DE69130704T2

DE69130704T2 - Polypeptide beteiligt an der kobalamin- und/oder kobamid-biosynthese, für diese kodierende dns-sequencen, und ihre herstellung und vewendung.

Info

Publication number: DE69130704T2
Application number: DE69130704T
Authority: DE
Inventors: Francis F-75019 Paris Blanche; Beatrice F-75005 Paris Cameron; Joel F-75012 Paris Crouzet; Laurent F-75013 Paris Debussche; Sophie F-75007 Paris Levy-Schil; Denis F-75013 Paris Thibaut
Original assignee: Rhone Poulenc Biochimie SA
Current assignee: Rhone Poulenc Biochimie SA
Priority date: 1990-01-31
Filing date: 1991-01-30
Publication date: 1999-05-27
Anticipated expiration: 2011-01-31
Also published as: JP3734466B2; US6656709B1; CA2072023C; DE69130704D1; CN1054799A; CA2072023A1; DK0516647T3; FR2657622A1; ES2128317T3; JP2003230389A; FR2657622B1; HU216653B; JP3452316B2; WO1991011518A1; JPH05506570A; HU9202487D0; EP0516647A1; ATE175237T1; US20060019352A1; HUT63458A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptide, die an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden und insbesondere von Coenzym B&sub1;&sub2; beteiligt sind. Sie betrifft auch die genetische Substanz, die für die Expression dieser Polypeptide verantwortlich ist, sowie ein Verfahren, das ihre Herstellung erlaubt. Sie betrifft schließlich ein Verfahren zur Amplifikation der Produktion von Cobalaminen und ganz besonders von Coenzym B&sub1;&sub2; durch die Techniken der rekombinanten DNA.
Vitamin B&sub1;&sub2; gehört zu den Vitaminen der B-Gruppe. Es handelt sich um ein wasserlösliches Vitamin, das als Faktor identifiziert wurde, der die Behandlung von Kranken, die an perniziöser Anämie leiden, erlaubt. Es wird im allgemeinen zur Stimulierung der Hämatopoese müden Patienten verschrieben, aber es wird auch in zahlreichen anderen Fällen verwendet, die hepatische Störungen, Nervenschwächen umfassen, oder als Appetitstimulans, tonifizierender Wirkstoff sowie in der Dermatologie verschrieben (Beck, 1982, Fraser et al., 1983). Bei der industriellen Zucht von nichtwiederkäuenden Tieren, bei der die Ernährung im wesentlichen auf Proteinen pflanzlichen Ursprungs beruht, ist es notwendig, den Futterportionen Vitamin B&sub1;&sub2; in Mengen von 10 bis 15 mg pro Tonne Futter zuzusetzen (Barrere et al., 1981).
Das Vitamin B&sub1;&sub2; ist Teil einer Klasse von Molekülen mit der Bezeichnung Cobalamine, deren Struktur in Fig. 1 dargestellt ist. Die Cobamide unterscheiden sich von den Cobalaminen durch die Base des unteren Nukleotids, die nicht mehr 5,6-Dimethylbenzimidazol ist, sondern eine andere Base, beispielsweise 5-Hydroxybenzimidazol, für den Vitamin B&sub1;&sub2;-Faktor III, der unter anderem von Clostridium thermoaceticum und Methanosarcina barkeri synthetisiert wird (Iron et al., 1984). Diese strukturellen Ähnlichkeiten erklären, daß die metabolischen Wege der Biosynthese von Cobalaminen und Cobamiden für den Hauptteil gemeinsam sind. Die Cobalamine werden fast ausschließlich von Bakterien gemäß einem komplexen und noch sehr schlecht verstandenen Verfahren synthetisiert, das in vier Stufen aufgeteilt werden kann (Fig. 2):
i) Synthese von Uroporphyrinogen III (oder Uro'Gen- III), anschließend
ii) Umwandlung von Uro'Gen III in Cobyrinsäure, gefolgt von
iii) Umwandlung dieser Verbindung in Cobinamid und
iv) Konstruktion des unteren Nukleotidrings unter Einbau der speziellen Base (5,6-Dimethylbenzimidazol, im Falle von Cobalaminen).
Für das Coenzym B&sub1;&sub2; ist es wahrscheinlich, daß die Addition der Gruppierung 5'-Desoxy-5'-adenosyl nur kurz nach der Synthese des Corrinrings stattfindet (Huennekens et al., 1892).
Im Falle von Cobamiden unterscheidet sich nur die Stufe der Synthese und des Einbaus der unteren Base.
Der erste Teil der Biosynthese der Cobalamine ist sehr gut bekannt, da er dem der Häme sowie dem der Chlorphylle entspricht (Battersby et al., 1980). Daran ist sukzessive die δ-Aminolävulinatsynthase (EC 2.3.137), die 6-Aminolävulinatdehydrase (EC 4.2.1.24), die Porphobilinogendeaminase (EC 4.3.1.8) und die Uro'Gen-III-Cosynthase (EC 4.2.1.75) beteiligt, die Succinyl-CoA und Glycin in Uro'Gen III umwandeln. Jedenfalls erfolgt die erste Stufe bei bestimmten Organismen [beispielsweise E. coli (Avissar et al., 1989) und bei methanogenen Bakterien (Kannangara et al., 1989)] durch Umwandlung dank eines multienzymatischen Komplexes auf Glutaminsäure in δ-Aminolävulinsäure.
Zwischen Uro'Gen III und Cobyrinsäure wurden nur drei Derivate von Zwischenprodukten bis zu diesem Tag gereinigt; es handelt sich um die Faktoren FI, FII und FIII, die die jeweiligen Oxidationsprodukte der drei Zwischenprodukte Präcorrin-1, Präcorrin-2 und Präcorrin-3 sind, die den mono-, di- und trimethylierten Derivaten von Uro'Gen III entsprechen (Fig. 3); diese Zwischenprodukte werden durch aufeinanderfolgende Übertragungen von Methylgruppen aus SAM (S-Adenosyl-L-methionin) auf Uro'Gen III in den Positionen C2, C7 bzw. C20 erhalten. Die anderen Reaktionen, die stattfinden, um Cobyrinsäure zu ergeben, sind außer fünf anderen Übertragungen von Methylgruppierungen aus SAM in C17, 012, C1, C15 und C5, die Abspaltung des Kohlenstoffs in C20, die Decarboxylierung in C12 und die Insertion eines Cobaltatoms (Fig. 4). Diese Biosynthesestufen wurden von in vitro in azellulären Extrakten von Propionibacterium shermanii oder von Clostridium tetanomorphum durchgeführten Versuchen abgeleitet. In diesen Extrakten wird die Cobyrinsäure durch Umwandlung von Uro'Gen III nach Inkubation unter geeigneten Bedingungen der Anaerobiose (Batterby et al., 1982) erhalten. Kein Zwischenprodukt zwischen Präcorrin-3 und Cobyrinsäure, das durch anschließende Inkubation mit Extrakten von Cobalamin-produzierenden Bakterien in Corrinoide umgewandelt werden kann, wurde bis zu diesem Tag bei diesen Mikroorganismen isoliert. Die Schwierigkeit, diese Zwischenprodukte zu isolieren und zu identifizieren ist mit
i) ihrer großen Instabilität
ii) ihrer Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff und
iii) ihrer schwachen Akkumulationshöhe in vivo verbunden.
In diesem Teil des Weges wurde nur ein Enzym von Pseudomonas denitrificans gereinigt und untersucht; es handelt sich um SAM:Uro'Gen-III-Methyltransferase (Blanche et al., 1989), die als SUMT bezeichnet wird.
Zwischen der Cobyrinsäure und Cobinamid werden die folgenden Reaktionen durchgeführt:
i) Addition einer 5'-Desoxyadenosylgruppierung (es handelt sich um Coenzym B&sub1;&sub2;, das synthetisiert werden muß),
ii) Amidierung von sechs der sieben Carboxylfunktionen durch Addition von Aminogruppierungen,
iii) Amidierung der zuletztgenannten Carboxylfunktion (Propionsäurekette des Pyrrolkerns D) durch Addition von R-1-Amino-2-propanol (Fig. 2).
Es wurde noch nicht erhellt, ob es wirklich eine Reihenfolge in den Amidierungen gibt. (Herbert et al., 1970). Schließlich wurde keine Aktivitätsbestimmung in diesem Teil des Wegs beschrieben, außer bezüglich der 5'-Desoxyadenosylgruppierung (Huennekens et al., 1982).
Die letzte Stufe der Biosynthese eines Cobalamins, beispielsweise Coenzym B&sub1;&sub2;, umfaßt vier andere aufeinanderfolgende Phasen, die in Fig. 5 beschrieben sind (Huennekens et al., 1982), nämlich:
i) die Phosphorylierung der Hydroxylgruppe des Aminopropylrests von Cobinamid, um Cobinamidphosphat zu ergeben, anschließend
ii) die Addition eines Guanosindiphosphats durch Umsetzung mit Guanosin-5'-triphosphat; die so erhaltene Verbindung ist GDP-Cobinamid (Friedmann, 1975), die
iii) mit α-Ribazol-5'-phosphat reagiert, das als solches aus Riboflavin synthetisiert wurde, wodurch Adenosylcobalamin-5'-phosphat erhalten wurde (Friedmann et al., 1968), das
iv) durch Dephosphorylierung zu Coenzym B&sub1;&sub2; führt (Schneider und Friedmann, 1972).
Unter den Bakterien, die Cobalamine produzieren können, können insbesondere genannt werden:
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium radiobacter
Bacillus megaterium
Clostridium sticklandii
Clostridium tetanomorphum
Clostridium thermoaceticum
Corynebacterium XG
Eubacterium limosum
Methanobacterium arbophilicum
Methanobacterium ivanovii
Methanobacterium ruminantium
Methanobacterium thermoautotrophicum
Methanosarcina barkeri
Propionobacterium shermanii
Protaminobacter ruber
Pseudomonas denitrificans
Pseudomonas putida
Rhizobium melitoti
Phodopseudomonas sphaeroides
Salmonella typhimurium
Spirulina platensis
Streptomyces antibioticus
Streptomyces aureofaciens
Streptomyces griseus
Streptomyces olivaceus
In industriellem Maßstab erfolgt wegen der großen Komplexität der Biosynthesemechanismen die Produktion von Cobalaminen und insbesondere von Vitamin B&sub1;&sub2; ausschließlich mikrobiologisch. Sie wird durch Züchtungen in großen Volumina der Bakterien Pseudomonas denitrificans, Propionobacterium shermanii und Propionibacterium freudenreichii durchgeführt (Florent, 1986). Die zur industriellen Produktion verwendeten Stämme sind aus Wildstämmen hervorgegangen. Sie können zahlreiche Zufallsmutationszyklen durchlaufen haben, anschließend eine Selektion von verbesserten Clonen zur Produktion von Cobalaminen (Florent, 1986). Die Mutationen werden durch Mutagenese mit mutagenen Mitteln oder durch physikalische Behandlungen, wie Behandlungen mit ultravioleten Strahlen, erhalten (Barrare et al., 1981). Nach diesem empirischen Verfahren werden Zufallsmutationen erhalten und verbessern die Produktion von Cobalaminen. Beispielsweise ist beschrieben, daß aus dem Ursprungsstamm von Pseudomonas denitrificans, der ursprünglich von Miller und Rosenblum (1960, U. S.-Patent 2 938 822) isoliert wurde, die Produktion dieses Mikroorganismus stufenweise über 10 Jahre durch die vorstehend genanten Techniken von 0,6 mg/l auf 60 mg/l erhöht wurde (Florent, 1986). Für die Bakterien der Gattung Propionibacterium, [Pronionibacterium shermanii (ATCC 13673) und freudenreichii (ATCC 6207)] scheinen dieselben Produktionswerte in der Literatur beschrieben zu sein; beispielsweise wurde eine Produktion von 65 mg/l beschrieben (europäisches Patent 87920). Jedoch wurde bis jetzt kein Absuchverfahren beschrieben, das die leichte Selektion oder Gewinnung entweder von überproduzierenden Mutanten für Cobalamine oder von deutlich in ihrer Produktion von Cobalaminen verbesserten Mutanten erlaubt.
Auf genetischer Ebene wurden bis jetzt wenige Arbeiten durchgeführt. Die Clonierung der cob-Gene (die Enzyme, die an dem Biosyntheseverfahren beteiligt sind, codieren) wurde bei Bacillus megaterium (Brey et al., 1986) beschrieben. Elf Komplementationsgruppen wurden durch Komplementation von cob-Mutanten von Bacillus megaterium mit Plasmiden, die verschiedene DNA-Fragmente von Bacillus megaterium tragen, identifiziert. Diese Gene sind auf dem gleichen Genort gruppiert, der auf einem 12-kb-Fragment vorhanden ist.
Untersuchungen wurden auch an den cob-Genen von Salmonella typhimurium durchgeführt. Ohne daß die Clonierung dessen beschrieben wurde, wurde gezeigt, daß fast alle Gene der Biosynthese der Cobalamine zwischen den Minuten 40 und 42 des Chromosoms angeordnet sind (Jeter und Roth, 1987). Nur der Genort cysG, der die Transformation von Uro'Gen III in Präcorrin-2 erlauben muß, ist nicht Teil dieser Gruppe von Genen. Jedoch wurden die von diesem Ort codierte Aktivität sowie seine biochemischen Eigenschaften nicht beschrieben.
Weiterhin wurden Phänotypen mit den cob-Mutationen assoziiert. Bei Salmonella typhimurium und bei Bacillus megaterium zeigen die cob-Mutanten kein Wachstum mehr auf Minimalmedium mit Ethanol als Kohlenstoffquelle oder als Stickstoffquelle (Roofund Roth, 1988). Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß ein Enzyme des Katabolismus von Ethanolamin, Ethanolamin-Ammoniak-Lyase (EC 4.3.1.7) Vitamin B&sub1;&sub2; als Cofaktor hat; die cob-Mutanten synthetisieren kein Vitamin B&sub1;&sub2; mehr. Sie können nicht mehr mit Ethanolamin als Kohlenstoffquelle und/oder als Stickstoffquelle wachsen. metE-Mutanten von Salmonella typhimurium besitzen nur eine Methylcobalmin-abhängige Homocystein-Methyltransferase (EC 2.1.1.13). Die cob-Mutanten von Salmonella typhimurium-metE sind für Methionin auxotroph (Jeter et al., 1984).
Bei Pseudomonas denitrificans und Acsrobacterium tumefaciens wurden keine Phänotypen, die mit einem vollständigen Defekt der Cobalaminsynthese assoziiert sind, bis jetzt beschrieben.
Schließlich führten Arbeiten über Pseudomonas denitrificans (Cameron et al., 1989) zur Clonierung von DNA-Fragmenten, die cob-Gene dieses Bakteriums tragen. Diese sind in vier Komplementationsgruppen aufgeteilt, die von mindestens 30 kb DNA getragen werden. Mindestens vierzehn Komplementationsgruppen wurden durch heterologe Komplementation von cob-Mutanten von Agrobacterium tumefaciens und Pseudomonas putida mit DNA-Fragmenten vom Pseudomonas denitrificans, die cob-Gene tragen, identifiziert.
Jedoch wurde bis jetzt keines dieser Gene gereinigt, und keine Nukleotidsequenz wurde beschrieben. Der Artikel von F. Blanche et al. (J. of Bact. (1989), 171, S. 4222-423) betrifft zwei Enzyme, SUH und cob-I-Alaninadenosyltransferase, die an der Biosynthese von Cobalaminen beteiligt sind. Schließlich konnte keine Verbesserung der Produktion von Cobalaminen durch die Techniken der rekombinanten DNA erhalten werden. Die Amplifikation von cob-Genen von Bacillus megaterium liefert bei dem Stamm, aus dem sie cloniert worden sind, keine Verbesserung der Produktion von Cobalaminen (Brey et al., 1986). Bei Salmonella typhimurium wurden physiologische Untersuchungen durchgeführt, um die Bedingungen zu bestimmen, unter denen eine starke Transkription der untersuchten cob-Gene beobachtet wurde (Escalante und Roth, 1987). Unter diesen Bedingungen gibt es keine Verbesserung der Produktion von Cobalaminen, obwohl Gene des Biosynthesewegs stärker exprimiert sind als unter Standarkulturbedingungen.
Die vorliegende Erfindung führt zur genauen Identifikation von DNA-Sequenzen, die Polypeptide codieren, die an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligt sind. Die vorliegende Erfindung betrifft somit DNA-Sequenzen, die an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligte Polypeptide codieren. Insbesondere betrifft die Erfindung die Gene cobA, cobB, cobC, cobD, cobE, cobF, cobG, cobH, cobI, cobJ, cobK, cobL, cobM, cobN, cobO, cobP, cobQ, cobS, cobT, cobU, cobV, cobW, cobX und corA, jede mit diesen Genen homologe DNA-Sequenz als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes sowie DNA-Sequenzen jeden Ursprungs (natürlich, synthetisch, rekombinant), die mit diesen Sequenzen oder Fragmenten davon hybridisieren und/oder signifikante Homologien zeigen und die an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligte Polypeptide codieren. Die Erfindung betrifft auch die Gene, die diese DNA-Sequenzen enthalten.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen wurden aus verschiedenen Stämmen isoliert: einem industriellen Stamm, Pseudomonas denitrificans SC510, abgeleitet von dem Stamm MB580 (U. S. Patent 3 018 225) durch Komplementieren der cob-Mutanten von A. tumefaciens und P. putida und von Methanobacterium ivanovii. Die so erhaltenen Clone konnten genau analysiert werden, insbesondere durch Kartographie mit Hilfe von Insertionen eines Derivats des Transposons Tn5. Diese genetischen Untersuchungen erlaubten die Lokalisierung der cob- oder cor-Gene auf der Restriktionskarte und die Durchführung ihrer Sequenzierung. Eine Analyse der offenen Leseraster erlaubte anschließend den Nachweis codierender Regionen dieser DNA-Fragmente.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Nukleotidsequenzen zur Clonierung der cob-Gene anderer Bakterien. In der Tat ist bekannt, daß, damit Proteine die gleichen Aktivitäten katalysieren, die Sequenzen und mit evolutionärenen Divergenz als Divergenz konserviert sind (Wein-Hsiung et al., 1985). Es wird erfindungsgemäß gezeigt, daß es eine signifikante Homologie zwischen den Nukleotidsequenzen der Gene verschiedener Mikroorganismen, die an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligte Polypeptide codieren, gibt. Die anscheinenden Unterschiede ergeben sich aus der evolutionären Degeneration und der Degeneriertheit des genetischen Codes, die mit dem Prozentsatz an GC des Genoms des untersuchten Mikroorganismus in Zusammenhang steht (Wein-Hsiung et al., 1985).
Erfindungsgemäß kann eine Sonde mit einer oder mehreren DNA-Sequenzen von insbesondere Pseudomonas denitrificans oder mit Fragmenten davon oder mit analogen Sequenzen, die einen spezifischen Degeneriertheitsgrad auf der Ebene des Codongebrauchs und des Prozentsatzes an GC der DNA des Bakteriums, das untersucht werden soll, besitzen, hergestellt werden. Unter diesen Bedingungen ist es möglich, ein spezifisches Hybridisierungssignal zwischen der Sonde und den genomischen DNA-Fragmenten des untersuchten Bakteriums nachzuweisen. Dieses spezifische Hybridisierungssignal entspricht der Hybridisierung der Sonde mit den isofunktionellen cob-Genen des Bakteriums. Die cob-Gene sowie ihre Produkte können anschließend isoliert, gereinigt und charakterisiert werden. Die Erfindung betrifft somit auch ein Mittel, das durch Hybridisierung Zugang zu Nukleotidsequenzen und Polypeptiden, die an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden jedes Mikroorganismus beteiligt sind, erlaubt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine rekombinante DNA, die mindestens eine DNA-Sequenz enthält, die ein an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligtes Polypeptid codiert, und insbesondere eine rekombinante DNA, in der die Sequenz(en) unter der Kontrolle von Expressionssignalen steht/stehen.
In dieser Hinsicht können insbesondere 5' der DNA-Sequenz Promotorregionen positioniert werden. Derartige Regionen können mit der DNA-Sequenz homolog oder heterolog sein, insbesondere können starke bakterielle Promotoren, wie der Promotor des Tryptophanoperons Ptrn oder des Lactoseoperons Plac von E. coli, der linke oder rechte Promotor der Bakteriophagen lambda, starke Promotoren von Bakteriophagen, wie Corynebakterien, bei gramnegativen Bakterien funktionelle Promotoren, wie der Promotor Ptac von E. coli, der Promotor PxvlS der Gene des Xylolkatabolismus des TOL-Plasmids, der Promotor der Amylase von Bacillus subtilis Pamv verwendet werden. Man kann auch von glykolytischen Genen von Hefen abgeleitete Promotoren, wie die Promotoren der Gene, die Phosphoglyceratkinase, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Lactase oder Enolase co dieren, verwenden, die verwendet werden können, wenn die rekombinante DNA in einen eukaryontischen Wirt eingeführt wird. Eine Ribosomenbindungsstelle wird auch 5' der DNA- Sequenz positioniert, und sie kann homolog oder heterolog sein, wie die Ribosomenbindungsstelle des Gens cII des Bakteriophagen lambda.
Für die Termination notwendige Signale der Transkription können 3' der DNA-Sequenz angebracht werden.
Die erfindungsgemäße rekombinante DNA kann anschließend direkt in eine Wirtszelle, die mit den gewählten Expressionssignalen kompatibel ist, eingeschleust werden oder in einen Plasmidvektor cloniert werden, um die stabile Einschleusung der infragekommenden DNA-Sequenz in die Wirtszelle zu erlauben.
Weiterhin betrifft die Erfindung die so erhaltenen Plasmide, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligtes Polypeptide codiert. Genauer enthalten diese Plasmide auch ein funktionelles Replikationssystem und einen Selektionsmarker.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, in denen eine oder mehrere DNA-Sequenzen, wie genauer definiert, oder ein Plasmid, wie vorstehend definiert, eingeschleust wurde(n).
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Produktion von Polypeptiden, die an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamide beteiligt sind. Gemäß diesem Verfahren wird in eine Wirtszelle eine DNA-Sequenz, wie vorstehend beschrieben, eingeschleust, diese rekombinante Zelle unter Expressionsbedingungen der Sequenz gezüchtet, anschließend die so gebildeten Polypeptide isoliert.
Die Wirtszellen, die dazu verwendet werden können, sind sowohl Prokaryonten als auch Eukaryonten, tierische Zellen oder pflanzliche Zellen. Bevorzugt werden sie aus Bakterien und insbesondere Bakterien der Gattung E. coli, P. denitrificans, A. tumefaciens oder R. melitoti ausgewählt.
Eine andere Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation der Produktion von Cobalaminen und/oder Cobamiden oder ihrer biosynthetischen Vorläufer durch rekombinante DNA- Techniken. In der Tat, wenn die Beschränkung des metabolischen Flusses der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden oder ihrer Vorläufer auf eine Beschränkung in der Aktivität eines Enzyms auf dem Biosyntheseweg zurückzuführen ist, führt die Erhöhung dieser Aktivität durch Erhöhung der Expression des gleichen Enzyms mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken (genetische Amplifikation, Substitution von Transkriptions-/Translationssignalen durch wirksamere Signale) zu einer Erhöhung der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden. Es ist auch möglich, daß die Beschränkung der Produktion von Cobalaminen und/oder Cobamiden das Ergebnis einer biochemischen Regulation ist. In diesem Fall können das oder die cob-Gen(e), das/die dem regulierten Enzym entspricht/entsprechen, in vitro spezifisch mutagenisiert werden, um mutierte Gene zu erhalten, deren Produkte die Regulationen verloren haben, was bis zum Auftreten einer Verbesserung der Produktion geht.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht aus der Einschleusung in einen Mikroorganismus, der Cobalamine und/oder Cobamide produziert, oder in einen potentiellen Produzenten dieser Verbindungen (d. h. der bezüglich einer oder mehrerer Stufen der Biosynthese defekt ist) einer DNA-Sequenz, wie vorstehend definiert, der anschließenden Züchtung dieses Mikroorganismus unter den Expressionsbedingungen der Sequenz und der Synthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden und schließlich der Isolierung der so gebildeten Cobalamine und/oder Cobamide. Ein derartiges Verfahren ist insbesondere auf alle auf Seite 5 genannten produzierenden Mikroorganismen und genauer auf die Mikroorganismen der Gattung P. denitrificans, Rhizobium melitoti oder Agrobacterium tumefaciens anwendbar. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus P. denitrificans insbesondere der Stamm 50510. Im Hinblick auf die potentiell produzierenden Mikroorganismen sind die DNA-Sequenzen, die verwendet werden, diejenigen, die den Stufen der Biosynthese entsprechen, die der Mikroorganismus nicht durchführen kann.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung und durch die verschiedenen vorstehend dargelegten Strategien kann eine Verbesserung der Produktion von Cobalaminen und/oder Cobamiden oder ihrer Vorläufer für jeden produzierenden Mikroorganismus oder potentiell produzierenden Mikroorganismus an Cobalaminen und/oder Cobamiden erhalten werden. Es reicht aus, diesen rekombinanten Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen für die Produktion von Cobalaminen und zur Expression der eingeschleusten DNA-Sequenzen zu züchten. Diese Kultur kann chargenweise oder auch kontinuierlich stattfinden, und die Reinigung der Cobalamine kann durch bereits in industriellem Maßstab verwendete Methoden durchgeführt werden (Florent, 1986). Diese Methoden umfassen unter anderem:
i) die Solubilisation der Cobalamine und ihre Umwandlung in ihre Cyanoform (beispielsweise durch Behandeln des Fermentationskuchens mit Wärme, mit Kaliumcyanid in Gegenwart von Natriumnitrit), anschließend
ii) die Reinigung der Cyanocobalamine in verschiedenen Stufen, die beispielsweise sein können
a) Adsorption auf verschiedenen Substraten, wie Amberlit IRC50, Dowex 1X2 oder Amberlit XAD 2, gefolgt von einer Elution mit einem Gemisch aus Wasser und Alkohol oder Wasser und Phenol, anschließend
b) Extraktion in einem organischen Lösungsmittel und schließlich
c) Fällung oder Kristallisation aus der organischen Phase, entweder durch Zugabe von Reagentien oder Verdünnung in einem geeigneten Lösungsmittel oder durch Verdampfen.
Die vorliegende Erfindung zeigt außerdem, daß es durch die Techniken der rekombinanten DNA möglich ist, die Produktion von Cobalaminen eines produzierenden Bakteriums für Cobalamine durch Kumulieren der Verbesserungen zu verbessern. Dadurch wird eine erste Verbesserung, wie vorstehend beschrieben, erhalten, dann wird diese Verbesserung immer weiter mit Hilfe der Technik der rekombinanten DNA verbessert, d. h. beispielsweise durch Amplifizieren der Biosynthesegene der Cobalamine.
Weiterhin betrifft die Erfindung die an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligten Polypeptide. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung alle Polypeptide oder Derivate oder Fragmente dieser Polypeptide, die von den vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen codiert werden und die an dem Biosyntheseweg der Cobalamine und/oder Cobamide beteiligt sind. Die Aminosäuresequenz dieser Polypeptide ist beschrieben, ebenso bestimmte ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften. Eine enzymatische Aktivität oder spezifische Eigenschaften sind auch mit jeder von ihnen assoziiert.
In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung die Polypeptide, die an der Umwandlung von Präcorrin-3 in Cobyrinsäure-a,c- diamid und insbesondere an der Übertragung einer Methylgruppierung von SAM in die Positionen C1, C5, C11, C15 und C17 beteiligt sind.
Die Erfindung betrifft auch die Polypeptide, die:
· an der Umwandlung von Cobyrinsäure in Cobinamid beteiligt sind, oder
· eine S-Adenosyl-L-methioninpräcorrin-2-methyltransferase(SP2MT)-Aktivität besitzen, oder
· eine Cobyrinsäure und/oder Hydrogenobyrinsäure-a,c- diamid-Synthaseaktivität besitzen, oder
· eine Präcorrin-8x-Mutaseaktivität besitzen, oder
· eine Nicotinat-Nukleotid: Dimethylbenzimidazolphosphorribosyltransferase-Aktivität besitzen, oder
· eine Cobalamin-(5'-phosphat)synthaseaktivität besitzen, oder
· eine Cobyrinsäuresynthaseaktivität besitzen, oder
· eine cob(I)-Alaninadenosyltransferaseaktivität besitzen, oder
· eine Präcorrin-6x-Reduktaseaktivität besitzen, oder
· an der Umwandlung von Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid in Cobyrinsäure-a,c-diamid beteiligt sind.
Vorteilhafterweise betrifft die Erfindung ein Polypeptid, ausgewählt aus den Plasmiden COBA, COBB, COBC, COBD, COBE, COBF, COBG, COBH, COBI, COBJ, COBK, COBL, COBM, COBN, COBO, COBP, COBQ, COBS, COBT, COBU, COBV, COBW, COBX und CORA, dargestellt in den Fig. 15, 16, 40, 41 und 47.
Außerdem erlaubt die Verwendung der vorstehend beschriebenen Hybridisierungssonden, die Charakterisierung und Isolierung von isofunktionellen Polypeptiden auf andere Mikroorganismen, ausgehend von den aus anderen Mikroorganismen isolierten Genen. So zeigt die vorliegende Erfindung, daß die Sequenz eines COB-Proteins von Pseudomonas denitrificans signifikant den Proteinsequenzen anderer Mikroorganismen, die den gleichen Aktivitätstyp zeigen, homolog ist. Unter diesen COB-Proteinen, die die gleiche Reaktion bei verschiedenen Mikroorganismen katalysieren, führten nur die evolutiven Entfernungen Variationen ein (Wein- Hsiung et al., 1985). Die vorliegende Erfindung betrifft auch diese isofunktionellen Polypeptide.
Die Zuteilung einer speziellen enzymatischen Aktivität ist das Ergebnis einer Analyse, die nach verschiedenen Strategien durchgeführt werden kann. Insbesondere erlauben Untersuchungen der in vitro-Aktivität gegenüber SAM (5-Adenosyl-L-methionin) die Zuteilung einer Methyltransferaseaktivität einem Protein, das SAM binden kann, und somit seine Beteiligung an Transferstufen von Methylgruppierungen, die zwischen Uro'Gen III und Cobyrinsäure stattfinden. Ein anderes Mittel zur Erkennung der Aktivität dieser Polypeptide besteht darin, daß man die Zwischenprodukte des Biosynthesewegs der Cobalamine bestimmt, die bei bestimmten Mutanten angereichtert wurden, die diese Polypeptide nicht exprimieren können (identifiziert durch Komplementationsversuche). Diese Analysen erlauben die Schlußfolgerung, daß das infragekommende Polypeptid das angereicherte Zwischenprodukt als Substrat hat, was die Einordnung und Definition seiner Aktivität auf dem Biosyntheseweg erlaubt. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivitäten des Biosynthesewegs, das auf jeden produzierenden Stamm für Cobalamine und/oder Cobamide anwendbar ist. Diese Bestimmungen erlauben die Reinigung der bestimmten enzymatischen Aktivität aus jedem Stamm, der diese Verbindungen produziert. Aus dieser gereinigten Aktivität kann die NH2-terminale Sequenz des infragekommenden COB-Proteins oder auch die der Untereinheiten dieses Proteins durchgeführt werden, was die Identifizierung des oder der Strukturgens/ Strukturgene, das/die die infragekommende Aktivität codiert/codieren, erlaubt. Für Pseudomonas denitrificans werden die Strukturgene, die Aktivitäten des Biosynthesewegs codieren, dadurch identifiziert, daß man für jede NH2-terminale Sequenz das COB-Protein mit der gleichen NH2-terminalen Sequenz identifiziert.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren, das die Indentifikation und Bestimmung von Zwischenprodukten des Biosynthesewegs der Cobalamine oder anderer Corrinoide bei Stämmen, die Cobalamine produzieren, oder nichtproduzierenden Mutanten erlaubt. Diese Zwischenprodukte können auch in den Kulturbrühen sowie in den Zellen selbst nachgewiesen werden. Die Zwischenprodukte, die bestimmt werden können, sind alle Corrinoide, die auf dem Biosyntheseweg nach Cobyrinsäure aufgefunden werden, d. h. neben Cobyrinsäure Cobyrinsäuremonoamid, cobyrinsäurediamid, Cobyrinsäuretriamid, Cobyrinsäuretetraamid, Cobyrinsäurepentaamid, Cobyrinsäure, Cobinamid, Cobinamidphosphat, GDP-Cobinamid, Coenzym B&sub1;&sub2;-Phosphat und Coenzym B&sub1;&sub2;. Die Cyanoformen und Coenzymformen dieser Produkte können durch diese Technik bestimmt werden.
Andere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der Lektüre der folgenden Beispiele und Bezeichnungen hervor, die als erläuternd und nichtbeschränkend gelten müssen.

DEFINITION DER VERWENDETEN AUSDRÜCKE UND ABKÜRZUNGEN

ACDAS: Cobyrinsäure-a,c-diamidsynthase rekombinante DNA: Gesamtheit der Techniken, die entweder die Assoziierung im gleichen Mikroorganismus von DNA-Sequenzen, die nicht natürlich sind, oder die spezifische Mutagenese eines DNA-Fragments erlauben
ATP: Adenosin-5'-triphosphat
BSA: Rinderserumalbumin
HPLC: Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Cluster: Gengruppe
Cob: entspricht dem Phänotyp der reduzierten (mindestens 10fach weniger als die Kontrolle) Produktionshöhe der Cobalamine
Stoppcodon: Codon zur Termination der Translation Corrinoide: Derivate der Cobyrinsäure, die den Corrinkern besitzen
dGTP: 2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat
DMBI: Dimethylbenzimidazol
dNTP: 2'-Desoxyribonukleosid-5'-triphosphate
DTT: Dithiothreit
cob-Gen: Gen, das an der Biosynthese von Cobinamid aus dem Uro'Gen-III beteiligt ist
cor-Gen: Gen, das an der Biosynthese der Corrinoide aus Uro'Gen III beteiligt ist
kb: Kilobasen
NN:DMBI PRT:
ORF: offenes Leseraster
bp: Basenpaar
COB-Protein: Protein, das entweder als Katalysator an dem Biosyntheseweg von Cobalaminen oder als Regulatorprotein an dem Regulationsnetz der cob-Gene beteiligt ist, oder beides
COR-Protein: Protein, das entweder als Katalysator an dem Biosyntheseweg der Corrinoide oder als Regulatorprotein an dem Regulationsnetzwerk der cor-Gene beteiligt ist, oder beides
SAM: S-Adenosylmethionin
SDS: Natriumdodecylsulfat
SP&sub2;MT: SAM-L-Methionin:Präcorrin-2-methyltransferase
SUMT: SAM:Uro'Gen-III-Methyltransferase
Uro'Gen III: Uroporphyrinogen III

Legende der Figuren:

