DE69023413T2

DE69023413T2 - Reinigung des Faktor-VIII-Komplexes unter Anwendung von Heparinaffinitätschromatographie.

Info

Publication number: DE69023413T2
Application number: DE69023413T
Authority: DE
Inventors: Prabir Bhattacharya; David Phillip Kosow; Charles Frederick Sternburg
Original assignee: Alpha Therapeutic Corp
Current assignee: Alpha Therapeutic Corp
Priority date: 1989-08-01
Filing date: 1990-07-24
Publication date: 1996-07-11
Anticipated expiration: 2010-07-25
Also published as: DE69023413D1; EP0411810A1; EP0411810B1; US5110907A; ES2078947T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, die sich zur Abtrennung des Faktor VIII-Komplexes von anderen Proteinfraktionen, die sich im Plasma finden, eignen.
Die Gerinnung von Blut ist ein komplexer Prozeß, der die aufeinanderfolgende Wechselwirkung einer großen Anzahl an Komponenten erfordert, wobei es sich bei fast allen Komponenten um Proteine handelt. Diese Komponenten umfassen Fibrinogen sowie die Faktoren II, V, VII, VIII, IX, X, XI und XII. Ein Mangel an einer dieser Komponenten oder eine nicht-funktionstüchtige Komponente können dazu führen, daß das Blut nicht gerinnen kann, wenn es erforderlich ist, was zu einem starken und lebensbedrohenden Blutverlust bei dem Patienten führt.
Hämophihe A ist eine häufige Blutungsstörung, die durch einen Mangel oder eine Anomalie von Faktor VIII verursacht wird. Die Schwere dieser Störung zeigt klar die Bedeutung von Faktor VIII für den Stoffwechselweg der Blutgerinnung, obwohl sich dieses Protein in normalem Plasma nur in Spurenmengen findet. Faktor VIII liegt im Plasma als ein hochmolekularer Komplex (Faktor VIII-Komplex) vor, der Faktor VIII:C und von Willebrand-Faktor (Faktor VIII:R oder vWf) umfaßt. Faktor VIII:C fördert die Blutgerinnung. Faktor VIII:R tritt in Wechselwirkung mit Blutplättchen, wobei die Aggregation der Blutplättchen gefördert wird, und er wirkt als Stabilisator für Faktor VIII:C, wenn er in den Faktor VIII-Komplex eingebaut wird.
Die hauptsächliche therapeutische Verwendung von Faktor VIII besteht in seiner intravenösen Verabreichung an Patienten mit Hämophihe A. In schweren Fällen sind relativ hohe Konzentrationen an Faktor VIII erforderlich. Diese hohen Konzentrationen werden durch Reinigung und Aufkonzentrieren von Faktor VIII erhalten. Die Reinigung führt jedoch oft zu einer Instabilität und zu einem Verlust an Faktor VIII:C-Aktivität, und zwar aufgrund der Entfernung von Faktor VIII:R aus dem Faktor VIII-Komplex während der Reinigung. Das erhaltene gereinigte Produkt ist also ein Gemisch aus sowohl dem stabilen Faktor VIII-Komplex als auch dem instabilen Faktor VIII:C, und zwar zusammen mit verunreinigenden Proteinen, die nicht entfernt worden sind, sowie Proteinen, wie Albumin, die zu dem Produkt zur Stabilisierung von Faktor VIII:C gegeben worden sind. Da diese Lösungen einen unerwünscht großen Anteil an verunreinigenden und stabilisierenden Proteinen enthalten und da nur Faktor VIII:C wirksam bei der Behandlung von Patienten mit Hämophihe A ist, müssen den Patienten größere Mengen an Proteinen infundiert werden, als erforderlich wären, wenn es sich bei dem gesamten Protein um Faktor VIII:C handeln würde.
