DE69221118T2 - Zielkomponenten-Assay - Google Patents

Description

• Diese Erfindung betrifft das Prüfen von Ziel-Bestandteilen von Präparateproben. Genauer betrifft diese Erfindung den Nachweis und/oder das Quantifizieren von Ziel-Zellen, -Partikeln oder -Organismen, hierin im folgenden als "Ziele" bezeichnet, in biologischen Präparateproben durch gleichzeitiges Andern der relativen Dichte und Hervorheben oder Markieren der Ziele.
• Das am 1. Januar 1980 S. C. Wardlaw et. al erteilte US Patent Nr. 4 181 609 offenbart ein Blutanalyse-Verfahren, bei dem bestimmte Blutzellen (Reticulozyten) verdichtet werden, so daß in einer zentrifugierten Blutprobe eine klare Zellen-Grenzfläche ausgebildet wird. So führt die Veränderung der natürlichen relativen Dichte der Reticulozyten zu einem verbesserten Bluttest. Das am 1. Januar 1982 Allen et. al erteilte US Patent Nr. 4 332 785 offenbart ein spezielles Verfahren, das fluoreszierende Antikörper zum Markieren von Reticulozyten bei einer quantitativen Analyse von Reticulozyten in einer Blutprobe verwendet; und das am 27. Mai 1986 Chang erteilte US Patent Nr. 4 591 570 offenbart die Verwendung einer Anzahl unterschiedlicher Antikörper, die punktförmig auf einem Träger angeordnet sind, um in einem Inununoassay-Verfahren eine Mehrzahl verschiedener Antigene festzuhalten. Der Stand der Technik offenbart jedoch nicht ein allgemeines Verfahren, welches das Verändern der relativen Dichte einer Anzahl unterschiedlicher Bestandteile der Präparateprobe beinhaltet, um die veränderten Bestandteile in einer zentrifugierten Präparateprobe anzusammeln und die Bestandteile zu markieren, um sie leicht identifizierbar zu machen. Das gleiche trifft auf EP-A-0 179 007 und EP-A-0 241 042 zu.
• EP-A-0 179 007 offenbart das Entfernen von Zellen aus einem Medium durch Verwenden von Teilchen, die spezifisch an die Ziel-Zellen binden, wobei die Teilchen eine geringere relative Dichte als das Medium haben. Zum Quantifizieren der Menge an Zellen, die an die Teilchen gebunden sind, wird die Probe unter einem Mikroskop betrachtet.
• EP-A-0 241 042 offenbart Mikrokapseln, z.B. Liposome, die ein Markierungsmaterial, z. B. fluoreszierende Substanzen oder Farbstoffe, enthalten, und an deren Oberflächen Antikörper gebunden sind. Zellen, die analysiert werden sollen, werden mit Mikrokapseln mit Antikörpern, die mit ihnen reagieren, vereinigt. Das Markierungsmaterial erlaubt den optischen Nachweis des sich ergebenden Immurikomplexes.
• Diese Erfindung betrifft eine verbesserte Analyse von Ziel-Bestandteilen von Präparateproben, die ein selektives Binden von beobachtbar unterschiedlichen Liposomen an die jeweiligen Ziel-Bestandteile der Probe beinhaltet. Die Liposome werden mittels Antikörpern, die an der Oberfläche der Liposomen befestigt sind, an die Präparat-Bestandteile gebunden. Bei den Antikörpern wird mindestens ein Antikörper sein, der für ein Oberflächen-Antigen, von dem man weiß, daß es an dem Ziel- Bestandteil der Probe vorkommt, spezifisch ist. An die Oberfläche eines einzigen Liposoms können gleichzeitig verschiedene Antikörper gebunden werden, so daß die Analyse für jedes von vielen unterschiedlichen Zielen spezifisch sein kann. Die Differenzierung der Liposome erfolgt bevorzugt durch ein sichtbares oder maschinenlesbares unterscheidendes Markierungsmittel, das im Inneren der Liposome eingeschlossen oder in die Phospholipid-Doppelschicht inkorporiert wird. Das unterscheidende Markierungsmittel kann ein sichtbarer Farbstoff, ein maschinenlesbarer Farbstoff, eine radioaktive Strahlungsquelle oder dergleichen sein.
