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Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung
bestimmter Antikörper bei der Vorbeugung und Behandlung von
insulinabhängigem Diabetes Mellitus.
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Insulinabhängiger Diabetes Mellitus (nachfolgend IDDM) ist
die frühe Anfangsform von Diabetes. Derzeit gibt es keine
Heilung für die Erkrankung und die Behandlung besteht in
der Aufrechterhaltung von Insulinleveln durch orale oder
intramuskuläre Verabreichung und Linderung der
unvermeidlichen Nebenwirkungen von beidem, der Krankheit
selbst und der Behandlungen.
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Es bestand ein andauerendes Bedürfnis ein Mittel zum
Stoppen des Verlusts an insulinproduzierenden β-Zellen der
Pancreas zu finden, was das unmittelbare Ergebnis der
zugrundeliegenden Abnormalitäten ist, wobei aber nur ein
geringer Fortschritt gemacht wurde.
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Die vorliegende Erfindung ist auf der überraschenden
Beobachtung gegründet, daß die Verabreichung eines nicht
zellzahlverringernden monoklonalen CD4 Antikörpers (im
nachfolgenden nd CD4 mAb) den Verlust an
insulinproduzierenden Zellen in einem Tiermodell von IDDM
stoppen kann. Es wird nun angenommen, daß die Verwendung
von nd CD4 mAbs wirksam beim Stoppen von IDDM in Menschen
ist und daß diese Behandlung auch die Regenerierung der β-
Zellen erlaubt, so daß der Krankheitsverlauf sogar
umgekehrt werden kann.
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Die WO-A-90/15152 beschreibt die Verwendung von nd CD4 mAbs
und/oder nicht zellzahlverringernden monoklonalen CD8
Antikörpern bei dem Induzieren von Toleranz gegenüber einem
Antigen und schlägt vor, daß dies bei chirurgischer
Behandlung und Therapie verwendbar ist, z.B. bei der
Vorbeugung gegen Transplantat-Abstoßung, Behandlung von
Auto-Immunerkrankungen und bei der Vermeidung unerwünschter
Immunreaktionen gegen therapeutische Peptid- und
Hormonagenzien. Diese Behandlung ist auf die Blockade von
CD4+- und/oder CD8+-Zellen gerichtet.
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Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine
Verwendung eines nicht zellzahlverringernden monoklonalen
anti CD4 Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments zur
Verwendung bei der Behandlung von insulinabhängigem
Diabetes Mellitus bei Menschen oder Tieren bereit.
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Gemäß Autoimmunity 1989, Vol 4, Seiten 1 bis 7, sind
Antikörper, die CD4+-Zellen nur wenig verringern, bei der
Vorbeugung von Insulitis in NOD/Wehi-Mäusen verwendet
worden. Dieser Stamm Mäuse ist zum Entwickeln von Insulitis
gezüchtet worden, obwohl sich bei sehr wenigen Mäusen eine
offene Diabetes entwickelt. Monoklonale anti CD4
Antikörper, entweder zellzahlverringernd oder nicht
zellzahlverringernd, sind auch zur Suppression des
Immunsystems vor der Transplantation von Langerhans-Zellen
verabreicht worden, gemäß Transplantation Proceedings 1990,
Vol 22, Nr. 5, Seiten 2113 bis 2114 bei D2.
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Zellzahlverringernde oder nicht zellzahlverringernde
monoklonale CD4 Antikörper sind auch bei der Behandlung von
systemischem Lupus Erythematosus verwendet worden, gemäß
Clinical Immunology and Immunopathology 1990, Vol 56, 373
bis 383. Typ 1 Diabetes in NOD-Mäusen ist, gemäß J. Japan
Diab. Soc. 1987, Vol 30(1), Seiten 47 bis 49, mit einem
monoklonalen Antikörper gegen L3T4 behandelt worden.
