DE69130063T2 - Antivirales arzneimittel enthaltend prostratin - Google Patents

Description

Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine antivirale Zusammensetzung, insbesondere eine Anti-HIV-Zusammensetzung, und auf Verfahren zum Behandeln von Virusinfektionen.
Hintergrundinformation
• Eine Nukleosidklasse antiviraler Agenzien, wovon AZT ein Prototyp ist, wird in der klinischen Behandlung des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS) in weitem Umfang verwendet. AZT wurde ursprünglich für den klinischen Gebrauch auf Basis einer in-vitro-Antivirusuntersuchung ausgewählt.
• Während AZT zur antiviralen Therapie extrem nützlich ist, ist seine Anwendbarkeit durch Toxizität und einen für seine Eignung zur Therapie unzureichenden therapeutischen Index begrenzt. Demgemäß werden neue Klassen von antiviralen Agenzien, die allein oder in Kombination mit AZT und anderen Agenzien einzusetzen sind, für eine selektive antivirale Therapie dringend benötigt. Bei der Suche nach neuen antiviralen Agenzien wurde ein umfassendes Rasterprogramm zur Identifizierung möglicher Anti-AIDS- und -Anti-Krebs-Verbindungen aus natürlichen Quellen eingeleitet (Boyd M. R.: in "AIDS Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention", (DeVita V. T. Jr, Hellman S., Rosenberg S. A; Herausgeber) Philadelphia: Lippincott, 1988, Seiten 305-318). Fortschreitende Naturprodukte-Sammelprojekte konzentrieren sich auf ungewöhnliche oder schwach erforschte Pflanzen-, Meeres- und Mikrobenquellen.
• Als Teil dieser Forschung wurde Homalanthus acuminatus, ein kleiner endemischer Baum aus den Urwäldern von Samoa und eine wichtige Komponente der Volksarzneimittelkunde von Samoa, untersucht. Interviews mit "Taulasen", bzw. samoanischen Heilern, haben ergeben, daß verschiedene Teile der Pflanze zur Behandlung physischer Beschwerden verwendet werden. Beispielsweise werden die Blätter in Wasseraufgüssen zur Behandlung von Rückenschmerzen und Unterleibsschwellungen, die Wurzeln zum Bekämpfen von Durchfall, und das Stammholz zur Behandlung von Gelbfieber benutzt, (Cox P. A. "Samoan Ethnopharmacology", in "Economic and Medicinal Plant Research, Band 4; "Plants and Traditional Medicine", (Wagner H., Farnworth N., Herausgeber) London: Academic Press, im Druck). Des weiteren werden verwandte Arten in Neu-Guinea (H, nervosus) zur Behandlung von Furunkeln und wunden Stellen (Holdsworth D. M.: Int. J. Crude Drug Res. 27, 95-100 (1989)), und in Indonesien (H. nutans) zur Behandlung von Tripper (Perry L. M.: Medicinal Plants of East and Southeast Asia, Cambridge, MIT Press, 1980, Seite 149) verwendet. Weiter sind in Samoa die Blätter von H. nutans zur Behandlung von Beschneidungswunden verwendet wurden (Uhe G.: Econ. Bot. 28, 1-30 (1979)).
Zusammenfassung der Erfindung
• Gemäß der vorliegenden Erfindung findet das 12-Desoxyphorbol ester-Prostratin eine neue Anwendung als antivirales Agens. Insbesondere kann es zur Behandlung einer Virusinfektion eingesetzt werden, die durch ein Retrovirus, beispielsweise ein Human-Immundefekt-Virus verursacht wird. Eine neue Zusammensetzung enthält Prostratin und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger für eine solche Verwendung.
• Prostratin kann ein potentes antivirales Agens mit minimalen ungünstigen toxikologischen Eigenschaften sein. Es kann antivirale Aktivität ohne wesentliche tumorbegünstigende Aktivität entfalten.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
• Fig. 1 zeigt die Struktur des 12-Desoxyphorbolester-Prostratins.
