DE69113791T2

DE69113791T2 - Käseherstellungsverfahren.

Info

Publication number: DE69113791T2
Application number: DE69113791T
Authority: DE
Inventors: Peter Budtz; Claus Dambmann; Steen Mortensen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1990-03-09
Filing date: 1991-03-08
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2011-03-09
Also published as: AU7498891A; EP0518995B1; AU642997B2; DE69113791D1; ATE128814T1; ES2079648T3; JPH05505523A; DK0518995T3; WO1991013553A1; EP0518995A1; DK63490D0; JP3115591B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Käse, in dem ein Enzympräparat, das eine spezifische Protease umfaßt, während des Verfahrens Käsereimilch zugesetzt wird.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bei der herkömmlichen Käseherstellung wird Käse hergestellt, in dem eine Starterkultur und gab zu warmer Milch gegeben werden, um einen Käsebruch zu bilden (Dicklegung/Dickwerden). Wenn die gewünschte Konsistenz und Festigkeit des Käsebruchs erhalten worden ist, wird der Käsebruch geschnitten, gefolgt von einer Abtrennung der Molke von dem Käsebruch, wie einem Abtropfenlassen, wonach der Käsebruch gesalzen, gepreßt und gelagert (reifen gelassen) wird.
Bei diesem Prozeß findet ein beträchtlicher Verlust von Milchproteinen und - zu einem gewissen Ausmaß - Fett in Folge des Entfernens der Molke statt, sodaß die Ausbeute an Käse in Bezug auf den Gesamtgehalt an Proteinen und Fett in der Milch herabgesetzt wird. Daher wurde ein Verfahren zur Käseherstellung entwickelt, wonach die Milch, hauptsächlich durch Ultrafiltration, auf annähernd den Fett- und Proteingehalt, der in dem Endprodukt gewünscht ist, konzentriert wird, wonach eine Starterkultur, Lab und Salz zugesetzt wird. Es findet kein wesentliches Abtropfenlassen von Molke aus dem Käsebruch statt, und daher werden die Molkeproteine (vor allem β-Lactoglobulin und -Lactalbumin), die normalerweise verloren werden, wenn die Molke entfernt wird, in dem Konzentrat zurückbehalten, was (zusammen mit dem zurückgehaltenen Fett) zu einer Ertragserhöhung von ungefähr 10 % führt.
Die Verwendung UF-konzentrierter Milch zur Herstellung von Käse ist jedoch nur für eine begrenzte Anzahl von Käsearten wirtschaftlich erfolgreich gewesen. Eine Hauptursache für dies ist die Wirkung von Molkeproteinen auf die typischen Merkmale des resultierenden UF-Käses. So hat man festgestellt, daß undenaturierte Molkeproteine gegen eine Hydrolyse durch Lab, Starterkulturproteasen und Plasmin resistent sind (De Boer und Nooy, North Eurpean Dairy Journal 46, 1980, S. 52-61; De Koning et al., Netherlands Milk und Dairy Journal 35, 1981, S. 35-46; Quist et al., Beretning fra Statens Mejerifors g, 1986, 5. 268). Die undenaturierten Molkeproteine können als ein Füllstoff wirken, was zu einem Käse mit weicherer Textur führt. Man nimmt an, daß die Veränderung in der Textur der Tatsache zugeschrieben werden kann, daß die Molkeproteine nicht an der Bildung der Casein-Matrix teilnehmen, die für die Festigkeit und Beständigkeit vieler Käse, insbesondere von Käse mit einem geringen Feuchtigkeitsgehalt, wesentlich ist, oder sogar die Matrix nachteilig beeinflussen können, wenn sie in einer Menge von bis zu 20 % des Protein- Trockenstoffgehaltes vorhanden sind. Es ist weiterhin beobachtet worden, daß die Molkeproteine den Prozeß des Käse- Reifung nachteilig beeinflussen können, indem sie eine Verdünnungswirkung durch ein Herabsetzen des Anteils von Casein in dem Käsebruch (De Koning et al., supra) besitzen können oder daß sie die Zugänglichkeit von Casein auf die für die Reifung verantwortlichen Enzyme begrenzen können.
Das Problem der herabgesetzten Reifungsrate von UF-Käse kann nicht überwunden werden, indem die Molkeproteine denaturiert werden, wie durch Hitzebehandlung der Käsereimilch, da man festgestellt hat, daß die Anwesenheit von denaturierten Molkeproteinen in bestimmten UF-Käsen deren Dehnungs- und Schmelzeigenschaften bei einem Erwärmen/Erhitzen nachteilig beeinflußt (Covacevich und Kosikowski, Journal of Dairy Science 61, 1978, 5. 704-709; Quist et al., supra; Olson, Dairy Record 85 (7), 1984, S. 85). Weiterhin kann die Hydrolyse von denaturierten Molkeproteinen zu untypischen Aromen und Texturen von gereiften Käsen führen (Green et al., Journal of Dairy Research 48, 1981, 5. 333-341; Brown und Ernstrom, LTournal of Dairy Science 65, 1982, S. 2391-2395; Banks und Muir, Journal of the Society of Dairy Technology 38, 1985, 5. 27-32). Denaturierte Molkeproteine können auch die Reifungsrate auf eine ähnliche Weise wie undenaturierte Molkeproteine, wie vorstehend diskutiert wurde, beeinträchtigen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Man hat überraschenderweise festgestellt, daß die nachteiligen Wirkungen, die von dem Zurückhalten der Molkeproteine in konzentrierter Milch, die zur Käseherstellung verwendet wird, herrühren, beträchtlich verringert werden können, wenn ein Enzym, das eine begrenzte spezifische Hydrolyse von Molkeproteinen verursacht ohne gleichzeitig irgendein Dicklegen von Milch zu verursachen, in das Verfahren aufgenommen wird.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Käse, wobei:
(i) ein Enzympräparat, das ein proteolytisches Enzym umfaßt, das für Glutaminsäure (Glu)- und Asparaginsäure (Asp)- Reste spezifisch ist, wobei das Enzympräparat im wesentlichen frei von einer anderen proteolytischen Aktivität ist, der Milch zugesetzt wird, um die begrenzte spezifische Hydrolyse der Molkeproteine in der Milch zu bewirken;
(ii) eine Starterkultur der Milch im Anschluß an oder gleichzeitig mit dem Enzympräparat zugesetzt wird; und
(iii) ein Milch-dicklegendes Enzym der Milch zugesetzt wird im Anschluß an oder gleichzeitig mit dem in Schritt (i) zugesetzten Enzympräparat oder im Anschluß an oder gleichzeitig mit der in Schritt (ii) zugesetzten Starterkultur, um ein Dicklegen der Milch zu bewirken, wonach der resultierende Käsebruch auf eine per se bekannte Weise zur Herstellung von Käse bearbeitet wird.

