DE69133201T2

DE69133201T2 - Klonierung und Expression von Xylanasegenen schimmeliger Herkunft

Info

Publication number: DE69133201T2
Application number: DE69133201T
Authority: DE
Inventors: Leendert Hendrik De Graaff; Abraham Harder; Jan Dirk Rene Hille; Henriette Catharina Van Den Broeck; Albert Johannes Joseph Van Ooyen; Jacob Visser
Original assignee: DSM NV
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1990-07-24
Filing date: 1991-07-24
Publication date: 2003-12-11
Anticipated expiration: 2011-07-25
Also published as: HU215234B; DE69111148D1; JPH05501657A; EP0892065A1; IE912582A1; ATE233818T1; PT98419A; IL98941A0; AU654147B2; HUT63881A; NZ239085A; IE912583A1; NO921134D0; AU8320591A; AU647170B2; FI921232L; DK0463706T3; EP0463706B2; NO921133L; CA2066734A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich Molekularbiologie. Im Besonderen betrifft die vorliegende Erfindung die Clonierung und Überexpression einer Pilz-DNA- Sequenz, die ein Protein codiert, das die Aktivität einer Xylanase hat. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung und Verwendung einer einzelnen Xylanase, die in einer Form erhältlich ist, die von anderen Xylanasen frei ist und im Allgemeinen tatsächlich auch von anderen Enzymen.

