DE69227065T2

DE69227065T2 - Elektrolysezelle und Verfahren zur Markierung von Proteinen und Peptiden

Info

Publication number: DE69227065T2
Application number: DE69227065T
Authority: DE
Inventors: Janeth M. Midland Michigan 48640 Bartlett; Carey Lee Sanford Michigan 48657 Scortichini
Original assignee: Dow Chemical Co
Current assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1991-05-15
Filing date: 1992-05-15
Publication date: 1999-02-11
Anticipated expiration: 2012-05-16
Also published as: AU650337B2; WO1992021019A1; MX9202260A; FI935023A0; DE69227065D1; KR0164876B1; SG45300A1; SA92130072B1; ATE171483T1; ES2120990T3; EP0514187B1; CN1069339A; UA27771C2; HK1016021A1; CA2068804C; FI108371B; TW225560B; CA2068804A1; IL101893A; ZA923559B

Description

Diese Erfindung betrifft eine Elektrolysezelle und ein Verfahren zur Verwendung der Elektrolysezelle um die Markierung von Proteinen, Peptiden und anderen organischen Molekülen zu erzielen. Genauer betrifft diese Erfindung eine Elektrolysezelle und ein Verfahren zur Verwendung der Elektrolysezelle, um die Radiomarkierung von Proteinen, Peptiden und anderen organischen Molekülen zu erzielen.
Gegenwärtig bekannte Techniken zur Markierung von Proteinen, Peptiden und anderen organischen Molekülen mit Halogenen oder anderen Markierungen leiden an verschiedenen Nachteilen. Chemische Markierungsverfahren weisen z. B. oftmals Schwierigkeiten bei einer Maßstabsvergrößerung auf und neigen dazu, die Proteine und Peptide zu beschädigen, die markiert werden sollen. Zusätzlich muß nicht umgesetzte Markierung von dem markierten Material abgetrennt werden, da diese gleichen chemischen Markierungsverfahren geringe Ausbeuten aufweisen. Während dieser Reinigungsschritt chemische Markierungsverfahren nicht nur weniger effizient macht, setzt es im Fall von radioaktiven Markierungen den Betreiber einer gefährlichen Substanz aus. Unter den gegenwärtigen Verfahren zur Radiomarkierung von Proteinen ist die Festphasenjodierung, die oxidative Techniken zur Herstellung einer elektrophilen Jodspezies (I&spplus;) aus Natriumjodid verwendet.
Gegenwärtige elektrochemische Techniken zur Markierung von Proteinen, Peptiden und anderen organischen Molekülen mit Halogenen oder anderen Markierungen, wie etwa Technetium und Rhenium, leiden an anderen Nachteilen. Zum Beispiel verwenden elektrochemische Markierungsverfahren oftmals Platin oder Gold als Anode und Kathode der Elektrolysezelle. Unter Verwendung von gegenwärtigen elektrochemischen Techniken können biologische Materialien im Mikrogramm-Maßstab mit bis zu 80% Inkorporation des Radiojods jodiert werden. Um kurze Reaktionszeiten zu erhalten, verwenden viele Arbeiter ein relativ hohes Verhältnis von Anodenoberfläche zu Elektrolytvolumen. Dieses Verhältnis wird üblicherweise durch Verwendung eines Platintiegels bewerkstelligt, der als Reaktionsgefäß sowie als Anode wirkt. Platintiegel sind jedoch für einen kommerziellen Betrieb aus einer Reihe von Gründen ungeeignet. Zum Beispiel sind Platintiegel nicht praktikabel, da ihre Geometrie das Aufrechterhalten eines gleichmäßigen Potentials über die Anodenoberfläche, insbesondere in Lösungen mit geringer Leitfähigkeit ausschließt. Ihre Geometrie erlaubt auch nicht eine leichte Variation des Verhältnisses Oberfläche/Elektrolytvolumen. Diese Folge ergibt sich aus der Tatsache, daß für jede Form die Fläche nicht zu schnell wie das Volumen ansteigt.
Weiterhin verwenden diese Tiegel relativ große Mengen an Platin oder Gold, die entweder nach jeder Verwendung weggeworfen werden müssen oder mühsamen Reinigungsverfahren unterzogen werden müssen, die flüssigen radioaktiven Abfall erzeugen.
Gegenwärtige elektrochemische Techniken leiden auch an Nachteilen ähnlich den chemischen Techniken. Zum Beispiel können im Zusammenhang mit der kommerziellen Herstellung von radiomarkierten monoklonalen Antikörpern (MAKs), die Anoden, Kathoden, Membranen und anderen Bestandteile der Elektrolysezelle mit dem radioaktiven Markierungsmittel verunreinigt werden. Die Kosten der Entsorgung von radioaktivem Abfall machen es erforderlich, der Wirksamkeit der Verwendung des Isotops und wo es zur Entsorgung hingelangt, wenn die Wirksamkeit kleiner 100% ist, mehr Aufmerksamkeit zu schenken.
US-A-3784453 offenbart ein geschlossenes steriles Elektrolysesystem zur Markierung von menschlichem Serumalbumin mit einem radioaktiven Isotop unter Verwendung einer einfachen (nicht geteilten) Elektrolysezelle.
Um viele dieser Schwierigkeiten für Elektrolysezellen und das Verfahren zur Markierung, insbesondere Radiomarkierung, von Proteinen und Peptiden zu überwinden, kann nun die vorliegende Erfindung verwendet werden. Die gemäß der Erfindung verwendete Elektrolysezelle zur Markierung von Proteinen, Peptiden und anderen organischen Molekülen umfaßt:
a. eine Kathodenhalbzelle und eine Anodenhalbzelle, geteilt durch einen Separator;
b. eine Arbeitselektrode in der Kathodenhalbzelle oder der Anodenhalbzelle;
c. eine Gegenelektrode in der anderen der Kathodenhalbzelle und der Anodenhalbzelle; und
d. eine Referenzelektrode, die in der Halbzelle, die die Arbeitselektrode enthält, und außerhalb des Stromwegs zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode angeordnet ist, worin die Arbeitselektrode eine poröse Elektrode ist und sich direkt benachbart zum Separator befindet.
Die Elektrolysezelle ist bevorzugt derart, daß die Kathodenhalbzelle einen ersten kreisförmigen Ring aufweist, der eine Öffnung umgibt und die Anodenhalbzelle einen zweiten kreisförmigen Ring aufweist, der eine Öffnung umgibt, und worin der erste und zweite kreisförmige Ring einander gegenüberstehen, wobei die Vorrichtung auch eine erste Dichtung, benachbart dem ersten kreisförmigen Ring und dem Separator, einen elektrischen Kontakt zum Verbinden der Arbeitselektrode mit einer Stromquelle, eine zweite Dichtung, benachbart dem zweiten kreisförmigen Ring und Mittel zum Klemmen des ersten kreisförmigen Rings an den zweiten kreisförmigen Ring derart, um die erste Dichtung, den Separator, die Arbeitselektrode und die zweite Dichtung dazwischen einzuklemmen, umfaßt.
Die Elektrolysezelle umfaßt bevorzugt auch eine Klammer mit einem ersten Stab, benachbart der Kathodenhalbzelle oder der Anodenhalbzelle und einen zweiten Stab, benachbart der anderen der Kathodenhalbzelle oder der Anodenhalbzelle; und
Mittel zum Zusammenverbinden des ersten und zweiten Stabes zum Anlegen eines Klemmdrucks an die Zelle und Halten des Separators zwischen der Kathodenhalbzelle und Anodenzelle.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Markierung eines organischen Materials, z. B. eines Proteins, eines Peptids oder eines anderen organischen Moleküls bereit, welches Verfahren umfaßt Einbringen des Materials in eine wie oben beschriebene Elektrolysezelle und worin das organische Material in die Halbzelle eingebracht wird, die die Arbeitselektrode enthält, Inkontaktbringen des Materials mit einem Markierungsmittel und Leiten eines Stroms durch die Elektrolysezelle.