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Wie er hierin verwendet wird, dient der Ausdruck
"Antikörper" dazu jedes bindende Mitglied mit einer
Bindungsregion, die mit einem Epitop aus dem CD4-
Zelloberflächen-Antigen reagiert einzuschließen. Die
Erfindung deckt somit auch Derivate und Homologe von CD4-
Antikörpern, Fragmenten von Antikörpern ab, die wenigstens
eine Antigen-Bindungsstelle enthalten, wie Fab- und
F(ab')&sub2;-Fragmente und "Domänen-Antikörper" (single domain
antibodies) auch bekannt als dAbs. Erfindungsgemäße
monoklonale Antikörper sind Antikörper oder Fragmente
davon, die durch einen Klon von Zellen produziert wurden,
die alle von einer einzigen Antikörper produzierenden Zelle
stammen, die von einem gegen das durch den Antikörper
erkannte Antigen immunisiert ist, oder durch Transformation
einer Zelle mit exprimierbarer DNA, die für den Antikörper
oder ein Fragment davon codiert, wobei diese DNA, die aus
einer Zelle entfernt worden ist, die aus einem Säugetier
erhalten worden ist, das gegen das von dem Antikörper
erkannte Antigen immunisiert ist, oder durch
Rekombinations-Techniken konstruiert wurde. Verfahren der
DNA-Rekombinations-Technologie können zur Herstellung von
Antikörpern oder chimären Molekülen mit geeigneter
Spezifizität für CD4 verwendet werden. Derartige Verfahren
können die Einführung von DNA einschließen, die für eine
variable Region eines Immunoglobulin codiert, oder eine
oder mehrere Komplimentarität bestimmende Regionen, welche
zum Binden von CD4 fähig sind, zu den konstanten Regionen
oder konstanten Regionen plus Rahmenregionen eines
verschiedenen Immunglobulins, z.B. zur Umwandlung eines von
Mäusen stammenden monoklonalen Antikörpers in einen der zum
größten Teil menschliche Immunoglobulin-Characteristika
besitzt (siehe EP 184187A, GB 2188638A). Eine weitere
Möglichkeit ist das ausschließliche Anhängen der variablen
Region eines Antikörpers an ein anderes
nicht-Immunoglobulin-Molekül,
um ein chimäres Molekül
herzustellen (siehe WO 86/01533). Doch eine weitere
Möglichkeit wäre die Erzeugung einer Mutation in der für
den monoklonalen Antikörper codierenden DNA, um so
bestimmte seiner Characteristika zu ändern, ohne dessen
wesentliche Spezifität zu ändern. Dies kann durch
stellengerichtete Mutagenese oder andere auf dem Gebiet
bekannte Verfahren getan werden. Monoklonale Antikörper und
Derivate und Homologe davon und deren Fragmente werden
durch herkömmliche Verfahren hergestellt.
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Wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck
"monoklonaler CD4 Antikörper" auf einen monoklonalen
Antikörper oder ein Fragment davon, das wenigstens eine
Antigen-Bindungsstelle enthält und zur spezifischen Bindung
an ein Epitop eines CD4-Zelloberflächen-Antigens fähig ist.
Der Ausdruck "CD4-Zelloberflächen-Antigen" schließt das
menschliche CD4-Zelloberflächen-Antigen und entsprechende
Zelloberflächen-Antigene anderer Säuger ein, wie das L3T4-
Antigen von Mäusen.
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Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "nicht
zellzahlverringernder monoklonaler CD4 Antikörper" auf
monoklonale CD4 Antikörper, die die Zellzahl weniger als
50 % der Zielzellen in vitro verringern. Bevorzugte nd CD4
mAbs verringern weniger als 25 % und am wahrscheinlichsten
weniger als 10 % der Zielzellen in vitro.
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Ein einfacher Test zur Bestätigung, ob ein CD4 mAb als
nicht zellzahlverringernd anzusehen ist, besteht darin,eine
Probe von peripherem Blut zu nehmen, die Zahl der
Zielzellen, d.h. CD4+-Zellen, in einem Aliquot zum
Vergleich zu zählen, ein weiteres Aliquot mit den CD4 mAb
behandeln und zählen der Zielzellen nach der Behandlung;
wenn 50 % oder größer Zielzellen in dem behandelten Aliquot
im Vergleich mit dem Vergleichsaliquot sind, sind die CD4
mAb erfindungsgemäß nicht zellzahlverringernd.