Hintergrund der Erfindung

Die Zusammensetzung einer Pflanzenzellwand ist komplex und variabel. Polysaccharide werden hauptsächlich in Form von langen Ketten aus Cellulose (die hauptsächliche strukturelle Komponente der Pflanzenzellwand), Hemicellulose (umfassend verschiedene β-Xylan-Ketten) und Pektin vorgefunden. Auftreten, Verteilung und strukturelle Merkmale von Pflanzenzellwand- Polysacchariden werden bestimmt durch (1) Pflanzenarten; (2) Vielfalt; (3) Gewebetyp; (4) Wachstumsbedingungen; (5) Alterung und (6) Prozessierung von Pflanzenmaterial vor der Verfütterung.
Grundsätzliche Unterschiede bestehen zwischen Monocotyledonen (z. B. Getreide und Gräser) und Dicotyledonen (z. B. Klee, Raps und Sojabohne) und zwischen dem Samen und den vegetativen Teilen der Pflanze (Chesson, 1987; Carré and Brillouet, 1986). Monocotyledonen sind durch die Anwesenheit eines Arabinoxylan-Komplexes als hauptsächliches Hemicellulose-Rückgrat charakterisiert. Die hauptsächliche Struktur der Hemicellulose in Dicotyledonen ist ein Xyloglucan-Komplex. Darüber hinaus werden in Dicotyledonen höhere Pektin-Konzentrationen gefunden als in Monocotyledonen. Die Samen haben im Allgemeinen einen sehr hohen Gehalt an pektinartigen Substanzen, besitzen jedoch einen relativ niedrigen Gehalt an celluloseartigem Material.
Ein Querschnitt-Diagramm einer Pflanzenzelle ist in Fig. 1 gezeigt. In der Zellwand können drei mehr oder weniger miteinander wechselwirkende Polysaccharid-Strukturen unterschieden werden:
(1) Die mittlere Lamelle bildet die äußere Zellwand. Sie dient auch als Anheftungspunkt für die individuellen Zellen miteinander innerhalb der Planzengewebsmatrix. Die mittlere Lamelle besteht hauptsächlich aus Kalziumsalzen von hochgradig veresterten Pektinen;
(2) Die primäre Wand befindet sich unmittelbar innerhalb der mittleren Lamelle. Es ist eine gut organisierte Struktur aus Cellulose-Mikrofibrillen, die in eine amorphe Matrix aus Pektin, Hemicellulose, Phenol-Estern und Proteinen eingebettet ist;
(3) Die sekundäre Wand wird gebildet, sobald die Pflanze heranreift. Während der Wachstums- und Alterungs-Phase der Pflanzen werden Cellulose- Mikrofibrillen, Hemicellulose und Lignin abgelagert.
Die primäre Zellwand reifer, metabolisch aktiver Pflanzenzellen (z. B. Mesophyll und Epidermis) ist für die enzymatische Hydrolyse leichter zugänglich als die sekundäre Zellwand, die in diesem Stadium hochgradig lignifiziert ist.
Es gibt einen hohen Grad an Interaktion zwischen Cellulose, Hemicellulose und Pektin in der Zellwand. Die enzymatische Degradation dieser ziemlich intensiv quervernetzten Polysaccharid-Strukturen ist kein einfacher Prozess. Mindesten fünf verschiedene Enzyme werden benötigt, um zum Beispiel ein Arabinoxylan vollständig aufzubrechen. Die innen stattfindende Spaltung (Endo-Spaltung) wird durch die Verwendung einer Endo-β(1→4)-D-Xylanase bewirkt. Exo-(1→4)-D- Xylanase setzt an dem nicht-reduzierenden Ende des Polysaccharids Xylose-Einheiten frei. Drei andere Enzyme (α- Glucuronidase, α-L-Arabinofuranosidase und Acetyl-Esterase) werden verwendet, um Substituenten an dem Xylan-Rückgrat zu attackieren. Die Wahl der spezifischen Enzyme ist natürlich von der spezifischen zu degradierenden Hemicellulose abhängig (McCleary and Matheson, 1986).
Für bestimmte Anwendungen ist jedoch die vollständige Degradation der gesamten Hemicellulose in Monomere nicht notwendig oder nicht erwünscht. Bei der Verflüssigung von Arabinoxylan zum Beispiel braucht man einfach nur das hauptsächliche Xylan-Rückgrat in kleinere Einheiten zu spalten. Dies kann durch die Wirkung einer Endo-Xylanase erreicht werden, was letztendlich in einem Gemisch aus Xylose- Monomereinheiten und Oligomeren wie Xylobiose und Xylotriose resultiert. Diese kürzeren Untereinheiten sind dann ausreichend löslich für die gewünschte Verwendung.
Filamentöse Pilze sind weitläufig für ihre Fähigkeit bekannt, eine große Menge einer Vielzahl hydrolytischer Enzyme wie α-Amylasen, Proteasen und Amyloglucosidasen und verschiedene Pflanzenzellwand abbauende Enzyme wie Cellulasen, Hemicellulasen und Pektinasen zu sekretieren. Unter diesen sind zahlreiche Xylan abbauende Enzyme nachgewiesen worden, von denen gezeigt wurde, dass sie eine Vielfalt biochemischer und physikalischer Eigenschaften besitzen. Diese Heterogenität in der Xylanase-Funktion erlaubt die Selektion einer Xylanase von Interesse, die für eine gewünschte Anwendung am besten geeignet ist (vgl. Wong et al. (1988), Woodward (1984) und Dekker and Richards (1977)).
Zahlreiche Xylanasen unterschiedlicher Molekulargewichte werden bekanntermaßen von Mikroorganismen wie Aspergillus niger, Clostridium thermocellum, Trichoderma reesei, Penicillium janthinellum sowie Arten von Bacillus und Streptomyces produziert.
Im Gegensatz dazu wurde in Hefe keine Xylanase-Vielzahl beobachtet. In drei Hefe-Gattungen, Trichosporon, Cryptococcus und Aureobasidium, konnte nur eine einzige Xylanase nachgewiesen werden.
In der Natur werden mikrobielle Xylanasen immer zusammen mit anderen Enzymen produziert, die Polysaccharid abbauende Eigenschaften besitzen, wie Exo-Arabinanase, Acetyl-Esterase und Cellulasen. Für einige Anwendungen sind diese Enzym- Aktivitäten nicht notwendig oder unerwünscht.
Es ist bekannt, dass die Fermentationsbedingungen variiert werden können, um die Herstellung eines Enzyms von Interesse zu begünstigen. Es ist auch bekannt, dass die Clonierung des Gens, das das gewünschte Enzym codiert, und dessen Überexpression in seinem natürlichen Wirt, oder anderen kompatiblen Expressionswirten, die Herstellung des Enzyms von Interesse spezifisch verstärken wird. Dieses letztere Verfahren ist besonders zweckmäßig, wenn das Enzym von Interesse in einer Form erhalten werden soll, die frei von unerwünschten Enzymaktivitäten ist.
Die Expression von rekombinanter bakterieller Xylanase ist zuvor in der Europäischen Patentanmeldung 121.138 beschrieben worden. Das Gen, das die bakterielle Xylanase codiert, wurde aus der chromosomalen DNA von Bacillus isoliert und in einem E. coli-Wirt zur Expression gebracht. E. coli-Expressionswirte werden jedoch in einigen Fällen aufgrund ihrer Herstellung nicht akzeptabler Nebenprodukte wie Toxine als unsicher für die Produktion von Proteinen bei Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren angesehen,.
Da bakterielle Gene keine Introns enthalten, wird man mit einigen Problemen bei der Clonierung und Expression solcher Gene in prokaryontischen Wirten konfrontiert. Andererseits ist die Expression eukaryontischer Gene nicht immer so einfach. Es ist gut bekannt, dass Gene, die aus eukaryontischen Stämmen isoliert wurden, Introns enthalten. Dies an sich bringt schon Schwierigkeiten bei der Clonierung und Expression dieser Gene mit sich, falls ein prokaryontischer Wirt bevorzugt sein sollte.
Darüber hinaus existieren im Allgemeinen bestimmte Unterschiede zwischen den physikalischen Eigenschaften der Xylanasen von Pilz-Ursprung und denjenigen aus Bakterien. Im Allgemeinen haben Pilz-Xylanasen ein pH-Optimum im Bereich zwischen pH 3,5 bis 5,5 im Vergleich zu bakteriellen Xylanasen, die im Allgemeinen ein pH-Optimum im Bereich von pH 5,0 bis 7,0 besitzen. Pilz-Xylanasen haben im Allgemeinen auch einen breiteren pH-Stabilitätsbereich (pH 3 bis 10) als ihre bakteriellen Gegenstücke (pH 5,0 bis 7,5). Pilz-Xylanasen haben im Allgemeinen ein Temperatur-Optimum von etwa 50ºC. Bakterielle Xylanasen haben im Allgemeinen ein Temperatur- Optimum zwischen 50ºC und 70ºC. Für eine weitere Diskussion der physikalischen Eigenschaften von Xylanasen vgl. Wong et al. (1988), Woodward (1984) und Dekker and Richards (1977).
Somit ist es klar, dass bakterielle Xylanasen weniger geeignet sind zur Verwendung in zum Beispiel Verfahren, die niedrigere pH-Bedingungen erfordern. In anderen Fällen sind bakterielle Xylanasen zu thermostabil für bestimmte Anwendungen wie die Lagerung von Bier (vgl. Europäisches Patent Nr. 227.159).
Demgemäß wäre es von großer Wichtigkeit, Gene zu erhalten, die Xylan abbauende Enzyme codieren, die von Pilzen abstammen, die in anderen mikrobiellen Expressionswirten mit hoher Produktion zur Expression gebracht werden können.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft gereinigte und isolierte DNA-Sequenzen von Pilz-Ursprung, entsprechend der Definition in Anspruch 1, die Proteine codieren, die Xylan abbauende Aktivität besitzen. Diese DNA-Sequenzen beinhalten die Xylanase codierende Sequenz und bevorzugt ebenso die benachbarten regulatorischen 5'- und 3'-Sequenzen.
Es ist auch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Konstrukte zur mikrobiellen Überexpression der Xylanase codierenden Sequenzen bereitzustellen, wobei entweder deren native regulatorische Sequenzen verwendet werden oder in einer alternativen Ausführungsform, die Xylanase codierende Sequenz funktionell mit ausgewählten regulatorischen Regionen verbunden ist, wie Promotor, Sekretions-Leader- und Terminations-Signalen, die in der Lage sind, die Überexpression des Xylanase-Proteins in einem geeigneten Expressionswirt zu steuern.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, mikrobielle Expressionswirte bereitzustellen, die mit dem erfindungsgemäßen Expressionskontrukt transformiert sind und die zu der Überexpression und, falls gewünscht, zur Sekretion einer Xylanase von Pilz-Ursprung fähig sind.
Es ist noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstellung einer Xylanase von Interesse bereitzustellen, die wiederum vorteilhaft in einem industriellen Verfahren verwendet werden kann. Typischerweise erfordert ein solcher industrieller Prozess Xylanase-Aktivität bei einem niedrigeren pH-Wert als demjenigen, bei dem Xylanasen von bakteriellem Ursprung optimal funktionieren.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1: Ein Querschnittsdiagramm einer Pflanzenzelle
Fig. 2: HPLC-Elutionsprofil eines Kulturfiltrats, das von Aspergillus niger DS16823 (CBS 323.90) erhalten wurde. Dieser Stamm wurde später reklassifiziert, insofern, dass er wahrscheinlicher zu der Art Aspergillus tubigensis gehört.
Fig. 3: Oligonucleotid-Sonden AB801-AB806, entworfen entsprechend der; N-terminalen Aminosäuresequenz des Aspergillus tubigensis XYL A-Proteins (Formel 1).
Fig. 4: Oligonucleotid-Sonde AB1255, entworfen entsprechend der N-terminalen Aminosäuresequenz eines internen 19 kDa-Fragments des Aspergillus tubigensis XYL A- Proteins, das mit der S. aureus V8-Endopeptidase gespalten wurde (Formel 2).
Fig. 5: Restriktionskarte der genomischen Region, die das xln A-Gen enthält, wie sie anhand einer Southern Blot- Analyse des Bakteriophagen lambdaxln3 erhalten wurde. Es sind die hybridisierenden Fragmente und deren entsprechende Längen angegeben.
Fig. 6: Strategie, die angewendet wurde, um das Aspergillus tubigensis xln A-Gen zu sequenzieren. Die Pfeile geben die Richtung und die Anzahl der Basenpaare an, die sequenziert wurden.
Fig. 7: Restriktionskarte von pIM100, das 6,9 kb-SalI- Fragment enthaltend, das das Aspergillus tubigensis xln A-Gen umfasst. Zusätzlich zu den zwei angegebenen HindIII-Stellen sind zwei weitere HindIII-Stellen in der Plasmid-Insertion vorhanden.
Fig. 8: Nucleotidsequenz des Aspergillus tubigensis xln A- Gens. Die Positionen des Introns und des Propeptids sind mutmaßlich.
Fig. 9: Darstellung eines Zymogramms, das das XYL A-Protein, exprimiert durch die Tranformanten TrX2 und TrX9, zeigt.
Fig. 10: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, die die Expression des XYL A-Proteins in A. niger CBS 513.88 (A) und A. niger N593 (B) zeigt.
Fig. 11: Native Gradienten-PAGE, die das XYL A-Protein, exprimiert durch die A. niger CBS 513.88- Transformanten Nr. 10, 29 und 1.1, zeigt, gefärbt mit CBB (A) und mit einem RBB-Xylanüberzug (B).
Fig. 12: Physikalische Karte von pXYL1, das das xln A-Gen in einem 2,1 kbp-PstI-Fragment im pTZ18R enthält [Abrkürzungen: H = HindIII; P = PstI; B = BamHI; K = KpnI; E = EcoRI; X = XhoI; und S = SalI]
Fig. 13: Physikalische Karte von pAB 6-1. Die 14,5 kbp- HindIII-DNA-Insertion in pUC19 enthält den gesamten Amyloglucosidase (AG)-Locus von A. niger.
Fig. 14: Eine schematische Ansicht der Erzeugung von AG- Promotor/Xylanase-Genfusionen, die mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt wurde.
Fig. 15: Herstellungspfad des Zwischenprodukt-Plasmids pXYL2AG. [Abkürzungen: vgl. Fig. 12]
Fig. 16: Herstellungspfad des Zwischenprodukt-Plasmids pXYL2. [Abkürzungen: vgl. Fig. 12].
Fig. 17: Herstellungspfad des Zwischenprodukt-Plasmids pXYL3AG. [Abkürzungen: vgl. Fig. 12]
Fig. 18: Herstellungspfad des Zwischenprodukt-Plasmids pXYL3. [Abkürzungen: vgl. Fig. 12].
Fig. 19: Schematische Darstellung der Konstrukte, die hergestellt wurden, indem Deletionen in der xln A- Promotorregion erzeugt wurden. Zur Orientierung ist die XbaI-Stelle angezeigt, die bei der Clonierung des A. niger pyr A-Gens verwendet wurde.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt gereinigte und isolierte DNA-Sequenzen von Pilz-Ursprung, die Xylanasen und genetische Varianten davon codieren, wie in Anspruch 1 definiert. Die DNA-Sequenz beinhaltet vorzugsweise die Xylanase codierende Sequenz und benachbarte regulatorische 5'- und 3'-Sequenzen. Genetische Variationen beinhalten Hybrid- DNA-Sequenzen, die die Xylanase codierende Sequenz gekoppelt an regulatorische Regionen enthalten, wie Promotor, Sekretions- und Terminations-Signale, die von homologen oder heterologen Organismen abstammen. Genetische Variationen beinhalten auch DNA-Sequenzen, die mutierte Xylanase-Proteine codieren, und degenerierte DNA-Sequenzen, in denen die Xylan abbauende Aktivität des Enzyms erhalten bleibt. Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, mit den Xylanase und genetischen Variationen davon codierenden DNA-Sequenzen, wie vorstehend beschrieben, zu hybridisieren, die sich jedoch aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes oder aufgrund von Variationen durch Artenkreuzung in der Codon-Sequenz unterscheiden können. Diese sind ebenfalls in Anspruch 1 spezifiziert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch DNA-Konstrukte (Vektoren in den Ansprüchen) für die Expression einer Xylanase von Interesse in einem gewünschten Expressionswirt bereit. Diese beinhalten Hybrid-DNA-Sequenzen, die die Xylanase codierende Region funktionell verbunden mit regulatorischen Regionen enthalten, wie Promotor-, Sekretions- und Terminations-Signale, die von homologen oder heterologen Organismen abstammen, wobei diese regulatorischen Regionen in der Lage sind, die Überexpression des Enzyms, das durch die Xylanase codierende DNA-Sequenz codiert wird, in einem geeigneten Wirt zu steuern. Vorzugsweise wird das Expressionskonstrukt in das Genom des ausgewählten Expressionswirts integriert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Vektoren, vorzugsweise Plasmide, für die Clonierung und/oder Transformation von mikrobiellen Wirten durch das Einbringen der DNA-Konstrukte in den mikrobiellen Wirt zur Expression der Xylanase von Interesse. Vektoren, die zu der Erfindung gehören, sind in den Ansprüchen definiert, ebenso wie die mikrobiellen Wirte.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung homologe oder heterologe Wirte, die mit den vorstehend beschriebenen DNA-Konstrukten transformiert wurden. Mikrobielle Expressionswirte können ausgewählt werden aus Bakterien, Hefen oder Pilzen.
Im Zusammenhang mit der vorliegende Erfindung wird der Begriff "homolog" so verstanden, dass alles berücksichtigt ist, was nativ ist in Bezug auf die DNA-Sequenz, die die Xylanase von Interesse codiert, einschließlich deren regulatorische Regionen. Ein homologer Wirt ist definiert als die Art, von der eine solche DNA-Sequenz isoliert werden kann.
Der Begriff "heterolog" ist somit so definiert, dass alles gemeint ist, was nicht nativ ist zu der DNA-Sequenz selbst, die die Xylanase von Interesse codiert, einschließlich regulatorischer Regionen. Ein "heterologer" Wirt ist definiert als jede mikrobielle Art, die von derjenigen abweicht, von der das Xylanase codierende Gen isoliert worden ist.
Innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung wird eine Xylanase von Interesse so verstanden, dass ein Xylan abbauendes Enzym umfasst ist, das in natürlicher Weise von einem filamentösen Pilz hergestellt wird. Xylanasen von besonderem Interesse sind diejenigen, die natürlicherweise von filamentösen Pilzen der Gattung Aspergillus hergestellt werden. Besonders bevorzugte Xylanasen sind diejenigen, die von Aspergillus tubigensis abstammen.
Eine Endo-Xylanase von Interesse kann über Testverfahren identifiziert werden, die für die vorliegende Erfindung nicht kritisch sind, wie ein Spot (Fleck)- Testsystem. Gemäß diesem Verfahren kann ein Filtrat, das aus der Züchtung eines Mikroorganismus, der dazu veranlasst wird (z. B. mit Haferspelz-Xylan), eine Endo-Xylanase zu produzieren, erhalten wird, auf die Anwesenheit von Endo- Xylanase-Aktivität getestet werden. Tropfen der eluierten Fraktionen werden einzeln auf einen Agarfilm aufgebracht, der einen Citrat-Phosphat-Puffer (vgl. Beispiel 1.1, nachfolgend) und Haferspelz-Xylan enthält. Der Film wird dann inkubiert. Falls Endo-Xylanase-Aktivität vorliegt, wird die Lage der einzelnen Tropfen auf dem Agarfilm sichtbar klar.
Sobald eine Xylanase von Interesse identifiziert worden ist, kann die DNA-Sequenz, die eine solche Xylanase codiert, aus dem filamentösen Pilz, der sie natürlicherweise produziert, erhalten werden, indem der Pilz in einem Xylan enthaltenden Medium gezüchtet wird, die gewünschte Xylanase unter Verwendung bekannter Verfahren wie Säulen- Chromatographie (z. B. HPLC - vgl. Fig. 2) isoliert und mindestens ein Teil der Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins bestimmt wird.
Danach können DNA-Sonden entworfen werden, indem auf der Grundlage der partiellen Aminosäuresequenz Oligonucleotid- Sequenzen synthetisiert werden. Aminosäuresequenzen können von dem N-terminalen Ende des vollständigen Proteins und/oder von den N-terminalen Enden interner Peptid-Fragmente bestimmt werden, die über proteolytische oder chemische Spaltung des vollständigen Proteins erhalten wurden. Sobald diese vorliegen, kann (können) dann die DNA-Sonde(n) verwendet werden, um eine genomische oder cDNA-Bibliothek zu durchmustern.
Falls dieses Verfahren nicht erfolgreich ist, kann die genomische Bibliothek mit cDNA-Sonden differentiell durchmustert werden, die anhand von mRNA aus nicht-induzierten und induzierten Zellen erhalten wurden. Induzierte mRNA wird aus Zellen hergestellt, die auf Medium gewachsen sind, das Xylan als eine Kohlenstoffquelle enthält, während nicht- induzierte mRNA aus Zellen isoliert werden muss, die auf einer anderen Kohlenstoffquelle als Xylan gewachsen sind, z. B. Glucose. Unter den Clonen, die ausschließlich mit der induzierten cDNA-Sonde hybridisieren, kann ein Clon erhalten werden, der das gewünschte Xylanase-Gen enthält. In einer alternativen Ausführungsform kann ein Xylanase-Gen durch Kreuz-Hybridisierung mit einer verwandten Xylanase-Sequenz identifiziert werden.
Eine genomische Bibliothek kann hergestellt werden, indem eine chromosomale Pilz-DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym, z. B. Sau3A, partiell gespalten wird und die resultierenden Fragmente in einem geeigneten Plasmid oder einem lambda-Phagen-Vektor, z. B. lambda EMBL 3, cloniert werden. Nachfolgend, nach Ausplattieren einer ausreichenden Menge von Kolonien oder Plaques, kann die genomische oder cDNA-Bibliothek mit einer geeigneten DNA-Sonde durchmustert werden.
In einer alternativen Ausführungsform kann eine cDNA- Bibliothek hergestellt werden, indem cDNA, die von mRNA synthetisiert wurde, die aus zur Synthese von Xylanase veranlassten Pilzzellen isoliert wurde, in einen geeigneten Phagen-Vektor cloniert wird, z. B. lambda gt10 oder lambda gt11. Die cDNA-Bibliothek kann dann mit einer DNA-Sonde oder in einer alternativen Ausführungsform unter Verwendung von immunologischen Mitteln oder mit Hilfe eines Plattentests durchmustert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Oligonucleotid-Sonden ausgehend von der N- terminalen Aminosäuresequenz (vgl. Fig. 3, Formel 1) einer Xylanase entworen, die ein offensichtliches Molekulargewicht von 25 kDa besitzt und aus einem Aspergillus tubigensis- Kulturfiltrat aufgereinigt wurde, und/oder ausgehend von der Aminosäuresequenz eines internen Peptid-Fragments (vgl. Fig. 4, Formel 2), das durch Spaltung der Xylanase mit Staphylococcus aureus-Endoprotease V8 erhalten wurde, entworfen. Die Oligonucleotid-Gemische, wie in den Fig. 3 und 4 gezeigt, sind komplementär zu der entsprechenden abgeleiteten Xylanase-mRNA. Aus dem Durchmustern einer lambda EMBL 3-Bibliothek, die aus partiell mit Sau3A gespaltener DNA, die aus Aspergillus niger DS16813 isoliert wurde, erhalten wurde, mit dem N-terminalen Oligo-Gemisch AB800 (ein Gemisch gleicher Mengen von AB801 bis AB806, vgl. Fig. 3) wurden vier positive Phagenclone erhalten. Aspergillus niger DS16813, später reklassifiziert als wahrscheinlicher zu der Art Aspergillus tubigensis gehörend (Kusters-van Someren et al. (1991)), wurde am 20. Juli 1990 beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande hinterlegt und erhielt die Bezeichnung CBS 323.90.