AUSFÜHRLICHE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Insbesondere ist das proteolytische Enzym eines, das die folgenden typischen Merkmale besitzt:
(a) es ist eine Serin-Protease, die spezifisch für Glutaminsäure (Glu)- und Asparaginsäure (Asp)-Reste ist;
(b) es besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 25 cpu (wie hierin definiert) pro Gramm an Enzymprotein;
(c) es besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 23.600;
(d) es wird durch Diisopropylphosphofluoridat, aber nicht durch Phenylmethansulfonylfluorid gehemmt;
(e) es zeigt 75 % oder mehr seiner maximalen Aktivität in dem pH-Bereich von 6,5 - 10,0.
Dieses proteolytische Enzym ist zuvor in US 4,266,031 als eine Verunreinigung von Subtilisin A, das durch Bacillus licheniformis erzeugt wird, charakterisiert worden. Es gab jedoch keinen Hinweis auf die spezifische proteolytische Aktivität des Enzyms in diesem US-Patent, und seine Nützlichkeit in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Käseherstellung wird daher nicht durch die Offenbarung des Enzyms der se in dem Patent vorweggenommen. In Übereinstimmung mit der Erfindung hat man überraschenderweise festgestellt, daß das proteolytische Enzym eine Protease ist, die für Glu- und Asp- Reste spezifisch ist. Diese Eigenschaft ist für den vorliegenden Zweck von Bedeutung, da sie für eine begrenzte und spezifische Hydrolyse von Molkeproteinen an Glu- und/oder Asp-Resten sorgt. Diese Aminosäurereste sind hydrophil, was zu einer verringerten Bitterkeit des resultierenden Molkeproteinhydrolysats führt, das daher nicht irgendeine nachteilige Wirkung auf das Aroma des durch das Verfahren erzeugten Käses besitzt. Man hat weiterhin überraschenderweise festgestellt, daß obwohl das fragliche proteolytische Enzym Molkeproteine hydrolysieren kann, es nicht irgendeine Proteolyse von kappa-Casein in seinem nativen Zustand verursacht, vermutlich weil die in Casein vorhandenen Glu-Reste infolge der dreidimensionalen Struktur von nativem kappa-Casein nicht für das Enzym zugänglich sind. Dies bedeutet, daß, entgegengesetzt zu dem, was man erwartet haben mochte, die Glu-Asp- spezifische Protease, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, nach unserer derzeitigen besten Kenntnis, nicht nachteilig auf das Verfahren zur Käseherstellung einwirkt, indem es die Eigenschaften des Casein-Koagulates verändert, die für die Struktur und/oder Textur des resultierenden Käses von Bedeutung sein kann.
Ein anderes proteolytisches Enzym, von dem man denkt, daß es für den vorliegenden Zweck von Nutzen ist, ist die V8- Protease von Staphylococcus aureus, die ebenfalls für Gluund Asp-Reste in Proteinen spezifisch ist. Beispiele für andere proteolytische Enzyme, von denen man denkt, daß sie für den vorliegenden Zweck von Nutzen sind, sind eine Glu/Asp-spezifische Protease von Streptomyces thermovulgaris (N.V. Khaidarova et al., Biokhimiya 54 (1), 1989, S. 32-38), eine Glu/Asp-spezifische Protease von Actinomyces (C.V. Moslova et al., Biokhimiya 52 (3), 1987, S. 358-366) und eine Glu/Asp-spezifische Protease von Bacillus subtilis (G.A. Rufo et al., J. Bacteriol. 172 (2), 1990, S. 1019-1023).
Indem eine partielle Hydrolyse von Molkeproteinen durch das vorliegende Verfahren bewirkt wird, können die anschließenden Schritte in dem Verfahren zur Käseherstellung, d.h. das Zusetzen einer Starterkultur und eines Milch-dicklegenden Enzyms, und weiterhin das Salzen, Pressen und Reifen des Käsebruchs auf die für die Herstellung von Käse herkömmliche Weise durchgeführt werden, z.B. wie in R. Scott, Cheesemaking in Practice, 2. Auflage, Elsevier, London, 1986, beschrieben. Es wird erwartet, daß die Hydrolyse der Molkeproteine durch das in dem vorliegenden Verfahren verwendete proteolytische Enzym die partiell hydrolysierten Molkeproteine für einen weiteren Abbau durch Proteasen aus der Starterkultur zugänglich macht, was zu einer beschleunigten und homogeneren Käsereifung (zumindest im Vergleich zu dem für UF-Käse berichtetem) sowie verbesserten Schmelzcharakteristika führt. Insbesondere kann die Körnigkeit von geschmolzenem UF-Käse vermieden werden.
Jede beliebige Art von Milch, insbesondere Milch von Wiederkäuern wie Kühen, Schafen oder Ziegen, kann als Ausgangsstoff in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, wie rekonstituierte Milch, Gesamtmilch, konzentrierte Gesamtmilch oder Magermilch. Man glaubt jedoch, daß das vorliegende Verfahren besonders gut geeignet ist, um die zuvor berichteten, mit der Verwendung von konzentrierter Milch verbundenen Nachteile zu überwinden.
Die Milch kann auf verschiedenartige Weisen wie durch Eindampfen oder Sprühtrocknen konzentriert werden, sie wird aber vorzugsweise durch Membranfiltration konzentriert, d.h. einer Ultrafiltration, bei der man Moleküle mit einem Molekulargewicht von bis zu 20.000 durch eine Membran passieren läßt, wahlweise mit einer Diafiltration vor oder nach der Ultrafiltration oder möglicherweise einer Hyperfiltration, in der man Moleküle mit einem Molekulargewicht von bis zu 500 durch die Membran passieren läßt. Die Filtration bedeutet, daß eine größere Menge an Trockenmasse in dem Käsebruch zurückgehalten wird, und folglich eine höhere Ausbeute an Käse erhalten wird. Die Ultrafiltration kann durchgeführt werden, indem man Milch in einem Kreisprozeß bei einem erhöhten Druck durch eine Membran wie eine Membran eines geeigneten organischen Polymeren oder eines anorganischen Keramikmaterials laufen läßt, wodurch die Milch auf bis zu ungefähr achtmal konzentriert werden kann. In diesem Verfahren werden Wasser und Bestandteile mit einem niedrigen Molekulargewicht durch die Membran geleitet, während Proteine (einschließlich Casein, Lactoglobulin und Lactalbumin) und Fette zurückgehalten werden. Für eine ausführlichere Beschreibung des Ultrafiltrationsverfahrens siehe z.B. Quist et al., supra.