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Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können nd CD4
mAbs durch herkömmliche Verfahren zum Züchten von mAbs
gegen CD4 und Screening und Auswahl von Klonen, die nicht
zellzahlverringernde Antikörper sekretieren. Typischerweise
sind derartige Antikörper aus der IgG&sub2;-Klasse, wie Ratten
IgG2a, Maus IgG2b oder menschliche IgG&sub2;, wobei aber
menschliche IgG&sub4; auch verwendbar sind. Ein bevorzugter nd
CD4 mAb zur Verwendung im Einklang mit der vorliegenden
Erfindung ist YT5177.9, hergestellt durch ein Hybridom, das
bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter
der Zugangsnummer ECACC 90053005 am 30. Mai 1990 in
Verbindung mit der internationalen Patentanmeldung Nr.
WO90/15152 hinterlegt worden ist.
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Andere bevorzugte nd CD4 mAbs zur Verwendung in der
vorliegenden Erfindung schließen nd CD4 mAb-Fragmente von
YT5177.9 (ECACC 90053005) und nd CD4 mAbs und Fragmente
davon ein, die ähnliche oder höhere Affinität für dieselben
Epitope wie YTS177.9 besitzen.
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Die Behandlung von Diabetes-Patienten kann mit als
gefährdet identifizierten Individuen (z.B. aufgrund einer
Familiengeschichte von IDDM) vor dem Auftreten der
Erkrankung begonnen werden, wobei dies aber allgemein
weniger bevorzugt ist, da angenommen wird, daß dies zu
einer generellen Toleranz des Patienten gegenüber
irrelevanten Antigenen führt, was zu einem Zustand der
Immunsuppression führt. Stärker bevorzugt wird die
Behandlung begonnen, sobald die Erkrankung offenkundig
geworden ist, da der Verlust an β-Zellen in diesem Stadium
begonnen hat und die Behandlung dann hauptsächlich den
Verlauf der Erkrankung stört. Idealerweise wird die
Behandlung begonnen nachdem die Erkrankung offenkundig
geworden ist, so daß der Patient den größten Teil der β-
Zellen beibehält und, sogar wenn keine Regeneration von β-
Zellen eintritt, Insulinlevel einem Management durch
herkömmliche Verfahren aber unter Vermeidung der
Verabreichung von Insulin zugängig sind. Sogar wenn die
Erkrankung bis zu einem späten Stadium fortgeschritten ist,
ist die Behandlung beim Schutz der verbleibenden β-Zellen
des Patienten vorteilhaft.
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Die Behandlung umfaßt die Verabreichung von wenigstens
einer Dosis von nd CD4 mAb und umfaßt bevorzugt einen Gang
mehrerer Dosen. Die exakte, in einer Einzeldosis zu
verabreichende Menge und die Anzahl und zeitliche
Abstimmung jeglicher nachfolgender Dosen wird durch viele
Faktoren einschließlich dem Alter, dem Geschlecht, dem
Gewicht und der Größe des Patienten, der allgemeinen
Gesundheit des Patienten und dem Ernährungszustand und dem
Stadium, zu dem die Erkrankung des Patienten
fortgeschritten ist, bestimmt. Als allgemeine Richtschnur
wird angenommen, daß sättigende Mengen des nd CD4 mAb am
wirksamsten sind und daß derartige Mengen durch
routinemäßige pharmacokinetische Untersuchungen bestimmt
werden können; eine Verabreichung von mehr als solchen
Mengen ist unökonomisch, aber wahrscheinlich nicht
schädlich, wohingegen die Verabreichung von weniger als
sättigenden Mengen audh wirksam sein kann, aber
wahrscheinlich weniger wirksam, so daß zusätzliche Dosen
erforderlich sein können.
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In einem Mausmodell-System werden Dosen von 1 µg bis 2 mg,
bevorzugt von 400 µg bis 1 mg nd CD4 mAb verabreicht. Bei
Menschen können Dosen von 1 bis 400 mg, wie von 3 bis
30 mg, z.B. von 5 bis 20 mg nd CD4 mAb bei einem ansonsten
normalen, gesunden Erwachsenen von ungefähr 75 kg ins Auge
gefaßt werden.