• Die Fig. 2A und 2B zeigen die Anti-HIV-1-Aktivität von Prostratin in CEM-SS-Zellen. Fig. 2A zeigt Meßwerte der optischen Dichte in der XTT-Tetrazoliumuntersuchung von unbehandelten Kontrollzellen ( ), Prostratin-behandelten Kontrollzellen ( ), Prostratin-behandelten Zellen, die mit HIV-1 infiziert waren ( ), und unbehandelten Zellen, die mit HIV-1 infiziert waren ( ). Fig. 2B zeigt die Verminderung von viralem p24-Protein ( ) und Syncytium-bildenden Einheiten ( ) nach Prostratinbehandlung.
• Fig. 3 zeigt die XXT-Formazanproduktion, die nach 1-5 Tagen in nichtinfizierten CEM-SS-Zellen ( ), Prostratin-behandelten (10 ug/ml) CEM-SS-Zellen ( ). Prostratin-behandelten (10 ug/ml) CEM-SS-Zellen, die mit HIV-1 infiziert waren ( ) und unbehandelten CEM-SS-Zellen, die mit HIV-1 infiziert waren ( ).
• Fig. 4 zeigt die Auswirkung von Prostratin auf die Zellenlebensfähigkeit. Der Prozentsatz der Zellenlebensfähigkeit ist durch Trypanblau-Farbstoffausschluß für Kontrollzellen ( ), Prostratin-behandelte Kontrollzellen ( ), Prostratin-behandelte Zellen, die mit HIV-1 infiziert waren ( ) und unbehandelte Zellen, die mit HIV-1 infiziert waren ( ), bestimmt.
• Die Fig. 5A bis 5D zeigen die Auswirkung von Prostratin (10 ug/ml) auf die Morphology einer CEM-SS-Zellenkolonie nach 6 Tagen in Kultur für Kontrollzellen (A), Prostratin-behandelte Kontrollzellen (B), Prostratin-behandelte Zellen, die mit HIV-1 infiziert waren (C), und unbehandelte Zellen, die mit HIV-1 infiziert waren (D).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine antivirale Zusammensetzung. Die Zusammensetzung nach der Erfindung umfaßt als aktiven Bestandteil das 12-Desoxyphorbolester-Derivat, Prostratin, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Das Prostratin der vorliegenden Zusammensetzung kann aus einer natürlichen Quelle in reiner Form gewonnen oder synthetisch hergestellt werden. Geeignete Träger zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, injizierbare oder oral oder rektal verabreichbare Öle, Lipidemulsionen oder wässrige Suspensionen, oder im Falle von oral oder rektal verabreichbaren Tabletten oder Kapseln einen pharmakologisch inerten Arzneistoffträger.
• Unter Anwendung einer in-vitro-Antivirusuntersuchung, von der bekannt ist, daß sie antivirale Aktivität in Menschen genau vorhersagt, wurde gezeigt, daß Prostratin antivirale Aktivität besitzt. Zusätzlich zu dieser antiviralen Aktivität fehlt, anders als bei den meisten anderen Phorbolestern, im wesentlichen eine tumorbegünstigende Aktivität. Dieses Fehlen einer tumorbegünstigenden Aktivität macht Prostratin zur Verwendung als antivirales Agens extrem geeignet und wünschenswerter als andere Agenzien mit Anti-HIV-Aktivität, die auch eine tumorbegünstigende Aktivität haben.
• Die Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung hemmen das HIV-Retrovirus. Wie der Fachmann erkennen wird, hemmen Prostratin und Zusammensetzungen hiervon wahrscheinlich auch andere Retroviren und können auch Nicht-Retrovirus-Viren hemmen.