Wenn die in dem Verfahren der Erfindung verwendete Milch konzentrierte Milch ist, kann es aus praktischen Gründen zweckmäßiger sein, das proteolytische Enzym zuzusetzen, nachdem die Milch konzentriert worden ist.
Die Menge an proteolytischem Enzym, die nach dem vorliegenden Verfahren zugesetzt wird, variiert in Übereinstimmung mit dem Grad der Konzentration der Milch (der die Menge an Molkeproteinen in dem Konzentrat bestimmt), wird aber üblicherweise in einer Menge von 0,005-0,25 cpu/l Milch, vorzugsweise 0,01 - 0,1 cpu/l Milch, wie 0,05 cpu/l Milch, zugesetzt.
In Übereinstimmung mit der Erfindung kann die Hydrolyse der Molkeproteine für 0,5 - 4 Stunden durchgeführt werden, typischerweise für ungefähr 2 Stunden, um einen zufriedenstellenden Hydrolysegrad (Spaltung an einer ausreichenden Anzahl von zugänglichen Glu- und Asp-Resten in dem Molkeprotein-Molekül) sicherzustellen. Der ph ist geeigneterweise in einem Bereich von 6,4 - 7,0, typischerweise ungefähr 6,7. Die Temperatur ist geeigneterweise zwischen 30 und 37ºC, typischerweise ungefähr 34ºC.
Das in dem vorliegenden Verfahren verwendete proteolytische Enzym kann eines sein, das durch einen Mikroorganismus, insbesondere ein Bakterium, erzeugbar ist. Ein derartiges Bakterium kann ein Stamm von Bacillus licheniformis sein, wie ein Stamm, der bekanntermaßen Subtilisin A sowie eine andere Protease, die dem vorstehend definierten proteolytischen Enzym entspricht, erzeugt. In diesem Fall kann das proteolytische Enzym hergestellt werden durch Kultivieren des Bakterienstammes unter Bedingungen, die der Erzeugung einer alkalischen Protease förderlich sind, die dann isoliert werden kann, wonach die Proteaseaktivitäten durch Verfahren, die per se bekannt sind, wie durch das in der vorstehend erwähnten US-Patentschrift 4,266,031 beschriebene Verfahren, getrennt werden können.
Der Stamm von Bacillus licheniformis kann auch ein mutanter Stamm sein, wie eine Mutante, in der das für Subtilisin A kodierende Gen inaktiviert worden ist, z.B. durch herkömmliche Mutagenese-Verfahren, die die Verwendung eines Mutagens wie Nitrosoguanidin beinhalten, wie im wesentlichen durch das in der vorstehend erwähnten US-Patentschrift 4,266,031 offenbarte Verfahren (die die Inaktivierung des Gens, das für das hier interessierende proteolytische Enzym kodiert, offenbart). Alternativ dazu, kann die Inaktivierung des Subtilisin A-Gens auch durch rekombinante DNA-Techniken stattfinden, wie durch Einsetzen von einem oder mehreren Nukleotiden in das Subtilisin A-Gen, um die Sequenz zu unterbrechen. Dies kann, zum Beispiel, durch homologe Rekombination getan werden, wie in F.A. Ferrari et al., J. Bacteriol. 154 (3), 1983, S. 1513-1515 beschrieben. Das proteolytische Enzym kann ebenfalls erzeugt werden durch Isolieren der DNA- Sequenz aus einer cDNA- oder genomischen Bank eines das Enzym erzeugenden Mikroorganismus', wie einem Stamm von Bacillus licheniformis, durch Einsetzen der DNA-Sequenz in einen geeigneten Expressionsvelctor, transformieren eines geeigneten Wirts-Mikroorganismus mit dem Vektor, Züchten des Wirts unter Bedingungen, die der Erzeugung des Enzyms förderlich sind, und Zurückgewinnen des Enzyms aus der Kultur. Diese Schritte können durch Standardverfahren, siehe T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, durchgeführt werden.
In einer besonderen Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ist das proteolytische Enzym eines, das die in der beiliegenden Fig. 4 gezeigte Aminosäureseguenz besitzt, oder ein Derivat davon.
In dem vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff "Derivat" dahingehend verstanden, ein proteolytisches Enzym zu bezeichnen, das von dem nativen Enzym abgeleitet ist durch Anfügen an entweder eines oder beide der C- und N-terminalen Enden des nativen Proteins, Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder einer Zahl von verschiedenen Stellen in der nativen Aminosäuresequenz, Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren an einem oder beiden Enden des nativen Proteins oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz, oder einem Einsetzen von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der nativen Amino- Säuresequenz, vorausgesetzt, daß die proteolytische Aktivität des Enzyms nicht dadurch beeinträchtigt wird.
Die in Schritt (ii) des Verfahren der vorliegenden Erfindung zugesetzte Starterkultur ist eine Kultur von Milchsäure-Bakterien, die, bei der herkömmlichen Käseherstellung, verwendet wird, um die in der Milch vorhandene Laktose zu fermentieren und einen weiteren Abbau des geronnenen Caseins in kleinere Peptide und freie Aminosäuren als ein Ergebnis ihrer Erzeugung von Proteasen und Peptidasen zu verursachen. Die Starterkultur kann in Mengen zugesetzt werden, die für den vorliegenden Zweck üblich sind, d.h. typischerweise Mengen von ungefähr 1x10&sup4; - 1x10&sup5; Bakterien/g Käsereimilch, und kann in der Form von gefriergetrockneten, gefrorenen oder flüssigen Kulturen zugesetzt werden. Wenn die in dem Verfahren der Erfindung verwendete Milch konzentrierte Milch ist, ist es bevorzugt, die Starterkultur nach dem Konzentrieren der Milch zuzusetzen, obwohl dies nicht ein absolutes Erfordernis ist, da die Starter-Bakterien während der Filtration zurückgehalten werden.