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Typisches Behandlungsverfahren schließen Wiederholungsdosen
ein, die mehrmals pro Woche verabreicht werden, z.B. von
ein- bis siebenmal pro Woche, bevorzugt von ein- bis
viermal pro Woche. Zum Beispiel dreimal pro Woche und
solche Verfahren können für mehrere Wochen oder sogar
Monate andauern, z.B. für wenigstens 2 Wochen und bis zu 6
Monaten, stärker bevorzugt bis zu 2 Monaten. Es ist derzeit
angestrebt, daß eine einzige Behandlungsreihe die
Erkrankung für die Lebenszeit des Patienten heilt, aber
Rückfälle und Wiederauftreten der Erkrankung können mit
weiteren Behandlungsreihen behandelt werden.
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Die nd CD4 mAbs können bevorzugt über herkömmliche Routen
verabreicht werden, wie oral oder parenteral, z.B. mittels
subkutaner oder intramuskulärer, bevorzugt intravenöser,
Injektion. Wo große Dosen zu verabreichen sind, oder die
gewählte Verabreichungsroute die Menge beschränkt, die dem
Patienten in einer einzigen Injektion zur Verfügung
gestellt werden kann, können mehrere Teildosen zum Erzielen
der gewünschten Gesamtdosis verabreicht werden, oder die
Dosis kann z.B. per intravenöser Infusion verabreicht
werden.
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Bequemerweise werden die nd cd4 mAbs in der Form einer
Zusammensetzung verabreicht, die ein pharmazeutisch
verträgliches Verdünnungsmittel oder einen solchen Träger
umfaßt. Bevorzugte Zusammensetzungen sind pharmazeutische
Formulierungen für die orale Verabreichung oder zur
Injektion. Derartige Formulierungen umfassen allgemein,
zusätzlich zu einem herkömmlichen Verdünnungsmittel oder
Träger, geeignete Hilfsbestandteile. Zur oralen
Verabreichung können die Formulierungen in der Form von
Tabletten, Kapseln und anderen diskreten Dosiseinheiten
oder in Multidosisformen, wie rieselfähigen Pulvern oder
Flüssigkeiten präsentiert werden. Zur parenteralen
Verabreichung können die Formulierungen als Lösungen zur
Injektion, konzentrierte Lösungen, die mit einem
Lösungsmittel, z.B. mit pyrogenfreiem, demineralisiertem
Wasser und Wasser zur Injektion vor der Injektion zu
verdünnen sind, und als Trockenpulver zur Auflösung in
einem Lösungsmittel (z.B. Wasser zur Injektion) vor der
Injektion. Die Hilfsbestandteile, die gemäß der Art der
Präsentation ausgewählt werden, können Füllstoffe,
Geschmacksstoffe, Tablettierungshilfen und -beschichtungen,
Konservierungsmittel, Antioxidantien, Stabilisatoren,
Puffer, antimikrobielle Agenzien, oberflächenaktive
Substanzen, Salze zum Einstellen der Tonizität und andere
herkömmliche Inhaltsstoffe sein, die auf dem Gebiet der
Pharmazie allgemein bekannt sind.
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Wie zuvor erwähnt, ist es für die Behandlung ausreichend
eine einzige nd CD4 mAb-Spezies zu verabreichen. Die
Verwendung eines Cocktails von nd CD4 mAbs kann auch in
Erwägung gezogen werden, aber die Verwendung von CDB mAbs
und zellzahlverringernden mAbs ist nicht erforderlich und
wird bevorzugt vermieden. Das Verfahren besteht bevorzugt
aus der Verabreichung einer Zusammensetzung einer einzigen
nd CD4 mAb-Spezies und ist nicht begleitet von einer
Verabreichung irgendeines CD8 mAb und nicht begleitet von
einer Verabreichung von irgendwelchen zellzahlverringernden
mAbs.
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Die Behandlung erfolgt wie zuvor hierin beschrieben,
bevorzugt unter Verwendung von nd CD4 mAb YTS 177.9.