Die DNA, die aus den vier Phagen-Clonen isoliert wurde, hybridisierte mit dem N-terminalen Oligo-Gemisch sowie mit dem Oligo-Gemisch, das von der Aminosäure-Sequenz des internen Fragments abstammt (vgl. Fig. 4). Die Restriktionsenzym-Analyse offenbarte, dass alle vier Clone DNA aus derselben genomischen Region von A. tubigensis enthielten.
Eine Region von ungefähr 2,1 kb, die mit beiden Oligo-Gemischen hybridisierte, wurde sequenziert. Die Nucleotidsequenz, wie in Fig. 8 gezeigt, umfasst eine Xylanase codierende Sequenz von 681 bp (die von einem kleinen Intron von 49 bp, Position 1179-1230, unterbrochen ist) sowie Sequenzen von 949 und 423 Nucleotiden der flankierenden 5'- bzw. 3'-Regionen.
Varianten unter den gereinigten Xylanase-Proteinen wurden ebenfalls entdeckt. Es wurde bestimmt, dass die entsprechenden Xylanasen drei unterschiedliche N-terminale Enden besitzen, möglicherweise als ein Ergebnis der Fermentationsbedingungen. Ungefähr ein Drittel dieser Xylanasen haben Serin als die N-terminale Aminosäure (Fig. 8, Position 1), ungefähr ein weiteres Drittel haben Alanin als die N-terminale Aminosäure (Fig. 8, Position 2) und die restlichen Proteine haben Glycin als die N-terminale Aminosäure (Fig. 8, Position 3).
Die Verfügbarkeit einer DNA-Sequenz, die ein Xylanase-Protein codiert, ermöglicht mit Hilfe einer ortsgerichteten Mutagenese die Konstruktion von Xylanase- Mutanten. Wenn die Tertiärstruktur der Xylanase bekannt ist und deren katalytische und Substrat bindende Domänen lokalisiert sind, können Aminosäuren für die Mutagenese ausgewählt werden (zum Beispiel mit Hilfe einer Computer- Modellierung), die am wahrscheinlichsten die katalytischen und/oder Substrat bindenden Funktionen beeinflussen. Wenn die Tertiärstruktur des Proteins nicht verfügbar ist, können entweder zufällige Mutanten über die vollständige codierende Sequenz hergestellt werden, oder die Tertiärstruktur des Proteins kann durch Vergleich mit ähnlichen bekannten Xylanasen vorhergesagt werden, die aus anderen Mikroorganismen isoliert wurden.
Um die Insertion des DNA-Fragments, das die Xylanase codierende Sequenz enthält, in Expressionskonstrukte, die eine oder mehrere heterologe regulatorische Regionen enthalten, zu erleichtern, kann die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Ehrlich, H. A. (Herausgeber), 1989) verwendet werden, um geeignete Restriktionsenzym-Schnittstellen in die 5'- und 3'- Enden der Xylanase codierenden Sequenz einzubringen. Die Wahl von Restriktions-Schnittstellen hängt von der DNA-Sequenz des Expressionsvektors ab, d. h. der Anwesenheit anderer Restriktions-Schnittstellen innerhalb des DNA-Moleküls.
Um die Überexpression des Xylanase-Proteins in der ursprünglichen (homologen) Produktionsart zu erhalten, oder in einer anderen Ausführungsform in einem anderen Pilzstamm, wird ein 6,9 kb-SalI-Fragment (vgl. Fig. 5), das das vollständige Gen mit seinen regulatorischen 5'- und 3'-Regionen umfasst, oder in einer anderen Ausführungsform das vollständige Gen, fusioniert mit den regulatorischen Regionen von anderen Genen, in den ausgewählten Expressionswirt eingebracht, um die Kopienzahl des Gens und als Folge davon die Protein-Expression zu erhöhen.
Wenn ein heterologer Expressionswirt bevorzugt wird, und ein Hefe- oder ein Bakterien-Stamm ausgewählt wird, wird eine nicht unterbrochene (intronlose) DNA-Sequenz zur Herstellung eines heterologen Expressionsvektors verwendet, um die Möglichkeit zu vermeiden, das Spleiß-Signale, die sich in dem genomischen Fragment befinden, von dem heterologen Wirt nicht erkannt werden. Diese nicht unterbrochene DNA-Sequenz kann aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die anhand von mRNA konstruiert wurde, die aus zur Synthese von Xylanasen veranlassten Zellen isoliert wurde. Diese Bibliothek kann mit einem Oligonucleotid oder einer cDNA-Sonde, die, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde, durchmustert werden. In einer alternativen Ausführungsform kann eine nicht unterbrochene DNA-Sequenz erhalten werden, indem eine Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt wird, wobei geeignete 5'- und 3'-Oligonucleotide auf dem ersten cDNA-Strang verwendet werden, der anhand der RNA von Xylan induzierten Zellen synthetisiert wurde.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist Überexpression definiert als die Expression der Xylanase von Interesse in Mengen oberhalb denjenigen, die gewöhnlich in dem homologen Wildtyp-Organismus gefunden werden. Im gleichen Zusammenhang betrifft Überexpression auch die Expression der Xylanase von Interesse in einem heterologen Organismus, der normalerweise keine solche Xylanase produziert, außer wenn die DNA-Sequenz, die die Xylanase von Interesse codiert, in den heterologen Expressionswirt eingebracht wurde. Nachkommen dieser Expressionswirte sind selbstverständlich auch als von der vorliegenden Erfindung umfasst zu verstehen.
Überexpression der Xylanase von Interesse kann auch durch die Auswahl von heterologen regulatorischen Regionen erzielt werden, z. B. Promotor-, Sekretions-Leader und Terminationsregionen, die dazu dienen, die Expression und, falls gewünscht, die Sekretionsspiegel des Proteins von Interesse aus dem ausgewählten Expressionswirt zu erhöhen und/oder die induzierbare Kontrolle der Expression der Xylanase von Interesse bereitzustellen.
Neben dem nativen Promotor der Xylanase von Interesse können andere Promotoren verwendet werden, um deren Expression zu steuern. Der Promotor kann hinsichtlich seiner Wirksamkeit der Steuerung der Expression der Xylanase von Interesse in dem gewünschten Expressionswirt ausgewählt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann ein konstitutiver Promotor ausgewählt werden, um die Expression der gewünschten Xylanase relativ frei von anderen Xylanasen zu steuern. Ein solches Expressionskonstrukt ist darüber hinaus von Vorteil, da so die Notwendigkeit umgangen wird, die Expressionswirte in einem Medium zu züchten, das feste Xylane als ein induzierendes Substrat enthält.
Beispiele von starken konstitutiven und/oder induzierbaren Promotoren, die für die Verwendung in Pilz- Expressionswirten bevorzugt sind, sind die Promotoren der ATP- Synthetase, Untereinheit 9 (oliC), Triosephosphat-Isomerase (tpi), Alkoholdehydrogenase (adhA), α-Amylase (amy), Amyloglucosidase (AG), Acetamidase (amdS) und Glycerinaldehyd- 3-phosphat-dehydrogenase (gpd).
Beispiele für starke Hefe-Promotoren sind die Promotoren der Alkoholdehydrogenase, Lactase, 3- Phosphorglyceratkinase und Triosephosphat-Isomerase.
Beispiele für starke bakterielle Promotoren sind die α-Amylase- und Spo2-Promotoren sowie Promotoren von extrazellulären Protease-Genen.
Hybrid-Promotoren können auch vorteilhaft verwendet werden, um die induzierbare Regulation des Expressionskonstrukts zu verbessern.
Bevorzugte erfindungsgemäße Promotoren sind diejenigen, die von dem Amyloglucosidase (AG)-Gen abstammen, und native Xylanase-Promotoren.
Es ist häufig wünschenswert für die Xylanase von Interesse, dass sie von dem Expressionswirt in das Kulturmedium sekretiert wird, woraus die Xylanase dann leichter gewonnen werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die native Sekretions-Leadersequenz der Xylanase von Interesse verwendet werden, um die Sekretion der exprimierten Xylanase zu bewirken.
Ein Anstieg in der Expression der Xylanase resultiert jedoch manchmal in der Herstellung des Proteins in Mengen oberhalb denjenigen, die der Expressionswirt prozessieren und sekretieren kann, wobei ein Anstieg an Proteinprodukt innerhalb der Zelle aufgrund eines Engpasses im Transport des Proteins durch die Zellwand entsteht. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch heterologe Leader-Sequenzen, um die wirkungsvollste Sekretion der Xylanase aus dem ausgewählten Expressionswirt bereitszustellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Sekretions- Leader-Sequenz auf der Grundlage des gewünschten Expressionswirts ausgewählt werden. Es kann eine heterologe Sekretions-Leader-Sequenz ausgewählt werden, die mit den anderen regulatorischen Regionen des Expressionskonstrukts homolog ist. Es kann zum Beispiel die Leader-Sequenz des hochgradig sekretierten Amyloglucosidase-Proteins in Kombination mit dem Amyloglucosidase-Promotor selbst verwendet werden, sowie in Kombination mit anderen Promotoren. Hybrid- Signal-Sequenzen können ebenfalls im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorteilhaft verwendet werden.
Beispiele für bevorzugte heterologe Sekretions- Leader-Sequenzen sind diejenigen, die von dem Amyloglucosidase-Gen (Pilze), dem α-Faktor-Gen (Hefen) oder dem α-Amylasegen (Bacillus) abstammen.
Die erfindungsgemäß am meisten bevorzugten Sekretions-Leader-Sequenzen sind diejenigen, die von dem Amyloglucosidase (AG)-Gen und der nativen Xylanase-Leader- Sequenz abstammen.
Im Allgemeinen geht man nicht davon aus, dass Terminationssequenzen kritische Elemente für die Überexpression von Genen sind. Falls gewünscht, kann eine Terminationssequenz aus dem gleichen Gen ausgewählt werden wie die Promotoren oder in einer anderen Ausführungsform kann die homologe Terminationssequenz verwendet werden.
Zusätzlich zu dem vorstehend erwähnten genomischen Fragment kann die transformierende DNA einen Selektionsmarker enthalten, um die Zellen, die das gewünschte Gen enthaltendes, von der Masse an nicht transformierten Zellen zu unterscheiden. Dieser Selektionsmarker, der mit den entsprechenden regulatorischen 5'- und 3'-Sequenzen bereitgestellt wird, kann sich auf dem gleichen DNA-Molekül befinden, das das gewünschte Gen enthält, oder kann auf einem gesonderten Molekül vorliegen. In letzterem Fall muss eine Co- Transformation durchgeführt werden. Das Verhältnis des Expressionsvektors/Selektionsvektors muss auf eine Art und Weise angepasst werden, dass ein hoher Prozentsatz der ausgewählten Transformanten auch den Vektor enthält, der das Expressionskonstrukt der Xylanase von Interesse enthält.
Die am besten geeigneten Selektionssyteme für industrielle Mikroorganismen sind diejenigen, die von der Gruppe von Selektionsmarkern gebildet werden, die keine Mutation in dem Wirtsorganismus erfordern. Beispiele für Pilz- Selektionsmarker sind die Gene für Acetamidase (amdS), ATP- Synthetase, Untereinheit 9 (oliC) und Benomyl-Resistenz (benA). Beispiele für Nicht-Pilz-Selektionsmarker sind das G481-Resistenzgen (Hefe), das Ampicillin-Resistenzgen (E. coli) und das Neomycin-Resistenzgen (Bacillus).
Sobald das gewünschte Expressionskonstrukt zusammengebaut worden ist, wird es in einen geeigneten Clonierungswirt wie E. coli transformiert, um das Konstrukt zu vermehren. Danach wird das Expressionskonstrukt in einen geeigneten Expressionswirt eingebracht, wobei das Expressionskonstrukt vorzugsweise in das Genom integriert wird. Bestimmte Wirte wie Bacillus-Arten können sowohl als Clonierungs- wie auch Expressions-Wirte verwendet werden, wobei ein gesonderter Transformationsschritt vermieden wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl von Expressionswirten verwendet werden, um die Xylanase von Interesse zu überexprimieren. In einer Ausführungsform kann ein homologer Expressionswirt verwendet werden. Dies beinhaltet das Einbringen des gewünschten Expressionskonstrukts zurück in den Stamm, aus dem die Xylanase codierende DNA-Sequenz isoliert wurde, entweder in erhöhter Genkopienanzahl oder unter der Kontrolle heterologer regulatorischer Regionen, wie vorstehend beschrieben, oder beides.
In einer anderen Ausführungsform kann eine Xylanase von Interesse überexprimiert werden, indem das DNA-Konstrukt, das die Xylanase von Interesse codiert, unter der Kontrolle der geeigneten regulatorischen Regionen in heterologe Wirte wie Bakterien, Hefen oder Pilzen eingebracht und dort exprimiert wird. Für diesen Zweck wird die DNA-Sequenz, die die Xylanase von Interesse codiert, vorzugsweise unter der Kontrolle von Promotor- und Terminator-Sequenzen exprimiert, die von dem heterologen Wirt abstammen. Zusätzlich kann es erforderlich sein, die native Sekretions-Leader-Sequenz der Xylanase von Interesse durch eine Leader-Sequenz zu ersetzen, die zu dem Expressionswirt homolog ist, um die wirkungsvollste Expression und Sekretion des Produkts zu erhalten.
Faktoren wie die Größe (Molekulargewicht), das mögliche Erfordernis für Glycosylierung oder die Erwünschtheit der extrazellulären Sekretion der Xylanase von Interesse spielen eine wichtige Rolle bei der Selektion des Expressionswirts.
Das Gram-negative Bakterium E. coli wird weitläufig als ein Wirt für heterologe Genexpression verwendet, reichert jedoch in den meisten Fällen große Mengen des heterologen Proteins innerhalb der Zelle an. Die nachfolgende Aufreinigung des gewünschten Proteins aus der Masse an intrazellulären E. coli-Proteinen kann manchmal schwierig sein.
Im Gegensatz zu E. coli sind Bakterien der Gattung Bacillus aufgrund ihrer Fähigkeit, Proteine in das Kulturmedium zu sekretieren, sehr als heterologe Wirte geeignet.
In einer alternativen Ausführungsform kann ein heterologer Wirt, ausgewählt aus Hefen oder Pilzen, bevorzugt sein. Im Allgemeinen werden Hefezellen vor Pilzzellen bevorzugt, weil sie leichter zu handhaben sind. Einige Proteine werden jedoch entweder schlecht aus der Hefezelle sekretiert oder werden in einigen Fällen nicht regelgerecht prozessiert (z. B. Hyperglycosylierung in Hefe). In diesen Fällen sollte ein Pilz-Wirtsorganismus ausgewählt werden.
Um die Xylanase von Interesse im Wesentlichen frei von anderen Polysaccharid abbauenden Enzymen zu exprimieren, kann auch ein heterologer Wirt ausgewählt werden, wobei ein Wirt ausgewählt wird, der normalerweise solche Enzyme nicht produziert, wie Kluyveromyces lactis.
Beispiele von bevorzugten Expressionswirten innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung sind Pilze wie Aspergillus-Arten (beschrieben in EP 184.438 und EP 284.603) und Trichoderma-Arten, Bakterien wie Bacillus-Arten (beschrieben in EP 134.048) und Hefen wie Kluyveromyces-Arten (beschrieben in EP 96.430 und EP 301.670) und Saccharomyces- Arten.
Besonders bevorzugte Expressionswirte können ausgewählt werden von Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Kluyveromyces lactis und Saccharomyces cerevisiae.
Die Überexpression der Xylanase von Interesse wird durch die Züchtung der Expressionswirte in einem herkömmlichen Fermentations-Nährmedium erwirkt, die mit dem Xylanase- Expressionskonstrukt transformiert worden waren.
Das Fermentationsmedium besteht aus einem gewöhnlichen Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle (z. B. Glucose, Maltose, Melasse, etc.), eine Stickstoffquelle (z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, etc.), eine organische Stickstoffquelle (z. B. Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton, etc.) und anorganische Nährstoffquellen (z. B. Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen, etc.) enthält. Optional kann ein Induktor (z. B. Haferspelz-Xylan) enthalten sein.
Die Auswahl des geeigneten Mediums kann auf der Wahl des Expressionswirtes beruhen und/oder auf den regulatorischen Erfordernissen des Expressionskonstrukts basiert sein. Solche Medien sind dem Fachmann gut bekannt. Falls erwünscht, kann das Medium zusätzliche Bestandteile enthalten, die die transformierten Expressionswirte gegenüber anderen potentiell kontaminierenden Mikroorganismen bevorzugen.
Die Fermentation wird über einen Zeitraum von 0,5 bis 20 Tagen in einem Batch oder Fed-Batch-Verfahren bei einer Temperatur im Bereich zwischen 0 und 45ºC und einem pH-Wert zwischen 2 und 10 durchgeführt. Bevorzugte Fermentationsbedingungen sind eine Temperatur im Bereich von 20 bis 37ºC und ein pH-Wert zwichen 3 und 9. Die geeigneten Bedingungen werden auf der Grundlage der Wahl des Expressionswirts ausgewählt.
Nach der Fermentation werden die Zellen mit Hilfe von Zentrifugation oder Filtration aus der Fermentationsbrühe entfernt. Nach Entfernen der Zellen kann dann die Xylanase von Interesse gewonnen werden und, falls erwünscht, mit Hilfe herkömmlicher Mittel gereinigt und isoliert werden.
Das Produkt wird stabil entweder in flüssiger oder trockener Form formuliert. Für bestimmte Anwendungen kann die Immobilisierung des Enzyms auf einer festen Matrix bevorzugt sein.
Xylanasen von Interesse, die mit Mitteln der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, können entweder alleine oder zusammen mit anderen ausgewählten Enzymen in einer Vielzahl von Verfahren verwendet werden, die die Wirkung eines Xylan abbauenden Enzyms benötigen. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Pilz-Xylanasen, die im Allgemeinen niedrigere pH-Optima haben als Xylanasen von bakteriellem Ursprung, besonders gut geeignet für die Verwendung in industriellen Verfahren, die bei niedrigem pH-Wert durchgeführt werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden, dass die Xylanasen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, für das Backen von Brot verwendet werden können. Die Beimischung kleiner Mengen von Xylanase zu dem Mehl verleiht dem Teig und somit dem Brot selbst positive Eigenschaften wie ein vergrößertes Laibvolumen und bessere strukturelle Eigenschaften wie Bruch- und Schrot- Qualität und Krümel-Qualität.
Xylanasen können auch zu Tierfutter-Zusammensetzungen zugegeben werden, die reichhaltig an Arabinoxylanen und Glucoxylanen sind. Wenn sie zu dem Futter (einschließlich Silofutter) monogastrischer Tiere (z. B. Geflügel oder Schwein) das Getreide wie Gerste, Weizen, Mais, Roggen oder Hafer enthält, oder zu Getreide-Nebenprodukten wie Weizenkleie oder Maiskleie zugegeben werden, verbessert das Enzym das Aufbrechen der Pflanzen-Zellwände signifikant, was zu einer besseren Verwertung der Pflanzennährstoffe durch das Tier führt. Als eine Konsequenz werden Wachstumsrate und/oder Futterverwertung verbessert. Darüber hinaus können Xylanasen verwendet werden, um die Viskosität von Futtermitteln zu reduzieren, die Xylane enthalten.
Xylanasen können im Voraus zu dem Futter oder Silofutter zugegeben werden, wenn ein zuvoriges Einweichen oder feuchte Nahrung bevorzugt wird. Vorteilhafterweise jedoch hydrolysieren die erfindungsgemäß produzierten Xylanasen die Xylane im Futter in vivo fortlaufend, wenn sie dem Futter zugegeben werden. Pilz-Xylanasen, die im Allgemeinen niedrigere pH-Optima haben, sind in der Lage, wichtige Nährstoffe in solchen sauren Umgebungen freizusetzen, wie dem Magen des Tieres, das solch Xylanase ergänztes Futter aufgenommen hat.
Die Xylanasen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, sind auch wirkungsvoll bei der Verbesserung der Filtrierung und der Entfernung gelöster organischer Substanzen aus der Brühe in Verfahren, in denen Apfel-Brennerei-Rückstande in mikrobielle Biomasse biokonvertiert werden. Xylanasen, die von filamentösen Pilzen abstammen, können bei diesem Verfahren vorteilhaft verwendet werden.
Ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung werden Glucose-Sirups, die verbesserte Filtrierbarkeit und/oder niedrigere Viskosität besitzen, aus unreiner Getreidestärke hergestellt, indem die unreine Stärke zuerst der Wirkung einer α-Amylase, dann der von Pilz-Xylanasen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, und schließlich einer Hydrolyse ausgesetzt wird. In ähnlicher Weise können die erfindungsgemäßen Xylanasen beim Bierbrauen verwendet werden, um die Filtrierbarkeit der Maische zu verbessern.
Xylanasen können auch verwendet werden, um Lignine aus Kraftzellstoff zu entfernen und somit das Bleichen zu erleichtern, indem die Menge an Chlor vermindert wird, die für die Herstellung von Papierprodukten benötigt wird.
Zusätzlich können die Xylanasen, die entsprechend der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, in anderen Verfahren verwendet werden, z. B. um den Ertrag bei der Herstellung von Frucht- oder Gemüsesäften und die enzymatische Hydrolyse von breiiger Zuckerrübenmasse, wobei die resultierende hydrolysierte Fraktion in Mikroorganismen- Kulturmedium verwendet werden kann; von agrarwirtschaftlichen Rückständen wie Maiskolben, Weizenstroh und Erdnussschalen; und von bestimmten wiederverwertbaren Materialien wie Abfallpapier zu erhöhen.
Die nachfolgenden Beispiele werden bereitgestellt, um den Fachleuten eine vollständige Offenbarung und Beschreibung davon zu geben, wie die Erfindung durchgeführt und verwendet werden soll, und sind nicht gedacht, den Schutzumfang dessen einzugrenzen, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten. Es sind Anstrengungen unternommen worden, die Richtigkeit im Hinblick auf die angegebenen Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur, pH, etc.) abzusichern, es sollten jedoch einige experimentelle Irrtümer und Abweichungen berücksichtigt werden. Falls nicht anders bezeichnet, ist die Temperatur in Grad Celsius angegeben und der Druck bewegt sich bei oder nahe dem atmosphärischen Druck.