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann das Milch-eindickende Enzym ein beliebiges Enzym sein, das fähig ist, die Koagulation von Casein unter den Bedingungen der Käseherstellung zu bewirken. So kann das Enzym von tierischer oder mikrobieller Herkunft sein. Ein Beispiel für ein geeignetes Milch-dicklegendes Enzym tierischer Herkunft ist Chymosin (auch bekannt als Labferment), das aus der Schleimhaut des vierten Magens von Kälbern erhalten werden kann, oder das durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden kann, z.B. wie in GB 2,100,737 beschrieben. Beispiele für geeignete Milch-dicklegende Enzyme mikrobieller Herkunft sind Proteasen von Pilzen wie die Saure Protease von Mucor miehei (im Handel erhältlich von Novo Nordisk A/S unter der Marke Rennilase; siehe auch GB 1 108 287), Mucor pusillus (K. Arima et al., Methods in Enzymology, Bd. 19, 1970, S. 446-459) oder Endothia Darasitica (J.R. Whitaker, Methods in Enzymology, Bd. 19, 1970, S. 436-445). Die Mucor-Proteasen können weiterhin chemisch modifiziert sein, um ihre Eigenschaften zu verbessern, z.B. wie in US 4,255,454 oder US 4,357,357 beschrieben.
Die Menge des Milch-dicklegenden Enzym, die in dem vorliegenden Verfahren zugesetzt wird, variiert in Übereinstimmung mit der Art des verwendeten Enzyms und dem Konzentrationsgrad der Milch, aber das Enzym wird üblicherweise in einer Menge von 18-25 ml eines handelsüblichen Enzympräparates (Einzelkonzentration = 1:14.000 Soxhlet-Einheiten) pro 100 l Milch zugesetzt.
Man zieht derzeit in Erwägung, daß die meisten Arten von Käse durch das Verfahren der Erfindung vorteilhafterweise hergestellt werden können. Es gibt jedoch einige Hinweise darauf, daß Hartkäse oder halbfeste Käse (mit einem Trockenstoffgehalt von ungefähr 50-70%), die Edamer, Mozzarella, Danbo, Havarti oder Cheddar ähneln, besonders vorteilhaft durch das vorliegende Verfahren herzustellen sind. Die mit der Herstellung von Käse aus UF-Milch verbundenen Probleme sind hauptsächlich bei der Herstellung von Hartkäse oder halbfestem Käse angetroffen worden. Es ist zum Beispiel berichtet worden, daß UF-Mozzarella deutlich beeinträchtigte Schmelzcharakteristiken im Vergleich zu auf herkömmliche Weise hergestellten Mozzarella besitzt (Covacevich, 2.Aufl., Biennial Marschall International Cheese Conference, 1981, Madison WI Marschall Products, S. 237-244). Es ist ebenfalls berichtet worden, daß UF-Mozzarella schwer zu reiben ist, und daß das geriebene Produkt weich wird und Serum freisetzt bei der Lagerung (Hansen, North European Dairy Journal 53, 1987, S. 21-23). Beeinträchtigte Schmelzcharakteristiken sind auch für UF-Havarti (Quist et al., supra) und Käse-Grundbestandteile (Ernstrom et al., Journal of Dairy Science 63, 1980, S. 228-234) berichtet worden. Man glaubt insbesondere, daß der Grund für die beeinträchtigten Charakteristiken von Hart-UF- Käse und halbfestem UF-Käse die größere Abhängigkeit dieser Käse von den Casein-Casein-Wechselwirkungen zum Erhalten einer beständigen Textur sind. Von Molkeproteinen, die mit derartigen Wechselwirkungen interferieren können, wie durch Verdünnungswirkungen (De Koning et al., supra), erwartet man daher, daß sie einen größeren Einfluß auf die Textur dieser Käsearten ausüben. Es ist überraschenderweise gefunden worden, daß wenn ein proteolytisches Enzym, wie das vorstehend definierte, das Molkeproteine in kleinere (Poly-)Peptide hydrolysieren kann, der Käsereimilch in Übereinstimmung mit der Erfindung zugesetzt wird, die mit der Verwendung von konzentrierter Milch zur Herstellung von Käse verbundendenen Nachteile überwunden werden können oder zumindest wesentlich verringert werden, insbesondere in Hinsicht auf Hart- oder halbfesten UF-Käse, oder UF-Käse, der sich auf Erwärmen/Erhitzen hin dehnt und schmilzt.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Enzympräparats, das in flüssiger, stabilisierter, sprühgetrockneter, vakuumgetrockneter, gefriergetrockneter oder körniger Form ist, wobei das Präparat ein proteolytisches Enzym mit den folgenden typischen Merkmalen umfaßt:
(a) es ist eine Serin-Protease, die für Glutaminsäure (Glu)- und Asparaginsäure (Asp)-Reste spezifisch ist;
(b) es besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 25 cpu (wie hierin definiert) pro Gramm Enzymprotein;
(c) es besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 23.600;
(d) es wird durch Diisopropylphosphofluoridat, aber nicht durch Phenylmethansulfonylfluorid gehemmt;
(e) es zeigt 75 % oder mehr seiner maximalen Aktivität in dem pH-Bereich von 6,5 - 10,0;
wobei das Enzympräparat im wesentlichen frei von einer anderen proteolytischen Aktivität ist.
Die verschiedenen Arten, auf die das Enzympräparat formuliert werden kann sind in dem Fachgebiet der Enzyme wohlbekannt, siehe z.B. K. Aunstrup et al., "Production of Microbial Enzymes", in Microbial Technology (H.J. Peppler und D. Perlman, Hrsg.), 2.Aufl., Bd. I, Academic Press 1979, 5.295- 297.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht:
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die die pH-Aktivität der SP 446-Protease zeigt;
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die die Temperatur- Aktivität der SP 446-Protease in Gegenwart (weiße Quadrate) und Abwesenheit (schwarze Quadrate) von Natriumtripolyphosphat (sodium tripolyphosphate, STPP) zeigt;
Fig. 3 zeigt die Spaltung von Insulin durch die SP 446-Protease; und
Fig. 4 zeigt die Aminosäuresequenz der SP 446-Protease, worin die Aminosäuren in dem üblichen Ein-Buchstaben-Code bezeichnet sind.
Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Charakterisierung der SP 446-Protease von Bacillus licheniformis