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Die Erfindung wird nun durch das folgende Beispiel
erläutert, das nicht zur Beschränkung des Rahmens der
Erfindung auf irgendeine Weise dienen soll.
Beispiel 1
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Die NOD-Maus wird von vielen als ein gutes Modell für IDDM
betrachtet, da das spontane Auftreten unter Weibchen 60 bis
80 % innerhalb 30 Wochen in den meisten Kolonien beträgt.
Unter Männchen ist das Auftreten viel niedriger (z.B.
weniger als 10 %) und dies macht diese zu einem idealen
Empfänger, wenn durch Bestrahlung immunangepaßt, zur
Induktion der Erkrankung durch den Transfer von Milz-Zellen
von diabetischen Donatoren.
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In dieser Untersuchung wird gezeigt, daß YTS 177 NOD-Mäuse
stark vor IDDM schützt, das durch diabetische Donor-Milz-
Zellen übertragen wurde. YTS 177 ist ein nicht
zellzahlverringernder IgG2a monoklonaler anti CD4 Ratten-
Antikörper, der, obwohl er dasselbe Epitop wie der
zellzahlverringernde IgG2b monoklonale anti CD4 YTS 191.1
(ECACC 87072282) erkennt, eine andere Wirkungsweise
besitzt, da CD4+ T-Zellen nicht eliminiert werden, sondern
erscheinen permanent anergisiert.
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Gruppen von 4 oder 5 Mäusen wurden unter Verwendung einer
Kobalt-Quelle (650 Rad pro Maus) bestrahlt und Milz-Zellen
(2 x 10&sup7; pro Maus) von diabetischen Donatoren wurden am
folgenden Tag intravenös übertragen. Eine Kontrollgruppe
(Gruppe 1) erhielt keine Antikörper-Behandlung. Zwei
Gruppen von Mäusen wurden mit YTS 177 behandelt, das i.v.
(2 mg pro Maus) 3 Tage vor der Übertragung von Milz-Zellen
gegeben wurde, und i.p. (2 mg pro Maus bei jeder
Gelegenheit) an den nächsten zwei Tagen und danach dieselbe
Dosis i.p. dreimal wöchentlich für insgesamt 10 Tage nach
dem Transfer von Milz-Zellen (Gruppe 3) oder bis zu deren
Opferung in Woche 4 (Gruppe 2). Das Experiment wurde nur
für Gruppen 1 und 2 wiederholt.
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Wie aus Tabelle 1 unten zu ersehen (Experimente 1 und 2)
war keine der Mäuse in den Gruppen 1 und 2 hyperglykemisch
in Woche 4, im Vergleich mit 7/9 Kontrolltieren. Drei
Monate später waren sämtliche Mäuse in Gruppe 3 immer noch
normoglykemisch.
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Zusätzlich zur Wiederholung der Gruppen 1 und 2 schloß
Experiment 2 eine Gruppe von Mäusen ein, bei denen eine YTS
177-Behandlung bis 12 Tage nach der Übertragung von Milz-
Zellen verzögert wurde, als es i.v., i.p. und i.p. an 3
aufeinanderfolgenden Tagen und danach dreimal wöchentlich
wie zuvor (Gruppe 4) gegeben wurde. Bei den Experimenten 3
und 4 wurden die Gruppen 1 und 4 wiederholt und die
Verabreichung von zellzahlverringernden CD8 mAb (YTS 169.4;
ECACC 87072284) an eine weitere Gruppe Mäuse (400 µg i.v.,
i.p. und i.p. an 3 aufeinanderfolgenden Tagen) beginnend
12 Tage nach der Übertragung von Milz-Zellen war zum
Vergleich (Gruppe 5) eingeschlossen. Tabelle 1 zeigt, daß
kein Tier in den Experimenten 2, 3 oder 4, denen YTS 177
gegeben wurde, diabetisch wurde, wohingegen 9/13
unbehandelte Tiere und 1/10 mit zellzahlverrringernden CD8
mAb behandelten Tieren in der fünften Woche hyperglykemisch
waren. In Experiment 4 wurde einer weiteren Gruppe Mäuse
(Gruppe 6) der zellzahlverringernde CD4 mAb (YTS 191.1
ECACC 87072282) gegeben, beginnend 12 Tage nach der
Übertragung, wobei irgendein auf diese Tiere übertragener
Schutz kaum signifikant war.