Fig. 1:
Struktur von Coenzym B&sub1;&sub2;; die 5'-Desoxydenosylgruppierung ist durch eine CH&sub3;-Gruppierung für Methylcobalamin, durch eine Cyanogruppierung für Cyanocobalamin, durch eine Hydroxylgruppierung für Hydroxycobalamin ersetzt.
Fig. 2:
Biosynthese der Cobalamine und verschiedene Stufen dieser Biosynthese gemäß der Literatur. X: axiale Liganden von Cobalt; der Ligand in a kann sich von dem Liganden in b unterscheiden. R: Ligand von a von Cobalt, der den Cobalamintyp definiert (siehe Fig. 1).
Fig. 3:
Strukturen von Uro'Gen III, von Präcorrin-1, von Präcorrin-2 und von Präcorrin-3.
Fig. 4:
Formeln, die von Uro'Gen ITI und von Cobyrinsäure entwickelt wurden. Gemäß der Literatur laufen zwischen Uro'Gen III und Cobyrinsäure 8 SAM-abhängige Methylübertragungen sukzessive in C2, C7, C20, CI7, Cl2, C1, C15 und C5, eine Decarboxylierung in C12, die Abspaltung von Kohlenstoff in C20 und die Einfügung des Cobaltatoms statt. X: axiale Liganden von Cobalt; der Ligand in a kann sich von dem Liganden in b unterscheiden.
Fig. 5:
Letzte Stufen der Biosynthese von Cobalaminen. Zur Klarheit des Schemas wurden Einzelheiten des Corrinrings weggelassen. Die fünf enzymatischen Stufen sind dargestellt: 1, Cobinamidkinase; 2, Cobinamidphosphatguanylyltransferase; 3, Cobalamin-5'-phosphatsynthase; 4, Cobalamin-5'- phosphatphosphohydrolase; 5, Nicotinatnukleotid: DMBI-Phosphoribosyltransferase.
Fig. 6:
Restriktionskarten der Fragmente ClaI-HindIII-HindIII- HindIII zu 5,4 kb; EcoRI zu 8,7 kb; SalI-SalI-SalI-SalI- SalI-BalI zu 4748 bp und SstI-SstI-BamHI zu 3855 bp. Es sind nur die 20 Restriktionsenzyme dargestellt, die die DNA weniger häufig spalten. Die Spaltstellen jedes Enzyms sind durch eine vertikale Linie angegeben.
Fig. 7:
Nukleotidsequenz der zwei Stränge des ClaI-HindIII- HindIII-HindIII-Fragments mit 5378 bp von Pseudomonas denitrificans. Der obere Strang ist 5' nach 3' in der Richtung von links nach rechts zu lesen, was der Orientierung von links nach rechts des Fragments der in Fig. 6 dargestellten Restriktionskarte entspricht. Die ClaI-Spaltstelle befindet sich in Position 23 (Beginn der Spaltstelle), weil sich auf dieser Sequenz Restriktionsspaltstellen für PstI, SalI und Xbal befinden, die während der Clonierung an mehreren Stellen im Hinblick auf die Sequenzierung erschienen. Die Sequenz des Fragments ClaI- HindIII-HindIII-HindIII beginnt somit in Position 23.
Fig. 8:
Nukleotidsequenz der zwei Stränge des EcoRI-Fragments mit 8753 bp von Pseudomonas denitrificans. Der oben gelagerte Strang ist 5' nach 3' im Sinne rechts nach links zu lesen, was der Orientierung von links nach rechts des Fragments der in Fig. 6 dargestellten Restriktionskarte entspricht.
Fig. 9:
Analyse der Wahrscheinlichkeiten der codierenden Raster gemäß Codongebrauch unter Verwendung des Programms von Staden und McLachlan (1982) an den 6 Leserastern der Sequenz des Fragments ClaI-HindIII-HindIII-HindIII mit 5378 bp. Für die Leseraster, die auf dem gleichen codierenden Strang erscheinen, entspricht das wahrscheinlichste Raster dem, in dem eine punktierte Linie, die durch Stoppcodons nicht unterbrochen ist, unter der Linie der Wahrscheinlichkeit dieses Rasters angebracht ist.
1. Sequenz von Nukleotid 1 bis Nukleotid 1200. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 1 identifiziert. Es beginnt mit ATG in Position 549 und endet bei TGA in Position 1011.
2. Sequenz von Nukleotid 1000 bis Nukleotid 2200. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 2 identifiziert. Es beginnt bei ATG in Position 1141 und endet bei TGA in Position 1981.
3. Sequenz von Nukleotid 1800 bis Nukleotid 3400. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 3 identifiziert. Es beginnt bei ATG in Position 1980 und endet bei TGA in Position 3282.
4. Sequenz von Nukleotid 3000 bis Nukleotid 4500. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 4 identifiziert. Es beginnt bei ATG in Position 3281 und endet bei TGA in Position 4280.
5. Sequenz von Nukleotid 3800 bis Nukleotid 5378. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 5 identifiziert. Es beginnt bei GTG in Position 4284 und endet bei TGA in Position 5253.
Fig. 10:
Analyse der Wahrscheinlichkeiten der codierenden Raster gemäß Codongebrauch und unter Verwendung des Programms von Staden und MacLachlan (1982) auf die 6 Leseraster des EcoRI-Fragments zu 8753 bp. Für die Raster, die dem gleichen codieren Strang angehören, entspricht das wahrschein lichste Raster dem, in dem eine punktierte Linie angegeben ist, die nicht durch Stoppcodons unterbrochen ist und die unter die Wahrscheinlichkeitslinie dieses Rasters gesetzt ist.
1. Sequenz von Nukleotid 650 bis Nukleotid 1650. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 6 identifiziert. Es beginnt bei ATG in Position 736 und endet bei TAG in Position 1519.
2. Sequenz von Nukleotid 1400 bis Nukleotid 3100. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 76 identifiziert. Es beginnt bei ATG in Position 1620 und endet bei TAG in Position 2997.
3. Sequenz von Nukleotid 2700 bis Nukleotid 3700. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 8 identifiziert. Es beginnt bei ATG in Position 3002 und endet bei TGA in Position 3632.
4. Sequenz von Nukleotid 3500 bis Nukleotid 4100. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 9 identifiziert. Es beginnt bei GTG in Position 3631 und endet bei TGA in Position 4366.
5. Sequenz von Nukleotid 4150 bis Nukleotid 5150. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 10 identifiziert. Es beginnt bei ATG in Position 4365 und endet bei TGA in Position 5127.
6. Sequenz von Nukleotid 5000 bis Nukleotid 6000. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 11 identifiziert. Es beginnt bei ATG in Position 5893 und endet bei TAG in Position 5110.
7. Sequenz von Nukleotid 5700 bis Nukleotid 7200. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 12 identifi ziert. Es beginnt bei ATG in Position 5862 und endet bei TAA in Position 7101.
8. Sequenz von Nukleotid 7000 bis Nukleotid 8000. Dank dieser Analyse wurde das offene Leseraster 13 identifiziert. Es beginnt bei ATG in Position 7172 und endet bei TTG in Position 7931.
Fig. 11:
Konstruktion der Plasmide pXL556, pXL545 undpXL723. Ein ClaI-EcoRV-Fragment zu 2,4 kb, das die cobA- und cobE-Gene enthält, wird aus dem 2,4 kb-Fragment herausgeschnitten und dann gereinigt. Ein EcoRI-Linker wird an die EcoRV- Spaltstelle angefügt, anschließend wird das Fragment in pXL59 zwischen die ClaI-EcoRI-Spaltstellen insertiert. Das so konstruierte Plasmid wird als pXL556 bezeichnet. Die Konstruktion ist für pXL545 vergleichbar: ein ClaI- HindIII-HindIII-Fragment zu 1,9 kb wird aus dem 5,4 kb- Fragment herausgeschnitten, anschließend gereinigt. Dieses Fragment enthält nur das CobE-Gen. Ein EcoRI-Linker wird an die HindIII-Spaltstelle angefügt, anschließend wird das Fragment in pXL59 zwischen die ClaI-EcoRI-Spaltstellen eingefügt.
Das pXL723 wird wie folgt konstruiert: ein EcoRI-HindIII- Fragment zu 2, 3 kb wird aus dem 5, 4 kb-Fragment herausgeschnitten, gereinigt, anschließend werden die Enden mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli aufgefüllt. Dieses Fragment wird in pRK290 cloniert (Ditta et al., 1981), das mit EcoRI gespalten wurde, anschließend mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli behandelt, um die Enden aufzufüllen. Die Restriktionsspaltstellen, die zwischen Klammern dargestellt sind, entsprechen den Spaltstellen, die nach Behandlung mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli verschwunden sind.
1, PstI-SstI-Fragment von RSF1010 (De Graff et al., 1978); 2, PstI-BamHI-Fragment von pACYC177 (Bagdasarian et al., 1981); 3, BamHI-SstI-Fragment, das das Lactoseoperon von E. coli ohne seinen Promotor, den Operator, die Initiationsstelle der Translation und die 8 ersten nichtessentiellen Codons von lacZ enthält (Casadaban et al., 1983); 4, Sau3AI-Fragment von Pseudomonas putida KT2440 (Bagdasarian et al., 1981); ori, Replikationsorigin; nic, Relaxationsstelle; mob, essentieller Ort für die Mobilisation; Kmr, Kanamycinresistenzgen (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S. SstI; Sa, SalI; X, XhoI; Xb, XbaI.
Fig. 12:
Untersuchungen der Insertionen der Transposons Tn5Spr und Tn5 in das 5378 bp-Fragment. Die Insertionen des Transposons Tn5 in das Plasmid pXL723 sind wie in Fig. 14 dargestellt; die des Transposons Tn5Spr in dem Chromosom des Stamms SBL27 Rifr sind mit einem Rahmen versehen; die Insertionen in das Chromosom von SC510 Rifr der Kassetten, die das Kanamycinresistenzgen (1630 und 1631) tragen, sind mit einem Pfeil dargestellt, entsprechend der Transkriptionsorientierung des Kanamycinresistenzgens unter der Ziffer der Insertion. Die offenen Leseraster, die von der Sequenz abgeleitet sind, sind in diese Figur eingetragen (von cobA bis cobE); die Zeichen + oder - sind unter jeder Insertion des Transposons oder der Resistenzkassette dargestellt, um anzuzeigen, ob die Insertion inaktivierend (-) oder nicht (+) für die Komplementation der verschiedenen Mutanten ist (Fall der Insertion des Transposons Tn5) oder ob die Insertion die Produktion der Cobalamine des Stamms, in dem sie stattfindet, aufhebt. Es gibt eine fehlende Komplementation, wenn die synthetisierte rekombinante Mutante weniger als das Dreifache an Cobalaminen synthetisiert als das Syntheseniveau des Stamms, aus dem die Mutante stammt. Die Insertionen der Plasmide pXL545Ω, pXL1500, pXL1397 und pXL302 sind mit den Restriktionsspaltstellen dargestellt, die sich an ihren Enden befinden. Diese Insertionen werden in die Plasmide des Wirts mit breiten Spektren pXL435 und pXL59 cloniert (Cameron et al., 1989).
Das Plasmid pXL545Ω entspricht dem Plasmid pXL545, das in Fig. 11 beschrieben ist, mit zusätlich dem BamHI-Fragment zu 2 kb von pHP45Ω (Prentki und Krisch), das ein Spectinomycinresistenzgen enthält, das in die BamHI-Spaltstelle von pXL545 cloniert wurde.
Das Plasmid pXL1500 entspricht dem BglII-SstI-Fragment zu 4,2 kb, das in dieser Figur dargestellt ist, cloniert an die BamHI- und SstI-Spaltstellen von pKT230 (Bagdasarian et al., 1981), die in Fig. 30 dargestellt ist; pXL1397 entspricht dem HindIII-SstI-Fragment zu 2,4 kb, das in der Figur dargestellt ist und zwischen die HindIII- und SstI- Spaltstellen der Mehrfachspaltstelle von pXL435 insertiert ist (Cameron et al., 1989) und ist in Fig. 30 beschrieben; das Plasmid pXL302 entspricht dem EcoRI-HindIII-Fragment zu 2, 3 kb, wie in der Figur beschrieben, insertiert in die EcoRI- und HindIII-Spaltstellen von pXL59 (Cameron et al.), beschrieben in Fig. 30. Dabei ist die verwendete HindIII-Spaltstelle die Spaltstelle, die sich an der Mehrfachclonierungsstelle von pXL59 befindet; pXL723 ist in Fig. 11, ebenso wie pXL545 beschrieben.
Die Zeichen + oder - sind unter jeder dieser Insertionen dargestellt, um anzugeben, ob eine Komplementation durch das infragekommende Plasmid der unten dergestellten chromosomalen Insertionen vorliegt. C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; RV, EcoRV; Sau, Sau3AI; 5, SstI.
Fig. 13:
Konstruktion der Plasmide pXL253 und pXL367. Das LCoRI- Fragment zu 8,7 kb wird herausgeschnitten, anschließend aus dem Plasmid pXL151 gereinigt. Es wird an die EcoRI- Spaltstelle von pKT230 cloniert, um pXL253 zu ergeben. Dieses gleiche Fragment wird in die EcoRI-Spaltstelle von pRK290 (Ditta et al., 1981) insertiert, wodurch pXL367 erhalten wird. 1, PstI-SstI-Fragment von RSF1010 (De Graff et al. 1978); 2, PstI-BamHI-Fragment von pACYC177 (Bagdasarian et al., 1981); ori, Replikationsorigin; nic, Relaxationsstelle; mob, essentieller Ort für die Mobilisierung (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI, C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S. SstI; 5a, SalI; X, XhoI; Xb, XbaI; tert, Tetracyclinresistenzgen; Kmr, Kanamycinresistenzgen.
Fig. 14:
Untersuchungen der Insertionen der Transposons Tn3lacZ und Tn5 in dem in pRK290 clonierten EcoRI-Fragment zu 8,7 kb (Ditta et al., 1980). Die Insertionen der Transposons Tn3lacZ sind unterstrichen, im Gegensatz zu denjenigen der Transposons TnS. Die von der Sequenz abgeleiteten offenen Leseraster (cobF bis cobM) sind in diese Figur eingetragen und die acht inaktivierenden Insertionsgruppen (numeriert von 1 bis 8) sind dargestellt; die Zeichen + oder - sind unter jeder Insertion des Transposons dargestellt, um anzuzeigen, daß die Insertion inaktivierend (-) oder nicht (+) für die Komplementation der verschiedenen Mutanten ist. Die Komplementation fehlt, wenn die rekombinante Mutante weniger als das Dreifache an Vitamin B&sub1;&sub2; synthetisiert als dem Syntheseniveau des Stammes, aus dem die Mutante sich ableitet, entspricht. Diese inaktivierenden Insertionsgruppen entsprechen den folgenden Mutanten: 1, G615; 2, G614 und G616; 3, 6613 und G614; 4, G620; 5, G638; 6, G610 und G609; 7, G612; 8, G611. Diese Mutanten sind Cob-Mutante von Agrobacterium tumefaciens, die bereits beschrieben wurden (Cameron et al., 1989). Eine Re striktionskarte des Fragments zu 8,7 kb ist im unteren Teil der Figur gezeigt.
Fig. 15:
Die Sequenzen, die jedes der Gene des Fragments 5,4 kb, cobA bzw. cobE, codieren, sind angegeben. Die Sequenz der Proteine cobA bis cobE, die von diesen Sequenzen codiert werden, sind unter ihrer jeweiligen codierenden Sequenz, COBA bis COBE, angegeben. Die Aminosäurezusammensetzung jedes Proteins, bezogen auf Anzahl und Prozentzahl, jeweils von COBA bis COBE sind angegeben, ebenso das Molekulargewicht, der Polaritätsindex, der isoelektrische Punkt, die optische Dichte bei 260 nm und bei 280 nm einer Lösung aus 1 mg/ml des gereinigten Proteins. Das Hydrophilieprofil jedes Proteins, jeweils COBA bis COBE, ist dargestellt; es wurde gemäß dem Programm von Hopp und Woods (1981) berechnet. Die positiven Werte entsprechen Ionen des Proteins, die hydrophil sind. Auf der Abszisse ist die Position der Aminosäuren angegeben, während auf der Ordinate der Wert des Hydrophilieindexes angegeben ist. Wenn dieser Wert positiv ist, zeigt dies an, daß die Region des Proteins hydrophil ist.
Fig. 16:
Die Sequenzen, die jedes der Gene des Fragments zu 8,7 kb, jeweils cobF bis cobM, codieren, sind angegeben. Die Sequenzen der Proteine COBF bis COBM, die von diesen Sequenzen codiert werden, sind unter ihrer Sequenz angegeben. Die Legende ist mit der von Fig. 15 identisch. NB. Das Protein COBF wurde bei ATG in Position 736 gestartet; es ist möglich, daß in Position 751 gelegenes ATG das wahre Initiationscodon dieses Proteins ist.
Fig. 17:
Reaktion, die durch Cobyrinsäure-a,c-diamidsynthase katalysiert wird. Die ACDAS katalysiert die Amidierung der Carbonsäurefunktionen der peripheren Acetatketten a und c der Cobyrinsäure (Hydrogenobyrinsäure), wodurch Cobyrinsäurediamid (Hydrogenobyrinsäurediamid) erhalten wird; der Donator für die Amingruppierung, der in diesem enzymatischen Test verwendet wurde, ist L-Glutamin; er ergibt durch Desaminierung L-Glutaminsäure. X entspricht den axialen Liganden von Cobalt, die sich voneinander unterscheiden können.
Fig. 18:
Reaktion, die durch SP2MT katalysiert wird. SP2MT katalysiert den Transfer von Methyl von SAM auf Dihydrosirohydrochlorin oder Präcorrin-2, wodurch Präcorrin-3 erhalten wird. Die Methylgruppierung wird auf die Position C20 des Porphyrinkerns übertragen.
Fig. 19:
Struktur der Hydrogenobyrinsäure und des Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamids.
Fig. 20:
Affinitäten der Proteine COBA und COBF für SAM. Die Kurven geben in freigewählten Einheiten die Radioaktivität am Ende der TSK-125-Säule für jedes auf diese Säule aufgebrachte Protein an. Die Retentionszeiten sind in Minuten angegeben, und der freiem SAM entsprechende Radioaktivitätspeak wird bei einer Zeit von 10 min 30 s beobachtet.
Fig. 21:
Vergleich der Sequenzen COBA und COBI. Nur die Regionen 1, 2 und 3 mit starker Homologie sind angegeben. Die Zeichen = sind zwischen identischen Resten angegeben und - zwischen homologen Resten (H K R, L I V M, A G S T, Y F W, D E Q N B Z, P, C).
Fig. 22:
Vergleich der Primärsequenzen der Proteine COBA von Pseudomonas denitrificans und CYSG von E, coli. Die Ausrichtung wurde entsprechend dem Programm von Kanehisa, 1984, durchgeführt. Die Zeichen = sind zwischen identischen Resten angegeben und - zwischen homologen Resten (H K R, L I V M, A G S T, Y F W, D E Q N B Z, P, C). Die Regionen 1, 2, 3 entsprechen Zonen starker Homologie zwischen den Proteinen.
Fig. 23:
Vergleich der Sequenzen von CYSG von E. coli mit den COB- Proteinen von Pseudomonas denitrificans (COBA, COBF, COBI, COBJ, COBL und COBM). Die Vergleiche umfassen die Regionen 1, 2 und 3 mit starken Homologien, die zwischen CYSG, COKBA und COBI vorkommen. Die Positionen auf den Proteinsequenzen der Regionen, die Homologien darbieten, sind in der Figur angegeben. Es wurden die folgenden Gruppen mit homologen Resten berücksichtigt: H K R, L I V M, A G S T, Y F W, D E Q N B Z, P, C. Wenn sich in der gleichen Position mindestens 3 homologe Reste befinden, wurden diese Aminosäuren mit einem Rahmen versehen.
Fig. 24:
Konstruktion der Plasmide pXL1148 und pXL1149. PXL1148 wird wie folgt konstruiert: das Fragment BamHI-BamHI-SstI- SstI zu 1,9 kb des Fragments zu 8,7 kb, das die Gene cobH und cob1 enthält, wird gereinigt und die Linker XbaI und EcoRI werden jeweils an die Enden BamHI und SstI angefügt. Dieses Fragment wird anschließend zwischen die XbaI- und EcoRI-Spaltstellen des Plasmids des Wirts mit breitem Spektrum pXL59 insertiert (Cameron et al., 1989), wodurch das Plasmid pXL1148 erhalten wird. PXL1149 wird wie pXL1148 konstruiert, außer daß das anfänglich gereinigte Fragment das Fragment BamHI-BamHI-SstI zu 1,5 kb anstelle des Fragments ist, das außerdem das kleine Fragment SstI zu 400 bp enthält, das für pXL1148 verwendet wird. Das Fragment wird anschließend in gleicher Weise enzymatisch behandelt und ebenso in pXL59 cloniert. 1, PstI-SstI- Fragment von RSF1010 (De Graff et al., 1978), 2, PstI- BamHI-Fragment von pACYC177 (Bagdasarian et al., 1981); 3, BamHI-SstI-Fragment, das das Lactoseoperon von E. coli ohne Promotor, den Operator, die Inititationsstelle der Translation und die 8 ersten nichtessentiellen Codons von lacZ enthält (Casabadan et al., 1983); 4, Sau3AI-Fragment von Pseudomonas putida KT2440 (Bagdasarian et al., 1981); ori, Replikationsorigin; nic, Relaxationsstelle; Kmr, Kanamycinresistenzgen; mob, essentieller Ort für die Mobilisation (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S. SstI; SalI; X, XhoI, Xb, XbaI.
Fig. 25:
Gesamtproteine der Stämme SC510 Rifr, SC510 Rifr pKT230, SC510 Rifr pXL1148, SC510 Rifr pXL1149, analysiert mittels 10%iger SDS -PAGE, wie beschrieben. Die Bakterien wurden 4 Tage in P54-Medium gezüchtet, anschließend wurden Lysate der Gesamtproteine hergestellt. Bahn 1, SC510; Bahn 2, SC510 Rifr pXL1149; Bahn 3, SC510 Rifr pXL1148; Bahn 4, SC510 Rifr pKT230. Die Molekulargewichte der Molekulargewichtsmarker sind angegeben. Die Positionen, bis zu denen die Proteine COBI und COBH wandern, sind angegeben.
Fig. 26:
Konstruktion der Plasmide pXL1496 und pXL1546. Das Plasmid pXL1496 erlaubt die Überexpression des COBF-Proteins bei E. coli, und das Plasmid pXL1546 erlaubt die Überexpression von COBF bei Pseudomonas denitrificans. Das Fragment EcoRI-XhoI von 2, 2 kb wird herausgeschnitten und aus dem 8,7 kb-Fragment gereinigt. Es wird an die E. coli-Spaltstelle des Phagen M13mp19 cloniert, wodurch das Plasmid pXL1405 erhalten wird. Anschließend wird eine NdeI-Spaltstelle durch gerichtete Mutagenese, wie vorstehend beschrieben, an der Position 733 dieses Fragments eingeführt; so befindet sich eine NdeI-Spaltstelle gerade an dem vermutlichen Initiationscodon des cobF-Gens. Das so erhaltene neue Plasmid wird als pXL1406 bezeichnet. Ein NdeI-SphI-SphI-Fragment zu 1,5 kb, das das cobF-Gen von seinem vermutlichen Initiationscodon enthält, wird nach Teilspaltung mit geeigneten Enzymen gereinigt und mit geeigneten Fragmenten des Plasmids pXL694 ligiert (EcoRI- NdeI-Fragment zu 120 pb, enthaltend Expressionssignale von E. coli - siehe Text - und EcoRI-SphI-Fragment zu 3, 1 kb, enthaltend das Ampicillinresistenzgen, die Replikationsfunktionen des Plasmids sowie die Terminatoren des rrnB- Operons von E. coli, wie im Text beschrieben). Das so konstruierte Plasmid wird als pXL1496 bezeichnet. pXL1546 wird wie folgt konstruiert: das EcoRI-BamHI-BamHI-Fragment zu 2 kb von pXL1496 wird durch Teilspaltung mit den geeigneten Enzymen gereinigt. Dieses Fragment enthält die Expressionssignale von E. coli, gefolgt von dem cobF-Gen, anschließend den 5'-Teil des cobG-Gens, dieser wiederum gefolgt von den Terminatoren des Operons rrnB von E. coli, wie im Text beschrieben. Dieses Fragment wird in das Multiwirtplasmid pKT230 (Bagdasarian et al., 1981), das in Fig. 30 beschrieben ist, cloniert, B, BamHI; C, ClaI, E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S. SstI; 5a, SalI; X, XhoI; Xb, XbaI; Kmr, Kanamycinresistenzgen; Amp, Ampicillinresistenzgen.
Fig. 27:
Gesamtproteine der Stämme SC510 Rifr, SC510 Rifr pKT230, SC510 Rifr pXL1546, analysiert mit 10%iger SDS-PAGE, wie beschrieben. Die Bakterien wurden 4 Tage in PS4-Medium gezüchtet, anschließend wurden Gesamtproteinlysate hergestellt. Bahn 1, SC510, Rifr; Bahn 2, SC510 Rifr pKT230; Bahn 3, SC510 Rifr pXL1546. Die Molekülgewichte der Molekulargewichtsmarker sind angegeben. Die Position, an die das COBF-Protein wandert, ist angegeben.
Fig. 28:
Gesamtproteine der Stämme E. coli B und E. coli B pXL1496, analysiert mit 10%iger SDS-PAGE, wie beschrieben. Bahn 1, E. coli pXL1496, gezüchtet in Abwesenheit von Tryptophan, Bahn 2, E. coli pXL1496, gezüchtet unter den gleichen Bedingungen in Gegenwart von Tryptophan, Bahn 3, E. coli, gezüchtet in Abwesenheit von Tryptophan, Bahn 4, E. coli, gezüchtet unter den gleichen Bedingungen in Gegenwart von Tryptophan. Die Molekulargewichte der Marker sind angegeben. Die Position der Wanderung des Proteins COBF ist angegeben.
Fig. 29:
Konstruktion der Plasmide pXL525 und pXL368. pXL368 wird wie folgt konstruiert: das EcoRV-ClaI-Fragment von 2,4 kb (enthaltend die Gene cobA und cobE) wird aus dem Plasmid pXL556 gereinigt (B. Cameron et al., 1989), was den Erhalt dieses Fragments mit einer BamHI -Spaltstelle und einer XbaI-Spaltstellen an den Enden erlaubt; dieses Fragment wird in pXL203 an den BamHI- und XbaI-Spaltstellen cloniert. Für die Konstruktion von pXL525 wird ein Linker XbaI an die EcoRI-Spaltstelle am rechten Ende des EcoRI- Fragments von 8,7 kb eingefügt; dieses EcoRI-XbaI-Fragment zu 8,7 kb wird anschließend mit dem EcoRI-Xbal-Fragment zu 2,4 kb aus pXL556 und enthaltend cobA und cobE cocloniert.
Die Restriktionsspaltstellen, die in Klammern angegeben sind, entsprechen den Stellen, die nach der Behandlung mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli verschwunden sind. 1, PstI-SstI-Fragment von RSF1010 (De Graff et al., 1978); 2, PstI-BamHI-Fragment von pACYC177 (Bagdasarian et al., 1981); ori, Replikationsorigin; nic, Relaxationsstelle; mob, essentieller Ort für die Mobilisierung; Kmr, Kanamycinresistenzgen (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, ClaI, E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S. SstI; 5a, SalI; X, XhoI; Xb, XbaI; tet, Tetracyclinresistenzgen; Ampr und Amp, Ampicillinresistenzgen.
Fig. 30:
Plasmide der Inkompatibilitätsgruppe Q mit großem Wirtsspektrum bei gramnegativen Bakterien. Diese Plasmide sind in einer früheren Publikation (Cameron et al., 1989) angegeben und werden erfindungsgemäß verwendet. 1, PstI- SstI-Fragment von RSF1010 (De Graff et al., 1978); 2, PstI-BamHI-Fragment von pACYC177 (Bagdasarian et al., 1981); 3, BamHI-SstI-Fragment, enthaltend das Lactoseoperon von E. coli ohne Promotor, Operator, Initiationsstelle der Translation und die ersten nichtessentiellen Codons von lacZ (Casadaban et al., 1983); 4, Sau3AI-Fragment von Pseudomonas putida KT2440 (Bagdasarian et al., 1981); ori, Replikationsorigin; nic, Relaxationsstelle; Kmr, Kanamycinresistenzgen; Smr, Streptomycinresistenzgen; mob, essentieller Ort für die Mobilisierung (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S. SstI; Sa, SalI; X, XhoI; Xb, XbaI.
Fig. 31:
Retentionszeiten der verschiedenen Corrinoidstandards (1 mg/Standard) in dem in Beispiel 9 beschriebenen Trennungs system. Die verwendete Säule ist eine Nucleosil-C-18-Saule (Macherey-Nagel). In jedem Absorptionspeak ist eine Nummer, entsprechend dem nachstehend beschriebenen Corrinoid, angegeben. Die Retentionszeit ist auf der Abszisse aufgetragen, und die Absorption bei 371 nm auf der Ordinate. 1, Cobyrinsäure; 2, Cobyrinsäure-a-amid; 3, Cobyrinsäure-g- amid; 4, Cobyrinsäure-a,g-diamid; 5, Cobyrinsäure-c-amid; 6, Cobyrinsäure-c,g-diamid; 7, Cobyrinsäure-a,c-diamid; 8, Cobyrinsäuretriamid; 9, Cobyrinsäuretetraamid; 10, Cobyrinsäurepentaamid; 11, Cobyrinsäure; 12, GDP-Cobinamid; 13, Cobinamidphosphat; 14, Cobinamid; 15, Cyanocobalamin- 5'-phosphat; 16, Cyanocobalamin.
Fig. 32:
Nukleotidsequenz der zwei Stränge des SalI-SalI-SalI-SalI- SalI-Ball-Fragments zu 4748 bp von Pseudomonas denitrificans. Der oben angebrachte Strang ist von 5' nach 3' in der Richtung links nach rechts, was der Orientierung links nach rechts des Fragments der Restriktionskarte, wie in Fig. 6 dargestellt ist, entspricht, zu lesen.
Fig. 33:
Nukleotidsequenz der zwei Stränge des SstI-SstI-BamHI- Fragments zu 3855 bp von Pseudomonas denitrificans. Der oben angeordnete Strang ist von 5' nach 3' in der Richtung links nach rechts zu lesen, was der Orientierung links nach rechts der Fragments der in Fig. 6 dargestellten Restriktionskarte entspricht.
Fig. 34:
Analyse der Wahrscheinlichkeiten der codierenden Raster gemäß Codongebrauch unter Verwendung des Programms von Staden und MacLachlan (1982) an den sechs Leserastern des Fragments SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BlgI zu 4748 bp. Für die Raster, die auf dem gleichen codierenden Strang aufscheinen, entspricht das wahrscheinlichste Raster dem, in dem eine punktierte nicht durch Stoppcodons unterbrochene Linie unter der Linie der Wahrscheinlichkeit dieses Rasters angebracht ist. 4a. Analyse der den Nukleotiden 200 bis 800 entsprechenden Sequenzen. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 14. Es beginnt bei ATG in Position 660 und endet bei TGA in Position 379. 4b. Analyse der Sequenz, die den Nukleotiden 800 bis 1500 entspricht. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 15. Es beginnt bei GTG in Position 925 und endet bei TAA in Position 1440. 4c. Analyse der Sequenz, die den Nukleotiden 1450 bis 2600 entspricht. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 16. Es beginnt bei ATG in Position 1512 und endet bei TGA in Position 2510. 4d. Analyse der den Nukleotiden 2500 bis 4650 entsprechenden Sequenz. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 17. Es beginnt bei GTG in Position 2616 und endet bei TGA in Position 4511.
Fig. 35:
Analyse der Wahrscheinlichkeiten der codierenden Raster gemäß Codongebrauch unter Verwendung des Programms von Staden und MacLachlan (1982) an den sechs Leserastern des Fragments SstI-SstI-BamHI zu 3855 bp. Für die Raster, die dem gleichen codierenden Strang angehören, entspricht das wahrscheinlichste Raster dem, in dem eine punktierte nicht durch Stoppcodons unterbrochene Linie unter die Linie der Wahrscheinlichkeit dieses Rasters angebracht ist. 5a. Analyse der den Nukleotiden 1 bis 905 entsprechenden Sequenz. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 18. Es beginnt bei ATG in Position 809 und endet bei TGA in Position 108. 5b. Analyse der den Nukleotiden 955 bis 2105 entsprechenden Sequenz. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 19. Es beginnt bei ATG in Position 1971 und endet bei TGA in Position 1063. 5c. Analyse der den Nukleotiden 2000 bis 3300 entsprechenden Sequenz. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 20. Es beginnt bei ATG in Position 2099 und endet bei TGA in Position 3115. 5d. Analyse der den Nukleotiden 3250 bis 3855 entsprechenden Sequenz. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 21. Es beginnt bei ATG in Position 3344 und endet bei TGA in Position 3757.
Fig. 36:
Konstruktion der Plasmide pXL233, pXL843 und pXLI558 aus pXL154. Diese Plasmide wurden wie folgt konstruiert. Das EcoRI-Fragment zu 3,5 kb, das das verkürzte cobS-Gen und die stromaufwärtige Sequenz enthält, wird aus pXL154 herausgeschnitten, anschließend gereinigt und in die EcoRI- Spaltstelle von pKT230 cloniert. Das so konstruierte Plasmid wird als pXL233 bezeichnet. Das EcoRI-XhoI-XhoI-Fragment zu 3,5 kb, das das cobT-Gen und die stromabwärtige Sequenz enthält, wird aus pXL154 durch Teilspaltungen herausgeschnitten und gereinigt. Das EcoRI-EcoRI-EcoRI-Fragment zu 4,3 kb, das das cobS-Gen und die stromabwärtige Sequenz enthält, wird aus pXL154 herausgeschnitten und gereinigt, dann mit dem vorstehenden 3,5 kb-Fragment ligiert. Das EcoRI-XhoI-Fragment zu etwa 8 kb, das so erhalten wurde, wird in die EcoRI- und SalI-Spaltstellen von pXL59 cloniert, um das Plasmid pXL843 zu erzeugen. Das Plasmid pXL1558 wird wie folgt konstruiert: das HindIII- HindIII-Fragment zu 12 kb wird aus pXL154 herausgeschnitten und gereinigt, anschließend werden die Enden durch das große Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli aufgefüllt. Diese Insertion wird in pRK290 (Ditta et al., 1981), das mit EcoRI gespalten worden war, cloniert, mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli behandelt, um glatte Enden zu erzeugen. Die Restriktionsspaltstellen, die zwischen Klammern angegeben sind, ent sprechen den Spaltstellen, die im Verlauf der Clonierung verschwunden sind. 1, PstI-SstI-Fragment von RSF1010 (Degraff et al., 1978); 2, PstI-BamHI-Fragment von pACYC177 (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S. SstI; 5a, SalI; X, XhoI; Xb, XbaI; Tet, Tetracyclinresistenzgen; Kmr, Kanamycinresistenzgen; Smr, Streptomycinresistenzgen.
Fig. 37:
Untersuchung der Insertionen des Transposons Tn5Sp in die HindIII-HindIII-Insertion von 12 kb von pXL154. Die Insertionen des Transposons sind in der Insertion HindIII- HindIII zu 12 kb, cloniert in pXL1558, kartographiert. Die chromosomalen Insertionen in dem Stamm SC510 Rifr sind mit einem Rahmen versehen, diejenigen, bei denen dies nicht der Fall ist, sind in den Stamm SBL27 Rifr eingeführt. Ein Plus- oder Minuszeichen ist unter jeder Insertion angegeben, um den Cob-Phänotyp des Stamms mit dieser Insertion zu bezeichnen. Das Fehlen der Komplementation (oder die Komplementation) des Stamms G2034 durch die Plasmide pXL1558::Tn5Sp ist durch Minus(oder Plus-)-zeichen unter jeder Insertion angegeben. Die Insertionen der Plasmide, die in Fig. 36 beschrieben sind, sind dargestellt. Die Zeichen plus (oder minus) über diesen Plasmiden, die mit den Insertionen der Transposons angeordnet sind, schematisieren die Komplementation (oder das Fehlen) des durch das Transposon mutierten Stamms in dem Plasmid. Die von der Sequenz abgeleiteten offenen Leseraster sind auch in dieser Figur eingetragen (ORF14 bis 17 sowie die entsprechenden cob-Gene (cobS und cobT). E, EcoRI; H, HindIII; X, XhoI.
Fig. 38:
Konstruktion der Plasmide pXL1286, pXL1303, pXL1324, pXL1490B und pXL1557 aus pXL519. Die Position des sequenzierten Fragments ist in dem oberen Teil der Figur über der Restriktionskarte des Clusters angegeben; es handelt sich um SstI-SstI-BamHI zu 3,9 kb. Die Plasmide werden wie folgt konstruiert. Das BglII-EcoRI-Fragment zu 2 kb, das das cobtJ-Gen und die stromabwärtige Sequenz enthält, wird aus pXL519 herausgeschnitten, anschließend gereinigt und in die BamHI- und EcoRI-Spaltstellen von pKT230 cloniert, um das Plasmid pXL1286 zu ergeben. Das SstI-EcoRT-Fragment zu 2,7 kb, das das verkürzte cobV-Gen, das cobU-Gen und die stromabwärtige Sequenz enthält, wird aus pXL519 herausgeschnitten, anschließend gereinigt und in die SstI- und EcoRI-Spaltstellen von pKT230 cloniert, um das Plasmid 1324 zu erhalten. Das SstI-SstI-Fragment zu 1,6 kb, das das verkürzte cobV-Gen und die stromaufwärtige Sequenz enthält, wird aus pXL519 herausgeschnitten, anschließend gereinigt und in die SstI-Spaltstelle von pKT230 cloniert, um das Plasmid pXL1303 zu ergeben. Das SstI-SstI-BamHI- Fragment zu 3,85 kb wird nach vollständiger Spaltung von pXL519 durch BamHI und Teilspaltung mit SstI gereinigt. Dieses Fragment wird anschließend in die BamHI- und SstI- Spaltstelle von pKT230 cloniert, um pXL1490B zu ergeben. Das Plasmid pXL1557 wird wie folgt konstruiert: das HindITI-BamHT-Fragment zu 9 kb wird aus pXL519 herausgeschnitten und gereinigt, anschließend werden die Enden mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli aufgefüllt. Diese Insertion wird in pRK290 (Ditta et al., 1981), gespalten durch EcoRI, cloniert, anschließend mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli behandelt, um glatte Enden zu erzeugen. Die Restriktionsspaltstellen, die zwischen Klammern angegeben sind, entsprechen den Spaltstellen, die im Verlauf der Clonierung verschwunden sind. 1, PstI-SstI-Fragment von RSF1010 (Degraff et al., 1978); 2, PstI-BamHI-Fragment von pACYC177 (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; Bg, BglII; C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S. SstI; 5a, SalI, X, XhoI; Xb, XbaI; Tetr, Tetracyclinresistenzgen; kmr, Kanamycinresistenzgen; Smr, Streptomycinresistenzgen.
Fig. 39:
Untersuchung der Insertionen des Transposons TnSSp in die Insertion HindIII-BamHI zu 9 kb von pXL519. Die Insertionen des Transposons sind in der Insertion HindIII-BamHI von 9 kb kartographiert und in pXL1557 cloniert. Die chromosomalen Insertionen in den Stamm SC510 Rifr sind mit einem Rahmen versehen, und diejenigen, bei denen dies nicht der Fall ist, sind in den Stamm SBL27 Rifr eingeschleust. Ein Plus- oder Minuszeichen ist unter jeder Insertion angegeben, um den Cob-Phänotyp des Stamms mit der Insertion anzugeben. Das Fehlen der Komplementation (oder die Komplementation) des Stamms G2040 durch die Plasmide pXL1557::Tn5Sp ist durch die Zeichen minus (oder plus) unter jeder Insertion angegeben. Die Insertionen der Plasmide, die in Fig. 6 beschrieben sind, sind dargestellt. Die Zeichen plus (oder minus) über diesen Plasmiden, die mit diesen Insertionen in das Transposon angeordnet sind, schematisieren die Komplementation (oder das Fehlen) des mutierten Stamms in dem Transposon durch das Plasmid. Die offenen Leseraster, die von der Sequenz abgeleitet sind, sind ebenfalls in diese Figur eingetragen (ORF18 bis 21) sowie die entsprechenden cob-Gene (cobU und cobV).
Fig. 40:
Sequenzen, die jedes der Gene des 4,8 kb-Fragments, d. h. cobX, cobS und cobT, codieren, sind angegeben. Die Sequenz der Proteine COBX, COBS und COBT, die von diesen Sequenzen codiert werden, sind unter den jeweiligen codierenden Sequenzen cobX, cobS und cobT angegeben. Die Legende ist mit der von Fig. 15 identisch.
Fig. 41:
Codierende Sequenzen für jedes der Gene des 3,9 kb-Fragments, d. h. cobu und cobV, sind angegeben. Die Sequenz der Proteine COBU und COBV, die von diesen Sequenzen codiert werden, ist unter den jeweiligen codierenden Sequenzen cobU und cobV angegeben. Die Legende ist identisch mit der von Fig. 15.
Fig. 42:
A. Gesamtproteine der Stämme E. coli BL21 pLysS pET3b, E. coli BL21 pLysS pXL1937, analysiert mittels 10%iger SDS- PAGE. Bahn I, BL21, pLyspET3b; Bahn 2, E. coli BL21 pLysS pXL1937.
B. Gesamtproteine der Stämme E. coli BL21, E. coli BL21 pXL1874 und E. coli BL21 pXL1875, analysiert mittels 10%iger SDS-PAGE. Bahn 1, E. coli BL21; Bahn 2, E. coli BL21 pXL1874; Bahn E. coli BL21 pXL1875.
Die Molekulargewichte der Marker sind angegeben. Die dem überexprimierten Protein entsprechende Bande ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Fig. 43:
Nukleotidsequenz der zwei Stränge des Fragments SstI-SstI- SstI-SstI-SstI-BglII-BglII zu 13144 bp von Pseudomonas denitrificans. Der oben angebene Strang ist von 5' nach 3' im Sinne links nach rechts zu lesen, was der Orientierung links nach rechts des Fragments der in Fig. 46 dargestellten Restriktionskarte entspricht.
Fig. 44:
Restriktionskarte des Fragments SstI-SstI-SstI-SstI-BglII- SstI-BqlII zu 13144 bp von Pseudomonas denitrificans. Die Position(en) der laufenden Restriktionsspaltstellen ist/sind in zunehmender Größenordnung der Anzahl der Spaltungen an dem sequenzierten Fragment angegeben. Die Positionen entsprechen der in Fig. 43 dargestellten Sequenz.
Fig. 45:
Analyse der Wahrscheinlichkeiten der codierenden Raster gemäß Codongebrauch unter Verwendung des Programms von Staden und MacLachlan (1982) an den sechs Leserastern des Fragments SstI-SstI-SstI-SstI-BcrlII-SstI-BglII zu 13144 bp von Pseudomonas denitrificans. Für die Raster, die dem gleichen codierenden Strang angehören, entspricht das wahrscheinlichste Raster demjenigen, in dem eine punktierte, nicht durch Stoppcodons unterbrochene Linie unter die Linie der Wahrscheinlichkeit dieses Rasters angegeben ist.
1. Sequenz entsprechend den Nukleotiden 1 bis 2266. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 22. Es beginnt bei ATG in Position 429 und endet bei TAG in Position 1884.
2. Sequenz entsprechend den Nukleotiden 2266 bis 4000. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 23. Es beginnt bei ATG in Position 3364 und endet bei TGA in Position 3886.
3. Sequenz entsprechend den Nukleotiden 3800 bis 5000. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 24. Es beginnt bei ATG in Position 3892 und endet bei TAG in Position 4954.
4. Sequenz entsprechend den Nukleotiden 5000 bis 9000. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 25. Es beginnt bei ATG in Position 5060 und endet bei TAG in Position 8885.
5. Sequenz entsprechend den Nukleotiden 9000 bis 9700. Diese Analyse erlaubt die Identifikation des offenen Leserasters 26. Es beginnt bei ATG in Position 9034 und endet bei TGA in Position 9676.
6. Sequenz entsprechend den Nukleotiden 9600 bis 13144. Diese Analyse erlaubt die Identifikation der offenen Leseraster 27, 28, 29 und 30. Sie beginnen jeweils bei ATG in Position 9678, 10895, 11656 und 13059 und enden bei den Stoppcodons in Position 10101, 10304, 12181 und 12366. Die offenen Leseraster 28 und 30 befinden sich auf dem Komplementärstrang des codierenden Strangs entsprechend allen anderen offenen Leserastern.
Fig. 46:
EcoRI-BQIII-EcoRI-BglII-Fragment zu 13,4 kb, Positionen der Insertionen der Transposons TnSSp auf dem EcoRI-Fragment von 9,1 kb, Positionen der Insertionen der Transposons Tn5 in der Insertion des Plasmids pXL189 sowie der Insertionen verschiedener Plasmids, die während der Komplementationsversuche der Stämme SC510 Rifr::Tn5Sp verwendet wurden. Die Komplementationen der Mutanten SC510 Rifr::Tn5Sp durch die Plasmide sind angegeben (+) zwischen 5% und 100% der Höhe des Elternstamms, 5C510 Rifr-, ( )Teilkomplementation zwischen 0,5 bis 5% der Höhe des Stamms SC10 Rifr-, oder (-) Fehlen von Komplementation, d. h. weniger als 1000fach weniger als 5C510 Rifr, positioniert genau unter die Bahnen, die die Insertion der Plasmide schematisieren und ausgerichtet mit den Insertionsstellen der entsprechenden Mutanten. Unter Kartographie der Insertionen der Transposons Tn5 in die Insertion des Plasmid pXL189 ist die Komplementation (+) oder das Fehlen der Komplementation (-) dieser mutierten Plasmide für die Mutanten Acrrobacterium tumefaciens angegeben. Im rechten Teil der Figur befindet sich eine Tabelle, die die Komplementation der Mutanten G622, G2623 und G630 (Cameron et al., 1989) durch verschiedene Plasmide angibt: (+) vollständige Komplementation, 100% der Höhe des Elternstamms, C58C9 Rifr-, ( )-Teilkomplementation zwischen 10 und 50% der Höhe von C58C9 Rifr- oder (-) -Fehlen der Komplementation.
Die verschiedenen Plasmide, deren Insertion dargestellt ist, werden wie folgt konstruiert (die Fragmente sind entweder aus pXL156 oder aus pXL157 herausgeschnitten):
pX1618 entspricht dem EcoRI-BamHI-Fragment zu 2,5 kb, cloniert in die gleichen Spaltstellen von pKT230 (Bagdasarian et al., 1981);
pXL593 entspricht dem BamHI-Fragment zu 3,1 kb, cloniert in die BamHI-Spaltstelle von pKT230 (Bagdasarian et al., 1981);
pXL623 entspricht dem BamHI-XhoI-Fragment zu 1,9 kb, cloniert in die BamHI-Sstl-Spaltstellen von pXL59 (Cameron et al., 1989);
pXL1909 entspricht dem BamHI-BamHI-BamHI-Fragment zu 8,4 kb, cloniert in die BamHI-Spaltstelle von pKT230 (Bagdasarian et al., 1981);
pXL221 entspricht dem EcoRI-ClaI-Fragment zu 1,6 kb, cloniert in die gleichen Spaltstellen von pXL59 (die ClaI- Spaltstelle, in die dieses Fragment cloniert ist, ist die ClaI-Spaltstelle der Mehrfachspaltstelle von pXL59 (Cameron et al., 1989);
pXL1908 und 1938 entsprechen der gleichen Insertion, XhoI- BamHI-BamHI-Fragment zu 6,5 kb, an das XbaI-Linker angefügt wurden; diese Insertion wird in den zwei Orientierungen in die XbaI-Spaltstelle von pXL435 (Cameron et al. 1989) cloniert; ein über der Figur positionierter Pfeil zeigt die Position des Kanamycinresistenzgens gegenüber den Enden der Insertion der zwei Plasmide an;
pXL208 entspricht dem BamHI-Fragment zu 5,2 kb, cloniert in die BamHI-Spaltstelle von pKT230 (Bagdasarian et al., 1981);
pXL297 entspricht dem EcoRI-Fragment zu 9,1 kb, cloniert in die EcoRI-Spaltstelle von pKT230 (Bagdasarian et al., 1981).
Die offenen Leseraster (PO), definiert durch die Sequenzierung des Fragments (PO 22 bis 30), sind angegeben, ebenso die entsprechenden cob-Gene; ein Pfeil zeigt die Polarität der Transkription an.
E, EcoRI, B, BamHI, Bg, BctlII, Cl, ClaI, Sau, Sau3Al, X, XhoI.
Fig. 47:
Codierende Sequenzen für jedes der Gene des Fragments zu 13, 4 kb, d. h. cob, cobP und cobW, cobN und cobO s ind angegeben. Die Sequenz der Proteine COBQ, COBP, COBW, COBN und COBO, die von diesen Sequenzen codiert werden, sind unter ihrer jeweiligen codierenden Sequenz cob, cobP und cobW, cobN und cobO angegeben. Die Legende ist mit der von Fig. 15 identisch.
Fig. 48:
A: NH2-terminale Sequenz von SUMT von M. ivanovii und Sequenz der Oligonukleotide 923 946, 497; - bezeichnet, daß an dieser Position der Rest nicht bestimmt werden konnte; für das Antisens-Oligonukleotid entsprechen die über der Sequenz angezeigten Aminosäuren den angegebenen Anticodons. B: Darstellung der enzymatischen Amplifikation eines internen Fragments des Strukturgens von SUMT von M. ivanovii mit den Oligonukleotiden 946 und 947.
Fig. 49:
Konstruktion der rekombinanten replikativen Form pG10. Das 615 bp Fragment, das durch Amplifikation erhalten wurde, wird mit HindIII und EcoRI gespalten, anschließend wie beschrieben gereinigt. Dieses Fragment wird anschließend mit der replikativen Form des Phagen M13mp19, der durch die gleichen Enzyme gespalten wurde, ligiert. Der rekombinante Clon wird wie im Text beschrieben aufgefunden.
Fig. 50:
Autoradiographie eines genomischen DNA-Blots von M. ivano vii, gespalten mit verschiedenen Enzymen, getrennt mittels Agarosegelelektrophorese, anschließend auf Nylonmembran überführt, wie vorstehend beschrieben. Die Membran wird mit der Sonde pG10 wie vorstehend beschrieben hybridisiert. 1, HindIII-BglII; 2, KnpI-BglII; 3, EcoRI- BglII; 4, BglII-PstI. Die Größen der verschiedenen Fragmente, die mit der Sonde hybridisieren, sind in kb angegeben.
Fig. 51:
Nukleotidsequenz der zwei Stränge des Fragments von 955 bp von M. ivanovii. Der oben angegebene Strang ist von 5' nach 3' in der Richtung links nach rechts zu lesen.
Fig. 52:
Codierende Sequenz des corA-Gens von M. ivanovii, erhalten von der 955 bp Sequenz. Die Primärsequenz des CORA-Proteins ist ebenfalls angegeben. Die Aminosäuren sind über ihrem Codon angegeben, und das Stoppcodon ist mit einem Stern gekennzeichnet. Die hauptsächlichen physikalischen Eigenschaften des CORA-Proteins von M. ivanovii, d. h. die Aminosäurezusammensetzung in Zahl und Prozent, das Molekulargewicht, der Polaritätsindex, der isoelektrische Punkt, die optische Dichte bei 280 nm einer Lösung aus 1 mg/l gereinigtem Protein sind angegeben. Das Hydrophobieprofil des CORA-Proteins von M. ivanovii; dieses Profil wurde ge mäß dem Programm von Hopp und Woods (1981) durchgeführt. Die positiven Werte entsprechen Regionen des Proteins, die hydrophil sind. Die Position der Aminosäuren ist auf der Abszisse angegeben, und auf der Ordinate ist der Hydrophobiewert angegeben; wenn dieser Wert positiv ist, bedeutet dies, daß diese Region des Proteins hydrophil ist.
Fig. 53:
Vergleich der Primärsequenzen der Proteine COBA von P. denitrificans und CORA von M. ivanovii. Die Proteine wurden mit dem Kanehisa-Programm (1984) angeordnet. = 1 identische Aminosäuren; -, homologe Aminosäuren gemäß den vorstehend definierten Kriterien (siehe Fig. 22 und 23).
Fig. 54:
Konstruktion der Plasmide pXL1832 und pXL1841.
Die beschriebenen Legenden, die auf der Figur angegeben sind, erlauben die Verfolgung der Konstruktionen.
Allgemeine Clonierungstechniken der Molekularbiologie und der Biochemie.
Die klassischen Methoden der Molekularbiologie, wie Plasmid-DNA-Zentrifugation in Caesiumchlorid-/Ethidiumbromidgradienten, die Spaltungen mit den Restriktionsenzymen, die Gelelektrophorese, die Elektroelution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen, die Transformation in E. coli etc. sind in der Literatur beschrieben (Maniatis et al., 1982, Ausubel et al., 1987).
Die Restriktionsenzyme wurden von New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) oder Amersham Ltd. (Amersham) geliefert. Die Oligonukleotid linker wurden von Biolabs bezogen. Für die Ligierungen wurden die DNA-Fragmente gemäß ihrer Größe auf 0,7%igen Agarose- oder 8%igen Acrylamidgelen getrennt, durch Elektroelution gereinigt, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt, anschließend in einem Puffer aus Tris-HCl pH 7, 4 50 mM, MgCl&sub2; 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM in Gegenwart von DNA-Ligase des T4-Phagen (Biolabs) inkubiert. Gegebenenfalls werden die DNA-Fragmente mit überstehenden 5'-Enden mit einer Behandlung mit alkalischer Kälberdarmphosphatase (CIP, Pharmacia) bei 37ºC während 30 min in dem folgenden Puffer dephosphoryliert: Glycin 100 mM, MgCl&sub2; 1 mM, ZnCl&sub2; 1 mM, pH 10,5. Die gleiche Technik wird für die Dephosphorylierung der 3'-überstehenden oder freien Enden verwendet, aber die Behandlung dauert 15 Minuten bei 37ºC, anschließend 15 Minuten bei 56ºC. Das Enzym wird durch 15minütiges Erhitzen des Reaktionsgemisches bei 68ºC in Gegenwart von 1% SDS und 100 mM NaCl, gefolgt von einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanolfällung, inaktiviert. Die Auffüllung der überstehenden 5'-Enden wird mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli durchgeführt (Biolabs). Die Reaktion wird bei Umgebungstemperatur während 30 Minuten in einem Puffer aus Tris HCl pH 7,2 50 mM, dNTPs 0,4 mM, MgSO&sub4; 10 mM, DTT 0,1 mM, BSA 50 mg/ml durchgeführt. Die Auffüllung der überstehenden 3'-Enden wird in Gegenwart von DNA-Polymerase des T4-Phagen (Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Hersteller durchgeführt. Die Spaltung der überstehenden 5'-Enden wird durch limitierte Behandlung mit 51-Nuklease (BRL) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Oligonukleotidlinker werden an die Enden der DNA-Fragmente, wie bereits beschrieben (Maniatis et al., 1982), angefügt. Die in-vitro-Mutagenese durch Oligodesoxynukleotide wird gemäß dem von Taylor et al., 1985, entwickelten Verfahren unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits durchgeführt. Die ligierten DNAs werden zur Transformation des kompetent gemachten Stamms verwendet: E. coli MC1060 [Δ(lacIOPZYA)X74, galU, galK, strAr, hsdR] für die Plasmide oder E. coli TG1[Δ(lac proA,B), supE, thi, hsdD5/F' traD36, proA+, B+, laclq, lacZΔM15] für die replikativen Formen der von dem Bakteriophagem M13 abgeleiteten Phagen. Die Plasmid-DNAs werden gemäß der Technik von Birmboim und Doly, 1979, gereinigt. Die Minipräparationen von Plasmid-DNA werden gemäß dem Protokoll von Klein et al., 1980, vorgenommen. Die chromosomalen DNA-Präparationen von gramnegativen Bakterien werden, wie bereits beschrieben (Cameron et al., 1989), durchgeführt. Die radioaktiven Sonden werden durch Translation der Spaltung, gefolgt von dem bereits dargelegten Verfahren (Rigby et al., 1977) hergestellt. Die Hybridisierungen zwischen DNA-Sequenzen sowie die Immobilisierung der Nukleinsäuren auf Nitrocellulosemembranen werden, wie beschrieben (Cameron et al., 1989), durchgeführt. Bei Clonierungen, bei denen eine geringe Wahrscheinlichkeit besteht, den gesuchten rekombinanten Clon aufzufinden, werden diese nach Hybridisierung auf einem Filter, wie bereits beschrieben, durchgeführt (Maniatis et al. 1982). Die Nukleotidsequenz der DNA-Fragmente wird nach dem Kettenterminationsverfahren (Sanger et al., 1977) durchgeführt. In dem Reaktionsgemisch wird dGTP durch 7-Deaza-dGTP ersetzt, um Kompressionen der Banden während der Elektrophorese auf Acrylamidgel, hervorgerufen durch einen erhöhten GC-Prozentsatz der DNA, zu vermeiden. Die für den biologischen Teil verwendeten Kulturmedien wurden bereits dargelegt (Maniatis et al., 1982). Die Kulturen im PS4-Medium werden wie bereits beschrieben durchgeführt (Cameron et al., 1989); die Stämme von Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr und G2 Rifr werden in PS4-Medium wie folgt gezüchtet: 250 ml Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 25 ml PS4-Medium, gegebenenfalls mit einem Selektiv-Antibiotikum für das von jedem Stamm getragene Plasmid, werden mit einer 1/100-Verdünnung der an L-Medium gesättigten Vorkultur (Miller 1972) mit gegebenenfalls dem Selektiv- Antibiotikum für das von jedem Stamm getragene Plasmid beimpft. Diese Kulturen werden sechs Tage bei 30ºC inkubiert, anschließend werden die Kulturbrühen auf ihren Ti ter an Cobalaminen oder die enzymatische Aktivität bestimmter Enzyme des Stoffwechselwegs untersucht. Die Stämme von Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas putida und Rhizobium melioti werden bei 30ºC gezüchtet; außer speziell angegeben, werden sie in L-Medium gezüchtet. Die bakteriellen Konjugationen werden wie bereits beschrieben durchgeführt (Cameron et al., 1989). Die Extrakte von Gesamtproteinen werden wie bereits beschrieben durchgeführt (Ausubel et al., 1987). Die Elektrophoresen (SDS-PAGE) der Analyse der Proteine auf Acrylamidgel unter denaturierenden Bedingungen werden wie bereits beschrieben durchgeführt (Ausubel et al., 1987). Das PhastSystem-Gerät (Pharmacia) unter Verwendung des diskontinuierlichen Puffersystems von Laemli (Laemli, 1970) wird ebenfalls verwendet; verschiedene Gele werden als Funktion der Molekulargewichte der zu analysierenden Proteine sowie ihrer Reinheit verwendet: PhastGel-Gradient 8-25 PhastGel-homogen 12,5. Die Färbung wird entweder in Coomassieblau oder mit Hilfe von PhastGel Blue R (Pharmacia) oder mit Silbernitrat unter Verwendung des PhastGel-Silberkits (Pharmacia) entsprechend den Angaben des Herstellers vorgenommen. Die NH&sub2;-terminalen Sequenzen der Proteine werden durch die Edman-Abbautechnik unter Verwendung eines automatisierten Sequenziergeräts (Applied Biosystems, Model 407A), gekoppelt an einen HPLC-Apparat, zur Identifikation der Phenylthiohydantoinderivate bestimmt.