Ausbeute an SP 446-Protease

Alkalase PPA 1618 wurde wie in US 4,266,031 beschrieben gereinigt. Der Ertrag an gereinigter SP 446-Protease wurde bestimmt, indem die enzymatische Aktivität der Ausgangs- und der gereinigten SP 446-Protease unter Verwendung von CBZ-Phe- Leu-Glu-pNA (Boehringer Mannheim) als Substrat gemessen wurde. Es war notwendig, Phenylmethansulfonylfluorid (1:10 Vol.) zuzusetzen, um das in dem Enzympräparat vorhandene Subtilisin A zu inaktivieren, da Subtilisin A das Substrat abbauen kann, offensichtlich durch ein Spalten nach Phe oder Leu. Die enzymatische Aktivität des Ausgangsmaterials (40 ml) wurde in einem Lambda-Ablesegerät von Perkin-Elmer gemessen als die Absorption bei 405 nm/min./ml und wurde als 166,920 bestimmt. Die enzymatische Aktivität des gereinigten Materials (31 ml) wurde auf ähnliche Weise gemesssen und als 158,720 bestimmt. Somit betrug die Ausbeute an SP 446-Protease 95 %.

Proteolytische Aktivität

Die proteolytische Aktivität der SP 446-Protease wurde als 27 cpu/g unter Verwendung von Casein als Substrat bestimmt. 1 Casein-Protease-Einheit (casein protease unit, cpu) wurde als die Menge an Enzym definiert, die ein Millimol von primären Aminogruppen (bestimmt durch Vergleich mit einem Serin-Standard) pro Minute unter Standardbedingungen wie nachstehend beschrieben freisetzt:
Eine 2 % (Gew./Vol.) Lösung von Casein (Hammarsten, geliefert durch Merck AG, Darmstadt, Deutschland) wird mit dem von Britton und Robinson (J. Chem. Soc., 1931, S. 1451) beschriebenen Universal-Puffer, eingestellt auf einen pH von 9,5, hergestellt. 2 ml der Substratlösung werden in einem Wasserbad für 10 min. bei 25ºC präinkubiert. 1 ml einer Enzymlösung die b g/ml des Enzympräparats enthält, entsprechend ungefähr 0,2 - 0,3 cpu/ml des Universal-Puffers (pH 9,5), wird zugesetzt. Nach 30 min. Inkubation bei 25ºC wird die Umsetzung durch Zusetzen eines Quensch-Mittels (5 ml einer Lösung, die 17,9 g Trichloressigsäure, 29,9 g Natriumacetat und 19,8 g Essigsäure enthält und mit deionisiertem Wasser auf 500 ml gebracht wird) beendet. Ein Leerwert wird auf die gleiche Weise wie die Testlösung hergestellt mit der Ausnahme, daß das Quensch-Mittel vorher der Enzymlösung zugesetzt wird. Die Reaktionsgemische werden für 20 min. in einem Wasserbad gehalten, wonach sie durch Whatman 42-Papierfilter filtriert werden. Ein Faltprospekt AF 228/1, das diese analytische Methode beschreibt, ist auf Anfrage von Novo Nordisk A/S, Dänemark, erhältlich.
Die primären Aminogruppen wurden durch ihre Farbentwicklung mit o-Phthaldialdehyd (OPA) wie folgt bestimmt:
7,62 g Dinatriumtetraboratdecahydrat und 2,0 g Natriumdodecylsulfat wurden in 150 ml Wasser gelöst. 160 mg OPA, gelöst in 4 ml Methanol, wurden dann zusammen mit 400 ul β- Mercaptoethanol zugesetzt, wonach die Lösung mit Wasser auf 200 ml gebracht wurde. Zu 3 ml des OPA-Reagenses wurden 400 ul der vorstehend erhaltenen Filtrate unter Mischen zugesetzt. Die optische Dichte (OD) bei 340 nm wird nach ungefähr 5 min. gemessen. Der OPA-Test wird auch mit einem Serin-Standard, der 10 mg Serin in 100 ml Universal-Puffer (pH 9,5) enthält, durchgeführt. Der Puffer allein wird als ein Leerwert verwendet. Die Proteaseaktivität wird aus den OD-Messungen mittels der folgenden Formel berechnet:
cpu/ml Enzymlösung:
cpu/g Enzympräparat = cpu/ml:b
worin ODt, ODb, ODser und ODB die optische Dichte der Testlösung, des Lehrwerts, des Serin-Standards bzw. Puffers darstellen, Cser ist die Konzentration von Serin (mg/ml) in dem Standard (in diesem Fall 0,1 mg/ml), und MWser ist das Molekulargewicht von Serin (105,09). Q ist der Verdünnungsfaktor für die Enzymlösung (in diesem Fall 8) und ti ist die Inkubationszeit in Minuten (in diesem Fall 30 Minuten).

pH-Aktivität

Die pH-Abhängigkeit der Aktivität der SP 446-Protease wurde durch die vorstehend beschriebene OPA-Casein-Methode bestimmt, mit der Abwandlung, daß der Universal-Puffer auf verschiedene pH-Werte eingestellt wurde, d.h. pH 6, 7, 8, 9, 10 und 11. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt, woraus ersichtlich ist, daß die SP 446-Protease ein pH-Optimum in dem Bereich von pH 8 - 10 besitzt.

Temperatur-Aktivität

Die Temperatur-Abhängigkeit der SP 446-Protease wurde durch die vorstehend beschriebene OPA-Casein-Methode bestimmt, mit den Modifikationen, daß die Enzymreaktion bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt wurde, d.h. 15ºC, 30ºC, 40ºC, 50ºC, 60ºC und 70ºC, und, daß die Enzymreaktion in der Gegenwart und Abwesenheit von 0,1 % Natriumtripolyphosphat (sodium tripolyphosphate, STPP) durchgeführt wurde, das ein üblicher Bestandteil in vielen im Handel erhältlichen Detergenzien ist. Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt, woraus es ersichtlich ist, daß die SP 446-Protease ein Temperatur-Optimum von ungefähr 50ºC, ob STPP anwesend ist oder nicht, besitzt.

Glu-Spezifität

Die Glu-Spezifität der SP 446-Protease wurde wie folgt bestimmt:
0,5 ml von 1 mg/ml menschlichem Insulin in Universal- Puffer, ph 9,5 (vide supra), und 75 ul SP 446-Protease ( 0,6 cpu/l) in dem gleichen Puffer wurden für 120 min. bei 37ºC inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zusetzen von 50 ul Salzsäure beendet.
Das Insulin-Molekül wurde in eine Anzahl von Peptid- Fragmenten gespalten. Diese wurden getrennt und isoliert durch reverse phase-HPLC unter Verwendung einer geeigneten C- 18-Säule (Hibar LiChrosorb RP-18, 5 um-Partikel, bereitgestellt durch Merck AG, Darmstadt, Deutschland). Die Fragmente wurden mit den folgenden Lösungsmitteln eluiert:
A. 0,2 M Natriumsulfat und 0,1 M Phosphorsäure, pH 2,5;
B. Acetonitril/Wasser, 50 %;
auf einem linearen Gradienten von 90 % A/10 % B bis 80 % A/20 % B für 0-5 min. und anschließend für 50 min. mit 80 % A/20 % B. Die isolierten Fragmente wurden, unter Verwendung eines Gasphasen-Sequenziergerätes Modell 470A von Applied Biosystems, Inc., (Foster City, CA, USA), einer Aminosäure-Sequenzierung durch automatisierten Edman-Abbau unterworfen, und die Phenylthiohydantoin (PTH-)-Aminosäuren wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie (high performance liquid chromatography) wie durch L. Thim et al., "Secretion of human insulin by a transformed yeast cell", FEBS Letters 212 (2), 1987, S. 307, analysiert, wodurch die Spaltungsstellen in dem Insulinmolekül identifiziert wurden, wie in Fig. 3 gezeigt.