BEISPIEL 1

Aufreinigung und Charakterisierung von Aspergillus tubigensis-Endo-Xylanase XYL A.

Beispiel 1.1

Reinigung von Aspergillus tubigensis-Endo-Xylanase XYL A.

Ein Kulturfiltrat wurde erhalten durch die Züchtung von Aspergillus niger DS16813 (CBS 323.90 - später als wahrscheinlicher zu der Art A. tubigensis gehörig reklassifiziert; Kusters-van Someren et al. (1991)) in einem Medium, das folgendes enthielt (pro Liter): 30 g Haferspelz- Xylan (Sigma); 7,5 g NH&sub4;NO&sub3;, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO&sub4;, 15 g KH&sub2;PO&sub4; und 0,5 g Hefeextrakt (pH 6,0). Das Kulturfiltrat wurde auf ein Volumen von ungefähr 35 ml konzentriert, das dann mit einem Diaflo PM 10-Filter in einem 50 ml Amicon-Modul ultrafiltriert wurde, um Salze zu entfernen.
Der Überstand wurde dann auf ein Volumen von 10 ml konzentriert, und der Rückstand wurde zweimal mit 25 ml 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gewaschen. Nach dem Waschen wurde das Rückstandsvolumen auf 25 ml gebracht.
Dieser Rückstand wurde in 1 ml-Mengen auf eine Syn Chropak AX 300-Säule (Dimensionen 10 · 250 mm) injiziert und nach dem folgenden HPLC-Schema eluiert:
Elutionsrate: 2 ml/min
Elutionspuffer A: 25 mM Tris-HCl pH 7,0
Elutionspuffer B: 25 mM Tris-HCl pH 7,0 + 1 M NaCl
Es wurden Fraktionen von jeweils 1 ml gesammelt. Der Nachweis des eluierten Proteins wurde anhand einer fortlaufenden Messung der UV-Absorption bei 280 nm durchgeführt. Das Elutionsprofil ist in Fig. 2 gezeigt.
Die Fraktionen wurden mit Hilfe eines Spot-Tests auf die Anwesenheit von Endo-Xylanase-Aktivität getestet. Dieser Spot- Test besteht aus der Zugabe von 12 ml Citrat-Phosphat-Puffer (hergestellt durch Mischen von 900 ml 0,2 M Na&sub2;PO&sub4; und 125 ml 0,5 M Citronensäure, gefolgt von einer Anpassung des pH-Wertes der Lösung auf pH 5,6, wobei 0,5 M Citronensäure oder 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; verwendet wurden), der 0,5% Haferspelz-Xylan (Sigma) enthielt, zu 180 mg Agar (Difco) und Erhitzen des Gemischs auf 100ºC, um den Agar aufzulösen. Nach Abkühlen auf 60ºC wird das Agar-Gemisch gleichmäßig auf Agarosegel-Klebefolie gegossen. Tropfen der eluierten Fraktionen werden einzeln auf den Film platziert und 30 min bei 30ºC inkubiert. Falls Endo- Xylanase-Aktivität vorliegt, wird die Stelle der individuellen Tropfen auf dem Agarfilm klar.
Die Gesamt-Xylanase-Aktivität in den gesammelten Fraktionen wurde quantitativ bestimmt, indem die Menge an reduzierenden Zuckern gemessen wurde, die während einem vorbestimmten Zeitabschnitt in dem Mikrotests gebildet wurden, wie von Leathers et al. (1984) beschrieben, wobei Haferspelz- Xylan in 50 mM Natriumacetat bei pH 5,0 als ein Substrat verwendet wurde. Die Aktivitätseinheiten sind ebenfalls, wie von Leathers (vorstehend) definiert.
Exo-Xylanase-Aktivität in den eluierten Fraktionen wurde nach dem Verfahren bestimmt, das von Poutanen und Puls (1988) beschrieben wurde, wobei p-Nitro-phenyl-β-D-xylopyranosid (0,3 mM, Sigma) als ein Substrat bei pH 5,0 und 30ºC verwendet wurde.
Der Spot-Test ergab, dass die eluierten Fraktionen, die den Peaks B, F und K entsprachen (vgl. Fig. 2), Endo- Xylanase-Aktivität enthielten. Der Gesamt-Xylanase-Test zeigte Aktivität in den eluierten Fraktionen der Peaks B, F, H und K. Es wurde bestimmt, dass die eluierten Fraktionen der Peaks B und H Exo-Xylanase-Aktivität enthielten.
Die eluierten Fraktionen der Peaks F (XYL2-Protein) und K (XYL A-Protein) wurden durch wiederholte Ionenaustausch- Chromatographie weiter aufgereinigt. Die darin enthaltenen Endo-Xylanasen wurden durch SDS/PAGE (Moonen et al., 1982) und isoelektrische Fokussierung (3,5 < pH < 9,5) mit Hilfe einer LKB-Apparatur gemäß den Angaben des Herstellers charakterisiert. Das offensichtliche Molekulargewicht der Endo-Xylanase F, bestimmt durch SDS-PAGE, betrug etwa 22 kDa; das offensichtliche Molekulargewicht der Endo-Xylanase K betrug ungefähr 24 kDa. Der isoelektrische Punkt (IEP) der Endo-Xylanase F war ungefähr pH 4,0, während der IEP von Endo- Xylanase K zu niedriger als pH 3,5 bestimmt wurde.

Beispiel 1.2

Aminosäure-Sequenzierung des N-terminalen Endes von Aspergillus tubigensis-Endo-Xylanase XYL A.

Ungefähr 5 ug Endo-Xylanase, gereinigt, wie in Beispiel 1.1 beschrieben, wurde einer Elektrophorese in einem 12% SDS- Polyacrylamidgel unterzogen, gefolgt von einem Elektroblotting auf Immobilon P-Membran (Millipore), entsprechend dem Verfahren, welches von Matsudaira (1987) beschrieben wurde. Das Membran-Fragment, das die Hauptbande enthielt, die ein offensichtliches Molekulargewicht (SDS-PAGE) von 25 kDa besaß, wird der Sequenzanalyse in einem Gasphasen-Sequenzierautomaten (Eurosequence, Groningen) unterzogen. Die nachfolgende N- terminale Sequenz wurde bestimmt: (Fig. 3, Formel 1)
Es wurden jedoch ungefähr gleiche Mengen zweier anderer Varianten entdeckt, in denen entweder ein Serin (Fig. 8, Position 1) oder ein Glycin (Fig. 8, Position 3) als die N- terminale Aminosäure bestimmt wurde.

Beispiel 1.3

Aminosäuresequenz-Bestimmung von Endo-Proteinase Glu-C freigesetzter Peptide von Endo-Xylanase XYL A.

Ungefähr 260 ug Endo-Xylanase, gereinigt, wie in Beispiel 1.1 beschrieben, wurden in 110 ul einer Lösung aufgelöst, die 50 mM Ammoniumbicarbonat-Puffer pH 7,5 und 2 mg/ml SDS enthielt. Nach Erhitzen der Lösung für drei Minuten bei 100ºC und Abkühlen auf Raumtemperatur wurde Endo-Proteinase Glu-C (Staphylococcus aureus-Protease V8) in einem 18-fachen molaren Überschuss zugegeben. Die Proteinspaltung wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt, wonach das Reaktionsgemisch für drei Minuten bei 100ºC erhitzt wurde.
Ungefähr 1/5 des Reaktionsgemisches wurde einer Elektrophorese in einem. 15% SDS-Polyacrylamid-Gel unterzogen, gefolgt von Blotten auf Immobilon-P-Membran (Millipore) entsprechend dem Verfahren, das von Matsudaira (1987) beschrieben wurde. Drei Fragmente mit einer molekularen Masse von 19, 16 bzw. 4 kDa wurden beobachtet. Die beiden größten Fragmente (19 und 16 kDa) wurden bei der Gasphasen- Sequenzierung verwendet (Applied Biosystems Modell 470A- Protein-Sequenzierautomat, Eurosequence, Groningen). Die Membranfragmente, die 2-3 nMol des jeweiligen Peptids enthielten, wurden gewaschen und der Sequenzanalyse unterzogen, entsprechend dem Programm, das von Amons (1987) beschrieben wurde.
Aus dem 19 kDa-Fragment wurde die nachfolgende N- terminale Aminosäure-Sequenz bestimmt: (Fig. 4, Formel 2)
Die Identität der Aminosäure an Position 9 (X) konnte nicht bestimmt werden. An Position 14 wurde nur eine Spur von Serin gefunden, wie durch Klammern angezeigt ist.
Die nachfolgende Aminosäuresequenz wurde anhand des N- terminalen Endes des 16 kDa-Fragments bestimmt: (Fig. 4, Formel 3)
Die Identität der Aminosäuren (X) an Position 10 konnte nicht bestimmt werden. Die Sequenz, die für dieses Fragment gefunden wurde, ist nahezu identisch mit der Sequenz des 19 kDa-Fragments. Beide Peptide teilen die gleiche N-terminale Sequenz, die nicht mit der N-terminalen Aminosäuresequenz übereinstimmt, die für das intakte Protein bestimmt wurde (Beispiel 1.2, Formel 1). Es wurde bestimmt, dass diese zwei internen Fragmente der Sequenz entsprechen, die mit Position 79 beginnt, wie in Fig. 8 dargestellt ist.

BEISPIEL 2

Konstruktion einer genomischen Bibliothek des Aspergillus niger-Stammes DS16813 (CBS 323.90; später reklassifiziert als A. tubigensis).

Beispiel 2.1

Isolierung von DNA aus Aspergillus niger DS16813 (CBS 323.90; später reklassifiziert als A. tubigensis).

Pilz-DNA wurde mit Hilfe des Verfahrens isoliert, das von de Graaff et al. (1988) beschrieben wurde. Mycel, das über Nacht in flüssigem Minimalmedium (pro 1000 ml: 6,0 g NaNO&sub3;; 1,5 g KH&sub2;PO&sub4;; 0,5 g MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O; 0,5 g KCl; 1 ml Visniac-Lösung [Visniac and Santer, 1957: 10 g EDTA; 4,4 g ZnSO&sub4; · 7 H&sub2;O; 1,0 g MnCl&sub2; · 4 H&sub2;O; 0,32 g CoCl&sub2; · 6 H&sub2;O; 0,32 g CuSO&sub4; · 5 H&sub2;O; 0,22 g (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; · 4 H&sub2;O; 1,47 g CaCl&sub2; · 2 H&sub2;O; 1,0 g FeSO&sub4; · 7 H&sub2;O; pH 4,0]; pH 6,0), ergänzt mit 0,2% Casaminosäuren und 0,5% Hefeextrakt, gezüchtet wurde, wurde geerntet, mit kalter Kochsalzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80ºC aufbewahrt. Nucleinsäuren wurden isoliert, indem 0,5 g gefrorenes Mycel aufgebrochen wurden, wobei ein Mikrodismembrator (Braun) verwendet wurde. Das erhaltene Mycelpulver wurde mit frisch hergestelltem Extraktionspuffer extrahiert.
Der Extraktionspuffer wurde wie folgt hergestellt: 1 ml Tri-isopropylnaphtalen-sulfonsäure (TNS) (20 mg/ml) wurde gründlich mit 1 ml p-Aminosalicylsäure (PAS) (120 mg/ml) vermischt, und 0,5 ml 5 · RNB-Puffer (pro 1000 ml: 121,10 g Tris; 73,04 g NaCl; 95,10 g EGTA; eingestellt auf pH 8,5 mit HCl) wurde zugegeben. Nach der Zugabe von 1,5 ml Phenol wurde der Extraktionspuffer 10 Minuten bei 55ºC äquilibriert. Der warme Puffer wurde dann zu dem Mycelpulver zugegeben, und die Suspension wurde 1 Minute lang gründlich vermischt, wobei ein Vortex-Mischgerät verwendet wurde. Nach der Zugabe von 1 ml Chloroform wurde die Suspension erneut 1 Minute lang vermischt. Nach 10 Minuten Zentrifugation bei 10&sup4; · g mit einer Sorvall-Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge wurde die wässrige Phase noch einmal mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1 : 1) extrahiert und wurde dann zweimal mit Chloroform extrahiert. Die DNA wurde aus der wässrigen Phase isoliert, wobei das nachfolgende Verfahren verwendet wurde. Die DNA wurde sofort bei Raumtemperatur mit 2 Volumina Ethanol präzipitiert und wurde nachfolgend durch 10 Minuten Zentrifugation mit einer Sorvall-Hochgeschwindigkeits- Zentrifuge bei 10&sup4; · g gesammelt, zweimal gewaschen durch Wiederauflösen der DNA in destilliertem, sterilem Wasser und erneute Präzipitation mit Ethanol. RNA wurde durch Zugabe von RNase A (20 ug/ml) zu der Endlösung entfernt.

Beispiel 2.2

Partielle Spaltung von Aspergillus tubigensis-DNA mit Sau3A und Isolierung von DNA-Fragmenten nach Agarose- Gelelektrophorese.

DNA (30 ug), die aus Aspergillus niger DS16813 (kürzlich reklassifiziert als A. tubigensis), wie in Beispiel 2.1 beschrieben, isoliert wurde, wurde durch Inkubation der DNA mit 0,1 U Sau3A 30 Minuten lang bei 37ºC partiell gespalten. Die resultierenden Fragmente wurden durch Elektrophorese in 0,4% Agarose in TAE-Puffer, der 0,5 ug/ml Ethidiumbromid enthielt, nach der Größe fraktioniert. Fragmente von 14 Kb bis 22 Kb Größe, im Vergleich mit Fragmenten der Bakteriophagen lambda DNA, die mit BglII gespalten wurde (22,0, 13,3, 9,7, 2,4, 0,65 und 0,44 Kb), als Größenmarker, wurden aus dem Gel gewonnen, indem die entsprechende Region aus dem Gel ausgeschnitten wurde.
Diese Fragmente wurden aus dem Agarosestück durch Elektroelution gewonnen, wobei ISCO-Gefäße verwendet wurden. Sowohl an dem großen als auch an dem kleinen Behälter dieses Gefäßes wurde eine Dialysemembran angebracht, das Gefäß wurde mit 0,005 · TAE (verdünnt aus 50 · TAE-Stammlösung (pro 1000 ml): 242,0 g Tris; 57,1 ml Eisessigsäure; 100 ml 0,5 M EDTA; eingestellt auf pH 8,0 mit HCl) gefüllt, und das Agarosestück wurde in den großen Behälter des Gefäßes gegeben. Nachfolgend wurde das Gefäß mit dem großen Behälter in die Kathoden- Kammer, die TAE enthielt, und dem kleinen Behälter in die Anoden-Kammer, die TAE/3 M NaCl enthielt, der Elektroelutions- Apparatur gegeben. Die Fragmente wurden bei 100 V in einem Zeitraum von 2 Stunden elektroeluiert. Danach wurde das Gefäß aus der Elektroelutions-Apparatur herausgenommen, und der Puffer wurde aus dem großen Behälter entfernt, während der Puffer nür aus dem oberen Teil des kleinen Behälters entfernt wurde. Der verbleibende Puffer (200 ul), der die DNA-Fragmente enthielt, wurde in dem Gefäß in einem Zeitraum von 30 Minuten gegen destilliertes Wasser dialysiert. Abschließend wurde die DNA durch Zugabe von 0,1 Volumina 3 M NaAc, pH 5,6 und 2 Volumina kaltem (-20ºC) Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde durch 30 Minuten Zentrifugation (Eppendorf) bei 14.000 · g bei 4ºC gesammelt. Nach Entfernen des Überstandes wurde das DNA- Pellet getrocknet, wobei eine Savant-Speedvac-Vakuum- Zentrifuge verwendet wurde. Nach der Ethanol-Präzipitation wurde die DNA in 10 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,9; 1 mM EDTA; pH 8,0) gelöst, und die Konzentration wurde durch Agarose-Elektrophorese bestimmt, wobei lambda-DNA mit einer bekannten Konzentration als eine Referenz und Ethidiumbromid- Färbung zum Nachweis der DNA verwendet wurden.

