HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusobacterium
necrophorum-Bacterin und ein Verfahren zu dessen Herstellung und die
Verwendung desselben zur Behandlung einer
Fusobacterium-Erkrankung mittels dieses Bacterins.
-
Fusobacterium necrophorum (früher als Sphaerophorus necrophorus
bezeichnet) ist ein obligat anaerobes gramnegatives Stäbchen,
von dem allgemein anerkannt ist, daß es eine bedeutsame Rolle
bei einer Vielfalt einzelner Krankheiten spielt, die
Wiederkäuer befallen, darunter die Chronische Fußfäule bei Schafen,
die Akute und die Chronische Fußfäule bei Rindvieh, Leberabszeß
bei Rindvieh und Diphtherie bei Kälbern.
-
Garcia et al. offenbaren in "Biological Characterization of
Fusobacterium necrophorum Cell Fractions in Preparation for
Toxin and Immunization Studies", Infection and Immunity, April
1975, Seiten 609-616, daß Vorversuche anzeigten, daß ein durch
Alaun gefälltes, aus dem Cytoplasma von Rinder-Leberabszessen
stammendes Toxoid Leberabszesse auf einen Wert von 10 %
senkten, verglichen mit einem Wert von 35 % der Kontroll-Probe.
-
Abe et al. offenbaren in "Immunization of Mice Against
Fusobacterium necrophorum Infection by Parenteral or Oral
Administration of Vaccine", Am. J. Vet. Res., Band 39, No. 1, Seiten
115-118 (Januar 1978) ein Vakzin, das mit Suspensionen ganzer
Zellen von in Formalin getötetem F. necrophorum hergestellt
ist. Dieses Vakzin wurde auf drei verschiedenen Routen
verabreicht: Intraperitoneale Injektion der getöteten Zellen in
einer Kochsalz-Lösung, intraperitoneale Injektion der getöteten
Zellen mit zugesetztem Aluminiumhydroxid-Adjuvans und durch
Füttern als Pulver, dem lyophilisierte Bakterienzellen
zugesetzt worden waren. Selbst die wirksamste Behandlung (d.h. ip-
Injektion der Zellen plus Adjuvans) ergab Mortalitätsraten von
fast 40% nach 7 Tagen nach der Reizeinwirkung. Diese Bacterine
haben jedoch, wenn sie unter Feldbedingungen geprüft wurden,
keine genügende Wirksamkeit gezeigt, um von kommerziellem Wert
zu sein.
-
Katitch berichtet in "Etude" comparative sur la valeur
prophylactique de 2 vaccins contre le pietin du mouton", Bull. Soc.
Vet. et Med. comparee, Band 76, Nr. 4 (Lyon 1974) über die
Ergebnisse eines Vergleichs zweier kommerzieller Vakzine gegen
Fußfäule in Felduntersuchungen. Eines der Vakzine enthielt nur
ein Antigen und erwies sich als nahezu vollständig unwirksam.
Das zweite Vakzin war ein mehrfaches Antigen-Präparat, in dem
S. necrophorus, Staphylococcus pyogenes und W. perfringens
enthalten waren.
-
Das US-Patent 4 061 751 offenbart eine Behandlung für Fußfäule
und Leber-Läsionen bei wiederkäuenden Tieren, bei der ein
6-substituiertes 3-Nitroimidazo[1,2-b]pyridazin dem der
Behandlung unterzogenen Tier verabreicht wird. Die bevorzugte Methode
der Verabreichung ist die orale Verabreichung.
-
Bis heute ist jedoch kein wirksames prophylaktisches Mittel zur
Bekämpfung oder Verhütung von F. necrophorum-Erkrankungen im
Handel erhältlich.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues
Bacterin bereitzustellen, das bei der Behandlung von Fußfäule
bei wiederkäuenden Tieren wie der Fußfäule bei Schafen und
Rindvieh von Nutzen ist.
-
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein
Verfahren zur Herstellung eines Fusobacterium
necrophorum-Bacterins bereitzustellen, das bei der Verhütung der Fußfäule bei
Schafen und Rindvieh wirksam ist.
-
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein
inaktiviertes Fusobacterium necrophorum-Bacterin
bereitzustellen, das einen signifikant besseren Schutz als bekannte
Behandlungen gegen Fußfäule bei Rindvieh und Schafen bietet.
-
Diese und andere Aufgaben, die für den Fachmann offen zutage
treten, werden dadurch gelöst, daß ein virulentes Isolat von
Fusobacterium necrophorum mit β-Propiolacton inaktiviert wird.