Die elektrochemische Zelle der vorliegenden Erfindung kann in einem verbesserten Verfahren zur Markierung von Proteinen, Peptiden und anderen organischen Molekülen, insbesondere monoklonalen Antikörpern, mit Halogenen oder anderen Markierungen, wie etwa Technetium und Rhenium verwendet werden. Der Ausdruck "Markierung", wie hierin verwendet, soll Markierungen umfassen, die entweder radioaktiv oder nichtradioaktiv sein können. Die Zelle verwendet eine Kathodenhalbzelle, enthaltend einen Katholyten, und eine Anodenhalbzelle, enthaltend einen Anolyten, geteilt durch einen Separator, welcher dabei hilft, das Gesamtvermischen des Anolyten und Katholyten zu verhindern, während er den Fluß von ionischem Strom erlaubt. Das Markieren der Proteine, Peptide, und anderer organischer Moleküle kann in jeder Halbzelle bei der Arbeitselektrode stattfinden. Wenn die Markierung oxidiert wird, um ein Markierungsmittel zu werden, dient eine in der Anodenhalbzelle angeordnete poröse Anode als Arbeitselektrode und eine innerhalb der Kathodenhalbzelle angeordnete Kathode dient als die nicht-Arbeits- oder Gegenelektrode. Wenn die Markierung reduziert wird, um ein Markierungsmittel zu werden, dient eine innerhalb der Kathodenhalbzelle angeordnete poröse Kathode als Arbeitselektrode und eine innerhalb der Anodenhalbzelle angeordnete Anode dient als die nicht-Arbeitselektrode. Eine Referenzelektrode, die außerhalb des Stromwegs zwischen der Arbeitselektrode und der nicht-Arbeitselektrode angeordnet ist, verleiht eine präzise Kontrolle des Arbeitselektrodenpotentials, was ermöglicht, daß eine maximale Markierungsrate erreicht wird, während eine oxidative Schädigung des Proteins, Peptids oder der organischen Moleküle minimiert wird.
Die Zelle bietet viele Vorteile, die in sehr hohen Ausbeuten an markiertem Produkt, einfacherer Maßstabsvergrößerung des Verfahrens und im Fall von Radiomarkierung, einem verringertem Volumen an flüssigem radioaktiven Abfall resultieren.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt ein schematisches Diagramm der Elektrolysezelle der vorliegenden Erfindung;
Fig. 2 zeigt eine Seitenansicht einer Glashalbzelle;
Fig. 3 zeigt eine Vorderansicht der Glashalbzelle;
Fig. 4 zeigt eine Vorderansicht einer Gummidichtung;
Fig. 5 zeigt eine Vorderansicht eines Separators;
Fig. 6 zeigt eine Vorderansicht einer porösen Anode;
Fig. 7 zeigt eine Vorderansicht eines Metallringkontakts;
Fig. 8 zeigt eine Skizzenansicht einer Klammer;
Fig. 9 zeigt eine Seitenansicht der Klammer von Fig. 8;
Fig. 10 zeigt eine Skizzenansicht einer kombinierten Klammer und Wärmesenke; und
Fig. 11 zeigt eine Seitenansicht der kombinierten Klammer und Wärmesenke von Fig. 10.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Zelle 10 aus zwei identischen Glashälften, einer ersten Kathodenhalbzelle 12 aus Glas und einer zweiten Anodenhalbzelle 14 aus Glas (Fig. 1, 2 und 3). Die erste Glashälfte 12 weist einen kreisförmigen Ring 16 mit einer geschliffenen Glasfläche auf, wobei der Ring 16 eine Öffnung 17 (nicht gezeigt) umschreibt, eine offene obere Öffnung 18 und eine Reaktionskammer 19, während die zweite Glashälfte 14 einen kreisförmigen Ring 20 mit einer geschliffenen Glasfläche, wobei der Ring 20 eine Öffnung 21 umschreibt, eine offene obere Öffnung 22 und eine Reaktionskammer 23 aufweist. Zwischen dem Ring 16 und Ring 20 sind eine erste Gummidichtung 24 (Fig. 1 und 4), ein Separator 26 (Fig. 1 und 5), eine poröse Anode 28 (Fig. 1 und 6), ein Metallringkontakt 30 (Fig. 1 und 7) und eine zweite Gummidichtung 32 gequetscht. Die relative Größe der verschiedenen Teile ist in den Fig. 2 bis 11 gezeigt. Wie man sehen kann, bestimmt der Innendurchmesser der Gummidichtungen 24 und 32 die aktive Fläche der Anode 28.
Ein Thermometeradapter 34, der eine Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode 36 hält, ist entfernbar in die Glashälfte 14 (Fig. 1) eingefügt. Die Glashälfte 12, auf der anderen Seite, ist mit einer Platin- oder Goldfolie oder einer Kathode aus rostfreiem Stahl 40 ausgestattet. Während Fig. 1 die Glashälfte 14 mit einem darin befindlichen Magnetrührstab 38 zeigt, hat auch die Glashälfte 12 eine ausreichende Größe, um einen ähnlichen Magnetrührstab zu enthalten. Die Kammern 19 und 23 sind so ausgelegt, daß sie ein näheres Anbringen des Bodens ihrer jeweiligen Glashälften 12 und 14 an eine Magnetrührplatte ermöglichen, so daß das durch einen Magnetrührstab bereitgestellte Rühren zuverlässiger sein wird.
Während die Halbzelle 12 und Halbzelle 14 auf verschiedene Arten zusammengehalten werden können, ergibt eine Klammer 42, die an zwei Enden der Zelle anstelle an Ring 16 und Ring 20 angelegt ist, einen gleichmäßigeren Druck, ohne die Notwendigkeit für Dichtungsmittel oder Haftmittel (Fig. 8 und 9). Die in den Fig. 8 und 9 gezeigte Klammer 42 besteht aus einem fixierten Stab 44 und einem beweglichen Stab 46, wobei der bewegliche Stab 46 durch Anziehen oder Lösen der Muttern 48 auf einem Paar Gewindestangen 50 betrieben werden kann. Der fixierte Stab 44 und der bewegliche Stab 46 sind so geformt, daß sie zur Ausgestaltung der Rückseiten der Halbzellen 12 und 14 passen. Bevorzugt sind sowohl die jeweiligen Stäbe als auch die jeweiligen Rückseiten der Halbzellen flach für eine gleichmäßige Druckverteilung und einen guten Kontakt. Die Klammer 42 könnte auch ein integriertes Teil eines Metallblocks 52 sein, der als Wärmesenke dienen könnte (Fig. 10 und 11). Der in den Fig. 10 und 11 gezeigte Block 52 besteht aus einem beweglichen Stab 46 und einem Ende 54, welches als fixierter Stab 42 wirkt und diesen ersetzt. Der Block 52 hat auch eine Basis 56 und eine aufrechte Wand 58 (von welchem Ende 54 ein Teil ist), die die Zelle 10 umgibt und als Träger für die Zelle 10 dient. Die Temperatur des Blocks 52 könnte auf eine Vielzahl von Arten gehalten werden, einschließlich dadurch, daß er in einen Inkubator gegeben wird oder durch Zirkulieren eines Fluids durch einen Kanal im Block 52.
Während die oben beschriebene Zelle 10 aus Glas aufgebaut ist, kann sie aus jedem einer großen Vielzahl von Materialien aufgebaut sein, einschließlich verschiedener Kunststoffe, wie etwa Polypropylen, Polycarbonat, TeflonTM und LuciteTM oder jeder Kombination der Materialien. Die allgemeinen Erfordernisse sind die, daß die Aufbaumaterialien mit den Verfahrenschemikalien unter den verwendeten Bedingungen kompatibel sind, ihre Strukturintegrität behalten und dem Produkt keine unerwünschten Materialien zufügen.
Radioaktive und nicht-radioaktive Halogene können zur Markierung von Proteinen, Peptiden und anderen organischen Molekülen, insbesondere monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Unter den zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen anderen Markierungen sind Technetium und Rhenium. Diese Markierungen können entweder radioaktiv oder nicht-radioaktiv sein.