Beispiel 2.3

Clonierung von Aspergillus tubigensis-DNA-Fragmenten in den Bakteriophagen lambda EMBL 3.

Fragmente, die durch partielle Spaltung genomischer DNA erhalten wurden, wie in Beispiel 2.2 beschrieben, wurden in Bakteriophagen lambda EMBL 3-BamHI-Arme, die von Promega erhalten wurden, nach dem nachfolgenden Verfahren ligiert: 4 ul (2 ug) EMBL-3-DNA, 1 ul (50 ng) genomische DNA-Fragmente, 0,75 ul 10 · Ligierungspuffer (Maniatis et al., 1982, S. 474: 660 mM Tris-HCl; 50 mM MgCl&sub2;; 50 mM Dithiothreit; 10 mM ATP; pH 7,6), 0,75 ul 10 mM ATP und 2 ul (1,5 U/ul) T&sub4; DNA-Ligase (BRL) wurden pipettiert, vorsichtig vermischt und 6 Stunden bei 14º C inkubiert. Nach diesem Inkubationszeitraum wurde 1 ul T&sub4; DNA- Ligase zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, und die Reaktion wurde für weitere 4 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt.
Die ligierte DNA wurde in vitro verpackt, wobei der Gigapack II Gold-Verpackungsextrakt (Stratagene) verwendet wurde, und auf E. coli LE392 (Murray, 1977) ausplattiert, wobei NZYCM-Medium (pro 1000 ml: 10 g NZ-Amin; 5 g NaCl; 5 g Hefeextrakt; 1 g Casaminosäure; 2 g MgSO&sub4; · 7H&sub2;O; pH 7,5; für Platten werden 12 g Agar zugegeben) entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet wurde.
Die komplette vorstehend beschriebene Umsetzung wurde einmal wiederholt, wobei 3 ul genomische DNA-Fragmente in einem Endvolumen von 10 ul verwendet wurden.

Beispiel 2.4

Titration und Amplifikation der genomischen Bibliothek von Aspergillus tubigensis.

Es wurden Verdünnungen der primären genomischen Bibliothek in SM-Puffer gemacht (pro 1000 ml: 5,8 g NaCl; 2,0 g MgSO&sub4; · 7H&sub2;O; 50 ml Tris-HCl; pH 7,5; 5 ml 20% Gelatine) und auf E. coli LE392 als ein Wirt ausplattiert, wie in Maniatis et al. (1982, S. 64) beschrieben, wobei NZYCM-Medium verwendet wurde. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die resultierenden Plaques gezählt, und die Menge an Phagen wurde berechnet. Die erste Ligierung und Verpackung resultierte in etwa 7 · 10&sup4; PBE (Plaques bildende Einheiten), die zweite in etwa 4 · 10&sup5; PBE, wobei eine Gesamtmenge von etwa 5 · 10&sup5; PBE resultierte.
Die so erhaltene genomische Bibliothek wurde durch Ausplattieren von 5 · 10³ PBE pro 85 mm Durchmesser-Platte (Gesamtanzahl von 5 Platten) auf NZYCM-Medium amplifiziert, wie von Maniatis et al. (1982, S. 293-294) beschrieben. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die Phagen aus den resultierenden konfluenten Platten durch Zugabe von 5 ml SM- Puffer eluiert. Die Platten wurden 2 Stunden bei 4ºC unter periodischem Schütteln gehalten. Nach Entfernen des Überstands wurden die Bakterien durch 10 Minuten Zentrifugation bei 4ºC bei 4.000 g aus der Lösung entfernt. Zu dem Überstand wurden 0,3% Chloroform zugegeben und die Anzahl an PBE wurde bestimmt. Diese Phagenstammlösung enthielt ungefähr 10¹&sup0; pfu pro ml.

BEISPIEL 3

Durchmusterung der genomischen Aspergillus tubigensis- Bibliothek nach dem Endo-Xylanase A-Gen (xln A) und Isolierung des Gens.

Beispiel 3.1

³²P-Markierung von synthetischen Oligonucleotiden.

Die Aminosäuresequenz, die aus Beispiel 1.2 (Formel 1) stammt, wurde verwendet, um Oligonucleotid-Gemische zu synthetisieren, die der N-terminalen Aminosäuresequenz entsprechen. Die Oligonucleotide wurden mit Hilfe des Phosphoamidit-Verfahrens synthetisiert, wobei ein Applied Biosystems-Oligonucleotid-Syntheseautomat verwendet wurde.
Die Oligonucleotid-Gemische AB801 bis AB806 (Fig. 3) wurden in gleichen Mengen vermischt, hierin nachfolgend als Oligonucleotid-Gemisch AB800 bezeichnet, wobei eine Endkonzentration von 37 pMol Oligonucleotide pro 4 erhalten wurde. Dieses Oligonucleotid-Gemisch wurde in einem Reaktionsgemisch der nachfolgenden Zusammensetzung markiert: 37 pMol Oligonucleotid-Gemisch, 66 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM ATP, 1 mM Spermidin, 10 mM MgCl&sub2;, 15 mM Dithiothreit, 200 ug/ml BSA, 34 pMol gamma-³²P-ATP (NEN, 6.000 Ci/mMol) und 30 U T&sub4; Polynucleotidkinase (BRL) in einem Endvolumen von 50 ul. Das Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert, wonach die Reaktion durch die Zugabe von 4 ul 0,5 M EDTA; pH 8,0 beendet wurde.
Das Oligonucleotid-Gemisch AB1255, das von der Aminosäuresequenz abstammt, die in Beispiel 1.3 erhalten wurde (Formeln 2 und 3) (Fig. 4), wurde nach dem gleichen Verfahren markiert, wie vorstehend beschrieben. Die Oligonucleotid- Gemische wurden ohne weitere Aufreinigung bei der Durchmusterung der genomischen Bibliothek (Beispiel 3.2) und für die Southern Blot-Analyse (Beispiele 3.4 und 3.5) verwendet.

Beispiel 3.2

Durchmusterung der genomischen Aspergillus tubigensis- Bibliothek nach dem xln A-Gen.

Um eine genomische Aspergillus tubigensis-Bibliothek nach dem xln A-Gen zu durchmustern, wurden 3 · 10³ PBE pro Platte in NZYCM-Topagarose, die 0,7% Agarose enthielt (NZYCM-Medium + 7 g Agarose) auf vier 85 mm Durchmesser große NZYCM (1,2% Agar)-Platten ausplattiert, wie von Maniatis et al. (1982, S. 64) beschrieben. E. coli LE392 wurden als ausplattierte Bakterien verwendet.
Nach Inkubation der Platten über Nacht bei 37ºC wurden zwei Kopien von jeder Platte auf Nitrocellulose-Filter (Schleicher und Schüll BASS) hergestellt, wie von Maniatis et al. (1982, S. 320-321) beschrieben.
Nach 2 Stunden Backen der Filter bei 80ºC wurden die Filter benässt und 60 Minuten bei Raumtemperatur in 3 · SSC (verdünnt aus 20 · SSC-Stammlösung (pro 1000 ml): 175,3 g NaCl; 107,1 g Natriumcitrat · 5, 5 H&sub2;O; pH 7,0) gewaschen. Die Filter wurden 2 Stunden bei 65ºC in einem Vorhybridisierungspuffer, enthaltend: 6 · SSC (verdünnt aus der 20 · SSC-Stammlösung (vgl. vorstehend)), 0,5% SDS, 10 · Denhardt-Lösung (pro 5.000 ml: 10 g Ficoll-400; 10 g Polyvinylpyrrolidon; 10 g Rinderserumalbumin (Pentax-Fraktion V)) und 100 ug/ml Hitze-denaturierte Heringssperma-DNA (Boehringer Mannheim), vorhybridisiert. Nach 2 Stunden Vorhybridisierung wurde der Vorhybridisierungspuffer durch den Hybridisierungspuffer ersetzt, der mit dem Vorhybridisierungspuffer identisch war, mit der Ausnahme, dass dieser Puffer keine Heringssperma-DNA enthielt, sondern ³²P- markiertes Oligonucleotid-Gemisch AB800, da, wie in Beispiel 3.1 beschrieben, hergestellt wurde. Die Filter wurden 18 Stunden bei einer Endtemperatur von 38ºC hybridisiert, die durch langsames kontrolliertes Abkühlen von der Ausgangstemperatur von 65ºC erreicht wurde.
Nach der Hybridisierung wurden die Filter zuerst in 2 · SSC gewaschen, wonach die Filter in vorgewärmtem Hybridisierungspuffer bei 38ºC über den gleichen Zeitraum gewaschen wurden. Schließlich wurden die Filter 30 Minuten bei 38ºC in 6 x SSC, 0,05% Natriumpyrophosphat gewaschen. Die luftgetrockneten Filter wurden mit Klebeband auf einem Blatt Whatman 3MM-Papier festgeklebt, mit radioaktiver Tinte wurden Orientierungsmarkierungen gemacht, und das Whatman-Papier und die Filter wurden mit Saran WrapTM bedeckt. Durch 72 Stunden Exposition gegen Kodak XAR Röntgenfilm bei -70ºC wurden Hybridisierungs-Plaques identifiziert, wobei eine Verstärkerfolie verwendet wurde.
Vier der mit dem Oligonucleotid-Gemisch hybridisierenden Plaques, die zweifach auf den kopierten Filtern auftraten, wurden identifiziert und als lambdaxln1 bis lambdaxln4 bezeichnet. Jeder positive Plaque wurde von der Platte entfernt, wobei eine Pasteur-Pipette verwendet wurde, und die Phagen wurden aus dem Agar-Pfropfen in 1 ml SM-Puffer, der 20 ul Chloroform enthielt, eluiert, wie von Maniatis et al. (1982, S. 64) beschrieben. Die erhaltenen Phagen wurden durch Wiederholen des vorstehend beschriebenen Verfahrens aufgereinigt, wobei Kopien der Filter von Platten verwendet wurden, die 50 bis 100 Plaques der isolierten Phagen enthielten.
Nach der Aufreinigung wurden die Phagen durch Ausplattieren von 5 · 10³ Phagen auf NZYCM-Medium vermehrt. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden konfluente Platten erhalten, von welchen die Phagen durch Zugabe von 5 ml SM- Puffer und Aufbewahren der Platte für 2 Stunden bei 4ºC mit periodischem Schütteln eluiert wurden. Nach Entfernen des Überstandes wurden die Bakterien durch 10 Minuten Zentrifugation bei 4.000 g bei 4ºC aus der Lösung entfernt. Chloroform (0,3%) wurde zu dem Überstand zugegeben, und die Anzahl an PBE wurde bestimmt. Diese Phagenstammlösungen enthielten ungefähr 10¹&sup0; PBE/ml.

Beispiel 3.3

Isolierung von DNA aus dem Bakteriophagen lambda.

Jeder der isolierten Phagen lambdaxln1 bis lambdaxln4 wurde vermehrt, wie in Beispiel 3.2 beschrieben, wobei 5 Platten für jeden der Phagen verwendet wurden. Die Phagen wurden aus dem so erhaltenen Überstand (25 ml) durch Zugabe eines gleichen Volumens einer Lösung präzipitiert, die 20% PEG-6.000 (Gew./Vol.) und 2 M NaCl enthielt, gefolgt von einem gründlichen Vermischen und einer Inkubation auf Eis für 60 Minuten. Die präzipitierten Phagen wurden durch 20 Minuten Zentrifugation bei 14.000 · g bei 4ºC gesammelt. Der Überstand wurde durch Absaugen8- entfernt, während die letzten Spuren von Flüssigkeit unter Verwendung eines Papiertuchs entfernt wurden. Die Phagen wurden sorgfältig in 4 ml SM- Puffer resuspendiert und einmal mit Chloroform extrahiert.
Vor der Extraktion der DNA aus den Phagen-Partikeln wurden DNA und RNA, die von lysierten Bakterien stammten, durch 30 Minuten Inkubation der Phagensuspension mit DNase I und RNase A (jeweils 100 ug/ml) bei 37ºC entfernt. Die Phagen-DNA wurde nachfolgend durch die Zugabe von SDS und EDTA in einer Endkonzentration von 0,1% bzw. 20 mM, gefolgt von einer 10 Minuten-Inkubation bei 65ºC, aus den Phagen freigesetzt. Protein wurde durch zweimalige Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) aus der Lösung entfernt. Nach Trennung der Phasen durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge (14.000 · g, 10 Minuten) wurde die wässrige Phase einmal mit einem gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Die Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt (Eppendorf-Zentrifuge, 14.000 · g, 10 Minuten), wonach die DNA durch Zugabe von 0,1 Volumina 5 M Natriumperchlorat und 0,1 Volumina Isopropanol und 30 Minuten Inkubation auf Eis aus der wässrigen Phase präzipitiert wurde. Die DNA wurde durch 10 Minuten Zentrifugation bei 4ºC (14.000 · g) gewonnen. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt, wonach die DNA in 400 ul TE- Puffer resuspendiert wurde. Die DNA wurde noch einmal mit Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde durch 10 Minuten Zentrifugation bei 4ºC (14.000 · g) gesammelt. Der überstand wurde durch Absaugen entfernt, das verbleibende Pellet wurde kurz unter Vakuum getrocknet, wonach die DNA in 125 ul TE- Puffer resuspendiert wurde, der 0,1 ug/ml RNase A enthielt. Dieses Reinigungsverfahren resultierte in der Isolierung von ungefähr 40-50 ug DNA von jedem Phagen.

Beispiel 3.4

Restriktionsanalyse von xln A enthaltenden Phagen.

Die isolierte DNA der Phagen lambdaxln1 bis lambdaxln4 wurde durch Southern-Analyse analysiert, wobei die nachfolgenden Restriktionsenzyme verwendet wurden: BamHI; BglII; EcoRI; HindIII; KpnI; SalI; SstI; XbaI und XhoI. Die DNA wurde zweifach 3 Stunden bei 37ºC in einem Reaktionsgemisch gespalten, das aus den nachfolgenden Lösungen zusammengesetzt war: 3 ul DNA-Lösung; 1 ul 0,5 M Spermidin; 5 ul des entsprechenden 10 · React-Puffers (BRL); 20 U Restriktionsenzym (BRL) und steriles destilliertes Wasser, wobei ein Endvolumen von 50 ul erhalten wurde. Nach der Spaltung wurde die DNA durch Zugabe von 0,1 Volumina 3 M NaAc und 2 Volumina Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde durch 10 Minuten Zentrifugation bei Raumtemperatur (14.000 · g) gesammelt. Der Überstand Wurde durch Absaugen entfernt. Das verbleibende Pellet wurde kurz unter Vakuum getrocknet und in sterilem destillierten Wasser resuspendiert. Nach Zugabe von 4 ul DNA-Ladepuffer (0,25% (Gew./Vol.) Bromphenolblau; 0,25% (Gew/Vol.) Xylolcyanol; 15% (Gew./Vol.) Ficoll Typ 400 in H&sub2;O), wurden die Proben 10 Minuten bei 65ºC inkubiert und schnell auf Eis gekühlt. Die Proben wurden dann auf ein 0,6% Agarosegel in 1 · TAE-Puffer aufgetragen. Die DNA-Fragmente wurden durch 15-18 Stunden Elektrophorese bei 25 Volt aufgetrennt.
Nach der Elektrophorese wurde die DNA denaturiert und, wie von Maniatis et al. (1982, S. 383-386) beschrieben, auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert, gefolgt von einer nachfolgenden Prähybridisierung und Hybridisierung, wobei die markierten Oligonucleotid-Gemische AB800 und AB1255, wie in Beispiel 3.1 beschrieben, und Hybridisierungsbedingungen, wie in Beispiel 3.2 beschrieben, verwendet wurden. Das Hybridisierungsmuster für jedes Oligonucleotid-Gemisch wurde durch 18 Stunden Exposition gegen Kodak XAR-5 Röntgenfilm bei -70ºC erhalten, wobei eine Verstärkerfolie verwendet wurde.
Von den Ergebnissen wurde geschlossen, dass die DNA von allen vier isolierten Clonen mit dem Oligonucleotid-Gemisch, das von der N-terminalen Aminosäuresequenz (Gemisch AB800) abstammte, sowie mit dem Oligonucleotid-Gemisch hybridisierte, das von der Aminosäuresequenz abstammte, die anhand des Peptids erhalten wurde, das nach der S. aureus V8-Spaltung (AB1255) isoliert wurde. In allen vier Clonen wurden Fragmente gefunden, die von der gleichen genomischen Region abstammten.
Das Restriktionsfragment-Muster und das Hybridisierungs- Muster wurden verwendet, um eine entsprechende Restriktionskarte von der genomischen Region zu erstellen, in der das xln A-Gen lokalisiert ist (Fig. 5).