Ein etwa vorhandener Überschuß von β-Propiolacton kann dann
durch Hydrolyse entfernt werden. Das inaktivierte Bacterin kann
danach mit einem bekannten Adjuvans kombiniert werden, um ein
Vakzin zu erzeugen, das für eine parenterale Verabreichung
geeignet ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bacterin-
Herstellung, bei dem β-Propiolacton (BPL) verwendet wird, um
virulente F.necrophorum-Isolate zu inaktivieren. Das restliche
BPL kann hydrolysiert werden, und ein Adjuvans kann dann
hinzugefügt werden. Das mittels dieses Verfahrens hergestellte
Bacterin ist bei der Verhütung und Bekämpfung der Fußfäule bei
wiederkäuenden Tieren, wie Schafen, Ziegen und Rindern unter
normalen Feldbedingungen nützlich.
-
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein aus virulenten
Isolaten von Fusobacterium necrophorum hergestelltes, durch β-
Propiolacton (BPL) abgetötetes Bacterin, das als Hilfsmittel
beim Schutz gegen Fußfäule nützlich ist, die durch F.
necrophorum bei Rindvieh und Schafen hervorgerufen wird.
-
Frühere Versuche zur Herstellung wirksamer Bacterine unter
Verwendung von Fusobacterium necrophorum waren erfolglos,
wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, daß kritische Antigene, die
für die Induktion der Immunität notwendig sind, aufgrund des
Einsatzes der Inaktivierungs-Verfahren nicht erhalten blieben,
bei denen Hitze oder Formaldehyd beteiligt waren. Die Anmelder
haben jedoch durch Reizeinwirkungs-Untersuchungen an Mäusen
gefunden, daß BPL-inaktivierte, mit Adjuvans versetzte Kulturen
Mäuse gegen eine experimentelle Reizeinwirkung von heterologen
Isolaten von F. necrophorum zu schützen vermögen. An trächtigen
Schafen und Mastrindern durchgeführte Feldversuche der
Reizeinwirkung haben ebenfalls gezeigt, daß das BPL-inaktivierte
Bacterin der vorliegenden Erfindung dahingehend wirksam ist,
daß es sowohl das Auftreten als auch die Schwere der ovinen und
der bovinen Fußfäule reduziert.
-
Die vorliegende Erfindung kann mit jedem beliebigen virulenten
Isolat von F. necrophorum durchgeführt werden. Ein virulentes
Isolat ist eines, das befähigt ist, eine typische F.
necrophorum-Läsion bei Rindern oder Schafen zu erzeugen. Zwei
Isolate, als 5118 und 5120 bezeichnet, wurden aus Missouri-Schafen
isoliert, die Anzeichen der chronischen ovinen Fußfäule
aufwiesen, und bei der Entwicklung des Bacterins der vorliegenden
Erfindung verwendet. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht
auf Bacterine beschränkt, die diesen spezifischen Isolaten
entstammen, da diese Isolate Kennwerte zeigten, die für alle
Biovar (Biotyp) A von F. necrcphorum typisch sind. Die Kennwerte,
die diese Bestimmung stützten, waren Kultur- und Virulenz-
Charakteristika wie die Isolierung aus typischen Läsionen, die
Pathogenizizät für Mäuse und das Wachstum als flache gräuliche
Kolonien auf Blut-Agar. Diese bekannten Charakteristika von F.
necrophorum und Techniken zu ihrer Bestimmung sind offenbart in
Veröffentlichungen wie Virulence Mechanisms of Bacterial
Pathogens, Roth, J. (Hrsg.), Kap. 21, Seiten 343-362, 350,
"Approaches Virulence Determinants of Fusobacterium and
Bacteroides spp." von David E. Mery (1988); Footrot and Foot Abscess
of Ruininants, Egerton, J.R., Yong, W.K. & Rifkin, G.G., Kap. 4,
Seiten 69-79, 70, "Foot Abscess of Cattle" von Clark, B.L. (CRC
Press 1989).
