DE69131903T2

DE69131903T2 - Klonierung hühner-anaemia-virus-dna

Info

Publication number: DE69131903T2
Application number: DE69131903T
Authority: DE
Inventors: Foppe De Boer; Hubertus Noteborn
Original assignee: Leadd BV
Current assignee: Leadd BV
Priority date: 1990-09-12
Filing date: 1991-09-11
Publication date: 2000-07-20
Anticipated expiration: 2011-09-12
Also published as: HU9300716D0; YU150891A; WO1992004446A1; US5958424A; US20020103336A1; US5491073A; HRP940668A2; US6238669B1; JP2846116B2; JPH06504195A; DK0548234T3; ES2144399T3; ZA917065B; RU2146292C1; HRP940668B1; NL9002008A; AU651999B2; SI9111508B; CA2091181C; HUT65974A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung liegt in dem Gebiet der Gentechnik (Genmanipulation) mittels der rekombinanten DNA- (und RNA-) Technologie, Diagnostik und Immunisierung/Impfung. Im besonderen betrifft die Erfindung den Nachweis, das Klonieren und die Sequenzanalyse des Hühner-Anämievirus- (CAV-; Chicken Anaemia Virus) DNA-Genoms und Anwendungen, die dadurch ermöglicht werden.[0001]

Hintergrund der Erfindung

Das CAV-Virus, das bislang noch nicht klassifiziert worden ist, verursacht eine infektiöse Anämie in Küken. Das Virus wurde das erste Mal in Japan 1979 isoliert und sein Name wurde ihm wegen der schweren Anämie gegeben, die davon in jungen Küken verursacht wird (Yuasa et al., 1979). Die anderen Symptome einer CAV-Infektion sind eine Atrophie des Knochenmarks und die Zerstörung von Lymphozyten im Thymus. Läsionen treten in der Milz und in der Leber auf.[0002]
Tage alte Küken sind am empfänglichsten. In diesen Tieren werden Lethargie, Anorexie und eine vorübergehende Anämie von Tag 4 bis 7 nach einer Inokulation mit CAV beobachtet und etwa die Hälfte der Tiere stirbt zwischen 2 und 3 Wochen nach der Infektion. Mit ansteigendem Alter steigt die natürliche Resistenz ebenfalls an. Nach einer Infektion im Alter von sieben Tagen entwickeln die Küken nur eine vorübergehende Anämie nach einer Infektion und nach einer Infektion von 14 Tage alten Tieren erfolgt keine Anämie.[0003]
Ein Schutz gegen eine CAV-Infektion und die Symptome der CAV-Erkrankung basieren in hohem Maße auf humoralen, immunologischen Verteidigungsmechanismen.[0004]
Vielitz (1989) entwickelte ein praktisches, recht wirksames Verfahren zur Prävention mittels einer "kontrollierten Exposition" mit CAV-infizierten Lebersuspensionen in Legehennen, wodurch die Nachkommenschaft auf diese Weise eine maternale Immunität erlangte. In Deutschland wird dieses Verfahren der Immunisierung in der Praxis verwendet, aber es scheint nicht völlig risikofrei zu sein.
[0005] Tierexperimente, welche mit dem Centraal Dieregeneeskundig Instituut (CDI) in Lelystad in isolierten Geflügelhäusern durchgeführt worden sind, haben den schützenden Wert maternaler Antikörper bestätigt. Hier wurde die "kontrollierte Exposition" mit in Gewebekultur vermehrtem CAV durchgeführt. Das Vorhandensein maternaler Antikörper gegen CAV verhinderte die Replikation von CAV vollständig nach einer Infektion von Tage alten Küken von auf diese Weise geimpften Muttertieren. Die CAV-Symptome traten ebenfalls nicht auf. Dieser passive Schutz wurde ebenfalls bei den Nachkommen immunisierter Legehennen erhalten und ebenso nach einer Injektion von in spezifischer Weise pathogenfreien (SPF; specifically pathogen free) Küken mit Eiweisextrakten von Eiern derselben immunisierten Legehennen. Der passive Schutz in bezug auf eine CAV-Infektion durch die Verabreichung von CAV-Antikörpern hielt bis zum Alter von 4 Wochen an. Dann fand man, daß der passive Schutz unvollständig ist. Diese Experimente zeigten, daß maternale Antikörper, welche durch eine Impfung von Muttertieren erzeugt werden, eine wichtige schützende Rolle in der Situation in der Praxis spielen werden.
[0006] Es wurde ebenfalls mittels Experiment gezeigt, daß in Küken, welche die CAV- Infektion überleben, eine vorübergehende Depletion einer spezifischen Population von Thymuslymphozyten auftritt (Jeurissen et al., 1989). Die Atrophie des Thymus ist die mögliche Ursache der Immunsuppression, welche CAV verursacht, was dazu führt, daß spezifische Impfungen weniger wirksam sind, z. B. gegen Newcastle Disease, CAV wurde mehrmals in Scharen mit erhöhten Verlusten aufgrund von der Marekschen Erkrankung, Gumboro's Disease (Infectious Bursal Disease Virus IBDV; Yuasa et all, 1980) und in Tieren mit Blue Wing Disease in Verbindung mit Retroviren (Engstöm 1988a, Engstöm et al., 1988b) isoliert. Mit experimentellen Doppelinfektionen wurden die verstärkenden Eigenschaften von CAV in bezug auf andere Hühnerviren (z. B. Marek's Disease Virus, MDV, De Boer et al., 1989a) demonstriert. Vor kurzem wurde eine heftig verstärkte Inokulierungs reaktion in unseren eigenen Experimenten nach einer Aerosol-Impfung mit Impfstoff für Newcastle Disease und einer gleichzeitigen CAV-Infektion beobachtet. CAV führt daher zu immunsuppressiven und zu verstärkenden Wirkungen von anderen Virusinfektionen. Diese Eigenschaften von CAV verursachen möglicherweise ein erhöhtes Auftreten virulenter Krankheitsausbrüche in der Praxis.
[0007] CAV scheint überall in der Welt verbreitet zu sein. Eine beträchtliche Zeit nachdem die CAV-Forschung in Japan begonnen hatte, wurden die ersten Isolationen von CAV in Europa durchgeführt, nämlich in Deutschland durch Von Blow (1983) und später von McNulty et al., (1990) in Großbritannien. In den Niederlanden wurden die ersten Isolate von CAV aus Materialien aus den USA, Israel und Tunesien von De Boer et al. (1988) durchgeführt. Die verfügbaren Literaturdaten zeigen an, daß die Isolate zu einem Serotyp gehören, aber einige Feldisolate müssen hinsichtlich ihrer wechselseitigen Beziehungen und möglichen Unterschieden bei der Pathogenität getestet werden (McNulty et al. 1990). Die Verbreitung von CAV innerhalb einer Schar tritt möglicherweise durch eine Infektion über Fäkalien und die Luft auf. Eine vertikale Transmission von Virus zu den Nachkommen spielt jedoch ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Epidemiologie von CAV. In verschiedenen Ländern wurde das Vorhandensein von CAV serologisch gezeigt.
[0008] Unter Gewebekulturbedingungen ist es schwierig, CAV zu vermehren. CAV verursacht bislang nur einen cytopathologischen Effekt (CPE) in MDV-transformierten Lymphoblastoid-Zellinien von Lymphomen von Marekscher Erkrankung (MDCC-MSB1- Zellen) oder in mit dem Vogel-Leukämievirus (ALV, Avian Leukaemia Virus) transformierten Lymphoblastoid-Zellinien von lymphoider Leukosis (1104-X5-Zellen, Yuasa 1983).
[0009] Eine neuere Studie von Todd et al., (1990) beschreibt Viruspartikel (in gereinigtem CAV-Material) mit einem Durchmesser von 23,5 nm, welche sich bei einer Dichte von 1,33- 1,34 g/ml in einem CsCl-Gradienten konzentrieren. Das Virus hat ein Haupt-Polypeptid (Mw: 50 000) und zirkuläres, einzelsträngiges DNA-Genom mit einer Länge von 2, 3 Kilobasen. Zwei kleine Viren, das Porcine Circovirus und ein Virus, welches mit der Schnabel und Feder Krankheit von Papageien (Psittacine Beak and Feather Disease) assoziiert ist, ähnelt CAV, was die zirkuläre einzelsträngige DNA betrifft, haben aber ein kleineres Genom und einen kleineren Durchmesser der Viruspartikel (Ritchie et al., 1989, Tischer et al., 1982). Es wurde während einer langen Zeit akzeptiert, daß CAV zu den Parvoviren gehöre. Obwohl die meisten Parvoviren einzelsträngige DNA-Viren sind, besitzen sie eine lineare DNA, ein größeres Genom und möglicherweise eine andere Zusammensetzung der viralen Polypeptide.