• Virusinfektionen können durch Verabreichung einer "wirksamen Menge" der Zusammensetzung nach der Erfindung an einem Patienten behandelt werden. Die "wirksame Menge" ist als diejenige Menge definiert, die einem einzelnen Patienten verabreicht werden muß, um einen "wirksamen Prostratinspiegel" im Blut von größer oder gleich 3 u-molar zu erreichen (z. B. der geeignete minimale, der für eine maximale Antivirusaktivität erforderlich ist - siehe Fig. 2). Da der feststehende "effektive Blutspiegel" als bevorzugter Endpunkt für die Dosierung verwendet wird, können die aktuelle Dosis und der Plan für die Arzneistoffverabreichung für jeden Patienten variieren, je nach den individuellen Unterschieden in der Pharmakokinetik, Arzneimitteldisposition und Stoffwechsel. Die Zusammen setzung kann beispielsweise oral, rektal, subkutan oder intravenös verabreicht werden. Der Fachmann kann die geeignete Verabreichungsmethode für die exakte Formulierung der verwendeten Zusammensetzung leicht bestimmen. Die Zusammensetzung kann in oder als sterile Lösung vorliegen, die beispielsweise für eine intravenöse Verabreichung geeignet ist. Die Zusammensetzung kann auch in Doseneinheitsform vorliegen, beispielsweise als Tablette oder Kapsel.
Beispiele
• Die folgenden Beispiele dienen zur Unterstützung des Verständnisses der Erfindung.
Ethnobotanische Techniken
• Befragungen betreffend die Verwendung von Homalanthus acuminatus (Muell.-Arg.) Pax wurden in der samoanischen Sprache mit Heilern in den Dörfern Falealupo und Pesega in West Samoa durchgeführt. Es wurden Massenproben von Stammholz und anderen Teilen von H. acuminatus gesammelt und sofort zum NCI Natural Products Repository in Frederick, Maryland, USA, versandt. Gleichzeitig wurden von Heilern verifizierte Belegproben gesammelt und danach in den Herbarien der Brigham Young University (BRG) und der Harvard University (GH) deponiert.
Isolation und Strukturbestimmung
• Großmaßstäbliche Separationen wurden unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) anfänglich mit einer Waters C-18 Prepak-500-Kasette durchgeführt und die abschließende Reinigung wurde auf einer Rainin-Dynamax C-18- Säule (1 · 25 cm) bewirkt. ¹H-NMR-Spektren wurden auf einem Varian-VXR-500-Spektrometer aufgezeichnet, und ¹³C-NMR-Spektren wurden auf einem Varian-XL-200-Spektrometer aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm mit Bezug auf einen internen Standard von Tetramethylsilan (TMS, δ = 0) angegeben. Infrarotspektren wurden auf einem Perkin-Elmer- 277-Spektrometer gemessen, und Ultraviolettspektren wurden mit einem Beckman-34-Spektrophotometer erhalten. Optische Drehungen wurden auf einem Perkin-Elmer-241-Polarimeter gemessen. Massenspektren wurden auf einem VG-Micromass-ZAB-2F- Massenspektrometer aufgezeichnet.
• Etwa 1,05 kg frisches Stammholz von Homalanthus acuminatus wurde sequentiell mit Ethanol und 1. 1 Dichlormethan-Methanol extrahiert und ergab 22,8 g Extrakt. Dieser Rohextrakt wurde einem modifizierten Kupchan-Aufteilungsprotokoll (Grode et al.: J. Org. Chem. 48, 5203-5207 (1983)) unterzogen. Die Hexan-löslichen und Kohlenstofftetrachlorid-löslichen Fraktionen erschienen reich an lipophilen Phorbolestern, wie durch TLC und ¹H-NMR-Analyse bestimmt wurde. Das Material, das sich in Chloroform (3,7 g) aufteilte, schien keine langkettigen Methylester von Phorbol nach ¹H-NMR zu enthalten, war aber in dem Anti-HIV-Test aktiv. Die letztere Probe wurde mittel Geldurchdringung durch Sephadex LH-20 (4 · 140 cm) mit Methanol/Dichlormethan (1 : 1) in sieben Fraktionen weiter aufgetrennt. Die Fraktionen zwei und drei wurden kombiniert (2,3 g) und einer präparativen HPLC unter Verwendung einer Wasser/Methanol-Stufengradientenelution auf C-18 Umkehrphasen-Sorptionsmittel unterzogen. Die Fraktion, die mit 70 : 30 Methanol-Wasser eluierte (95 mg), wurde durch C-18-HPLC (70 : 30 Methanol-Wasser) weiter gereinigt und ergab 18 mg einer reinen Verbindung, die in dem Anti-HIV-Raster beeindruckende Aktivität zeigte. Während des gesamten Isolationsverfahrens wurden alle Fraktionen auf Anti-HIV-Aktivität getestet, wie nachstehend beschrieben wird.