N-terminale Aminosäuresequenz

Die N-terminale Aminosäuresequenz der gereinigten SP 446-Protease wurde wie vorstehend beschrieben ermittelt. Die ermittelte N-terminale Aminosäuresequenz war

Vollständige Aminosäureseouenz

Die vollständige Aminosäuresequenz wurde aus der DNA- Sequenz ermittelt. Die DNA-Sequenz wurde durch Standardtechniken, wie in dem Abschnitt mit dem Titel "Ausführliche Offenbarung der Erfindung" beschrieben, bestimmt. Die vollständige Aminosäuresequenz ist in der beiliegenden Fig. 4 gezeigt.
Basierend auf dieser Aminosäuresequenz wurde das Molekulargewicht der SP 446-Protease als 23.600 bestimmt.

Inaktivierung der SP 446-Protease mit DFP

Die Inkubation des Enzyms mit PMSF (1 % in Isopropanol) in einem Verhältnis von 10 zu 1 (Volumenverhältnis) führte nicht zu irgendeiner Inaktivierung der SP 446-Protease. Eine Inkubation von 10 ul (1 mg/ml) des Enzyms mit 80 ul 10 mM MOPS, pH 7,2, + 10 ul 0,1 M Diisopropylphosphofluoridat (DFP) für 60 min. führte jedoch zu einer vollständigen Inaktivierung des Enzyms, wie es durch seine Aktivität auf das Substrat CBZ-Phe-Leu-Glu-pNA gemessen wurde.

BEISPIEL 2

Hydrolyse von Molkeprotein

Zu 75 g an sprühgetrocknetem Molkeprotein (Lacprodan-80, erhältlich von Danmark Protein A/S, Nr. Vium, 6920 Videbaek, Dänemark), das in 800 ml deionisiertem Wasser gelöst war, wurden 14,7 cpu pro 100 g Protein der SP 446-Protease bzw. im Handel erhältliches Trypsin (Pancreas Trypsin Novo 6.0 S, erhältlich von Novo Nordisk A/5, das als Vergleichsprobe verwendet wurde) zugesetzt. Die Proteasen wurden mit dem Molkeprotein für 4 Stunden bei 65ºC und einem pH-Wert von 8,0 inkubiert durch das Sogenannte pH-stat-Verfahren, das in dem Informationsblatt Nr. B 163f, November 1984, mit dem Titel "Use of Food Grade Alcalase or Neutrase for Controlled Enzymatic Hydrolysis of Proteins", beschrieben ist und auf Anfrage von Novo Nordisk A/S erhältlich ist. Der Hydrolysegrad, der für das Molkeprotein gemessen wurde, war 12,1 % mit SP 446 und 10,4 mit Trypsin (der Prozentsatz wurde aus der Gesamtzahl an Peptidbindungen in dem Protein errechnet).
Der Hydrolysegrad kann mittels der folgenden Formel berechnet werden:
HG = Anzahl der gespaltenen Peptidbindungen/Gesamtzahl der Peptidbindungen x 100
Die Gesamtzahl an Peptidbindungen in einem Protein kann aus seiner Aminosäure-Zusammensetzung errechnet werden. Die Anzahl der gespaltenen Peptidbindungen kann dann aus einem Assay der freien -Aminogruppen in dem Hydrolysat durch das folgende Verfahren unter Verwendung von Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) bestimmt werden:
0,25 ml einer Probe, die zwischen 0,25x10&supmin;³ und 2,5x10&supmin;³ Amino-Äquivalente/l enthält werden in einem Teströhrchen mit 2,00 ml Phosphatpuffer bei pH 8,2 gemischt. 2 ml einer 0,1 % TNBS-Lösung werden zugesetzt und das Teströhrchen wird geschüttelt und in ein Wasserbad gestellt bei 50 +/- 1ºC für 60 min. Während der Inkubation wird das Teströhrchen und das Wasserbad mit einer Aluminiumfolie bedeckt, weil die Umsetzung des Leerwerts durch Licht beschleunigt wird. Nach 60 min. werden 4,00 ml HCI zugesetzt, um die Umsetzung zu beenden, und das Teströhrchen wird bei Raumtemperatur für 30 min. stehengelassen, bevor die Absorption spectrophotometrisch bei 340 nm gegen Wasser abgelesen wird. Für weitere Einzelheiten siehe J. Adler-Nissen, J. Agric. Food Chem. 27, 1979, S. 1256-1262.

BEISPIEL 3

Um die Fähigkeit der SP 446-Protease zu bestimmen, Molkeproteine in Milch ohne ein begleitendes Dicklegen der Milch zu hydrolysieren, wurden jeweils 0,2 cpu/l Subtilisin A bzw. SP 446-Protease zu 15 ml Gesamtmilch bei einem pH von 6,8 und einer Temperatur von 35ºC zugesetzt. Die Reaktionsgemische wurden für 3-4 Stunden stehengelassen. Die Milch, die Subtilisin A enthielt, wurde nach einer Inkubation von wenigen Minuten dick, während bei der Milch, die die SP 446-Protease enthielt, nach einer 3-4 stündigen Inkubation mit dem Enzym kein Dicklegen beobachtet wurde. Dem Reaktionsgemisch, das die SP 446-Protease enthielt, wurde dann Rennilase (eingetragene Marke von Novo Nordisk A/S) auf eine Konzentration von 17,5 KRU/l zugesetzt (KRU = kilorenneting units, vide Informationsblatt Nr. 8250f, 1989, mit dem Titel "Cheesemaking with Rennilase", auf Anfrage von Novo Nordisk A/S erhältlich), was zu einem Dickwerden der Milch nach einer Inkubation von wenigen Minuten führte.