Kurze Beschreibung der Erfindung

[0010] Es ist allgemein akzeptiert, daß zelluläre Komponenten, welche an der Replikation und Transkription eines Virus beteiligt sind, nur dann funktionell sind, wenn die DNA eine doppelsträngige Form hat. Ein Virus mit einer zirkulären, einzelsträngigen DNA kann in der Zelle in einer Phase auftreten, in welcher es aus einer doppelsträngigen DNA besteht. Die gegenwärtigen Erfinder haben von dieser Tatsache Gebrauch gemacht.
[0011] Die gegenwärtigen Erfinder haben die doppelsträngige CAV-DNA mit einer Länge von 2,3 Kilobasenpaaren in CAV-infizierten 1104-X5 und MDCC-MSB1-Zellen charakterisiert und sie in pIC-20H kloniert. Die DNA wurde vollständig sequenziert (siehe Fig. 1). In einem diagnostischen Test mit markierter, klonierter CAV-DNA konnten CAV- Nukleinsäuren in Virus, in Leber- und Gewebekulturpräparationen nachgewiesen werden. Man fand, daß das klonierte CAV alle biologischen und pathogenen Eigenschaften des CAV vom Wildtyp sowohl in der Gewebekultur als auch in Tiertests besaß.
[0012] PCR- und Hybridisierungsexperimente zeigten, daß das klonierte vollständige CAV- Genom repräsentativ für CAV im Feld ist. Mittels Southern-Analysen mit ³²P-markierten DNA-Sonden wurde gezeigt, daß alle Feldisolate DNA-Moleküle von 2,3 kb enthielten. Restriktionsenzymanalysen zeigen, daß die klonierte CAV-DNA der DNA von Feldisolaten entspricht. In einem Dot-Blot-Assay wurde gezeigt, daß mit Digoxigenin markierte, klonierte CAV-DNA in spezifischer Weise mit der DNA der unterschiedlichen Feldisolate hybridisiert. In PCR-Experimenten unter Verwendung von Oligonukleotiden, deren Sequenz von der klonierten CAV-Sequenz abgeleitet war (Fig. 4), wurde CAV-DNA in einer spezifischen Weise amplifiziert oder erkannt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

[0013] Die vorliegende Erfindung stellt in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von Hühner-Anämievirus in einer doppelsträngigen Form bereit, umfassend die Schritte des Isolierens von DNA mit niedrigem Molekulargewicht aus CAV-infizierten Zellen, des Fraktionierens der DNA mit niedrigem Molekulargewicht auf Agarose/Ethidiumbromid, des Vergleichens des Fraktionierungsmusters mit dem Fraktionierungsmuster der gleichen, nicht infizierten Zelle, des Isolierens der nur in der infizierten Zelle vorhandenen DNA und des Überprüfens, daß diese DNA doppelsträngig ist durch eine Restriktionsenzymanalyse.
[0014] Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt eine rekombinante Nukleinsäure, welche eine CAV-spezifische Nukleotidsequenz umfaßt, die der in der Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz entspricht oder zu ihr komplementär ist, eine zu mindestens 60% dazu homologen Nukleotidsequenz oder einen Teil davon.
[0015] Dieser Aspekt der Erfindung besteht aus einer Nukleinsäure, welche ausgewählt ist aus DNA oder RNA in jedweder möglichen Manifestation, d. h. sowohl in der Form von nackter DNA oder RNA und in der Form von DNA oder RNA, welche auf jedwede Weise verpackt ist (d. h. in Proteinen oder in Viruspartikeln) oder mit anderem Material verknüpft ist (z. B. mit einem Träger oder mit einem Material, welches als ein Marker dient). Die DNA kann sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige DNA sein, und sie kann sowohl in einer linearen als auch in einer zirkulären Form sein.
[0016] Charakteristisch für rekombinante Nukleinsäuren gemäß der Erfindung ist das Vorhandensein einer CAV spezifischen Nukleotidsequenz darin. Diese CAV-spezifische Sequenz muß nicht das gesamte Genom vom CAV abdecken und aus einem praktischem Gesichtspunkt wird nur ein spezifischer Anteil notwendig und wünschenswert für die meisten Anwendungen sein.
[0017] Eine erste bevorzugte Möglichkeit ist eine CAV-spezifische Nukleotidsequenz, welche einer für ein CAV kodierende Nukleotidsequenz entspricht oder zu ihr komplementär ist, und welche in einem CAV-Genom auftritt oder ein Teil davon. Rekombinante DNA, welche solch eine kodierende Sequenz umfaßt, kann z. B. zum Nachweis von CAV-Boten-RNA in einer Probe verwendet werden oder kann z. B. innerhalb des Umfanges eines Verfahrens zur Herstellung von CAV-Proteinen oder von Teilen davon verwendet werden. Die Worte "Teil davon" umfassen im Prinzip jeden Teil, der immer noch als CAV spezifisch bezeichnet werden kann. Auf dem Proteinniveau wird dies ein Epitop für die meisten von den Anwendungen sein, d. h. eine antigene Determinante, welche von Antikörpern erkannt werden kann.
[0018] Die rekombinanten Nukleinsäuren gemäß der Erfindung können ebenfalls eine Nukleotidsequenz umfassen, welche nicht von einem CAV-Genom abgeleitet ist. Diese "nicht von einem CAV-Genom abgeleitete Nukleotidsequenz" kann z. B. durch eine Nukleotidsequenz gebildet werden, welche von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionsvektor abgeleitet ist. Daher umfaßt die Erfindung die Möglichkeit einer Insertion einer CAV spezifischen Sequenz in einen (viralen oder nicht-viralen) Vektor, welcher für die Expression in eukaryontischen Organismen geeignet ist, oder in ein Plasmid, welches für eine Expression in Bakterien geeignet ist. Des weiteren ist es ebenfalls möglich, daß als die "nicht von einem CAV-Genom abgeleitete Nukleotidsequenz" rekombinante Nukleinsäuren gemäß der Erfindung eine Nukleotidsequenz umfassen, welche nicht in dem CAV-Genom auftritt, mit einer regulatorischen Funktion.
[0019] Die "nicht von einem CAV-Genom abgeleitete Nukleotidsequenz" kann jedoch ebenfalls aus einer Nukleotidsequenz, welche für ein anderes Protein (bzw. einen Teil eines anderen Proteins) als ein CAV-Protein kodiert, bestehen, falls die rekombinante DNA verwendet werden soll, um ein Hybrid- oder ein Fusionsprotein herzustellen, in welchem ein CAV-Protein als ein Träger für ein Epitop eines Nicht-CAV-Proteins funktioniert oder umgekehrt ein Nicht-CAV-Protein als ein Träger für ein Epitop eines CAV-Proteins funktioniert.
[0020] Falls eine rekombinante Nukleinsäure gemäß der Erfindung innerhalb des Umfanges von Verfahren für den Nachweis von komplementärer DNA oder RNA in einer Probe verwendet werden soll, kann das Vorhandensein einer Markierung notwendig sein. Eine Markierung, wie sie hierin verwendet wird, ist ein Marker, welcher für eine Verwendung mit DNA oder RNA geeignet ist, welcher den Nachweis der markierten DNA oder RNA ermöglicht oder erleichtert. Ein Fachmann kennt viele Typen von Markern, welche für diesen Zweck geeignet sind, wie Radioisotope (z. B. 32P), Enzymmoleküle (z. B. Peroxidasen), Haptene (z. B. Biotin), fluoreszente Substanzen, Farbstoffe, Pigmente (z. B. anorganischen Phosphor) und teilchenförmige Marker (z. B. Gold- oder Selenpartikel).
[0021] In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von rekombinanten Nukleinsäuren, wie vorausstehend definiert, insbesondere für diagnostische Zwecke, Zwecke der Immunisierung oder der Impfung oder für die Produktion von CAV- oder von Nicht- CAV-Proteinen.
[0022] Im besonderen betrifft sie z. B. eine Verwendung von rekombinanten Nukleinsäuren gemäß der Erfindung, wie eine CAV-spezifische Sonde oder einen Primer in einem Verfahren zum Nachweis von CAV-DNA oder -RNA, z. B. in einem Verfahren von DNA/RNA-Slot- Blotting, Southern-Blotting, Northern-Blotting, In-Situ-Hybridisierung, der DNA- Amplifikation mittels PCR, S1-Mapping und Primer-Extension, die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf einen diagnostischen Kit zum Nachweis von CAV-DNA oder -RNA in einem Verfahren wie DNA/RNA-Slot-Blotting, Southern-Blotting, Northem-Blotting, In-Situ- Hybridisierung, der DNA-Amplifikation mittels PCR, S1-Mapping oder Primer-Extension, wobei dieser diagnostische Kit rekombinante genetische Information gemäß der Erfindung als eine CAV-spezifische Sonde oder einen Primer enthält.
[0023] Des weiteren ist eine Verwendung von rekombinanten Nukleinsäuren gemäß der Erfindung als ein Impfstoff mit Lebend-Virus betroffen, um einen Schutz gegen CAV oder ein anderes Pathogen zu realisieren, wobei sich die Erfindung ebenfalls auf eine Präparation eines Impfstoffes für eine Immunisierung gegen CAV oder ein anderes Pathogen erstreckt, wobei diese Präparation rekombinante genetische Information gemäß der Erfindung umfaßt und wahlweise einen oder mehrere Träger und Adjuvanzien, welche für Lebend-Virus- Impfstoffe geeignet sind.
[0024] Die Verwendung rekombinanter genetischer Information gemäß der Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung eines CAV-Proteins, eines Teils davon durch Translation in vitro oder in vivo ist ebenfalls umfaßt. Dasselbe findet Anwendung auf eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle, welche rekombinante genetische Information, wie vorausstehend definiert, enthält, und im besonderen eine solche prokaryontische oder eukaryontische Zelle, welche in der Lage ist, wenigstens ein Protein oder einen Proteinteil zu exprimieren, welcher durch rekombinante genetische Information gemäß der Erfindung kodiert wird. Diese verschiedenen Möglichkeiten werden ausführlich nachstehend in dieser Beschreibung erklärt werden.
[0025] Ein folgender Aspekt der Erfindung betrifft ein CAV-Protein oder einen Teil davon, welcher durch die Translation in vitro von rekombinanter genetischer Information gemäß der Erfindung erhalten wird, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für das CAV-Protein oder einen Teil davon kodiert, sowie CAV-Protein oder einen Teil davon, welches bzw. welcher durch die Isolation aus einer prokaryontischen oder einer eukaryontischen Zelle erhalten wird, welche rekombinante genetische Information gemäß der Erfindung enthält, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für das CAV-Protein oder einen Teil davon kodiert und zur Expression davon in der Lage ist.
[0026] Auf dem Proteinniveau erstreckt sich die Erfindung ebenfalls auf die verschiedenen Anwendungen, insbesondere die Verwendung eines CAV-Proteins oder eines Proteinteils gemäß der Erfindung für diagnostische Zwecke, Zwecke der Immunisierung oder Impfung oder für die Herstellung von CAV spezifischen Antikörpern.
[0027] Im konkreteren umfaßt die Erfindung die Verwendung eines CAV-Proteins oder eines Proteinteils, wie vorausstehend definiert, als ein Reagenz, welches CAV-spezifische Antikörper in einem Immungssayverfahren zum Nachweis von CAV-spezifschen Antikörpern bindet, z. B. eine Immunperoxidasefärbung, ein ELISA oder ein Immunfluoreszenzassay und entsprechendermaßen einen diagnostischen Kit für den Nachweis CAV-spezifischer Antikörper in einem Immungssayverfahren, wie einer Immunperoxidasefärbung, einem ELISA oder ein Immunfluoreszenzassay, wobei dieser diagnostische Kit ein CAV-Protein oder Proteinteil gemäß der Erfindung als Reagenz enthält, welches CAV-spezifische Antikörper bindet.
[0028] Die Verwendung eines CAV-Proteins oder eines Proteinteils, wie vorausstehend definiert in einem Verfahren zur Herstellung von CAV spezifischen polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gehört ebenfalls zu den Möglichkeiten, welche innerhalb des Umfangs der Erfindung fallen. Alle diese Anwendungen werden ausführlicher nachstehend in dieser Beschreibung erklärt.