-
Die zur Erzeugung der Bacterine der vorliegenden Erfindung
verwendeten virulenten F. necrophorum-Isolate können in
irgendwelchen der Wachtumsmedien, die den Fachleuten bekannt sind, in
Zeiträumen von etwa 10 h bis etwa 24 h, vorzugsweise von etwa
16 h bis etwa 18 h, bei Temperaturen von etwa 35 ºC bis etwa
39 ºC, vorzugsweise von etwa 36 ºC bis etwa 38 ºC, kultiviert
werden. Zu speziellen Beispielen für geeignete Wachstumsmedien
zählen: Eugon-Brühe {erhältlich von Baltimore Biological
Laboratories (BBL)}, die mit Maltose, Rindfleischextrakt,
Hefeextrakt, Menadion und l-Cystein-HCl ergänzt ist; Trypsin-Soja-
Brühe mit Dextrose (erhältlich von BBL), die mit
Rindfleischextrakt und l-Cystein-HCl ergänzt ist; und
Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (erhältlich von Difco), die mit Hefeextrakt und l-
Cystein-HCl ergänzt ist. Bevorzugte Wachstumsmedien sind
Gehirn-Herz-Infusionsbrühe, die mit Hefeextrakt und l-Cystein-
HCL ergänzt ist, und Trypsin-Soja-Brühe mit Dextrose, die mit
Rindfleischextrakt und l-Cystein-HCl ergänzt ist. Das
meistbevorzugte Wachstumsmedium ist Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (im
Handel erhältlich von Difco Labs oder BBL), die mit l-Cystein-
Hydrochlorid und Hefeextrakt ergänzt ist.
-
Die fermentierten Kulturen werden dann auf eine Temperatur von
ungefähr 4 ºC bis ungefähr 10 ºC, vorzugsweise von etwa 4 ºC
bis etwa 8 ºC und meistbevorzugt von etwa 4 ºC bis etwa 7 ºC,
gekühlt. Die gekühlten Kulturen werden dann mit β-Propiolacton
(BPL) inaktiviert. Das β-Propiolacton wird im allgemeinen im
Überschuß verwendet, typischerweise in einer Menge, die etwa
0,10 bis 0,15 Vol./Vol.-%, vorzugsweise etwa 0,11 Vol./Vol.-%,
beträgt. Bei der Arbeitsweise der Inaktivierung wird das β-
Propiolacton direkt zu der gekühlten Kultur hinzugefügt, und
die resultierende Mischung wird einen Zeitraum von wenigstens
24 h, vorzugsweise von etwa 48 h bis etwa 96 h, stehen
gelassen.
Die Kultur wird während der Verfahrensstufe der
Inaktivierung auf einer Temperatur von nicht mehr als 10 ºC,
vorzugsweise von etwa 4 ºC bis etwa 7 ºC, gehalten. Restliches
β-Propiolacton kann dann mittels irgendeiner der bekannten
Verfahrensweisen entfernt oder inaktiviert werden. Eine geeignete
Verfahrensweise, die angewandt werden kann, ist die Hydrolyse.
Im einzelnen wird die BPL enthaltende Kultur eine Zeitspanne
von wenigstens etwa 2 h, vorzugsweise von etwa 3 h bis etwa 5 h
und meistbevorzugt etwa 4 h, auf eine Temperatur von wenigstens
36 ºC, vorzugsweise von etwa 36 ºC bis etwa 38 ºC und
meistbevorzugt von etwa 30 ºC bis etwa 40 ºC, erwärmt.
-
Bekannte Konservierungsmittel können dann der inaktivierten
Kultur zugesetzt werden. Zu geeigneten Konservierungsmitteln
zählen Thimerosal, das bis zu Konzentrationen von 1 : 1 000
hinzugefügt wird, Gentamycin, das bis zu 30 ug/ml hinzugefügt
wird, und deren Mischungen. Eine Mischung aus Thimerosal
(vorzugsweise in einer Endkonzentration von 1 : 10 000) und
Gentamycin (30 ug/ml) wird bevorzugt.
-
Die Kulturen können nach Techniken, die fachbekannt sind, mit
irgendeinem der bekannten Adjuvantien versetzt werden. Zu
Beispielen geeigneter Adjuvantien zählen: Beliebige der
Adjuvantien auf Carbopol-Basis, Öl-Basis und Aluminium-Basis, die im
Handel erhältlich sind. Ein 10 proz. Aluminiumhydroxid-Gel wird
besonders bevorzugt.
-
BPL-inaktivierte Kulturen virulenter F. necrophorum-Isolate
können dann mit einem Adjuvans kombiniert werden, um das
fertige Bacterin herzustellen.
-
Das Bacterin der vorliegenden Erfindung kann irgendwelchen
wiederkäuenden Tieren wie Rindvieh oder Schafen nach
irgendeiner der bekannten Vorgehensweisen oder einer Kombination der
bekannten Vorgehensweisen zur parenteralen Verabreichung, wie
der intramuskulären oder subkutanen Injektion, verabreicht
werden. In den meisten Fällen wird die intramuskuläre Injektion
bevorzugt. Die geeignete Dosierung des Bacterins hängt
naturgemäß von der Größe des behandelten Tieres ab und kann von dem
behandelnden Veterinär ohne weiteres bestimmt werden. Es wurde
jedoch gefunden, daß eine Dosis von etwa 1 ml bis etwa 4 ml im
allgemeinen für ein ausgewachsenes Schaf ausreichend ist und
eine Dosis von etwa 2 ml bis etwa 6 ml im allgemeinen für ein
ausgewachsenes Rind ausreichend ist.