• Liposome sind mikroskopische, kugelige, künstliche Gebilde, die vorwiegend aus Phospholipiden bestehen. Ein Liposom kann aus einer oder mehreren lamellaren Phospholipid-Vesikula bestehen, die eine geschlossene kugelige Schale bilden, die mit einem Material wie einer Flüssigkeit oder dergleichen beladen oder gefüllt werden kann. Da Liposome eine Größe im Bereich von 150-250 nm haben und die durchschnittliche Dicke einer Lipidmembran 2,5 nm beträgt, ist es offensichtlich, daß die Dichte des Liposoms in erster Linie durch die Dichte der eingeschlossenen Substanz, d.h. des Farbstoffs oder Indikators und des Puffer- oder Trägermediums, bestimmt wird. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Liposomen sind offenbart in "Liposomes: Diagnostic and Therapeutic Applications" von James O'Connell, in der Ausgabe vom Dezember 1988 von Medical Device and Diagnostic Industry, auf den Seiten 31-36.
• Diese Erfindung betrifft die Verwendung von speziell hergestellten Liposomen zur Trennung und Hervorhebung unterschiedlicher Bestandteile einer Präparateprobe. Die Liposome werden mit einem markierenden oder hervorhebenden Material wie einer Flüssigkeit, die ein sichtbares oder maschinenlesbares Färbemittel enthält, oder irgend einem anderen wahrnehnnbaren Bestandteil gefüllt oder beladen. Das Füllmaterial wird eine vorbestimmte relative Dichte haben, die so die relative Dichte der Liposome bestimmen wird. An der Außenoberfläche der Liposome werden ein oder mehrere verschiedene Antikörper gebunden sein, die für verschiedene Oberflächen-Antigene, von denen man weiß, daß sie an verschiedenen Zielen in verschiedenen zu testenden Proben vorkommen, spezifisch sein werden. So könnten die Liposome beispielsweise mit einer fluoreszierenden Flüssigkeit mit einer relativen Dichte von 1,5 gefüllt werden, und es könnten an sie die Antikörper A, B, C und D gebunden sein, die für Oberflächen-Antigene a, b, c und d spezifisch sein würden. Diese Oberflächen-Antigene würden Antigene sein, von denen man weiß, daß sie an einem oder mehrerern Zielen in verschiedenen Präparateproben, die qualitativ oder quantitativ analysiert werden könnten, vorkommen. Auf diese Weise könnte beispielsweise ein einziges Analysenmedium verwendet werden, um mehrere verschledene Proben zu analysieren. Es ist auch möglich, verschiedene Liposome A-D, jedes mit seiner eigenen Dichte, zu verwenden, um die vorgenannten Oberflächen-Antigene a-d gleichzeitig zu untersuchen.
• Aus dem vorstehenden allgemeinen Beispiel wird man erkennen, daß die Erfindung auf medizinischem Gebiet für diagnostische und/oder quantifizierende Verfahren eine umfangreiche Anwendbarkeit besitzt. Man muß bloß die relative Dichte des zu untersuchenden Bestandteils wissen, und welche Oberflächen-Antigene er besitzt. Wenn diese Tatsachen bekannt sind, kann ein Liposom erzeugt werden, um den Bestandteil zu markieren und ihn in der Probe, in der er sich befindet, anzusammeln. Die verwendeten Antikörper können polyklonale oder monoklonale Antikörper sein.
• Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, ein verbessertes Verfahren zum Prüfen einer Präparateprobe auf einen darin befindlichen, bestimmten Ziel- Bestandteil bereitzustellen.
• Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren der beschriebenen Art bereitzustellen, das die relative Dichte des Ziel- Bestandteils verändern und auch die Ziel-Bestandteile hervorheben kann, um sie in der Probe nachweisbar zu machen.
• Es ist noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren der beschriebenen Art bereitzustellen, das die Ziel-Bestandteile in der Probe quantitativ und/oder qualitativ analysieren kann.
• Die Aufgaben werden gelöst durch die Verfahren der Ansprüche 1 und 2. Besonders vorteilhafte Anwendungen werden in den Ansprüchen 3 bis 8 beansprucht.