Beispiele

Analyse niedermolekularer aus CAV-infizierten Zellen isolierter DNA

[0029] Das aus einer gereinigten Viruspräparation isolierte CAV-Genom erwies sich als ein zirkuläres einzelsträngiges DNA-Molekül mit einer Länge von etwa 2300 Basen (Todd et al., 1990). Unsere Erwartung war, daß in CAV-infizierten Zellen zusätzlich zu der zirkulären einzelsträngigen Virus-DNA ebenfalls eine zirkuläre doppelsträngige CAV-DNA auftritt. Doppelsträngige DNA kann mit Restriktionsenzymen geschnitten werden und kann daher direkt kloniert werden, im Gegensatz zu einzelsträngiger DNA. Angesichts dessen wurde untersucht, ob in der niedermolekularen Fraktion von CAV-infizierten Zellen ein DNA- Produkt auftritt, welches in nicht infizierten Zellen abwesend war.
[0030] Niedermolekulare DNA wurde aus CAV-infizierten MDCC-MSB1 und 1104-X5- Zellen und aus nicht infizierten 1104-X5-Zellen isoliert. Die DNA wurde auf einem Agarose/Ethidiumbromid-Gel fraktioniert. Eine sehr schwache DNA-Bande mit einer (gemessenen) Länge von etwa 3 Kilobasenpaaren (kbp) war in dem Gel sichtbar. Dieses spezifische DNA-Produkt war in der DNA, welche aus nicht infizierten Zellen isoliert wurde, abwesend.
[0031] In dem folgenden Experiment wurde die Wahrscheinlichkeit erhöht, daß die spezifische DNA nur in CAV-infizierten Zellen vorhanden war. DNA, welche von infizierten Zellen isoliert wurde, wurde der Länge nach mittels eines Agarosegels getrennt. DNA mit einer Länge von 2,7 bis 3,5 kbp wurde isoliert. Diese DNA-Fraktion müßte die spezifische Virus-DNA enthalten zusätzlich zu anderer, zellulärer DNA. Die isolierte DNA wurde radioaktiv markiert und mit einem Southern-Blot mit niederermolekularer DNA von CAV infizierten Zellen und von nicht infizierten Zellen hybridisiert. In der Höhe von 3 kbp hybridierte ein DNA-Produkt in dem Blot von CAV-infizierten Zellen, welches in dem Blot von nicht infizierten Zellen abwesend war.
[0032] Die Länge von 3 kbp wurde mit aus doppelsträngigen linearen DNA-Molekülen bestehenden DNA-Markern bestimmt. Das Verhalten eines zirkulären, doppelsträngigen DNA-Moleküls in einem Agarosegel ist verschieden von demjenigen von linearen DNA- Fragmenten. Die DNA von 3 kbp aus CAV-infizierten Zellen könnte eine lineare Form von einer DNA sein, welche in Wirklichkeit 2,3 kbp lang ist.
[0033] Falls die zirkuläre doppelsträngige DNA mit einem Restriktionsenzym verdaut wird, welches nur einmal in dem DNA-Molekül schneidet, dann muß ein lineares DNA-Molekül mit einer (gemessenen) Länge von 2,3 kbp gebildet werden.
[0034] Daß diese Annahme korrekt ist, wurde gezeigt, indem niedermolekulare DNA, welche aus CAV-infizierten 1104-X5-Zellen isoliert worden war, separat mit sechs verschiedenen Restriktiorisenzymen (BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, PstI und XbaI) inkubiert wurde. Ein Southern-Blot von niedermolekularer DNA, welche aus CAV-infizierten 1104-X5-Zellen isoliert und mit den vorausstehenden Restriktionsenzymen geschnitten wurde, wurde mit der vorausstehenden radioaktiv markierten DNA-Sonde hybridisiert. Dies zeigte, daß eine Behandlung mit den Restriktionsenzymen BamHI, EcoRI, PstI und XbaI zu einem DNA- Molekül mit einer gemessenen Länge von 2,3 kbp führte. DNA von nicht infizierten Zellen, welche mit BamHI inkubiert wurden, enthielten dieses DNA-Produkt nicht. Das Restriktionsenzym HindIII schnitt zweimal in der DNA, während KpnI nicht schnitt.
[0035] Aus den vorausstehenden Experimenten kann man schließen, daß in der niedermolekularen DNA von CAV-infizierten Zellen ein 2,3 kbp zirkuläres DNA-Molekül auftritt, welches in nicht infizierten Zellen abwesend ist, und daß dieses das CAV-Genom in der Form eines zirkulären, doppelsträngigen DNA-Moleküls ist.

Klonieren und Subklonieren von doppeisträngiger CAV-DNA in einen bakteriellen Vektor

[0036] Niedermolekulare DNA von CAV-infizierten 1104-X5-Zellen wurde separat mit BamHI, EcoRI, PstI und XbaI inkubiert. Die DNA wurde auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt separiert. Aus allen vier DNA-Präparationen wurde das 2,3-kbp- DNA-Molekül isoliert. Der Klonierungsvektor pIC-20H wurde separat mit denselben vier Restriktionsenzymen verdaut, mit welchen die niedermolekulare DNA geschnitten worden war. Der lineare Vektor wurde mit "alkalischer Phosphatase aus Eingeweide von Kälbern (calf intestine alkaline phosphatase)" behandelt. Jedes DNA-Fragment mit 2,3 kbp wurde an der entsprechenden Restriktionsenzymschnittstelle von pIC-20H ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in den E. coli Stamm HB 101 transfiziert. Alle vier Klonierungen ergaben Plasmide, welche eingefügte DNA mit einer Länge von etwa 2,3 kbp hatten. Eine weitere Restriktionsenzymanalyse zeigte, daß wenigstens 7 Plasmide dasselbe DNA-Fragment enthielten. Die Integrationsstelle des Vektors war jedoch verschieden, wegen der Verwendung von verschiedenen Enzymen, um das zirkuläre Molekül aufzuschneiden. Mit den Restriktionsenzymen BamHI, EcoRI, PstI und XbaI wurde eine Restriktionsenzymkarte von allen vier CAV-DNA-Klonen bestimmt.
[0037] Vier "verschiedene" CAV-DNA-Plasmide wurden radioaktiv markiert und mit Southern-Blots von mit BamHI verdauter DNA hybridisiert, welche aus CAV-infizierten und aus nicht infizierten Zellen isoliert worden war. Alle getesteten Klone hybridisierten nur mit dem 2,3 kbp DNA-Molekül, welches in der DNA von CAV-infizierten Zellen enthalten war.