BEISPIEL 1 - Isolierung der DNA-Fragmente von P. denitrificans, die die Cob-Gene enthalten

Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung der DNA-Fragmente von Pseudomonas denitrificans, die die Cob-Gene tragen. Diese Fragmente wurden durch Komplementationsversuche von Cob-Mutanten von A. tumefaciens und P. putida nachgewiesen (Cameron et al., 1989).
Diese Cob-Mutanten wurden durch Mutagenese mit N-Methyl-N- nitrosoguanidin gemäß der Technik von Miller (Miller et al., 1972) oder durch Insertionen des Transposons Tn5 erhalten. So wurden Stämme, die Cobalamine nicht synthetisieren können, und insbesondere die Mutante cob G572 von P. putida und die Mutanten Cob G159, G161, G164, G169, G171, G258, G609, G610, G611, G612, G613, G614, G615, G616, G620, G622, G623, G630, G632, G633, G634, G638, G642, G643, G2034, G2035, G2037, G2038, G2039, G2040, G2041, G2042 und G2043 von A. tumefaciens hergestellt.
Parallel wurde eine genomische DNA-Bank von P. denitrificans in einem in eine Vielzahl von Wirte mobilisierbaren Vektor pXL59 durch Spaltung von 5 ug DNA in Gegenwart von Restriktionsenzymen durchgeführt (Cameron et al., 1989).
Durch Komplementation konnten mehrere Plasmide isoliert werden, die die Komplementation der cob-Mutanten von P. putida und A. tumefaciens erlauben. Unter diesen werden insbesondere die Plasmide pXL154, pXL156, pXL157 und pXL519 festgestellt.
Diese Plasmide wurden isoliert, und die DNA-Fragmente konnten herausgeschnitten, gereinigt und mittels Restriktionsspaltung analysiert werden. Diese Fragmente sind in den Fig. 6 und 44 dargestellt: ein ClaI-HindIII- HindIII-HindIII-Fragment zu 5,4 kb, ein EcoRI-EcoRI-Fragment zu 8,7 kb, ein SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI-Fragment zu 4, 8 kb, ein SstI-SstI-BamHI-Fragment zu 3,9 kb und ein EcoRI-BglII-EcoRI-BglII-Fragment zu 13,4 kb.

BEISPIEL 2 - Sequenzierung der isolierten DNA-Fragmente

Dieses Beispiel erläutert die Sequenzierung der DNA-Fragmente, die die cob-Gene von Pseudomonas denitrificans SC510 tragen.

2. 1. Sequenzierung eines ClaI-HindIII-HindIII-HindIII- Fragments zu 5,4 kb

Dieses Fragment ist in dem Plasmid pXL157, das in Beispiel 1 beschrieben ist, enthalten. Nach Exzision wurden Subfragmente des 5,4 kb-Fragments in die Phagen M13mp18 oder M13mp19 (Norrander et al., 1983) oder M13tg130 oder M13tg131 (Kieny et al., 1983) in beiden Orientierungen cloniert. Deletionen wurden anschließend in vitro nach dem Henikoff-Verfahren (1987) durchgeführt. Diese Deletionen wurden anschließend mit dem Universalprimer als Synthesestarter der Kettenterminationsreaktionen sequenziert. Die Ausbeute zwischen diesen verschiedenen Deletionen erlaubte die Ermittlung der Gesamtsequenz aus den zwei Strängen des 5,4 kb-Fragments (Fig. 7). Dieses Fragment umfaßt 5378 bp. In der in Fig. 7 beschriebenen Sequenz sind vor der ClaI-Spaltstelle drei Restriktionsspaltstellen (PstI, SalI und XbaI) angegeben, die während der Clonierung des infragekommenden Fragments im Hinblick auf die Sequenzierung in den Mehrfachclonierungsstellen aufgetreten sind. Während in der Folge erfindungsgemäß auf die Sequenz dieses Fragments ClaI-HindIII-HindIII-HindIII Bezug genommen wird, ist dies die Sequenz, die in Fig. 7 dargestellt ist, in der die 22 ersten Basen nicht der DNA von Pseudomonas denitrificans entsprechen (sowie alle Positionen der Restriktionsspaltstelle oder der Beginn des offenen Leserasters sich auf die in Fig. 7 dargestellte Sequenz beziehen).

2.2. Nukleotidsequenz eines EcoRI-EcoRI-Fragments zu 8,7 kb

Dieses Fragment ist in pXL151, der in Beispiel 1 beschrieben ist, enthalten. Die EcoRI-Spaltstelle sowie die 70 benachbarten Basenpaare, die rechts von diesem Fragment gelegen sind, stammen von pXL59, das der Vektor ist, der zur Konstruktion von pXL151 durch Clonierung eines Sau3A1- Fragments von Pseudomonas denitrificans SC510 gedient hat. Nach Extraktion wurden Subfragmente des 8,7 kb-Fragments in die Phagen M13mp18 oder M13mp19 (Norrander et al., 1983) oder M13tg130 oder M13tg131 in den beiden Orientierungen (Kieny et al., 1983) cloniert. Deletionen wurden anschließend in vitro nach dem Henikoff-Verfahren (1987) durchgeführt. Diese Deletionen wurden anschließend mit dem Universalprimer als Synthesestarter der Kettenabbruchreaktionen sequenziert. Die Ausbeute zwischen den verschiedenen Deletionen erlaubte die Ermittlung der vollständigen Sequenz des 8,7 kb-Fragments auf den zwei Strängen (Fig. 8). Dieses Fragment umfaßt 8753 bp.

2.3. Sequenzierung eines SalI-Sall-SalI-SalI-SalI-BglI- Fragments zu 4,8 kb

Dieses Fragment ist in dem Plasmid pXL154, das in Beispiel 1 beschrieben ist, enthalten. Das Protokoll ist dem in Beispiel 2.2 verwendeten identisch. Die Gesamtsequenz auf den zwei Strängen des 4,8 kb-Fragments ist in Fig. 32 dargestellt. Dieses Fragment enthält 4749 bp.

2.4. Nukleotidsequenz eines SstI-SstI-BamHI-Fragments zu 3,9 kb

Dieses Fragment ist in dem Plasmid pXL519, das in Beispiel 1 beschrieben wurde, enthalten. Das Protokoll ist mit dem, das in Beispiel 2.2. verwendet wurde, identisch. Die Gesamtsequenz auf diesen zwei Strängen des 3,9 kb- Fragments ist in Fig. 33 dargestellt. Dieses Fragment enthält 3855 bp.

2.5. Nukleotidsequenz eines EcoRI-BculII-ECORI-BQIII-Fragments zu 13,4 kb

Dieses Fragment ist in den Plasmiden pXL156 und pXL157, die in Beispiel 1 beschrieben sind, enthalten. Das verwendete Protokoll ist mit dem von Beispiel 2.2. identisch. Die Sequenz auf den zwei Strängen des 13,15 kb-Fragments ist in Fig. 43 dargestellt. Sie entspricht der Gesamtsequenz des 13,4 kb-Fragments bis auf 250 bp, die einem EcoRI-SstI-Fragment entsprechen, und sich am linken Ende davon befinden.
Aus diesen Nukleotidsequenzen wurden Restriktionskarten für die Enzyme, die weniger häufig spalten (Fig. 6 und 44) erhalten. Der Prozentsatz an GC-Basen der DNA von Pseudomonas denitrificans ist relativ erhöht (65,5%) und wird durch Kompressionen auf die Sequenzgele übertragen. Um diese Probleme zu vermeiden, gibt es zwei Lösungen:
i) Verwendung von 7-Deaza-dGTP anstelle von dGTP in den Sequenzreaktionen, um die Sekundärstrukturen zu vermeiden, die sich während der Elektrophorese in dem Sequenzgel bilden und
ii)Sequenzierung der zwei Stränge.

BEISPIEL 3 - Analyse dieser Nukleotidsequenzen: Bestimmung der offenen Leseraster

Die Nukleotidsequenzen der Fragmente ClaI-HindIII-HindIII- HindIII zu 5,4 kb (Fig. 7), EcoRI-EcoRI zu 8,7 kb (Fig. 8), SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI zu 4,8 kb (Fig. 32), SstI-SstI-BamHI zu 3,9 kb (Fig. 33) und EcoRI-BglII- EcoRI-BglII zu 13,4 kb (Fig. 43) erlauben die Definition der offenen Leseraster. Da es sich um DNA mit einem hohen Prozentsatz an GC handelt, sind die offenen Leseraster angesichts der geringen Häufigkeit von Translationsstoppcodons zahlreich. Eine Untersuchung der Wahrscheinlichkeit codierender Leseraster gemäß Codonverwendung unter Verwendung des Verfahrens von Staden und MacLachlan (1982) wurde durchgeführt. Es kennzeichnet die offenen Leseraster, die die bessere Wahrscheinlichkeit, codierend zu sein, vergli chen mit den anderen Rastern des gleichen DNA-Strangs, besitzen, wobei diese Wahrscheinlichkeit eine Funktion des Codongebrauchs der bereits sequenzierten Gene aus Bakterien der Gattung Pseudomonas ist. So:
3.1. Fünf offene Leseraster sind für das Fragment ClaI- HindIII-HindIII-HindIII zu 5,4 kb kennzeichnend. Sie werden als Raster 1 bis 5 bezeichnet, und ihre Positionen auf der Sequenz des 5,4 kb-Fragments sind die folgenden (auf der 5'-+3'-Sequenz der ClaI-Spaltstelle in Richtung HindIII-Spaltstellen):
Tabelle: wahrscheinliche offene Leseraster des Fragments ClaI-HindllI-HindIII-HindIII zu 5,4 kb. Die Positionen auf der Sequenz entsprechen den Positionen auf der in Fig. 7 beschriebenen Sequenz; der codierende Strang ist der 5'→3'-Strang entsprechend dem oberen Strang in dieser Figur.
Die Darstellungen der Wahrscheinlichkeiten, daß diese offenen Leseraster codierende Raster sind, parallel zu denen, die an den anderen Rastern beobachtet werden (5 insgesamt) sind in Fig. 9 eingetragen. Die fünf Raster werden von dem gleichen Strang codiert. Fünf unter ihnen (offene Raster 1 bis 4) zeigen Eigenschaften der codierenden Raster in translationeller Kopplung (Normak et al., 1983), nämlich: das Translationsstartcodon des Rasters x+1 überlappt mit dem Translationsstoppcodon des Rasters x, oder die beiden sind sehr nahe beieinander gelegen.
3.2. Acht Raster werden für das EcoRI-EcoRI-Fragment zu 8,7 kb charakterisiert. Sie werden als Raster 6 bis 13 bezeichnet, und ihre Positionen in der Sequenz des 8,7 kb- Fragments sind in der nachstehenden Tabelle eingetragen.
Tabelle: wahrscheinliche offene Leseraster des EcoRI-Fragments zu 8,7 kb. Die Positionen auf der Sequenz entsprechen den Positionen auf der in Fig. 8 beschriebenen Sequenz; in dieser Figur ist der codierende Strang der obere Strang, ausgenommen das Raster 11.
Die Darstellungen der Wahrscheinlichkeiten dieser offenen Leseraster mit parallel derjenigen, die in den anderen Rastern (6 Raster ingesamt) beobachtet werden, sind in Fig. 10 eingetragen. Mit Ausnahme des Rasters 11 werden diese Raster von dem gleichen Strang codiert. 4 unter ihnen (7 bis 10) zeigen Eigenschaften der codierenden Raster in translationeller Kopplung (Normak et al., 1983), d. h. das Translationsstartcodon des Rasters x+1 überlappt mit dem Translationsstoppcodon des Rasters x, oder die beiden sind sehr nahe beieinander gelegen.
3.3. Vier offene Leseraster werden für das Fragment SalI- SalI-SalI-SalI-SalI-BgII zu 4,8 kb charakterisiert. Sie werden als Raster 14 bis 17 bezeichnet, und ihre Positionen in der Sequenz des 4,8 kb-Fragments sind die folgenden (in der 5'-3'-Sequenz der SalI-Spaltstellen in Richtung BglI-Spaltstelle):
Tabelle: wahrscheinliche offene Leseraster des Fragments SalI-SalI-SalI-SalI-SalI-BglI zu 4,8 kb. Die Positionen auf der Sequenz entsprechen den in Fig. 32 beschriebenen Positionen, worin der obere Strang in seiner 5'-3'-Orientierung angegeben ist. Die Raster 15, 16 und 17 werden von dem oberen Strang im Gegensatz zu Raster 14 codiert.
Die Darstellung der Wahrscheinlichkeiten, daß diese offenen Leseraster codierend sind, zusammen mit denjenigen, die in den anderen Rastern beobachtet werden (insgesamt 4), sind in der Fig. 34 eingetragen. Die Raster 15, 16 und 17 werden von dem gleichen Strang codiert, das Raster 14 von dem Komplementärstrang.
3.4. Vier Raster werden für das Fragment SstI-SstI-BamHI zu 3,9 kb charakterisiert. Sie werden mit 18 bis 21 bezeichnet, und ihre Positionen in der Sequenz des Fragments zu 3,9 kb sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.
Tabelle: wahrscheinliche offene Leseraster des Fragments SstI-SstI-BamHI zu 3,9 kb. Die Positionen in der Sequenz entsprechen den in Fig. 33 beschriebenen Positionen, worin die Polarität des oberen Strangs 5'-3' ist. Die Raster 18 und 19 werden von dem unteren Strang codiert, im Gegensatz zu den Rastern 20 und 21.
Die Darstellungen der Wahrscheinlichkeiten, daß diese offenen Raster codierend sind, parallel mit denjenigen, die an den anderen Rastern beobachtet werden (insgesamt 4) sind in der Fig. 35 eingetragen. Die Raster 19 und 20 werden divergierend transkribiert.
3. 5. Neun offene Leseraster werden für das Fragment EcoRI- BgIII-EcoRI-BglII zu 13,1 kb charakterisiert. Sie werden als Raster 22 bis 30 bezeichnet, und ihre Positionen auf der Sequenz des 13,1 kb-Fragments sind die folgenden (auf der 5'-3'-Sequenz der EcoRI-Spaltstelle in Richtung BglII Spaltstelle):
Tabelle: wahrscheinliche offene Leseraster des Fragments EcoRI-HglII-EcoRI-BglII zu 13,1 kb. Die Positionen in der Sequenz entsprechen den Positionen, die in der Fig. 43 beschrieben sind, worin der obere Strang in einer Orientierung 5'-3' angegeben ist. Die Raster 22, 23, 24, 25, 26, 27 und 29 werden von dem oberen Strang codiert, im Gegensatz zu den Rastern 28 und 30.
Die Darstellung der Wahrscheinlichkeiten, daß die offenen Raster 22, 23, 24, 25 und 26 codierend sind, parallel mit denjenigen, die in den anderen Rastern beobachtet werden (insgesamt 5 Raster), sind in Fig. 45 eingetragen. Diese 5 Raster werden von dem gleichen Strang codiert.

BEISPIEL 4 - Genetische Untersuchungen an den DNA-Fragmenten, die die cob-Gene enthalten

Dieses Beispiel zeigt die Beziehung, die zwischen den verschiedenen offenen Leserastern, die vorstehend identifiziert wurden, und den Genen, die an der Biosynthese von Cobalaminen oder Cobamiden, die von diesen gleichen Fragmenten getragen werden, beteiligt sind, existiert. Diese Gene werden durch eine genetische Untersuchung, wie nachstehend beschrieben, identifiziert.

4.1. Genetische Untersuchung des 5,4 kb-Fragments

Das Plasmid pXL723 ist das Plasmid pRK290 (Ditta et al., 1980), das das EcoRI-HindIII-Fragment zu 2264 bp enthält, dem rechten Teil des untersuchten Fragments entspricht und in die EcoRI-Spaltstelle von pRK290 cloniert wurde (Fig. 11) Die Konstruktion der in dieser Untersuchung verwendeten anderen Plasmide (pXL302, pXL1397, pXL545, pXL545Q, pXL556 und pXL1500) ist in der Legende der Fig. 11 und 12 beschrieben.
Insertionen wurden in dem Plasmid pXL723 unter Verwendung der Technik von Bruijn und Lupski, 1984, erhalten. Die Insertionen des Transposons Tn5 in dem Plasmid pXL723 wurden selektioniert, anschließend in das 5,4 kb-Fragment kartographiert (Fig. 12). pXL723 komplementiert die Mutante Cob G572 von Pseudomonas putida und die Mutante Cob G634 von Agrobacterium tumefaciens. Diese Insertionen klassifizieren sich in zwei inaktivierende Insertionsgruppen: einerseits diejenigen, die die Komplementation der Mutante Cob G572 nicht mehr erlauben, andererseits in diejenigen, die die Komplementation der Mutante Cob G634 beseitigen (Fig. 12). Die Insertionen, die die Komplementation der Mutante G572 inaktivieren, sind in dem offenen Raster 4 kartographiert (es handelt sich um die Insertionen 15, 27, 68, 81 und 97); das offene Leseraster 4 entspricht nun einem cob-Gen. Es wird als cobC bezeichnet. Insertionen, die die Komplementation der Mutante G634 inaktivieren, sind in dem Raster 5 kartographiert (dies sind die Insertionen 66 und 107, Fig. 12); das offene Leseraster 5 entspricht nun einem cob-Gen. Es wird als cobD bezeichnet. Außerdem wurden Insertionen mit einem Transposon Tn5Spr hergestellt. Das Transposon TnSSpr wurde im Labor konstruiert, indem in die BamHI-Spaltstelle des Transposons Tn5 (Jorgensen et al., 1979) eine BamHI-Kassette, die das Spectinomycinrestistenzgen aus dem Plasmid pHP45Ω enthält, cloniert wurde (Prentki und Krisch, 1984). Diese Insertionen wurden in dem Chromosom des Stamms Pseudomonas denitrificans SBL27 Rifr durchgeführt. Der Stamm SBL27 ist ein Stamm von Pseudomonas denitrificans, bei dem 5C510 aus mehreren Mutagenesen stammt. 5BL27 produziert 10mal weniger Cobalamine als SC510 in PS4-Medium. Auf 10000 Clone des Stamms 5BL27 Rifr, die jeweils eine Insertion des Transposons enthalten, hatten mehr als 30 unter ihnen die Fähigkeit, Cobalamine zu synthesieren, verloren. Manche dieser Clone besaßen eine Insertion in dem in diesem Beispiel untersuchten Fragment. Diese Insertion wurden durch Restriktionsanalysen gemäß dem Southern-Verfahren kartographiert (Southern, 1975). Die Insertionsstellen des Transposons bei diesen verschiedenen Mutanten sind in Fig. 12 eingetragen. Eine dieser Insertionen, die als 2639 numeriert wurde, befindet sich in dem cobC-Gen. Diese Insertion wird durch das Plasmid pXL302, das ein Fragment, das das cobC- Gen enthält, enthält, komplementiert (Fig. 12). Zwei Insertionen mit den Bezeichnungen 2636 und 2638 befinden sich in dem offenen Raster 3. Diese Mutanten sind bei der Biosynthese von Cobalaminen blockiert, und sie werden durch das Plasmid pXL1397, das nur das offene Raster 3 enthält, komplementiert, nicht aber durch das Plasmid pXL302, das die Gene cobC und cobG enthält (Fig. 12). Diese zwei Insertionen befinden sich nun in einem anderen Gen. Das offene Raster 3 wurde mit dem cobB-Gen assoziiert. Eine Insertion 2933 wird in das offene Raster 2 eingebracht; sie wird durch das Plasmid pXL1500, das das offene Raster 2 enthält, komplementiert. Diese Insertion wird durch das Plasmid pXL1397, das das cobB-Gen enthält und das die zwei Insertionen in cobB komplementiert, nicht komplementiert. Es handelt sich hier nun um eine Insertion in einem anderen Gen; das offene Raster 2 wurde mit einem Gen mit der Bezeichnung cobA assoziiert.
Eine Kanamycinresistenzkassette aus dem Plasmid pUC4K (Barany et al., 1985) wurde in die NotI-Spaltstelle des Fragments ClaI (Position 0 auf der Sequenz)-RsaI (Position 1686 in der Sequenz), cloniert in ein Plasmid pUC8 (Viera und Messing, 1982) eingeschleust; es handelt sich um die NotI-Spaltstelle, die in Position 771 in dem Raster 1 vorhanden ist (siehe die Sequenz in Fig. 7); zwei Insertionen wurden beibehalten, die jeweils einer anderen Orientierung der Resistenzkassette entsprechen. Diese Fragmente, die jeweils eine Insertion der Resistenzkassette enthalten, wurden in das Plasmid pRK404 (Ditta et al.) cloniert, wodurch die Plasmide pXL1630 und 1631 erhalten wurden. Diese Plasmide wurden durch konjugativen Transfer in den Stamm Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr einge schleust, anschließend wurde eine Reihe von Kulturverdünnungen in Abwesenheit eines Selektionsantibiotikums für das Plasmid (Tetracyclin) durchgeführt, wobei doppelte Rekombinante, die das Plasmidfragment mit dem chromosomalen Fragment ausgetauscht hatten und das Plasmid verloren hatten, aufgefunden wurden. Zwei Stämme wurden so charakterisiert:
i) einer mit der Bezeichnung SC510 : 1631 Rifr; in diesem Stamm befindet sich die Kanamycinresistenzkassette in Insertion in dem Chromosom an der NotI-Spaltstelle (welche sich in dem Raster 1 befindet); die Transkriptionspolaritäten des Kanamycinresistenzgens und des offenen Rasters 1 sind entgegengesetzt,
ii) die andere Insertion wird als SC510 : 1630 Rifr bezeichnet; die Resistenzkassette ist an der gleichen Spaltstelle insertiert, aber die Transkription des Resistenzgens besitzt die gleiche Polarität wie die des ganzen offenen Rasters 1.
Die zwei Stämme besitzen alle beide einen Synthesegrad an Cobalaminen von mindestens 100fach unter dem von 5C510.
Das Plasmid pXL545Ω entspricht dem Plasmid pXL545, in das die Spectinomycinresistenzkassette des Plasmids pHP45Ω in die BamHI-Spaltstelle insertiert wurde. Dieses Plasmid (Fig. 12), das das ClaI-HindIII-Fragment zu 814 bp enthält (indem nur das offene Raster 1 vollständig ist) komplementiert nur die Mutante SC510 : 1630 Rifr. Dies reicht aus, um ein neues Gen zu definieren, da diese Mutante durch ein Plasmid komplementiert wird, das nur das ganze offene Raster 1 enthält. Das offene Raster 1 entspricht einem Gen des Biosynthesewegs der Cobalamine und/oder Cobamide. Dieses Gen wird als cobE bezeichnet. Das Fehlen der Komplementation der Mutante SC510 : 1631 Rifr durch das Plasmid pXL545Ω kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, daß die Gene cobA, cobB, cobc, cobD und cobE oder ein Teil von ihnen dem gleichen Operon angehören und daß die Insertion in cobE, die eine Transkription in der Richtung der Transkription des Operons beibehält, nur durch die Expression des cobE-Gens in trans komplementiert werden kann. Im Gegensatz dazu kann die Mutante SC510 : 1631 Rifr als solche nicht durch ein Plasmid, das die Expression der cobA- und cobE-Gene in trans erlaubt, komplementiert werden.
Das Fragment ClaI-HindIII-HindIII-HindIII zu 5,4 kb enthält nun fünf cob-Gene mit den Bezeichnungen cobA, cobB, cobC, cobD und cobE.