• Die Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden genauen Beschreibung mehrerer bevorzugter Ausführungsformen davon, wenn sie in Verbindung mit der begleitenden Zeichnung, die eine schematische Ansicht eines zur Verwendung in Verbindung mit dieser Erfindung veränderten Liposoms ist, gesehen werden, deutlicher werden.
• Bezugnehmend auf die Zeichnung, wird eine monolamellare Liposom- Vesikel gezeigt, die allgemein durch die Ziffer 2 bezeichnet wird. Die Membran 4 der Vesikel 2 ist sehr dünn, etwa 40 Å dick, und schließt doch ein im Verhältnis großes Volumen ein. Das Innere der Vesikel enthält eine Markierungsflüssigkeit 6 wie einen Farbstoff oder dergleichen, die eine Trägefflüssigkeit sein oder in einer Trägerflüssigkeit dispergiert sein kann. Die Antikörper 8 sind außen an der Membran 4 gebunden. Als ein Beispiel sind die vier verschiedenen Antikörper A, B, C und D an der Außenseite der Membran 4 gezeigt. Wie vorstehend angegeben, können tatsächlich an jede Vesikel hunderte (oder tausende) verschiedene Antikörper gebunden werden, wenn es gewünscht wird. Man glaubt, daß die Antikörper über die Außenseite der Vesikel 2 bewegbar sind, so daß keine bestimmte Ausrichtung der Vesikel notwendig ist, um das gewünschte Markieren der Ziel- Bestandteile zu erhalten. Man wird bemerken, daß wegen des immens größeren Anteils an eingeschlossenem Markierungsmittel 6 gegenüber der Membran 4 in der Vesikel die relative Dichte des Markierungsmittels 6 und/oder seines Trägers die relative Dichte der Vesikel 2 bestimmt.
• Die Vesikula 2 können nach irgend einem konventionellen Verfahren hergestellt werden, wobei das Markierungsmittel 6 während der Herstellung der Vesikula eingeschlossen wird, wie es in dem vorstehend angegebenen O'Connell-Literaturverweis beschrieben ist. Szoka und Papahadjopoulos beschreiben in ihrem Artikel "Liposomes: Preparation and Characterization", Seiten 69-82, From Physical Structure to Therapeutic Applications, Elsevier/North Holland Biomedical Press 1981, mehrere Verfahren zum Binden von Antikörpern an Liposome. Beispielweise können die Liposome hergestellt werden durch Einschließen von 5 mM Fluorescein-Sulfonsäure-Markierungsmittel, gelöst im 5 mM EDTA-Puffer-Träger, mit einem pH von 4,5. Antikörper können an die intakten Liposome gekoppelt werden über eine Schiff'sche Base, die bei neutralem oder alkalischem pH nach dem von Fiddler und Gray in Vol 86 von Analytical Biochemistry auf den Seiten 716-724 beschriebenen Natriumcyanoborhydrid-Verfahren zu einem stabilen Amid reduziert wird. Dieses Verfahren verwendet Periodat- Oxidation von Liposomen, die 10 Molprozent Lactosylcerebrosid oder gemischte Gehirnganglioside enthalten. Der Oxidationsschritt wird entweder unter sauren (pH 5,5) oder alkalischen (pH 8,4) Bedingungen durchgeführt. Die Dauer der Periodat-Oxidation bei pH 5,5 muß sorgfältig gesteuert werden, um Periodat daran zu hindern, in die Liposome einzutreten. Ein nachfolgender Reduktionsschritt mit Natriumcyanoborhydrid wird bei neutralem pH durchgeführt. Während der Reaktion wird die Unversehrtheit der Vesikula aufrecht erhalten, wie es durch die Tatsache, daß weder eingeschlossene Inhalte aus den Liposomen herauslecken, noch eingeschlossene, durch Periodate spaltbare Bestandteile oxidiert werden, angezeigt wird. Bei der vorgenannten Technik ist die Proteinkopplung wirkungsvoll. Kreuzvernetzen von Protein zu Protein oder Liposom-Aggregation sind bei dem vorgenannten Verfahren keine ernsten Probleme.