Biologische Aktivität von zwei CAV-DNA-Klonen

[0038] Die zwei CAV-Klone pIC-20H/CAV-EcoRI und pIC-20H/CAV-PstI wurden mit Restriktionsenzymen so verdaut, daß die CAV-DNA vollständig aus dem Vektor geschnitten wurde. Die linearen CAV-DNA-Moleküle wurden mit T4-DNA-Ligase behandelt. Die linearen CAV-DNAs wurden so zirkularisiert. Die "klonierten" CAV-DNA hatte jetzt die doppelsträngige zirkuläre Form, welche ebenfalls die CAV-DNA vom Wildtyp in infizierten Zellen besaß. MDCC-MSB1 und 1104-X5-Zellen wurden mit den "klonierten" zirkulären CAV-DNAs transfiziert. Für den Klon pIC-20H/CAV-EcoRI wurde ein sehr klarer cytopathogener Effekt (CPE) in beiden Zellarten gefunden. Der Klon pIC-20H/CAV-PstI verursachte einen klaren CPE in MDCC-MSB1-Zellen und einen weniger klaren CPE in 1104-X5-Zellen. Die Überstände von pIC20H/CAV-PstI-transfizierten 1104-X5-Zellen verursachten jedoch einen klaren CPE in MDCC-MSB1-Zellen. Transfektionen mit aus CAVinfizierten Zellen isolierter DNA verursachten ebenfalls einen klaren CPE in MDCC-MSB1- Zellen, während in 1104-X5-Zellen ein weniger klarer CPE gesehen werden konnte. Der CPE wurde nicht nach einer Transfektion von MDCC-MSB1 oder 1104-X5-Zellen mit pIC-20H- Vektor-DNA gesehen.
[0039] Eine Southern-Analyse zeigte, daß in Zellysaten von MDCC-MSB1 und 1104-X5- Zellen, welche mit Virus infiziert worden waren (Passage 6), welcher durch klonierte CAV- DNA erhalten worden war, CAV-DNA vorhanden war.
[0040] Ein Neutralisierungstest mit MDCC-MSB1-Zellen zeigte, daß der CPE, welcher durch klonierte DNA in den transfizierten Zellen verursacht wurde, das Ergebnis einer CAV- Infektion war. Neutralisierende, gegen CAV gerichtete Antikörper verhinderten den CPE von MDCC-MSB1-Zellen, welche von CAV-Nachkommen von transfizierten Zellen infiziert wurden.
[0041] Tage alte Küken wurden intramuskulär mit Überständen von transfizierten Zellen infiziert. In den Hühnern verursachten die Überstände dasselbe klinische Bild wie CAV vom Wildtyp; verzögertes Wachstum, welches aus Unterschieden im Gesamtkörpergewicht resultierte, blasses Knochenmark und verminderte Hämatokritwerte (Anämie), eine Atrophie des Thymus (Depletion einer spezifischen Population von T-Zellen) und Mortalität. Die Überstände von mit Vektor-DNA transfizierten Zellen verursachten keine Erkrankungssymptome in den Kontrollküken.

Sequenzanalyse des doppelsträngigen CAV-DNA-Genoms

[0042] Das gesamte doppelsträgige CAV-DNA-Genom wurde vollständig sequenziert mittels des Sanger-Verfahrens (Sanger et al., 1977) und des Maxam-Gilbert-Verfahrens. Mit M13- Sequenzierungs- und M13-reversen Sequenzierungsprimern wurde die DNA-Sequenz von etwa 2100 Basen von den 4 pIC-20H-CAV-Klonen (BamHI, EcoRI, PstI und XbaI) bestimmt. Dann wurde das CAV-Genom subkloniert. Von den fünf verschiedenen Subklonen des CAV- DNA-Genoms wurde die DNA-Sequenz durch das Sanger-Verfahren mit M13-Primern und/oder das Maxam-Gilbert-Verfahren bestimmt. Auf diese Weise wurde die DNA-Sequenz beider Stränge des CAV-Genoms bestimmt.
[0043] Die Länge der (doppelsträngigen) CAV-DNA ist 2 319 bp. Die erste Base der EcoRI- Schnittstelle des zirkulären CAV-Genoms wird mit +1 numeriert. Die Sequenz des DNA- Strangs, welcher die meisten/die größten offenen Leserahmen enthält ist in der Fig. 1 gezeigt und wird als (+)-Strang bezeichnet. Die Zusammensetzung der Basen dieses Stranges ist 25,5% Adenin, 28,7% Cytosin, 27,7% Guanin, 18,1% Thymin. Computerstudien einer möglichen Homologie des CAV-Genoms mit bereits bekannten Virensequenzen zeigte, daß die DNA nicht zuvor beschrieben worden war und keinen Teil einer früher beschriebenen Virusgruppe bildete. Die anfängliche Hypothese, daß CAV ein Parvovirus sei, ist nicht länger solide, insofern die Sequenz und die Form des CAV-DNA-Genoms (zirkulär) betroffen sind.
[0044] Mittels Computerstudien wurde die Organisation des CAV-Genoms charakterisiert. Die offenen Leserahmen, Promoter/Enhancer-Elemente, das Polyadenylierungssignal und die -Stelle, und der "Replikationsursprung" werden vorausgesagt. Die Fig. 2 zeigt die vorausgesagten offenen Leserahmen, welche 300 Basen überschreiten, für beide DNA- Stränge von CAV. Die Fig. 2A zeigt die offenen Leserahmen, welche mit dem Codon ATG beginnen. Das Codon ATG ist das am häufigsten verwendete Initiationscodon für Proteine. Es ist bemerkenswert, daß einer von beiden DNA-Strängen für 3 Proteine mit einer Länge von 449 Aminosäuren (51,6 kDa), 216 Aminosäuren (24 kDa) und 121 Aminosäuren (13,3 kDa) kodiert. Todd et al. (1990) zeigten ein 50 kDa-Protein in gereinigtem CAV. Falls alle offenen Leserahmen tatsächlich verwendet werden, wird etwa 80% des Virusgenoms in Protein translatiert. Einige Bereiche sogar doppelt. Es ist stark anzunehmen, daß die 3 offenen Leserahmen von 1 RNA translatiert werden. Der vorausgesagte Start des RNA-Moleküls ist an der Position 354 und die Poly(A)-Addition ist an der Position 2317. Das einzige Poly(A)- Signal ist an der Position 2287 des Plus-Stranges.
[0045] Es ist unwahrscheinlich, daß die offenen Leserahmen in dem anderen DNA-Strang verwendet werden, da in diesem Strang einige wesentliche Regulationssequenzen fehlen. Die Fig. 2B und 2C zeigen die offenen Leserahmen, welche CTG bzw. GTG als ein Start- Codon verwenden. Es wird jedoch nur von wenigen Proteinen beschrieben, daß diese Start- Codons tatsächlich verwendet werden (Hann et al., 1988).
[0046] Computerstudien von Ähnlichkeiten zwischen den separaten Proteinen von CAV und bereits bekannten Proteinen ergaben nur begrenzte Homologien an Sequenzen, welche in den verfügbaren Programmen vorhanden waren. Entsprechend ist es schwierig vorauszusagen, was für einem Typ von Protein die CAV-Proteine ähneln. Ein relativ hoher Trefferbetrag wurde durch virales Kapsid, DNA-Binde- und Blutkoaggulierungs-Proteine erzielt. Die Ergebnisse sind hierin nicht gezeigt.
[0047] Die Expression von Proteinen wird durch Promotor/Enhancer-Elemente reguliert (Jones 1990). Ein eukaryontischer Promoter ist meistens direkt vor dem Start des Transkriptes positioniert. Die CAV-Sequenz enthält stromaufwärts von der Cap-Stelle die allgemeinen Elemente TATA-Box, SP1-Box und CAAT-Box. Die Sequenz und die Position dieser Boxen entspricht in einer ausgezeichneten Weise denjenigen, welche in den meisten eukaryontischen Promotoren beschrieben wird (Tabelle 1). Um die Position 285 können Bindestellen für vier verschiedene Transkriptionsfaktoren sein: CREB, MLTF, GT und PEA-I.
[0048] Ein eukaryontisches Gen enthält ebenfalls Enhancer-Elemente, welche die Stärke des eukaryontischen Promotors bestimmen. Die Enhancer-Elemente sind die fünf direkten Wiederholungen, welche alle eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, und die zwischen den Positionen 144 und 260 lokalisiert sind. Alle Wiederholungen haben 19 identische Nukleotide. Nur die letzten zwei Nukleotide sind verschieden. Die Wiederholung 1 ist identisch mit 2, und 3 ist gleich 5. Die Wiederholungen 1, 2 und 3 sind bei einander lokalisiert, so wie 4 und 5. Zwischen den Wiederholungen 3 und 4 ist ein "Bruch (break)" von 12 Nukleotiden lokalisiert. Eine Computerstudie zeigt, daß kein beschriebener (eukaryontischer) Enhancer alle Sequenzen enthält, welche für die wahrscheinlichen CAV-Enhancer- Elemente gefunden wurden. Alle direkten Wiederholungen enthalten ein ATF-Element, welches an der Steigerung der Transkription von CAV-RNAs beteiligt sein kann. Die direkten Wiederholungen enthalten zweimal die Sequenz CATCC und zweimal die Sequenz CAGCC. Die letzte Sequenz überlappt mit der CAAT-Box. Diese vier Sequenzen haben nur 1 Fehlpaarung mit der CACCC-Box, welche ihr β-Globin beschrieben wurde (Tabelle 1).
[0049] Die Fig. 3 zeigt, daß etwa zwischen den Positionen 55 und 135 und zwischen den Positionen 2180 und 2270 des Plus-DNA-Stranges sehr große Haarnadelstrukturen in der (einzelsträngigen) DNA-Form von CAV vorhanden sind. Haarnadelstrukturen in der DNA können an der Replikation der CAV-DNA beteiligt sein. Die Haarnadeln zwischen 2180 und 2270 können nicht nur in CAV-DNA sondern ebenso in CAV-RNA vorhanden sein und es ist wahrscheinlich, daß sie eine Rolle bei der Stabilität der CAV-RNA spielen.