Die Affinitätschromatographie wird häufig als ein Verfahren zur Abtrennung eines gewünschten Proteins von anderen, verunreinigenden Proteinen genutzt. Dieses Verfahren beruht auf einer spezifischen Wechselwirkung zwischen dem gewünschten Protein und einem Liganden, der an das chromatographische Medium angeheftet ist. Für die Spezifität der Wechselwirkung bei der Affinitätschromatographie wird durch die einzigartige Fähigkeit eines gegebenen Proteins gesorgt, die spezifischen chemischen Verbindungen, die als Liganden verwendet werden, zu erkennen und daran zu binden. Der enorme Vorteil dieses chromatographischen Verfahrens gegenüber anderen Verfahren, die üblicherweise angewandt werden (z. B. Ionenaustausch), besteht darin, daß nur die Proteine, die den Liganden erkennen, an die Säule binden; auf diese Weise können Verunreinigungen und inaktives Protein aus dem gewünschten Protein entfernt werden. Die Elution des spezifisch gebundenen Proteins kann nach dem Prinzip des Ionenaustausches durch Verwendung von Lösungen mit hohen Salzkonzentrationen oder selektiv nach dem Affinitätsprinzip unter Verwendung einer zweiten chemischen Verbindung, die durch das Protein erkannt wird, erfolgen. Wenn die Lösung, die die zweite chemische Verbindung enthält, zugegeben wird, dann dissoziiert das gebundene Protein von dem Liganden und bindet an die "mobile" zweite chemische Verbindung in der Lösung, wobei eine Elution aus der Säule stattfindet.
Die Ionenaustauschchromatographie unterscheidet sich von der Affinitätschromatographie dadurch, daß sie nur auf ionischen Wechselwirkungen zwischen dem Protein und dem chromatographischen Medium beruht. Derartige ionische Wechselwirkungen sind nicht spezifisch. In diesem Fall enthalten die Liganden, die an das chromatographische Medium gebunden sind, geladene Gruppen, und zwar entweder negativ oder positiv geladene Gruppen, anstelle einer chemischen Verbindung, die spezifisch durch das Protein erkannt wird. Die Elution aus dem Ionenaustauschmedium ist ebenfalls nicht spezifisch und beruht nur auf hohen Salzkonzentrationen. Bei der Ionenaustauschchromatographie konkurriert das Salz um die geladenen Gruppen des chromatographischen Mediums und des Proteins, was zur Elution des Proteins aus dem chromatographischen Medium führt.
DL 3 504 385 beschreibt ein chromatographisches Ionenaustauschverfahren zur Reinigung des Faktor VIII-Komplexes, bei dem der Faktor VIII an eine Matrix mit Sulfatgruppen, wie Dextransulfat, gebunden und mit Citrat-Puffer, CaCl&sub2; und einem Gradienten von NaCl eluiert wird. Der Faktor VIII-Komplex wird mit etwa 0,52 m NaCl eluiert.
In Haemostasis, Bd. 7 (1978), S. 321-331 wird ein Verfahren zur Reinigung von Faktor VIII unter Verwendung von Heparin-Sepharose beschrieben. Nachdem die unreine, Faktor VIII enthaltende Probe auf die Säule aufgetragen worden war, wurde die Säule mit einer gepufferten Lösung mit einem Gehalt an NaCl und Imidazol gewaschen. Es folgte eine stufenweise Elution mit ansteigenden Konzentrationen an NaCl. Es wurde jedoch festgestellt, daß der gewonnene Faktor VIII eine geringe oder keine Aktivität aufwies.
Ein weiteres Verfahren, das zur Reinigung von Faktor VIII herangezogen wurde, besteht in der Bindung des Faktor VIII:R-Anteils des Faktor VIII-Komplexes an monoklonale Antikörper und der anschließenden Elution des Faktors VIII:C aus dem Faktor VIII-Antikörper-Komplex. Dieses Verfahren führt zu einem Faktor VIII:C mit sehr hoher spezifischer Aktivität von ungefähr 1500 bis 2500 Einheiten/mg Gesamtprotein und damit zu einer sehr hohen Reinheit. (Der Ausdruck "spezifische Aktivität" bedeutet in der vorliegenden Anmeldung Einheiten Faktor VIII :C-Gerinnungsaktivität pro mg Protein. Eine "Einheit" ist als die Menge an Faktor VIII:C in 1 ml normalem Plasma definiert). Der Faktor VIII:R dissoziiert jedoch während dieses Verfahrens vom Faktor VIII:C, was dazu führt, daß der Faktor VIII:C instabil ist. Um die Instabilität von Faktor VIII:C zu überwinden, werden große Mengen an stabilisierenden Proteinen, wie menschliches Serumalbumin, zu dem gereinigten Faktor VIII:C gegeben. Wie auch bei anderen Reinigungsverfahren (die vorstehend erörtert wurden) besteht der Nachteil darin, daß die Zugabe von stabilisierenden Proteinen erforderlich ist und größere Mengen an Proteinen den Patienten infundiert werden müssen, als erforderlich wären, wenn es sich beim gesamten Protein um Faktor VIII:C handeln würde.