-
Es ist auch zu bevorzugen, das Bacterin in einer Serie von
Dosierungen anzuwenden, vorzugsweise in einer Serie von etwa 2
bis etwa 3, vorzugsweise etwa 2, Injektionen, die in Abständen
von etwa 2 bis etwa 6 Wochen, vorzugsweise von etwa 3 bis etwa
5 Wochen, gegeben werden. Es wurde gefunden, daß die Bacterine
der vorliegenden Erfindung, die aus den Isolaten 5118 und 5120
hergestellt wurden, Rindern und Schafen nach zwei
intramuskulären Injektionen, die in Abständen im Bereich von 2 bis 6
Wochen gegeben werden, einen guten Schutz gegen Fusobacterium-
Erkrankungen verleihen.
-
Nachdem meine Erfindung nunmehr im einzelnen beschrieben ist,
werden die folgenden Beispiele zur Erläuterung derselben
gegeben. In diesen Beispielen sind alle Prozent-Angaben auf das
Gewicht bezogen, sofern nichts anderes angegeben ist.
BEISPIELE
Beispiel 1
-
Das Folgende ist eine Beschreibung der zur Herstellung von F.
necrophorum, Experimental-Sene X0188, angewandten Methodik.
Diese Serie wurde dazu verwendet, Rindvieh in dem South Dakota
Cattle Efficacy Trial zu impfen, dessen Ergebnisse in der
Tabelle 1 wiedergegeben werden.
-
Gefrorene Impfkulturen der F. necrophorum-Isolate 5118 und 5120
wurden auf Blut-Agar-Platten aufgeimpft, die aus Gehirn-Herz-
Infusions-Agar, 5 % Rinderblut und 0,05 % l-Cystein-HCl
hergestellt waren. Diese Kulturen wurden in einem anaeroben
Handschuhkasten ("glove box") etwa 24 h bei 37 ºC unter einer
Atmosphäre von 80 % N&sub2;, 10 % H&sub2; und 10 % CO&sub2; inkubiert. Eine Probe
des Bakterienrasens von den Blut-Agar-Platten wurde unter
Benutzung einer Impfschleife in 125 ml-Flaschen Bugon-Brühe
{erhältlich von Baltimore Biological Laboratories (BBL)}, die mit
0,5 % Maltose, 0,5 % Rindfleischextrakt (erhältlich von BBL),
0,5 % Hefeextrakt (erhältlich von BBL), 50 mg/l Hamm, 500 ug/l
Menadion und 0,05 % l-Cystein-Hydrochlorid ergänzt war,
überführt.
-
Die Kulturflaschen wurden in einem anaeroben Handschuhkasten
etwa 24 h bei 37 ºC inkubiert; zu diesem Zeitpunkt wurde der
Inhalt zum Beimpfen von 1 500 ml-Kolben mit
Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI), die mit 1 % Hefeextrakt und 0,05 % l-Cystein-
Hydrochlorid ergänzt war, verwendet. Die Kolben wurden in dem
Handschuhkasten bei 37 ºC etwa 18 h inkubiert; zu diesem
Zeitpunkt war die Fermentation vollständig. Die Kolben wurden dann
in einem Kühlschrank auf ungefähr 4 ºC abgekühlt.
-
β-Propiolacton (0,11 Vol./Vol.-&sup0;&sub0;) wurde jedem Kolben zugesetzt,
und das inaktivierende Mittel wurde durch Vermischen
gleichmäßig in jedem Kolben verteilt. Die Kolben wurden dann bei 4 ºC
aufbewahrt. Nach 4 d wurde das BPL durch 3 h Erwärmen der
Kulturen in einem Wasserbad auf 37 ºC hydrolysiert. Zur Prüfung
auf Inaktivierung wurden Proben aus jeder der inaktivierten
Kulturen auf BHI-Blut-Agar-Platten ausgestrichen und 24 h
anaerob inkubiert. Auf den Platten wurde kein Wachstum
beobachtet. Ein experimentelles bivalentes Bacterin wurde durch
Kombinieren von Volumina der inaktivierten Kulturen 5118 und 5120
in einem Verhältnis 1 : 1 und nachfolgenden Adjuvans-Zusatz von
10 % Aluminiumhydroxid-Gel (Rehydrogel, Reheis Chemical
Company)
hergestellt. Gentamycin (30 ug/ml) wurde als
Konservierungsmittel zugesetzt.