4.2. Genetische Untersuchungen des 8,7 kb-Fragments

Das Plasmid pXL367 ist pRK290 (Ditta et al., 1980), das das EcoRI-Fraginent zu 8,7 kb, cloniert in die EcoRI-Spaltstelle, enthält (Fig. 13). Insertionen des Transposons Tn5 in dem Plasmid pXL367 wurden unter Verwendung der bereits beschriebenen Technik (von Bruijn und Lupski, 1984) selektioniert. Die Insertionen in dem 8,7 kb-Fragment wurden kartographiert. Ebenso wurden Insertionen des Transposons Tn3lacZ gemäß dem bereits beschriebenen Verfahren erhalten (Stachel et al., 1985) und kartographiert. 29 Insertionen des Transposons Tn5 und 13 Insertionen des Transposons Tn3lacZ wurden so kartographiert. Die genaue Position dieser Insertionen in dem 8,7 kb-Fragment ist in Fig. 14 eingetragen. Plasmide, die jeweils eine einzige Insertion in dem 8,7 kb-Fragment enthalten, wurden durch konjugative Transfers in die Cob-Mutanten von Acrrobacterium tumefaciens G164, G609, GEb, GE11, G612, GE13, GE14, GE15, GEbE, GE20, GE38 eingeschleust. Diese Mutanten werden alle durch pXL367 komplementiert. Die Insertionen, die die Komplementation der verschiedenen Mutanten nicht mehr erlauben, wurden gesucht. Sie entsprechen einer Insertion in dem Gen, das für die Komplementation der entsprechenden Mutante verantwortlich ist. Die Ergebnisse der Komplemen tationen der verschiedenen Mutanten für ihren Produktionscharakter an Cobalaminen (Phänotyp Cob) sind in Fig. 14 eingetragen. Wenn die rekombinante Mutante weniger als dreimal weniger Cobalamine als die gleiche Mutante mit dem Plasmid pXL367 produziert, produziert, gilt sie als nichtkomplementiert. Unter den untersuchten Mutanten G164, G609, G610, G611, 6612, G613, G614, G615, G616, G620, G638 werden acht verschiedene inaktivierende Insertionsklassen des Transposons, die zu einem mutierten Phänotyp führen, beobachtet. Diese Klassen charakterisieren Insertionen durch das Fehlen von Komplementation einer oder mehrerer Mutanten durch die Plasmide pXL367, die die gleichen Insertionen enthalten. Jede Klasse entspricht nun einem mutierten Gen. Es wird beobachtet, daß die Insertionen, die der gleichen Klasse angehören, jeweils an der Seite der anderen angeordnet sind. Acht Insertionsklassen wurden so beobachtet, die die Definition von acht Genen erlauben. Jede Insertionsklasse definiert ein minimales Fragment, das in dem entsprechenden Gen enthalten sein muß. Die Fig. 14 zeigt eine perfekte Überschneidung zwischen den Regionen, die durch jede Klasse beschränkt sind, in der Restriktionskarte und den vorstehend beschriebenen offenen Rastern (Beispiel 3). Es wird in der Tat festgestellt, daß für jede Klasse von Insertionen die Transposons immer in einen Teil des 8,7 kb-Fragments insertiert sind, das in einem offenen Raster enthalten ist. Jede Klasse von Insertionen wird nun mit einem offenen Raster und sich selbst assoziiert. Die vorstehend angegebenen offenen Raster codieren nun jeweils ein Protein, das an dem Biosyntheseweg von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligt ist. Die offenen Raster entsprechen jeweils Genen, die an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligt sind. Diese offenen Raster werden als cobF, cobG, cobH, cob1, cobJ, cobK, cobL und cobM für die Raster 6 bis 13 bezeichnet. Die Position dieser Gene, bezogen auf die Restriktionskarte, ist in Fig. 14 dargestellt.

4.3. Genetische Untersuchung des 4,8 kb-Fragments

Das Plasmid pXL1558 und ist das Plasmid pRK290 (Ditta et al., 1980), die das HindIII-HindIII-Fragment zu 12 kb von pXL154 (Cameron et al., 1989), cloniert in die EcoRI- Spaltstelle von pRK290 (Fig. 36) enthält. Die Konstruktion der bei dieser Untersuchung verwendeten anderen Plasmide (pXL233 und pXL843) ist in der Legende der Fig. 36 beschrieben.
Tn5Sp-Insertionen wurden an dem Plasmid pXL1558 erhalten. Zuerst wurde ein Stamm, der ein Transposon Tn5Sp enthält, konstruiert; dies wurde durch Transformieren des Stamms C2110 (Stachel et al., 1985) mit Hilfe des Plasmids pRK2013Tn5Sp (Blanche et al., 1989) durchgeführt; das Plasmid pRK2013Tn5Sp, das einen ColE1-Replikationsorigin besitzt, repliziert sich nicht in dem Stamm C2110, der polA- ist. Die nach Transformation erhaltenen Kolonien, die spectinomycinresistent sind, besitzen nun das Transposon Tn5Sp in ihrem Chromosom; eine Kolonie wird anschließend reisoliert, anschließend wird die Insertion des Transposons mit Hilfe des Phagen P1 in dem Stamm MC1060 wie vorstehend beschrieben translatiert (Miller, 1972). Der Stamm MC1060 TnSSp wird mit dem Plasmid pXL1558 transformiert; das Plasmid pXL1558 wird anschließend durch Konjugation mit Hilfe von pRK2013 bei C600 Rifr mobilisiert. Tetracyclinresistente Konjuganten (für das Plasmid pXL1558) und spectinomycinresistente Konjuganten (für das Transposon) werden anschließend selektioniert; derartige Konjuganten müssen das Plasmid pXL1558 enthalten, in das das Transposon TnSSp insertiert ist. Insertionen, die in dem Plasmid pXL1558 und genauer in dem 12 kb-Fragment vorhanden sind, werden anschließend durch Restriktionsspaltung kartographiert; 23 Insertionen wurden so erhalten und in dem 12 kb-Fragment kartographiert; die Position dieser verschiedenen Insertionen in dem Fragment ist in Fig. 37 dargestellt. Diese 23 Insertionen wurden in das Chromosom des Stamms SC510 Rifr nach konjugativem Transfer von p- XL1588::Tn5Sp eingeschleust und anschließend in das Plasmid pR751 eingeschleust. Das Plasmid pR751 ist ein trimethoprimresistentes Plasmid der gleichen Inkompatibilitätsgruppe wie pXL1558 (incP, Thomas und Smith, 1987). Durch eine Züchtung, die für pXL1558 nicht selektiv ist (Fehlen von Tetracyclin), aber für pR751 und das Transposon selektiv ist (Anwesenheit von Trimethoprim und Spectinomycin) wurden der Austausch der Mutation, die in pXL1558:Tn5Sp vorhanden ist, mit dem Chromosom sowie die Abtrennung von pXL1558 durch die Technik des Markeraustauschs durch doppelte homologe Rekombination, wie bereits beschrieben (Schell et al., 1988), erhalten. Die so selektionierten Stämme enthalten das Transposon in ihrem Chromosom. Die doppelte homologe Rekombination wurde durch das Verfahren von Southern (Southern 1975) bestätigt. So wurden 23 Stämme SC510 Rifr::TnSSp in dem 12 kb-Fragment identifiziert.
Andererseits wurde eine andere Tn5Sp-Insertion, die durch Zufallsmutagenese des Transposons Tn5Sp in dem Stamm SBL27 Rifr (Blanche et al., 1989) erhalten worden war, in dem 12 kb-Fragment durch Restriktionsanalyse gemäß dem Southern- Verfahren kartographiert (Southern, 1975), vergleiche Fig. 37; dieser Stamm wird als SBL27 Rifr::TnSSp 1480 bezeichnet.
Der Synthesegrad der Cobalamine wird für die 24 in PS4-Medium gemäß dem bereits beschriebenen Protokoll gezüchteten Stämme bestimmt (Cameron et al., 1989) und der Phänotyp Cob- wird den Stämmen zugeteilt, die mindestens 1000fach weniger (bzw. 100) Vitamin B&sub1;&sub2; als der Elternstamm SC510 Rifr (bzw. SBL27 Rifr) produzieren, Fig. 37. Es wurde so beobachtet, daß 6 dieser chromosomalen Insertionen zu einem Cob--Phänotyp bei P. denitrificans führen; es handelt sich um die Insertionen 31.1, 41.3, 45, 55, 22.1 und 1480.
Drei Plasmide pXL233, pXL837 (Cameron et al.) und pXL843 wurden durch konjugative Transfers in drei Stämme, die den Phänotyp Cob- besitzen, eingeschleust, nämlich SC510 Rifr::Tn5Sp 31.1, SC510 Rifr::Tn5SP 45, SBL27 Rifr::Tn5Sp 1480. Diese drei Mutanten besitzen jeweils ein anderes Komplementationsprofil für die Synthese von Cobalaminen. In der Tat wird SBL27 Rifr::Tn5Sp 1480 durch pXL837 und pXL843, aber nicht durch pXL233 komplementiert; die Mutante SC510 Rifr::Tn5Sp 45 wird nur durch pXL843 komplementiert; die Mutante SC510 Rifr::Tn5Sp 31.1 wird durch das Plasmid pXL843 sowie durch das Plasmid pXL233 (siehe Fig. 37) komplementiert. Die angegebenen Daten erlauben nun gemäß den Ergebnissen der Komplementationen der drei Mutanten die Schlußfolgerung, daß die drei Mutanten verschieden sind und daß für jede unter ihnen das Transposon Tn5Sp sich in ein anderes cob-Gen insertiert hat.
Andererseits wurden die Plasmide pXL1558:TN5SP 41.3, pXL1558::Tn5Sp 45 und pXL1558::Tn5Sp 22.1 durch konjugative Transfers in den Stamm G2035 (Cameron et al., 1989) eingeschleust und komplementieren diesen nicht. Das Plasmid pXL1558 komplementiert diese Mutante im Gegensatz zu dem Plasmid pXL1558::Tn5Sp 31.1.
Die Werte des Phänotyps und der Komplementation erlauben nun die Definition von 3 Insertionsklassen; jede dieser Klassen wird durch die folgenden Insertionen wiedergegeben: 31.1, Klasse 1; 45, 41.3, 55 und 22.1, Klasse 2; 1480 Klasse 3.
Für jede Klasse von Insertionen wurden die Transposons immer in einen Teil des 4,8 kb-Fragments, das in dem alleinigen offenen Raster (ORF14, ORF16 und ORF17, wie in Beispiel 3 definiert) enthalten ist, insertiert. Jede Klasse von Insertionen wurde mit einem ausschließlichen offenen Raster assoziiert. Die vorstehend angegebenen offenen Raster codieren nun ein Protein, das an einem Biosyntheseweg von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligt ist. Die offenen Raster werden als cobx, cobS und cobT für die Raster 14, 16 und 17 bezeichnet. Die Position dieser Gene, bezogen auf die Restriktionskarte ist in Fig. 37 dargestellt. Das offene Raster 15 ist kein Gen, das an der Biosynthese von Coenzym B12 beteiligt ist.

4.4. Genetische Untersuchung des 3,9 kb-Fragments

Das Plasmid pXL1557 ist das Plasmid pRK290 (Ditta et al., 1980), das das HindIII-BamHI-Fragment zu 9 kb von pXL519, cloniert in die EcoRI-Spaltstelle von pRK290 (Fig. 38), enthält. Die Konstruktion der anderen Plasmide, die zu dieser Untersuchung verwendet wurden (pXL1286, pXL1303, pXL1324), ist in der Legende von Fig. 38 beschrieben. Außerdem wird das BglII-XhoI-Fragment zu 2 kb (Positionen auf der Sequenz in Fig. 33 dargestellt, 251 und 2234) des Plasmids pXL519 in die BamHI-SalI-Spaltstellen des Plasmids pXL435 (Cameron et al.) cloniert, wodurch das Plasmid pXL699 erzeugt wird.
Tn5Sp-Insertionen wurden in dem Plasmid pXL1557 gemäß der in Beispiel 4.3. beschriebenen Technik erhalten. Die Insertionen des Transposons Tn5Sp in dem Plasmid pXL1557, das nun als pXL1557::Tn5Sp bezeichnet wurde, wurden ausgewählt. Diejenigen, die in dem 9 kb-Fragment (Fig. 39) kartographiert sind, wurden in das Chromosom des Stamms SC510 Rifr nach konjugativem Transfer von pXL1557::Tn5Sp und Markeraustausch durch doppelte homologe Rekombination, wie unter 4.3. beschrieben, eingeschleust.
Die doppelte homologe Rekombination wurde nach dem Southern-Verfahren bestätigt (Southern, 1975). So wurden 20 Stämme SC510 Rifr::TnSSp identifiziert.
Andererseits wurden zwei andere Tn5Sp-Insertionen, die durch Zufallsmutagenese des Transposons TnSSp in dem Stamm SBL27 Rifr (Blanche et al., 1989) erhalten worden waren, in das 9 kb-Fragment durch Restriktionsanalyse gemäß dem Southern-Verfahren (Southern, 1975) kartographiert, vergleiche in Fig. 39 die Insertionen 1003 und 1147.
Der Synthesegrad der Cobalamine wurde für die 22 Stämme, die in PS4-Medium gemäß dem bereits beschriebenen Protokoll gezüchtet wurden (Cameron et al., 1989), bestimmt, und der Phänotyp Cob- wurde in Stämmen, die 1000mal weniger (bzw. 100) an Vitamin B&sub1;&sub2; produzieren als der Elternstamm SC510 Rifr (bzw. SBL127 Rifr), Fig. 39, zugeteilt. Nur die 4 Insertionen 1, 1003, 23 und 1147 führen zu einem Phänotyp Cob- bei P. denitrificans.
Vier Plasmide pXL699, pXL1286, pXL1303 und pXL1324 wurden durch konjugative Transfers in die vier Stämme, die den Phänotyp Cob- besitzen, eingeschleust, nämlich SC510 Rifr::Tn5Sp 23 und SBL27 SBL27 Rifr::TnSSp 1147. Das Plasmid pXL699 komplementiert die zwei ersten Mutanten (SC510 Rifr::TnSsp 1, SBL27 Rifr::TnSSp 1003), aber das Plasmid pXL1303 komplementiert sie nicht; das Plasmid pXL1324 komplementiert die zwei anderen Mutanten (SC510 Rifr::Tn5Sp und SBL27 Rifr::Tn5Sp 1147), aber das Plasmid pXL1286 komplementiert sie nicht.
Andererseits wurde das Plasmid pXL1557:Tn5Sp 1 durch konjugativen Transfer in den Stamm G2040 eingeschleust und komplementiert diesen nicht, während die Plasmide pXL1557, pXL1557::Tn5Sp 6A, pXL1557:Tn5Sp 54, pXL1557::Tn5Sp 48, pXL1557::Tn5Sp 21, pXL1557::Tn5Sp 8, pXL1557:Tn5Sp 23, die auch durch konjugative Transfers eingeschleust wurden, sie komplementieren (siehe Fig. 39).
Die Werte des Phänotyps und die Komplementation erlauben die Definition von 2 Klassen von Insertionen. Für jede Klasse von Insertionen sind die Transposons immer in einen Teil des 3,9 kb-Fragments, das in einem einzigen offenen Raster enthalten ist, insertiert (ORF 19 und ORF20, wie in Beispiel 3 definiert).
Jede Klasse von Insertionen wird mit einem offenen Raster assoziiert. Die vorstehend angegebenen offenen Raster codieren ein Protein, das an dem Biosyntheseweg von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligt ist. Diese offenen Raster werden als cobV und cobU für die Raster 19 und 20 bezeichnet. Die Raster 18 und 21 sind keine Gene, die an dem Biosynthesewegs des Coenzyms B12 beteiligt sind. Die Position dieser Gene, bezogen auf die Restriktionskarte, ist in Fig. 39 dargestellt. Die Insertionen 48, 21 und 8 sind zwischen den Genen cobU und cobV kartographiert.

4.5. Genetische Untersuchungen des 13,4 kb-Fragments

4.5.1. Untersuchungen an dem EcoRI-BalII-Fragment zu 4327 bp

Das Plasmid pXL189 (Cameron et al., 1989), das mindestens ein cob-Gen enthält, enthält eine 3,1 kb Insertion, die mit Ausnahme von 300 bp einem EcoRI-ClaI-Fragment zu 4,26 kb (siehe Fig. 45) entspricht. pXL189 wurde einer Mutagenese mit dem Transposon Tn5, wie vorstehend beschrieben (De Bruijn und Lupski, 1984) unterworfen. 13 Insertionen wurden so in die Insertion von pXL189, wie in Fig. 46 dargestellt, kartographiert. Diese 13 mutierten Plasmide sowie pXL189 wurden mit zwei Mutanten von A. tumefaciens, G632 und G633, die durch pXL189 komplementierte Mutanten sind, konjugiert (Cameron et al., 1989). Nur die Insertion 58 erwies sich als eine inaktivierende Insertion. Dieses Ergebnis zeigt, daß die zwei Mutanten G632 und G633 einer Mutation in dem gleichen Gen entsprechen, und daß andererseits nur das Gen von P. denitrificans, das für dessen Komplementation verantwortlich sein kann, dem offenen Raster 26 entspricht (siehe Fig. 46), da die Insertion 58 in diesem offenen Raster kartographiert ist; außerdem han delt es sich um die einzige Insertion unter den 13, die in diesem offenen Raster kartographiert ist. Ein cob-Gen mit der Bezeichnung cobO ist nun mit dem offenen Raster 26 assoziiert.
Um zu erfahren, ob die vier anderen offenen Raster (offene Raster 27 bis 30), die in diesem Fragment identifiziert wurden, den cob-Genen entsprechen, wurde eine Spectinomycinresistenzkassette des Plasmids pHP45Q (Prentki und Krisch, 1984) spezifisch in jedes dieser Gene insertiert, anschließend in das Chromosom von P. denitrificans SC510 Rifr durch homologe Rekombination eingeschleust, um Insertionsmutanten in jedem dieser offenen Raster zu erhalten. Dazu wurde das EcoRI-ClaI-Fragment (jeweilige Positionen 8818 und 13082 in der in Fig. 43 dargestellten Sequenz) verwendet. Dieses Fragment, das die offenen Raster 27 bis 30 enthält, wurde aus pXL157 (Cameron et al., 1989) gereinigt; ein EcoRI-Linker wurde an das ClaI-Ende angefügt, nachdem dieses durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase von E. coli aufgefüllt worden war. Dieses Fragment wurde anschließend in das Plasmid pUC13 (Viera et al., 1982) an der EcoRI-Spaltstelle cloniert. Das so konstruierte Plasmid wurde als pXL332 bezeichnet. Insertionen der Spectinomycinresistenzkassette des Plasmids pHP45Q (Prentki und Krisch, 1984) wurden an pXL332 durchgeführt. Diese Insertionen wurden separat an den Spaltstellen SmaI (Position 9869, offenes Raster 27), BamHI (Position 10664, offenes Raster 28), GlaI (Position 11687, offenes Raster 29) und NcoI (Position 12474, offenes Raster 30) durch vollständige oder teilweise Spaltungen von pXL332 mit den entsprechenden Enzymen, anschließend gegebenenfalls Auffüllung dieser Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase von E. coli, anschließende Ligierung mit dem 2 kb-SmaI-Fragment von pHP45Ω (Prentki und Krisch, 1984), das ein Spectinomycinresistenzgen enthält, durchgeführt; diese Insertionen wurden jeweils als Ω2, Ω1, Ω3 und Ω4 bezeichnet, wie in Fig. 46 dargestellt. Die Fragmente EcoRI, die diese verschiedenen Insertionen enthalten, wurden anschließend in pRK404 (Ditta et al., 1985) an eine der zwei EcoRI-Spaltstellen cloniert. Die 4 Plasmide, die diese verschiedenen Insertionen enthalten, wurden anschließend durch Konjugation in SC510 Rifr, wie vorstehend beschrieben, eingeschleust. Das Plasmid pR751 (Thomas und Smith, 1987) wurde anschließend in die Transkonjuganten eingeschleust. Der Austausch der in den 4 verschiedenen Derivaten von pRK404 und dem Chromosom von SC510 Rifr enthaltenen Mutationen konnte wie beschrieben selektioniert werden (siehe Beispiel 4.3.). 4 Stämme wurden so erhalten. Diese Stämme enthalten jeweils eine Insertion der Resistenzkassette in einer der vier offenen Raster 27 bis 30. Diese Insertionen wurden durch Analyse der genomischen DNA durch Southern-Blot (Southern, 1975) bestätigt. Die Produktion von Cobalaminen dieser verschiedenen Stämme wurde untersucht. Sie zeigten alle einen Cob+-Phänotyp bei Züchtung in einem PS4-Medium. Dieses Ergebnis zeigt an, daß diese offenen Raster nicht die Biosynthese von Coenzym B12 stören. Jedoch ist es möglich, daß eines oder mehrere dieser Raster für Proteine codieren, die beispielsweise an der Umwandlung von Coenzym B12 in Methylcobalamin, d. h. an der Synthese eines anderen Cobalamins, nämlich eines anderen Corrinoids, beteiligt sind.

4.5.2. Untersuchung des 9,1 kb EcoRI-EcoRI-Fragments

Verschiedene Plasmide wurden bei dieser Untersuchung verwendet;
das Plasmid pXL1560 ist das Plasmid pRK290 (Ditta et al., 1980), das das 9,1 kb EcoRI-EcoRI-Fragment von pXL156 (Beispiel 1), cloniert an die EcoRI-Spaltstelle pRK290 (siehe Fig. 46), enthält. Die Konstruktion der anderen, bei dieser Untersuchung verwendeten Plasmide (pXL618, pXL593, pXL623, pXL1909, pXL1938, pXL1908, pXL221, pXL208, pXL297) ist in der Legende von Fig. 45 beschrieben.
Tn5Sp-Insertionen wurden an dem Plasmid pXL1560 erhalten. Der Stamm MC1060 Tn5Sp, der durch das Plasmid pXL1560 transformiert worden war, diente dazu, Insertionen des Transposons Tn5Sp in das Fragment pXL1560 zu erhalten; 27 Insertionen wurden so erhalten und in dem 9, 1 kb-Fragment kartographiert; die Position dieser verschiedenen Insertionen in dem Fragment ist in Fig. 4 dargestellt. Diese 27 Insertionen wurden in das Chromosom des Stamms SC510 Rifr nach konjugativem Transfer von pXL1560::Tn5Sp, anschließende Einschleusung in das Plasmid pR751, eingeschleust. Das Plasmid pR751 ist ein Plasmid, das trimethoprimresistent ist und der gleichen Inkompatibilitätsgruppe wie pXL1560 angehört (incP, Thomas und Smith, 1987). Durch Züchtung, die für pXL1560 nicht selektiv ist (Fehlen von Tetracyclin), aber für pR751 und das Transposon selektiv ist (Anwesenheit von Trimethoprim und Spectinomycin) wurden der Austausch der Mutation, die in dem pXL1560::Tn5Sp vorhanden ist, mit dem Chromosom sowie die Abtrennung von pXL1560 erhalten. Diese Technik des Markeraustausches durch doppelte homologe Rekombination ist derjenigen, die bereits von Schell et al., 1988 beschrieben wurde, äquivalent. Die so selektionierten Stämme enthalten das Transposon in ihrem Chromosom.
Die doppelte homologe Rekombination wird durch das Southern-Verfahren bestätigt (Southern, 1975). So wurden 27 Stämme SC510 Rifr::TnSSp, die jeweils eine andere Insertion des Transposons Tn5Sp in dem 9,1 kb-Fragment enthalten, identifiziert.
Der Grad der Synthese an Cobalaminen wurde für diese 27 Stämme, die in PS4-Medium gezüchtet wurden, identifiziert, und der Cob&supmin;-Phänotyp wurde den Stämmen, die mindestens 1000mal weniger Vitamin B12 als der Elternstamm SC510 Rifr produzieren, zugeteilt, Fig. 46. Es wurde so beobachtet, daß 18 dieser chromosomalen Insertionen von den 27 zu ei nem Cob--Phänotyp bei P. denitrificans führen, wie das in Fig. 46 gezeigt ist.
Die Insertionen 19, 32, 24, 27, 37, 39, 26, 11 und 14 sind in dem offenen Raster 22 kartographiert (siehe Fig. 46). Alle diese Insertionen werden durch das Plasmid pXL618 komplementiert, das nur das offene Raster 22 enthält. Daraus wird abgeleitet, daß das offene Raster 22 einem cob- Gen entspricht, das als cobO bezeichnet wird. Keine Insertion wurde in dem offenen Raster 23 erhalten. Jedoch komplementiert das Plasmid pXL623, das nur dieses offene Raster enthält (siehe Fig. 46), zwei cob-Mutanten von Agrobacterium tumefaciens, G642 und G2043 (Cameron et al., 1989). Das offene Raster 23 entspricht nun einem cob-Gen mit der Bezeichnung cobP. Die Insertionen 23, 13, 12, 30, 22, 40 35, 10 und 17, die in den offenen Rastern 24 und 25 kartographiert sind, führen zu einem Cob--Phänotyp bei SC510 Rifr. Es scheint nun, daß es sich um zwei offene Raster handelt, deren Produkt an der Biosynthese von Cobalaminen beteiligt ist. Jedoch kann man nicht ausschließen, daß diese Insertionen polare Wirkungen auf die in 3' positionierten Gene, wie cobO, besitzen. Es muß nun die Komplementation dieser Mutanten untersucht werden, um zu untersuchen, ob ihr Cob--Phänotyp nicht das Ergebnis eines polaren Effekts ist.
Die Cob-Mutanten von Aqrobacterium tumefaciens G622, G623 und G630, die durch pXL156 komplementiert wurden, wurden untersucht. Diese Mutanten werden durch das Plasmid pXL189 (Cameron et al., 1989), das cobO als einziges cob-Gen enthält, nicht komplementiert. Im Gegensatz dazu werden sie durch das Plasmid pXL1908, das cobO und das offene Raster 25 zusätzlich zu den offenen Rastern 27 bis 30 enthält, komplementiert (siehe Fig. 45). Diese Zuletztgenannten können für Komplementation dieser Mutanten nicht verantwortlich sein, da die Proteine, die sie codieren, nicht an dem Stoffwechselweg von Coenzym B&sub1;&sub2; beteiligt sind. Die beobachteten Komplementationen können somit nur eine Folge des offenen Rasters 25 sein. Außerdem werden die Mutanten SC510 Rifr TnSSp, die in diesem gleichen offenen Raster kartographiert sind (es handelt sich um die Mutanten 22, 40, 35, 10 und 17), durch das Plasmid pXL1908 komplementiert, siehe Fig. 46, (das cobO und die Phase 25 enthält) während mindestens zwei von ihnen nicht durch pXL189 komplementiert werden, das nur cobO als cob-Gen enthält. Diese Ergebnisse zeigen klar, daß das offene Raster 25 ein cob-Gen ist; dieses cob-Gen wird als cobN bezeichnet.
Die Mutanten SC510 Rifr TnSSp 23, 13 und 12, die den Cob- Phänotyp besitzen, sind in das offene Raster 24 kartographiert. Diese Mutanten werden durch das Plasmid pXL623 nicht komplementiert, das nur das cobP-Gen enthält. Im Gegensatz dazu werden diese Mutanten durch das Plasmid pXL593, das cobP und das offene Raster 24 enthält, komplementiert, was anzeigt, daß das offene Raster 24 für ihre Komplementation verantwortlich ist. Das offene Raster 24 ist nun ein cob-Gen, das als cobW bezeichnet wird.

BEISPIEL 5 - Gene und Proteine

5.1. - 5,4 kb-Fragment

Fünf Gene (cobA, cobB, cobC, cobD und cobE) sind nun in dem Fragment ClaI-HindIII-HindIII -HindIII zu 5,4 kb definiert. Sie codieren jeweils für die folgenden COB-Proteine: COBA, COBB, COBC, COBD und COBE. Die codierenden Teile der Gene (cobA bis cobE) sind in Fig. 15 beschrieben sowie die Sequenzen der Proteine COBA bis COBE. Die Eigenschaften jedes dieser Proteine sind auch angegeben (Aminosäurezusammensetzung, isoelektrischer Punkt, Polaritätsindex und Hydrophilieprofil).

5.2. - 8,7 kb-Fragment

Acht Gene sind nun in dem 8,7 kb-Fragment definiert. Diese Gene cobF bis cobM codieren jeweils für die folgenden COB- Proteine: COBF, COBG, COBH, COBI, COBJ, COBK, COBL, COBM. Die codierenden Teile dieser Gene (cobF bis cobM) sind in Fig. 16 beschrieben sowie die Sequenzen der Proteine COBF bis COBM. Die Eigenschaften jedes dieser Proteine sind auch angegeben (Aminosäurezusammensetzung, Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt, Polaritätsindex, Hydrophilieprofil).

5.3. - 4,8 kb-Fragment

Drei Gene (cobX, cobS, cobT) sind in dem Fragment SalI- Sall-SalI-SalI-SalI-BglI zu 4,8 kb definiert. Sie codieren jeweils die folgenden Proteine: COBX, COBS und COBT. Die codierenden Teile dieser Gene sind in Fig. 40 beschrieben sowie die Sequenzen der Proteine COBX, COBS und COBT. Willkürlich wurde das ATG in Position 1512 von cobS als Initiationscodon, eher als das in Position 1485 gelegene, gewählt (siehe Fig. 32). Die Eigenschaften jedes dieser Proteine sind auch angegeben (Aminosäurezusammensetzung, isoelektrischer Punkt, Polaritätsindex und Hydrophobieprofil). COBT bezeichnet eine hydrophile Tasche, entsprechend den Aminosäuren 214 bis 305.

5.4.- 3,9 kb-Fragment

Zwei Gene (cobU und cobV) sind in dem Fragment SstI-SstI- BamHI zu 3,9 kb definiert. Sie codieren jeweils die folgenden Proteine: COBU und COBV. Die codierenden Teile dieser Gene sind in Fig. 41 beschrieben sowie die Sequenzen der Proteine COBU bis COBV. Die Eigenschaften jedes dieser Proteine sind auch angegeben (Aminosäurezusammensetzung, isoelektrischer Punkt, Polaritätsindex, Hydrophobieprofil)

5.5. - 13,4 kb-Fragment

Fünf cob-Gene sind in dem 13,4 kb-Fragment definiert (cob, cobP, cobW, cobN und cobO und cobV). Sie codieren jeweils die folgenden Proteine: COBQ, COBP, COBW, COBN und COBO. Die codierenden Teile dieser Gene (cobO, cobP, cobW, cobN und cobO) sind in Fig. 46 beschrieben sowie die Sequenzen der Proteine COBQ, COBP, COBW, COBN und COBO. Die Eigenschaften jedes dieser Proteine sind auch angegeben (Aminosäurezusammensetzung, isoelektrischer Punkt, Polaritätsindex, Hydrophobieprofil).
Gemäß den Hydrophilieprofilen, die gemäß den Programmen von Hopp und Woods (1981) durchgeführt wurden, sind alle COB-Proteine mit Ausnahme von COBV wahrscheinlich lösliche Proteine, im Gegensatz zu den Membranproteinen, da das Fehlen von großen hydrophoben Domänen festgestellt wird. COBV ist entweder ein Membranprotein, da 4 lange hydrophobe Domänen festgestellt werden (siehe Fig. 41), oder ein cytoplasmatisches Protein mit großen hydrophoben Domänen.
Für alle Aminosäuresequenzen der COB-Proteine wird als erste Aminosäure in der NH&sub2;-terminalen Position ein Methionin festgestellt. Es versteht sich, daß dieses in vivo abgespalten werden kann (Ben Bassat und Bauer, 1984). Man weiß, daß Regeln zur in vivo-Exzision des NH&sub2;-terminalen Methionins durch Methioninaminopeptidase vorgeschlagen wurden (Hirel et al., 1989).
Außerdem wurden diese Proteinsequenzen mit den Proteinen von Genpro verglichen, das ein Proteinextrakt von Genbank (Version 59) ist, die mit den vermutlichen codierenden Teilen mit mehr als 200 Aminosäuren gemäß dem Programm von Kanehisa (1984) verstärkt wurde. Keine signifikante Homologie konnte mit den in der Version 59 von Genbank verwendeten Parametern festgestellt werden, ausgenommen für COBT. In der Tat besitzt das Protein COBT einen Kern aus sauren Aminosäuren zwischen den Positionen (in Aminosäuren) 224 und 293 (siehe Fig. 40); in diesem Teil des Proteins ist mehr als eine Aminosäure von 2 ein Glutaminsäure- oder Asparaginsäurerest; dieser Kern aus sauren Aminosäuren macht das Protein in dieser Region gemäß dem Programm von Kanehisa (1984) mit anderen Proteinen homolog, die selbst auch einen derartigen sauren Kern besitzen. Die am meisten homologen Proteine sind: das Protein GARP von Plasmodium falciparum (Triglia et al., 1988), das Herztroponin T der Ratte (Jin und Lin, 1989), das menschliche Prothymosin und das der Ratte (Eschenfeld und Berger, 1986), ein androgenabhängiges Protein der Ratte, das als Spermin bindet (Chang et al., 1987), die Proteine midsize neurofilament subunit des Menschen, der Ratte und des Huhns (Myers et al., 1987, Levy et al., 1987, Zopf et al., 1987). Die Funktion dieser an sauren Resten reichen Kerne ist nicht bekannt; jedoch müßte dieser saure Kern entweder die Bindung von metallischen Kationen, wie von Co++, erlauben, was dem COBT-Protein eine Cobaltmetallothionenin-Rolle zuteilten würde, oder Wechselwirkungen mit anderen Proteinen erlauben.

BEISPIEL 6 - Enzymatische Untersuchungen

6.1. - Identifizierung der COB-Proteine und ihrer Gene, aus den enzymatischen Aktivitäten

Dieses Beispiel beschreibt, wie es, ausgehend von einem gereinigten Protein nach Ermittlung dessen NH&sub2;-terminaler Sequenz, möglich ist, das entsprechende Strukturgen unter den sequenzierten cob-Genen zu finden.

6.1.1. Identifikation des von dem COBA-Gen codierten cobA- Proteins

Die Reinigung von SUMT von Pseudomonas denitrificans wurde beschrieben (F. Blanche et al., 1989). Die NH&sub2;-terminale Sequenz des so gereinigten Proteins konnte gemäß der vorstehend beschriebenen Technik ermittelt werden. Die zehn ersten Aminosäuren wurden identifiziert:
Die NH&sub2;-terminale Sequenz des COBA-Proteins (Fig. 15) entspricht genau dieser Sequenz. Das Molekulargewicht von gereinigter SUMT beträgt gemäß Abschätzung durch 12,5%ige SDS-PAGE-Elektrophorese 30.000. Das COBA-Protein besitzt ein von seiner Sequenz abgeleitetes Molekulargewicht von 29.234 (Fig. 15). Die Entsprechungen zwischen den NH&sub2;- terminalen Sequenzen und den Molekulargewichten zeigen klar an, daß das COBA-Protein SUMT entspricht. Das cobA- Gen ist das Strukturgen von SUMT.

6.1.2. Identifikation des von dem CobB-Gen codierten Proteins COBB

a) Bestimmung der Cobyrinsäure-a,c-diamidsynthaseaktivität
Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung einer Aktivität des Biosynthesewegs der Corrinoide, die bis jetzt noch nie beschrieben wurde. Es handelt sich um die Cobyrinsäurea,c-diamidsynthase (ACDAS), die die Amidierung der zwei Carbonsäurefunktionen des Corrinkerns oder Descobaltocorrinkerns in den Positionen a und c katalysiert (Fig. 17). Der Spender der NH&sub2;-Gruppierung ist L-Glutamin, und die Reaktion verbraucht 1 Molekül ATP pro Amidierung jeder Carbonsäurefunktion. Die Bestimmung, die nachstehend beschrieben ist, gilt für die Diamidierungsreaktion von Cobyrinsäure; mit einigen Modifikationen (HPLC-Detektion bei 330 nm insbesondere) gilt sie auch für die Diamidierungsreaktion von Hydrogenobyrinsäure.
Das Inkubationsgemisch (250 ul Tris-HCl 0,1 M pH 7,6), das 1 mX ATP, 2, 5 mM MgCl&sub2;, 1 mM Glutamin, 25 um Cobyrinsäure oder 5 uM Hydrogenobyrinsäure, etwa 1 Aktivitätseinheit Cobyrinsäure-a.c-diamidsynthase enthält, wird 1 Stunde bei 30ºC inkubiert. Am Ende der Inkubation werden 125ul einer wäßrigen KCN-Lösung (2,6 g/l) und 125 ul 0,2 M HCl dem Gemisch zugesetzt, das anschließend 10 Minuten bei 80ºC erhitzt wird, dann 5 Minuten bei 5000 g zentrifugiert wird. 50 ul des Zentrifugationsüberstands werden mittels HPLC analysiert. Sie werden in eine 25 cm Nucleosil 5-C&sub1;&sub8;-Säule injiziert und mit einem Gradienten von 0 bis 100% Puffer B in A 30 Minuten eluiert; Puffer A: 0,1 M Kaliumphosphat pH 6,5, 10 mM KCN; Puffer B: 0,1 M Kaliumphosphat pH 8, 10 mM KCN/Acetonitril (1/1). Die Corrinoiden werden dank ihrer UV-Absorption bei 371 nm detektiert. Die enzymatische Aktivitätseinheit ist als die Menge Enzym definiert, die notwendig ist, 1 nmol Amidgruppierungen pro Stunde unter den beschriebenen Bedingungen zu synthetisieren.
b) Reinigung der Cobyrinsäure-a,c-diamidsynthaseaktivität von Pseudomonas denitrificans
Dieser Versuch erläutert, wie ein Protein von Pseudomonas denitrificans, das an dem Biosyntheseweg von Cobalaminen beteiligt ist, gereinigt werden kann.
Aus der in Beispiel 6.1.2a) beschriebenen Bestimmung wird die Reinigung der Cobyrinsäure-a,c-diamidsynthase von Pseudomonas denitrificans wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
In einem typischen Reinigungsexperiment werden 7 g feuchte Zellen des Stamms SC 510 Rifr, in den das Plasmid pXL1500 eingeschleust worden war (siehe Beispiel 4.1 für die Beschreibung von pXL1500 sowie Fig. 12), in 30 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7,7 suspendiert und 15 Minuten bei 4ºC beschallt. Der Rohextrakt wird anschließend durch einstündige Zentrifugation mit 50.000 g isoliert, anschließend werden 10 ml dieses Extrakts in einer Mono-Q- HR-10/10-Säule, die mit dem gleichen Puffer equilibriert worden war, injiziert. Die Proteine werden mit einem linearen KC&sub1;-Gradienten (0 bis 0,5 M) eluiert. Die Fraktionen, die die enzymatische Aktivität enthalten, werden vereinigt und auf 2,5 ml eingeengt. Nach Verdünnung mit 1 ml 25 mM Tris-HCl pH 7, 7 werden die Proteine über eine Mono-Q-HR-5/5-Säule unter Verwendung des vorstehenden KC&sub1;-Gradienten (0 bis 0,5 M) fraktioniert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, 1 ml Tris-HCl pH 7, 7, der 1,7 M Ammoniumsulfat enthält, wird der Probe zugesetzt, die anschließend über eine Phenyl-Superose-Säule (Pharmacia) mit einem abnehmenden Ammoniumsulfatgradienten (1,0 M bis 0 M) gereinigt wird. Die Fraktionen, die die gewünschte Aktivität enthalten, werden vereinigt und über eine Bio- Gel HPHT-Säule (Bio-Rad) mit einem Kaliumphosphatgradienten (0 bis 0,35 M) chromatographiert.
Nach dieser Stufe ist das Enzym zu mindestens 95% rein. Es besitzt kein verunreinigendes Protein in der SDS-PAGE. Die Reinheit des Proteins wird durch die Einzigartigkeit der NH&sub2;-terminalen Sequenz bestätigt. Dessen Molekulargewicht mit dieser Technik beträgt 45.000. Die verschiedenen Reinigungsstufen der ACDAS mit ihrem Reinigungsfaktor und ihrer Ausbeute sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt. Tabelle: Reinigung von ACDAS
1 Dieser Faktor wird gemäß der Erhöhung der spezifischen Aktivität der Fraktionen im Verlauf der Reinigung berechnet.
c) NH&sub2;-terminale Sequenz der Cobyrinsäure-a,,c-diamidsynthase von Pseudomonas denitrificans und Identifikation des Strukturgens von Pseudomonas denitrificans, das diese Aktivität codiert
Dieses Beispiel erläutert, wie die NH&sub2;-terminale Sequenz eines Proteins, das an dem Biosyntheseweg von Cobalaminen beteiligt ist, die Identifikation des Strukturgens, das dieses Protein codiert, erlaubt.
Die NH&sub2;-terminale Sequenz der Cobyrinsäure-a.c-diamidsynthase von Pseudomonas denitrificans, die wie in Beispiel 6.1.2b) beschrieben gereinigt wurde, wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt. 15 Reste wurden identifiziert:
Die NH&sub2;-terminale Sequenz des COBB-Proteins (Fig. 15) entspricht genau dieser Sequenz, ausgenommen, daß in der in Fig. 15 dargestellten Sequenz ein Methionin der durch direkte Sequenzierung bestimmten Peptidsequenz vorausgeht. Daraus folgt, daß das aminoterminale Methionin mit Sicherheit in vivo durch die Methionin-Aminopeptidase abgespalten wird (Ben Bassat und Bauer, 1987). Das Molekulargewicht der gereinigten ACDAS beträgt nach Abschätzung mittels 12,5%iger SDS-PAGE-Elektrophorese 45.000. Das COBB- Protein besitzt ein von seiner Sequenz abgeleitetes Molekulargewicht zu 45.676 (Fig. 15). Die Entsprechungen zwischen den NH&sub2;-terminalen Sequenzen und den Molekulargewichten zeigen klar an, daß das COBB-Protein ACDAS entspricht. Das cobB-Gen ist das Strukturgen von ACDAS.