Gegenwärtig führen die Verfahren, die zur Reinigung von Faktor VIII angewandt werden, zu Proteinzubereitungen, d. h. Faktor VIII-Konzentraten, die eine relativ geringe spezifische Faktor VIII-Aktivität aufgrund von verunreinigenden und stabilisierenden Proteinen aufweisen. Wenn das Faktor VIII-Konzentrat eine relativ geringe spezifische Faktor VIII: C-Aktivität aufweist, dann müssen den Patienten unerwünscht große Mengen an fremdem Protein infundiert werden, um den erforderlichen Spiegel an Faktor VIII zu erzielen, der für eine wirksame Behandlung nötig ist. Die Menge an Protein, die infundiert werden muß, könnte drastisch verringert werden, wenn der Faktor VIII-Komplex das einzige Protein wäre, das in den Infusionslösungen enthalten ist. Es ist daher wünschenswert, daß ein verbessertes Verfahren zur Abtrennung des Faktor VII-Komplexes, d. h. des intakten Faktor VIII:C/Faktor VIII:R-Komplexes, von verunreinigenden Proteinen bereitgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Abtrennung des Faktor VIII-Komplexes aus einer unreinen Proteinfraktion, die den Faktor VIII-Komplex enthält, z. B. aus einer Plasmafraktion oder aus beliebigem, mit Hilfe von rekombinanter DNA erhaltenem Material, das den Faktor VIII- Komplex enthält, gerichtet. Der Faktor VIII-Komplex wird durch Auftragen der unreinen Proteinfraktion auf ein Heparin-gekuppeltes chromatographisches Medium abgetrennt, wobei der Faktor VIII-Komplex an das Heparin bindet. Der Faktor VIII-Komplex wird aus dem chromatographischen Medium unter Verwendung einer wäßrigen Lösung, die CaCl&sub2; enthält, als Elutionsmittel eluiert, und anschließend wird der Faktor VIII-Komplex aus dem Eluat gewonnen.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine einfache und wirksame Reinigungsmethode für den Faktor VIII-Komplex mit hoher spezifischer Aktivität aus einer unreinen Proteinfraktion bereit. Der Ausdruck "unreine Proteinfraktion" bedeutet in der vorliegenden Anmeldung eine Lösung, die ein oder mehrere Proteine zus:tzlich zu dem Faktor VIII-Komplex enthält, wobei die Entfernung dieser zusätzlichen Proteine erwünscht ist. Die unreine Proteinfraktion, die als Ausgangsmaterial für die Reinigung des Faktor VIII-Komplexes verwendet wird, kann aus einer Reihe von Quellen stammen, wie Cryopräzipitat oder anderen, aus Blutplasma abgeleiteten Fraktionen, oder sie kann mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken erhalten werden.
Gemäß der Praxis der vorliegenden Erfindung wird der Faktor VIII- Komplex mit einer hohen spezifischen Aktivität an Faktor VIII:C bereitgestellt, indem der Faktor VIII-Komplex von den Verunreinigungen unter Anwendung affinitätschromatographischer Techniken entfernt wird. Eine Lösung, die den Faktor VIII-Komplex enthält, d. h. die unreine Proteinfraktion, wird auf ein affinitätschromatographisches Medium aufgetragen, das einen an eine Matrix gebundenen Heparin-Liganden umfaßt. Der Faktor VIII- Komplex bindet an das Heparin, während andere verunreinigende Proteine aus dem affinitätschromatographischen Medium in das ausströmende Material treten. Der Faktor VIII-Komplex wird dann spezifisch von dem affinitätschromatographischen Medium mit einer Lösung mit einem Gehalt an CaCl&sub2; eluiert. Heparin und CaCl&sub2; werden bei diesem Verfahren verwendet, da beide spezifisch von dem Faktor VIII-Komplex erkannt werden. Da sowohl Heparin als auch Calcium imstande sind, spezifisch an den Faktor VIII- Komplex zu binden, sind sie wirksame Liganden bzw. Elutionsmittel bei der affinitätschromatographischen Reinigung des Faktor VIII-Komplexes.