-
Das wie oben beschrieben hergestellte bivalente F. necrophorum-
Bacterin der Serie X0188 wurde unter Feldbedingungen getestet,
um seine Wirksamkeit bei der Reduzierung der Akuten
Rinder-Fußfäule bei Mast-Rindvieh zu bestimmen. Etwa 1 500 Stück nicht
der Zucht dienendes Rindvieh, Ochsen oder Färsen, wurden in
einer Rinder-Mästerei in South Dakota in dem Versuch
eingesetzt. Das Rindvieh wurde in 12 Gehegen gruppiert. Ungefähr die
Hälfte des Rindviehs in jedem Gehege wurde statistisch den
Impflingen zugeordnet und erhielt zwei intramuskuläre
Injektionen von 5 ml F. necrophorum, Serie X0188, im Abstand von
3 Wochen. Die übrigen Rinder wurden den Kontrollen zugeordnet
und erhielten zwei 5 ml-Impfungen mit einem Placebo (BHI-Medium
mit Adjuvans-Zusatz von Aluminiumhydroxid). Die Rinder wurden
während eines Zeitraums von 6 Monaten auf Fälle der Akuten
Rinder-Fußfäule untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung
sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt. 26 der 783 Kontroll-
Rinder (3,3 %) entwickelten während der Dauer der Untersuchung
Fälle der Akuten Rinder-Fußfäule; alle wurden anschließend mit
Antibiotika (Sulfonamid-Medikamenten) behandelt. 3 der 26
Rinder sprachen nicht auf die Behandlung an. Diese Tiere
entwickelten Fälle der Chronischen Fußfäule und mußten aus der
Herde ausgesondert und zum Schlachten abtransportiert werden.
11 der 763 geimpften Rinder (1,4 %) entwickelten Fälle der
Akuten Fußfäule; alle von ihnen sprachen auf die Behandlung mit
Antibiotika an. Das relative Auftreten der Fußfäule unter den
Impflingen und Kontrollen war, auf der Basis der χ²-Analyse,
statistisch verschieden (P < 0,05). Die Ergebnisse wurden auch
auf der Basis eines klinischen Index ausgewertet, der die
Schwere der Erkrankungen berücksichtigte, wie sie bei den
betroffenen Kontrollen zu sehen war. Eine Erniedrigung des
klinischen Index um 64,1 % wurde bei den geimpften Rindern
beobachtet.
-
Zusammenfassend ergab die Impfung eine statistisch signifikante
Verminderung des Auftretens der Akuten Fußfäule bei
Mast-Rindvieh und zeigte auch Anzeichen einer Verminderung der Schwere
der Erkrankung. Die Ergebnisse zeigen, daß das durch BPL
inaktivierte F. necrophorum-Bacterin gegen Fußfäule bei Rindern
unter normalen Feldbedingungen wirksam ist.
Tabelle 1
Ergebnisse der Wirksamkeit von F. necrophorum bei Mast-Rindern
Zahl der Rinder
Zahl der Fälle der Akuten Fußfäule
Prozentsatz*** des Auftretens
% Verminderung des Auftretens
Zahl der Fälle der Chronischen Fußfäule
Klinischer Index (CI)
% Verminderung des CI
Geimpfte Rinder*
Kontroll.Rinder**
*Die geimpften Rinder erhielten zwei intramuskuläre
5 ml-Dosen von F necrophorum-Bacterin Experimental-Serie
X0188.
**Die Kantroll-Rinder erhielten zwei intramuskuläre 5 ml-Dosen Placebo.
***Das relative Auftreten der Fußfäule bei Impflingen und
Kontrollen war statistisch verschieden (P < 0,05) auf der
Basis der χ²-Analyse.
Beispiel 2
-
Die folgende Methodik wurde zur Herstellung von F. necrophorum
der Experimental-Serien 29687BB und X0988 angewandt. Diese
Serien wurden zur Impfung von Schafen bei den Sheep Efficacy
Trials eingesetzt, die in den Tabellen 2, 3 und 4
zusammengefaßt sind. Die einzigen Unterschiede zwischen den Serien
29687BB und X0988 beruhten auf der Verwendung unterschiedlicher
experimenteller Chargen von F. necrophorum 5118 und 5120 bei
jeder Serie.