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Die Dosen der in den Experimenten 3 und 4 verabreichten
zellzahlverringernden Antikörper, obwohl wesentlich
geringer als die der nicht zellzahlverringernden YTS 177,
waren zuvor, als die Tiere von praktisch sämtlichen CD4+
oder CD8+ T-Zellen entziehend, gefunden worden.
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Zur Bestätigung der schützenden Wirkung von YTS 177 auf die
Insel-Morpholgie (islet morphology), wurden Cryostat-
Schnitte aus den Bauchspeicheldrüsen von Mäusen aus
Experiment 3 hergestellt und auf infiltrierende T-Zellen
gefärbt. Die Untersuchung von Bauchspeicheldrüsen von
unbehandelten Mäusen, die am 12. Tag nach der Übertragung
geopfert wurden, zeigte, daß eine Peri-Insel-Infiltration
bereits extensiv vorlag, wobei einige Intra-Insel-
Lymphozyten auch vorlagen, obwohl die Anzahl von
verbleibenden Inseln relativ niedrig war (23 %).
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Bauchspeicheldrüsen von Tieren, denen YTS 177 von Tag 12 an
gegeben worden war und die 4 Wochen nach der Übertragung
getötet wurden, waren ununterscheidbar von der vorherigen
Gruppe (19 % Restinseln), was naheliegt, daß der Antikörper
die Infiltration stoppt und jegliche weitere β-
Zellenzerstörung verhinderte.
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Im Gegensatz dazu besaßen die Tiere, denen keine
Antikörperbehandlung gegeben worden war und die nach Woche
4 getötet wurden, intensive Intra-Inselinfiltration und
70 % der Insel waren verbleibend. Gruppe 5 (behandelt mit
zellzahlverringenden CD8 mAb von Tag 12 an), obwohl noch
nicht offen diabetisch, zeigte nichts desto Trotz Beweise
für eine deutlich stärkere 13-Zellenzerstörung (51 %
Restinseln) als die mit YTS 177 behandelten Mäuse. In
Experiment 4, wo man ähnlich behandelte Tiere länger als 4
Wochen leben ließ, war zu sehen, daß nach 8 Wochen 3/5 der
Tiere der Gruppe 5 diabetisch waren, während keine der YTS
177 behandelten Mäuse irgendwelche Zeichen offener
Erkrankung zeigte. In demselben Experiment war zu sehen,
daß der zellzahlverringernde CD4 mAb keinen signifikanten
oder andauernden Schutz lieferte.
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Es könnte argumentiert werden, daß YTS 177 einfach als
Ergebnis einer allgemeinen Immunsuppression wirkt, aber als
SRBC-Mäusen der Gruppe 4 2 Wochen nach Beendigung der YTS
177-Behandlung i.p. verabreicht wurden, oder einer Gruppe
bestrahlter und mit 2 x 10&sup7; normalen Milz-Zellen wieder
hergestellten NOD-Mäusen, war der in den Sera 5 Tage später
gefundene Level von agglutinierendem anti SRBC-Antikörper
in beiden Gruppen vergleichbar.
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Der durch Antikörper YTS 177 verliehene Schutz war
unerwartet stark im Vergleich mit der Wirkung monoklonaler
Antikörper, die eine der zwei hauptsächlichen T-Zell-
Untergruppen verringern. Im letztgenannten Fall kann
erwartet werden, daß neu hervorgebrachte T-Zellen
irgendwann zu einer Antwort gegen β-Zellen fähig sind und
irgendein Schutz somit von beschränkter Dauer wäre. Der nd
CD4 mAb scheint durch Abschalten von β-Zell-spezifischen
Effektoren und, vielleicht, durch Iniziieren eines
schützenden iodotypischen Netzwerks einen permanenten
Schutz bereitzustellen.
Tabelle 1
Anzahl von in der Woche 4 oder 5 nach Übertragung diabetischen Mäusen