Da der intakte Faktor VIII-Komplex, d. h. der Komplex aus Faktor VIII:C und Faktor VIII:R, durch das erfindungsgemäße Verfahren isoliert wird, ist die Zugabe von fremden Proteinen zur Stabilisierung der Aktivität von Faktor VIII:C nicht erforderlich. Als Ergebnis werden schließlich hohe spezifische Aktivitäten von 30 bis 60 Einheiten an Faktor VIII:C/mg erhalten. Diese Werte sind höher als die spezifische Aktivität von 5 bis 10 Einheiten/mg, die für Zubereitungen erhalten wird, wenn der instabile Faktor VIII:C in einer Form gereinigt wird, die vom Faktor VIII-Komplex dissoziiert ist. In diesem letztgenannten Fall müssen große Mengen an fremden Proteinen, wie Albumin, zugegeben werden, um die Aktivität von gereinigtem Faktor VIII:C zu stabilisieren.
Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform der Praxis der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Ausgangsmaterial zur Bereitstellung der unreinen Proteinfraktion, die den Faktor VIII-Komplex enthält, um Cryopräzipitat. Das Cryopräzipitat wird aus menschlichem Blutplasma gewonnen, das gesammelt und gemäß den von der US Food and Drug Administration genehmigten Verfahren getestet wurde. Das Plasma wird bei einer Temperatur von etwa -20ºC gefroren und anschließend bei 0ºC bis 5ºC aufgetaut. Während dieses Auftauprozesses bildet sich ein Präzipitat (das "Cryopräzipitat"), das durch Zentrifugation entfernt und für die weitere Reinigung und Aufkonzentrierung gewonnen wird.
Das Cryopräzipitat wird in einer "Heparin-Lösung" gelöst, die destilliertes Wasser mit einem Gehalt von etwa 30 bis 150 Einheiten Heparin pro ml Wasser enthält. Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform werden 80 Einheiten Heparin pro ml Wasser verwendet. Die Lösung wird anschließend bei einer Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 30ºC gemischt, bis sich das Cryopräzipitat vollständig aufgelöst hat (ungefähr 10 Minuten), um eine Cryopräzipitat/Heparin-Lösung bereitzustellen. Vorzugsweise wird die Temperatur während des Mischens bei etwa 30ºC gehalten, und das Volumen der verwendeten Heparin-Lösung beträgt etwa 2 bis etwa 10 1 pro kg Cryopräzipitat. Nachdem sich das Cryopräzipitat aufgelöst hat, wird der pH- Wert der Cryopräzipitat/Heparin-Lösung auf etwa 7 ± 0,1 eingestellt, und zwar z. B. unter Verwendung von 0,1 m HCl. Die Lösung wird für weitere 20 bis 30 Minuten gerührt.
Eine Einheit an Heparin soll definitionsgemäß eine U.S.P. -Einheit (United States Pharmacopoeia) bedeuten. Die U.S.P.-Einheit an Heparin ist die Menge, die erforderlich ist, um die Gerinnung von 1,0 ml an mit Citrat behandeltem Schafplasma für 1 Stunde nach der Zugabe von 0,2 ml einer 1:100-Calciumchloridlösung (CaCl&sub2;-Lösung) zu verhindern. Der Ausdruck "Heparin" soll in der vorliegenden Anmeldung Heparin selbst und pharmazeutisch verträgliche, wasserlösliche Salze von Heparin, z. B. die Natriumsalze, umfassen. Ein geeignetes Beispiel für ein im Handel erhältliches Heparin-Natrium-Produkt ist U.S.P.-Heparin von Lyphomed Company, Melrose Park, Illinois, oder von Sigma Chemical Company (Sigma Nr. H7005), St. Louis, Missouri.