BEISPIEL 4

0,1 cpu der SP 446-Protease wurden zu 1 l pasteurisierter Kuhmilch mit einem standardisierten Fettgehalt von 3,5 % bei 34ºC gegeben und für 3 Stunden inkubiert, gefolgt von einem Zusetzen von 10 ml einer im Handel erhältlichen Starterkultur in einer Menge von 1x10&sup6;-1x10&sup7; Bakterien/g Milch. Nach einem Stehenlassen für 10 min. wurde eine Stammlösung von Ca zugestzt, entsprechend 0,2 g CaCl&sub2;. 0,2 g Rennilase 14 L (Marke von Novo Nordisk A/S für eine im Handel erhältliche protease von Mucor miehei) Batch PRN 1382 wurden dann unter Rühren zugesetzt und dann stehengelassen, was zu der Bildung eines ausreichend festen Käsebruchs nach ungefähr 20 min. führte. Der Käsebruch wurde geschnitten und gesalzen auf eine Weise, die der se zur Herstellung von Feta-Käse bekannt ist.
Die verbleibende Molke wurde dann einer SDS-PAGE auf eine der se bekannte Weise unterzogen, aus der ersichtlich war, daß die Proteine mit einem hohen Molekulargewicht (> 30.000) zu Peptiden mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 abgebaut worden sind.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Käse, wobei:

(i) ein Enzympräparat, das ein proteolytisches Enzym mit einer Spezifität umfaßt, die es befähigt, eine begrenzte Hydrolyse von Molkeproteinen zu bewirken ohne irgendein Dicklegen von Milch zu vemrsachen, wobei das Enzympräparat im wesentlichen frei von einer anderen proteolytischen Aktivität ist, zu Milch gegeben wird, um die begrenzte spezifische Hydrolyse der Molkeproteine in der Milch zu bewirken;

(ii) eine Starterkultur im Anschluß an oder gleichzeitig mit dem Enzympräparat zu der Milch gegeben wird; und

(iii) ein Milch-dicklegendes Enzym der Milch zugegeben wird im Anschluß an oder gleichzeitig mit dem in Schritt (i) zugegebenem Enzympräparat und im Anschluß an oder gleichzeitig mit der in Schritt (ii) zugegebenen Starterkultur, um ein Dicklegen der Milch zu bewirken, wonach der resultierende Käsebruch auf eine per se bekannte Weise zur Herstellung von Käse verarbeitet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das proteolytische Enzym die folgenden typischen Merkmale besitzt:

(a) es ist eine Serin-Protease, die für Glutaminsäure (Glu)- und Asparaginsäure (Asp)-Reste spezifisch ist;

(b) es besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 25 Casein- Protease-Einheiten pro Gramm Enzymprotein;

(c) es besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 23.600;

(d) es wird durch Diisopropylphosphofluoridat, aber nicht durch Phenyimethansulfonylfluorid gehemmt;

(e) es zeigt 75 % oder mehr seiner maximalen Aktivität in dem pH-Bereich von 6,5 - 10,0.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Milch konzentrierte Milch ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Enzympräparat nach dem Konzentrieren der Milch zugegeben wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das proteolytische Enzym ein durch einen Mikroorganismus, insbesondere ein Bakterium, herstellbares ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Bakterium ein Stamm von Bacillus licheniformis, einschließlich eines Mutantenstammes von Bacillus licheniformis, ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das proteolytische Enzym die folgende Aminosäuresequenz besitzt, die in dem üblichen Ein-Buchstaben- Code wiedergegeben wird:

8. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Starterkultur nach dem Konzentrieren der Milch zugegeben wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Milch-dicklegende Enzym von tierischer oder mikrobieller Herkunft ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzympräparat in einer Menge von 0,005 - 0,25 cpu/l Milch, vorzugsweise 0,01 - 0,1 cpu/l Milch, beispielsweise ungefähr 0,05 cpu/l Milch, zugegeben wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Milch-dicklegende Enzym in einer Menge von 18 - 25 ml eines im Handel erhältlichen Enzympräparates pro 100 l Milch zugegeben wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11 zur Herstellung von Hartkäse oder halbfestem Käse.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11 zur Herstellung von skäse, der sich beim Erwärmen dehnt und schmilzt.

14. Verwendung eines Enzympräparates in dem Verfahren nach einem der Anspräche 1 - 13, wobei das Präparat in flüssiger, stabilisierter, spritzgetrockneter, vakuumgetrockneter, gefriergetrockneter oder körniger Form bereitgestellt wird, und wobei das Präparat ein proteolytisches Enzym mit den folgenden typischen Merkmalen umfaßt:

(a) es ist eine Serin-Protease, die für Glutamin (Glu)- und Asparaginsäure (Asp)-Reste spezifisch ist;

(b) es besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 25 cpu (Casein-Protease-Einheiten) pro Gramm Enzymprotein;

(c) es besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 23.600;

(d) es wird durch Diisopropylphosphofluoridat, aber nicht durch Phenylmethansulfonylfluorid gehemmt;

(e) es zeigt 75 % oder mehr seiner maximalen Aktivität in dem pH-Bereich von 6,5 - 10,0;

wobei das Enzympräparat im wesentlichen frei von einer anderen proteolytischen Aktivität ist.