Beispiel 3.5

Subclonierung des xln A-Gens.

Das 6,9 kb-SalI-Fragment wurde aus dem Phagen lambdaxln3 isoliert, wie in Beispiel 2.2 beschrieben. Dieses Fragment wurde in den Vektor pUC9 ligiert, der mit SalI gespalten und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert wurde, was wie folgt durchgeführt wurde: 1 ul (1 ug/ul) pUC9 wurde mit 2 ul 10 · React 10 (BRL), 1 ul (1 U/ul) SalI und 16 ul sterilem destilliertem Wasser vermischt. Die DNA wurde 1 Stunde lang bei 37ºC gespalten, wonach 0,5 ul alkalische Phosphatase (1 U/ul) (Pharmacia) zugegeben wurden, gefolgt von einer weiteren 30 Minuten-Inkubation bei 37ºC. Der linearisierte Vektor wurde aus einem 0,6% Agarosegel isoliert, wie in Beispiel 2.2 beschrieben.
Das 6,9 kb-SalI-Fragment wurde in den SalI gespaltenen, dephosphorylierten pUC-Vektor nach dem folgenden Verfahren ligiert: 100 ng pUC-Fragment wurden mit 100 ng 6,9 kb SalI- Fragment vermischt, und 4 ul 5 · Ligierungspuffer (500 mM Tris-HCl, pH 7,6; 100 mM MgCl&sub2;; 10 mM ATP; 10 mM Dithiothreit; 25% PEG-6.000) und 1 ul (1,2 U/ul) DNA-Ligase (BRL) wurden zu diesem Gemisch zugegeben, wobei ein Endvolumen von 20 ul resultierte. Das resultierende Plasmid wurde als pIM100 bezeichnet. Nach 16 Stunden Inkubation bei 14ºC wurde das Gemisch mit sterilem Wasser auf 100 ul verdünnt. 10 ul des verdünnten Gemischs wurden verwendet, um E. coli JM101 (Yanisch-Perron et al., 1985)-kompetente Zellen zu transformieren, die nach dem CM1-, CM2-Verfahren hergestellt wurden, wie im Pharmacia-Handbuch für das M13- Clonierungs/Sequenzierungs-System beschrieben ist. E. coli JM101, die das Plasmid pIM100 enthalten, wurden am 19. Juli 1990 beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande hinterlegt und wurden mit der Bezeichnung CBS 322.90 versehen.
Eine Auswahl von 6 der resultierenden Kolonien wurde über Nacht in LB-Medium (pro 1.000 ml: 10 g Trypticase-Pepton (BBL); 5 g Hefeextrakt (BBL); 10 g NaCl; 0,5 mM Tris-HCl; pH 7,5) gezüchtet, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt.
Plasmid-DNA wurde aus den Kulturen mit dem alkalische Lyse-Verfahren isoliert, wie von Maniatis et al. (1982, S. 368-369) beschrieben. Diese Plasmid-DNA wurde, wie in Beispiel 3.4 beschrieben, für Restriktionsanalysen verwendet, um einen Clon auszuwählen, der das gewünschte Plasmid beinhaltet. Plasmid-DNA wurde in einem Großansatz aus 500 ml-Kulturen E. coli JM101, die das Plasmid pIM100 enthielten und in LB-Medium gezüchtet wurden, das 100 ul/ml Ampicillin enthielt (Maniatis et al., 1982, S. 86), isoliert. Das Plasmid wurde durch CsCl- Zentrifugation gereinigt, phenolisiert, mit Ethanol präzipitiert und in 400 ul TE gelöst. Die Ausbeute betrug ungefähr 500 ug.
Das Plasmid pIM100 wurde weiter durch Restriktionsenzyme analysiert, wobei die Restriktionskarte resultierte, die in Fig. 7 gezeigt ist. Die Orientierung des Gens, wie angegeben, wurde in Hybridisierungsexperimenten unter Bedingungen bestimmt, die in Beispiel 3.2 beschrieben sind, wobei die Oligonucleotid-Gemische AB800 und AB1255 als Sonden verwendet wurden.

BEISPIEL 4

Charakterisierung des Aspergillus tubigensis xln A-Gens.

Beispiel 4.1

Sequenz-Bestimmung des A. tubigensis xln A-Gens.

Die Sequenz des Aspergillus tubigensis xln A-Gens, die dessen Promotor/regulatorische Region, das Strukturgen und die Terminationsregion umfasst, wurde durch Subclonierung von Fragmenten aus pIM100 in M13mp18/mp19 in Verbindung mit der Verwendung spezifischer Oligonucleotide als Primer für die Sequenzierungs-Reaktionen bestimmt.
Für die Nucleotidsequenz-Analyse wurden Restriktionsfragmente isoliert, wie in Beispiel 2.2 beschrieben, und wurden dann in Bakteriophagen M13mp18/19 RF-DNA-Vektoren (Messing, 1983; Norrander et al., 1983) cloniert, die mit den entsprechenden Restriktionsenzymen gespalten worden waren. Die Nucleotidsequenzen wurden mit dem Didesoxynucleotid-Ketten- Terminationsverfahren (Sanger et al., 1977) bestimmt, wobei der Pharmacia T&sub7;-DNA Polymerase-Sequenzierungskit verwendet wurde. Die verwendete Strategie zur Sequenzierung des xln A- Gens ist in Fig. 6 gezeigt. Die Computeranalyse der resultierenden Daten wurde unter Verwendung des PC/Gene- Programms (Intelligenetics, Inc.; Madison WI) durchgeführt. Die bestimmte Sequenz ist in Fig. 8 gezeigt.

Beispiel 4.2

Das A. tubigensis xln A-Gen.

Die erhaltene Sequenz umfasst 2.054 bp, 949 bp in der nicht-codierenden 5'-Region und 24 bp in der nicht-codierenden 3'-Region. In der 5'-Stromaufwärts-Region wurde an Position 848 bis Position 854 vor der Translations-Initiationsstelle (Position 950) eine mutmaßliche TATA-Box (TATAAAT) gefunden. Eine dreifach wiederholte Sequenz (5'-GTCCATTTAGCCA-3') wurde in der Region 190 bis 350 Basenpaare von der Translations- Initiationsstelle gefunden (Positionen: 618 bis 632; 636 bis 650; 656 bis 670).
Der strukturelle Bereich des xln A-Gens ist 681 bp lang und wird durch ein einzelnes mutmaßliches Intron unterbrochen, das 48 bp lang ist. Das von der Sequenz abgeleitete Polypeptid ist 211 As lang. Eine 17 As lange hydrophobe Signalsequenz wird am N-terminalen Ende dieses Polypeptids gefunden, welches von einem Pro-Peptid gefolgt ist, das 12 Reste lang ist. Das reife Protein ist 184 As groß mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 19 kDa und besitzt einen theoretischen IEP von 3,6.

BEISPIEL 5

Expression des xln A-Gens in Aspergillus niger N593.

Beispiel 5.1

Einbringen des xln A-Gens in Aspergillus niger N593 durch Co-Transformation.

Das Plasmid pIM100, das in Beispiel 3.5 erhalten wurde, wurde durch Co-Transformation von Aspergillus niger N593 (pyr&supmin;- Mutante von A. niger N402; Goosen et al., 1987) in Aspergillus niger eingebracht, wobei das Aspergillus niger-pyr A-Gen als ein Selektionsmarker auf dem Plasmid pGW635 (Goosen et al., 1989) und das Plasmid pIM100 als das Co-Tranformations-Plasmid verwendet wurden.
Aus dem Mycel wurden Protoplasten hergestellt, indem Aspergillus niger N593 auf Minimalmedium, das mit 0,5% Hefeextrakt, 0,2% Casaminosäuren, 50 mM Glucose und 10 mM Uridin ergänzt wurde, 20 Stunden bei 30ºC gezüchtet wurde. Die Herstellung von Protoplasten aus Aspergillus niger N593 und das Transformationsverfahren wurden durchgeführt, wie von Goosen et al. (1987) beschrieben. Die resultierenden PYR&spplus;- Transformanten wurden dann auf die Expression des xln A-Gens analysiert.

Beispiel 5.2

Durchmusterung der Transformanten auf Expression des xln A-Gens.

Die in Beispiel 5.1 erhaltenen Transformanten wurden auf die Bildung des xln A-Genprodukts, das XYL A-Protein, analysiert. 20 Transformanten wurden ausgewählt und 72 Stunden in Medium gezüchtet, das Folgendes enthielt (pro Liter): 30 g Haferspelz-Xylan (Sigma); 7,5 g NH&sub4;NO&sub3;, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO&sub4;, 15 g KH&sub2;PO&sub4; und 0,5 g Hefeextrakt (pH 6,0). Nach dem Wachstum wurde das Mycel durch Filtration entfernt, und das Kulturfiltrat wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert, wobei ein Gel verwendet wurde, das 12% Acrylamid enthielt. Das XYL A-Protein wurde nach Elektroblotten und Inkubation mit polyclonalen Antikörpern, die gegen das XYL A- Protein gerichtet sind, das aufgereinigt wurde, wie in Beispiel 1.1 beschrieben, auf Nitrocellulose nachgewiesen. Der gebundene Antikörper wurde nach Inkubation mit Ziege-anti- Kaninchen-Antikörper, konjugiert an alkalische Phosphatase, nachgewiesen, entsprechend dem Biorad-Anleitungshandbuch.
16 der 20 analysierten Transformanten produzierten das XYL A-Protein, was mit diesem Verfahren nachgewiesen wurde. Das Protein wurde in das Medium sekretiert. Von den analysierten Transformanten wurde der Transformant TrX9 für eine I.E.F.- Analyse ausgewählt, wobei ein pH-Gradient von pH 3 bis 7 und nachfolgende Färbung einer Verdünnungsreihe der Transformanten TrX2 und TrX9 verwendet wurden, wobei das Verfahren verwendet wurde, das von Biely et al. (1985a und b) beschrieben wurde.
Fig. 9 ist ein Zymogramm, das das XYL A-Protein zeigt, das von den Transformanten TrX2 und TrX9 exprimiert wurde.
Eine SDS-PAGE-Analyse wurde durchgeführt, wobei 4 ul Überstandsproben der einzelnen Transformanten und des A. niger-Kontrollstammes verwendet wurden, zuerst eingestellt auf einen pH-Wert von 7 mit 3 N NaOH und nachfolgend mit 1 · SB- Puffer auf ein Endvolumen von 20 ul gebracht, wie von Laemmli (1970) beschrieben. Nach 5 Minuten Erhitzen bei 100ºC wurden die Gesamtgemische einer SDS/12,5% Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterzogen und nachfolgend mit Coomassie Brilliant blau gefärbt. Wie in Fig. 10 B gezeigt, konnte eine Proteinbande in den Transformanten TrX2 (Spur 4) und TrX9 (Spur 5) nachgewiesen werden, die ein offensichtliches Molekulargewicht von 25 kDa (vergleichbar mit gereinigter Xylanase (Spur 2)) besitzt, die im Überstand des Kontrollstammes (Spur 3) nicht auftritt. Die Molekulargewichtsmarker (Spur 1) repräsentieren 92, 68, 46 und 30 kDa.

Beispiel 5.3

Deletionsanalyse der xln A-Promotorregion.

Regulatorische Elemente im A. tubigensis xln A-Promotor wurden mit Hilfe von Promotor-Deletions-Analysen untersucht. Eine Reihe von 5 Konstrukten des xln A-Gens wurde hergestellt und in Verbindung mit dem A. niger pyr A-Gen cloniert. Das pyr-Gen erlaubt die Selektion in Transformations-Experimenten, wie in Beispiel 5.1 beschrieben. Zusätzlich erlaubt das pyr A- Gen die Selektion von Transformanten, die eine einzelne Kopie des Plasmids in den pyr A-Locus integriert haben.
Das 4,5 kb SalI/XbaI-Fragment (Fig. 7) wurde isoliert und in den Vektor pEMBL18 ligiert, wie in Beispiel 3.5 beschrieben, wobei das intermediäre Plasmid pIM101 resultierte. Zusätzlich zu dem Plasmid pIM101 wurden die folgenden Fragmente, die das xln A-Gen enthielten, in pEMBL18 ligiert; das 3,5 kb-HindIII/XbaI-Fragment (resultierend in pIM102), das 2,0 kb-PstI-Fragment (resultierend in pIM103), das 1,98 kb-XhoI/XbaI-Fragment (resultierend in pIM104) und das 1,97 kb-NsiI/XbaI-Fragment (resultierend in pIM105). Die erhaltenen Plasmide wurden unter Verwendung von XbaI gespalten und in ein 3,8 kb-XbaI-Fragment ligiert, das das funktionelle A. niger-pyr A-Gen umfasst, wobei die Plasmide pIM112, pIM113, pIM114, pIM116 und pIM117 resultierten (Fig. 21).
Die Plasmide pIM112, pIM113, pIM114, pIM116 und pIM117 wurden verwendet, um A. niger N593 zu transformieren, wie in Beispiel 5.1 beschrieben. Die resultierenden PYR&spplus;- Transformanten jedes Plasmids wurden gezüchtet, und DNA wurde isoliert, wie in Beispiel 2.1 beschrieben. Die resultierende DNA wurde mit HpaI gespalten, und Einzelkopie-Integrationen wurden mit Hilfe von Southern-Analysen ausgewählt, wobei ein ³²P-markiertes 3,8 kb-XbaI-Fragment (markiert wie in Beispiel 7.2 beschrieben) als Sonde verwendet wurde, das das pyr A-Gen enthielt. Transformanten, die ein hybridisierendes HpaI- Fragment besaßen (dessen Größe durch eine Einheit Plasmidlänge im Vergleich zu der Größe des HpaI-Fragments in A. niger N593 vergrößert war) wurden als Einzelkopie-Integration in dem pyr A-Locus ausgewählt.
Einzelkopie-Transformanten von jedem der Plasmide, die wie vorstehend ausgewählt wurden, wurden 36 Stunden, wie in Beispiel 5.2 beschrieben, gezüchtet. Die Expression des xln A- Gens wurde mit Hilfe einer IEF-Analyse, wie in Beispiel 5.2 beschrieben, und durch Northern-Analyse nach Isolierung der Gesamt-RNA analysiert, wie von de Graaff et al. (1988) beschrieben, wobei das ³²P-markierte 900 bp-XhoI/BamHI-Fragment des xln A-Gens als eine Sonde verwendet wurde.
In Transformanten, die von den Plasmiden pIM112, pIM113 und pIM114 abstammen, wurde die Expression des xln A-Gens gefunden, wie durch IEF und Northern-Analyse nachgewiesen wurde. Die Transformanten, die jedoch von den Plasnüden pIM116 und pIM117 abstammten, exprimierten das xln A-Gen nicht, da weder XYL A-Protein noch hybridisierende RNA gefunden wurden. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass das 158 bp- PstI/XhoI-Fragment, der wesentliche Unterschied zwischen pIM114 und pIM116, ein Element enthält, das für die Induktion des xln A-Gens in A. niger notwendig ist, die auf Medium gezüchtet wurden, wobei Xylan als eine Kohlenstoffquelle verwendet wurde.