Polyethylenglykol-Pulver (PEG-Pulver), vorzugsweise mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 2000 bis etwa 6000 (insbesondere von etwa 3000 bis etwa 4000) wird dann zu der Cryopräzipitat/Heparin-Lösung gegeben, um eine PEG-Lösung mit einer Endkonzentration an PEG von etwa 1 % bis etwa 5 % (Gew./Vol.) bereitzustellen. Der Ausdruck "% (Gew./Vol.)" bedeutet in der vorliegenden Anmeldung das Gewicht an Material, das pro 100 ml Ausgangsvolumen der Lösung zugegeben wurde. Die Prozentsätze beziehen sich in der vorliegenden Anmeldung alle auf das Gewicht pro Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist. Vorzugsweise wird das PEG in Form einer Lösung zugegeben, die durch Lösen von PEG in destilliertem Wasser, das ein Citrat-Salz (wie Natriumcitrat) enthält, hergestellt wurde. Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform enthält die wäßrige PEG-Lösung, die zu der Cryopräzipitat/Heparin-Lösung gegeben wird, etwa 31,5 % PEG, 0,22 % Natriumcitrat-Dihydrat und 0,08 % Citronensäure-Monohydrat bei einem pH-Wert von 6,2. Der pH-Wert der PEG-Lösung wird auf einen Wert zwischen 5,5 und 7,1 mit einer Säure, wie verdünnter Essigsäure, eingestellt. Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform beträgt der pH-Wert etwa 6,3. Die PEG-Lösung mit eingestelltem pH-Wert wird für etwa 15 Minuten bei einer Temperatur von 15ºC bis 35ºC gemischt. Gemäß einer Ausführungsform beträgt die Temperatur etwa 27ºC.
Die Zugabe von PEG (1 % bis 5 % und vorzugsweise 3 % bis 5 %) zur Bildung einer PEG-Lösung führt zur Ausfällung verschiedener Proteine, wie Fibronectin und Fibrinogen, wobei der Faktor VIII-Komplex in Lösung verbleibt. Das Fibronectin und andere ausgefällte Proteine, d. h. das PEG- Präzipitat, werden von der den Faktor VIII-Komplex enthaltenden Lösung (dem PEG-Überstand) durch Zentrifugation abgetrennt. Der PEG-Überstand, d. h. die den Faktor VIII-Komplex enthaltende, unreine Proteinfraktion, wird gewonnen und weiterverarbeitet, um den Faktor VIII-Komplex zu reinigen, und zwar gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform der Praxis der vorliegenden Erfindung umfaßt das Verfahren zur Herstellung des Faktor VIII-Komplexes Stufen zur Inaktivierung von Viren, die in derartigen Blutprodukten vorhanden sein können, z. B. Hepatitis B-Virus, Hepatitis-non-A/non- B-Virus, HTLV III (AIDS-Virus), Cytomegalo-Virus, Epstein-Barr-Virus und dergl. Gemäß einer Ausführungsform wird eine Lösung, die sowohl ein organisches Lösungsmittel als auch ein Detergens umfaßt, zu dem PEG-Überstand gegeben, um Viren, die möglicherweise vorhanden sind, zu inaktivieren. Die Menge an organischem Lösungsmittel und Detergens, die zugegeben wird, führt vorzugsweise zu einer Lösung, die etwa 0,3 % organisches Lösungsmittel und etwa 1 % Detergens enthält. Detergentien, die sich für die Praxis der Prinzipien der vorliegenden Erfindung eignen, sind ein Detergens, das unter dem Warenzeichen "TWEEN-80" von Fisher Scientific, Springfield, New Jersey, vertrieben wird, oder ein Detergens, das unter dem Warenzeichen "TRITON X-100" von Aldrich Company, Milwaukee, Wisconsin, vertrieben wird. Geeignete organische Lösungsmittel sind Tri-n-butylphosphat (TNBP) und Ethylether oder dergl. Die Lösung wird für etwa 6 Stunden bei einer Temperatur von etwa 24ºC bis etwa 30ºC inkubiert. Die Inaktivierung der Viren unter Verwendung eines Gemisches aus organischem Lösungsmittel/Detergens wird im US-Patent 4 540 573 beschrieben, das am 10. September 1985 Neurath et al. erteilt wurde und das durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird.
Die viral inaktivierte PEG-Überstandslösung, d. h. die den Faktor VIII-Komplex enthaltende unreine Proteinfraktion, wird durch Filtration geklärt und anschließend zur Reinigung des Faktor VIII-Komplexes durch Affinitätschromatographie weiterverarbeitet.