In der oben beschriebenen Zelle 10 dient die poröse Anode 28 als Arbeitselektrode. Die poröse Anode 28 ist aus einem Metall hergestellt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gold, Platin und einem Gemisch von 90% Platin/10% Rhodium. Es wird postuliert, daß Gold für Jodierungen, in denen das zu halogenierende Protein, Peptid oder andere organische Molekül sehr oxidationsempfindlich ist, ein besseres Anodenmaterial sein könnte. Im allgemeinen kann jedes elektrisch leitende oder halbleitende Material als Anode verwendet werden. Beispiele von geeigneten Materialien umfassen verschiedene Arten von Kohlenstoff, Blei, Bleidioxid, Edelmetallen (Gruppen VIII und IB im Periodensystem) und ihre Oxide (z. B. Platinoxid) und Edelmetalle und ihre Oxide als Beschichtungen auf einem Ventilmetall, wie etwa Titan. Das Anodenmaterial wird wegen seiner Fähigkeit, die gewünschte Überführung effizient zu bewirken und wegen seiner Korrosionsbeständigkeit ausgewählt. Hinsichtlich Halogenierungen und Radiohalogenierungen sind die Edelmetalle vorteilhaft aufgrund ihrer Inertheit und ihrer Fähigkeit, Halogenide wirksam zu aktiven Halogenierungsmitteln zu oxidieren. Edelmetalloxide sind jedoch für Jodierungen und Radiojodierungen aufgrund der Bildung von Jodat nicht geeignet.
Wenn eine poröse Kathode als Arbeitselektrode dient, kann jedes elektrisch leitende oder halbleitende Material im allgemeinen als Kathode 40 verwendet werden. Beispiele geeigneter Materialien umfassen verschiedene Arten von Kohlenstoff, rostfreien Stahlen, Edelmetallen (Gruppe VIII und IB des Periodensystems) und ihre Oxide (z. B. Platinoxid) und Übergangsmetalle, wie etwa Kupfer und Nickel.
Während der Metallkontaktring 30 kein kritischer Bestandteil der Zellanordnung 10 ist, stellt er sicher, daß ein elektrischer Kontakt mit der Arbeitselektrode beibehalten wird. Der Metallkontaktring 30 ist insbesondere nützlich, wenn sehr dünne Teile von teurem Platin oder Gold als Anode oder Kathode in der Arbeitselektrode verwendet werden. In Situationen, wo diese dünnen Teile von Platin oder Gold einer direkten Verbindung mit einer Stromquelle durch eine Krokodilklemme nicht standhalten können, kann der Metallkontaktring 30 als Kontaktpunkt dienen.
Egal ob eine poröse Kathode oder eine poröse Anode als Arbeitselektrode dient, ist es wichtig, daß die Kanten der Arbeitselektrode durch die Dichtungen 24 und 32 bedeckt ist, um den Massenübergang an den Kanten zu verringern. Ein erhöhter Massenübergang an den Kanten macht es schwierig, über die Arbeitselektrode ein gleichmäßiges Potential aufrechtzuerhalten, was Probleme mit dem Markierungsmittel verursachen kann. Wenn das Potential z. B. nicht hoch genug ist, wird kein aktives Markierungsmittel aus Jodid gebildet; wenn das Potential dagegen zu hoch ist, wird Jodid zu Jodat oxidiert, welches kein aktives Markierungsmittel ist. Wenn die Kanten der Arbeitselektrode bedeckt sind, ist der Ort der Referenzelektrode nicht kritisch, solange sie außerhalb des Stromweges angeordnet ist, da der Strom nicht um die Kanten der Arbeitselektrode herum gelangen kann. Wenn die Kanten der Arbeitselektrode jedoch unbedeckt sind, ist es schwieriger, die Referenzelektrode außerhalb des Stromwegs anzuordnen.
Der Separator 26 hilft dabei, das Gesamtvermischen des Anolyten und Katholyten zu verhindern, während er den Fluß von ionischem Strom zwischen Anode und Kathode erlaubt. Der Separator 26 sollte im allgemeinen elektrisch isolierend sein und kann aus einer großen Vielzahl von Materialien hergestellt sein, umfassend, aber nicht beschränkt auf Frittglas, gesintertes Glaspulver, poröse oder geschäumte Kunststoffe, wie etwa TeflonTM, Asbestdiaphragma, poröse keramische Materialien, Ionenaustauschmembranen und Ultrafiltrationsmembranen. In einem Aspekt der Erfindung ist der Separator 26 eine NafionTM 117 Kationenaustauschmembran. Wenn der Separator 26 kationisch ist, stellt er sicher, daß die Radiohalogenide in der Anionenkammer der vorliegenden Erfindung bleiben.
Die vorliegende Erfindung zieht auch die Verwendung einer Anionenaustauschmembran als Separator 26 in Betracht. In dieser Ausführungsform wird das Radiohalogenid dem Katholyten zugegeben und das Halogenid diffundiert durch den Anionenmembran-Separator 26 als Antwort auf einen Konzentrationsgradienten. Das Halogenid trifft dann auf die poröse Metallschicht 28, worin das Halogenid, wenn die Schicht bei einem geeigneten Potential gegen die Referenzelektrode 36 ist, zu einem aktiven Halogenierungsmittel oxidiert wird und mit dem Proteinmaterial reagiert, wenn die poröse Anode 28 ausreichend porös ist. Für diese Ausführungsform verwendbare, gegenwärtig erhältliche Anionenaustauschmembranen sind die RaiporeTM Anionenaustauschmembranen 1030, 4030 und 5030 (Pall RAI, Inc.).
Ein Vorteil, wenn man das Radiohalogenid in den Katholyten einbringt, ist es, daß das Problem des Abtrennens nicht umgesetzten radioaktiven Materials von radiomarkiertem Protein verringert wird. Dieses Ergebnis wird weiterhin durch Anordnen einer porösen Anode 28 direkt benachbart zum Separator 26 verbessert. Mit einer solchen Anordnung reagiert das Radiojodid mit dem Protein an der porösen Anode 28, wenn es in die Anodenhalbzelle 14 gelangt, und die Zelle wird abgestellt, wenn im wesentlichen kein nicht umgesetztes radioaktives Jodid in der Anodenhalbzelle 14 übrig ist, welches von dem radiomarkierten Protein abgetrennt werden muß. Ein Nachteil, das Radiohalogenid in den Katholyten einzubringen liegt darin, daß viel vom Radiohalogenid im Separator 26 verbleibt. Dies muß jedoch in einer kommerziellen Anwendung kein Nachteil sein, wo eine wiederholte oder kontinuierliche Verwendung die anfängliche Sättigung des Separators 26 irrelevant machen kann.
Jeder Leitelektrolyt kann im Katholyten oder Anolyten verwendet werden. Beispiele von üblicherweise verwendeten Leitelektrolyten umfassen Natriumchlorid, Phosphatpuffer, Tetraalkylammoniumsalze und Alkalimetallacetate. Die Zelle 10 kann auch ohne jeden Leitelektrolyten in der Kammer der Arbeitselektrode verwendet werden, wenn dies aus Verfahrensgründen gewünscht wird.