BEISPIEL 6

Expression des xln A-Gens, das an den Promotor und/oder die Signalsequenz des A. niger-Amyloglucosidase (AG)-Gens fusioniert wurde, in A. niger.

Beispiel 6.1

Xylanase-Expressionsvektoren

Um die Expression von Xylanase in dem Stamm A. niger CBS 513.88 zu erhalten, wurden zusätzliche Expressions-Kassetten (pXYL3 und pXYL3AG) erzeugt, in denen das xln A-Gen unter der Kontrolle des A. niger-Amyloglucosidase (AG)-Promotors in Verbindung mit verschiedenen Signalsequenzen vorliegt.
In der Expressions-Kassette pXYL3 wurde die AG- Promotorsequenz mit der xln A codierenden Sequenz fusioniert, wobei der Xylanase-Leader darin enthalten ist.
In der Expressions-Kassette pXYL3AG wurde die AG- Promotorsequenz sowie die 18 Aminosäure (As)-Leader-Sequenz des AG-Gens mit dem xln A-Gen-Fragment fusioniert, das ausschließlich das reife Protein codiert.

Beispiel 6.2

Erzeugung von intermediären Plasmiden.

a) Subclonierung des xln A-Locus.

Um die Länge des genomischen xln A-Locus zu reduzieren, wurde das 2 kb-PstI-Fragment von pIM100 (in Beispiel 3.5 beschrieben), das das vollständige xln A-Gen einschließlich der flankierenden 5'- und 3'-Sequenzen umfasst, in die PstI- Stelle von pTZ18R (Promega) subcloniert. Das Plasmid, das das xln A-Gen in der richtigen Orientierung enthielt (angezeigt in Fig. 12), wurde mit pXYL1 bezeichnet.

b) Elementarer Selektionsvektor pAmdSH.

Um den Zweck eines Selektionsmarkers für die Transformation von Aspergillus zu erfüllen, wurde das EcoRI/KpnI-DNA-Fragment des Plasmids pGW325 (Wernars, K. (1986)), das das homologe Aspergillus nidulans amdS-Gen enthält, in die EcoRI/KpnI-Stellen von pTZ18R (Promega) inseriert. In dem resultierenden Vektor (pAmdS) wurde durch Insertion des nachfolgenden synthetischen Fragments eine zusätzliche HindIII-Restriktionsschnittstelle:
in die EcoRI-Stelle eingebracht. Das so erhaltene Plasmid wurde als pAmdSH bezeichnet. In diesen elementaren Vektor werden die AG/Xylanase-Fusions-DNA-Fragmente inseriert.

c) Isolierung des genomischen AG-Locus: Herstellung von pAB6- 1.

Das Plasmid pAB6-1 enthält den gesamten AG-Locus von A. niger, der aus einer A. niger-Plasmid-Bibliothek isoliert wurde, die die 13-15 kb HindIII-Fragmente in pUC19 inseriert enthielt.
Für diese Isolierung wurden die nachfolgenden AG- spezifischen Oligonucleotide verwendet:
beide basierend auf der Nucleotidsequenz, die für A. niger veröffentlicht wurde (Boel, et al. (1984a); Boel, et al. (1984b)). Die Oligonucleotid-Sonden stammten von der Sequenz, die das Intron 2 umgeben: Oligo AG-1 ist stromabwärts dieses Introns lokalisiert und besitzt eine Polarität, die mit der AG-mRNA identisch ist; Oligo AG-2 wird stromaufwärts vom Intron 2 gefunden und ist antiparallel zu der AG-mRNA ausgewählt. Das Plasmid pAB6-1 enthält den gesamten AG-Locus auf einem 14,5 kb-HindIII-Fragment (vgl. Fig. 13).

d) Die intermediären Plasmide pXYLAG und pXYL2AG.

Die Fusion des AG-Promotors und der 18 As-AG-Leader- Sequenz mit dem xln A-Gen, das das reife Protein codiert (dem das Serin an Position 1 fehlt), wurde mit Hilfe des Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Verfahren durchgeführt.
Für die PCR-Reaktionen wurden 2 Matrizen verwendet: pXYL1, enthaltend das xln A-Gen, und pAB6-1, enthaltend den gesamten genomischen AG-Locus.
Als Primer für die PCR-DNA-Amplifikationen wurden 4 synthetische Oligonucleotide entworfen, die die nachfolgende Sequenz haben:
(eine AG-spezifische Sequenz um die EcoRI-Stelle herum, ungefähr 250 bp stromaufwärts von dem ATG- Initiationscodon).
(eine xln A-spezifische Sequenz, die an der BamHI-Stelle an Position 1.701 lokalisiert ist, wie in Fig. 8 gezeigt).
Die PCR wurde, wie von Saiki et al. (1988) beschrieben und gemäß dem Anbieter der TAQ-Polymerase (Cetus) durchgeführt. Es wurden 25 Amplifikationszyklen (jeder: 2 Minuten bei 55ºC, 3 Minuten bei 72ºC; 1 Minute bei 94ºC) in einer DNA-Amplifikationsmaschine (Perkin-Elmer/Cetus) durchgeführt.
Um die AG-Sequenzen mit der xln A codierenden Sequenz zu fusionieren, wurden zwei separate Polymerase-Kettenreaktionen durchgeführt: die erste Reaktion mit pAB6-1 als die Matrize und den Oligonucleotiden AB 1771 und AB 1985 als Primer, um ein 300 bp-DNA-Fragment zu amplifizieren, das das 3'-Stück des AG-Promotors und die 18 As-AG-Leadersequenz, am 3'-Ende flankiert durch die ersten 18 Nucleotide der codierenden Sequenz des xln A-Gens, enthielt, und die zweite Reaktion mit pXYL1 als die Matrize und die Oligonucleotide AB1986 und 1984 als Primer, um xln A-DNA-Sequenzen zu amplifizieren, die das reife Xylanase-Protein codieren, am 5'-Ende flankiert durch die letzten 18 Nucleotide des AG-Signalpeptids. Eine schematische Ansicht dieser Amplifikationsreaktionen ist in Fig. 14 dargestellt.
Die zwei erzeugten DNA-Fragmente wurden durch Agarose- Gelelektrophorese und Ethanolpräzipitation gereinigt und nachfolgend als Matrizen für die dritte PCR mit den Oligonucleotiden AB1771 und 1984 als Primer verwendet, um die AG-Xylanase-Fusion zu erzeugen. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde mit EcoRI und BamHI gespalten und in die entsprechenden Stellen des pTZ18R subcloniert. Die resultierende Fusion wurde sequenziert und als pXYLAG bezeichnet (vgl. die Fig. 14 und 15).
Die verbleibende (3,5 kb) Stromaufwärts-Region des AG- Promotors wurde durch Spaltung von pAB6-1 mit KpnI und partiell mit EcoRI erhalten und durch Agarose- Gelelektrophorese gereinigt und mit Ethanol präzipitiert. Dieses 3,5 kb-AG-DNA-Promotor-Fragment wurde zuerst in das EcoRI/BamHI AG/Xylanase-Fusionsfragment von pXYLAG ligiert mit nachfolgender molekularer Clonierung in E. coli nach Ligation in den Vektor pXYL1, der mit KpnI/BamHI gespalten wurde und wovon das KpnI/BamHI-Fragment entfernt wurde, das die 5'- und codierenden xln A-Sequenzen enthielt. Das so erhaltene Plasmid pXYL2AG ist in Fig. 15 gezeigt.

e) Die intermediären Plasmide pXYL und pXYL2.

Die Fusion der AG-Promotorsequenz mit dem xln A-Gen, das die Xylanase-Leadersequenz einschließt, wurde durchgeführt, wie vorstehend in Teil d) beschrieben. Als Primer wurden zwei zusätzliche Oligonucleotide konstruiert, die die nachfolgende Sequenz hatten:
Um die AG-Promotorsequenz an das Xylanase-Gen (einschließlich der Xylanase-Signalsequenz) zu fusionieren, wurden zwei separate Polymerase-Kettenreaktionen durchgeführt: die erste Reaktion mit pAB6-1 als Matrize und den Oligonucleotiden AB 1.771 und AB 1.982 als Primer, um ein 282 bp-Fragment zu amplifizieren, das den 3'-Teil des AG- Promotors, flankiert am 3'-Ende durch 18 Nucleotide der Xylanase-Leadersequenz, enthält, und die zweite Reaktion mit pXYL1 als Matrize und den Oligonucleotiden AB 1.983 und AB 1.984 als Primer, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, das das vollständige Xylanase-Gen (einschließlich der Xylanase- Leadersequenz), flankiert am 5'-Ende von 18 Nucleotiden des AG-Promotors, enthält.
Die zwei erzeugten DNA-Fragmente wurden durch Agarose- Gelelektrophorese und Ethanol-Präzipitation gereinigt und nachfolgend als Matrize in einer dritten PCR mit den Oligonucleotiden AB 1.771 und 1.984 als Primer verwendet, um die AG-Xylanase-Fusion zu erzeugen. Das so erhaltene DNA- Fragment wurde mit EcoRI und BamHI gespalten und in die entsprechenden Stellen von pTZ18R subcloniert. Die resultierende Fusion wurde sequenziert und als pXYL bezeichnet (vgl. Fig. 14 und 16).
Die verbleibende (3,4 kb) Stromaufwärts-Region des AG- Promotors wurde in pXYL1 inseriert, wie in Teil d) vorstehend beschrieben. Das so erhaltene Plasmid wurde als pXYL2 bezeichnet.

Beispiel 6.3

Erzeugung der Xylanase-Expressions-Kassetten pXYL3AG und pXYL3.

Beide Expressions-Kassetten wurden durch Insertion der AG/Xylanase-Fusionen von pXYL2AG oder pXYL2 in den elementaren A. niger-Vektor pYmdSH erzeugt. Für diese endgültige Konstruktion wurde pAmdSH mit KpnI und HindIII (partiell) und pXYL2AG und pXYL2 mit HindIII und partiell mit KpnI gespalten. Alle Fragmente wurden durch Gelelektrophorese und Ethanol- Präzipitation isoliert und gereinigt. Zu dem. 6,8 kb- KpnI/HindIII-DNA-Fragment von pAmdSH wurde entweder das 5,3 kb-KpnI/HindIII-DNA-Fragment von pXYL2AG oder pXYL2 zugegeben, ligiert und nachfolgend durch Transfer beider Ligierungsgemische in E. coli molekular cloniert. Die so erhaltenen Expressions-Kassetten wurden als pXYL3AG (enthaltend die AG-Leadersequenz) und pXYL3 (enthaltend die Xylanase-Leadersequenz) bezeichnet, wie in den Fig. 17 bzw. 18 gezeigt.

Beispiel 6.4

Expression des xln A-Gens unter der Kontrolle des AG- Promotors in A. niger.

a) Transformation von A. niger (CBS 513.88).

Vor dem Transfer beider Expressions-Kassetten pXYL3AG und pXYL3 in A. niger wurden die E. coli-Sequenzen durch HindIII- Spaltung, Gelelektrophorese und Ethanol-Präzipitation entfernt. Die Transformation des Stammes A. niger (CBS 513.88, hinterlegt am 10. Oktober 1988) wurde mit 10 ug linearisiertem DNA-Fragment nach Verfahren, wie von Tilburn, J. et al. (1983) und Kelly and Hynes (1985) beschrieben, mit den nachfolgenden Modifikationen durchgeführt:
- Das Mycel wurde auf Aspergillus-Minimalmedium (Cove, D. (1966)), das mit 10 mM Arginin und 10 mM Prolin ergänzt wurde, 16 Stunden bei 30ºC in einem Rotationsschüttler bei 300 UpM gezüchtet.
- Für die Bildung von Protoplasten wurden ausschließlich Novozym 234 und keine Helicase verwendet.
- Nach 90 Minuten Protoplastenbildung wurde 1 Volumen STC- Puffer (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl&sub2;) zu der Protoplasten-Suspension zugegeben und 10 Minuten bei 2.500 UpM bei 4ºC in einem Rotor mit Ausschwing- Einsätzen zentrifugiert. Die Protoplasten wurden gewaschen und in einer Konzentration von 10&sup8; Zellen pro ml in STC-Puffer resuspendiert.
- Plasmid-DNA wurde in einem Volumen von 10 ul in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA) zu 100 ul der Protoplasten-Suspension zugegeben.
- Nach 25 Minuten Inkubation der DNA-Protoplasten- Suspension bei 0ºC wurden 200 ul PEG-Lösung tropfenweise zugegeben (25% PEG 4000 (Merck), 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl&sub2;). Nachfolgend wurde 1 ml PEG-Lösung (60% PEG 4000 in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl&sub2;) langsam zugegeben, wobei die Röhrchen wiederholt durchmischt wurden. Nach Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Suspensionen mit STC-Puffer verdünnt, durch Inversion vermischt und 10 Minuten bei 2.000 UpM bei 4ºC zentrifugiert. Die Protoplasten wurden behutsam in 200 ul STC-Puffer resuspendiert und auf Aspergillus- Minimalmedium mit 10 mM Acetamid als einzige Stickstoffquelle, 15 mM CsCl, 1 M Saccharose, erstarrt mit 0,7% bakteriologischem Agar #1 (Oxoid), ausplattiert. Die Züchtung erfolgte 6-10 Tage bei 33ºC.

b) Wachstum von Transformanten in Schüttelkolben.

Einzelne A. niger-Transformanten von jeder Expressions- Kassette wurden isoliert, und die Sporen wurden auf selektiven Acetamid-Agarplatten ausgestrichen. Sporen jedes Transformanten wurden von Zellen gesammelt, die 3 Tage bei 37º C auf 0,4% Kartoffel-Dextrose (Oxoid, England)-Agar-Platten gezüchtet wurden. Xylanase-Produktion wurde in Schüttelkolben unter den folgenden Wachstumsbedingungen getestet:
- Etwa 1 · 10&sup8; Sporen wurden in 100 ml Vorkultur-Medium überimpft, das Folgendes enthielt (pro Liter): 1 g KH&sub2;PO&sub4;; 30 g Maltose; 5 g Hefe-Extrakt; 10 g Casein-Hydrolysat; 0,5 g MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O und 3 g Tween 80. Der pH-Wert wurde auf 5,5 eingestellt.
- Nach Züchtung über Nacht bei 34ºC in einem Rotationsschüttler wurde 1 ml der wachsenden Kultur in eine 100 ml Hauptkultur überimpft, die Folgendes enthielt (pro Liter): 2 g KH&sub2;PO&sub4;; 70 g Maltodextrin (Maldex MDO&sub3;, Amylum); 12,5 g Hefe-Extrakt; 25 g Casein-Hydrolysat; 2 g K&sub2;SO&sub4;; 0,5 g MgSO&sub4; · 7H&sub2;O; 0,03 g ZnCl&sub2;; 0,02 g CaCl&sub2;; 0,05 g MnSO&sub4; · 4H&sub2;O und FeSO&sub4;. Der pH-Wert wurde auf 5,6 eingestellt. Das Mycel wurde mindestens 140 Stunden gezüchtet.

c) Analysen von Tranformanten.