Die Herstellung des Heparin-gekuppelten chromatographischen Mediums erfolgt gemäß der vorliegenden Erfindung durch Kupplung von Heparin oder Heparinsulfat an ein aktiviertes Harz. Aktivierte Harze, die sich für die Praxis der vorliegenden Erfindung eignen, umfassen, ohne Beschränkung hierauf, Bromcyan-aktivierte Agarose, N-Hydroxysuccinimid-aktivierte Agarose, Aldehyd-aktivierte Agarose, Bromcyan-aktivierte Sepharose, Bromcyan-aktiviertes Siliciumdioxidgel und dergl.
Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform der Herstellung eines Heparin-gekuppelten chromatographischen Mediums wird Heparin an ein aktiviertes Aldehyd-Agaroseharz, das von Sterogene Biochemicals, San Gabriel, Californien, unter dem Warenzeichen "ACTIGEL-A" vertrieben wird, gebunden. Gemäß dieser Ausführungsform wird ACTIGEL-A mit 3 Volumina eines Puffers, wie eines Phosphat-, Acetat- oder Borat-Puffers, bei Konzentrationen von etwa 0,1 molar (m) und bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5 gewaschen und äquilibriert. Ein Kupplungsgemisch aus Heparin in einem Puffer mit einem Gehalt an etwa 0,1 m Phosphat, Acetat oder Borat mit etwa 0,1 m Natriumcyanoborhydrid (NaCNBH&sub3;) bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5 wird zu einem gleichen Volumen an gewaschenem ACTIGEL-A-Harz gegeben und 12 bis 20 Stunden bei etwa 4ºC bis etwa 30ºC unter konstanter Bewegung mit einem mechanischen Mischer, wie einem Labquake-Taumelmischer, der von Scientific Products, Irvine, Californien, bezogen wird, inkubiert. Nach der Kupplung wird das Gemisch durch einen Büchner-Trichter unter Verwendung eines gesinterten Glasfilters mit mittlerer Porengröße ("medium-gauge") filtriert, und das Retentat, d. h. das chromatographische Heparin-gekuppelte ACTIGEL-A-Medium, wird gewaschen, indem mehrere Volumina einer Lösung, die etwa 0,1 m Phosphat-, Acetat- oder Borat-Puffer bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 7,5 mit einem Gehalt an 0,5 m bis 1 m NaCl umfaßt, über das Retentat gegossen werden, während es sich im Büchner-Trichter befindet. Das gewaschene, Heparin-gekuppelte chromatographische Medium wird anschließend bei 4 C bis 30 C in etwa 0,1 m Ethanolamin bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 7,5 für etwa 2 Stunden inkubiert, um nicht-umgesetzte Aldehydgruppen zu desaktivieren. Das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium wird über einen Büchner- Trichter unter Verwendung eines gesinterten Glasfilters mit mittlerer Porengröße filtriert und anschließend gewaschen, indem mehrere Volumina einer Lösung mit einem Gehalt an etwa 1 m NaCl über das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium gegossen werden, während es sich im Büchner-Trichter befindet. Schließlich wird das Medium mit einem Puffer, wie einem Phosphatpuffer, bei einer Konzentration von etwa 0,1 m und einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 7,5 gewaschen. Das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium wird dann gekühlt bei etwa 4ºC bis 10ºC in etwa 0,1 m Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 gelagert, wobei etwa 0,01 m Natriumazid oder ein anderes Baktericid als Konservierungsmittel zugegeben wird.
Die Menge an Heparin, die bei den Kupplungsreaktionen verwendet wird, beträgt vorzugsweise etwa 250 bis etwa 2000 Einheiten Heparin pro ml ACTIGEL-A und insbesondere etwa 1000 Einheiten Heparin pro ml ACTIGEL- A, da diese Konzentration zu einer optimalen Bindung des Faktor VIII-Komplexes führt. Bei Konzentrationen unterhalb etwa 1000 Einheiten pro ml findet man unerwünscht hohe Konzentrationen an Faktor VIII-Komplex im aus der chromatographischen Säule ausströmenden Material. Bei Konzentrationen über 1000 Einheiten Heparin pro ml gibt es keinen Anstieg der Menge an gebundenem Faktor VIII-Komplex, und daher führt das zusätzliche Heparin zu einer unnötigen Erhöhung der Kosten des Verfahrens.