6.1.3. Identifikation des durch das CobI-Gen codierten Proteins COBI

a) Bestimmung einer S-Adenosyl-L-methionin: Präcorrin-2-methyltransferase-Aktivität

Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung einer enzymatischen Aktivität des Biosynthesewegs der Corrinoide, der noch niemals beschrieben wurde. Es handelt sich um 5-Adenosyl-L-methionin:-2-Methyltransferase (SP&sub2;MT), die den Transfer einer Methylgruppe von S-Adenosyl-L-methionin (SAM) auf Präcorrin-2 katalysiert, wodurch Präcorrin-3 erhalten wird (Fig. 18). Die Faktoren II und III, Oxidationsprodukte von Präcorrin-2 bzw. Präcorrin-3, wurden bereits aus Zellextrakten von Propionibacterium shermanii gereinigt (Battersby und MacDonald, 1982, Scott et al., 1984); Präcorrin-2 und Präcorrin-3 werden als vermutliche Intermediate der Biosynthese von Coenzym B&sub1;&sub2; erkannt, aber sie wurden niemals gereinigt. Deshalb wurde die entsprechende Aktivität weder jemals bestimmt noch vorher gereinigt. Das Substrat der enzymatischen Reaktion Präcorrin-2 ist ein sehr labiles Molekül, das nicht aufbewahrt werden kann, da es spontan in Gegenwart selbst winziger Spuren Sauerstoffs oxidiert (Battersby und MacDonald, 1982). Das Prinzip dieses enzymatischen Tests beruht nun auf der Möglichkeit der extemporären Erzeugung von Präcorrin-2 mit Hilfe eines enzymatischen Extrakts des Stamms SC510 Rifr, in den das Plasmid pXL1500 eingeschleust wurde, aus SAM und δ-Aminolävulinsäure. Die Inkubation muß unter strikt anaeroben Bedingungen durchgeführt werden.
Die Fraktionen, die SP&sub2;MT enthalten, werden in 1 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7, 7 in Gegenwart von 5 mM DDT, 1 mM EDTA, 100 uM [Methyl ³H]-SAM (1 /iCi), 0,8 mM δ-Aminolävulinsäure und 6 mg enzymatischem Rohextrakt des Stamms Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr pXL1500 für 3 Stunden bei 30ºC inkubiert. Der Stamm SC510 Rifr enthält eine starke SUMT-Aktivität (F. Blanche et al., 1989). Die Tetrapyrrolverbindungen, die während der Inkubation produziert werden, werden auf eine DEAE-Sephadex-Anionenaustauschersäule gebunden und mit Methanol mit 5% Schwefelsäure in Abwesenheit von Sauerstoff verestert. Die dimethylierten und trimethylierten Derivate des Uro'Gens III werden anschließend dünnschichtchromatographisch über Kieselgel unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98,3/l,7) als Elutionssystem (F. Blanche et al., 1989) getrennt. Die Aktivität der SP&sub2;MT wird durch das Verhältnis der Menge der trimethylierten Derivate, die bezogen auf die Gesamtheit der wiedergewonnenen di- und trimethylierten Derivate zu der Gesamtmenge an Protein, ausgedrückt. Der Extrakt von SC510 Rifr pXL1500 der in den Test eingebracht wird, besitzt keine nachweisbare SP&sub2;MT-Aktivität unter den Bestimmungsbedingungen (das Verhältnis der Präcorrin-3-Produkte zu den Präcorrin-2-Produkten während des Tests liegt unter 0,05).

b) Reinigung von S-Adenosyl-L-methionin: Präcorrin-2-methyltransferase von Pseudomonas denitrificans

Dieses Experiment erläutert, wie ein Protein von Pseudomonas denitrificans, das an dem Biosyntheseweg von Cobalaminen beteiligt ist, gereinigt werden kann, wenn eine Bestimmung der infragekommenden Aktivität vorliegt.
Das Protein wird aus Zellen von SC510 Rifr, die das Plasmid pXL253 enthalten, gereinigt. Es handelt sich um das Plasmid pKT230, in das das EcoRI-Fragment zu 8,7 kb insertiert wurde (Fig. 13). In einem typischen Reinigungsver such werden 50 g feuchte Zellen des Stamms SC150 Rirr, in den das Plasmid pXL253 eingeschleust wurde, in 250 ml 0,1 M Kaliumphosphat pH 7,7, 5 mM DTT suspendiert und 15 Minuten bei 4ºC beschallt. Nach 1stündiger Zentrifugation mit 50.000 g wird der Überstand durch eine DEAE-Sephadex-Säule (10 ml Gel) geleitet, um die Tetrapyrrolverbindungen zu beseitigen. Der pH-Wert des so erhaltenen Rohextrakts wird auf pH 7,7 mit 0,1 M KOH eingestellt. Die Proteine, die zwischen 33% und 45% Sättigung mit Ammoniumsulfat ausfallen, werden gewonnen und in 40 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7,7, 5 mM DTT aufgelöst. Diese Lösung wird über eine Sephadex-G- 25-Säule geleitet, die mit 10 mM Tris-HCl pH 7, 7, 5 mM DTT eluiert wird, und die gewonnenen Proteine werden in eine DEAE-Trisacryl-M-Säule injiziert. Die Proteine werden mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,25 M KCl eluiert, und die Fraktionen, die die SP&sub2;MT-Aktivität enthalten, werden vereinigt und ein zweites Mal über eine Sephadex-G- 25-Säule wie vorstehend geleitet. Die Proteinfraktion wird in eine Ultrogel-HA-Säule (IBF), die in 10 mM Tris-HCl pH 7,7, 5 mM DTT equilibriert worden war, injiziert. Die Proteine werden mit einem linearen Gradienten von 0 bis 50 mM Kaliumphosphat pH 7,8, der 5 mM DTT enthält, eluiert. Die Fraktionen, die die gewünschte Aktivität enthalten, werden vereinigt und in eine MonoQ-HR-5/5-Säule (Pharmacia), die mit 50 mM Tris-HCl pH 7,7, 5 mM DTT equilibriert worden war, injiziert. Das SP&sub2;MT wird mit einem linearen KCl-Gradienten (0 bis 0,25 M) eluiert. Am Ende der MonoQ-Stufe zeigt die SDS-PAGE-Elektrophorese (12,5%) mit Anfärbung mit Silbersalzen, daß das Enzym zu mehr als 99% rein ist. Dies wird durch die Einzigartigkeit der NH&sub2;-terminalen Sequenz des Proteins bestätigt. Das aus der Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen errechnete Molekulargewicht (12,5% SDS-PAGE) beträgt 26.500. Die Stufen der Reinigung der SP&sub2;MT mit ihren Ausbeuten sind in der nachstehenden Tabelle beschrieben. Tabelle: Reinigung von SP&sub2;MT
¹ Dieser Faktor wird gemäß der Ausbeute an Proteinen berechnet

c) NH&sub2;-terminale Sequenz von SP&sub2;MT und Identifikation des Strukturgens, das diese Aktivität codiert

Dieses Beispiel erläutert, wie die NH&sub2;-terminale Sequenz eines Proteins, das an dem Biosyntheseweg beteiligt ist, die Identifikation des Strukturgens, das dieses Protein codiert, erlaubt. Im vorstehenden Beispiel handelt es sich um das Strukturgen von SP&sub2;MT.
Die NH&sub2;-terminale Sequenz des gereinigten Proteins wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt. Die 15 ersten Aminosäuren wurden identifiziert:
Die NH&sub2;-terminale Sequenz des Proteins COBI (Fig. 16) entspricht genau dieser Sequenz, außer daß in der in Fig. 16 dargestellten Sequenz ein Methionin der von der Nukleotidsequenz abgeleiteten Peptidsequenz vorausgeht. Daraus folgt, daß das aminoterminale Methionin mit Sicherheit in vivo durch die Methioninaminopeptidase abgespalten wird (Ben Bassat und Bauer, 1987). Das Molekulargewicht von gereinigtem SP&sub2;MT beträgt nach Abschätzung durch 12,5%ige SDS-PAGE 26.500. Das COBI-Protein besitzt ein von seiner Aminosäuresequenz abgeleitetes Molekulargewicht von 25.878 (Fig. 16). Die Entsprechungen zwischen den NH&sub2;-terminalen Sequenzen und den Molekulargewichten zeigen klar an, daß das COBI-Protein SP&sub2;MT entspricht. Das cobI-Gen ist das Strukturgen von SP&sub2;MT.

6.1.4. Identifikation des von dem COBH-Gen codierten Proteins cobH

a) Bestimmung der Präcorrin-8x-Mutaseaktivität

Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung einer enzymatischen Aktivität des Biosynthesewegs von Cobalaminen, der bis zu diesem Tag niemals beschrieben wurde. Es handelt sich um die Präcorrin-8x-Mutase. Dieses Enzym katalysiert den Transfer der Methylgruppierung von Position C-11 auf Position C-12 während der Umwandlung von Präcorrin-8x in Hydrogenobyrinsäure (siehe die Nomenklatur der Kohlenstoffatome Fig. 19; PL. 68). Allgemeiner ist dies das Enzym, das die Übertragung der Methylgruppierung von C-11 nach C-12 katalysiert, was so zu dem Corrinkern führt. Das Enzym wird hier als Mutase bezeichnet, obwohl formell nicht gezeigt wurde, daß der Transfer der Methylgruppierung intramolekular ist, auch wenn dies sehr wahrscheinlich ist.
Die enzymatische Aktivität wird durch die Transformation von Präcorrin-8x (5 uM) in Hydrogenobyrinsäure im Verlauf der Inkubation in Gegenwart von enzymatischen Fraktionen in 0,1 M Tris-HCl pH 7,7, 1 mM EDTA, bei 30ºC während 1 h nachgewiesen. Am Ende der Inkubation wird die Reaktion durch 10minütiges Erhitzen auf 80% gestoppt, und nach 10minütiger Zentrifugation mit 3000 g wird die gebildete, im Überstand vorhandene Hydrogenobyrinsäure mittels HPLC analysiert (vgl. Beispiel 6.1.2. a).
b) Reinigung von Präcorrin-8x-Mutase
Die Reinigung von Präcorrin-8x-Mutase von Pseudomonas denitrificans wird wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
Während dieser Reinigung werden alle Pufferlösungen auf pH 7,7 eingestellt.
In einem typischen Reinigungsversuch werden 50 g Zellen des Stamms SC510 Rifr, die das Plasmid pXL253 enthalten (Plasmid pKT230, in das an die EcoRI-Spaltstelle das 8,7 kb-Fragment cloniert wurde, Fig. 13), erhalten nach Züchtung in PS4-Medium, in 200 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer resuspendiert und 12 min beschallt. Nach 1stündiger Zentrifugation mit 50.000 g wird der Überstand durch eine DEAE-Sephadex-Säule (10 ml Gel) geleitet, um die Tetrapyrrolverbindungen zu beseitigen. Der pH-Wert der Lösung wird sofort auf 7, 7 mit einer 1 M KOH-Lösung eingestellt. Die Proteinfraktion fällt zwischen 40 und 60% Sättigung mit Ammoniumsulfat aus und wird durch Zentrifugation gewonnen und in 50 ml 0,1 M Tris-HCl aufgelöst. Diese Probe wird anschließend in eine Ultrogel AcA-54-Säule (IBF, Frankreich) (Gelvolumen 1000 ml) injiziert, und die Proteine werden mit einer Fließgeschwindigkeit von 60 ml/h mit 50 mM Tris-HCl eluiert. Die Fraktionen, die die Aktivität enthalten, werden vereinigt und in eine DEAE-Trisacryl-M-Säule (IBF, Frankreich), die mit 50 mM Tris-HCl equilibriert worden war, injiziert, und die Proteine werden mit einem Gradienten von 0 bis 0,2 M KCl eluiert. Die Fraktionen, die das zu reinigende Protein enthalten, werden vereinigt, über eine G-25-Sephadex-Säule, die mit 10 mM Tris-HCl equilibriert worden war, geleitet. Die Proteinfraktion wird in eine Ultrogel-HA-Säule (IBF, Frankreich), die mit 10 mM Tris-HCl equilibriert worden war, injiziert, und die Proteine werden mit einem Gradienten von 0 bis 0,1 M Kaliumphosphat eluiert, dann wird die aktive Fraktion über eine Phenyl-Sepharose-CL-4B-Säule (Pharmacia) in 10 mM Kaliumphosphat chromatographiert, mit einem Gradienten von 0,65 bis 0 M Ammoniumsulfat eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt. Das so erhaltene Protein ist zu mehr als 95% rein (gemäß den Ergebnissen der SDS-PAGE-Elektrophorese mit 12,5% und Anfärbung mit Silbersalzen). Die Reinheit des Proteins wird durch die Einzigartigkeit der N-terminalen Sequenz bestätigt. Sein mit Hilfe dieser Technik berechnetes Molekulargewicht beträgt 22.000. Die Stufen der Reinigung der Präcorrin-8x- Mutase mit ihren Ausbeuten bei der Reinigung sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. Tabelle: Reinigung von Präcorrin-8x-Mutase
¹ Dieser Faktor ist gemäß der Ausbeute an Proteinen berechnet
c) NH&sub2;-terminale Sequenz von Präcorrin-8x-Mutase und Identifikation seines Strukturgens
Dieses Beispiel erläutert, wie die NH&sub2;-terminale Sequenz eines Proteins, das an dem Biosyntheseweg beteiligt ist, die Identifikation des Strukturgens, das dieses Proteins codiert, erlaubt.
Die NH&sub2;-terminale Sequenz dieses Proteins wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt. 15 Reste wurden identifiziert.
Die NH&sub2;-terminale Sequenz des Proteins COBH (Fig. 16) entspricht genau dieser Sequenz, ausgenommen, daß in der in Fig. 16 dargestellten Sequenz ein Methionin der Peptidsequenz vorausgeht, wie durch die vorstehend beschriebene Sequenzierung bestimmt wurde. Daraus folgt, daß das aminoterminale Methionin mit Sicherheit in vivo durch die Methioninaminopeptidase abgespalten wird (Ben Bassat und Bauer, 1987). Der zweite Rest ist ein Protein, und die Abspaltung entspricht den bereits dargelegten Regeln (Hirel et al., 1989). Das Molekulargewicht der gereinigten Präcorrin-8x-Mutase beträgt nach Abschätzung mittels 12, 5%iger SDS-PGAE-Elektrophorese 22.000. Das COBH-Protein besitzt ein von seiner Sequenz abgeleitetes Molekulargewicht von 22.050 (Fig. 16). Die Entsprechungen zwischen den NH&sub2;-terminalen Sequenzen und den Molekulargewichten von diesen Proteinen zeigen klar an, daß das COBH-Protein der Präcorrin-8x-Mutase entspricht. cobH ist das Strukturgen der Präcorrin-8x-Mutase.

d) Herstellung, Isolierung und Identifikation von Präcorrin-8x

In einem typischen Experiment zu Reinigung von Präcorrin- 8x wird ein enzymatischer Rohextrakt des Stamms SC510 Rifr pXL253 (1000 mg Protein) unter Anaerobiose 20 h bei 30ºC in 100 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,7 mit 1000 nmol Trimethylisobacteriochlorin, hergestellt wie vorstehend be schrieben (Battersby et al., 1982), EDTA (1 mM), ATP (100 gnol), MgCl&sub2; (250 umol), NADH (50 umol), NADPH (50 umol), SAM (50 umol) und Hydrogenobyrinsäure (20 umol) inkubiert. Am Ende der Inkubation ist das Präcorrin-8x das in Hauptsache gebildete Tetrapyrrolprodukt. Es wird isoliert und mittels HPLC über eine uBondapak-C18-Säule (Waters) unter Verwendung eines linearen Elutionsgradienten von 0 bis 50% Acetonitril in einem Kaliumphosphatpuffer pH 5,8 gereinigt. Die Masse von Präcorrin-8x (m/z = 880) und die Masse seines Ethylesterderivats (m/z = 978) zeigen an, daß es sich um eine Verbindung mit der gleichen Bruttoformel handelt wie Hydrogenobyrinsäure. Die UV/VIS-Eigenschaften und die Fluoreszenseigenschaften unterscheiden sich sehr von denjenigen der Hydrogenobyrinsäure und zeigen an, daß das Molekül zwei getrennte Chromophore besitzt. Die einzige enzymatische Isomerisierungsreaktion zwischen Präcorrin-6x (Thibaut et al., 1990) und Hydrogenobyrinsäure ist die Wanderung von Methyl von C-11 in C-12, und so ist Präcorrin-8x das letzte Zwischenprodukt vor der Hydrogenobyrinsäure, und die entsprechende Reaktion ist die Wanderung von Methyl von C-11 in C-12, die durch Präcorrin-8x-Mutase katalysiert wird.

6.1.5. Identifikation des COBU-Proteins, das von dem cobU- Gen codiert wird

a) Bestimmung der Nicotinat-Nukleotid: Dimethylbenzimidazol-Phosphoribosyltransferase-Aktivität (Fig. 5, Reaktion 5). Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung einer enzymatischen Aktivität, die direkt mit dem Biosyntheseweg der Cobalamine verbunden ist. Es handelt sich um die Nicotinat-Nukleotid: Dimethylbenzimidazol-Phosphoribosyltransferase (NN:DMBI PRT) (EC 2.4.2.21). Die Fraktionen, die die NN:DMBI PRT-Aktivität enthalten (etwa 5 Einheiten) werden 8 min bei 30ºC in 500 ul 0,1 M Glycin:NaOH-Puffer pH 9,7 in Gegenwart von 1 mM NaMN (Nicotinsäuremononukleotid) und 10 uM DMBI inkubiert. Die Reaktion wird anschließend durch 10minütiges Erhitzen auf 80% gestoppt. Das Reaktionsgemisch wird mit 4 Volumina Wasser verdünnt, und 100,II dieser Lösung werden in eine 15 cm Nucleosil 5-C8-HPLC-Säule injiziert, die mit einem Gemisch 0,1 M Kaliumphosphat pH 2,9 : Acetonitrill (93 : 7) mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min eluiert wird. Das α-Ribazol-5'-phosphat wird nachgewiesen und fluorimetrisch quantitativ bestimmt (Anregung: 260 nm; Emission > 370 nm). Die enzymatische Aktivitätseinheit wird als die Menge an Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 nmol α-Ribazol-5'-phosphat pro Stunde unter diesen Bedingungen zu erzeugen.

b) Reinigung der NN:DMBI PRT-Aktivität von Pseudomonas denitrificans

Dieses Experiment erläutert, wie ein Protein von P. denitrificans, das an dem Biosyntheseweg der Cobalamine beteiligt ist, gereinigt werden kann. Ausgehend von der in Beispiel 6.1.5. a) beschriebenen Bestimmung wird die Reinigung von NM: DMBI PRT von Pseudomonas denitrificans wie nachstehend beschrieben durchgeführt. In einem typischen Reinigungsexperiment werden 10 g feuchte Zellen des Stamms SC510 Rifr, in den das Plasmid pXL1490B, wie vorstehend beschrieben eingeschleust worden war, verwendet. Das Plasmid pXL1490B ist in Fig. 38 beschrieben. Dieses Plasmid wurde durch Clonierung des BamHI-SstI-SstI-Fragments zu 3,85 kb von pXL519 (siehe Fig. 38) erhalten. Dieses Plasmid enthält nun die Gene cobU und cobV von P. denitrificans. Die in P54-Medium, das mit Lividomycin supplementiert ist, wie vorstehend beschrieben, gezüchteten Zellen werden nach 96stündiger Kultur in PS4-Medium geerntet. Sie werden in 25 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,2 resuspendiert und während 25 min bei 4% beschallt. Der Rohextrakt wird anschließend durch 1stündige Zentrifugation bei 50.000 g gewonnen, anschließend über eine DEAE-Trisacryl-M-Säule (IBF, Frankreich), die mit dem gleichen Puffer equilibriert worden war, geleitet. 10% des Eluats (120 mg Pro teine) werden über eine MonoQ-HR-10/10-Säule unter Verwendung eines KCl-Gradienten (von 0 bis 0,6 M) fraktioniert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf 2 ml durch Ultrafiltration eingeengt, anschließend nach Vermischen mit einem 30 mM Tris-HCl-Puffervolumen pH 7,2 wird die Probe ein zweitesmal über eine MonoQ-HR-5/5-Säule wie vorstehend fraktioniert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, anschließend wird die Probe auf eine Molarität von 1 M mit Ammoniumsulfat gebracht und über eine Phenyl-Superose-HR-5/5-Säule chromatographiert, die mit einem abnehmenden Ammoniumsulfatgradienten (1 M bis 0 M) eluiert wird. Die Fraktionen, die die gewünschte Aktivität enthalten, werden vereinigt, durch Ultrafiltration eingeengt und über eine Bio-Sil-250-Gelpermeationssäule chromatographiert, die mit 20 mM Natriumphosphat/50 mM Natriumsulfat pH 6,8 eluiert wird.
Nach dieser Stufe ist das Enzym zu mindestens 95% rein. Es besitzt kein verunreinigendes Protein in der SDS-PAGE. Diese Reinheit wird durch Einzigartigkeit der NH&sub2;-terminalen Sequenz bestätigt. Sein Molekulargewicht bei dieser Technik beträgt 35.000. Die verschiedenen Reinigungsstufen der NN:DMBI PRT sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. Tabelle: Reinigung von NN:DMBI PRT von P. denitrificans
c) NH&sub2;-terminale Sequenz von NN:DMBI PRT von P. denitrificans und Identifikation des Strukturgens von Pseudomonas denitrificans, das diese Aktivität codiert. Die NH&sub2;-terminale Sequenz von NN:DMBI PRT von Pseudomonas denitrificans, wie in Beispiel 6.1.5b) beschrieben, wurde gemäß der vorstehend beschriebenen Technik durchgeführt. Die 15 ersten Reste wurden identifiziert:
Die NH&sub2;-terminale Sequenz des COBU-Proteins (Fig. 41) entspricht dieser Sequenz, außer daß in der in Fig. 41 dargestellten Sequenz ein Methionin der ersten Aminosäure der durch direkte Sequenzierung bestimmten Peptidsequenz vorausgeht. Daraus folgt, daß das aminoterminale Methionin mit Sicherheit in vivo durch die Methioninaminopeptidase abgespalten wird (Ben Bassat und Bauer, 1987). Das Molekulargewicht der gereinigten N-Transglycosidase beträgt nach Abschätzung durch 12,5%ige SDS-PAGE 35.000. Das COBU- Protein besitzt ein von seiner Sequenz abgeleitetes Molekulargewicht von 34.642 (Fig. 41). Die Entsprechungen zwischen den NH&sub2;-terminalen Sequenzen und den Molekulargewichten zeigen klar an, daß das COBU-Protein der NN:DMBI PRT entspricht. Das cobU-Gen ist das Strukturgen von NN:DMBI PRT.
d) Spezifität der NN:DBI PRT für DBI. Dieses Beispiel erläutert, wie die Untersuchung der Spezifität von NN:DMBI PRT von P. denitrificans die Biosynthese von verschiedenen Cobamiden in P. denitrificans unter Verwendung der katalytischen Einheiten der NN:DMBI PRT von P. denitrificans erlaubt, um die Synthese der infragekommenden Nukleotidbase zu bewirken.
Das Substrat des Enzyms zur Synthese der Cobalamine ist 5,6-Dimethylbenzimidazol. Das Benzimidazol bzw. das 5-Methylbenzimidazol sind Substrate der Reaktion mit Reaktionsgeschwindigkeiten von 157% bzw. 92%, verglichen mit dem natürlichen Substrat (5,6-Dimethylbenzimidazol), wobei die Konzentration an NaMN auf 2 mM festgelegt wurde. Die Spezifität der NN:DMBI PRT von P. denitrificans ist nun für die Substrate mit Benzimidazolkern gering. Man kann nun den Stamm P. denitrificans SC510 Rifr (Cameron et al., 1989) verwenden, ihn in PS4-Medium, in dem das 5,6-Dimethylbenzimidazol durch Benzimidazol bzw. 5-Dimethylbenzimidazol ersetzt ist, züchten, um die Synthese von Coa- (Benzimidazolyl)-Coß-cyanocobamid bzw. Coα-(5-Methylbenzimidazolyl)-Coß-cyanocobamid durch das Bekterium zu bewirken. Es ist sicher, daß andere Cobamide auf diese Weise synthetisiert werden können.

6.1.6. Identifikation des von dem CobV-Gen codierten COBV- Proteins

Dieses Beispiel erläutert, wie die Bestimmung einer Aktivität des Biosynthesewegs des Coenzyms B&sub1;&sub2; bei P. denitrificans, anschließend die Teilreinigung der Aktivität, die Identifikation des Strukturgens dieses Enzyms bei P. denitrificans erlaubt
a) Bestimmung der GDP-Cobinamid: α-Ribazol-(5'-phosphat)cobinamidphosphotransferase (oder Cobalamin-(5'-phosphat)synthase)-Aktivität
Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung einer direkt mit dem Biosyntheseweg von Cobalaminen verknüpften Aktivität. Es handelt sich um Cobalamin-(5'-phosphat)synthase. Die Fraktionen, die die Aktivität enthalten (etwa 5 bis 10 Einheiten) werden in der Dunkelheit bei 30ºC in 500 ul 0,3 M Tris-HCl-Puffer pH 9,0 in Gegenwart von 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl&sub2;, 50 uM α-Ribazol-5'-phosphat und 20 uM GDP-Cobin amid [in Form von 5'-Desoxy-5'-adenosyl (Ado) oder Coenzym] inkubiert. Nach 1Sminütiger Inkubation werden 500 ul 20 mM Kaliumcyanid zugesetzt, und die Lösung wird 10 min auf 80ºC erhitzt. Nach Zentrifugation zur Beseitigung des ausgefallenen Materials wird das Vitamin-B&sub1;&sub2;-5'-phosphat, das in dem Überstand vorhanden ist, als das in Beispiel 9 beschriebene bestimmt. Eine Einheit Cobalamin-(5'-phosphat)synthase ist als die Menge Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 nmol Cobalmin-5'-phosphat pro h unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zu erzeugen.
Ado-GDP-Cobinamid wird durch Inkubation von Ado-Cobinamidphosphat (Blanche et al., 1989) mit einem Extrakt von SC510 Rifr pXL623 unter den Bedingungen der Bestimmung von Cobinamidphosphat-Guanylyltransferase erhalten (siehe 6.1.11.b). Das α-Ribazol und das α,-Ribazol-5'-phosphat werden aus Kulturen von SC510 Rifr isoliert und mittels HPLC unter den in Beispiel 6.1.5a) beschriebenen Bestimmungsbedingungen gereinigt.

b) Teilreinigung von Cobalamin-(5'-phosphat) synthase.

Dieses Experiment zeigt, wie eine enzymatische Aktivität von P. denitrificans, die an dem Biosyntheseweg der Cobalamine von P. denitrificans beteiligt ist, teilgereinigt werden kann. Aus der vorstehend beschriebenen Bestimmung wurde die Reinigung von Cobalamin-(5'-phosphat)synthase durchgeführt. Dazu wurde in einem typischen Reinigungsversuch 10 g feuchte Zellen des Stamm SC510 Rifr, in den das Plasmid pXL1490B eingeschleust worden war, wie vorstehend beschrieben, verwendet. Das Plasmid pXL1490B ist in Fig. 38 beschrieben. Dieses Plasmid entspricht dem SstI-SstI- BamHI-Fragment zu 3,85 kb, das in pKT230 cloniert wurde. Dises Plasmid enthält die Gene cobU und cobV von P. denitrificans. Die Anwesenheit dieses Plasmids bei P. denitrificans SC510 Rifr führt zu einer Amplifikation der Cobalamin-(5'-phosphat)synthaseaktivität um etwa einen Faktor von 100; es ist nun wahrscheinlich, daß die von dem Plasmid pXL1490B getragene Insertion das Strukturgen dieses Enzyms enthält. Dieses Gen kann nun cobU oder cobV sein. Die SC510 Rifr pXL1490B-Zellen wurden durch Züchtung in einem PS4-Medium, das mit Lividomycin supplementiert ist, wie vorstehend beschrieben, gezüchtet. Die Zellen werden zentrifugiert, anschließend in 25 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8,39-1 mM EDTA (Puffer A) resuspendiert und 15 min bei 4ºC beschallt. Der Rohextrakt wurde anschließend durch 1stündige Zentrifugation mit 50.000 g gewonnen und über eine mit Puffer A equilibrierte Sephadex-G-25-Säule geleitet. Die Proteinfraktion wird gewonnen und als Fraktion zu 300 ul (7,5 mg Proteine) in eine Superose-12-HR-10/30- Säule, die mit dem Puffer A eluiert wird, injiziert. Die ausgeschlossene Fraktion wird gewonnen, mit dem gleichen Volumen Puffer A-1,0 M Ammoniumsulfat vermischt und über eine Phenyl-Superose-HR-5/5-Säule chromatographiert. Die Proteine werden mit einem abnehmenden Ammoniumsulfatgradienten (von 0,5 M bis 0 M) in Puffer A, gefolgt von einem Plateau bei 0 M Ammoniumsulfat, eluiert, um die Cobalamin- (5'-phosphat)synthaseaktivität zu eluieren. Die Teilreinigung dieses Enzyms ist in der nachstehenden Tabelle beschrieben und beruht auf 75 mg Protein, die anfangs in das Reinigungsverfahren eingeführt wurden. Tabelle: Teilreinigung von Cobalamin-(5'-phosphat)synthase von P. denitrificans
c) Spezifität der Cobalamin-(5'-phosphat)synthase. Der Km- Wert für (Ado)GDP-Cobinamid beträgt 0,9 uM. Jedenfalls besitzt das Enzym die gleiche Affinität und eine praktisch identische Reaktionsgeschwindigkeit für die Form (CN, aq) des Substrats. Der Km-Wert des Enzyms für α-Ribazol-5'- phosphat beträgt etwa 2,7 uM. Außerdem katalysieren die reineren Präparate von Cobalamin-(5'-phosphat)synthase die Reaktion von Ado-GDP-Cobinamid mit α-Ribazol, wodurch Coenzym B&sub1;&sub2; erhalten wird, und unter diesen Bedingungen wird keine Anhäufung von Cobalamin-5'-phosphat beobachtet. Der Km-Wert des Enzyms für α-Ribazol beträgt 7,8 uM. Intracelluläre Konzentrationen an α-Ribazol-5'-phosphat und an α- Ribazol von 30 bzw. 700 uM wurden mittels HPLC während der Produktion von Cobalaminen von SC510 Rifr in PS4-Medium unter den in Beispiel 6.1.5a) beschriebenen Kulturbedingungen gemessen. Dies zeigt, daß das Coenzym B12 direkt aus Ado-GDP-Cobinamid für Cobalamin-(5'-phosphat)synthase ohne Beteiligung einer Cobalamin-5'-phosphatase erzeugt werden kann.
Die fehlende Anhäufung oder die Anwesenheit von Spuren von Cobalamin-5'-phosphat in den Kulturen von P. denitrificans SC510 Rifr bestätigen, daß das Coenzym B&sub1;&sub2; durch die direkte Reaktion von Ado-GDP-Cobinamid mit α-Ribazol in vivo gebildet wird.
Diese direkte Reaktion wurde bereits beobachtet und in vitro bei Propionibacterium shermanii (Ronzio et al., 1967; Renz, 1968) beschrieben. Da das Strukturgen von Cobalamin- (5'-phosphat)synthase nur cobU oder cobV sein kann, da die Amplifikation bei P. denitrificans eines Fragments, das diese zwei cob-Gene von P. denitrificans enthält, zu einer Erhöhung um einen Faktor 100 der Cobalamin-(5'-phosphat)synthaseaktivität führt und da das cobU-Gen das Strukturgen von NN:DMBI PRT ist, ist cobV nun das Strukturgen der Cobalamin-(5'-phosphat)synthase.

6.1.7. Identifikation des COBK-Proteins, das von dem cobK- Gen codiert wird

a) Bestimmung der Präcorrin-6x-reduktaseaktivität

Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung einer neuen enzymatischen Aktivität, die direkt mit dem Biosyntheseweg der Cobalamine verbunden ist. Es handelt sich um Präcorrin-6x-reduktase.
Die Fraktionen, die die Präcorrin-6x-reduktaseaktivität enthalten (etwa 0,05 Einheiten, E) werden bei 30ºC während 60 min in 250 ul 0,lM Tris-HCl pH 7,7-Puffer in Gegenwart von 1 mM EDAT, 500 gM NADPH, 25 uM [Methyl-3HJSAM (0 uCi/umol, 4 uM Präcorrin-6x (Thibaut et al., 1990) und 0,05 E Dihydropräcorrin-6x-methylase, die teilgereinigt ist (siehe vorstehende Herstellung), inkubiert. Die Reaktion wird anschließend durch 15minütiges Erhitzen auf 80ºC gestoppt und nach 5minütiger Zentrifugation mit 5000 g wird der Überstand in eine DEAE-Sephadex-Säule (die 200 ul Gel enthält) injiziert. Die Säule wird anschließend ausgiebig mit Tris-HCl-Puffer gewaschen, und die gebundenen Verbindungen werden mit 5 ml 1 M HCl eluiert. Die Radioaktivität in diesem Eluat wird mittels Flüssigszintillation ausgezählt. Die enzymatische Aktivitätseinheit ist als die Menge Enzym definiert, die notwendig ist, 1 nmol Präcorrin-6x pro h unter diesen Bedingungen zu reduzieren.
Die Dihydropräcorrin-6x-methylase wird aus einem Rohextrakt von SC510 Rifr pXL253 über eine Mono-Q-HR-5/5-Anionenaustauschersäule (Pharmacia) teilgereinigt. Die Säule wird mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0, 4 M KCl in einen 0,1 M Tris-HCl pH 7,7-Puffer eluiert. Die enzymatische Aktivität eluiert bei 0,35 M KCl. Diese Aktivität wird nachgewiesen und mit dem vorstehend definierten Präcorrin-6x-reduktaseaktivitätstest (in Gegenwart von 0,5 E Präcorrin-6x-reduktase in dem Inkubationsmedium) nachge wiesen. Nach der Stufe mit Mono Q verschwindet in den Fraktionen, die die Dihydropräcorrin-6x-methylaseaktivität enthalten, die Präcorrin-6x-reduktaseaktivität vollständig. Die Aktivitätseinheit der Methylase ist als die Menge Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 nmol Methylgruppierungen auf Dihydropräcorrin-6x pro h unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zu übertragen.

b) Reinigung der Präcorrin-6x-reduktaseaktivität

Aus der vorstehend beschriebenen Bestimmung wird die Reinigung der Präcorrin-6x-reduktase von Pseudomonas denitrificans wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
In einem typischen Reinigungsversuch werden 100 g Feuchtzellen des Stamms SC510 Rifr, in den das Plasmid pXL253 eingeschleust worden war (Plasmid pKT230, in das an die EcoRI-Spaltstelle das 8,7 kb-Fragment cloniert wurde, Fig. 13) in 200 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7, 7 mit 1 mM EDTA (Puffer A) suspendiert und 15 min bei 4ºC beschallt. Der Rohextrakt wird anschließend durch 1stündige Zentrifugation mit 50.000 · gewonnen und dreimal durch eine mit Puffer A equilibrierte Sephadex-G-25-Säule geleitet. Die drei von dem Gel ausgeschlossenen Fraktionen werden vereinigt und mit Puffer A auf 1 l eingestellt. Die Proteine, die zwischen 25 und 40% Ammoniumsulfatsättigung ausfallen, werden durch Zentrifugation gewonnen und in 50 ml Puffer A resuspendiert, und diese Lösung wird durch eine mit Puffer B (25 mM Tris-HCl-500 uM DTT-15% Glycerin) equilibrierte Sephadex-G-25-Säule entsalzt. Die Proteinlösung wird anschließend mit einer Menge von 2,5 ml/min in eine Q-Sepharose-Fast-Flow-Säule (Pharmacia), die mit Puffer B equilibriert worden war, injiziert, und die Proteine werden mit einem Gemisch aus Puffer B-0, 2 M KCl eluiert. Diese Fraktion wird über eine Sephadex-G-25-Säule, die mit Puffer C (50 mM Tris-HCl-500 um DTT-15% Glycerin) equilibriert worden war, entsalzt. Die Proteinlösung wird anschließend (100 mg Proteine in jeder Chromatographie) über eine Mono- Q-HR-10/10-Säule (Pharmacia) mit Hilfe eines Gradienten von 0 bis 0,4 M KCl in Puffer C fraktioniert, anschließend wird die die Aktivität enthaltende Fraktion über eine Phenyl-Superose-HR-10/10-Säule (Pharmacia) in einem linearen abnehmenden Ammoniumsulfatgradienten (von 1 bis 0 M) chromatographiert. Die aktive Fraktion wird entsalzt und die Präcorrin-6x-reduktase wird über eine Mono-Q-HR-5/5- Säule erneut gereinigt. Sie wird in dem 50 mM Tris-HCl- Puffer pH 8, 1 mit 500 mm DTT, 15% Glycerin mit einem Gradienten von 0 bis 0,2 M KCl eluiert. Um die Reinigung zu vervollständigen, wird das Protein schließlich über eine Bio-Sil-250-Säule (Bio-Rad), die mit 20 mM Kaliumphosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, und 500 mm DTT plus 15% Glycerin eluiert wird, chromatographiert. Nach dieser Stufe ist das Enzym zu mindestens 95% rein. Es besitzt kein verunreinigendes Protein in der SDS-PAGE, wobei die Proteine mittels Silbernitrat detektiert wurden. Dieser Reinheitsgrad wird durch die Einzigartigkeit der NH&sub2;-terminalen Sequenz bestätigt. Dessen Molekulargewicht in dieser Technik beträgt 31.000. Die verschiedenen Stufen der Reinigung der Präcorrin-6x-reduktase mit ihrem Reinigungsfaktor und ihrer Ausbeute sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt. Tabelle: Reinigung der Präcorrin-6x-reduktase

c) NH&sub2;-terminale Sequenz und interne Teilsequenzen von Präcorrin-6x-reduktase von Pseudomonas denitrificans und Identifikation des Strukturgens von Pseudomonas denitrificans, das diese Aktivität codiert

Die NH&sub2;-terminale Sequenz von Präcorrin-6x-reduktase von Pseudomonas denitrificans, die wie vorstehend beschrieben gereinigt wurde, wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt. Sechs Reste wurden identifiziert:
Ala-Gly-Ser-Leu-Phe-Asp
Ebenso wurden nach tryptischer Spaltung und Trennung der Fragmente mittels HPLC über eine Umkehrphasen-C-18-Säule drei interne Sequenzstücke erhalten:
Ile-Gly-Gly-Phe-Gly-Gly-Ala-Asp-Gly-Leu
Arg-Pro-Glu-Trp-Val-Pro-Leu-Pro-Gly-Asp-Arg
Val-Phe-Leu-Ala-Ile-Gly
Die NH&sub2;-terminale Sequenz des Proteins COBK (Fig. 16) entspricht genau der NH&sub2;-terminalen Sequenz der Präcorrin- 6x-reduktase, außer daß in der in Fig. 16 dargestellten Sequenz ein Methionin der durch direkte Sequenzierung bestimmten Peptidsequenz vorausgeht. Daraus folgt, daß das aminoterminale Methionin mit Sicherheit in vivo durch die Methionin-Aminopeptidase (Ben Bassat und Bauer, 1987) abgespalten wird. Ebenso entsprechen die drei internen Sequenzen den drei Sequenzen 60 bis 69, 112 bis 122 und 143 bis 148 des Proteins COBK. Das Molekulargewicht der gereinigten Präcorrin-6x-reduktase wird durch SDS-PAGE-Elektro phorese zu 31.000 bestimmt. Das COBK-Protein besitzt ein von seiner Sequenz abgeleitetes Molekulargewicht von 28.000 (Fig. 16). Die Entsprechungen zwischen den NH&sub2;- terminalen Sequenzen, internen Sequenzen und den Molekulargewichten zeigen klar an, daß das Protein COBK der Präcorrin-6x-reduktase entspricht. Das CobK-Gen ist das Strukturgen der Präcorrin-6x-reduktase.

d) Durch Präcorrin-6x-reduktase katalysierte Reaktion

Die enzymatische Reaktion der Reduktion von Präcorrin-6x ist bei P. denitrificans strikt NADPH-abhängig. Das NADPH kann nicht durch NADH ersetzt werden. Wenn das gereinigte Enzym (oder eine aktive Fraktion im Verlauf der Reinigung oder auch ein enzymatischer Rohextrakt) unter den Bedingungen der Aktivitätsbestimmung, aber in Abwesenheit von SAM und Dihydropräcorrin-6x-methylase inkubiert wird, kann das Reaktionsprodukt auch mittels HPLC in dem für die Reinigung von Präcorrin-6x beschriebenem System gereinigt werden (vergleiche Beispiel 6.1.4.d). Nach Entsalzung und Veresterung (schwefelsäurehaltiges Methanol in einer Konzentration von 4%, 20ºC, 24 h, Argonatmosphäre) besitzt der entsprechende Ester eine Masse m/z = 1008. Das Produkt der Reaktion, die durch Präcorrin-6x-reduktase katalysiert wird, ist nun Dihydropräcorrin-6x, das auch als Präcorrin- 6y bezeichnet wird.