-
Gefrorene Impfkulturen der F. necrophorum-Isolate 5118 und 5120
wurden auf Blut-Agar-Platten aufgeimpft, die aus Gehirn-Herz-
Infusionsbrühe (Difco), 1 % Hefeextrakt (Yeast Products, Inc.),
0,05 % gereinigtem Agar (Difco), 5 % frischem Rinderblut und
0,05 % l-Cystein-HCl hergestellt waren. Nach 24 h Inkubation in
einem anaeroben Handschuhkasten bei 37 ºC unter einer
Gas-Atmosphäre von 10 % Wasserstoff, 10 % Kohlenstoffdioxid und 80 %
Stickstoff wurden Schleifenfüllungen der gewachsenen Kolonien
von den Blut-Platten in Röhrchen überführt, die 15 ml BHI-Brühe
enthielten, die mit 1 % Hefeextrakt und 0,05 % l-Cystein-HCl
ergänzt war. Die Röhrchen wurden anaerob etwa 8 h bei 37 ºC
inkubiert. Mit Volumina von 3 ml der aktiven Impfkultur wurden
dann Flaschen überimpft, die 80 ml Gehirn-Herz-Infusionsbrühe
(BHI), die mit 1 % Hefeextrakt und 0,05 % l-Cystein-HCI ergänzt
war, enthielten, und die Flaschen wurden anaerob bei 37 ºC
inkubiert. Nach 16 bis 18 h der Inkubation wurden die Kulturen
in einer nächsten Passage überimpft, dieses Mal in 350 ml der
Gehirn-Herz-Infusionsbrühe, die mit 1 % Hefeextrakt und 0,05 %
l-Cystein-HCl ergänzt war, und anaerob bei 37 ºC ungefähr 8 h
inkubiert.
-
Schließlich wurden Volumina von 10 l der BHI-Hefe-Medien, die
mit 0,05 % l-Cystein-HCl ergänzt worden waren, mit der aktiven
Impfkultur (3,5 bis 4,5 Vol./Vol.-%) beimpft und unter
konstantem Vermischen etwa 16 h bei 37 ºC inkubiert. Die Kulturen
wurden in einem Eisbad auf 4 ºC abgekühlt, mit β-Propiolacton
(0,11 %) inaktiviert und 4 d bei 4 ºC vermischt. Das restliche
BPL wurde durch 4 h Erhitzen der Kulturen auf 37 ºC
hydrolysiert. Die hydrolysierten Kulturen wurden auf Inaktivierung in
der gleichen Weise geprüft, wie in Beispiel 1 beschrieben ist.
Proben wurden auf Blut-Agar-Platten ausgestrichen und 24 h
anaerob inkubiert. Auf den Platten wurde kein Wachstum
beobachtet.
-
Die inaktivierten Kulturen von 5118 und 5120 wurden einzeln mit
Aluminiumhydroxid-Gel-Adjuvans (10 Vol./Vol.-%) versetzt und
mit Gentamycin (30 ug/ml) konserviert. Ein bivalentes Bacterin
wurde durch Kombinieren gleicher Volumina der inaktivierten
Kulturen 5118 und 5120 mit Adjuvans-Zusatz hergestellt.
-
Bivalente F. necrophorum-Bacterine 29687BB und X0988, die
hergestellt worden waren, wie oben beschrieben ist, wurden zur
Bestimmung ihrer Wirksamkeit bei der Reduzierung der F.
necrophorum-Erkrankungen an Oregon-Schafherden getestet, bei denen
Chronische Fußfäule in der Vergangenheit aufgetreten war. Die
bei dem Versuch 1 eingesetzten Schafe waren trächtige
Mutterschafe im Alter von zwei Jahren oder mehr aus
Suffolk-Züchtungen oder Suffolk-Dorset-Mischrassen. Die bei den Versuchen 2
und 3 eingesetzten Schafe waren junge Mutterschafe im Alter von
ein bis zwei Jahren. Die Schafe wurden auf der Weide
freilaufend gehalten, wurden jedoch ergänzend, zur freien Wahl, mit
einem Mineral-Ergänzungsangebot versorgt, das Natriumchlorid,
Calcium, Phosphor, Magnesium, Mangan, Iod, Eisen, Cobalt, Zink,
Selen, Vitamin A, Vitamin D3, Vitamin E und Lasalocid, einen
als Coccidiostat verwendeten Ionophor, enthielt.
-
Die Schafe wurden statistisch entweder den Impflingen oder der
Kontroll-Gruppe zugeordnet. Die Impflinge erhielten zwei
intramuskuläre Impfungen mit 3 ml bivalenten F.
necrophorum-Bacterinen, 29687BB oder X0988, im Abstand von 5 Wochen. Die
Kontrollen erhielten zwei 3 ml-Impfungen mit einem Placebo (BHI-
Medium mit Adjuvans-Zusatz von Aluminiumhydroxid-Gel).