• Die reine aktive Verbindung war ein optisch aktiver, weißer kristalliner Feststoff, Schmelzpunkt 215º bis 2600, (α)D + 62,6º (c 0,9, MeOH). Die molekulare Formel von C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub0;O&sub6; wurde durch hochauflösende Massenspektrometrie mit Bombardierung durch schnelle Atome (FAB) festgestellt (beobachtet m/z 391,2088 für (MH&spplus;), berechnet m/z 391,2119 für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub0;O&sub6;). Diese Daten und vorhergehende Erkenntnisse, daß viele Spezien der Familie Euphorbiaceae Phorbol-Diterpene produzieren, legten nahe, daß diese Verbindung ein monoacetyliertes Phorbol- Diterpen-Derivat war. Charakteristische dekadische ultraviolette Estinktionen (EtOH) bei 210 nm (ε = 8900) und 236 nm (ε = 5900) und Infrarotbänder (CHCl&sub3;) bei 3300, 1725 und 1705 cm&supmin;¹ stützten diese Schlußfolgerung. Homonuklearmolekülaufspaltungs- und COSY-Analysen (Korrelationsspektroskopie) (Bax et al.: J. Magn. Reson. 44, 542-561 (1981)) der ¹H-NMR- Spektren (500 MHz, CDCl&sub3;) zeigten einen 12-Desoxyphorbol- Kern. Die ¹H- und ¹³C-NMR-Resonanzen (siehe nachstehende Tafel 1) erwiesen sich als übereinstimmend mit Literaturwerten für eine als Prostratin bekannte Verbindung (Cashmore et al.: Tetrahedron Lett. 20, 1737-1738 (1976), und Evans F. J.: Naturally Occurring Phorbol Esters (Herausgeber Evans F. J.) Boca Raton, FL, CRC-Press, 1986, Seiten 171-215), deren Struktur (Fig. 1) früher durch Röntgenstrahlen-Kristallographie-Analyse festgestellt worden war (McCormick et al.: Tetrahedron Lett. 20, 1735-1736 (1976)). Tafel 1 NMR-Daten für Prostratin
• a Spektrum erhalten bei 50 MHz in CDCl&sub3;. Zuordnungen basieren auf Literaturwerten für 12-Desoxyphorbole (Cashmore et al.: Tetrahedron Lett. 20, 1737-1738 (1976) und Evans F. J.: in Naturally Occurring Phorbol Esters (Evans F. J., Herausgeber), Boca Raton, FL, CRC Press, 1986, Seiten 171-215).
• b Spektrum erhalten bei 500 MHz in C&sub6;D&sub6;. Koppelkonstanten sind in Hertz angegeben. Zuordnungen basieren auf Homonuklearmolekül-Zerfallsanalyse und COSY-Analyse.
• c Zuordnungen können umgekehrt sein.
• d Zuordnungen können umgekehrt sein.
• e Weitreichende Allyl- und Homoallyl-Bindungen.