Gemäß einer Ausführungsform der Praxis des erfindungsgemäßen Verfahrens werden chromatographische Säulen, wie Säulen, die von Amicon Corporation, Danvers, Massachusetts, bezogen werden, verwendet. Die Säule um faßt einen länglichen hohlen Behälter mit einem Auslaß an seinem Boden. Das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium, das hergestellt wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, wird von der Natriumazid-Konservierungsmittel-Lösung dekantiert, in der es gelagert wurde, und mit einem Puffer, wie einem Imidazol-Puffer mit einem Gehalt an etwa 0,01 m bis 0,05 m Imidazol, bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 7,5 gewaschen. Das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium wird mit einem ausreichenden Volumen an Puffer, wie 0,01 m bis 0,05 m Imidazolpuffer, bei einem pH- Wert von 6,5 bis 7,5 aufgeschlämmt, so daß das Aufschlämmungsvolumen das Gesamtvolumen der Säule nicht übersteigt und die Aufschlämmung nicht so dickflüssig ist, daß Luftblasen festgehalten werden. Das untere Ende der Säule wird mit etwa 1 bis etwa 3 cm einer Lösung gefüllt, die einen Puffer, wie einen 0,02 m bis 0,05 m Imidazol-Puffer, bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 mit einem Gehalt an etwa 0,1 m bis 0,15 m eines Salzes, wie NaCl, LiCl oder KCl, enthält, und zwar bei der Temperatur, bei der die Säule betrieben werden soll. Das aufgeschlämmte chromatographische Medium wird dann in die Säule gepackt, indem es herunter entlang der Seitenwand gegossen wird, so daß eine Heparin-gekuppelte chromatographische Säule bereitgestellt wird, die sich bei der Praxis der vorliegenden Erfindung zur Abtrennung des Faktor VII-Komplexes aus der unreinen Proteinfraktion, die den Faktor VIII-Komplex enthält, eignet.
Gegebenenfalls kann gemäß der Techniken der vorliegenden Erfindung zur Abtrennung des Faktor VIII-Komplexes aus der unreinen Proteinfraktion das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium in einem absatzweisen Verfahren anstelle eines Säulenverfahrens verwendet werden. Bei dem absatzweisen Verfahren wird das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium, das hergestellt wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, von der Natriumazid-Lösung, in der es gelagert wurde, dekantiert und mit einem Puffer, wie einem Imidazolpuffer, bei einer Konzentration von etwa 0,01 m bis etwa 0,05 m und einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 7,5 gewaschen. Die Pufferlösung wird dekantiert, und das gewaschene, Heparin-gekuppelte chromatographische Medium wird direkt zu der den Faktor VIII-Komplex enthaltenden unreinen Proteinfraktion gegeben.
Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform der Praxis der vorliegenden Erfindung wird die Faktor VIII-Komplex-Lösung aus der Stufe der viralen Inaktivierung (die den Faktor VIII-Komplex enthaltende unreine Proteinfraktion) auf die chromatographische Säule aufgetragen, die das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium enthält, indem die Lösung durch die Säule gegossen wird. Die Durchflußgeschwindigkeit der Säule beträgt etwa 0,35 ml pro min für eine kleine Säule (etwa 5 ml) bis etwa 2 ml pro min für eine große Säule (etwa 50 ml). Sowie die unreine Proteinfraktion durch die Säule fließt, bindet der Faktor VIII-Komplex an den Heparin-Liganden auf dem Heparin-gekuppelten chromatographischen Medium, während andere Proteine durch das chromatographische Medium in der Säule treten und als ausströmendes Material aus der Säule fließen. Vorzugsweise werden nicht mehr als 20 Einheiten Faktor VIII:C-Aktivität auf die Säule pro ml an Heparin-gekuppeltem chromatographischem Medium in der Säule aufgetragen, wenn, wie gemäß einer beispielhaften Ausführungsform, 1000 Einheiten an Heparin pro ml an aktiviertem Harz gebunden sind. Wenn mehr als etwa 20 Einheiten Faktor VIII:C-Aktivität pro ml Heparin-gekuppeltem chromatographischem Medium zugegeben werden, dann wird der überschüssige Faktor VIII-Komplex nicht gebunden, sondern durch die Säule in das aus der Säule ausströmende Material gespült. Wenn weniger als etwa 20 Einheiten an Faktor VIII:C-Aktivität pro ml zugegeben werden, dann wird die maximale Bindungskapazität des Heparin-gekuppelten chromatographischen Mediums (bei 1000 Einheiten an Heparin pro ml an aktiviertem Harz) nicht genutzt.