• Diese Erfindung kann bei der mengenmäßigen Bestimmung von Reticulozyten in einer Vollblut-Probe verwendet werden. Reticulozyten sind junge Erythrozyten, und die quantitative Messung von Reticulozyten in einer Blutprobe kann verwendet werden, um die Produktionsrate von roten Blutzellen des Körpers zu bestimmen. Die Reticulozyten- Quantifizierung ist wichtig bei der Bestimmung der Ursache von Anämie und sie kann auch verwendet werden, um das Vorliegen eines "kompensierten Blutverlusts", d.h. einer normalen Menge an roten Blutzellen, die nur wegen einer enorm hohen Produktionsrate an roten Blutzellen vorhanden ist, festzustellen. Ein solcher kompensierter Blutverlust kann ein frühes Anzeichen für das Vorliegen gastromtestinaler Blutungen aufgrund von Bösartigkeit oder anderen Ursachen sein. Reticulozyten besitzen das Oberflächen-Antigen Transferrin, an das Antitransferrin-Antikörper binden können. So kann die Reticulozyten-Population einer Vollblut-Probe quantitativ bestimmt werden durch Binden der Antitransferrin-Antikörper an die Membran von Liposomen, die ein flüssiges Färbemittel wie einen Farbstoff oder ein fluoreszierendes Färbemittel, das ein von den Reticulozyten und reifen roten Zellen verschiedenes spezifisches Gewicht hat, enthalten. Die markierenden Liposome werden dann mit der Blutprobe in dem Ausmaß, das erforderlich ist, um alle Reticulozyten in der Blutprobe zu binden, gemischt. Das Gemisch wird dann in ein Blutprobenröhrchen der in dem S. C. Wardlaw et al erteilten US Patent Nr.4 027 660 offenbarten Erfindung gebracht und nach den darin beschriebenen Verfahren quantitativ bestimmt.
• Diese Erfindung kann auch verwendet werden, um T-Lymphozyten und ihre Untergruppen im Blut eines Individuums nachzuweisen und quantitativ zu bestimmen. T-Lymphozyten sind eine Untergruppe von Lymphozyten, die Vermittler von zellulärer Immunität sind; und B- Lymphozyten sind Vermittler humoraler Immunität (Antikörper- Erzeuger).
• Eine Diskussion der Lymphozyten-Reaktivität gegenüber spezifischen Antigenen im Blut ist enthalten in der US-Patentanmeldung Nr.07/340 248, die am 19. April 1989 von Robert A. Levine und Stephen C. Wardlaw eingereicht wurde und zu den erteilten Patenten Nr.5 360 719 und Nr. 5 480 778 führte. Aktivierte Lymphozyten (Lymphoblasten) besitzen Oberflächen-Aktivierungsantigene wie einen Transferrin- Rezeptor, HLA-Dr; Leu-23 und dergleichen. Um die Lymphoblasten nachzuweisen, werden Antikörper, die für eines der vorgenannten Lymphozyten-Antigene spezifisch sind, an Liposome, in die ein geeignetes Markierungsmittel inkorporiert ist, gebunden. Die markierenden Liposome werden dann mit einer Blutprobe für eine Zeit, die geeignet ist, um das Binden der Liposome an irgendwelche Lymphoblasten, die in der Blutprobe vorhanden sein können, zu erlauben, gemischt. Das Gemisch wird dann in ein Blutuntersuchungsröhrchen der in dem US Patent Nr. 4 027 660 beschriebenen Art gezogen und nach den darin beschriebenen Verfahren getestet.
• Da die zu untersuchenden Zellen weiße Zellen sind, wird der Markierungs-Farbstoff bevorzugt mit einer relativen Dichte, die von den weißen Zellen verschieden ist, ausgewählt werden, um irgendwelche markierten Lymphoblasten zu veranlassen, sich vom Rest der weißen Zellen entfernt oder in einer lokalisierten Bande innerhalb der weißen Zellen schichtförmig auszuscheiden. Die Liposome, die in der Lymphozyten-Untergruppen-Auswahl für T-Lymphozyten verwendet werden, haben eine Dichte von weniger als 1,017 g/ml. Lymphozyten haben eine mittlere Dichte von 1,06 g/ml und einen Dichtebereich von 1,055-1,070 g/ml. Daher sind die verwendeten Liposomen in der Lage, die Dichte der Ziel-T-Lymphozyten zu verringern, was sie veranlasst, zum oberen Ende der Lymphozytenschicht hin aufzusteigen.