6.1.8. Identifikation des Proteins COBQ, das von dem Gen CobQ codiert wird

a) Bestimmung der Cobyrinsäuresynthaseaktivität

Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung einer enzymatischen Aktivität des Biosynthesewegs von Cobalaminen, die bis zu diesem Tag niemals beschrieben wurde. Es handelt sich um die Cobyrinsäuresynthase. Dieses Enzym katalysiert die Amidierung der peripheren Carbonsäurefunktionen in den Positionen b, d, e und g an dem Corrinkern (siehe Fig. 19; PL 68). Der Spender der NH&sub2;-Gruppierungen ist L- Glutamin, und jede Amidierungsreaktion ist mit dem Verbrauch eines Moleküls ATP verbunden.
Die zu bestimmende Fraktion wird in der Dunkelheit bei 30ºC 60 min in 250 ul 0,1 M Tris-Hydrochlorid-Puffer pH 7,5, der 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM ATP, 2,5 mM MgCl&sub2;, 1 mM Glutamin, 10 gM Ado-Cobyrinsäuredi- oder -pentamid enthält, inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 25 ul einer wäßrigen 0,1 M Kaliumcyanidlösung gestoppt. Nach 10minütiger Erhitzung auf 80ºC und 10minütiger Zentrifugation bei 3000 g werden die gebildeten Verbindungen, die im Überstand vorhanden sind, mittels HPLC analysiert. Die Aktivitätseinheit wird wie die Menge an Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 nmol der Amidfunktionen pro h unter diesen Bedingungen zu ergeben.
5'-Desoxy-5'-adenosyl-(Ado)-cobyrinsäurediamid und -pentamid werden aus den Kulturen des Stamms SC510 in PS4-Medium unter Verwendung des Verfahrens, das im Prinzip in Beispiel 9 beschrieben ist, isoliert.

b) Reinigung der Cobyrinsäuresynthase

Aus der in Beispiel 6.1.8a) beschriebenen Bestimmung wird die Reinigung der Cobyrinsäuresynthase von Pseudomonas denitrificans wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
In einem typischen Reinigungsexperiment werden 6 g feuchte Zellen von SC510 Rifr, in die das Plasmid pXL618 eingeschleust worden war (siehe Beispiel 4.5.2) in 15 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7, 7, 1 mM DTT, 1 mM EDTA beschallt. Nach Zentrifugation (50.000 · g während 1 h) wird der Extrakt auf 20% mit Glycerin (Vol./Vol.) gebracht. 8,5 ml des Rohextrakts (203,5 mg Proteine) werden mit 24 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer, 1 mM DTT, 20% Glycerin versetzt. Die Lö sung wird in eine Mono-Q-HR-10/10-Säule (Pharmacia) in einer Menge von 2 ml/min injiziert, wobei mit 50 mM Tris- HC&sub1;-Puffer pH 7, 7, 1 mM DTT, 20% Glycerin equilibriert worden war. Die Proteine werden mit einem linearen Gradienten von 0,5 M NaCl eluiert, und die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf 1 mM EDTA gebracht. Die Lösung wird auf 0,85 M Ammoniumsulfat gebracht und in eine Phenyl-Superose-HR-5/5-Säule (Pharmacia), die mit dem Tris-HCl-Puffer pH 7,7, 1 mM DTT, 0,85 M Ammoniumsulfat equilibriert worden war, injiziert, und die Proteine werden mit einem linearen abnehmenden Gradienten von 0,85 M auf 0 M Ammoniumsulfat eluiert. Die Fraktionen werden sofort auf 20% Glycerin gebracht. Die aktive Fraktion wird auf 2,5 ml durch Ultrafiltration eingeengt und über eine PD-10-Säule (Pharmacia) chromatographiert, wobei mit 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 8,3, 1 mM DTT, 20% Glycerin (Vol./Vol.) equilibriert und eluiert wurde. Die Proteinfraktion wird gewonnen und in eine mit dem gleichen Puffer equilibrierte Mono-Q-HR-5/5-Säule injiziert, und die Proteine werden mit einem linearen Gradienten von 0,5 M NaCl eluiert. Die Permeationschromatographie über Bio-Sil-250-Gel (Bio-Rad) in einem 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5, 1 mM DTT, 20% Glycerin, 0,1 M NaCl erlaubt schließlich den Erhalt eines zu mehr als 97% reinen Proteins. Es besitzt kein verunreinigendes Protein in der SDS-PAGE. Diese Reinheit wird durch die Einzigartigkeit der NH&sub2;-terminalen Sequenz bestätigt, Dessen Molekulargewicht in dieser Technik beträgt 50.000. Die verschiedenen Stufen der Reinigung der Cobyrinsäuresynthase mit ihrem Reinigungsfaktor und ihrer Ausbeute sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt. Tabelle: Reinigung der Cobyrinsäuresynthase
a/ Mit Ado-Cobyrinsäure-a,c-diamid als Substrat
b/ Mit Ado-Cobyrinsäurepentamid als Substrat
ND = Nicht bestimmt
Der sehr hohe Reinheitsgrad des gereinigten Proteins sowie die Konstanz des Verhältnisses der Amidierungsaktivitäten von Cobyrinsäurediamid und -pentamid während des Reinigungsverfahrens des Proteins (siehe vorstehende Tabelle) zeigen ohne Zweifel an, daß nur ausschließlich das Protein für die vier Aktivitäten der Amidierung des Corrinkerns in den Positionen b, d, e und g verantwortlich ist.
c) NH&sub2;-terminale Sequenz der Cobyrinsäuresynthase von Pseudomonas denitrificans und Identifikation des Strukturgens von Pseudomonas denitrificans, das diese Aktivität codiert.
Die NH&sub2;-terminale Sequenz der Cobyrinsäuresynthase von Pseudomonas denitrificans wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt. Sechzehn Reste wurden identifiziert:
Thr-Arg-Arg-Ile-Met-Leu-Gln-Gly-Thr-Gly-Ser-Asp-Val-Gly-Lys-Ser
Die NH&sub2;-terminale Sequenz des Proteins COBQ (Fig. 47) entspricht genau dieser Sequenz, außer daß bei der in Fig. 47 dargestellten Sequenz ein Methionin der durch direkte Sequenzierung bestimmten Peptidsequenz vorausgeht. Daraus folgt, daß das aminoterminale Methionin mit Sicher heit in vivo durch die Methionin-Aminopeptidase (Ben Bassat und Bauer, 1987) abgespalten wird. Das Molekulargewicht der gereinigten Cobyrinsäuresynthase wird durch SDS- PAGE-Elektrophorese auf 57.000 abgeschätzt. Das Protein cobQ besitzt ein von seiner Sequenz abgeleitetes Molekulargewicht von 52.000 (Fig. 47). Die Entsprechungen zwischen den NH&sub2;-terminalen Sequenzen und den Molekulargewichten zeigen klar an, daß das Protein COBQ der Cobyrinsäuresynthase entspricht. Das Gen cobQ ist das Strukturgen der Cobyrinsäuresynthase.

6.1.9. Identifikation des Proteins COBO, das von dem Gen cob0 codiert wird

a) Bestimmung der Aktivität der cob(I)Alanin-adenosyltransferase (EC 2.5.1.17)

Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung einer enzymatischen Aktivität, die direkt mit dem Biosyntheseweg der Cobalamine verbunden ist. Es handelt sich um die cob(I)Alanin-adenosyltransferase (EC 2.5.1.17). Dieses Enzym wurde in bakteriellen Zellen (Ohta et al. 1976, Brady et al., 1962) und in tierischen Zellen (Fenton et al., 1978) nachgewiesen. Es wurde aus Clostridium tetanomorphum (Vitols et al., 1966) gereinigt. Die Fraktionen, die die cob(I)Alanin-adenosyltransferaseaktivität enthalten (etwa 20 Einheiten) werden anaerob bei 30% 15 min ohne Licht in 1 ml 0,2 M Tris-HCl-Puffer pH 8,0 in Gegenwart von 5 mM DTT, 400 uM [8-14C]ATP (2,5 uCi/umol), 800 uM MnCl&sub2;, 50 uM Hydroxycobalamin oder Diaquacobinamid und 3 mg KBH&sub4; inkubiert. Die Reaktion wird anschließend durch 10minütiges Erhitzen auf 80% gestoppt, und nach 5minütiger Zentrifugation mit 15.000 g werden 200 ul Überstand mittels HPLC analysiert (Gimsing et al., 1986, Jacobsen et al., 1986).
Die enzymatische Aktivitätseinheit ist als die Menge an Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 nmol Adenosylcorrinoid pro min unter diesen Bedingungen zu ergeben.

b) Reinigung der cob(I)Alanin-adenosyltransferaseaktivität

Aus der in Beispiel 6.1.9a) beschriebenen Bestimmung wird die Reinigung von cob(I)Alanin-adenosyltransferase von Pseudomonas denitrificans, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt.
In einem typischen Reinigungsversuch werde 10 g Feuchtzellen des Stamms SC510 Rifr, in dem das Gen cobQ amplifiziert wurde, in 20 ml 0,2 M Tris-HCl-Puffer pH 8,0 suspendiert und 40 min bei 4ºC beschallt. Der Rohextrakt wird anschließend durch 1stündige Zentrifugation mit 50.000 g gewonnen und über mit 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 8,5, 5 mM DTT (Puffer A) equilibrierte, PD-10-Säulen (Pharmacia) entsalzt. Die Proteinlösung wird anschließend über eine Mono-Q-HR-10/10-Säule (Pharmacia) mit Hilfe eines Gradienten von 0 bis 0,5 M KCl in Puffer A fraktioniert (280 mg Protein in jeder Chromatographie), anschließend werden die aktivitätshaltigen Fraktionen gereinigt, durch Ultrafiltration eingeengt und über eine Phenyl-Superose-HR-10/10- Säule (Pharmacia) mit einem linearen abnehmenden Gradienten von Ammoniumsulfat (1,7 bis 0 M) in einer Säule, die mit dem 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 8,0, 5 mM DTT equilibriert worden war, chromatographiert. Zur Durchführung der Reinigung wird das Protein schließlich chromatographiert, nach Einengung durch Ultrafiltration über eine Bio-Sil- 250-Säule (Bio-Rad) mit dem 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 7, 5, 0,1 M NaCl, 5 mM DTT eluiert.
Nach dieser Stufe ist das Enzym zu mehr als 95% rein. Es besitzt in der SDS-PAGE kein verunreinigendes Protein. Sein Molekulargewicht bei dieser Technik beträgt 28.000. Dieser Reinheitsgrad wird durch die Einzigartigkeit der NH&sub2;-terminalen Sequenz bestätigt. Die verschiedenen Reinigungsstufen von cob(I)Alanin-adenosyltransferase mit ihrem Reinigungsfaktor und ihrer Ausbeute sind in der nachste henden Tabelle für die zwei folgenden Substrate angegeben: Diaquacobinamid (a) und Hydroxycobalamin (b). Diese Ergebnisse zeigen das Fehlen von Spezifität bei diesem Enzym für die Natur des Substrats Corrinoid. Andererseits wurden alle Corrinoide des Biosynthesewegs zwischen Cobyrinsäurediamid und B12 in ihrer nativen Form isoliert (Blanche et al., Ergebnisse nicht veröffentlicht), und es stellte sich heraus, daß sie in der Form des Coenzyms vorliegen. Dies zeigt, daß das natürliche Substrat von cob(I)Alanin-adenosyltransferase Cobyrinsäure-a,c-diamid ist. Tabelle: Reinigung von cob(I)Alanin-adenosyltransferase
c/ nach Entsalzung über PD10
c) NH&sub2;-terminale Sequenz von cob(I)Alanin-adenosyltransferase von Pseudomonas denitrificans und Identifikation des Strukturgens von Pseudomonas denitrificans, das diese Aktivität codiert
Die NH&sub2;-terminale Sequenz von cob(I)Alanin-adenosyltransferase von Pseudomonas denitrificans, die wie in Beispiel 6.1.9b) beschrieben gereinigt wurde, wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt. 13 Reste wurden identifiziert:
Ser-Asp-Glu-Thr-?-Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Pro-Ala-Lys-Lys
Die NH&sub2;-terminale Sequenz des Proteins COBO (Fig. 47) entspricht genau der NH&sub2;-terminalen Sequenz von cob(I)Alanin-adenosyltransferase, ausgenommen, daß bei der in Fig. 47 dargestellten Sequenz ein Methionin der durch direkte Sequenzierung bestimmten Peptidsequenz vorausgeht. Daraus folgt, daß das aminoterminale Methionin mit Sicherheit in vivo durch die Methioninaminopeptidase abgespalten wird (Ben Bassat und Bauer, 1987). Das Molekulargewicht von gereinigter cob(I)Alanin-adenosyltransferase wird mittels SDS-PAGE-Elektrophorese zu 28.000 bestimmt. Das Protein COBO besitzt ein von seiner Sequenz abgeleitetes Molekulargewicht von 24.000 (Fig. 47). Die Entsprechungen zwischen den NHZ-terminalen Sequenzen und den Molekulargewichten zeigen klar an, daß das Protein COBO der cob(I)Alanin-adenosyltransferase entspricht. Das Gen COBO ist das Strukturgen der cob(I)Alanin-adenosyltransferase.

6.1.10. Identifikation des Proteins COBN, das von dem cobN-Gen codiert wird

a) Nachweis der Aktivität der Umwandlung von Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid in Cobyrinsäure-a,c-diamid

Dieses Beispiel erläutert den Nachweis einer enzymatischen Aktivität, die direkt mit dem Biosyntheseweg der Cobalamine verbunden ist, die bis heute nie beschrieben wurde. Es handelt sich um die Aktivität zur Umwandlung von Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid in Cobyrinsäure-a,c-diamid.
Diese Aktivität wird unter anderem durch das folgende typische Experiment nachgewiesen. Ein Rohextrakt des Stamms 5C510 Rifr wird durch Beschallen von 10 g feuchten Zellen in 20 ml 0,2 M Tris-HCl-Puffer pH 8,0, anschließende Entfernung der Zelltrümmer durch 1stündige Zentrifugation bei 50.000 g erhalten. 1000 mg Protein dieses Extrakts werden 1 h bei 30ºC mit am Kohlenstoff 14 markiertem Hydrogenobyrinsäurediamid (32 nmol; 50 uCi/umol) in 40 ml 0,2 M Tris- HC&sub1;-Puffer pH 8,0 mit 7 mM ATP, 200 uM CoCl&sub2; inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 7,5 ml 1 M KH&sub2;PO&sub4; und 6 ml 0, 3 M KCl, gefolgt von einer 10minütigen Erhitzung auf 80ºC, gestoppt. Nach 15minütiger Zentrifugation bei 15.000 g zeigt die HPLC-Analyse des Überstands: (I) die Bildung während der Inkubation von 19,2 nmol Cobyrinsäure-a,c-diamid mit der gleichen spezifischen Radioaktivität wie das Ausgangs-Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid und (2) das Verschwinden einer entsprechenden Menge der letzteren. Um zu bestätigen, daß es sich um Cobyrinsäure-a,c-diamid handelt, wird das Produkt mittels HPLC gereinigt, anschließend wird es mit Methanol, das 5% Schwefelsäure enthält (18 h, 20ºC), verestert. Die Authentizität des gebildeten Pentamethylesters von Cobyrinsäure-a,c-diamid wird mittels TLC (unter Bezugnahme auf eine Referenzprobe) und Massenspektrometrie gezeigt. Es wird darauf hingewiesen, daß unter ähnlichen Inkubationsbedingungen, unter denen die radioaktive Markierung nicht an Hydrogenobyrinsäurea,c-diamid, sondern an Cobalt eingeführt wird (unter Verwendung von Cobalt 57), mit Cobalt markiertes Cobyrinsäure-a,c-diamid biosynthetisiert wird und die gleichen Schlußfolgerungen gezogen werden können. Das mit Kohlenstoff 14 markierte Hydrvgenobyrinsäure-a,c-diamid wird wie folgt erhalten: die Hydrogenobyrinsäure wird in vitro unter Verwendung von [Methyl-14C]SAM biosynthetisiert, anschließend in Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid umgewandelt und mittels HPLC wie in Beispiel 6.1.2 beschrieben gereinigt.
Diese Untersuchung zeigt, daß die Insertion von Cobalt in Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid bei P. denitrificans stattfindet. Unter den beschriebenen Bedingungen ist die Hydrogenobyrinsäure nicht das Substrat der enzymatischen Chelatierung durch Cobalt.

b) Bestimmung und Reinigung eines Proteins des Stamms SC510 Rifr, das an der Umwandlung von Hydrogenobyrinsäurea,c-diamid in Cobyrinsäure-a,c-diamid beteiligt ist

Die zu bestimmende Fraktion (0,5 bis 2 Einheiten) wird 60 min bei 30ºC mit 50 ul Rohextrakt des Stamms SC510 Rifr, der wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, 7 mM ATP, 20 pM CoCl2, 7 uM Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid, markiert an Kohlenstoff 14 (50 uC1/umol) in 400 ul 0,1 M Tris-HCl- Puffer pH 8,0 inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 75 ul 1 M KH&sub2;PO&sub4; und 60 ul 0,3 M KCN gestoppt, anschließend 10 min auf 80ºC erhitzt. Nach 15minütiger Zentrifugation mit 15.000 g wird der Überstand mittels HPL analysiert, um das Cobyrinsäure-a,c-diamid quantitativ zu bestimmen (vgl. Beispiel 9). Die enzymatische Aktivitätseinheit ist als die Menge an Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 nmol Cobyrinsäure-a,c-diamid pro h unter diesen Bedingungen zu erzeugen. Unter diesen Bedingungen scheint, daß die Extrakte des Stamms SC510 Rifr, in den das Plasmid pXL1909 eingeschleust worden war (siehe Beispiel 4.5.2) eine Aktivität zwischen der 20- und 50fach erhöhten Aktivität der Extrakte des Stamms SC510 Rifr besitzen. Auf dieser Grundlage wurde ein Protein gereinigt, das allein für diese Amplifikation der Aktivität verantwortlich ist.
In einem typischen Reinigungsversuch werden 10 g feuchte Zellen des Stamms SC510 Rifr, in den das Plasmid pXL1909 eingeschleust worden war, in 20 ml 0,2 M Tris-HCl-Puffer pH 8,0 suspendiert und 30 min bei 4ºC beschallt. Der Rohextrakt wird anschließend durch 1stündige Zentrifugation mit 50.000 g gewonnen und über eine mit einem 0,1 M Tris- HC&sub1;-Puffer pH 8,0 (Puffer A) equilibrierte PD10-Säule (Pharmacia) entsalzt. Die Proteinlösung wird anschließend über eine Mono-Q-HR-10/10-Säule (Pharmacia) mit Hilfe eines Gradienten von 0 bis 0,5 M KCl in Puffer A fraktio niert (213 mg Protein in jeder Chromatographie). Anschließend werden die aktivitätshaltigen Fraktionen vereinigt, durch Ultrafiltration konzentriert, über PD10-Säulen (Pharmacia), die mit dem 0,1 M Tris-HC&sub1;-Puffer pH 7,2 (Puffer B) equilibriert worden waren, entsalzt und über eine Mono-Q-HR-10/10-Säule (Pharmacia) mit Hilfe eines Gradienten von 0 bis 0,5 M KCl in Puffer B chromatographiert. Die aktivitätshaltigen Fraktionen werden vereinigt, durch Ultrafiltration konzentriert, über PD10-Säulen (Pharmacia), die mit Puffer B equilibriert worden waren, entsalzt und über eine Mono-Q-HR-5/5-Säule (Pharmacia) mit Hilfe eines Gradienten von 0 bis 0,5 M KCl in Puffer B chromatographiert. Zur Durchführung der Reinigung wird das Protein schließlich über eine Bio-Sil-250-Säule (Bio-Rad), die mit 20 mM Kaliumphosphat, 20 mM Natriumsulfat, pH 6,8, eluiert wurde, chromatographiert.
Nach dieser Stufe ist das Enzym zu mehr als 95% rein. Es besitzt kein verunreinigendes Protein in der SDS-PAGE. Sein Molekulargewicht bei dieser Technik beträgt 135.000. Dieser Reinheitsgrad wird durch die Einzigartigkeit der NH&sub2;-terminalen Sequenz bestätigt. Die verschiedenen Stufen der Reinigung des Proteins des Stamms SC510 Rifr, der an der Umwandlung von Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid in Cobyrinsäure-a,c-diamid beteiligt ist, mit ihrem Reinigungsfaktor und ihrer Ausbeute sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. Tabelle: Reinigung eines Proteins des Stamms SC510 Rifr, das an der Umwandlung von Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid in Cobyrinsäure-a,c-diamid beteiligt ist

c) NH&sub2;-terminale Sequenz des Proteins, das an der Umwandlung von Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid in Cobyrinsäurea,c-diamid von Pseudomonas denitrificans beteiligt ist, und Identifikation des Strukturgens von Pseudomonas denitrificans, das diese Aktivität codiert

Die NH&sub2;-terminale Sequenz dieses wie in Beispiel 6.1.10b) beschrieben gereinigten Proteins wird wie vorstehend beschrieben bestimmt. Sechs Reste wurden identifiziert:
His-Leu-Leu-Leu-Ala-Gln
Die NH&sub2;-terminale Sequenz des Proteins COBN (Fig. 47) entspricht genau der NH&sub2;-terminalen Sequenz des gereinigten Proteins, ausgenommen, daß bei der in Fig. 47 dargestellten Sequenz ein Methionin der durch direkte Sequenzierung bestimmten Peptidsequenz vorausgeht. Daraus folgt, daß das aminoterminale Methionin mit Sicherheit in vivo durch die Methionin-Aminopeptidase abgespalten wird (Ben Bassat und Bauer, 1987). Das Molekulargewicht des gereinigten Proteins wird durch SDS-PAGE-Elektrophorese auf 135.000 geschätzt. Das COBN-Protein besitzt ein von seiner Sequenz abgeleitetes Molekulargewicht von 138.000 (Fig. 47). Die Entsprechungen zwischen den NH&sub2;-terminalen Sequenzen und den Molekulargewichten zeigen klar an, daß das Protein COBN dem an der Umwandlung von Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid in Cobyrinsäure-a,c-diamid beteiligten Protein entspricht. Das Gen cobN ist nun das Strukturgen dieses Proteins.

6.1.11. Identifikation des COBP-Proteins, das von dem CobP-Gen codiert wird

a) Bestimmung der Cobinamidkinaseaktivität

Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung einer enzymatischen Aktivität des Biosynthesewegs der Cobalamine, der bis zu diesem Tag nie untersucht wurde. Es handelt sich um die Aktivität Cobinamidkinase. Sie katalysiert die ATP-abhängige Phosphorylierung der Hydroxylgruppe des (R)-1- Amino-2-propanolrests von Ado-Cobinamid, wodurch Cobinamidphosphat erzeugt wird.
Die zu bestimmende Fraktion wird im Dunkeln bei 30ºC während 60 min in 500 ul 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 8, 8, enthaltend 1 mM EDTA, 1 mM ATP, 2, 5 mM MgCl&sub2; und 16 uM Ado- Cobinamid inkubiert (Blanche et al., 1989). Die Reaktion wird unter Zugabe von 500 ul einer wäßrigen 20 ml Kaliumcyanidlösung gestoppt. Nach 10minütigem Erhitzen auf 80% und 10minütiger Zentrifugation mit 5000 g wird das in dem Überstand vorhandene gebildete Cobinamidphosphat mittels HPLC (vergleiche Beispiel 9) unter Verwendung des vereinfachten folgenden linearen Gradienten bestimmt: 25% bis 30% B in A in 15 min. anschließend 30% bis 100% B in 12 min und in 3 min auf 100% B.
Die Aktivitätseinheit ist als die Menge an Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 nmol Cobinamidphosphat aus Cobinamid pro h unter diesen Bedingungen zu erzeugen.

b) Bestimmung der Cobinamidphosphatguanylyltransferaseaktivität

Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung einer enzymatischen Aktivität des Biosynthesewegs von Cobalaminen, der bis zu diesem Tag nie untersucht wurde. Es handelt sich umdie Cobinamidphosphatguanylyltransferaseaktivität. Sie ka talysiert die Addition des GMP-Teils als GTh-Molekül an Ado-Cobinamidphosphat, wodurch so ein GDP-Cobinamidmolekül erzeugt wird und ein Pyrophosphatmolekül freigesetzt wird.
Diese Aktivität wird unter den gleichen Bedingungen wie die der Cobinamidkinase bestimmt, ausgenommen, daß Ado-Cobinamidphosphat (16 uM) (Blanche et al., 1989) und GTP (2 mM) Ado-Cobinamid bzw. ATP während der Inkubation ersetzen.
Die Aktivitätseinheit ist als die Menge an Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 nmol GDP-Cobinamid aus Cobinamidphosphat pro h unter diesen Bedingungen zu erzeugen.

c) Reinigung der Cobinamidkinase

Aus der in Beispiel 6.1.11a) beschriebenen Bestimmung wird die Reinigung der Cobinamidkinase von Pseudomonas denitrificans wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
In einem typischen Reinigungsversuch werden 5 g feuchte Zellen von SC510 Rifr, in die das Plasmid pXL623 eingeschleust worden war (siehe Beispiel 4.5.2), in 20 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,6 (Puffer A) beschallt. Nach Zentrifugation (50.000 g für 1 h) und 4stündiger Dialyse gegen Puffer A werden 4,5 ml des Retentats in eine mit Puffer A equilibrierte Mono-Q-HR-10/10-Säule (Pharmacia) injiziert. Die Proteine werden mit einem linearen Gradienten von 0,5 M NaCl eluiert, und die aktiven Fraktionen werden vereinigt und über eine PD-10-Säule (Pharmacia) geleitet, die in 30 mM Tris-HCl/5 mM Kaliumphosphat/5 gN Calciumchlorid pH 7,6 (Puffer B) equilibriert worden war. Die Proteinlösung wird über eine Bio-Gel-HPHT-Säule (Bio-Rad) fraktioniert, die in Puffer B equilibriert worden war und mit einem Gradienten von 5 bis 350 mM Kaliumphosphat eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf 500 mIN Am moniumsulfat gebracht, anschließend über eine Phenyl-Superose-5/5-Säule (Pharmacia) fraktioniert, wobei mit einem abnehmenden Ammoniumsulfatgradienten eluiert wird. Die Fraktion, die die Aktivität enthält, wird schließlich über eine Mono-Q-HR-5/5-Säule in Tris-HCl-Puffer mit pH 7,3 erneut gereinigt. Nach dieser Stufe ist das Protein zu mehr als 97% rein. Es besitzt kein verunreinigendes Protein in der SDS-PAGE. Diese Reinheit wird durch die Einzigartigkeit der NH&sub2;-terminalen Sequenz bestätigt. Sein Molekulargewicht bei dieser Technik beträgt 20.000. Die verschiedenen Stufen der Reinigung von Cobinamidkinase mit ihrem Reinigungsfaktor und ihrer Ausbeute sind in der nachstehend angegebenen Tabelle A zusammengestellt.
Die Fraktionen, die die Cobinamidkinaseaktivität enthalten, besitzen auch die Cobinamidphosphatguanylyltransferaseaktivität. Andererseits bleibt, wie die in der vorstehenden Tabelle dargelegten Ergebnisse zeigen, das Verhältnis dieser zwei Aktivitäten in den Fraktionen während der Reinigung konstant. Schließlich besitzt das gereinigte Protein einen hohen Reinheitsgrad von mehr als 97%. Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt nun zweifellos an, daß ein und dasselbe Protein für die zwei sukzessiven Aktivitäten verantwortlich ist, nämlich die Cobinamidkinase und Cobinamidphosphatguanylyltransferase des Biosynthesewegs der Cobalamine bei Pseudomonas denitrificans.

d) NH&sub2;-terminale Sequenz von Cobinamidkinase- Cobinamidphosphatguanylyltransferase von Pseudomonas denitrificans und Identifikation des Strukturgens von Pseudomonas denitrificans, das diese Aktivität codiert

Die NH&sub2;-terminale Sequenz von Cobinamidkinase-Cobinamidphosphatguanylyltransferase von Pseudomonas denitrificans wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt. Zehn Reste wurden identifiziert:
Ser-Ser-Leu-Ser-Ala-Gly-Pro-Val-Leu-Val Tabelle: Reinigung der Cobinamidkinase-Cobinamidphosphatguanylyltransferase von Pseudomonas denitrificans
a Ausgehend von 1 g feuchten Zellen von SC510 pXL622, gezüchtet in PS4-Medium (Cameron et al., 1989) ohne Cobalt.
TABELLE A
Die NH&sub2;-terminale Sequenz des Proteins COBP (Fig. 47) entspricht genau dieser Sequenz, ausgenommen, daß bei der in Fig. 47 dargestellten Sequenz ein Methionin der durch direkte Sequenzierung bestimmten Peptidsequenz vorausgeht. Daraus folgt, daß das aminoterminale Methionin mit Sicherheit in vivo durch die Methionin-Aminopeptidase abgespalten wird (Ben Basat und Bauer, 1987). Das Molekulargewicht der gereinigten Cobinamidkinase-Cobinamidphosphatguanylyltransferase wird mittels SDS-PAGE-Elektrophorese auf 20.000 abgeschätzt. Das COBP-Protein besitzt ein von seiner Sequenz abgeleitetes Molekulargewicht von 19.500 (Fig. 47). Die Entsprechungen zwischen den NH&sub2;-terminalen Sequenzen und den Molekulargewichten zeigen klar an, daß das Protein COBP der Cobinamidkinase-Cobinamidphosphatguanylyltransferase entspricht. Das Gen cobP ist das Strukturgen der Cobinamidkinase-Cobinamidphosphatguanylyltransferase.

6.2. - Bestimmung der Eigenschaften der Proteine COB durch Messungen der angehäuften Biosynthesezwischenprodukte

Dieses Beispiel erläutert, wie es möglich ist, einem COB- Protein von Pseudomonas denitrificans eine enzymatische Aktivität zuzuordnen. Diese Aktivität wird gemäß den erhaltenen Werten bezüglich der angehäuften Biosynthesezwischenprodukte bei der oder den blockierten Mutanten in der infragekommenden Stufe zugeordnet. In der Tat, wenn eine Mutante ein Biosynthesezwischenprodukt anreichert, ist es sehr wahrscheinlich, daß diese Mutante in der Stufe blockiert ist, die als Substrat das infragekommende Zwischenprodukt hat.

6.2.1. Eigenschaften der Proteine COBC und COBD

Die Mutanten Cob G643 (Agrobacterium tumefaciens) und G572 (Pseudomonas putida), die bereits in den Beispielen 1 und 4 beschrieben wurden, wurden in der dem Protein COBC ent sprechenden Stufe blockiert. In der Tat werden diese zwei Mutanten nicht durch die aktivierenden Insertionen des Transposons Tn5 komplementiert, die in dem Gen cobC vorkommen. Die zwei Stämme G643 und G572 sowie die nichtmutierten Elternstämme [C58-C9 Rifr und KT 2440 Rifr (Cameron et al., 1989)] wurden in PS4'-Medium für A. tumefaciens und PS4 " für P. putida (PS4' und PS4 " entsprechen dem PS4-Medium, das jeweils 100 bzw. 1000fach weniger Cobalt als das vorstehend beschriebene PS4-Medium enthält) 3 Tage wie vorstehend beschrieben gezüchtet. 57CoC12 wurde den Kulturen (2,5 uCi/0,1 um für die Kultur zu 25 ml) zugesetzt. Die intracellulären Corrinoide wurden in ihrer nativen Form isoliert und durch ihr HPLC-Verhalten identifiziert. Die Elternstämme reichern keine anderen Corrinoide als Coenzym B&sub1;&sub2; an. Die zwei Mutanten, G643 und G572, reichern adenosylierte Cobyrinsäure in den jeweiligen Verhältnissen 11% bzw. 6% an. Die Anteile in % werden bezogen auf die durch den Elternstamm synthetisierte Menge an Coenzym B12 berechnet. Außer der Cobyrinsäure reichert die G643-Mutante Cobyrinsäurepentaamid in einem Verhältnis von 2% an. Das Cobyrinsäurepentaamid ist das Zwischenprodukt, das der Cobyrinsäure vorausgeht. Die Untersuchung dieser Mutanten läßt die Schlußfolgerung zu, daß sie nach der Cobyrinsäure blockiert sind. Alle diese Cob-Mutanten sind entweder zwischen Uro'Gen III und Cobinamid oder dem Cobinamid und den Cobalaminen blockiert. Die Mutanten G643 und G572 sind zwischen Uro'Gen III und dem Cobinamid blockiert. Wenn diese Mutanten vor dem Cobinamid blockiert sind und alle beide Cobyrinsäure anreichern, können die Proteine, die sie codieren, nur an der enzymatischen Stufe (mit der Bezeichnung Cobinamidsyntase) beteiligt sein, die die Amidierung von Cobyrinsäure durch einen Aminopropanolrest katalysiert, wodurch Cobinamid erhalten wird. Sie können auch gegebenenfalls an der Synthese des Subtrats der Reaktion, die Aminopropanol beisteuert, beteiligt sein, wenn dies Aminopropanol nicht selbst ist. Das cobC- Gen codiert ein Protein, das entweder Cobinamidsynthase oder eine seiner Untereinheiten ist.
Die Mutante Cob G634 von Agrobacterium tumefaciens, die in der entsprechenden Stufe in dem Gen cobfl blockiert ist, wurde auf gleiche Weise analysiert. Diese Mutante wird durch die inaktivierenden Insertionen des Gens cobD nicht komplementiert (Beispiel 4.1.). Das einzige intracelluläre Corrinoid, das bei dieser Mutante aufgefunden wird, ist das der adenosylierten Cobyrinsäure. Wie die vorausgehenden Mutanten codiert diese Mutante ein Protein, das an der Umwandlung von Cobyrinsäure in Cobinamid oder gegebenenfalls auch an der Synthese des anderen Reaktionssubstrats beteiligt ist. Diese zwei verschiedenen Gene (cobC und cobD) codieren zwei Proteine, die an der gleichen Stufe beteiligt sind.