Unabhängig vom verwendeten Leitelektrolyten muß eine gewisse Art des Rührens in der Halbzelle verwendet werden, die die Arbeitselektrode enthält, um ein angemessenes Mischen von Reagenzien und einem Kontakt mit der Arbeitselektrode sicherzustellen. In der oben beschriebenen Zelle 10 liefert ein Rührstab 38 das Mischen. Andere Verfahren zum Bereitstellen von Vermischen umfassen das Zerstäuben von Gas in die Halbzelle. Es wird in Betracht gezogen, daß Rühren in beiden Halbzellen Vorteile bereitstellen würde, wenn das Markierungsmittel in einer Halbzelle vorliegt und das zu markierende Material in der anderen Halbzelle vorliegt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Halogenierung von Proteinen, worin die Anodenhalbzelle 14 die Arbeitselektrode enthält, wird eine andere Form einer Anode 28 und eine bessere Anordnung von Anode 28 und Referenzelektrode 36 verwendet. Die Verwendung eines dünnen Teils eines porösen Anodenmaterials 28 in der in Fig. 1 gezeigten Art ergibt eine ökonomischere Verwendung von teuren Edelmetallanoden, eine erhöhte Ökonomie und Flexibilität bei Reinigungsvorgängen und liefert eine genaue Kontrolle des Anodenpotentials und somit der Wirksamkeit der Halogenierungsreaktion. Die Anordnung der Referenzelektrode 36 außerhalb des Stromweges bietet ebenfalls eine genaue Kontrolle des Anodenpotentials, was ermöglicht, daß die maximale Halogenierungsrate erzielt wird, während eine oxidative Schädigung des Proteins minimiert wird. Eine Anordnung der Referenzelektrode 36 außerhalb des Stromweges macht es jedoch notwendig, daß die Arbeitselektrode porös ist. Die Referenzelektrode 36 kann eine von einer Vielzahl von solchen, üblicherweise zur Kontrolle oder Messung des Arbeitselektrodenpotentials verwendeten Elektroden sein.
Unter den weiteren Vorteilen der Elektrolysezelle 10 der vorliegenden Erfindung und insbesondere des Anordnens einer porösen Anode 28 direkt benachbart zum Separator 26, ist ihr einfacher Aufbau und ihre Fähigkeit, effektiv betrieben zu werden, selbst wenn die Leitfähigkeit der verwendeten Lösungsmittel ziemlich gering ist. Zum Beispiel lösen einige Lösungsmittel, die Jodid oder Jodidquellen, wie etwa Phenyljodid, lösen können, andere Elektrolyten nicht und können deshalb keine Leitfähigkeit verleihen. Es kann eine solche Situation vorliegen, wo unerwünschte Reaktionen auftreten können, wenn Salze oder Wasser vorliegen. In dieser Situation, in der die Anolytlösung schlecht leitend ist, kann die Anode 28 direkt benachbart zum Separator 26 angeordnet werden, so daß ein Strom fließen kann und eine Jodierung des Proteins, Peptids oder organischen Moleküls noch auftreten kann. Da das zu halogenierende Material in der Anodenhalbzelle 14 ist, kann ein leitendes Lösungsmittel in der Kathodenhalbzelle 12 verwendet werden. Dieser Aufbau ist in Fig. 1 gezeigt. Wenn die Leitfähigkeit des Anodenlösungsmittels kein Faktor hinsichtlich des Vermeidens unerwünschter chemischer Reaktionen zwischen dem Lösungsmittel und dem zu halogenierenden Material ist, kann jedoch ein leitendes Lösungsmittel verwendet werden und die Anode 28 kann irgendwo in der Anodenhalbzelle 14 angeordnet werden. Ein verfügbares, wirkungsvolles Mittel zur Anordnung der Anode 28 direkt benachbart zum Separator 26 ist es, das Anodenmaterial chemisch auf dem Separator 26 abzuscheiden. Beispiel 16 unten zeigt eine Art, diese Abscheidung zu bewerkstelligen.
Ein Nachteil der Verwendung von Edelmetallen als Anodenmaterialien der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß sie eine hohe Kapazität zur Absorption von Jodid oder anderen Halogenen aufweisen. Zum Beispiel wurde festgestellt, daß eine Adsorption von Radiojodid auf der Anode, die für seine Oxidation verwendet wird, um die aktive Jodierungsspezies herzustellen, für fast die gesamte Ineffizienz in der Verwendung des Isotops beim elektrochemischen Markieren von Antikörpern verantwortlich ist, vorausgesetzt, daß die Technik der Verwendung von kontrolliertem Potential oder kontrolliertem Strom richtig durchgeführt wurde. Es ist gut bekannt, daß die Größe der Anode relativ zum Volumen des Anolyten die Zeit bestimmt, die für eine Potential-kontrollierte Elektrolyse benötigt wird und folglich kann die Anode nicht immer kleinergemacht werden, ohne in unvernünftig langen Elektrolysezeiten zu resultieren. Deshalb mußte das Problem des Verlustes an Aktivität durch Adsorption auf der Anode auf eine andere Weise minimiert werden.
Dieses Problem kann durch Kontrolle des Verhältnisses der Oberfläche der Arbeitselektrode/des Volumens der Halbzelle (A/V) minimiert werden. Es wurde nun festgestellt, daß, wenn das A/V-Verhältnis zu klein ist, lange Elektrolysezeiten benötigt werden; wenn es dagegen zu groß ist, tritt ein übermäßiger Verlust an Radiohalogenid durch Adsorption auf. Diese Sorge betrifft speziell die Radiohalogenierung; andere elektrochemische Überführungen oder Arten von Radiomarkierungsreaktionen können diese Schwierigkeit aufweisen oder auch nicht. Ein allgemeiner Bereich für das A/V-Verhältnis, der die Radiohalogenierung von Proteinen betrifft, beträgt 0,001 bis 5000 cm&supmin;¹ und der bevorzugte Bereich ist 0,05 bis 10 cm&supmin;¹. Die geometrische Fläche wird aus den physikalischen Bruttomessungen der Elektrode berechnet. Der Parameter, der tatsächlich sowohl die für die Elektrolyse erforderliche Zeit als auch die Kapazität Halogen zu adsorbieren bestimmt ist die echte Oberfläche. Die echte Oberfläche variiert gemäß der mikroskopischen Rauhigkeit, welche durch die Form der Elektrode (z. B. porös gegenüber glatt), die Vergangenheit der Elektrode und andere Faktoren bestimmt wird. Die echte Fläche kann größer oder kleiner als die geometrische Fläche sein.
Dieses Problem wird in einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung durch Sättigen der Anode 28 der Elektrolysezelle der vorliegenden Erfindung mit einem nicht-Radiohalogen und dann Minimieren des Austausches von Radiohalogen mit dem adsorbierten nicht-Radiohalogen während des Markierungsvorgangs ebenfalls minimiert. Zwei Verfahren werden zur Sättigung der Anode 28 mit nicht-Radiohalogen vorgeschlagen: Tränken der porösen Anode 28 mit einem nicht-Radiohalogen vor dem Einbringen in die Elektrolysezelle 10; und Unterziehen der porösen Anode 28 einer Elektrolyse, während sie sich in einer Lösung von nicht-Radiohalogen befindet.
Im Betrieb kann die Zelle 10 durch Kontrollieren des Arbeitselektroden- Potentials, des Zellstroms oder der Gesamtzellspannung, d. h. dem Potential über die Anode und die Kathode betrieben werden. Der angelegte Strom kann Gleichstrom oder Wechselstrom sein oder das angelegte Potential kann konstant sein oder gemäß jeder gegebenen Wellenform variieren, abhängig von den Erfordernissen des Verfahrens von Interesse. Wenn das Potential kontrolliert wird, ermöglich die Anordnung der Referenzelektrode außerhalb des Stromweges, daß die Kontrolle genauer ist. Der vorgeschlagene Grund für diese Kontrolle ist, daß diese Geometrie den Beitrag des IR-Abfalls (Produkt an Zellstrom mal Lösungswiderstand) zum Potential zwischen den Referenz- und Arbeitselektroden minimiert. Wenn der Zellstrom oder das Potential kontrolliert wird, liefert diese Geometrie eine genauere Messung des Arbeitselektroden-Potentials. Im Fall von Jodierungen und Radiojodierungen in wäßrigen Medien wurde festgestellt, daß für manche Substrate eine genaue Potentialkontrolle der Anode wesentlich ist, um eine hohe, reproduzierbare Ausbeute zu erzielen.
Die Erfindung wird durch Betrachtung der folgenden Beispiele weiter verdeutlicht, welche für die vorliegende Erfindung lediglich beispielhaft sein sollen.