• Das Folgende ist ein Beispiel der Verwendung der Erfindung für den Nachweis von T-Lymphozyten in einer Blutprobe. Eine Markierungmittel-Zusammensetzung, die 25 µl eines unverdünnten, an mit einem Fluorescein-(fluoreszierenden) Farbstoff beladene Liposome mit einer relativen Dichte von weniger als 1,017 g/ml gekoppelten 55- 2/LEU-1-Antikörpers enthielt, wurde zu 1 ml EDTA-Venenblut hinzugefügt, und zu diesem Gemisch wurden 25 µl unverdünnter 0,42 g/10ml Vorratslösung Natriumfluorid hinzugefügt. Das Natriumfluorid erzeugt eine schärfere Trennung der nicht fluoreszierenden und fluoreszierenden Bestandteile der Lymphozytenzellen-Banden. Zu dem vorgenannten Gemisch wurden 50 µl unverdünnter 1,1 g/10ml Vorratsiösung von Kaliumoxalat hinzugefügt, um eine schärfere rote Zellen-Granulozyten-Trennung zu ergeben, wie es im vorstehend zuerst genannten Stand der Technik beschrieben ist. Das sich ergebende Gemisch ließ man fünf Minuten lang inkubieren, wonach das Gemisch zentrifügiert wurde, um die verschiedenen Zelltypen in einem Kapillar - oder anderen transparenten Röhrchen, das einen Kunstoff- Schwimmkörper, der die verschiedenen Zellen in der Probe ausdehnt, enthielt, zu trennen. Unter Verwendung der vorgenannten Technik wurde in der Schicht aus weißen Zellen eine deutliche Bande von fluoreszierenden Lymphozyten ausgebildet. Diese Bande wurde quantitativ bestimmt durch Messen ihrer axialen Ausdehnung in dem Röhrchen. Der sich ergebende Wert war ein Hinweis auf die in dem Blut zirkulierenden T-Lymphozytenzellen. Wenn Farbstoffe oder Färbemittel mit einer anderen relativen Dichte verwendet werden, können die markierten Zellen dazu gebracht werden, sich woanders in der zentrifügierten Blutprobe auszuscheiden.
• Die Erfindung kann auch zur Analyse anderer Zellen, Teilchen oder Organismen in Proben biologischer Flüssigkeiten verwendet werden. Es ist bekannt, daß das Vorhandensein abnormer Mengen an Beta- Amyloid-Protein (BAP) im Gehirn, der Haut und der Dickdarmschleimhaut von Patienten, die unter der Alzheimerkrankheit, einer degenerativen neurologischen Krankheit leiden, und bei älteren Patienten mit Down-Syndrom, einer auch als Trisomie 21 bekannten angeborenen Krankheit, auftritt. Bis jetzt war BAP in Serum nicht nachweisbar. Die Anwesenheit von BAP in weißen Blutzellen des Lymphozyten-Typs oder anderen Typen kann unter Verwendung von an Liposome gebundenen Antikörpern, die gegen Oberflächenantigene an BAP gerichtet sind, wobei die Antigene an der Oberfläche der im Kreislauf befindlichen Zellen, die BAP erzeugen, exponiert sind, nachgewiesen werden.
• Was den Nachweis von Organismen in Proben biologischer Flüssigkeiten betrifft, sind Malaria-Protozoen im wesentlichen intrazelluläre Organismen, die durch immunologische Mittel innerhalb der roten Blutzellen geortet werden, da Antikörper nicht in der Lage sind, in unversehrten lebenden Zellen die Membran roter Blutzellen zu durchdringen. Malaria-Protozoen des Falciparum-Typs erzeugen in infizierten roten Blutzellen charakteristische Veränderungen der roten Zellen. Es besteht eine lebenswichtige Notwendigkeit, Falciparum- Malaria von nicht-Falciparum-Malaria zu unterscheiden, da die erstere oft tödlich und oft gegen allgemein verwendete Arzneimittel gegen Malaria resistent ist. Für nicht-Fachleute ist es schwierig, zwischen Falciparum-Malaria und nicht-Falciparum-Malaria morphologisch zu unterscheiden. Die Verwendung von markierenden Liposomen, die an rote Zellen, die mit Falciparum-Malaria infiziert sind, binden können, würde einen Techniker befähigen, die Infektion zu identifizieren. Die Antikörper an den Liposomen sind spezifisch für ein Membranoberflächen-Antigen roter Zellen, das bei mit Falciparum infizierten roten Zellen einzigartig ist.

