpruch 1, wobei das vorgannte Präzipitierungsagens ein Salz ist, z. B. ausgewählt aus den Gruppe I-Metallsalzen, Gruppe II-Metallsalzen, den entsprechenden Ammoniumsalzen, und Gemischen hiervon, vorzugsweise ein Salz bei welchem die Valenz des Anions zwei oder höher ist, vorzugsweise Phosphate, Sulfate oder Citrate, insbesondere Natriumphosphat, Ammoniumphosphat, Natriumcitrat, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat und die ensprechenden Kalium- und Cäsium-Salze, besonders bevorzugt die Sulfate.

3. Verfahren nach Anpruch 1, wobei das Präzipitierungsagens ein organisches Lösungsmittel mit geringem Molekulargewicht ist, wie Methylethylketon, Aceton, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, Isopropanol, tert.-Butanol, n-Butanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, der Monoethylether von Ethylenglykol oder der Monomethylether von Ethylenglykol.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Abtrennung des Proteins und Aufhebung des Schutzes bewirkt wird durch Filtration, Zentrifugation, Sedimentation, Hydrozyklon-Trennung, Flockulation oder Flotation, vorzugsweise durch Filtration oder Zentrifugation, und anschließend Waschen des Präzipitats mit Wasser zur Entfernung von Verunreinigungen, Extraktion/Resolubilisierung des Proteins aus dem Präzipitat, und Abtrennung des/der Protein enthaltenden Extraktes/Lösung von den zurückbleibenden Feststoffen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Extraktion/Resolubilisierung durchgeführt wird unter Verwendung eines Polyols, z. B. eines Polyethylenglykols mit geringem Molekulargewicht oder C&sub2;-C&sub8;-Alkoholen mit wenigstens zwei OH-Gruppen, vorzugsweise mit nur zwei OH-Gruppen, besonders bevorzugt von Polyolen, bei welchen sich die zwei OH-Gruppen in der Kette an benachbarten Kohlenstoffatomen befinden, und der C&sub2;-C&sub8;-Alkolhol aliphatisch ist und eine gerade Kohlenstoffkette besitzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polyol ausgewählt ist aus Ethylenglykol, Propylenglykol, Mono-propylengylcol, Glycerin, Polyethylenglykolen mit geringem Molekulargewicht (etwa 900 oder weniger), und Gemische hiervon.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Protein ein Enzym ist, wie eine Oxidoreduktase, Transferase, Hydrolase, Lyase, Isomerase oder Ligase, vorzugsweise eine Protease, Amylase, Cellulase, Pectinase, Oxidase, Peroxidase oder Lipase.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Enzym eine Subtilisin-Protease ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Subtilisin-Protease Subtilisin 309 ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Subtilisin 309 mindestens an Position 36 modifiziert worden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Modifikation *36D oder *36Q ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Enzym wie folgt modifiziert worden ist:

*36D,

*36D+R170Y+G195E+K251E,

*36D+H120D+R170Y+G195E+K235L,

*36D+H 120D+R170Y+G195E+K235L+K251E,

*36D+H120D+G195E+K235L,

*36D+N76D,

*36D+N76D+H120D+G195E+K235L,

*36Q,

*36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R+R170Y+

G195E+K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, und

*36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R+S156E+A158R+ A172D+N173K+K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R.