BEISPIELE 1 bis 13: JODIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN

Tabelle A faßt die Ergebnisse der Beispiele 1 bis 13 von elektrolytischen Radiojodierungen eines monoklonalen Antikörpers mit I-125 zusammen. Diese Experimente wurden unter Verwendung der Elektrolysezelle 10 der vorliegenden Erfindung durchgeführt, um die Effekte zu bestimmen, die Variieren der Mengen an radiomarkiertem Halogen und eine Anoden- Vorbehandlung mit Halogen auf die Ausbeute an markierten Proteinen, Peptiden und anderen organischen Molekülen haben würden. Da die Menge an in diesen Experimenten verwendetem I-125 verglichen mit der Adsorptionskapazität der Anode 28 so gering war, wurde ein Lösungsphasen-Trägerjodid (nicht radioaktives Jodid) verwendet, um die Ergebnisse zu erhalten. Ein nicht radioaktives Markierungsmittel, insbesondere ein nicht radioaktives Halogen, ist eines, das die Standards der U. S. Nuclear Regulatory Commission erfüllt. TABELLE A
a = E ist das Elektrolysepotential in Millivolt gegen Ag/AgCl
b = Anode %, MAK % und nicht umgesetzt % sind die Prozentanteile des anfänglichen I-125, gebunden an die Anode, gebunden an den Antikörper bzw. in Lösung geblieben, am Ende der angezeigten Elektrolysezeit.
c = Anmerkungsspalte auf nächster Seite.
Anmerkungsspalte:
1. Anode ist ein durch elektroerosive Metallbearbeitung gebildetes Gitter aus Au, 1000 Linien/Zoll
2. Anode ist ein durch elektroerosive Metallbearbeitung gebildetes Gitter aus Au, 670 Linien/Zoll
3. Anode ist Pt-Oxide auf einem Pt-Gitter
4. Anodenvorbehandlung: In einer Jodidlösung bei offenem Stromkreis außerhalb der Radiojodierungszelle getränkt
5. Anodenvorbehandlung: Elektrolyse bei 650 mV unter Verwendung von 40 oder 50 mikromolarem Jodid in der Radiojodierungszelle
6. Anodenvorbehandlung: Elektrolyse bei 650 mV unter Verwendung von 1 mM Jodid in der Radiojodierungszelle
7. Anodenvorbehandlung: Behandeln mit 1 mM Jod bei offenem Stromkreis außerhalb der Radiojodierungszelle
8. Anodenvorbehandlung: Elektrolyse bei 650 mV unter Verwendung von 1 mM Jodid außerhalb der Radiojodierungszelle
9. Anzeichen einer Aggregation durch HPLC
10. Immunreaktivität = 78,4%
11. Trägerjodid wurde zugegeben, nachdem das I-125 bereits auf die Anode adsorbiert war
12. 9 mg MAK
13. 6 mg MAK
Vor dem Zusammenbau der Zelle 10 wurde der Separator 26, eine Kationenaustauschmembran, auf nahezu Kochen in 2M Salpetersäure für 2 Stunden erwärmt, um Verunreinigungen zu entfernen. Die Membran 26 wurde dann durch Tränken in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) in die Salzform überführt. Die Membran 26 verhinderte den Durchtritt von Antikörpern vom Anolyten zum Katholyten. Die Membran 26 stellte auch sicher, daß das Radiojodid in der Anodenkammer verblieb.
Die Zelle 10 wurde mit einer Anode 28 zusammengebaut, die unter Verwendung einer der Methoden vorbehandelt war, die in den Bemerkungen zu Tabelle A beschrieben sind. Sowohl die Kathodenkammer 12 als auch die Anodenkammer 14 wurden mit PBS gefüllt. Wenn ein Trägerjodid verwendet werden sollte, wurde es zunächst zum Anolyten zugegeben, gefolgt von frisch aufgetautem MAK und schließlich radiochemischen I-125. Nach kurzem Rühren wurde der gesamte Anolyt unter Verwendung einer 10 ml Spritze abgezogen und unter Verwendung eines CapintecTM CRC7 Radioisotopenkalibrators ausgezählt. Der Anolyt wurde zurück in die Zelle gegeben, das Rühren begonnen und die Elektrolyse bei einem kontrollierten Potential ausgeführt. Der Potentiostat war ein zyklischer Voltamograph, Modell CV1B, geliefert von Bioanalytical Systems, Inc. (BAS-West Lafayette, IN). Der Strom wurde unter Verwendung eines digitalen Voltmeters überwacht.
Die Elektrolyse wurde periodisch unterbrochen, um den Anolyten auszuzählen und eine 50 ul Probe zur HPLC-Analyse abzuziehen. Die Probe wurde mit 200 ul Eluent (400 mM PBS enthaltend Natriumazid) verdünnt und auf eine Gelpermeationssäule injiziert. UV (280 nm) und Strahlungsdetektoren in Reihe ergaben eine Quantifizierung der relativen Mengen an ungebundenem und MAK-gebundenem I-125.
Nach Abschluß der Elektrolyse wurde die Anode 28 manchmal von der Zelle 10 entfernt und ausgezählt. Wenn dies durchgeführt wurde, wurde diese Messung verwendet, um direkt den Prozentanteil des anfänglichen I-125 zu erhalten, der an die Anode 28 adsorbiert wurde. (Die Anode 28 ist der einzige Zellbestandteil, von dem jemals festgestellt wurde, daß er nach einer Elektrolyse signifikant radioaktiv war.) Der Anolyt wurde immer ausgezählt und wenn die Anode 28 nicht ausgezählt wurde, wurde die auf der Anode 28 adsorbierte Mengen als die Differenz zwischen der anfänglichen Zählung und der abschließenden Anolytzählung genommen. Aufgrund der Schwierigkeit den Anolyten quantitativ mit einer Spritze zu entfernen wurde angenommen, daß jede nicht zugeordnete Radioaktivität in der restlichen Lösung war und die fehlende Menge wurde der Anolytenzählung zugerechnet.
Die ersten drei Experimente in Tabelle A wurden unter Verwendung von Au- Anoden durchgeführt, die in Jodid außerhalb der Zelle, in der die Radiojodierung stattfinden sollte, getränkt wurden. Diese Behandlung erzeugte wahrscheinlich keine Sättigungsbedeckung an adsorbiertem I, wobei offene Stellen zurückblieben, an die I-125 adsorbieren konnte, ohne mit zuvor adsorbierten I auszutauschen. Es wird vermutet, daß wenn kein Trägerjodid verwendet wird, das I-125 fast quantitativ durch die Anode aufgenommen wird. Die Verwendung einer großen Menge an Trägerjodid (100 nmol Jodid auf 33,3 nmol MAK) resultierte in sehr guten Jodierungsausbeuten, zeigte aber Anzeichen einer Aggregation der MAKs. Den Fachleuten ist allgemein bekannt, daß eine Aggregation nachteilig für das Produkt ist, da es die Bioverteilung und pharmakologische Aktivität verändert. Versuch #3 wurde in einer ähnlichen Weise wie Versuch #2 begonnen und nachdem bestätigt war, daß das I-125 durch die Anode aufgenommen war, wurde Trägerjodid in dem angezeigten Gehalt zugegeben und die Elektrolyse fortgesetzt, was in der gezeigten Ausbeute resultierte.
In der nächsten Gruppe von Experimenten (Versuche 4 bis 9) wurde die Anode durch Oxidieren des Jodids (ohne Anwesenheit von MAK) in der Zelle vorbehandelt, in der die Radiojodierung stattfinden sollte, gefolgt von ausführlichem Spülen der Zelle (Bemerkungen 5, 6 von Tabelle A). Es schien, daß bei dieser Vorbehandlung kein Trägerjodid notwendig war, um gute Ausbeuten zu erhalten. Getrennte Experimente zeigten jedoch, daß es schwierig war, durch Spülen alles Jodid und/oder Jod von der Vorbehandlung vollständig zu entfernen, so daß diese Experimente trotz allem einen unbestimmten Gehalt an Träger aufgewiesen haben könnten. In jedem Fall gab es keine Anzeichen einer Aggregation der MAKs.
In der nächsten Gruppe von drei Experimenten in Tabelle A (Versuche 10, 11 und 12) wurde die Anode außerhalb der Zelle (Bemerkungen 7 und 8) vorbehandelt, so daß sicher war, daß der Gehalt an Träger genau bekannt war. Bei keinem zugegebenen Träger war die Ausbeute an markiertem Material gering, wobei das meiste der Aktivität in der Anode endete. Die Zugabe einer geringen Menge an Träger verbesserte jedoch die Ausbeute beträchtlich, ohne jedes Anzeichen einer Aggregation der MAKs. Es schien aus diesen Ergebnissen, daß der Träger mindestens bis zu einem derartigen Gehalt zugegeben werden könnte, daß das molare Verhältnis an Gesamtjodid zu MAK etwa 0,2 betrug ohne Schädigung des Antikörpers.
Die Beispiele 1 bis 13 veranschaulichen, daß das Verfahren der Anodenvorbehandlung und der Gehalt an Trägerjodid sehr wichtige Faktoren bei der Bestimmung der Ausbeute an markiertem MAK waren, wenn die verwendete Menge an I-125 sehr klein verglichen mit der Adsorptionskapazität der Anode 28 war. Ausbeuten (bezogen auf anfängliches I-125) an markiertem MAK im Bereich von 70 bis 80% wurden mit wenig oder keinem Träger erreicht, wenn das Verfahren der Anodenvorbehandlung mit einem nicht-Radiojodid durch Elektrolyse anstelle durch Vortränken der Anode verwendet wurde.