Die verschiedenen DNA-Formen von CAV in infizierten Zellen

[0050] Vier verschiedene CAV-DNA-Moleküle sind in einem Northern-Blot einer DNA- Präparation von CAV-infizierten Zellen sichtbar. Die DNA wurde mit radioaktiv markierter DNA des Klons pIC-20H/CAV-EcoRI hybridisiert. Die CAV-DNA-Moleküle sind angesichts ihrer gemessenen Längen und Formen in einem nicht denaturierenden Agarosegel und ihrer Empfänglichkeit gegenüber S1-Nuklease doppelsträngige offene Ringe (3 kbp), überhelikale doppelsträngige DNA (2 kbp), zirkuläre einzelsträngige DNA (0,8 kbp) bzw. einzelsträngige lineare DNA (1,5 kbp). Manchmal ist die lineare doppelsträngige DNA-Form von CAV ebenfalls sichtbar (2,3 kbp). Todd et al. (1990) haben eine Länge von 0,8 kbp für die zirkuläre einzelsträngige DNA aus isoliertem CAV auf der Grundlage der elektrophoretischen Mobilität in einem nicht denaturierenden Agarosegel gemessen.

Nachweis von CAV-DNA in Viruspräparationen

[0051] Gesamt-DNA wurde aus CAV isoliert und gereinigt nach dem Verfahren, welches von Von Blow (1989) beschrieben wurde. Die DNA-Präparation wurde in einem Southern-Assay mit einer markierten CAV-DNA-Sonde, welche die gesamte klonierte CAV-Sequenz enthielt, analysiert. Von gereinigtem CAV isolierte DNA enthält ein DNA-Molekül mit einer Länge von 0,8 kbp, gemessen in einem nicht denaturierenden Agarosegel. In einer Southern-Analyse von aus gereinigtem CAV isolierter DNA mit Oligonukleotiden als Sonden, welche von der klonierten CAV-DNA-Sequenz stammten, wurde gezeigt, daß der Minus-DNA-Strang in dem Virus eingeschlossen ist. Daher kann geschlossen werden, daß die einzelsträngige DNA von CAV in dem Kapsid der Minus-Strang ist.

Southern-Analyse von DNA aus CAV-Feldisolaten

[0052] DNA-Präparationen wurden aus CAV-Isolaten hergestellt, welche aus Hühnern aus Scharen, in welchen die Mareksche Erkrankung in einem erhöhten Ausmaß auftrat, erhalten wurden. Die DNA-Präparationen von CAV-Isolaten, welche in 12 Unternehmen in den Niederlanden erhalten wurden, wurden nichtselektiv aus einer Sammlung von 60 Proben gesammelt. Nur in einem Unternahmen wurde eine höhere Sterblichkeit aufgrund von Marekscher Erkrankung berichtet. Darüber hinaus stammte ein CAV-Isolat von einem Perlhuhn. Die von uns untersuchten CAV-Isolate wurden hauptsächlich erhalten, nachdem eine Atrophie des Thymus nach einer Untersuchung durch das Tier-Gesundheitsamt (Animal Health Services) festgestellt worden war.
[0053] Um das Ausmaß an Ähnlichkeit zwischen der klonierten CAV-DNA (pIC-20H/CAV- EcoRI) und der DNA der verschiedenen CAV-Feldisolate zu studieren, wurden MDCC- MSB1-Zellen mit den isolierten CAV-Stämmen infiziert. Eine Southern-Analyse wurde durchgeführt. Alle DNA-Präparationen enthielten DNA-Moleküle, welche in einer spezifischen Weise mit ³²P-markierter, klonierter CAV-DNA hybridisierten. Die DNA- Moleküle der verschiedenen CAV-Feldisolate haben Längen, welche derjenigen des klonierten CAV entsprechen, und sind doppelsträngig oder einzelsträngig. Man fand bei Southern-Blot-Analysen, welche direkt an Gewebeproben der CAV-infizierten Hühner aus dem Feld durchgeführt wurden, daß sie DNA-Moleküle enthielten, welche mit markiertem pIC-20H/CAV-EcoRI hybridisierten.

Restriktionsenzymanalyse von DNA von CAV-Feldisolaten

[0054] Die Ähnlichkeit der DNA von den verschiedenen CAV-Feldisolaten mit dem klonierten CAV-Genom wurde des weiteren mittels Restriktionsenzymanalyse untersucht. Die DNA-Präparationen der CAV-Isolate und von kloniertem CAV wurden separat mit sieben Restriktionsenzymen geschnitten. Es erwies sich, daß die Enzyme BamHI, BgII und XbaI alle DNAs in einer identischen Weise schnitten. Die DNA der meisten von den Feldisolaten enthielt zwei AccI-Schnittstellen und/oder zwei HindIII-Schnittstellen, während die DNA von nur einigen wenigen Isolaten die EcoRI-Schnittstelle enthielt. Die Fig. 5 faßt die Restriktionsenzymkarten des klonierten CAV und der verschiedenen Feldisolate zusammen. Pro Restriktionsenzymschnittstelle ist die Anzahl der Feldisolate, welche die relevante Schnittstelle enthalten, in Klammern angegeben.

Polymerasekettenreaktion (PCR) von DNA von CAV-Feldisolaten

[0055] Die Oligonukleotide CAV-1 und CAV-2 (Fig. 4), welche von der klonierten CAV- DNA-Sequenz abgeleitet sind, wurden synthetisiert. Eine PCR, welche diese synthetischen Oligonukleotide verwendete, wurde durchgeführt, um auf spezifische Weise DNA von CAV im Feld nachzuweisen. DNA, welche aus MDCC-MSB1-Zellen isoliert wurde, die mit den verschiedenen CAV-Isolaten infiziert worden waren, und aus nicht infizierten Zellen isolierte DNA wurden amplifiziert. Nach der DNA-Amplifikation wurde die DNA elektrophoretisch der Länge nach auf einem Agarose/Ethidiumbromid-Gel getrennt. Eine amplifizierte Bande von 186 bp (d. h., der theoretisch erwartete Wert) war in allen DNA-Proben von Zellen sichtbar, welche mit den verschiedenen CAV-Isolaten infiziert worden waren. Diese spezifische Bande war nicht nach einer Amplifikation von DNA sichtbar, welche aus nicht infizierten Zellen isoliert worden war. Amplifizierte DNA-Banden aller Feldisolate zeigen eine identische Migrationsrate in dem Agarosegel. Dieses Resultat impliziert, daß keine großen Deletionen oder Insertionen in diesem Teil des Genoms der verschiedenen CAV- Feldisolate auftreten. Eine Southern-Analyse mit dem ³²P-markierten Oligonukleotid CAV-3 (Fig. 4) zeigte, daß die amplifizierte DNA von 186 bp CAV spezifisch ist, und daß keine andere DNA-Bande mit der CAV-3-Sonde hybridisierte.
[0056] Die Empfindlichkeit des Nachweises der CAV-PCR wurde untersucht. DNA wurde aus CAV-infizierten Zellen isoliert, schrittweise verdünnt, amplifiziert und auf einem Agarose/Ethidiumbromid-Gel analysiert. Nach einer Amplifikation von Proben, welche eine Menge von DNA enthielten, die der Menge von DNA in etwa 100 CAV-infizierten Zellen entsprach, wurde ein CAV-spezifisches DNA-Fragment von 186 bp nachgewiesen. Falls jedoch die amplifizierte DNA einer Southern-Analyse mit ³²P-markierter CAV-3-DNA unterzogen wurde, wurde bereits eine Menge von DNA, welche der Menge in einer Zelle entsprach, gefunden, die zu einer klar sichtbaren, für CAV spezifischen DNA-Bande führte. Die CAV-PCR ist ein sehr sensitives Nachweisverfahren, welches für die bisher untersuchten Isolate von CAV spezifisch ist.

Dot-Blot-Analyse von DNA aus CAV-Feldisolaten mit Digoxigenin-markierten CAV- DNA-Sonden

[0057] Zusätzlich zu der PCR wurde ein Assay für den Nachweis von DNA aus CAV- Feldisolaten entwickelt. Dieser Test macht keine Verwendung von radioaktiven Sonden. Die CAV-DNA-Insertion von Klon pIC-20H/CAV-EcoRI wurde mit 11-dUTP-Digoxigenin markiert. DNA-Präparationen aus MDCC-MSB1-Zellen, welche mit den verschiedenen CAV-Isolaten separat isoliert worden waren, wurden auf einen Filter geblottet und hinsichtlich ihrer Fähigkeit, mit der Digoxigenin-markierten DNA-Sonde zu hybridisieren, analysiert. DNA-Präparationen aus MDCC-MSB1-Zellen, welche mit den verschiedenen CAV-Isolaten infiziert waren, hybridisierten mit der Digoxigenin-markierten DNA-Sonde, während die DNA aus nicht infizierten Zellkulturen nicht hybridisierte. Dieser, eine nicht radioaktiv markierte CAV-DNA-Sonde verwendende Test ist daher für den Nachweis von DNA aus CAV-Feldisolaten geeignet.