-
Zur Zeit der ersten Impfung (T1) wurden die Füße aller
geimpften Schafe und Kontroll-Schafe einzeln untersucht und unter
Anwendung eines klinischen Index auf der Basis einer Skala
einzeln bewertet, die von Dr. John Berg, University of
Missouri, Columbia, Mo., zur Verfügung gestellt worden war.
Fünf Monate später (T2) wurden die Füße der Impflinge und der
Kontroll-Schafe wiederum einzeln untersucht und bewertet. Der
Unterschied des klinischen Index zwischen dem Zeitpunkt T1 und
dem Zeitpunkt T2 spiegelt das Fortschreiten der F. necrophorum-
Erkrankung auf eine Basis "pro Fuß" wider. Die Gesamtzahl der
untersuchten Füße war für geimpfte Schafe und Kontroll-Schafe
geringfügig unterschiedlich. Zusätzlich zu einer geringen
Varianz der Zahlen der Impflinge und Kontrollen wurde eine
bestimmte Zahl von Füßen nicht in die Untersuchung einbezogen.
Diese Füße befanden sich bereits zum Zeitpunkt der ersten
Impfung in einem fortgeschrittenen Stadium der chronischen
Krankheit und eigneten sich nicht für eine Auswertung in diesen
Versuchen.
Klinischer Index zur Untersuchung der Fußfäule bei Schafen
Klinische Anzeichen
Bewertung
Keine sichtbare Läsion
Läsionen unter Beteiligung des interdigitalen Raums
A. Interdigitale Dermatitis
B. Interdigitale Dermatitis mit merklicher Entzündung
C. Interdigitale Dermatitis mit sehr schwerer Entzündung
Läsionen unter Zusammenbrechen des Horns
A. Zersetzung von Horn, Sohle, Wandung an der Ferse - keine Nekrose
B. Zersetzung des Horns an der Ferse mit Nekrose, Geruch
C. Zersetzung der Sohle - keine Nekrose
D. Zersetzung der Sohle mit Nekrose, Geruch
E. Zersetzung der Wandung - keine Nekrose
F. Zersetzung der Wandung mit Nekrose, Geruch
-
Die Ergebnisse der drei Versuche an Schafen sind in den Tabelle
2, 3 und 4 zusammengefaßt. Die Akute Ovine Fußfäule nahm unter
den Kontroll-Schafen in jedem der Versuche beträchtlich zu. Die
geimpften Schafe, die die F. necrophorum-Bacterine 29687BB oder
X0988 erhielten, zeigten im Vergleich zu den Kontrollen
signifikante Rückgänge der Erkrankungen im Bereich von 61,2 %
(Versuch 1) bis 87,9 % (Versuch 3). Der Gesamt-Rückgang des
klinischen Index für alle 2 424 in den drei Versuchen ausgewerteten
Füße betrug 80 %. Es wurde gezeigt, daß bei Anwendung des
Student'schen t-Tests die Differenz der Mittelwerte der
Klinischen Indices zwischen geimpften Schafen und Kontroll-Schafen
für jeden der drei einzelnen Versuche statistisch signifikant
war (P < 0,01).
-
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten eine signifikante
Reduzierung der Fusobacterium-Erkrankungen bei den geimpften
Schafen und demonstrierten die Wirksamkeit des
BPL-inaktivierten Bacterins unter Feldbedingungen.
Tabelle 2
Wirksamkeit von F. necrophorum bei Schafen - Versuch Nr. 1
Zahl der Füße, die die angegebenen Veränderungen des Klinischen Index (ACI)
zwischen dem Beginn und dem Ende der Beobachtungen zeigten
ACI
Gesamt-Bewertung
Gesamt-Zahl der Füße
Mittlerer Klinischer Index (MCI)***
* Geimpfte Schafe (N - 94)
** Kontrolle
* Geimpfte Schafe erhielten zwei intramuskuläre 3 ml-Dosen von F. Necrophorum-Bacterin
Experimental-Serie 2968788
** Kontroll-Schafe erhielten zwei intramuskuläre 3 ml-Dosen Placebo
*** Mittlerer Klinischer Index (MCI) = Gesamt-Bewertung/Gesamt-Zahl der Füße. Es wurde mittels
des Student'schen t-Tests gezeigt, daß die MCIs der geimpften Schafe
und der Kontroll-Schafe
statistisch voneinander verschieden waren (P < 0,01).