Rasterung auf Anti-HIV-1-Aktivität
• Der XTT-Tetrazolium-Anti-HIV-Test wurde an Rohextrakten, chromatographischen Fraktionen und reinen Verbindungen durchgeführt, wie früher beschrieben (Weislow et al.: J. Nat. Cancer Inst. 81, 577-586 (1989), und Gustafson et al.: J. Nat. Cancer Inst. 81, 1254-1258 (1989)), aber mit mehreren Modifikationen. Die menschliche T-lymphoblastische Zellinie CEM-SS (Nara et al.: AIDS Res. Hum. Retroviruses 3, 283-302 (1987)) wurde als Target-Zellinie benutzt, und es wurden Virusinfektionen unter Verwendung der RF-Variante von HIV-1 (MOI = 0,05) durchgeführt. Konzentriertes Granulat von CEM- SS-Zellen wurden während einer Stunde bei 37ºC mit dem freien Virus inkubiert. Die Zellen wurden dann verdünnt und in Rundboden-96-Mulden-Mikrotiterplatten (Corning) mit einer Dichte von 5000 Zellen/Mulde inokuliert. Dann wurden Testverbindungen und geeignete Verbindungen und geeignete Kontrollverbindungen in die Mulden zugegeben, und die Platten wurden während sechs Tagen inkubiert. Am Ende der Inkubationsperiode wurden Zellenwachstumsparameter und HIV-1-Aktivitäten bestimmt.
• Die relativen Anzahlen lebensfähiger Zellen in den mit verschiedenen Konzentrationen von Prostratin-inkubierten Kulturen wurden unter Verwendung des XTT-Tetrazolium-Verfahrens geschätzt; überlebende Zellen reduzieren XTT metabolisch zu einem gefärbten Formazan-Produkt, das colometrisch gemessen wird (Boyd M. R.: In AIDS Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention (DeVita V. T. Jr., Hellman S., Rosenberg S. A., Herausgeber; Philadelphia, Lippincott, 1988, Seiten 305-317, Weislow et al.: J. Nat. Cancer Inst. 81, 577-586 (1989), und Gustafson et al.: J. Nat. Cancer Inst. 81, 1254-1258 (1989)).
• Es wurde ein interessantes Ergebnis erhalten (Fig. 2A), das klar die Bedeutung des Einschlusses der nichtinfizierten, chemikalienbehandelten Kontrollen für eine richtige Interpretation der XTT-Testergebnisse zeigte. Bei isolierter Betrachtung hätten die XTT-Testdaten für die virusinfizierten Zellen nur eine mäßige Steigerung der zellulären Produktion von XTT-Formazan-Produkten in Anwesenheit von 1,0 bis 200 ug/ml Prostratin angezeigt. Bei Vergleich der Wirkungen von Prostratin gegenüber dem gleichen Konzentrationsbereich der nichtinfizierten Zellen war es aber auch augenscheinlich, daß das Agens eine ausgeprägte wachstumshemmende bzw. zytostatische Wirkung auf diese Kontrollkonturen hatte. Was anfänglich als nur eine mäßige antivirale Wirkung von Prostratin hätte erscheinen können, war daher tatsächlich ganz ausgeprägt. Bei Vorhandensein eines breiten Bereichs von Prostratinkonzentrationen war die Anzahl der lebensfähigen Zellen, was durch die XTT-Formazan-Produktion angedeutet wird, in den nichtinfizierten Zellkonturen und in den mit HIV-1 infizierten Kulturen im wesentlichen identisch.
• Aliquoten des Flüssigkeitsüberstands aus den Testmulden des Tetrazolium-Tests wurden vor dem Zeitpunkt der XTT-Zugabe entfernt, um den restlichen infektiösen Virus unter Anwendung des Syncytium-Tests quantitativ zu bestimmen, der durch Nara et al. beschrieben ist. (Nara et al.: AIDS Res. Hum. Retroviruses 3, 283-302 (1987)). Die Daten wurden als Syncytiumbildende Einheiten (SFU/40 ul) ausgedrückt. Weitere Aliquoten wurden 1. 100 mit Triton X-100 verdünnt und auf das HIV- Kernprotein, p24, analysiert, wie früher beschrieben (Gustafson et al.: J. Nat. Cancer Inst. 81, 1254-1258, (1989)). Korrelationstests zur Messung der Wirkungen von Prostratin auf die p24-Virusantigen-Produktion und die Syncytium-Bildung als Schätzung infektiöser Virionen zeigen ähnlich beeindruckende Hemmwirkungen von Prostratin bei Konzentrationen von nur 1,0 ug/ml (Fig. 2B).