Anwendungen

DNA

[0058] CAV-Sequenzen von z. B. dem pIC-20H/CAV-EcoRI-DNA-Plasmid oder Teile davon können verwendet werden, um CAV-DNA und/oder -RNA in zu untersuchenden Präparationen für Forschungs- und diagnostische Zwecke nachzuweisen. Die DNA kann radioaktiv oder in einer anderen Weise markiert sein, z. B. mit Biotin/Digoxigenin. Mittels DNA/RNA-Slot-Blots, Southern/Northern-Analysen und In-Vitro-Hybridisierungen kann das Vorhandensein von CAV-Nukleinsäuren bewiesen werden. Teile der CAV-Sequenzen, wie hierin verwendet, sind auch DNA-Oligomere.
[0059] Von den CAV-Sequenzen des Klons pIC-20H/CAV-EcoRI abgeleitete Oligomere können in einer "Polymerasekettenreaktion" verwendet werden, um sehr niedrige Konzentrationen von CAV-DNA/RNA aufzuspüren. Die PCR ist ein sehr sensitives Verfahren, welches häufig für den Nachweis von Viren verwendet wird.
[0060] Diagnostische Kits, welche auf den vorausstehenden Anwendungen basieren, sind in der Praxis möglich.
[0061] Für Forschungszwecke sind Verfahren, wie S1-Kartierung und Primerverlängerung mit den CAV-DNA-Fragmenten wichtig. Durch diese zwei Verfahren kann CAV-RNA quantifiziert und weiter charakterisiert werden.
[0062] Oligomere in einer Antisense-Konfiguration können verwendet werden, um Genfunktionen zu studieren. Diese können ebenfalls als ein Modell zur Untersuchung neuer Verfahren für die Hemmung der Virusreplikation dienen.
[0063] CAV-DNA kann in der Transfektion als ein Träger von kleinen Genfragmenten verwendet werden, insbesondere falls die pathogenen Eigenschaften durch Deletion in dem CAV-Genom entfernt worden sind.
[0064] CAV-Oligomere in einer Antisense-Konfiguration können in Virusvektoren exprimiert werden, was ein Studium der CAV-Replikation oder anderer Genfunktionen im lebenden Tier oder in vitro ermöglicht.

RNA

[0065] CAV-DNA-Fragmente, welche in Sp6/T7-Vektoren kloniert wurden, führen zu CAV- RNA-Produkten. CAV-RNAs, welche durch In-Vitro-Transkription erhalten werden, können für die In-Vitro/In-Vivo-Synthese von CAV-Proteinen verwendet werden. Daher können RNA-Moleküle, z. B. in einem Weizenkeim-Extrakt, in Proteine translatiert werden (In-Vitro- Translation). Die durch In-Vitro-Translation erhaltenen CAV-Proteine können dann verwendet werden, um z. B. Antikörper, welche gegen CAV gerichtet sind, in Sera von Hühnern (siehe nachstehend) aufzuspüren. CAV-RNA-Moleküle können ebenfalls in Zellen durch Mikroinjektion gedrängt werden, so daß sie darin in Proteine translatiert werden. Daher können die Wirkungen von CAV-Proteinen auf einem zellulären Niveau studiert werden. Protein/Protein und/oder Protein/DNA-Wechselwirkungen können ebenfalls analysiert werden.
[0066] CAV-RNAs können ebenfalls als Sonden für das Aufspüren von CAV-Nukleinsäuren in Präparationen verwendet werden. Die Analysen können mittels Slot-Blot, Southern-, Northern- und In-Situ-Hybridisierungsanalysen durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um diagnostische Tests für CAV zu entwickeln.

Proteine

[0067] Alle CAV-Proteine können in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen exprimiert werden. Dies erfordert, daß die offenen Leserahmen von CAV, welche gefunden wurden, in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert werden. Für das bakterielle System gibt es einen Expressionsvektor, welcher auf dem T7-Promotor basiert, der für die Expression von offenen Leserahmen von CAV geeignet ist. Das Baculovirussystem, Hefe und das CHO- dhfr-Sytem sind mögliche eukaryontische Expressionssysteme. Virale Vektoren wie retrovirale Vektoren sind ebenfalls dafür wählbar.
[0068] Die CAV-Proteine oder die Epitope, welche darauf liegen, können verwendet werden, um Antikörper, welche gegen CAV gerichtet sind, aufzuspüren. Daher können CAV-infizierte Hühner aufgespürt werden. Die CAV-Proteine oder die Epitope, welche darauf liegen, können in Immunoassays, wie Immunperoxidasefärbungen, ELISAs und Immunfluoreszenzassays verwendet werden.
[0069] Die CAV-Proteine oder Epitope, welche darauf liegen, können verwendet werden, um für eine humorale und/oder zellgebundene Immunität gegen CAV zu sorgen. Die CAV- Proteine, welche durch die Expression in eukaryontischen und prokaryontischen Vektor/ Wirtssystemen erhalten wurden, können für eine Verwendung in Untereinheiten-Impfstoffen verwendet werden.
[0070] Mittels der CAV-Proteine oder von Epitopen, welche darauf liegen, können CAV- spezifische Antikörper erhalten werden, welche es ermöglichen, daß CAV-Proteine in Präparationen von CAV-infizierten Hühnern aufgespürt werden (siehe nachstehend).

Antikörper

[0071] In einer Anzahl von Infektionstests in jungen Küken konnte bestätigt werden, daß maternale Antikörper einen wirksamen passiven Schutz gegen eine CAV-Infektion bieten. Die maternalen Antikörper wurden auf die jungen Küken über den natürlichen Weg übertragen sowie durch eine Injektion von neugeborenen Küken mit Antikörper gegen CAV enthaltenden Eiweißextrakten. Ein passiver Schutz gegen eine CAV-Infektion wurde ebenfalls mittels einer Injektion von Eiweißextrakten aus Eiern von Legehennen geboten, welche mit CAV direkt vor der Legeperiode infiziert worden waren.
[0072] Die Impfung von Legehennen mit CAV-Proteinen, welche in einem der vorausstehend genannten Expressionssysteme exprimiert wurden, wird zur Bildung maternaler Antikörper führen. Junge Küken dieser Legehennen werden gegen eine CAV-Infektion geschützt sein.
[0073] Diagnostische Tests können auf der Basis von Antikörpern gegen CAV entwickelt werden. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper können dafür verwendet werden. Durch CAV-spezifische Antikörper können Präparationen auf die Anwesenheit von CAV-Proteinen untersucht werden.
[0074] Die vorausstehenden Anwendungen von CAV-Antikörpern sind in derselben Weise möglich für Antikörper gemäß der Erfindung, welche durch darin beschriebene Verfahren erhalten wurden, wie für natürliche CAV-Antikörper.

Lebend-Virus-Impfstoffe

[0075] Das Bereitstellen von viralen Proteinen für das Immunsystem durch einen Lebend- Virus-Vektor führt wahrscheinlich zu einer besseren Immunantwort als ein Untereinheiten- Impfstoff. Einer oder mehrere offene Leserahmen von CAV (im Ganzen oder als Teil) könnten in Lebend-Virus-Vektoren kloniert werden. In Geflügel können nur Lebend-Virus- Vektoren verwendet werden, welche selbst eine gute Replikation im Vogel-System zeigen. Als Vektoren für eine Anwendung in Hühnern wählbar sind z. B. das Geflügelpocken-Virus, retrovirale Vektoren, Herpesvirus-Vektoren (Serotypen 1, 2 und 3 des Vogelherpesvirus) und infektiöses Laryngotracheitis-Virus und möglicherweise ebenfalls Adenoviren wie CELO. Eine Immunisierung mit den vorausstehenden Lebend-Virus-Vektoren schützt gegen CAV und das Trägervirus.
[0076] Durch die Anwendung von einer oder mehrerer Deletionen in dem CAV-Genom, können Impfstoffe entwickelt werden, welche gegen eine CAV-Infektion in jungen Küken schützen. Bei der Anwendung der Deletionen muß der pathogene Charakter einer CAV- Infektion eliminiert werden, aber die replikativen und daher immunisierenden Eigenschaften müssen beibehalten werden.
[0077] Das CAV-Genom kann also selbst als ein Lebend-Virus-Vektor für die Expression von Antigenen von anderen Viren geeignet gemacht werden. Dies erfordert, daß das CAV-Genom so verändert wird, daß zusätzlich zu oder anstelle von CAV-Proteinen "fremde" Virusproteine exprimiert werden. CAV-Vektoren können daher so konstruiert werden, daß ein Schutz gegen "fremde" Viren alleine oder ebenfalls gegen CAV auftritt, abhängig von der Expression der viralen Proteine durch den rekombinanten Vektor in dem geimpften Tier.
[0078] CAV-Impfstoffe, welche als ein Untereinheiten-Impfstoff produziert werden, ein Deletions-Impfstoff oder ein Genfragment in einem anderen Virus-Vektor werden hauptsächlich für die Impfung von Legehennen verwendet werden. Eine Impfung von Küken in einem jüngeren Alter, z. B. in Kombination mit einer Impfung gegen die Mareksche Erkrankung, bleiben jedoch ebenfalls eine mögliche Verwendung der Erfindung.