Tabelle 3
Wirksamkeit von F. necrophorum bei Schafen - Versuch Nr. 2
Zahl der Füße, die die angegebenen Veränderungen des Klinischen Index (ACI)
zwischen dem Beginn und dem Ende der Beobachtungen zeigten
ACI
Gesamt-Bewertung
Gesamt-Zahl der Füße
Mittlerer Klinischer Index (MCI)***
* Geimpfte Schafe (N - 94)
** Kontrolle
* Geimpfte Schafe erhielten zwei intramuskuläre 3 ml-Dosen von F. Necrophorum-Bacterin
Experimental-Serie 2968788
** Kontroll-Schafe erhielten zwei intramuskuläre 3 ml-Dosen Placebo
*** Mittlerer Klinischer Index (MCI) = Gesamt-Bewertung/Gesamt-Zahl der Füße. Es wurde mittels
des Student'schen t-Tests gezeigt, daß die MCIs der geimpften Schafe
und der Kontroll-Schafe
statistisch voneinander verschieden waren (P < 0,01).
Tabelle 4
Wirksamkeit von F. necrophorum bei Schafen - Versuch Nr. 3
Zahl der Füße, die die angegebenen Veränderungen des Klinischen Index (ACI)
zwischen dem Beginn und dem Ende der Beobachtungen zeigten
ACI
Gesamt-Bewertung
Gesamt-Zahl der Füße
Mittlerer Klinischer Index (MCI)***
* Geimpfte Schafe (N - 94)
** Kontrolle
* Geimpfte Schafe erhielten zwei intramuskuläre 3 ml-Dosen von F. Necrophorum-Bacterin
Experimental-Serie 2968788
** Kontroll-Schafe erhielten zwei intramuskuläre 3 ml-Dosen Placebo
*** Mittlerer Klinischer Index (MCI) = Gesamt-Bewertung/Gesamt-Zahl der Füße. Es wurde mittels
des Student'schen t-Tests gezeigt, daß die MCIs der geimpften Schafe
und der Kontroll-Schafe
statistisch voneinander verschieden waren (P < 0,01).
Beispiel 3
-
Monovalente F. necrophorum-Bacterine 5118 und 5120 wurden in
der gleichen Weise und unter Verwendung der gleichen
Materialien hergestellt, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind.
Versuche der Reizeinwirkung auf Mäuse wurden durchgeführt, um zu
bestimmen, ob die experimentellen monovalenten Bacterine in der
Lage sind, Mäuse vor einer virulenten Reizung durch heterologe
Isolate aus F. necrophorum zu schützen. Virulente F.
necrophorum-Isolate 5103, 5116 und 5120 wurden aus Fällen der ovinen
Fußfäule aus drei verschiedenen Schafherden in Missouri
erhalten. Das Isolat 2382 war ein Isolat aus einem bovinen
Leber-Abszess, das aus einem in einer Missouri-Verpackungsanlage
geschlachteten Kalb erhalten worden war. Jedes dieser Isolate
zeigte eine typische kolonieartige Morphologie,
Mäuse-Pathogenizität und mikroskopische Charakteristiken von F.
necrophorum. Gruppen von 5 oder 10 Swiss-Webster-Mäusen im Gewicht
von 18 bis 20 g erhielten drei subkutane Injektionen von 0,2 ml
entweder des Bacterins 5118 oder des Bacterins 5120 in
wöchentlichen Abständen. Gleiche Anzahlen von Kontroll-Mäusen
erhielten 0,2 ml Placebo (mit Adjuvans versetztes PES). Eine Woche
nach der letzten Impfung wurden Gruppen der Impflinge und der
Kontroll-Mäuse intraperitoneal mit 0,25 ml von 16 h-Kulturen
eines der F. necropborum-Isolate 5103, 5116, 5120 oder 5126
gereizt.
-
Die Mäuse wurden über einen Beobachtungs-Zeitraum von 7 Tagen
beobachtet, und Todesfälle während der Zeit wurden vermerkt.
Die Ergebnisse der Versuche der Reizeinwirkung auf Mäuse sind
in der Tabelle 5 dargestellt.
-
Die Ergebnisse zeigten, daß aus F. necrophorum-Isolaten 5118
und 5120 hergestellte monovalente Bacterine Mäuse vor einer
tödlichen Reizung zu schützen vermochten. Es war signifikant,
daß Schutz gegen eine Mannigfaltigkeit heterologer Isolate zu
erkennen war. Somit scheinen die mit β-Propiolacton inaktivier
ten Isolate der 5118- und 5120-Bacterine unter Feldbedingungen
eine wirksame schützende Immunität hervorzurufen.
Tabelle 5
Versuche der Reizeinwirkung auf Mäuse unter Verwendung
monovalenter Bacterine aus F. necrophorum 5118 und 5120
(Ergebnisse ausgedrückt als Überlebende/Gesamt-Zahl)
Isolate der Reizeinwirkung
Monovalentes Bacterin
[ovin]
[bovin]
PBS Placebo