BEISPIEL 14: JODIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN OHNE DIE VERWENDUNG EINES LÖSUNGSPHASENTRÄGERS

Beispiel 14 veranschaulicht, daß ähnliche oder bessere Ausbeuten erhalten werden ohne die Verwendung eines Lösungsphasen-Trägers, wenn Aktivitätsgehalte im Produktionsmaßstab von I-125 verwendet werden.
Die Zelle der vorliegenden Erfindung wurde in einem verbesserten Verfahren zur Radiojodierung eines Tumor-spezifischen MAK mit I-125 verwendet. Dieses Material ist zum Nachweis von z. B. kleinen Tumoren oder solchen Tumoren, die anders nicht detektiert werden können, für eine chirurgische Entfernung verwendbar.
Die Zelle wurde aufgebaut, um ein Anolytvolumen von 5 ml und eine geometrische Anodenoberfläche von 2,9 cm² (eine Seite) bereitzustellen. Die zur Trennung der Anoden- und Kathodenkammern verwendete Membran war eine starke Kationenaustauschmembran, NafionTM 117. Das Anodenmaterial war ein durch elektroerosive Metallbearbeitung gebildetes Goldgitter, 670 Linien Zoll&supmin;¹, das durch Elektrolyse in einer 1 mM Lösung eines nicht radioaktiven Jodids vorbehandelt worden war, um die Jodadsorptionsstellen zu sättigen. Die in dem Experiment verwendete Anode war für zwei frühere Experimente verwendet worden ohne die Jodelektrolyse zu wiederholen, war aber zwischen den Experimenten in 1 M NaOH getränkt worden, gefolgt von vorsichtigem Spülen mit Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
Die folgende Vorgehensweise wurde für die Radiojodierung verwendet: 2 ml PBS enthaltend 60 mg Antikörper, 1 ml einer I-125-Lösung (105 mCi) und ausreichend PBS, pH 7, um ein Gesamtvolumen von 5 ml zu ergeben, wurden der Anodenkammer zugegeben. Die Kathodenkammer wurde mit PBS gefüllt. Der Anolyt wurde magnetisch gerührt, als die Elektrolyse bei +0,650 V (gegen eine Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode) begonnen wurde. Die Elektrolyse wurde nach 90 Minuten gestoppt und der Anolyt entfernt. Der Anolyt und die Zelle wurden ausgezählt, um den Verlust an Radiojodid durch Adsorption an die Anode zu bestimmen. Nach der Elektrolyse waren 96,4 mCi im Anolyten anwesend, während 8,6 mCi in der Zelle verblieben.
Eine Präzipitation mit Trichloressigsäure zeigte, daß 5,0% der Anolyten- Radioaktivität nicht kovalent an den Antikörper gebunden waren. Dieses Ergebnis zusammen mit der Gesamtanolytzählung zeigte, daß die Gesamtausbeute an radiojodiertem Produkt, bezogen auf das anfängliche I- 125,87% betrug. Eine HPLC-Analyse des Anolyten zeigte, daß > 97% des radiomarkierten Antikörpers in monomerer Form vorlag; 82,7% des radiomarkierten Antikörpers war immunreaktiv.
Zusätzlich dazu, daß sie in der Lage sind, die Radiohalogenierung von MAKs zu erzielen, sind die elektrolytische Zelle der vorliegenden Erfindung und das Verfahren ihrer Verwendung in der Lage, die Radiohalogenierung von anderen Proteinen, Peptiden und organischen Molekülen zu erreichen.
Die folgenden speziellen Beispiele sind auf verschiedene Ausführungsformen der Erfindung gerichtet und sollten nicht als den Umfang der Erfindung einschränkend aufgefaßt werden.

BEISPIEL 16: CHEMISCHE ABSCHEIDUNG EINER GOLDANODE AUF EINE ANIONENAUSTAUSCHMEMBRAN VOR DER JODIERUNG VON TYROSIN

Gold wurde chemisch auf eine RaiporeTM 4030 Anionaustauschmembran wie folgt abgeschieden: Unter Verwendung eines Reaktions mit zwei Kammern mit der Membran selbst als Separator wurde eine 0,02M AuCl&sub3; (pH 1) Lösung auf eine Seite und eine 0,1 M Hydrazinlösung (pH 13) auf der anderen Seite angeordnet. Nach 45 Minuten wurde die metallisierte Membran aus dem Reaktor entfernt, mit deionisiertem Wasser gespült und 10 Minuten in einer Lösung von Jod (1 mM) in 70% Methanol, 30% Wasser getränkt. Die metallisierte Membran wurde dann mehrere Male mit 70% Methanol gewaschen und in mehreren Wechseln eines pH 9,0 Puffers getränkt. Eine Elektrolyse unter Verwendung dieser metallisierten Membran als Anode und Separator wurde in der gleichen Zelle durchgeführt und folgte der gleichen Vorgehensweise wie in Beispiel 15. Bei einer 88%-igen Jodumsetzung betrug die Ausbeute an 3-Jod-L-tyrosin 40%, bezogen auf anfängliches Jodid (nur der Anolyt wurde geprüft).

BEISPIEL 17: ZUGABE VON JODID ZUM KATHOLYTEN VOR DER JODIERUNG VON TYROSIN

Wenn man eine Verbindung mit radioaktivem Jod markiert, kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, das nicht umgesetzte Radiojodid, das in der Produktlösung nach der Elektrolyse verbleibt zu minimieren, ohne von übermäßig langen Elektrolysezeiten Gebrauch zu machen. Dieses Konzept kann mit nicht radioaktivem Jodid unter Verwendung der vorliegenden Erfindung in der folgenden Weise gezeigt werden: Die Zelle wurde unter Verwendung der in Beispiel 16 beschriebenen metallisierten Membran zusammengebaut. Die Elektrolyse wurde wie in Beispiel 15 ausgeführt, mit den Ausnahmen, daß das Jodid dem Katholyt zugegeben wurde und sowohl Anolyt als auch Katholyt magnetisch gerührt wurden. Die Ausbeute an 3- Jod-L-tyrosin betrug 45%, bezogen auf das anfänglich dem Katholyten zugegebene Jodid, und die Konzentration an Jodid in dem Anolyten war praktisch null.

BEISPIEL 18: JODIERUNG VON TYROSIN BEI pH 7,0

Eine Elektrolyse wurde ausgeführt unter Verwendung der gleichen Zelle, Anode, Membran und Vorgehensweise wie in Beispiel 15, außer daß der pH des Anolyten und Katholyten 7,0 betrug. Bei einer 85%-igen Jodidumsetzung betrug die Ausbeute an 3-Jod-L-tyrosin 58%, bezogen auf das anfängliche Jodid.

BEISPIEL 19: ABSCHEIDUNG EINER GOLDANODE AUS DER GASPHASE AUF EINE ULTRAFILTRATIONSMEMBRAN VOR DER JODIERUNG VON TYROSIN

Gold wurde aus der Gasphase mit einer Dicke von 150 Angström auf eine Polysulfon-Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsgrenze 100.000) abgeschieden. Diese metallisierte Membrananordnung wurde zur Jodierung von L-Tyrosin verwendet, unter Verwendung der gleichen Vorgehensweise wie in Beispiel 18. Bei einer 45%-igen Jodidumsetzung betrug die Ausbeute an 3-Jod-L-tyrosin 54%, bezogen auf das anfängliche Jodid (100 % Jodierungsselektivität innerhalb des experimentellen Fehlers).

BEISPIEL 20: JODIERUNG VON NICHT-STEROIDARTIGEM ESTROGEN

Die Zelle wurde verwendet, um die folgende Jod-Entfernung von Zinn- Reaktion zu bewirken:
Tri-n-butylzinn-tamoxiphen Jodtamoxiphen
Tamoxiphen ist ein nicht-steroidartiges Estrogen-Analogon mit einer Affinität für den Estrogen-Rezeptor und mit antiestrogener Aktivität in vivo. Das radiomarkierte Jodderivat ist potentiell nützlich als Gammastrahlen aussendender Tracer für den Rezeptor. Jodtamoxiphen wird in diesem Beispiel unter Verwendung von nicht radioaktivem Jod hergestellt, um die Anwendbarkeit der Erfindung zu zeigen.
Die Zelle wurde mit einer Pt/Rh-Netzanode (10% Rh, 80 Mesh), einer Pt- Netzkathode und einem NafionTM 117 Kationenaustauschmembran- Separator zusammengebaut. Der Katholyt war ein wäßriger Puffer, pH 7,0. Der Anolyt bestand aus etwa 5 ml Methanol enthaltend 0,086 g Tri-n- butylzinn-tamoxiphen (0,00013 Mol) und 0,042 g Nal (0,00028 Mol). Dem Anolyt wurde kein weiterer Leitelektrolyt zugegeben. Die Elektrolyse wurde mit magnetischem Rühren des Anolyten für etwa 2,5 Stunden bei +500 mV gegen Ag/AgCl (3M KCl) ausgeführt. Zu dieser Zeit zeigte eine Dünnschichtchromatographie des Anolyten (Silikagel, Eluent 5% Methanol in Chloroform) eine vollständige Umsetzung von Tri-n-butylzinn-tamoxiphen an. Der Anolyt wurde aus der Zelle entfernt, mit 30 ml Diethylether verdünnt und mit 10 ml 10%-igem Natriummetabisulfit und zwei 10 ml Mengen 1 NaOH gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter einem milden Strom von trockenem Stickstoff evaporiert, wobei 0,051 g (0,00010 Mol) eines farblösen Öls zurückblieben. Die ¹H und ¹³C-NMR-Spektren dieses Produktes (in CDCl&sub3;) stimmten mit der gewünschten Verbindung Jodtamoxiphen überein.