Enhancer/Promotor-Elemente

[0079] Die CAV-Promotor- und Enhancer-Elemente können in DNA-Vektoren kloniert werden. Unter der Regulation des CAV-Promotors/Enhancers können CAV-Proteine oder "fremde" Proteine sowohl in Hühnerzellen als auch in anderen Zellarten exprimiert werden.
[0080] Es ist begreiflich, daß der CAV-Promotor in (Hühner-) Knochenmarkszellen funktionell ist. Als ein Modellsystem für eine Gentherapie können "fremde" Proteine in vitro in Knochenmarkszellen durch CAV-Promotor/Enhancer-Elemente exprimiert werden, wahlweise in Kombination mit retroviralen Vektoren. Die genetisch modifizierten Knochenmarkszellen können dann in das Knochenmark von, im vorliegenden Fall den Hühnern, transplantiert werden. Für sehr kleine Genfragmente ist das CAV-Genom selbst ebenfalls zur Verwendung als ein Vektor wählbar.
[0081] CAV-Enhancer/Promotor-Elemente könnten ebenfalls in anderen Organismen aktiv sein. Falls dies der Fall sein sollte, können die Elemente ebenfalls in z. B. dem Maus-System als ein Modell für eine Gentherapie verwendet werden.
[0082] Produkte von CAV selbst unter der Regulation unseres eigenen CAV-Promotors oder eines anderen Promotors bieten ebenfalls Möglichkeiten für das Studium und das Entwickeln von Verfahren für die Gentherapie.
[0083] Die Möglichkeit der Verwendung des gesamten oder im wesentlichen des gesamten CAV-Genoms als ein Klonierungsvektor, d. h. als eine Art von eukaryontischem Plasmid für Vogel-Systeme, ist eine Entwicklung, welche angesichts der gefundenen Struktur des CAV- Genoms wirklich erwogen werden muß.

Niederlegung des CAV-Klons pIC-20H/CAV-EcoRI

[0084] Ein Glycerolvorrat von HB101-Zellen, welche mit dem Plasmid pIC-20H/CAV-EcoRl transformiert worden waren, wurde im Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn in den Niederlanden am 7. September 1990 unter der Nummer CBS 361.90 hinterlegt.

Beschreibung der Figuren

[0085] Die Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz der klonierten CAV-DNA. Die Gesamtlänge ist 2 319 Basen, wobei das erste G der EcoRI-Schnittstelle als Nr. 1 genommen wird.
[0086] Die Fig. 2 zeigt die vorausgesagten offenen Leserahmen (ORFs, open reading frames) mit einer Länge von mehr als 300 Basen für beide DNA-Stränge. Die vorausgesagten ORFs für die 3 verschiedenen Start-Codons ATG, CTG und GTG sind jeweils in den 3 Unterfiguren 2A, 2B und 2C gezeigt.
[0087] Die Fig. 3 zeigt einige vorausgesagte Haarnadelstrukturen des aus einzelsträngiger DNA bestehenden CAV-Genoms.
[0088] Die Fig. 4 zeigt die in der PCR verwendeten Oligonukleotide. Die DNA-Sequenz und die Position der Oligonukleotide auf dem CAV-Genom sind gezeigt. Die Position der Nukleotide in dem CAV-Genom entspricht derjenigen, welche in der Fig. 1 gezeigt ist.
[0089] Die Fig. 5 zeigt die Restriktionsenzymkarte der klonierten CAV-DNA. In Klammern angegeben ist die Anzahl von CAV-Isolaten pro Gesamtheit von 21, welche die relevanten Restriktionsenzymschnittstellen in dem Genom besaßen.

Materialien und Methoden

Zellkulturen und Viren

[0090] Die CAV-Isolate wurden in transformierten Lymphobastoid-Zellinien von Tumoren von Hühnern, welche durch das Vogel-Leukosis-Virus der Untergruppe A (1104-X-5) oder durch den Virus der Marekschen Erkrankung (MDCC-MSB1) transformiert worden waren. Die Zellkulturen wurden mit etwa 0,1-1 TCID50 pro Zelle infiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen geerntet. Die Zellen wurden mit den Virusnachkommen von klonierter CAV-DNA oder von Feldisolaten infiziert. CAV-Cux-1, welches ursprünglich in Deutschland aus einer Schar von Hühnern, welche an Marekscher Erkrankung litten, isoliert worden war (Von Blow et al., 1983, 1985), wurde von Dr. M. S. McNulty, Veterinary Research Laboratories, Belfast, Nordirland bereitgestellt. Im Januar 1988 sandte Dr. J. P. Rosenberger, University of Delaware, Newark, USA, uns zwei Blutproben zur Bestimmung der Virulenz der Stämme von Marekscher Erkrankung T-1704 und seines Derivates MDV-Del-S, welches die erste Passage in einem Huhn ist. Wir erhielten die CAV-T-1704 und CAV-Del-S-Isolate von SPF-Hühnern, welche mit dem MDV-Stamm T-1704 und seinem Derivat MDV-Del-S infiziert waren. Die holländischen CAV-Isolate wurden nichtselektiv aus einer Reihe von sechzig ausgewählt, welche alle in MDCC-MSB1-Zellkulturen kultiviert wurden. Das Feldmaterial wurde von J. C. von den Wijngaard, Gezondheitsdienst Brabant in Boxtel und von J. Naber, Gezondheitsdienst voor Pluimvee in Dorn bereitgestellt, hauptsächlich weil während einer Autopsie eine Atrophie des Thymus festgestellt worden war. Die aus unseren eigenen SPF- Scharen erhaltenen CAV-Isolate wurden zu den Serien hinzugefügt.

Isolation von Gesamt-DNA

[0091] Virus- und Leber-Präparationen wurden in 20 mM Tris-HClpH 7,5, 2 mM EDTA, 0,2% SDS, 0,6 mg/ml Proteinase K resuspendiert und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Präparationen wurden mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) extrahiert, und die DNA wurde durch Ethanol präzipitiert. Die DNA-Pellets wurden in 100 ul 10 mM Tris-HClpH 7,5, 1 mM EDTA resuspendiert.

Extraktion und Analyse niedermolekularer DNA

[0092] Niedermolekulare DNA wurde aus CAV-infizierten 1104-X5- und MDCC-MSB1- Zellen und aus nicht infizierten 1104-X5-Zellen gemäß dem von Hirt (1967) beschriebenen Verfahren isoliert. Die DNA wurde auf Agarosegelen separiert und nach einer Färbung mit Ethidiumbromid direkt durch UV-Licht analysiert oder auf einen Biotrace-Filter, gemäß dem von Southern (1982) beschriebenen Verfahren geblottet. Die Blots wurden mit zufallsgeprimten ³²P-markierter DNA hybridisiert, welche aus niedermolekularer DNA mit einer Länge von 2,7 bis 3,5 kb aus CAV-infizierten 1104-X5-Zellen isoliert worden war.

Klonierung von CAV-DNA

[0093] Das gesamte CAV-DNA-Genom wurde in den bakteriellen Vektor pIC-20H kloniert. Teile des CAV-DNA-Genoms wurden in den Vektor pIC-19R kloniert. Alle Plasmid-DNA- Klonierungsschritte wurden im Prinzip in Übereinstimmung mit den Verfahren, welche von Maniatis et al. (1982) beschrieben wurden, durchgeführt.

Sequenzanalyse von CAV-DNA

[0094] CAV-DNA-Plasmide wurden mittels eines CsCl-Gradienten und Sephacryl-S500- (Pharmacia) Chromatographie gereinigt. Die doppelsträngige DNA wurde mit T&sub7;-DNA- Polymerase (Pharmacia) sequenziert oder mit Taq-DNA-Polymerase (Promega). Beide Verfahren wurden gemäß den Anweisungen, welche von Pharmacia oder Promega gegeben wurden, durchgeführt. Die Oligonukleotide wurden mit T4-Nukleotidkinase phosphoryliert (kinated). "Starke Stops" wurden gemäß dem Verfahren, welches von Maxam und Gilbert beschrieben wurde (1977), sequenziert.

Zirkularisierung des klonierten CAV-DNA-Genoms

[0095] 10 ug Plasmid-DNA von Klonen, welche das gesamte CAV-DNA-Genom enthielten, wurden mit Restriktionsenzym verdaut, so daß die gesamte CAV-DNA-Insertion von der Vektor-DNA getrennt wurde. Eine T&sub4;-DNA-Ligase-Behandlung der 2,3 Kilobasenpaare des linearen CAV-DNA-Moleküls, führte zu einer zirkulären, doppelsträngigen CAV-DNA. Die Ligationsprodukte wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel analysiert.