Trypanblau-Farbstoff-Ausschlußtest
• Der Trypanblau-Farbstoff-Ausschluß wurde zur sekundären Auswertung der Chemikalientoxizität und des antiviralen Schutzes über der Zeit angewendet. Ein 50-ul-Aliquot von Zellen wurde aus jeder Testmulde herausgenommen und mit 100 ul 0,4-%-igem Trypanblau vermischt. Der Prozentsatz lebensfähiger Zellen wurde mikroskopisch durch direkte Hämozytometerzählungen bestimmt. Die Tests zeigten, daß die Zellenlebensfähigkeit größer als 90% sowohl bei infizierten als auch nichtinfizierten Kulturen war, die mit Prostratin behandelt waren (Fig. 4).
• Die Fig. 3 und 4 zeigen Ergebnisse einer Reihe von Experimenten, die jeweils wie oben beschrieben durchgeführt wurden, mit der Ausnahme, daß anstelle der Anwendung einer sechstägigen Inkubation die Zellenlebensfähigkeitstests nach 0, 1, 2, 3, 4 und 5 Inkubationstagen durchgeführt wurden. Die in Fig. 3 gezeigten Daten wurden unter Anwendung des XTT-Tetrazolium- Tests erhalten, während die Daten in Fig. 4 aus einem Trypanblau-Farbstoff-Ausschlußtest erhalten wurden. In beiden Fällen stimmen die Ergebnisse vollständig mit den Daten und Interpretationen aus Fig. 2 überein, was die zytostatische Wirkung von Prostratin auf die CEM-SS-Targetzellen weiter bestätigt, und die schlagende Bedeutung dieser Wirkung auf die Beurteilung der Anti-HIV-Aktivität von Prostratin illustriert. Bei jedem der beiden Zellenlebensfähigkeits-Endpunkt-Tests tritt die Anti-HIV-Aktivität von Prostratin nach drei oder mehr Tagen des Kulturwachstums auffallend in Erscheinung.
Proteinkinase-C-Test
• Die Bindung von (³H)Phorbol-12,13-Dibutyrat((³H)PDBu) an teilweise durch die DEAE-Chromatographiestufe gereinigte Proteinkinase C (Jeng et al.: Cancer Res. 46, 1966-1971 (1986)) wurde ein Anwesenheit von Phoesphatidylserin getestet, wie beschrieben (Sharkey et al.: Cancer Res. 45, 19-24 (1985)), mit der Ausnahme, daß die Inkubation während fünf Minuten bei 37ºC erfolgte. Die Konkurrenz der (³H)PDBu-Bindung durch Prostratin wurde in Anwesenheit von 4 nM (³H)PDBu bestimmt. Die Bindung von (³H)PDBu an intakte CEM-SS-Zellen und die Konkurrenzbindung durch Prostratin wurden in RPMI- Zellkulturmedium getestet, das 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, 25 mM Hepes, pH 7,4, enthielt. Die Inkubation dauert 30 Minuten bei 37ºC, wonach die Zellen abgekühlt wurden, ein Aliquot zur Bestimmung der Gesamtzählungen entnommen wurde, und Bindungszählwerte durch Filtration bestimmt wurden. Nichtspezifische Bindungen wurden in Anwesenheit von 5 uM nicht radioaktivem PDBu bestimmt. Die Aktivierung enzymatischer Aktivität von Proteinkinase C durch PDBu bzw. Prostratin wurde durch das Verfahren von Nakadate et al., bestimmt (Nakadate et al.. Biochem. Pharmacol. 37, 1541-1545 (1988)).