Beispiel 21: JODIERUNG VON 17-α-(TRIBUTYLZINN)-VINYLESTRADIOL

Radiomarkierte Derivate von 17-α-Jodvinylestradiol sind ebenfalls als Gamma aussendende Pharmazeutika verwendbar, die selektiv an Estrogenrezeptorstellen binden. Dieses Beispiel zeigt die Verwendbarkeit der Zelle zur Synthese von 17-α-Jodvinylestradiol über eine Jod-Entfernung von Zinn-Reaktion von 17-α-(Tributylzinn)-vinylestradiol:
17-α-(Tributylzinn)-vinylestradiol 17-α-Jodvinylestradiol
Die Zelle wurde mit einer durch elektroerosive Metallbearbeitung gebildete Gitteranode aus Gold (geometrische Fläche 3,9 cm²), einer Netzkathode aus rostfreiem Stahl 304 (40 Mesh) und einem NafionTM 117 Kationenaustauschmembran-Separator zusammengebaut. Der Katholyt bestand aus einem Puffer, pH 7,0. Der Anolyt bestand aus 5 ml 10% Wasser in Methanol, zu dem 0,060 g 17-α-(Tributylzinn)vinylestradiol (0,00010 Mol) und 0,031 g Nal (0,00010 Mol) zugegeben wurden. Die Elektrolyse wurde bei + 600 mV (gegen Ag/AgCl, 3M KCl) mit magnetischem Rühren ausgeführt, bis Dünnschichtchromatographie (Silikagel, Eluent 20% Ethylacetat in Hexan) eine komplette Umsetzung des 17-α-(Tributylzinn)vinylestradiols anzeigte. Der Anolyt wurde mit 20 ml Chloroform verdünnt und einmal mit wäßrigem 10% Natriummetabisulfit/l % Kaliumfluorid extrahiert. Die wäßrige Phase wurde einmal mit 10 ml frischem Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte wurden vereint, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter einem trockenen Stickstoffstrom evaporiert, wobei 0,056 g eines weißen Feststoffes zurückblieben. Dieses Material wurde in einem Lösungsmittel gelöst und durch Blitzchromatographie unter Verwendung von 12 g 40 Mikron Silikagel und 25% Ethylacetat/Hexan als Eluent gereinigt. Die homogenen Fraktionen wurden vereint und die Evaporation des Lösungsmittels ergab 0,030 g (0,000071 Mol) eines weißen Feststoffes. Die ¹H und ¹³C-NMR-Spektren, das Massenspektrum durch schnellen Atombeschuß (FAB-MS) und das Massenspektrum durch chemische Ionisation (CI-MS) stimmten alle mit der Struktur des gewünschten Produkts 17-α-Jodvinylestradiol überein.

BEISPIEL 22: BROMIERUNG VON ESTRONENOLDIACETAT

16-α[&sup7;&sup7;Br]Bromestradiol hat eine potentielle Verwendbarkeit zur Abbildung von menschlichen Brusttumoren, die Estrogenrezeptoren enthalten. Dieses Beispiel zeigt eine Synthese des nicht radioaktiven Analogons dieser Verbindung aus Estron, worin die Zelle zur Bromierung eines Zwischenstoffes, Estronenoldiacetat, verwendet wird.
Estron Estron-3-acetat-17-enolacetat
16-α-Bromestradiol 16-α-Bromestron-3-acetat
15 ml Isopropenylacetat, 2,0 g Estron (0,0074 Mol) und 0,6 ml einer Katalysatorlösung (0,1 ml konzentrierte Schwefelsäure in 5 ml Isopropenylacetat) wurden für 2,5 Stunden unter Rückfluß gekocht. Etwa 4 ml Lösungsmittel wurde dann über eine Zeitdauer von 1,5 Stunden destilliert. 10 ml Isopropenylacetat enthaltend 0,5 ml der Katalysatorlösung wurden zugegeben und das Gemisch langsam destilliert, um etwa die Hälfte des Volumens zu entfernen. Das verbleibende Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt, mit 50 ml wasserfreiem Diethylether verdünnt und mit 10 ml gesättigtem wäßrigem Natriumbicarbonat gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne evaporiert. Der Rückstand wurde in 1 I 20% Ethylacetat in Hexan gelöst und durch eine kurze Säule (5 cm lang mal 2 cm Durchmesser) mit neutralem Aluminiumoxid, 80 bis 200 Mesh, geleitet. Die Lösung wurde dann unter verringertem Druck auf ein Volumen von etwa 50 ml evaporiert und zur Seite gestellt, um eine Kristallisation des Produkts zu ermöglichen, was eine Ausbeute von 1,56 g an weißen Kristallen (Schmelzbereich 149 bis 150ºC, Literatur 149 bis 150ºC) ergab. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren stimmten mit dem gewünschten Enoldiacetat (Estron-3- acetat-17-enolacetat) überein.
Die Zelle wurde mit einer Pt/Rh-Netzanode (80 Mesh, 3,9 cm² geometrische Fläche), einer Kathode aus rostfreiem Stahl 304 (40 Mesh) und einem NafionTM 117 Kationenaustauschmembran-Separator zusammengebaut. Eine Elektrolytlösung, bestehend aus 10 ml Tetrahydrofuran, 7 ml Diethylether und 33 ml Puffer (2,81 g Kaliumacetat in 50 ml 85% Essigsäure, 15% Wasser) wurde für den Anolyten und den Katholyten verwendet. Der Anolyt bestand aus 5 ml Elektrolyt, enthaltend 0,039 g Estron-3-acetat-17- enolacetat (0,00011 Mol) und 0,013 g Natriumbromid (0,00013 Mol). Die Elektrolyse wurde bei + 1200 mV (Ag/AgCl, 3M KCl) mit Magnetrühren des Anolyten durchgeführt, bis Dünnschichtchromatographie (Silikagel, Eluent 20% Ethylacetat in Hexan) vollständige Umsetzung des Estron-3-acetat- 17-enolacetats zeigte. Der Anolyt wurde 25 ml Wasser zugegeben und das Gemisch wurde dreimal mit 10 ml Mengen Diethylether extrahiert. Die Etherextrakte wurden vereint, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter einem trockenen Stickstoffstrom entfernt, wobei 0,032 g (0,000082 Mol) eines weißen Feststoffes zurückblieben. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren des Produkts stimmten mit 16-α-Bromestron-3-acetat überein.
0,064 g 16-α-Bromestron-3-acetat (0,00016 Mol) wurden in 5 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst und auf -78ºC unter Stickstoff in einem Isopropanol/Trockeneis-Bad gekühlt. 2 ml 1,0M Lithiumaluminiumhydrid in THF wurden langsam mit schnellem Magnetrühren zugegeben. Nach Rühren für 10 Minuten wurde das Gemisch durch Zugabe von 4 ml von 1 : 1 Ethylacetat in THF (vorgekühlt auf -78ºC) gequencht. Das Gemisch wurde 5 Minuten gerührt, dann wurde das Isopropanol/Trockeneis-Bad durch ein Eisbad ersetzt. 10 ml gekühlte 3M wäßrige HCl wurden langsam zugegeben, um das Quenchen abzuschließen. 10 weitere ml 3M HCl wurden zugegeben und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Gemisch wurde dreimal mit 10 ml Mengen Diethylether extrahiert. Die Etherextrakt wurden vereint, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Eine Evaporation des Lösungsmittels unter einem trockenen Stickstoffstrom ergab 0,075 g eines leicht grünlichen Rückstands. Dünnschichtchromatographie (Silikagel, Eluent 25% Ethylacetat in Hexan) dieses Rückstands zeigte mindestens fünf Komponenten an. Das Gemisch wurde einer Blitzchromatographie (15 g 40 Mesh Silikagel, Eluent 25% Ethylacetat in Hexan) unterzogen.
Kombinierung von homogenen Fraktionen, gefolgt von Evaporation des Lösungsmittels ergab 0,024 g eines weißen Feststoffes (der Hauptbestandteil, Rf = 0,31). Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren dieses Produkts stimmten mit 16-α-Bromestradiol überein. Die Kohlenstoff-13 NMR-Daten legen nahe, daß die Stereochemie an Position 17 Alpha ist.

BEISPIEL 23: RADIOJODIERUNG DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS B72.3

Die Zelle wurde mit einer durch elektroerosive Metallbearbeitung gebildeten Gitteranode aus Gold (670 Linien/Zoll, vorbehandelt durch Tränken in 1 mM nicht radioaktivem Jod), einer Gitterkathode aus rostfreiem Stahl 304 und einem NafionTM 117 Kationenaustauschmembran-Separator zusammengebaut. 3 ml PBS, pH 7, wurden in die Katholytkammer gegeben.
3 ml PBS, pH 8,1, enthaltend 15 mg Antikörper, 1,44 mCi I-125 und 22 nmol Trägerjodid (Gesamtjodid äquivalent zu 40 mCi I-125) wurden der Anolytkammer zugegeben. Mit Magnetrühren wurde eine Elektrolyse bei + 800 mV (Ag/AgCl, 3M Cl&supmin;) ausgeführt. Eine bei 30 Minuten genommene Zwischenprobe zeigte eine Jodierungsausbeute von 71,8% an. Nach 90 Minuten waren 9,5% des anfänglichen I-125 auf der Anode adsorbiert, während 4,5% in Lösung verblieben und nicht an den Antikörper banden, was in einer Jodierungsausbeute von 86,0% resultierte.