DEAE-Dextran-Transfektion

Für die Transfektion von 1104-X5 und MDCC-MSB1-Zellen wurden 2 ug wiederligierte CAV-DNA zweimal in 25 ul Milli-Q-Wasser suspendiert und mit 260 ul TBS-Puffer gemischt. 15 ul von 10 mg/ml DEAE-Dextran wurden zu der DNA-Mischung hinzugegeben, und die Mischung wurde 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert.
[0097] 1104-X5-Zellen. Eine 50-mm-Gewebekulturplatte mit 1-2 · 10&sup6; 1104-X5-Zellen/Platte wurde zweimal mit TBS-Puffer gewaschen. Der TBS-Puffer wurde vollständig von der einlagigen Schicht der Zellen entfernt und 300 ul DEAE-Dextran/DNA-Verdünnung wurden zugegeben. Die Zellen wurden 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die DEAE- Dextran/DNA-Mischung wurde durch 2 ml 25% DMSO/TBS ersetzt und die einlagige Schicht der Zellen wurde 2 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit TBS-Puffer gewaschen, und dann wurde Gewebekulturmedium (RPMI 1640 oder E-MEM) zugegeben. Die Zellen wurden bei 37ºC-5% CO&sub2; inkubiert.
[0098] MDCC-MSB1-Zellen. Etwa 2 · 10&sup6; MDCC-MSB1-Zellen wurden bei 1500 U/min in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Das Medium wurde durch 5 ml TBS-Puffer ersetzt und die Zellen wurden sorgfältig resuspendiert. Der Waschschritt wurde wiederholt. Aller TBS-Puffer wurde entfernt. Das Zellpellet wurde sorgfältig in 300 ul DEAE-Dextran-DNA-Mischung resuspendiert und bei Raumtemperatur 30 min lang inkubiert. 0,5 ml 25% DMSO/TBS wurden zugegeben und die Suspension wurde 3 min bei Raumtemperatur inkubiert. 5 ml TBS wurden hinzugegeben und die Zellen wurden bei 1500 U/min in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und 50 ml Gewebekulturmedium wurden hinzugefügt. Die Zellen wurden resuspendiert und abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 5 ml Gewebekulturmedium aufgenommen und bei 37ºC - 5% CO&sub2; inkubiert. Als Kontrolle wurden 2 ug des Plasmids pIC-20H für die Transfektion verwendet.

In-Vitro-Neutralisierungstest

[0099] MDCC-MSB1-Zellen wurden mit dem Überstand von MDCC-MSB1 infiziert und 1104-X5-Zellen wurden mit klonierter "CAV-DNA" transfiziert. Etwa 2 · 10&sup4; Zellen wurden infiziert. Der Virusgehalt dieses Inokulums war nicht genau bekannt. Bei der Hälfte der infizierten Zellkulkturen wurde polyklonales Serum mit einer neutralisierenden gegen CAV gerichteten Aktivität, 1 : 100 verdünnt, zu dem Medium hinzugegeben. Als Kontrolle wurde eine Reihe von "Vertiefungen" mit CAV-infizierten MSB1-Zellen mitgenommen, wobei kein gegen CAV gerichtetes Antiserum zu dem Medium zugefügt wurde.

CAV-Infektion von Tage alten Küken

[0100] Überstände von mit CAV-DNA und Kontroll-DNA transfizierten MDCC-MSB1- und 1104-X5-Zellen wurden intramuskulär in Tage alte Küken injiziert. Sechs Tage nach der Infektion wurde eine Autopsie bei 5 Küken pro Gruppe durchgeführt, nachdem der Hämatokritwert und das Gesamtkörpergewicht zuerst bestimmt worden waren. Zur Isolation des Virus und zur Immunhistochemie wurden Heparinblut, Thymus und Knochenmark gesammelt. Die immunhistochemische Untersuchung trat mittels einer Peroxidasefärbung von Thymusschnitten (coupes) unter anderem mit dem CAV spezifischen monoklonalen CV1- 85.1 auf. Vierzehn und achtundzwanzig Tage nach der Infektion wurde eine Autopsie an 5 weiteren Küken durchgeführt und alle der vorausstehenden Bestimmungen wurden durchgeführt.

Polymerasekettenreaktion (PCR)

[0101] Die Oligonukleotide wurden mit einem Cyclone DNA-Synthesegerät (Biosearch Inc., USA) synthetisiert. Die Sequenz wurde von der in der Fig. 1 gezeigten CAV-DNA-Sequenz abgeleitet. Die PCR wurde aus DNA von CAV-infizierten und nicht infizierten MDCC- MSB1-Zellen isoliert. Die Endkonzentration der Reagenzien war 50 mM KCl, 10 mM Tris- HCl (pH 8,3), 3 mM MgCl&sub2;, 0,01% Kälberserumalbumin, 200 uM von jedem dNTP, 1 uM von jedem Oligonukleotid und 2 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase (Cetus, USA) in insgesamt 100 ul. Die DNA-Proben wurden zyklisch 30 mal bei 93ºC 1 min lang, bei 55ºC 1 min lang und bei 72ºC 3 min Lang in einem Perkin Eimer/Cetus Thermocycler inkubiert. Ein Zehntel der amplifizierten DNA wurde direkt auf einem 2%igen Agarose/Ethidiumbromidgel oder durch Southernblot-Analyse analysiert. Die verwendete DNA-Sonde war das Oligonukleotid, welches mit 32P nach Maniatis et al. (1982) endmarkiert war.

Dot-Blot-Analyse

[0102] Die CAV-DNA-Insertion von pIC-20H/CAV-EcoRI wurde isoliert und mit Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer Mannheim, Deutschland) gemäß dem Protokoll des Händlers markiert. Biotrace-RP-Filter wurden mit 1,5 M NaCl und 0,15 M Na-Citrat gesättigt. Die DNA-Proben wurden in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA resuspendiert, 3 min lang gekocht, auf Eis abgekühlt und auf dem Filter plaziert. Der Filter wurde bei Raumtemperatur getrocknet und 30 min lang bei 65ºC inkubiert. Die Filter wurden mit Digoxigenin-markierter DNA hybridisiert. Die mit Digoxigenin markierte DNA wurde durch eine immunologische Färbung gemäß dem Protokoll des Händlers sichtbar gemacht. Tabelle 1: Bekannte Transkriptionsfaktor-Bindungssequenz-Elemente in der Enhancer/Promotor-Region von CAV
- die CAP-Stelle liegt wahrscheinlich bei etwa 350
+ perfekte Homologie zwischen CAV und Consensus-Sequenz
- in mehreren Viren gefundene Consensus-Sequenz
# DNA-Sequenz eines Elementes

Referenzen

[0102]
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Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Hühner-Anämievirus (chicken anaemia virus, CAV) in doppelsträngiger Form, umfassend die Schritte des Isolierens von DNA mit niedrigem Molekulargewicht aus CAV-infizierten Zellen, des Fraktionierens der DNA mit niedrigem Molekulargewicht auf Agarose/Ethidiumbromid, des Vergleichens des Fraktionierungsmusters mit dem Fraktionierungsmuster der gleichen, aber nicht infizierten Zelle, des Isolierens der nur in der infizierten Zelle vorhandenen DNA und des Überprüfens der Doppelsträngigkeit dieser DNA durch Restriktionsenzymanalyse.

2. Rekombinante Nucleinsäure in Form eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, das eine CAV-spezifische Nucleotidsequenz umfaßt, die der Nucleotidsequenz eines CAV-Genoms oder eines Teils davon entspricht, erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1.

3. Rekombinante Nucleinsäure, die eine CAV-spezifische Nucleotidsequenz umfaßt, die wenigstens einem CAV spezifischen Teil der in Fig. 1 gezeigten Nucleotidsequenz oder einer zu wenigstens 60% dazu homologen Nucleotidsequenz entspricht oder dazu komplementär ist, erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1.

4. Rekombinante Nucleinsäure gemäß Anspruch 2 oder 3, die eine CAV- spezifische Nucleotidsequenz umfaßt, die einer Nucleotidsequenz, die in einem CAV-Genom vorkommt entspricht oder dazu komplementär ist, wobei die Nucleotidsequenz für wenigstens einen Teil eines CAV-Proteins codiert.

5. Rekombinante Nucleinsäure gemäß Ansprüchen 2 bis 4, die weiterhin eine Nucleotidsequenz umfaßt, die von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Vektor abgeleitet ist.

6. Rekombinante Nucleinsäure gemäß Ansprüchen 2 bis 5, die weiterhin eine Nucleotidsequenz, die für ein anderes Protein als ein CAV-Protein codiert, oder eine Nucleotidsequenz, die für einen Teil eines solchen anderen Proteins codiert, umfaßt.

7. Rekombinante Nucleinsäure gemäß Ansprüchen 2 bis 6, die eine Nucleotidsequenz umfaßt, die in dem CAV-Genom nicht vorkommt und eine regulatorische Funktion hat.

8. Rekombinante Nucleinsäure gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 3 bis 7, die mit einem oder mehreren Marken markiert ist, die zum Markieren von Nucleinsäuren geeignet sind, wie Radioisotopen, Enzymmolekülen, Haptenen, fluoreszenten Substanzen, Farbstoffen, Pigmenten und teilchenförmigen Markern.

9. Verwendung einer rekombinanten Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3 als CAV-spezifische Sonde oder CAV-spezifischer Primer bei einem Verfahren zum Nachweis von CAV-DNA oder -RNA.

10. Diagnositscher Kit zum Nachweis von CAV-DNA oder -RNA, der rekombinante Nucleinsäure gemäß Ansprüchen 2 bis 3 als CAV-spezifische Sonde oder CAV spezifischen Primer enthält.

11. Prokaryontische oder eukaryontische Zelle, die eine rekombinante Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9 enthält.