Claims (8)

1. Verfahren zum Prüfen einer Probe einer biologischen Flüssigkeit auf Anwesenheit eines Ziel-Bestandteils in der Probe, folgende Schritte aufweisend:

a) Bereitstellen einer Mehrzahl von Liposom-Vesikula, bei denen an eine Außenoberfläche der Vesikula ein Antikörper gebunden ist, der spezifisch für ein Oberflächen-Antigen an dem Ziel- Bestandteil ist; wobei die Vesikula ein inkorporiertes Markierungsmaterial und/oder Trägermaterial besitzen, das die Vesikula in der Probe der biologischen Flüssigkeit nachweisbar macht, und wobei das Markierungsmaterial und/oder Trägermaterial den Vesikula eine relative Dichte verleiht, die von der relativen Dichte des Ziel-Bestandteils verschieden ist;

b) Zugeben der Vesikula zu der Flüssigkeitsprobe zur Bildung eines Gemisches davon;

c) Zentrifugieren des Gemisches, um irgendwelche Liposom-Ziel Kombinationen zu einem eigenen Band in dem Gemisch abzusondern;

d) Identifizieren und/oder Quantifizieren des eigenen Bands in dem zentrifügierten Gemisch.

2. Verfahren zum Prüfen einer Probe einer biologischen Fkissigkeit auf Anwesenheit mindestens zweier Ziel-Bestandteile in der Probe, folgende Schritte aufweisend:

a) Bereitstellen einer Mehrzahl von ersten Liposom-Vesikula, bei denen an eine Außenoberfläche der ersten Vesikula ein erster Antikörper gebunden ist, der für ein Oberflächen-Antigen an einem der Ziel-Bestandteile spezifisch ist; wobei die ersten Vesikula ein inkorporiertes erstes Markierungsmaterial besitzen, das die ersten Vesikula in der Probe der biologischen Flüssigkeit nachweisbar macht, und wobei das erste Markierungsmaterial den ersten Vesikula eine erste relative Dichte verleiht, die von der relativen Dichte des einen der Ziel- Bestandteile verschieden ist;

b) Bereitstellen einer Mehrzahl von zweiten Liposom-Vesikula, bei denen an einer Außenoberfläche der zweiten Vesikula ein zweiter Antikörper gebunden ist, der für ein Oberflächen- Antigen an einem anderen der Ziel-Bestandteile spezifisch ist; wobei die zweiten Vesikula ein inkorporiertes zweites Nlarkierungsmaterial besitzen, das die zweiten Vesikula in der Probe der biologischen Flüssigkeit nachweisbar macht, und wobei das zweite Markierungsmaterial den zweiten Vesikula eine relative Dichte verleiht, die von der relativen Dichte des anderen der Ziel-Bestandteile verschieden ist, und die auch von der ersten relativen Dichte verschieden ist;

c) Zugeben der Vesikula zu der Flüssigkeits-Probe zur Bildung eines Gemisches davon;

d) Zentrifugieren des Gemisches, um irgendwelche Liposom-Ziel- Kombinationen zu eigenen Bändern in dem Gemisch abzusondern;

e) Identifizieren und/oder Quantifizieren der eigenen Bänder in dem zentrifugierten Gemisch.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Probe der biologischen Flüssigkeit eine Blutprobe ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Ziel-Bestandteil ein bestimmter Blutzellen-Typ ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Ziel-Bestandteil T- Lymphozyten oder ihre Untergruppen sind.

6. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Ziel-Bestandteil Reticulozyten sind.

7. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Ziel-Bestandteil BAP- produzierende Blutzellen sind.

8. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Ziel-Bestandteil Falciparum-infizierte rote Zellen sind.