BEISPIEL 24: RADIOJODIERUNG DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS B72.3

Die in Beispiel 23 durchgeführte Radiojodierung wurde wiederholt, außer daß das Anodenpotential auf +850 mV gesetzt wurde, während die gleiche Referenzelektrode verwendet wurde. Eine Probe bei 30 Minuten zeigte eine Jodierungsausbeute von nur 31,8%.
Die Beispiele 15 bis 24 veranschaulichen weitere Verwendungen der Elektrolysezelle der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele 15 und 18 veranschaulichen den Effekt, den der pH-Wert auf die Jodierung von L- Tyrosin hat. Beispiele 16 und 17 auf der anderen Seite vergleichen die Zugabe von Jodid zum Anolyten mit der Zugabe zum Katholyten unter Verwendung einer Zelle mit einer Anionenaustauschmembran in jedem Experiment. Der Vorteil der Zugabe des Jodids zum Katholyten ist die Minimierung von nicht umgesetztem Jodid in der Produktlösung. Die Beispiele 16, 17 und 19 sind auch Beispiele, in denen der Separator 26 als fester Träger für die Abscheidung des Anodenmaterials dient, um zu ermöglichen, daß die Anode 28 dem Separator 26 benachbart ist.
Schließlich veranschaulichen die Beispiele 20, 21, 22, 23 und 24 die Halogenierung von anderen organischen Molekülen.
In den obigen Beispielen wurde Raumtemperatur aus Bequemlichkeit gewählt, aber geringere oder höhere Temperaturen können verwendet werden, wobei die Hauptsorge die Stabilität des zu markierenden Materials ist. Der pH-Wert und die Konzentration und die Art von Pufferbestandteilen können ebenfalls über weite Bereiche variieren, wobei die Hauptbetrachtung wiederum die Stabilität des zu markierenden Materials ist. Das Potential der Arbeitselektrode, das Verhältnis der Arbeitselektrodenfläche zum Arbeitszellvolumen und die Anwesenheit der Referenzelektrode sind die Mittel, durch die eine maximale Markierungsrate erreicht werden kann, während die oxidative Schädigung des Proteins minimiert wird.
Die vorhergehende detaillierte Beschreibung ist lediglich zur Klarheit des Verständnisses gegeben und es sollten daraus keine unnötigen Beschränkunge aufgefaßt werden.

Claims

1. Elektrolysezelle zur Markierung von Proteinen, Peptiden und anderen organischen Molekülen, umfassend:

a. eine Kathodenhalbzelle (12) und eine Anodenhalbzelle (14), geteilt durch einen Separator (26);

b. eine Arbeitselektrode (28) in der Kathodenhalbzelle (12) oder der Anodenhalbzelle (14);

c. eine Gegenelektrode (40) in der anderen der Kathodenhalbzelle (12) und der Anodenhalbzelle (14); und

d. eine Referenzelektrode (36), angeordnet in der Halbzelle, die die Arbeitselektrode (28) enthält und außerhalb des Stromweges zwischen der Arbeitselektrode (28) und der Gegenelektrode (40), worin die Arbeitselektrode (28) eine poröse Elektrode ist und sich direkt benachbart zum Separator (26) befindet.

2. Elektrolysezelle nach Anspruch 1, worin die Kathodenhalbzelle (12) einen ersten kreisförmigen Ring (16) aufweist, der eine Öffnung (17) umgibt, und die Anodenhalbzelle einen zweiten kreisförmigen Ring (20) aufweist, der eine Öffnung (21) umgibt, und worin der erste und zweite kreisförmige Ring (16, 20) einander gegenüberstehen; worin die Vorrichtung auch eine erste Dichtung (24), benachbart dem ersten kreisförmigen Ring (16) und dem Separator (26), einen elektrischen Kontakt (30) zum Verbinden der Arbeitselektrode mit einer Stromquelle, eine zweite Dichtung (32), benachbart dem zweiten kreisförmigen Ring (20) und Mittel (42) zum Klemmen des ersten kreisförmigen Rings an den zweiten kreisförmigen Ring auf eine solche Weise umfaßt, daß die erste Dichtung (24), der Separator (26), die Arbeitselektrode (28) und die zweite Dichtung (32) dazwischen eingeklemmt werden.

3. Elektrolysezelle nach Anspruch 2, worin der elektrische Kontakt ein Metallring ist.

4. Elektrolysezelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend:

a. eine Klammer mit einem ersten Stab (44), benachbart der Kathodenhalbzelle (12) oder der Anodenhalbzelle (14) und einen zweiten Stab (46) benachbart der anderen Zelle der Kathodenhalbzelle (12) und der Anodenhalbzelle (14); und

b. Mittel, die den ersten und zweiten Stab (44, 46) zusammen verbinden, um einen Klemmdruck an die Zelle anzulegen und den Separator (26) zwischen der Kathodenhalbzelle (12) und der Anodenzelle (14) zu halten.

5. Elektrolysezelle nach Anspruch 4, worin der erste Stab (44) eine Wärmesenke ist.

6. Elektrolysezelle nach Anspruch 5, worin die Wärmesenke (44) aus einer Basis (56) und einer aufrechten Wand (58) besteht, die die Zelle umgibt.

7. Elektrolysezelle nach einem der Ansprüche 4 bis 6, worin der erste Stab (44) und der zweite Stab (46) gemäß der Form der Rückseiten der Zelle ausgestaltet sind.

8. Elektrolysezelle nach Anspruch 7, worin die Rückseiten der Zelle und der erste und zweite Stab flach sind.

9. Elektrolysezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Arbeitselektrode (28) eine Gold-, Platin- oder 90% Platin/10% Rhodium-Elektrode ist.

10. Elektrolysezelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Gegenelektrode (40) eine Elektrode aus rostfreiem Stahl oder Platin ist.

11. Elektrolysezelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Arbeitselektrodenmaterial auf dem Separator (26) abgeschieden ist.

12. Elektrolysezelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Arbeitselektrode (28) mit einem nicht radioaktiven Markierungsmittel vorbehandelt ist.

13. Elektrolysezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die Arbeitselektrode (28) mit einem Nicht-Radiohalogen vorbehandelt ist.

14. Elektrolysezelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Verhältnis der Oberfläche der Arbeitselektrode (28) zum Volumen der Anodenhalbzelle von 0,001 bis 5000 cm&supmin;¹ beträgt.

15. Elektrolysezelle nach Anspruch 14, worin das Verhältnis der Oberfläche der Arbeitselektrode (28) zum Volumen der Anodenhalbzelle von 0,05 bis 10 cm&supmin;¹ beträgt.

16. Elektrolysezelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Separator eine Anionenaustauschmembran oder eine Kationenaustauschmembran ist.

17. Elektrolysezelle nach Anspruch 16, worin der Separator eine Anionenaustauschmembran ist.

18. Verfahren zur Markierung eines organischen Materials, wobei Verfahren umfaßt Einbringen des Materials in eine Elektrolysezelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche und wobei das organische Material in die Halbzelle eingebracht wird, die die Arbeitselektrode enthält, Inkontaktbringen des Materials mit einem Markierungsmittel und Leiten eines Stroms durch die Elektrolysezelle.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin das organische Material ein Protein oder Peptid ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 19, worin der Schritt des Inkontaktbringens den Schritt der Zugabe des Markierungsmittels zu der Halbzelle, die die Gegenelektrode enthält, und seines Wandernlassens durch den Separator zur Arbeitselektrode zur Reaktion mit dem zu markierenden Material, umfaßt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, worin der Schritt des Stromleitens den Schritt des Kontrollierens des Arbeitselektrodenpotentials mit der Referenzelektrode (36) umfaßt.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, worin das Markierungsmittel ein radioaktives Markierungsmittel ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, worin das radioaktive Markierungsmittel ein radioaktives Halogenid ist.

24. Verfahren nach Anspruch 23, worin das radioaktive Halogenid I-125 ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, worin der Separator eine Anionenaustauschmembran oder eine Kationenaustauschmembran ist.