6.2.2. Eigenschaften der Proteine COBF bis COBM

Die bereits beschriebenen Mutanten von Agrobacterium tumefaciens, von denen man gemäß der in Beispiel 4.2. beschriebenen Untersuchung weiß, an welchen Genen jede von ihnen blockiert ist, wurden untersucht. Es sind die Mutanten: G612 (cobF), G615 (cobG), G616 (cobH), G613 (cobI), G611 (cobJ), G620 (cobK), G638 (cobL) und G609 (cobM); in Klammern wurde das Gen von Pseudomonas denitrificans angegeben, das für die Komplementation dieser Mutanten verantwortlich ist (Beispiel 5), das nun dem mutierten Gen bei dieser Mutante entspricht. Diese Mutanten wurden in PS4- Medium, wie vorstehend beschrieben, mit markiertem Cobalt gezüchtet. Nach 4 Tagen Inkubation wurden die Mutanten auf ihren intracellulären Gehalt an Corrinoiden und Descobaltocorrinoiden analysiert (vgl. Beispiele 6.1.2. und 9). Tabelle: Von den in den Genen des 8,7 kb-Fragments von Pseudomonas denitrificans blockierten Mutanten von Agrobacterium tumefaciens angehäufte Zwischenprodukte
HAB: Hydrogenobyrinsäure
HABM: Hydrogenobyrinsäuremonoamid
HABD: Hydrogenobyrinsäurediamid
* in der Tat handelt es sich um den Stamm C58-C9 RifrNalr, der bereits beschrieben wurde (Cameron et al., 1989)
¹ Werte sind in % der gleichen, bei dem nichtmutierten Elternstamm angehäuften Zwischenprodukte angegeben
Diese Ergebnisse zeigen, daß alle Mutanten kein Corrinoid anhäufen (mit Ausnahme der in dem cobF-Gen inaktivierten Mutante G612, die selbst Cobinamid, aber in geringer Menge, entsprechend 2, 2%, der von dem nichtmutierten Stamm synthetisierten Cobalamine anhäuft). Jedenfalls besitzen bestimmte Mutanten (G612, G615 und G616) Cobalamingehalte, die mehr als 10% des Gehalts an Cobalaminen des Eltern stamms ausmachen. Es ist wahrscheinlich, daß alle diese Mutanten mindestens vor Cobyrinsäurediamid blockiert sind. Alle diese Mutanten häufen Hydrogenobyrinsäure und Hydrogenobyrinsäurediamid in Mengen an, die unter den Mengen des nichtmutierten Stamms liegen; sie sind nun sehr wahrscheinlich vor der Hydrogenobyrinsäure blockiert. Es kann gefolgert werden, daß alle Gene cobF bis cobG Proteine codieren, die vor der Hydrogenobyrinsäure beteiligt sind. Man weiß, daß die Mutante G613 in dem cobI-Gen mutiert ist, das SP2MT codiert, das auch vor der Hydrogenobyrinsäure ein Zwischenprodukt ist. Für diese Mutante sind die Ergebnisse des vorliegenden Beispiels, betreffend die Anhäufung der Zwischenprodukte, in perfekter Übereinstimmung mit der bei dieser Mutante inaktivierten Stufe, nämlich, daß diese Mutant kein Zwischenprodukte nach der Hydrogenobyrinsäure in einem Gehalt anhäuft, der über dem liegt, den man bei dem nichtmutierten Stamm beobachtet. Dieses Ergebnis gilt für die Gene cobF, cobJ, cobL, cobM, die mit denjenigen des Beispiels 6.4. zusammenhängen, worin vorgeschlagen ist, daß diese Gene Proteine codieren, die SAMabhängige Methylübertragungen katalysieren und die vor der Hydrogenobyrinsäure beteiligt sind. Mit Ausnahme von cobI, das das Strukturgen von SP2MT ist, sind diese Gene nach Präcorrin-3 beteiligt. In der Tat, da sie weder die Strukturgene von SUMT noch von SP2MT sind, sind sie viel später, d. h. nach Präcorrin-3 beteiligt (alle in der vorliegenden Erfindung beschriebenen cob-Gene sind zwischen Uro'Gen III und den Cobalaminen beteiligt). Diese Gene cobF bis cobH und cobJ bis cobM codieren Enzyme, die zwischen Präcorrin-3 und Hydrogenobyrinsäure beteiligt sind.

6.2.3. Eigenschaften der Proteine COBS und COBT

Die Mutante G2035, die in den Beispielen 1 und 4.3. beschrieben wurde, ist in der dem Protein COBS entsprechenden Stufe blockiert. Die in Beispiel 1 beschriebene Mu tante G2037 ist in der dem Protein COBT entsprechenden Stufe blockiert. Diese Stämme sowie der Elternstamm (Agrobacterium tumefaciens C58C9Rifr) werden in PS4'-Medium (es handelt sich um ein P54-Medium, in dem die Konzentration an Cobaltchlorid 100fach geringer ist als in PS4-Medium) in Gegenwart von radioaktivem Cobalt &sup5;&sup7;CoCl&sub2; 3 Tage gezüchtet, dann wird ihr intracellulärer Gehalt an Descobaltocorrinoiden analysiert, ebenso der Gehalt an Corrinoiden, wie bereits vorstehend beschrieben (vgl. Beispiel 6.2.2). Die Stämme G2035 und G2037 reichern keine Corrinoide an, und große Konzentrationen (größer als diejenigen, die bei dem Elternstamm beobachtet werden) an Hydrogenobyrinsäure und Hydrogenobyrinsäuremono- und -diamid sind nur bei dem Stamm G2035 vorhanden. Diese Mutante ist wahrscheinlich in einer Stufe, die nach der Hydrogenobyrinsäurediamid und vor der Cobyrinsäurediamid gelegen ist, blockiert. Folglich codiert das cobS-Gen vermutlich ein Enzym, das an der Umwandlung von Hydrogenobyrinsäurediamid in Cobyrinsäurediamid beteiligt ist. Dieses Protein kann nun entweder an der Einfügung von Cobalt oder an der Reduktion von Cobalt des nichtadenosylierten Cobyrinsäurea,c-diamids beteiligt sein. Im Gegensatz dazu ist die Mutante G2037 vermutlich in einer Stufe, die vor der Hydrogenobyrinsäure gelegen ist, blockiert. Das cobT-Gen codiert vermutlich ein Protein, das an der enzymatischen Stufe vor der Hydrogenobyrinsäure und nach Präcorrin-3 beteiligt ist (andere Strukturgene, die nach Präcorrin-3 beteiligte Enzyme codieren, wurden bereits identifiziert). Eine andere Möglichkeit für das Protein COBT ist, daß es wie in Beispiel 5 beschrieben als Protein beteiligt ist, das Cobalt bindet und/oder als Protein mit einem anderen Proteinanderen Proteinen durch seinen sauren Teil wechselwirkt.

6.2.4. Eigenschaften von Protein COBv

Die Mutanten G2039 und G2040, die in den Beispielen 1 und 4.4. beschrieben wurden, sind in der entsprechenden Stufe von Protein COBV blockiert. Diese Stämme sowie der Elternstamm werden in PS4'-Medium in Gegenwart von radioaktivem Cobalt &sup5;&sup7;CoCl&sub2; gezüchtet, anschließend wird ihr intracellulärer Gehalt an Descobaltocorrinoiden analysiert, und der Gehalt an Corrinoiden wird bestimmt, wie in Beispiel 9 beschrieben. Die Stämme G2039 und G2040 reichern Cobyrinsäure, Cobinamid und Cobinamidphosphat und GDP-Cobinamid an. Diese Mutanten sind wahrscheinlich in einer enzymatischen Stufe vor dem GDP-Cobinamid blockiert. Das cobV-Gen codiert vermutlich ein Enzym, das an der Umwandlung von GDP-Cobinamid in Cobalamin beteiligt ist, siehe Fig. 5. Dieses Ergebnis stimmt perfekt mit der Aktivität der Cobalamin-(5'-phosphat)synthase des COBV-Proteins überein, das Ado-GDP-Cobinamid als Substrat besitzt.

6.3. - Bestimmung der Aktivität des COB-Proteine durch Affinitätsstudien gegenüber SAM

Dieses Beispiel erläutert, wie es möglich ist, ausgehend von gereinigten COB-Proteinen von Pseudomonas denitrificans in vitro eine Bindungsaktivität von SAM nachzuweisen. Wenn ein COB-Protein eine derartige Aktivität besitzt, bedeutet dies, daß dieses COB-Protein eine Methyltransferase des Stoffwechselwegs ist und daß es an einem der Transfers der acht Methylgruppierungen beteiligt ist, die zwischen Uro'Gen III und Cobyrinsäure stattfinden.

6.3.1. Affinitätstest auf SAM an einem gereinigten Protein

Der Test beruht auf dem folgenden Prinzip, gemäß dem die Methyltransferase des Biosynthesewegs der Cobalamine mit Sicherheit eine SAM-Bindungsstelle besitzen. Diese Bindungsstelle muß durch eine höhere SAM-Affinität als für jedes Protein, das SAM nicht spezifisch bindet, nachgewie sen werden. Bei Inkubation des zu untersuchenden Proteins in Gegenwart eines Überschusses an radioaktivem SAM wird dieses von freiem SAM durch eine Gelpermeationschromatographie abgetrennt. Die in der Fraktion des Molekulargewichts des Proteins aufgefundene Radioaktivität entspricht dem während der Inkubation gebundenen SAM. Die Chromatographie wird bei 2ºC durchgeführt, um die Freisetzung von gebundenem SAM während der Trennung maximal zu beschränken.
Das Protein (etwa 10 ug) wird 10 min bei 30ºC in 200 ul 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,7 mit 5 nmol [Methyl-3H]-SAM (1 uCi) inkubiert. Nach Inkubation werden 100 ul des Gemisches sofort in eine TSK-125-(Bio-Rad)-Säule injiziert, die mit 1 ml/min mit dem Gemisch aus 50 mM Natriumsulfat/20 mM Natriumdihydrogenphosphat pH 6,8, wie vom Anbieter dieser Säule vorgesehen, eluiert wird. Fraktionen zu 0,5 ml werden gewonnen und mittels Flüssigkeitsszintillation ausgezählt. Die Retentionszeiten des Proteins und SAM werden direkt nach der Aufzeichnung der Absorption des Eluats bei 280 nm erhalten.

6.3.2. In vitro-Untersuchung der SAM-Bindung an die Proteine COBA und COBF von Pseudomonas denitrificans

a) Reinigung der Proteine COBF und COBA

Das Protein COBF von Pseudomonas denitrificans wird, wie nachstehend beschrieben, gereinigt. In einem typischen Experiment zur Reinigung werden 5 g feuchte Zellen des Stamms SC510 Rifr, in den das Plasmid pXL1546 eingeschleust worden war (siehe Beispiel 7.3.), erhalten mit Kultur in PS4-Medium, in 30 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,7 resuspendiert und 15 min bei 4ºC beschallt. Der Rohextrakt wird anschließend durch 1stündige Zentrifugation mit 50.000 g gewonnen, und der Überstand wird durch eine DEAE-Sephadex-Säule (1 ml Gel) geleitet, um vorhandene Tetrapyrrolverbindungen zu beseitigen. 10 mg der Proteine (0,7 ml) dieses Extrakts werden anschließend in eine mit dem gleichen Puffer equilibrierte Mono-Q-HR- 5/5-Säule injiziert. Die Proteine werden mit einem linearen KC&sub1;-Gradienten (0, bis 0,25 M) eluiert. Das COBF- Protein wird bei 0,20 M KCl eluiert. Es wird zweimal mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,5 verdünnt und ein zweites Mal über eine Mono-Q-HR-5/5-Säule gereinigt. Die SDS-PAGE- Elektrophorese unter Detektion mit Coomassieblau wird verwendet, um das Protein sichtbar zu machen. Diese Technik zeigt andererseits, daß COBF eine Reinheit von etwa 95% nach dieser Reinigungsstufe besitzt. Die NH&sub2;- terminale Sequenz des gereinigten Proteins wurde wie vorstehend beschrieben ermittelt. Die NH&sub2;-terminalen Sequenzen erscheinen in jedem Abbauzyklus gleichzeitig; es sind die folgenden Sequenzen in den angegeben Verhältnissen:
Die Sequenz 1 entspricht der NH&sub2;-terminalen Sequenz des COBF-Proteins, das in Fig. 6 angegeben ist, ausgenommen, daß das aminoterminale Methionin gemäß den bereits mitgeteilten Regeln (Hirel et al., 1989) durch die Methionin- Aminopeptidase abgespalten wird (Ben Bassat und Bauer, 1989). Die Sequenz 2, die in größeren Mengen vorhanden ist, entspricht dem gleichen Protein, aber der Translationsstart erfolgt vermutlich nicht bei dem ATG-Initiationscodon der Translation, das vermutet wurde, sondern bei dem, das 5 Codons stromabwärts des codierenden Rasters gelegen ist (Fig. 16). In der Tat, die Aminosäuren dieser Sequenz sind exakt diejenigen, die man in der Sequenz des COBF-Proteins ausgehend von dem zweiten Methionin (Aminosäure Nr. 6) dieser Sequenz findet (Fig. 16). In diesem Fall wird das aminoterminale Methionin nicht herausgeschnitten, was die bereits mitgeteilten Regeln bestätigt (Hirel et al., 1989). Es gibt bei dem Stamm SC510 Rifr, der das Plasmid pXL156 enthält, zwei Translationsstartpunkte, von denen einer dem in guter Entfernung in der vorliegenden Konstruktion von der Shine- und Delgarno- Sequenz plazierten Methionincodon entspricht, und der andere, der zu dem zweiten Methionincodon führt, sich in der Sequenz des cobF-Gens, die in Fig. 16 dargestellt ist, befindet. Daraus folgt, daß wahrscheinlich das COBF-Protein nicht bei dem in Fig. 16 angegeben Methionin beginnt, sondern bei dem, das sich 5 Aminosäuren weiter befindet.
Jedenfalls zeigt dieses Ergebnis, daß es sich sicher um das COBF-Protein handelt, das exprimiert wird, und daß dieses in einer um 4 Aminosäuren verlängerten Form exprimiert wird. Während der Reinigung werden die zwei Proteinformen gereinigt. In diesem Beispiel wird das gereinigte COBF-Protein als Gemisch dieser zwei gereinigten Proteine bezeichnet.
Das Protein COBA von Pseudomonas denitrificans wird wie vorstehend beschrieben gereinigt (Blanche et al., 1989).

b) Bindung von SAM

Die Bindung von SAM an diese zwei Proteine wird wie vorstehend in Beispiel 6.3.1a) beschrieben untersucht. Rinderserumalbumin und das gereinigte COBH-Protein werden als negative Kontrollen verwendet. Für die Proteine COBA und COBF wird ein Radioaktivitätspeak am Ende der TSK-125- Säule gleichzeitig mit dem Austritt dieser Proteine beobachtet (Fig. 20). In diesem Test zeigt das COBI-Protein die gleiche Bindungseigenschaft für SAM. Im Gegensatz dazu gibt es keine derartigen Radioaktivitätspeaks mit BSA und dem Protein COBH. Dieser Test beweist die in vitro-Bindung von SAM an die Proteine COBA, COBI und COBF. Diese Ergebnisse zeigen, daß COBA, COBI und COBF SAM-Methyltransferasen sind. Dieses Ergebnis stimmt vollkommen mit den COBA- und COBI-Aktivitäten überein, da es sich jeweils um SP&sub2;MT von Pseudomonas denitrificans handelt. Das COBF-Protein ist nun wahrscheinlich eine SAM-Methyltransferase des Biosynthesewegs der Cobalamine. Dieser Test bestätigt, daß COBF eine Methyltransferase ist.

6.4. - Bestimmung der Aktivität der COB-Proteine durch Sequenzhomologiestudien.

Dieses Beispiel erläutert, wie durch Vergleiche der Sequenzen verschiedener COB-Proteine von Pseudomonas denitrificans es möglich ist, die COB-Proteine zu finden, die SAM-Methyltransferasen des Biosynthesewegs der Cobalamine sind.
Die Proteine COBI und COBA sind alle beide SAM-Methyltransferasen des Biosynthesewegs. Diese zwei Proteine wurden gemäß dem Programm von Kanehisa, 1984, verglichen. Dieser Vergleich läßt drei Regionen mit starker Homologie erkennen (Fig. 21). In jeder dieser Regionen liegt mehr als 45% strikte Homologie zwischen den zwei Proteinen vor. Drei Regionen mit starker Homologie zwischen COBA und CYSG sind ebenfalls dargestellt (Fig. 22); es sind die gleichen Regionen von COBA, die eine starke Homologie mit COBI zeigen. Diese Regionen mit starken Homologien zwischen COBA, CYSG und COBI besitzen Homologien mit anderen COB- Proteinen. Es handelt sich um die Proteine COBF, COBJ, COBL und COBM (Fig. 23). Was die Region 1 betrifft, besitzen die Proteine COBF, COBL und COBM signifikante Homologien, bezogen auf alle Proteine von Genpro, was ein Proteinextrakt von Genbank (Version 59), verstärkt durch ver mutliche codierende Teile mit mehr als 200 Aminosäuren gemäß dem Programm von Kanehisa (1984) ist. Was die Region 2 betrifft, besitzen die Proteine COBJ, COBL und COBM signifikante Homologien, bezogen auf alle Proteine von Genpro (Version 59). Was die dritte Region mit Homologie betrifft, besitzen COBJ, COBL und COBM signifikante Homologien, bezogen auf alle Proteine von Genpro (Version 59). Die Vergleiche der Sequenzen erlauben nun den Nachweis, daß vier Proteine COBF, COBJ, COBL und COBM signifikante Homologien mit den konservierten Sequenzregionen von drei Typen von Methyltransferasen COBA, COBI und COBF besitzen. Die Proteine COBG, COGH und COBK besitzen keine signifikanten Homologien mit den konservierten Regionen der Methylasen. Das Protein COBF besitzt keine signifikante Homologie mit den anderen Proteinen, außer in Region 1. Diese Homologien müssen wahrscheinlich der Tatsache entsprechen, daß alle diese Proteine Methyltransferasen sind. Dieses Ergebnis bestätigt die biochemischen Daten, die an COBF hinsichtlich der Fähigkeit dieses Proteins, SAM in vitro zu binden, beschrieben wurde (Beispiel 6.3.). Diese Homologien erlauben einerseits die Bestätigung, daß COBF eine SAM-Methyltransferase des Biosynthesewegs der Cobalamine ist und andererseits den Nachweis, daß COBJ, COBL und COBM SAM-Methyltransferasen des Biosynthesewegs von Cobalaminen sein könnten. Diese Ergebnisse zeigen auch die Homologie, die zwischen den COB-Proteinen von P. denitrificans und den isofunktionellen Proteinen anderen Mikroorganismen vorliegen.

BEISPIEL 6(B) - Reinigung und Clonierung des Strukturgens von SUMT von Methanobacterium ivanovii

Dieses Beispiel erläutert, wie es möglich ist in anderen Mikroorganismen COB-Enzyme und cob-Gene entsprechend denjenigen, die bei P. denitrificans identifiziert wurden, zu erhalten.

6(B).1. Reinigung von SUMT von Methanobacterium ivanovii

Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung von SUMT von Methanobacterium ivanovii und die Untersuchung seiner katalytischen Eigenschaften. Der Stamm Methanobacterium ivanovii DSM2611 wird wie beschrieben gezüchtet (Souillard et a1., 1988). 12 g der feuchten Zellen werden erhalten. Diese werden in 80 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,6, enthaltend 5 mM DTT und 1 mM EDTA, resuspendiert und 1 h 30 min bei 4ºC beschallt, anschließend 1 h bei 50.000 g zentrifugiert. Der Extrakt wird anschließend von freien Tetrapyrrolverbindungen durch Passage durch eine kleine DEAE-Sephadex-A25-Säule, die mit dem gleichen Puffer eluiert wird, befreit. Die Proteine, die zwischen 55 und 75% Sättigung mit Ammoniumsulfat ausfallen, werden in einem 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,5, 0,5 mM DTT, 1,7 M Ammoniumsulfat solubilisiert und in eine Phenyl-Superose-HR-10/10- Säule (Pharmacia, Frankreich/SA) injiziert, die mit einem abnehmenden Gradienten (von 1,7 M bis 0 M Ammoniumsulfat) eluiert wird. Die aktiven Fraktionen werden durch eine Sephadex-G-25-Säule, die mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,5, 0,5 mM DTT, 25% Glycerin (Puffer A) equilibriert worden war, geleitet, anschließend in eine mit Puffer A equilibrierte Mono-Q-HR-5/5-Säule (Pharmacia Frankreich SA) injiziert und mit einem KC&sub1;-Gradienten von 0 bis 0, 3 M eluiert; diese Stufe wird ein zweites Mal unter den gleichen Bedingungen wiederholt. Eine Gelpermeationschromatographie über Bio-Sil TSK-250 (BioRad Frankreich SA) der aktiven Fraktion der vorstehenden Stufe erlaubt den Erhalt eines in der SDS-PAGE und in der RP-HPLC (C-18 uBondapak) homogenen Proteins. Die verschiedenen Stufen der Reinigung mit ihrer Ausbeute sowie ihr Reinigungsfaktor sind in der nachstehenden Tabelle beschrieben.
Wie in dieser Tabelle gezeigt, beträgt der Gesamtreinigungsfaktor mehr als 4500. Die Eigenschaften des reinen Enzyms wurden gemäß bereits beschriebenen Methoden unter sucht (Blanche et al., 1989). Dieses Enzym besitzt eine SUMT-Aktivität, d. h., es katalysiert den Transfer von zwei Methylgruppen in Abhängigkeit von SAM in C-2 und in C-7 von Uro'Gen III. Das durch Gelpermeation geschätzte Molekulargewicht des Enzyms beträgt 60.000 +/- 1500, während es gemäß SDS-PAGE 29.000 beträgt, was klar zeigt, daß es sich um ein homodimeres Enzym handelt. Unter den bereits beschriebenen Bedingungen (Blanche et al., 1989) besitzt das Enzym einen Km-Wert für Uro'Gen III von 52 +/- 8 n14. Außerdem zeigt dieses Enzym keine Hemmung durch sein Substrat in Konzentrationen unter 20 uM, während das SUMT von Pseudomonas denitrificans eine Hemmung von Uro'Gen III in einer Konzentration über 2 uM zeigt (Blanche et al., 1989). Tabelle: Reinigung von SUMT von M. ivanovii
1/ berechnet gemäß der Ausbeute an Proteinen
Vmax von SUMT von M. ivanovii wurde bestimmt. Er beträgt 1537 E/mg Protein. Dieser Wert liegt über dem, der für SUMT von P. denitrificans aufgefunden wird, der bereits unter optimalen Reaktionsbedingungen bestimmt wurde (unter Berücksichtigung seiner Hemmung durch Uro'Gen III), 489 E/mg Protein (Blanche et al., 1989).

6(B).2. Clonierung des Strukturgens von SUMT von M. ivanovii in E. coli

6(B).2.1. Clonierung eines internen Fragments des Strukturgens von SUMT von M. ivanovii. Dazu wird wie folgt vorgegangen: 200 picomol von SUMT von M. ivanovii werden zur NH&sub2;-terminalen Sequenzierung des Proteins wie vorstehend beschrieben verwendet. Weiterhin wird ein durch tryptische Spaltung des Proteins erhaltenes Peptidfragment auch einer Sequenzierung seines NH&sub2;-terminalen Teils unterworfen. Die erhaltenen Sequenzen sind in Fig. 48 dargestellt. Die Sens- bzw. Antisens-Oligonukleotide 946, 923 und 947 (siehe Fig. 48) werden wie vorstehend beschrieben. Diese Oligonukleotide enthalten an ihrem 5'-Ende eine Restriktionsspaltstelle, die entweder EcoRI für die Sens-Oligonukleotide oder Hindill für das Antisens-Oligonukleotid ist. Diese Oligonukleotide werden für ein enzymatisches Amplifikationsexperiment der DNA (Saiki et al., 1988) verwendet, wie in Fig. 48.B. schematisch dargestellt.
Die genomische DNA von M. ivanovii wird wie folgt hergestellt. 0,4 g Zellen von M. ivanovii (DSM 2611) werden mit einer 0,15 M NaCl-Lösung gewaschen. Die Zellen werden anschließend in 4 ml einer Lösung aus 25% Saccharose, 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 8, 40 mg Lysozym inkubiert, anschließend 2 bis 3 h bei 50ºC nach Zugabe von 40 mg Proteinase K und 5 ml einer Lösung aus 0,2% SDS, 0,1 M EDTA pH 8 inkubiert. Die DNA wird anschließend mit Phenol-Chloroform (50%-50%) 2mal, anschließend 2mal mit Chloroform extrahiert und anschließend mit Isopropanol ausgefällt und 3 ml TNE (10 mM Tris-HCl-Puffer pH 8, 1 mM EDTA, 100 mM Na-Cl) aufgenommen.
Die enzymatische Amplifikation der DNA von M. ivanovii wird gemäß dem Protokoll von Saiki et al., 1988 in einem Volumen von 0,1 ml mit 600 ng genomischer DNA von M. ivanovii unter Verwendung der Startersequenzen 946 und 947 (Reaktion 1) oder 923 und 947 (Reaktion 2) durchgeführt. Der für diese Reaktion verwendete Puffer ist 1 M MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 0,001% Gelatine und jedes dNTP in einer Konzentration von 0,2 mM; für jede Amplifikationsreaktion werden 10 mg jedes Oligonukleotids verwendet, ebenso 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Cetus Corporation). Die Amplifikation wird an 30 Zyklen in einem Perkin-Elmer-Cetus-DNA-Amplifikationssystem durchgeführt; im Verlauf jedes Zyklus wird die DNA 1 min bei 95ºC denaturiert; die Oligonukleotid- Startersequenzen werden mit einzelsträngiger DNA 2 min bei 38ºC hybridisiert, und die neuen Stränge werden 3 min bei 72ºC polymerisiert. Die Amplifikationsprodukte werden anschließend mit Chloroform extrahiert und dann einer Ethanolfällung unterworfen. Sie können anschließend nach Wanderung auf einem Acrylamidgel sichtbar gemacht werden, dann mit den Restriktionsenzymen, wie EcoRI und Hindill, gespalten werden.
Im Falle der Reaktion 1 werden zwei Fragmente beobachtet: eines zu 615 bp sowie eines zu 240 bp. Was die Reaktion 2 betrifft, werden ebenfalls zwei Fragmente beobachtet: eines zu 630 bp und eines zu 170 bp. Die Gesamtheit des Produkts einer enzymatischen Amplifikationsreaktion zwischen den Oligonukleotiden 946 bis 947 wird durch Wanderung über Acrylamidgel getrennt. Das 615-bp-Fragment wird wie vorstehend beschrieben gereinigt. Dieses Fragment wird anschließend mit EcoRI und HindIII gespalten, um die Enden des Fragments kohäsiv zu machen. Dieses Fragment wird anschließend mit DNA der replikativen Form des Phagen M13mp19 ligiert. Die Ligatur wird in E. coli TG1 transformiert. Sechs rekombinante Clone, die eine Insertion von 615 bp enthalten, werden durch Sequenzierung mit dem Universalprimer -20 (Pharmacia SA, Frankreich) analysiert. Wie in Fig. 49 gezeigt, muß, wenn einzelsträngige DNA der rekombinanten Phagen, die die 615-bp-Insertion enthalten, sequenziert wird, stromabwärts der EcoRI-Spaltstelle eine nichtdegenerierte Sequenz, die der des Oligonukleotids 946 entspricht, gefolgt von einer Sequenz, die die Aminosäuren LITLKAVNVLK?ADWL (? bedeutet, daß an dieser Position der Rest nicht bestimmt werden konnte) codiert, beobachtet werden; diese Sequenz entspricht der, die in der NH&sub2;-terminalen Sequenz von SUMT den dem Oligonukleotid 946 entsprechenden Aminosäuren folgt (siehe Fig. 48). Für zwei Clone wurde effektiv nach der EcoRI-Spaltstelle eine Sequenz beobachtet, die für die NH&sub2;-terminale Region von SUMT von Methanobacterium ivanovii codieren kann, wobei diese mit dem Kettenelement Pro-Gly-Asp-Pro-Glu-Leu beginnt, das Aminosäuren sind, die von einer Sequenz, die Oligonukleotid 946 enthält, codiert wird. Diese Beobachtung zeigt, daß diese zwei replikativen rekombinanten Formen eine Insertion enthalten, die einem internen Fragment des Strukturgens von SUMT von Methanobacterium ivanovii entspricht. Die replikative Form, die dieses interne Fragment des Strukturgens von M. ivanovii enthält, wird als pG10 bezeichnet.

6(B).2.2. Clonierung des Strukturgens von SUMT von Methanobacterium ivanovii

Die genomische DNA von Methanobacterium ivanovii wird mit mehreren Restriktionsenzymen (einfache oder doppelte Spaltungen) gespalten. Nach der Spaltung werden die Fragmente durch Agarosegelelektrophorese getrennt, dann werden sie wie vorstehend beschrieben auf eine Nylonmembran überführt. Nach Denaturierung der so überführten Fragmente und Vorhybridisierung wird eine Hybridisierung mit der replikativen Form pGlO als an 32P markierte Sonde, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. So wurde gefunden, daß ein Fragment, das aus einer EcoRI-BglII-Spaltung zu 3,2 kb von Methanobacterium ivanovii hervorgeht, mit der Sonde hybridisiert (Fig. 50). 40 ug genomische DNA von M. ivanovii werden anschließend mit EcoRI und BglII gespalten, dann durch Wanderung über ein Agarosegel getrennt. Die Fragmente mit einer Größe zwischen 3 und 3,5 kb werden wie vorstehend beschrieben elektroeluiert. Die so gereinigten Fragmente werden mit dem Vektor pBKS+ ligiert (Stratagene Cloning Systems, La Jolla), der durch BamHI-EcoRI gespalten worden war. Die Ligierung wird in E. coli DHSα (Gibco BRL) transformiert. Die Transformanten werden über ein mit Ampicillin und X-gal supplementiertes LB-Medium selektioniert. 800 weiße Kolonien werden auf dem Filter aufgenommen. Nach Wachstum und anschließender Lyse der Bakterien wird eine Koloniehybridisierung gemäß der Technik von Grünstein und Hogness (1975) durchgeführt. Die verwendete Sonde ist die replikative Form pG10, die an 32P markiert ist. Ein einzelner positiver Clon wird nach diesem Hybridisierungstest mit der Sonde gefunden. Die Plasmid-DNA dieses Clons wird als pXL1809 bezeichnet (siehe Fig. 56). Eine Spaltung dieser DNA mit EcoRI-XbaI erlaubt wie erwartet die Sichtbarmachung einer 3,2-kb- Insertion. Das Plasmid pXL1809 wird an den zwei Strängen durch die Technik von Chen und Seeburg (1985) sequenziert. Eine 955 Basen lange Sequenz wird erhalten (Fig. 51). Eine Analyse des offenen Leserasters führt zur Identifikation eines offenen Rasters von der Base 34 (ATG) bis zu Base 729 (TGA). Dieses offene Raster codiert ein Protein, dessen Sequenz in Fig. 52 dargestellt ist. Dieses Protein besitzt ein Molekulargewicht von 24.900 (siehe Fig. 53), was nahe des Molekulargewichts des aus M. ivanovii gereinigten Proteins ist. Die NH&sub2;-terminale Sequenz dieses Proteins ist genau diejenige, die für SUMT von gereinigtem M. ivanovii bestimmt wurde (siehe Fig. 48 und Fig. 52). Diese Beobachtungen legen zweifelsohne fest, daß das clonierte und sequenzierte Gen das Strukturgen von SUMT von M. ivanovii ist. Da diese Aktivität vermutlich an der Biosynthese von Corrinoiden bei allen Bakterien beteiligt ist, wird dieses Gen als das Gen corA bezeichnet, und das von dem gleichen Gen codierte Protein als Gen CORA bezeichnet. Das Hydrophobieprofil des CORA-Proteins von M. ivanovii, das mit dem Programm von Hopp und Woods (1981) hergestellt wurde, zeigt, daß es sich wie erwartet um ein hydrophiles Protein handelt, wie in Fig. 54 dargestellt. Das CORA-Protein von M. ivanovii zeigt einen strikten Homologiegrad von mehr als 40% gegenüber COBA von P. denitrificans (Fig. 53). Diese Homologie erstreckt sich fast auf die Gesamtheit der zwei Proteine, da sie die Reste 3 bis 227 von CORA von M. ivanovii und die Reste 17 bis 251 von COBA von P. denitrificans betrifft. Diese Homologie spiegelt die strukturellen Homologien wider, die zwischen zwei Proteinen, die die gleiche Reaktion katalysieren, existieren. Dies sind die gleichen Regionen, die zwischen CORA und COBA von P. denitrificans am meisten konserviert sind, wie sie zwischen COBA von P. denitrificans und CYSG von E. coli konserviert sind (Fig. 22).

BEISPIEL 7 - Expression der COB-Proteine

7.1. - Expression bei Pseudomonas denitrificans

Dieses Beispiel erläutert, daß die Amplifikation eines Strukturgens eines COB-Proteins von Pseudomonas denitrificans bei Pseudomonas denitrificans zu einer Amplifikation der Aktivität des COB-Proteins führt.

7.1.1. - Expression des COBA-Proteins

Das Plasmid pXL557 entspricht dem Plasmid pXL59, in das das BcrlII-EcoRV-Fragment (jeweils an den Positionen 80 bzw. 2394 in der Sequenz von Fig. 7) zu 2,4 kb des 5,4 kb-Fragments cloniert wurde. Dieses Fragment enthält die Gene cobA und cobE.
Das Plasmid pXL545 enthält nur das cobE-Gen. Dessen Konstruktion wurde in Beispiel 4.1. beschrieben.
Diese zwei Plasmide wurden durch konjugativen Transfer in SC510 Rifr eingeschleust. Die Stämme SC510 Rifr, SC510 Rifr pXL59, SC510 Rifr pXL557 und SC510 Rifr pXL545 wurden in PS4-Medium gezüchtet. Nach 4 Tagen wurden die Kulturen gestoppt, und die SUMT-Aktivitäten wurden gemäß dem bereits beschriebenen Standardprotokoll (F. Blanche et al., 1989) bestimmt. Die Aktivitäten sind nachstehend zusammengestellt. Tabelle: SUMT-Aktivität von SC510 Rifr und von einigen seiner Derivate
Aus diesen Ergebnissen folgt klar, daß nur das Plasmid pXL557 bei SC510 Rifr eine deutliche Erhöhung der SUMT-Aktivität herbeiführt (Faktor 50). Diese Erhöhung ist das Ergebnis der Amplifikation von cobA und nicht von cobr, da das Plasmid pXL545, das nur die Amplifikation von cobE erlaubt, keine Erhöhung der SUMT-Aktivität hervorruft. Dieses Ergebnis bestätigt, daß cobA das Strukturgen von SUMT von Pseudomonas denitrificans ist. Dieses Ergebnis zeigt, daß man eine Amplifikation der SUMT-Aktivität bei Pseudomonas denitrificans durch Amplifikation des Strukturgens von SUMT von Pseudomonas denitrificans erhalten kann.

7.1.2. - Expression des COBI-Proteins

Ein Fragment, das aus dem 8,7 kb-DNA-Fragment stammt, das das Strukturgen von SP2MT (cobI) enthält, wird in ein Plasmid mit einem breiten Wirtsspektrum bei gramnegativen Bakterien cloniert, anschließend wird dieses Plasmid durch Konjugation in Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr eingeschleust. Die S-Adenosyl-L-methionin: Präcorrin-2-Methyltransferaseaktivität des Stamms wird anschließend im Vergleich zu derjenigen des den Vektor enthaltenden Stamms gemessen.
Das Fragment BamHI-BamHI-SstI-SstI zu 1,9 kb, das die Gene cobH und cob1 enthält, wird aus dem 8,7 kb-Fragment gereinigt. XbaI- und EcoRI-Linker werden jeweils an die BamHI- und SstI-Enden angefügt, nachdem diese mit DNA-Polymerase des Bakteriophagen T4 aufgefüllt worden waren. Das Fragment wird anschließend zwischen die XbaI- und EcoRI- Spaltstellen des Plasmids mit einem breiten Wirtsspektrum pXL59 insertiert. Es enthält eine Kanamycinresistenz. Das so erhaltene Plasmid wird als pXL1148 bezeichnet (Fig. 24).
Außerdem wurde ein ähnliches Plasmid konstruiert: das BamHI-BamHI-SstI-Fragment zu 1,5 kb, das nur das ganze cobH-Gen und den 5'-Teil des cobI-Gens enthält, wurde aus dem 8,7 kb-Fragment gereinigt. XbaI- und EcoRI-Linker wurden an die BamHI- bzw. SstI-Spaltstellen nach deren Auffüllung oder Spaltung mit DNA-Polymerase des Phagen T4 angefügt. Dieses Fragment wurde anschließend in EcoRI- und XbaI-Spaltstellen von pXL59 insertiert, wodurch das Plasmid pXL1149 erhalten wurde. Die Plasmide pXL1148 und pXL1149 unterscheiden sich nur durch die Anwesenheit des 0,3 kb-SstI-SstI-Fragments in pXL1148, das das 3'-Ende des cob1-Gens enthält. pXL1148 besitzt das ganze Strukturgen von cob1 im Gegensatz zu pXL1149. Die zwei Plasmide enthalten das cobH-Gen.
Diese zwei Plasmide wurden durch Konjugation in SC510 Rifr eingeschleust. Die Stämme SC510 Rifr, SC510 Rifr pXL59, SG510 Rifr pXL1148 und SC510 Rifr pXL1149 werden in PS4-Me dium gezüchtet. Nach 4 Kulturtagen wurden die zeilen gewonnen und die SP&sub2;MT-Aktivitäten wurden wie in Beispiel 6.1.3a) beschrieben bestimmt.
Das Ergebnis dieser Bestimmungen ist nachstehend mit den wie in Beispiel 6.1.3a) definierten SP&sub2;MT-Aktivitäten zusammengestellt. Tabelle: SP&sub2;MT-Aktivitäten von verschiedenen Stämmen, die von Pseudomonas denitrificans abgeleitet sind
1 auf 500 ug Rohextrakt, der für den Test eingesetzt wurde.
Die Aktivität ist als % wie in Beispiel 6.1.3a) definiert ausgedrückt.
Nur das Plasmid pXL1148 führt zu einer meßbaren Erhöhung der SP&sub2;MT-Aktivität. Im Gegensatz dazu ergibt das Plasmid pXL1149 keine Ergebnisse, die sich von denen, die bei den Kontrollen SC510 Rifr und SC510 Rifr pXL59 beobachtet werden, unterscheiden. pXL1148 ist das einzige Plasmid, das das cob1-Gen enthält und ist das einzige Plasmid, das die SP&sub2;MT-Aktivität amplifiziert. Dieses Ergebnis bestätigt, daß das Strukturgen von SP2MT von Pseudomonas denitrificans das cobI-Gen ist. Außerdem wird, wenn die Gesamtproteine der verschiedenen Stämme durch Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE mit 10% Acrylamid) getrennt werden, spezifisch im Fall von pXLII48 die Anwesenheit einer Bande beobachtet, die einem Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 25.000 entspricht (Fig. 25). Das Molekulargewicht dieses Proteins entspricht dem des COBI-Proteins. Das Plasmid pXL1148 erlaubt den Erhalt einer Überproduktion des Proteins COBI bei Pseudomonas denitrificans.