• Weil Prostratin ein Phorbolderivat ist, war es von Interesse, zu sehen, ob es sich an Proteinkinase C binden und diese aktivieren oder hemmen würde (Blumberg P. M.: Cancer Res. 48, 1-8 (1988), und Nishizuka Y.: Nature 308, 693 - 398 (1984)). Interessanterweise wird von Prostratin im Gegensatz zu vielen anderen Phorbolderivaten berichte t, daß es kein Tumorpromotor ist (Zayed et al.: Experientia 33, 1554-1555 (1977)). Der Wert Ki für Prostratin war 12,5 ± 0,4 nM (Mittelwert ± Standardabweichung; 3 Experimente). Zum Vergleich beträgt der Ki-Wert für 12-Desoxyphorbol-13-Isobutyrat 2,1 ± 0,1 nM (Mittelwert ± Bereichsabweichung; 2 Experimente), und der Kd-Wert für PDBu betrug 0,59 nM. Prostratin stimuliert ebenso wie PDBu die Proteinkinase-C-Aktivität (PKC-Aktivität) in vitro; bei einer Konzentration von 1000 nm Prostratin betrug die Stimulation von PKC 95% von der bei einer Konzentration von 100 nM PDBu beobachteten.
• Die Bindungsaffinitäten von Phorbolestern in Zellen waren typischerweise geringer als die bei rekonstituierter Proteinkinase C erhaltenen (Blumberg et al.: in Mechanism of Tumor Promotion, Vol. 3; Tumor Promotion and Cocarcinogenesis in vitro (Slage T. J., Herausgeber) Boca Raton, FL, CRC Press, 1984, Seiten 143-184), was vermutlich die Rolle zellulärer Kalzium- und Phospholipid-Zusammensetzung bei der Bindung reflektiert (Konig et al.: J. Cell. Biochem. 7, 255-265, (1985)). Bei den CEM-SS-Zellen wurde (³H)PDBu mit einer Affinität von 4,9 ± 0,8 nM (Mittelwert ± Bereichsabweichung; 2 Experimente) und einer Bmax von 1,2 ± 0,1 umol/mg Protein (Mittelwert ± Bereichsabweichung; 2 Experimente) gebunden. Prostatin hemmte die (³H)PDBu-Bindung an die TEM-Zellen mit einem Ki-Wert von 210 ± 30 nM (Mittelwert ± Bereichsabweichung; 2 Experimente). Das übliche Bindungsprotokoll der Zellen läßt das Serum weg, wegen der berichteten veränderlichen Wirkungen von Serum auf die Bindung (Blumberg et al.: in Mechanism of Tumor Promotion, Vol. 3, Tumor Promotion and Cocarcinogenesis in vitro (Slage T. J., Herausgeber), Boca Raton, FL, CRC Press, 1984, Seiten 143-184). Jedenfalls wurde, wenn 10% fötales Kälberserum in den Tests der biologischen Reaktionen enthalten war, in den CEM-Zellen keine wesentliche Auswirkung auf den Ki-Wert für Prostratin beobachtet (Ki = 190 nM; 1 Experiment).
• Deutlich charakterisierte biologische Reaktionen auf die Phorbolester umfassen die Hemmung der Bindung von Epidermis- Wachstumsfaktor und Freisetzen von Arachidonsäure-Metaboliten (Dell'Aquila et al.: Cancer Res. 48, 3702-3708 (1988)). Es wurde bestätigt, daß Prostratin diese beiden Reaktionen in C3H10T1/2-Zellen induziert. C3H10T1/2-Zellen wurden gezüchtet und die (³H) Arachidonsäure-Metabolit-Freisetzung wurde bestimmt wie früher beschrieben (Dell'Aquila et al.: Cancer Res. 48, 3702-3708 (1988)). ¹²&sup5;I-Epidermis-Wachstumsfaktorbindung durch C3H10T1/2-Zellen wurde getestet wie beschrieben (Dell'Aquila et al.: Cancer Res. 48, 3702-3708 (1988)), unter Verwendung einer einstündigen Vorbehandlung mit Phorbolester und dann einer einstündigen Co-Inkubation mit dem Phorbolester und dem ¹²&sup5;I-Epidermis-Wachstumsfaktor.