Xylanase-Analysen individueller Transformanten wurden durch Messung der Xylanase-Aktivität durchgeführt; durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese, gefärbt mit Coomassie Brilliant blau, und durch ein Zymogramm, gefärbt mit Xylan- Remazol Brilliant blau R.
Xylanase-Aktivitäten wurden bestimmt, wie von Leathers et al. (1984) beschrieben, mit einigen Modifikationen. Die Substrat-Konzentration wurde von 1% auf 5% Hafer-Xylan, gelöst in 100 mM NaAc bei pH 3,5, erhöht und 10 Minuten auf 100ºC erhitzt. Zusätzlich wurden die Enzymreaktionen bei 39º C anstelle von 30ºC durchgeführt.
Xylanase-Produktionsspiegel wurden im Überstand 6 Tage alter Schüttelkolben-Fermentationen von einigen zufällig ausgewählten Transformanten gemessen, die von jeder Expressions-Kassette erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Xylanase-Produktion einiger A. niger CBS 513.88-Stämme, die mit Plasmiden transformiert sind, die das xln A-Gen unter der Kontrolle des A. niger-AG-Promotors in Kombination mit unterschiedlichen Leadersequenzen enthalten.
Die SDS-PAGE-Analyse wurde wie folgt durchgeführt: nach 6 Tagen Züchtung, wie in Teil b) vorstehend beschrieben, wurden 4 ul Überstands-Proben von individuellen Transformanten und von dem A. niger-Kontrollstamm mit 3 N NaOH zuerst auf pH 7 eingestellt und nachfolgend mit 1 · SB-Puffer auf ein endgültiges Volumen von 20 ml gebracht, wie von Laemmli (1970) beschrieben. Nach 5 Minuten Erhitzen bei 100ºC wurden die gesamten Gemische einer SDS/12,5% Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterzogen und nachfolgend mit Coomassie Brilliant blau gefärbt. Wie in Fig. 10A gezeigt, konnte in den Transformanten 10 (Spur 4), 29 (Spur 5) und 1.1 (Spur 6) eine Proteinbande mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 25 kDa (vergleichbar mit gereinigter Xylanase (Spur 1)), nachgewiesen werden. Diese Proteinbande war im Überstand des Kontrollstammes (Spur 3) nicht vorhanden. Die Molekulargewichts-Marker (Spur 2) repräsentieren 94, 67, 43, 30, 20 und 14,5 kDa.
Die Zymogramm-Analyse wurde wie folgt durchgeführt. Die gleichen Proben, wie vorstehend verwendet, wurden ebenfalls zweimal in einem nativen 8-25% PAA-Phastsystemgel (BRL) verwendet. Nach der Elektrophorese wurde das Gel A mit Coomassie Brilliant blau (vgl. Fig. 11A) und Gel B mit einer Remazol Brilliantblau-Xylan (Megazyme)-Überschichtung bei pH 3,5 gefärbt, wie von Biely et al. (1985a) beschrieben (vgl. Fig. 11B), um die Xylanase-Aktivität sichtbar zu machen. Proben, die für dieses RBB-Xylan-Überschichtungsgel eingesetzt wurden, enthielten fünfmal weniger Protein, verglichen mit den Proben, die für die Gele bereitgestellt wurden, die in den Fig. 10 und 11A gezeigt sind. Die Identifizierung der Spuren in den Fig. 11A und B sind die gleichen wie in den Fig. 10A und B.
Diese Analysen zeigen deutlich die Expression und Sekretion von aktiver Endo-Xylanase in A. niger CBS 513.88, der mit einer Expressions-Kassette transformiert wurde, in der das xln A-Gen unter der Kontrolle des A. niger- Amyloglucosidase-Promotors vorliegt. Die Expression und Sekretion wurden auch mit unterschiedlichen A. niger- Signalsequenzen beobachtet. Darüber hinaus behielten die Proteine, denen der Serinrest an Position 1 fehlte, trotzdem Xylan abbauende Aktivität.

BEISPIEL 7

Verwendung des XYL A-Proteins in Tierfutter- Zusammensetzungen.

Die Wirksamkeit des Endo-Xylanasezusatzes zu einer Nahrung, die reichhaltig ist an Weizen-Nebenprodukten, in Bezug auf die Verdaulichkeit der Nährstoffe und auf die zootechnische Entwicklung wird durch das nachfolgende experimentelle Protokoll dargestellt.
Einen Tag alte weibliche Küken wurden in Batterie-Käfigen mit Drahtböden gehalten und bis zum Beginn des experimentellen Abschnitts mit einer käuflichen Anfangsnahrung gefüttert. Am Tag 13 wurden die Vögel zufällig in gleiche Lebendgewicht- Behandlungsgruppen eingeordnet. Drei unterschiedliche experimentelle Nahrung wurden 18 Gruppen von Vögeln mit 8 Vögeln pro Gruppe zugeordnet. Die Nahrung wurde unter sehr milden Bedingungen pelletiert, und die Küken wurden ad libitum während der Tage 13 bis 34 (nach dem Ausbrüten) gefüttert.
Der Futterverbrauch und das Wachstum wurden wöchentlich für jeden Käfig überwacht. Die Verdaulichkeit wurde durch eine Sammlung der Ausscheidungen über einen Zeitbereich von 3 Tagen gemessen. Eine semi-quantitative Sammlung der Ausscheidungsstoffe wurde durchgeführt. Unter Verwendung eines Markers (HCl-unlösliche Asche) wurden individuelle Verdaulichkeits-Koeffizienten für Protein, Fett, Rohfaser und Stickstofffreien Extrakt berechnet. Die offensichtliche metabolisierbare Energie (AME) jede Nahrung wurde nach der nachfolgenden Gleichung berechnet:
AME (MJ/kg D. M.) = 17,46 a&sub1; + 38,81 a&sub2; + 8,0 a&sub3; + 16,5 a&sub4;
a&sub1; = Roheiweiß (Gramm pro kg D. M.) · d. c.1)
a&sub2; = Rohfett (Gramm pro kg D. M.) · d. c.
a&sub3; = Rohfaser (Gramm pro kg D. M.) · d. c.
a&sub4; = Stickstoff-freier Extrakt (Gramm pro kg D. M.) · d. c.
1) d. c. = Verdaulichkeits-Koeffizient
Die Grundnahrung beruhte auf Weizenkleie, Maisstärke und proteinreichen tierischen Nebenprodukten (Tabelle 3). Diese Nahrung wurde mit Endo-Xylanase in zwei unterschiedlichen Mengen, 36.000 U/kg und 174.000 U/kg gereinigte Endo-Xylanase (spezifische Aktivität 300.000 U/g), ergänzt.

Tabelle 3

Zusammensetzung der Grundnahrung

Bestandteil %
Weizenkleie 40
Maisstärke 30
Mais 4,4
Tierische Nebenprodukte (Fleischmehl, Fischmehl, Gefiedermehl) 9,7
Soja-Isolate (81% cp) 6,0
Sojaöl 6,0
Fettgemisch 0,7
gemahlener Kalkstein 0,32
Monocalciumphosphat 0,13
Prämix (einschließlich DL-Methionin & Lysin-HCl) 1,35
SiO&sub2;-Marker (Diamol®) 1,4
Berechneter Gehalt
AME (MJ/kg) 12,66
Rohprotein, % 18,0
Lysin, % 1,2
Methionin + Cystein, % 0,9
Analysierter Gehalt
Rohprotein, % 18,2
Rohfett, % 9,7
Rohfaser, % 4,1
SiO&sub2;-Marker, % 1,07
Ca % 0,8
P % 0,85
Asche, % 5,9
Die wichtigsten Ergebnisse sind in Tabelle 4 (Entwicklungsdaten) und Tabelle 5 (Verdaulichkeits-Daten) zusammengefasst. Die Entwicklungsdaten beziehen sich auf den gesamten experimentellen Zeitraum, die Tage 13 bis 34 (nach Ausbrüten), während die Verdaulichkeitswerte durchschnittliche Werte sind, die von Analysen der Exkrete abstammen, die während der Tage 21 bis 24 und 28 bis 31 gesammelt wurden. Tabelle 4 Die Wirkung der Zugabe von Endo-Xylanase auf die Entwicklung der Küken im Alter von 13 bis 34 Tagen. Tabelle 5 Die Wirkung der Zugabe von Endo-Xylanase auf die Verdaulichkeits- Koeffizienten (. c.) der organischen Nährstoffe und berechnete Energiewerte der Nahrung
* Der in den Ausscheidungen gemessene Stickstoff wurde bezüglich des Harnsäure-Gehaltes im Urin korrigiert
Dieses Experiment zeigt die Wirksamkeit der Zugabe von Endo-Xylanase zu Futter-Zusammensetzungen für Hühnchen, die einen großen Anteil an Weizenkleie enthalten. Sowohl die Entwicklung der Küken als auch die Energiewerte der Nahrungen wurden positiv beeinflusst.
Im Hinblick auf die Entwicklung, war die Effizienz der Futterumwandlung der am meisten sensitive Parameter, der den Einfluss der Enzymzugabe wiedergab. Es gab eine Tendenz hin zu einer leicht verminderten Futterverbrauch in den Enzym ergänzten Gruppen, die mit einem ähnlichen oder besseren Wachstum assoziiert war. Infolge dessen war das Verhältnis Futter zu Gewichtszunahme wesentlich erniedrigt.
Die Verbesserung der Entwicklung kann durch die Auswirkungen der Enzym-Zugabe auf die Verdaulichkeits- Koeffizienten erklärt werden. Alle Nährstoff- Verdaulichkeitswerte wurden positiv beeinflusst, wobei die Zunahme an Fett-Verdaulichkeit am deutlichsten hervortrat, was zu einem 3,5%igen Anstieg bezüglich des Energiewertes der Enzym ergänzten Nahrungen führte.
Keine Dosis-Respons-Beziehung wurde bei diesen Mengen an Enzym-Inklusion festgestellt.

BEISPIEL 8

Verwendung von Endo-Xylanase bei der Herstellung von Brot

Brötchenlaibe wurden aus 150 g-Teigstücken gebacken, die durch Mischen von 200 g Weizenmehl (100%), 106 ml Wasser (53 %), 1,2 g getrocknete Instanthbäckerhefe (0,6%: Gist-brocades N.V., Delft, Niederlande), 4 g NaCl (2%), 400 mg CaCl&sub2; · 2H&sub2;O (0,2%), 10 mg Pilz-α-Amylase P&sub2;&sub0;&sub0; (Gist-brocades, 2250 SKB pro kg Mehl) und eine variable Zahl an Einheiten von Endo-Xylanase (xyl A)-Aktivität erhalten wurden. Nach 6 Minuten und 15 Sekunden Mischen bei 52 U.p.M. in einem Stiftmixer wurde der Teig, geteilt, man ließ ihn 45 Minuten bei 31ºC gehen, er wurde ausgestanzt, man ließ ihn für weitere 25 Minuten gehen, er wurde geformt in eine Backpfanne gegeben. Nach einem endgültigen Gehenlassen von 70 Minuten bei 31ºC wurde der Teig 20 Minuten bei 250ºC in einem Ofen gebacken. Das Laib- Volumen wurde mit Hilfe des Rapssaat-Verdrängungsverfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 nachfolgend zusammengefasst. Tabelle 6 Eigenschaften von Brot, das mit verschiedenen Mengen Endo- Xylanase (xyl A-Aktivität) hergestellt wurde
* = Bewertung von 1 (niedrigste Qualität) bis 10 (höchste Qualität)
Von diesen Ergebnissen wird es klar, dass eine zunehmende Menge Endo-Xylanase-Aktivität, die dem Teig zugegeben wird, zu einem Anstieg des Laib-Volumens und einer Verbesserung der Brotqualität hinsichtlich des Brechens und Zerreißens und der Krümelstruktur führt.

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Claims

1. DNA-Sequenz, umfassend eine Sequenz, die ein Polypeptid mit Pilz- Xylanase-Aktivität codiert, die

(a) eine DNA-Sequenz ist, die die Xylanase-Aminosäuresequenz aus Fig. 8 von Position 2 bis 184 codiert;

(b) eine DNA-Sequenz ist, die zur Hybridisierung mit einer Sequenz aus (a) unter den folgenden stringenten Bedingungen befähigt ist:

(i) Vorhybridisierung bei 65ºC für 2 Stunden in 6 · SSC;

(ii) Hybridisierung in 6 · SSC bei einer Anfangstemperatur von 65ºC, die über 18 Stunden auf 38ºC fällt;

(iii) ein erstes Waschen in 2 · SSC;

(iv) ein zweites Waschen in 6 · SSC bei 38ºC; und

(v) ein letztes Waschen in 6 · SSC, 0,05% Natriumpyrophosphat bei 38ºC für 30 Minuten; oder

(c) eine DNA-Sequenz ist, die zu der DNA-Sequenz aus (a) degeneriert ist und worin die Xylanase-Aktivität des dadurch codierten Enzyms erhalten bleibt.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem Pilz der Gattung Aspergillus abstammt.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, worin die DNA-Sequenz die Aminosäuresequenz aus Fig. 8 von Position 1, 2 oder 3 bis 184 codiert.

4. DNA-Sequenz nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz von der Pilzart Aspergillus tubigensis abstammt.

5. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine DNA-Sequenz nach einem der vorstehenden Ansprüche enthält, funktionell verbunden mit entweder den regulatorischen Regionen, die zur Steuerung der Überexpression des Polypeptids mit Xylanase-Aktivität in einem geeigneten Expressionswirt befähigt sind, oder den nativen (des Expressionswirts) regulatorischen Sequenzen.

6. Vektor nach Anspruch 5, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorische Region einen Promotor einschließt, ausgewählt aus dem Promotor, der von einem Amyloglucosidasegen abstammt, und dem Promotor der von dem nativen Xylanasegen abstammt.

7. Vektor nach Anspruch 6, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorische Region eine Sekretionsleadersequenz einschließt, ausgewählt aus der Sekretionsleadersequenz, die von einem Amyloglucosidasegen abstammt, und der Sekretionsleadersequenz des nativen Xylanasegens.

8. Transformierter mikrobieller Wirt, der zur Erzeugung eines Polypeptids mit Xylanase-Aktivität befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, dass der mikrobielle Wirt einen Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 5 bis 7 enthält, oder Wirt-Abkömmlinge davon, den Vektor enthaltend.

9. Mikrobieller Wirt nach Anspruch 8, der zur Gattung Aspergillus, Kluyveromyces, Trichoderma, Saccharomyces oder Bacillus gehört.

10. Mikrobieller Wirt nach Anspruch 9, der Aspergillus tubigensis, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Kluyveromyces lactis oder Saccharomyces cerevisiae ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Xylanase-Aktivität gekennzeichnet durch die Schritte:

(a) Züchten des mikrobiellen Wirts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 unter Bedingungen, die der Expression des Gens, das das Polypeptid mit Xylanase-Activität codiert, förderlich sind; und

(b) Gewinnen des Polypeptids mit Xylanase-Aktivität.

12. Verfahren nach Anspruch 11, das weiterhin den Schritt umfasst: Mischen des Polypeptids mit Xylanase-Aktivität mit anderen ausgewählten Enzymen.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, das weiterhin den Schritt umfasst: stabiles Formulieren des Polypeptids mit Xylanase-Aktivität in flüssiger oder trockener Form.

14. Verwendung eines Polypeptids mit Xylanase-Aktivität, das durch eine DNA-Sequenz gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, für die Herstellung von Tierfuttermittel, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid das einzige Xylan abbauende Enzym ist, das bei der Herstellung der Tierfuttermittel verwendet wird.

15. Verwendung eines Polypeptids mit Xylanase-Aktivität, das durch eine DNA-Sequenz gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, in einem Teig für die Herstellung von Brot, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid das einzige Xylan abbauende Enzym ist, das im Teig zur Herstellung von Brot verwendet wird.

16. Verwendung eines Polypeptids mit Xylanase-Aktivität, das durch eine DNA-Sequenz gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, zur Entfernung von Ligninen aus Kraftzellstoff bei der Herstellung von Papierprodukten, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid das einzige Xylan abbauende Enzym ist, das zur Entfernung von Ligninen aus dem Kraftzellstoff verwendet wird.

17. Tierfutter, das eine Xylanase enthält, die durch ein Verfahren nach Anspruch 11 hergestellt wurde.

18. Tierfutter, das eine Xylanase umfasst, die durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 codiert wird.