7.1.3. - Expression yon COBF

Die Expression wird dadurch erhalten, daß man stromaufwärts des cobF-Gens den Ptrp-Promotor von E. coli und die Ribosomenbindungsstelle des cII-Gens des Bakteriophagen lambda plaziert. Die so erhaltene Expression ist viel höher als diejenige, die durch einfache genetische Amplifikation durch das gleiche Multicopy-Plasmid beobachtet wird.
Das etwa 2 kb große EcoRI-BamHI-BamHI-Fragment von pXL1496 (Beispiel 7.2.1.) wird gereinigt (Fig. 26). Dieses Fragment enthält den Ptrp-Promotor von E. coli und die Ribosomenbindungsstelle des Gens cli des Bakteriophagen lambda stromaufwärts des Gens cobF. Stromabwärts des Gens cobF befindet sich der Terminator des Operons rmB von E. coli. Dieses Fragment wird an die EcoRI-BamHI-Spaltstellen des Plasmids pXL230 cloniert, wodurch pXL1546 erhalten wird (Fig. 26). pKT230 ist ein Plasmid der Imkombatibilitätsgruppe Q, das sich bei fast allen gramnegativen Bakterien repliziert (Bagdasarian et al., 1981); dieses Plasmid trägt das Kanamycinresistenzgen. Die Plasmide pXL1546 und pKT230 werden durch Konjugation in SC510 Rifr eingeschleust. Die Stämme SC510 Rifr, SC510 Rifr pKT230 und SC510 Rifr pXL1546 werden in PS4-Medium, wie vorstehend beschrieben, gezüchtet. Nach 4 Kulturtagen werden die Gesamtproteine der verschiedenen Stämme mittels 10%iger SDS-PAGE analysiert. Wie in Fig. 27 gezeigt, wird in dem Extrakt von SC510 Rifr pXL1546 ein Protein mit einem Mole kulargewicht von etwa 32.000 beobachtet, das überexprimiert wird; dieses Protein wandert gleichzeitig mit dem Protein, das bei E. coli B pXL1496 überexprimiert wird (Beispiel 7.2.1.). Außerdem wird dieses Protein spezifisch in dem Stamm SC510 Rifr exprimiert, der pXL1546 enthält, worin es mindestens 20% der Gesamtproteine darstellt. Im Gegensatz dazu wird dieses Protein nicht in den Gesamtproteinen der Stämme SC510 Rifr und 50510 Rifr pKT230 beobachtet. Dieses überexprimierte Protein ist nun das COBF-Protein.

7.1.4. - Expression von COBH

Dieses Beispiel beschreibt die Amplifikation eines DNA- Fragments von Pseudomonas denitrificans, das das cobH-Gen enthält. Das Protein, das von diesem Gen codiert wird, wird gereinigt; es handelt sich um das Protein COBH. Das Plasmid pXL1149, das in Beispiel 7.1.2. beschrieben wurde, enthält in der DNA-Insertion aus dem 8,7 kb-Fragment nur das ganze cobH-Gen. Bei 50510 Rifr führt dieses Plasmid im Gegensatz zum Vektor zur Überexpression eines Proteins mit einem Molekulargewicht von 22.000 (Fig. 25).

7.1.5. - Expression von COBV

Dieses Beispiel beschreibt die Amplifikation der Cobalamin-(5'-phosphat)synthaseaktivität durch ein Plasmid, das nur cobV enthält (pXL699, siehe Fig. 38). Die Cobalamin- (5'-phosphat)synthaseaktivität wird bei SC877Rifr durch das Plasmid pXL699 um einen Faktor 50, verglichen mit dem gleichen Stamm mit dem Vektor pXL435, pXL1303, pXL1324 oder pKT230, erhöht. Dieses Plasmid enthält auf seiner Insertion nur das ganze cobV, außerdem die 5'-terminalen Teile von ORF18 und von cobU. Es ist sicher, daß in einem derartigen Stamm (SC877RIfr pXL699) das COBV-Protein überexprimiert wird. Diese Überexpression erfolgt um einen Faktor 50, bezogen auf die Expression des Stamms SC877Rifr.

7.1.6. - Expression des Proteins CORA

Das EcoRI-BamHI-BamHI-Fragment zu 1,5 kb von pXL1832 (siehe Beispiel 7.2.4.), das den Ptrp-Promotor, dann RBS cII des Bakteriophagen λ, das Strukturgen von SUMT von M. ivanovii und die Terminatorregion des Operons rrnB von E. coli enthält, wird an die EcoRI-BamHI-Spaltstellen von pKT230 (Bagdasarian et al., 1981) cloniert. So wird das Plasmid pXL1841 erhalten (siehe Fig. 56). Dieses Plasmid wird bei P. denitrificans 5C510 Rifr wie vorstehend beschrieben mobilisiert. Ein Transkonjugant wird außerdem ausführlich untersucht. Dieser Stamm wird in PS4-Medium gezüchtet, und die SUMT-Aktivität der Bakterienextrakte wird gleichzeitig wie die des Kontrollstamms SC510 Rifr pXL435 (Cameron et al., 1989) bestimmt. Die Aktivitäten dieser Stämme sind nachstehend angegeben.
Dieses Ergebnis zeigt klar, daß es eine Expression der SUMT-Aktivität von M. ivanovii bei P. denitrificans dank des Plasmids pXL1841 gibt, da die SUMT-Aktivität des Stamms SC510 Rifr pXL1846 deutlich über der von SC510 Rifr pXL435 liegt.

7.2. - Expression bei E. coli

Dieses Beispiel erläutert, wie ein COB-Protein von Pseudomonas denitrificans bei E. coli überproduziert werden kann.

7.2.1. - Expression von COBF

Die Überproduktion wird dadurch erhalten, daß stromaufwärts des cob-Gens der Ptrp-Promotor von E. coli und die Ribosomenbindungsstelle des Gens cli des Bakteriophagen lambda positioniert wird. Das EcoRI-XhoI-Fragment zu 2250 bp des 8,7 kb EcoRI-Fragments (in den Positionen 0 bzw. 2250 auf der in Fig. 8 dargestellten Sequenz) wurde in den Phagen M13mp19 (Norrander et al., 1983) zwischen die EcoRI- und SalI-Spaltstellen cloniert. Das so konstruierte Plasmid wurde als pXL1405 bezeichnet. Die NdeI-Spaltstelle wurde durch gerichtete Mutagenese so eingeführt, daß die drei letzten Basen (ATG) dieser Restriktionsspaltstelle die Translationsstartstelle des Gens cobF darstellt. Dieses stammt von einer Modifikation der drei Basen, die dem ATG des cobF-Gens vorausgehen, GAA (das G befindet sich in Position 733 der in Fig. 8 dargestellten Sequenz) in CAT. Das NdeI-SphI-SnhI-Fragment (Fig. 26), das das cobF-Gen enthält, wurde anschließend gereinigt; dieses Fragment zu 1,5 kb wurde anschließend zwischen die NdeI- Sphl-Spaltstelle des Plasmids pXL694 (Denefle et al., 1987) cloniert. Das so konstruierte Plasmid wird als pXL1496 bezeichnet (Fig. 26). In dem EcoRI-NdeI-Fragment zu 120 bp (das aus pXL694 stammt), das dem cobF-Gen vorausgeht, sind Signale zur Regulation der genetischen Expression von E. coli vorhanden. Diese Signale bestehen aus der Region [-40+1] des Ptrp-Promotors von E. coli, anschließend aus 73 bp, die die Ribosomenbindungsstelle des Gens cli des Bakteriophagen λ (Denefle et al., 1987) enthalten. Stromabwärts des cobF-Gens befinden sich die Terminatoren des Operons rmB von E. coli (in dem HindIII- BamHI-Fragment). Das Plasmid pXL1496 wurde durch Transformation in den Stamm E. coli eingeschleust (Monod und Wollman, 1947). Die Expression des cobF-Gens wurde wie bereits beschrieben (Denefle et al., 1987) unter Bedingungen, unter denen der Ptrp-Promotor reprimiert ist (Anwesenheit von Tryptophan) oder nicht reprimiert ist (Abwesenheit von Tryptophan), untersucht. Das Medium, in dem die Expression durchgeführt wurde, ist das Minimalmedium M9 (Miller, 1972), supplementiert durch 0,4% Glucose, 0,4% Casaminosäuren, 10 mM Thiamin und 40 ug/ml Tryptophan, in dem Fall, in dem man den Promotor Ptrn reprimieren möchte. Der Stamm E. coli B pXL1496 wurde bei 37ºC in dem vorstehend beschriebenen Medium mit 100 ug Ampicillin gezüchtet. Wie in Fig. 28 gezeigt, führt das Fehlen von Tryptophan zur Expression eines Proteins mit einem Molekulargewicht von 32.000. In der Tat wird in dem Extrakt der Gesamtproteine von E. coli B pXL1496 bei der Analyse mittels SDS-PAGE (Fig. 28) klar ein Protein mit einem Molekulargewicht von 32.000 beobachtet, das zwischen 1 und 4% der Gesamtproteine ausmacht. Dieses Protein ist in einer deutlich geringeren Menge im Extrakt der Gesamtproteine von E. coli B pXL1496, der unter den gleichen Bedingungen, aber in Gegenwart von Tryptophan gezüchtet wurde, vorhanden. Das Molekulargewicht des Proteins, das unter diesen Bedingungen exprimiert wird, liegt in der Nähe des Molekulargewichts des COBF-Proteins, das von der Aminosäuresequenz des Proteins mit 28927 abgeleitet ist (Fig. 16). Das Protein, das so bei E. coli exprimiert wird, ist das Protein COBF.

7.2.2 - Expression von COBT

Die Überproduktion wird durch Fusionieren des lac-Promotors und der ersten drei Codons von lacZ von E. coli an das 5'-Ende des cob-Gens erhalten.
Die EcoRI-Spaltstelle an Position 2624 in der in Fig. 32 dargestellten Sequenz des 4,8 kb-Fragments enthält das vierte Codon des cobT-Gens. Das EcoRI-XbaI-Fragment zu 3,5 kb von pXL837 (siehe Fig. 36) wird in die EcoRI- und XbaI-Spaltstellen von pTZl8R oder pTZ19R (Pharmacia) cloniert, um pXL1874 bzw. pXL1875 zu erzeugen; diese zwei Plasmide unterscheiden sich durch die Orientierung des verkürzten cobT-Gens gegenüber dem Promotor des Lactoseoperons von E. coli (Plac). Plac befindet sich stromaufwärts von cobT in pXL1874, während in pXL1875 das Gegenteil der Fall ist. Die Clonierung an die EcoRI-Xba-Stellen von pTZ18R des EcoRI-XbaI-Fragments von pXL837 erlaubt die Durchführung einer Fusion des Proteins zwischen den 4 ersten Aminosäuren der β-Galactosidase von E. coli und des cobT-Gens von seinem 4. Codon aus. Die Expression dieses lacZ-cobT-Gens steht unter der Kontrolle von Expressionssignalen von lacZ. Die Plasmide pXL1874, pXL1875, pTZ18R werden durch Transformation in den Stamm E. coli BL21 eingeschleust. Die Expression des cobT-Gens wird wie beschrieben untersucht (Maniatis et al., 1989).
Wie Fig. 42B zeigt, wird ein Protein mit einem Molekulargewicht von 72.000 nur mit pXL1874 exprimiert und umfaßt in dem Extrakt von Gesamtproteinen von BL2I,pXL 1874, analysiert mit SDS-PAGE, 1 bis 4% der Gesamtproteine. Das Molekulargewicht des Proteins, das unter diesen Bedingungen exprimiert wird, liegt in der Nähe des Molekulargewichts des von der Aminosäure abgeleiteten COBT-Proteins, das 70335 in Fig. 40 ist. Dieses Experiment zeigt klar, daß, ausgehend von der am 4. Codon gelegenen EcoRI-Spaltstelle des cobT-Gens, ein offenes Raster, das mit dem, das für das cobT-Gen gefunden wird, kompatibel ist, exprimiert werden kann.

7.2.3. - Expression eines verkürzten COBS-Proteins

Eine BamHI-Spaltstelle liegt am 45. Codon des COBS-Gens. Das BamHI-BamHI-Fragment zu 1,2 kb, das den 3'-Teil des cobS-Gens und Sequenzen stromabwärts dieses Gens enthält, wird aus pXL843 herausgeschnitten und in die BamHI-Spaltstelle des Plasmids pET-3b (Rosenberg et al., 1987) cloniert, wodurch pXL1937 erhalten wird. Das BamHI-Fragment wird so orientiert, daß der verkürzte Teil des cobS-Gens im Leseraster mit den 12 ersten Codons des Hauptproteins des Capsids des Bakteriophagen T7 oder Gen 10 fusioniert ist (Rosenberg et al., 1987). Dieses Hybridgen steht unter der Kontrolle des Promotors X10 des Bakteriophagen T7. Das Plasmid pXL1937 sowie pET-3b werden durch Transformation in E. coli BL21 pLysS (W. Studier, persönliche Mitteilung) eingeschleust. Nach Reisolierung auf Selektivmedium werden die zwei Stämme in flüssigem L-Medium bis zu einer OD 610 nm von 1 gezüchtet; in diesem Stadium wird das Medium auf eine Konzentration an IPTG (Isopropyl-(3-galactosid) von 1 mM eingestellt, um die Expression der Polymerase des Bakteriophagen T7 (Rosenberg et al., 1987) zu induzieren. Die Kultur wird anschließend 3 h bei 37ºC inkubiert, anschließend werden Bakterienlysate hergestellt. Die Gesamtproteine der so gezüchteten Bakterien werden durch PAGE unter denaturierenden Bedingungen getrennt. Wie aus Fig. 42A hervorgeht, gibt es eine spezifische Überexpression eines Proteins mit 33.000 mit der Kultur BL21 pLysS pXL1937. Dieses Molekulargewicht ist völlig kompatibel mit dem für das Fusionsprotein erwarteten Molekulargewicht (33 kD). Dieses Experiment zeigt klar, daß von der BamHI- Spaltstelle, die im 45. Codon des cobS-Gens gelegen ist, ein offenes Leseraster, das mit dem, das für das cobS-Gen gefunden wird, kompatibel ist, überexprimiert werden kann.

7.2.4. - Expression des Proteins CORA

Die folgenden Oligonukleotide wurden wie vorstehend beschrieben synthetisiert: Oligonukleotid 1277 Oligonukleotid 1278
(= Sequenz gemäß Fig. 41, Positionen 926 bis 915 auf dem Komplementärstrang des codierenden Strangs)
Das Oligonukleotid 1277 besitzt Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme EcoRI und NdeI. Die drei letzten Basen der NdeI-Spaltstelle (ATG), die einem Translationssstartcodon entsprechen, sind direkt gefolgt von den Codons 2 bis 5 des Strukturgens von SUMT von M. ivanovii, wie in der in Fig. 52 gezeigten Sequenz angegeben ist. Das Oligonukleotid 1278 enthält die Erkennungssequenz für SstI, gefolgt direkt von der Sequenz TATTACATAATT, die einer in dem 955 bp-Fragment, das das corA-Gen enthält und in Fig. 51 dargestellt ist, vorhandenen Sequenz entspricht; diese Sequenz befindet sich in Position 926 bis 915 (siehe Fig. 51) auf dem Komplementärstrang des Strangs, der das Protein CORA codiert. Die zwei Oligonukleotide 1277 und 1278 enthalten nun in ihrem 3'-Teil Sequenzen, die jeweils dem codierenden Strang des Gens corA und dem Komplementärstrang stromabwärts dieses Gens entsprechen. Diese zwei Oligonukleotide können zur Durchführung eines enzymatischen Amplifikationsversuches mit dem Plasmid pXL1809 als Matrix verwendet werden. Dieses Experiment erlaubt den Erhalt eines 910 bp-Fragments, das das corA-Gen von M. ivanovii enthält und eine NdeI-Spaltstelle in ATG des corA- Gens und eine SstI-Spaltstelle am anderen Ende des Fragments nach dem Ende des corA-Gens enthält. Die enzymatische Amplifikation wird wie vorstehend beschrieben für die enzymatische Amplifikation, die an genomischer DNA von M. ivanovii durchgeführt wurde, außer daß die Matrix aus 10 ng DNA des Plasmids pXL1809 besteht; die verwendeten Temperaturen sind die gleichen, aber nur 20 Amplifikationszyklen werden durchgeführt. Wie vorstehend beschrieben werden die Amplifikationsprodukte mit NdeI und SstI vor der Trennung durch Wanderung über ein Agarosegel gespalten. Wie erwartet, wird ein Fragment mit einer Größe von 910 bp effektiv sichtbar gemacht. Dieses Fragment wird, wie bereits beschrieben, gereinigt. Dieses Fragment wird an die NdeI- und SstI-Spaltstellen von pXL694 (Denefle et al., 1987) cloniert. Das hervorgehende Plasmid mit der Bezeichnung pXL1832 ist in Fig. 56 beschrieben. In diesem Plasmid geht, wie bereits in Beispiel 7.2. beschrieben, dem Strukturgen von SUMT von M. ivanovii die Ribosomenbindungsstelle des Gens cli des Bakteriophagen λ voraus. Stromaufwärts dieses CBS befindet sich der Promotor Ptrp. Das Plasmid pXL1832 wird in E. coli B5548 durch Transformation eingeschleust, der ein E. coli-Stamm ist, der die Mutation cysG44 enthält (Cossart und Sanzey, 1982). Die SUMT-Aktivitäten der Stämme E. coli B5548 pUC13 und E. coli B5548 pXL1832 werden an den aus in LB-Medium, das mit Ampicillin supplementiert ist, erhaltenen Extrakten bestimmt. Die Bestimmung der SUMT-Aktivität wird wie bereits beschrieben durchgeführt (Blanche et al., 1989). Die Ergebnisse dieser Bestimmung sind nachstehend angegeben.
Die in der vorstehenden Tabelle angegebenen Ergebnisse zeigen klar, daß es eine Expression bei der SUMT-Aktivität bei dem Stamm E. coli B5548 gibt, wenn dieser ein Plasmid pXL1832 enthält, das SUMT von M. ivanovii exprimiert. Die SUMT von M. ivanovii kann nun bei E. coli exprimiert werden.

BEISPIEL 8 - Amplifikation der Produktion von Cobalaminen durch die rekombinanten DNA-Techniken

8.1. - Amplifikation bei P. denitrificans

Dieses Beispiel erläutert, wie eine Verbesserung der Produktion von Cobalaminen bei Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr durch Amplifikation der cob-Gene von Pseudomonas denitrificans erhalten wird.

8.1.1. Verbesserung der Produktion von Cobalaminen bei Pseudomonas denitrificans durch Entfernen einer den Biosyntheseweg beschränkenden Stufe

Das Plasmid pXL367 ist in Beispiel 4.2. (Fig. 13) beschrieben. Dieses Plasmid entspricht pRK290 (Ditta et al., 1981), in das das EcoRI-Fragment zu 8,7 kb insertiert wurde. Dieses Plasmid pXL367 ist mit einer Verbesserung der Biosynthese von Cobalaminen bei dem Stamm SC510 Rifr verbunden. Die Stämme SC510 Rifr, SC510 Rifr pRK290 und SC510 Rifr pXL367 werden in einem Erlenmeyer-Kolben in einem PS4-Medium gemäß den in den experimentellen Protokollen beschriebenen Bedingungen gezüchtet. Es wird eine Verbesserung des Produktionstiters infolge der Anwesenheit des Plasmids pXL367 beobachtet. In der Tat produziert der Stamm SC510 Rifr pXL367 30% mehr Cobalamine als die Stämme SC510 Rifr und SC510 Rifr pRK290. Diese Verbesserung ist nicht auf eine Amplifikation irgendwelcher Gene von Pseudomonas denitrificans zurückzuführen, sondern auf eine spezifische Amplifikation der Gene des EcoRI-Fragments zu 8,7 kb. In der Tat ergibt das in Fig. 11 beschriebene Plasmid pXL723 keine Verbesserung, und der gleiche Produktionstiter wird mit diesem Plasmid beobachtet wie mit den Stämmen SC510 Rifr und SC510 Rifr pRK290.

8.1.2. Verbesserung der Produktion von Coenzym B&sub1;&sub2; bei Pseudomonas denitrificans durch Entfernen von zwei beschränkenden Stufen der Biosynthese von Cobalaminen

Dieses Beispiel erläutert, wie die Produktivität von Cobalaminen von Stämmen von Pseudomonas denitrificans durch Amplifikation der cob-Gene von Pseudomonas denitrificans verbessert werden kann. Diese Verbesserung ist das Ergebnis der Entfernung von zwei begrenzenden Stufen des Biosynthesewegs.
Das Fragment ClaI-EcoRV zu 2,4 kb, das aus dem 5,4 kb- Fragment hervorgegangen ist (das die Gene cobA und cobE enthält), wird mit dem EcoRI-Fragment zu 8,7 kb in das Plasmid mit einem großen Wirtsspektrum pXL203 cocloniert. Das so konstruierte Plasmid wird als pXL525 bezeichnet (Fig. 29). Dieses Plasmid wird durch Konjugation in SC510 Rifr eingeschleust. Der Stamm SC510 Rifr pXL525 produziert 20% mehr Cobalamine als SC510 Riff pXL367. Die Amplifikation der Gene cobA und cobE erlaubt die Entfernung einer neuen begrenzenden Stufe bei SC510 Rifr bei der Biosynthese von Cobalaminen. Der Stamm 5C510 Rifr von Pseudomonas denitrificans wird im vorliegenden Beispiel durch die sukzessive Entfernung von zwei beschränkenden Stufen entfernt. Dieses Beispiel zeigt, daß die Entfernung von zwei beschränkenden Stufen bei der Biosynthese von Cobalaminen zu zusätzlichen Produktionsverbesserungen führen kann.

8.2. - Verbesserung der Produktivität von Cobalaminen bei Agrobacterium tumefaciens

Dieses Beispiel erläutert die Verbesserung der Produktion von Cobalaminen eines Stammes, der Cobalamine produziert, durch Amplifikation der cob-Gene von Pseudomonas denitrificans SC510.
Der verwendete Stamm ist ein Stamm eines gramnegativen Bakteriums. Es handelt sich um einen Stamm von Agrobacterium tumefaciens.
Die in den Beispielen 4.2. und 8.1 beschriebenen Plasmide pXL367 und pXL525 sowie der Vektor pRK290 (Ditta et al., 1981) und das Plasmid pXL368 (Fig. 29) werden durch konjugativen Transfer in den Stamm von Agrobacterium tumefaciens C58-C9 Rifr (Cameron et al., 1989) eingeschleust. Die Stämme C58-C9 Rifr, C&sub5;&sub8;-C9 Rifr pRK290, C&sub5;&sub8;-C9 Rifr pXL367, C58-C9 Rifr pXL368 und C58-C9 Rifr pXL525 werden in PS4-Medium bei 30ºC wie vorstehend beschrieben gezüchtet. Die gebildeten Cobalamine werden wie vorstehend beschrieben bestimmt. Die Produktionstiter sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt. Tabelle: Titer an Vitamin B12, produziert durch verschiedene rekombinante Stämme von Agrobacterium tumefaciens
Wie klar aus der vorstehenden Tabelle hervorgeht, ist die Produktion von Cobalaminen bei dem verwendeten Stamm von Agrobacterium tumefaciens verbessert. Zwei verschiedene Plasmide verbessern die Produktion von Cobalaminen des verwendeten Stamms von Agrobacterium tumefaciens: pXL367 und pXL368. Diese Plasmide enthalten jeweils das Fragment EcoRI zu 8,7 kb (Gene cobF bis cobM) und das ClaI-EcoRV- Fragment zu 8,7 kb (Gene cobE und cobA). Getrennt davon verbessern sie die Produktion von Cobalaminen von Agrobacterium tumefaciens C&sub5;&sub8;-C9 Rifr um einen Faktor von 2; dieses Ergebnis zeigt, daß es möglich ist, die Produktion von Cobalaminen eines Stamms von Agrobacterium tumefaciens durch Amplifikation der Fragmente, die cob-Gene von Pseudomonas denitrificans tragen, zu verbessern. Im vorliegenden Fall handelt es sich um eine heterologe Verbesserung, d. h. eine Verbesserung der Produktion von Cobalaminen durch einen Stamm, der die Amplifikation der cob-Gene eines anderen Stamms vermittelt.
Die Verbesserung der Produktion von Cobalaminen, die durch die verschiedenen Fragmente von Pseudomonas denitrificans beigesteuert wurden, die die cob-Gene enthalten, sind kumulierbar, d. h. durch Einsetzen der zwei Fragmente, die separat in pXL367 und pXL368 cloniert wurden, in das gleiche Plasmid, werden additive Verbesserungen beobachtet. Das Plasmid pXL525 bewirkt bei Agrobacterium tumefaciens C58-C9 Rifr eine Verbesserung der Produktion, die über der liegt, die von jedem der separat in den gleichen Vektor clonierten Fragmente beigesteuert wird.

8.3. - Verbesserung der Produktivität von Cobalaminen bei Rhizobium meliloti

Dieses Beispiel beschreibt die Verbesserung der Produktion von Cobalaminen eines anderen Stamms, der Cobalamine produziert. Das in Beispiel 8.2. beschriebene Plasmid pXL368 sowie der Vektor pRK290 (Ditta et al., 1981) werden durch konjugativen Transfer in den Stamm Rhizobium meliloti 102F34 Rifr (Leong et al., 1982) eingeschleust. Die Transkonjuganten: 102F34 Rifr, 102F34 Rifr pRK290 und 102F34 Rifr pXL368 werden in PS4-Medium bei 30% wie vorstehend beschrieben gezüchtet. Die gebildeten Cobalamine werden wie vorstehend beschrieben bestimmt. Die Produktionstiter sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. Tabelle: Titer an durch verschiedene rekombinante Stämme von Rhizobium meliloti produzierten Cobalaminen
Wie klar aus der vorstehenden Tabelle hervorgeht, ist die Produktion von Cobalaminen bei dem verwendeten Stamm von Rhizobium meliloti verbessert. Das Plasmid pXL368 verbessert die Produktion von Cobalaminen des verwendeten Stamms von Rhizobium meliloti. Dieses Plasmid enthält das ClaI- EcoRV-Fragment zu 2, 4 kb (Gene cobA und cobE); es verbessert die Produktion von Cobalaminen bei Rhizobium meliloti 102F34 Rifr um einen Faktor von 2. Dieses Ergebnis zeigt, daß es möglich ist, die Produktion von Cobalaminen eines Stammes von Rhizobium meliloti durch Amplifikation der Fragmente, die die cob-Gene von Pseudomonas denitrificans enthalten, zu verbessern. Im vorliegenden Fall handelt es sich um eine heterologe Verbesserung, d. h. eine Verbesserung der Produktion von Cobalaminen mit einem Stamm der die Amplifikation der cob-Gene eines anderen Stammes vermittelt.

BEISPIEL 9 - Bestimmung der Corrinoide und Descobaltocorrinoide in den Brühen und den Zellen der Stämme, die Corrinoide produzieren

Dieses Beispiel erläutert, wie es möglich ist, die verschiedenen Corrinoide und Descobaltocorrinoide, die von den verschiedenen Stämmen, die Cobalamine produzieren, zu identifizieren und zu bestimmen. Diese Bestimmung erlaubt unter anderem die Bestimmung von Coenzym B12.
Die Brühen (oder die einzelnen Zellen) werden wie bereits beschrieben mit Cyanid behandelt (Renz, 1971). Nach Zentrifugation wird ein Aliquot des Überstands durch eine DEAE-Sephadex-Säule geleitet, die anschließend ausgiebig mit 1M Kaliumdihydrogenphosphat gewaschen wird. Die gewonnenen Fraktionen werden vereinigt und über eine Sep- Päk-C-18-(Waters)-Kartusche entsalzt. Nach Eindampfen und Resuspension in Wasser (100 ul auf 1 ml, entsprechend der Menge an vorhandenen Corrinoiden) werden die Corrinoide mittels HPLC über eine Nucleosil-G-18-Säule (Macherey-Nagel) identifiziert und bestimmt. Die Säule wird mit 1 ml/min mit einem Gradienten von Acetonitril (0% bis 100%) in einem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, der 10 mM KCN enthält, eluiert.
Die Corrinoide werden durch UV-Detektion bei 371 nm und/oder durch spezifische Detektion von &sup5;&sup7;Co (wenn die Kultur in Gegenwart von &sup5;&sup7;CoCl&sub2; hergestellt wurde) mit Hilfe eines Berthold-LB-505-Detektors sichtbar gemacht. Sie werden nun sowohl durch Vergleich mit ihrer Retentionszeit als auch mit Eichstandards identifiziert. Ebenso werden die Descobaltocorrinoide (Hydrogenobyrinsäure, Hydrogenobyrinsäuremonoamid und Hydrogenobyrinsäurediamid) durch UV-Detektion bei 330 nm sichtbar gemacht. Durch diese Technik werden die folgenden Zwischenprodukte getrennt: Cobyrinsäure, Cobyrinsäuremonoamid, Cobyrinsäurediamid, Cobyrinsäuretriamid, Cobyrinsäuretetraamid, Cobyrinsäurepentaamid, Cobyrinsäure, Cobinamid, Cobinamidphos phat, GDP-Cobinamid, Vitamin B&sub1;&sub2;-Phosphat und Vitamin 812. Die adenosylierten Formen dieser Produkte werden auch durch diese Technik getrennt und bestimmt. Dazu wird die anfängliche Stufe der Cyanidbehandlung weggelassen, und die HPLC-Säule wird mit einem Puffer ohne KCN eluiert. In Fig. 31 sind die Retentionszeiten der verschiedenen Standards, die durch dieses System getrennt und am Ende der Säule durch UV-Absorption identifiziert wurden, angegeben.
Eine Probe des Stamms SC510 Rifr wurde am 30. Januar 1990 bei Centraal Bureau voor Schimmelcultures in Baarn (Niederlande) hinterlegt, wo sie unter Hinterlegungsnummer CBS 103.90 registriert wurde.

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Claims

1. Teilgereinigte DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligtes Polypeptid codiert und daß sie ausgewählt ist aus

· den Genen cobA, cobB, cobC, cobD, cobE, cobF, cobG, cobH, cobI, cobJ, cobK, cobL, cobM, cobN, cob0, cobP, cobQ, cobS cobT, cobU, cobV, cobW, cobX, corA, die in den Fig. 15, 16, 40, 41, 47 und 52 dargestellt sind,

· den Homologen dieser Sequenzen als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes,

· den Sequenzen natürlichen, synthetischen oder rekombinanten Ursprungs, die mit diesen DNA-Sequenzen oder den Fragmenten davon hybridisieren und/oder signifikante Homologien mit ihnen zeigen und die an der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden beteiligte Polypeptide codieren.

2. Teilgereinigtes Gen, enthaltend eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1.

3. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2 enthält.

4. Rekombinante DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzen unter der Kontrolle von Expressionssignalen stehen.

5. Rekombinante DNA nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionssignale homolog oder heterolog mit der-DNA-Seguenz sein können.

6. Rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie Teil eines Expressionsplasmids ist.

7. Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 und Sequenzen, die ihre Expression erlauben, enthält.

8. Plasmid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält

eine rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 3 bis 6

· ein Replikationssystem

· mindestens einen Selektionsmarker.

9. Plasmid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt ist aus:

- dem Plasmid pXL1500, enthaltend die Insertion, wie in Fig. 12 dargestellt, mit den Genen cobA cobB, cobC und cobE;

- dem Plasmid pXL723, enthaltend die Gene cobc und cobD, wie in Fig. 11 dargestellt;

- dem Plasmid pXL302, enthaltend die Insertion, wie in der Fig. 12 dargestellt, mit den Genen cobC und cobD;

- dem Plasmid pXL1397, enthaltend die Insertion, wie in Fig. 12 dargestellt, mit den Genen cobB und cobC;

- dem Plasmid pXL368, enthaltend die Gene cobA und cobE, wie in Fig. 29 dargestellt;

- dem Plasmid pXL545, enthaltend das Gen cobE, wie in Fig. 11 dargestellt;

- dem Plasmid pXL545 Ω, entsprechend dem Plasmid pXL545, in das ein Spectinomycinresistenzgen insertiert ist;

- dem Plasmid pXL253, enthaltend die Gene cobF, cobG, cobH, cob1, cobJ, cobK, cobL, cobM, wie in Fig. 13 dargestellt;

- dem Plasmid pXL367, enthaltend die Gene cobF, cobG, cobH, cokl, cobJ, cobK, cobL, cobM, wie in Fig. 13 dargestellt;

- dem Plasmid pXL1148, enthaltend die Gene cobH und cob1, wie in Fig. 24 dargestellt;

- dem Plasmid pXL1149, enthaltend das Gen cobH, wie in Fig. 24 dargestellt;

- den Plasmiden pXL1496 und pXL1546, enthaltend das Gen cobF, wie in Fig. 26 dargestellt;

- dem Plasmid pXL525, enthaltend die Gene cobA, cobE und cobF bis cobM, wie in Fig. 29 dargestellt;

- dem Plasmid pXL843, enthaltend die Gene cobX, cobS und cobT, wie in Fig. 36 dargestellt;

- dem Plasmid pXL699, enthaltend das BglII-XhoI-Fragment, identifiziert durch die Positionen 251-2234 der Sequenz, die in Fig. 33 dargestellt ist, mit dem Gen cobV;

- dem Plasmid pXL1324, enthaltend das Gen cobU, wie in Fig. 38 dargestellt;

- dem Plasmid pXL618, enthaltend die Insertion, wie in Fig. 46 dargestellt, mit dem Gen cobQ,

- dem Plasmid pXL623, enthaltend die Insertion, wie in Fig. 46 dargestellt, mit dem Gen cobP;

- dem Plasmid pXL593, enthaltend die Gene cobP und cobw, wie in Fig. 46 dargestellt, und

- dem Plasmid pXL1909, enthaltend die Gene cobP, cobkw, cobN und cob0, wie in Fig. 46 dargestellt.

10. Zelle, in die eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Plasmid nach einem der Ansprüche 7 bis 9 eingeschleust wurde.

11. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es an der Umwandlung von 3-Präcorrin in 5'-Desoxy-5'-adenosyl-(Ado)- cobyrinsäure-a,c-diamid beteiligt ist.

12. Polypeptid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenzen COBB, COBF, COBG, COBH, COBJ, COBK, COBL, COBM, COBN, COBS und COBT, dargestellt in den Fig. 15, 16, 40 und 41, enthält.

13. Polypeptid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es die Übertragung einer Methylgruppe in die Positionen C1, C5, C11, C15 oder C17, die zwischen dem 3-Präcorrin und dem Cobyrinsäure-a,c-diamid vorkommen, katalysiert.

14. Polypeptid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenzen COBF, COBJ, COBL und COBM, die in Fig. 16 dargestellt sind, enthält.

15. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es an der Umwandlung von Cobyrinsäure in Cobinamid beteiligt ist.

16. Polypeptid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenzen COBC und COBD, dargestellt in Fig. 15, enthält.

17. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine S-Ade nosyl-L-methionin-. 2-Präcorrin-methyltransferase(SP2MT) - Aktivität besitzt.

18. Polypeptid nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenz COBI, dargestellt in Fig. 16, enthält.

19. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Cobyrinsäure- und/oder Hydrogenobyrin-a,c-diamidsynthase-Aktivität besitzt.

20. Polypeptid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenz COBB, dargestellt in Fig. 15, enthält.

21. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Präcorrin-8x-Mutaseaktivität besitzt.

22. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1 gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenz COBH, dargestellt in Fig. 16, enthält.

23. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenz COBE, dargestellt in Fig. 15, enthält.

24. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nicotinat-Nukleotid-: Dimethylbenzimidazolphosphorribosyltransferase-Aktivität besitzt.

25. Polypeptid nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenz COBU, dargestellt in Fig. 41, enthält.

26. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Cobalamin-(5'-phosphat)synthaseaktivität besitzt.

27. Polypeptid nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenz COBV, dargestellt in Fig. 41, enthält.

28. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Cobyrinsäuresynthaseaktivität besitzt.

29. Polypeptid nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenz COBQ, dargestellt in Fig. 47, enthält.

30. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Präcorrin-6x-Reduktaseaktivität besitzt.

31. Polypeptid nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenz COBK, dargestellt in Fig. 16, enthält.

32. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es an der Umwandlung von Cobinamid in GDP-Cobinamid beteiligt ist.

33. Polypeptid nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Cobinamidkinase- und Cobinamidphosphatguanylyltransferase-Aktivität besitzt.

34. Polypeptid nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenz COBP, dargestellt in Fig. 47, enthält.

35. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es vollständig oder teilweise die Peptidsequenzen COBS, COBT und COBX, dargestellt in Fig. 40, enthält.

36. Polypeptid, codiert von einer Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus den Proteinen CORA, COBB, COBC, COBD, COBE, COBF, COBG, COBH, COBI, COBJ, COBK, COBL, COBM, COBN, COBP, COBQ, COBS, COBT, COBU, COBV, COBW und COBX, dargestellt in den Fig. 15, 16, 40, 41, 47 und 52, ausgewählt ist.

37. Verfahren zur Produktion von Polypeptiden nach den Ansprüchen 11 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß man

· in eine Wirtszelle eine DNA-Sequenz nach den Ansprüchen 1 bis 6 oder ein Plasmid nach den Ansprüchen 7 bis 9, enthaltend eine derartige Sequenz, einschleust,

· diese rekombinante Zelle unter Expressionsbedingungen der Sequenz züchtet und

· die so gebildeten Polypeptide isoliert.

38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle aus Prokaryonten, Eukaryonten, tierischen Zellen oder pflanzlichen Zellen ausgewählt werden kann.

39, Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle ein Archaebakterium oder ein Eubakterium ist.

40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle, E. coli, Pseudomo nas denitricans, Rhizobium melitoli, Agrobactrium tume faciens oder Salmonella typhimurium ist.

41. Verfahren, das die Vermehrung der Produktion von Cobalaminen und/oder Cobamiden oder ihren Vorläufern erlaubt, dadurch gekennzeichnet, daß man

· in einen Mikroorganismus, der diese Verbindungen produziert oder diese Verbindungen produzieren kann, eine oder mehrere DNA-Sequenz(en) nach Anspruch 1 einschleust,

· den so erhaltenen Mikroorganismus unter Bedingungen der Synthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden und der Expression der Sequenz züchtet,

· die Cobalamine und/oder Cobamide oder ihre Vorläuferprodukte isoliert.

42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Mikroorganismus eine oder mehrere DNA-Sequenz(en) nach einem der Ansprüche 3 bis 6 oder ein Plasmid nach den Ansprüchen 7 bis 9, das derartige Sequenzen enthält, einschleust.

43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß die in den Mikroorganismus eingeschleuste DNA-Sequenz ein Polypeptid, das eine begrenzende Stufe der Biosynthese der Cobalamine und/oder Cobamide katalysiert, codiert.

44. Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß die in den Mikroorganismus eingeschleusten DNA-Sequenzen Polypeptide, die begrenzende Schritte der Biosynthese von Cobalaminen und/oder Cobamiden katalysieren, codieren.

45. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus P. denitrificans, R. melitoti, A. tumefaciens ausgewählt wird.

46. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet; daß der Mikroorganismus P. denitrificans ist.

47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus P. denitrificans SC510 RifR ist.

48. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Mikroorganismus ein Plasmid nach Anspruch 9 einschleust.

49. Verfahren nach den Ansprüchen 41 bis 48, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Stamm P. denitrificans SC510 RifR das Plasmid pXL525, das die Gene cobA, cobE und cobF bis cobM, wie in Fig. 29 dargestellt, enthält, einschleust.

50. Verfahren nach den Ansprüchen 41 bis 49, dadurch gekennzeichnet, daß die so gebildeten Cobalamine und/oder Cobamide durch

· Solubilisation,

· Umwandlung in die Cyanoform und

· Reinigung

isoliert werden.

51. Verfahren nach den Ansprüchen 41 bis 50, dadurch gekennzeichnet, daß das Cobalamin das Coenzym B12 ist.

52. Verfahren nach den Ansprüchen 41 bis 51, dadurch gekennzeichnet, daß der Vorläufer aus den Deskobaltocorrinoiden und den Corrinoiden ausgewählt wird.