• Die halbmaximal wirksamen Konzentrationen von Prostratin waren 220 nM bzw. 1100 nM. Die parallel bestimmten ent sprechenden Werte für PDBu waren 10 nM bzw. 24 nM.
• Da Prostratin in vitro wie ein typischer Phorbolesterwerte, sowohl in PKC-Enzymaufbereitungen und in intakten Zellen, obwohl mit 20- bis 45-fach niedrigerer Potenz als PDBu, wurde die Aktivität anderer Phorbolderivate in dem Anti-HIV-Test untersucht. Die Phorbolester PMA (Phorbol 12-Myristat-13-Azetat) bei einer Konzentration von 50 nM und PDBu (500 nM) waren bei den oben beschriebenen Versuchsbedingungen in gleicher Weise zytostatisch und gegen HIV-1 schützend.
Zellenmorphologie
• Energieschwache Photomikrographien (Fig. 5), die von CEM-SS- Zellen nach 6 Kulturtagen unter veränderlichen Versuchsbedingungen aufgenommen wurden, zeigten deutlich sowohl die vermehrungshemmenden als auch die Anti-HIV-1-Wirkungen der Prostratinbehandlung.
• Bild A zeigt nichtinfizierte Kontroll-CEM-SS-Zellen, die nicht mit Prostratin behandelt worden sind. Die Zellen bilden auf dem Boden der runden Mulde ein gleichförmiges Pellet, das mehrere hundert Zelldurchmesser dick ist. In dieser Kulturkonfiguration stehen die Zellen in sehr enger Nähe zueinander, hängen aber nicht mechanisch zusammen und können durch leichte Agitation getrennt werden. Die Infektion von CEM-Zellen durch HIV-1 führt nach 6 Tagen (Bild B) zu dramatischen morphologischen Veränderungen; die Auswirkungen umfassen Riesenzellenbildung (Syncytia-Bildung), Zell-Lyse und Produktion großer Mengen zellulärer Teilchen. Im Gegensatz dazu war die makroskopische Morphology der Zellenpellets von nichtinfizierten CEM-Zellen (Bild C) und mit HIV-1 infizierten Zellen (Bild D), die beide mit 10 ug/ml Prostratin behandelt waren, im wesentlichen identisch.
• Die Prostratinbehandlung verursachte eine Abnahme der Größe des Zellenpellets relativ zu den Kontrollzellen in beiden Kulturen. Jedoch waren die Größe des Zellenpellets und der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen in mit HIV-1-infizierten Kulturen und nichtinfizierten Kulturen nach der Prostratinbehandlung ähnlich. Folglich, obwohl Prostratin die Zellenvermehrung hemmte, scheint es auch die zytopathischen Wirkungen der HIV-1-Infektion vollständig zu blockieren.
• Beobachtungen der zellulären Morphology bei höheren Vergrößerungen bestätigten, daß bei Vorhandensein von 1 uM Prostratin die Syncytiumbildung vollständig unterbunden war.

Claims (10)

1. Prostratin für antivirale Verwendung.

2. Prostratin nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung einer Virusinfektion.

3. Prostratin nach Anspruch 2, wobei die Infektion durch einen Retrovirus verursacht wird.

4. Prostratin nach Anspruch 3, wobei der Retrovirus ein Human-Immundefekt-Virus ist.

5. Zusammensetzung, die Prostratin und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält, zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5 in Einheitsdosierungsform.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Träger in injizierbarer oder oral oder rektal verabreichbarer Form als Öl, Lipidemulsion, wässrige Suspension oder pharmakologisch inerter Arzneistoffträger vorliegt.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7 in Form einer sterilen Lösung.

9. Verwendung eines Prostratins zur Herstellung eines Medikaments zur Anwendung bei der Behandlung einer Virusinfektion.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Injektion nach Anspruch 3 oder 4 vorliegt.