Das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium, an das der Faktor VIII-Komplex gebunden ist, wird gewaschen, um alle ungebundenen Proteine zu entfernen. Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform wird das Waschen durchgeführt, indem etwa 5 bis 10 Volumina einer Lösung, die etwa 0,01 bis 0,05 m Puffer, wie Imidazolpuffer, bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 mit einem Gehalt an etwa 0,1 m bis 0,15 m an Salzlösung, wie LiCl, NaCl oder KCl, umfaßt, aufgegeben werden, und das aus der Säule ausströmende Material wird gesammelt. Vorzugsweise enthält die Lösung etwa 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 mit einem Gehalt von 0,15 m NaCl. Der Faktor VIII-Komplex bleibt an das chromatographische Medium während dieses Waschverfahrens gebunden.
Der Faktor VIII-Komplex wird von der Säule, d. h. von dem Heparingekuppelten chromatographischen Medium, eluiert, indem auf die Säule eine gepufferte wäßrige Lösung gegeben wird, die ein Calcium-, ein Magnesium-, ein Strontium- oder ein anderes Salz eines zweiwertigen Metallions, wie CaCl&sub2;, MgCl&sub2;, SrCl&sub2; oder dergl., umfaßt. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Elutionsmittel um CaCl&sub2; bei einer Konzentration von etwa 0,01 m bis etwa 0,3 m. Insbesondere wird CaCl&sub2; bei einer Konzentration von etwa 0,05 m bis etwa 0,2 m verwendet, und ganz besonders wird CaCl&sub2; bei einer Konzentration von etwa 0,1 m verwendet. Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform umfaßt der Puffer Imidazol bei einer Konzentration von etwa 0,01 m bis etwa 0,05 m, und die Lösung weist einen pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5 auf. Die Säule wird mit der gepufferten CaCl&sub2;-Lösung gewaschen, bis der gesamte Faktor VIII-Komplex von der Säule gewaschen ist. Typischerweise werden etwa 2 bis etwa 4 Säulenvolumina an gepufferter CaCl&sub2;-Lösung auf die Säule aufgegeben, um den Faktor VIII-Komplex zu eluieren. Wenn die Konzentration an CaCl&sub2; weniger als etwa 0,05 m beträgt, dann wird weniger als die gewünschte Menge an Faktor VIII-Komplex aus dem Heparin-gekuppelten chromatographischen Medium eluiert. Wenn die Konzentration an CaCl&sub2; größer als etwa 0,2 m ist, dann werden unerwünschte Proteine zusammen mit dem Faktor VIII-Komplex eluiert, wobei die spezifische Aktivität des Faktor VIII-Komplexes im Endprodukt verringert wird. Außerdem können Salzkonzentrationen von mehr als 0,2 m zur Dissoziation des Faktor VIII-Komplexes führen, was zur Folge hat, daß der Faktor VIII weniger stabil ist. Vorzugsweise beträgt die Konzentration von CaCl&sub2; etwa 0,1 m, um die Menge an eluiertem Faktor VIII-Komplex zu maximieren, jedoch die Elution von unerwünschten Proteinen und die Dissoziation des Faktor VIII-Komplexes zu minimieren.
Der Faktor VIII-Komplex, der aus dem Heparin-gekuppelten chromatographischen Medium eluiert wurde, wird durch Ultrafiltration ungefähr 20fach aufkonzentriert, und die Calciumkonzentration wird auf etwa 0,002 m bis etwa 0,005 m verringert. Ein Histidin-Puffer und ein Glycin-Stabilisator werden zur ultrafiltrierten Faktor VIII-Komplex-Lösung gegeben, so daß für eine Histidinkonzentration von etwa 0,025 m und eine Glycinkonzentration von etwa 0,28 m gesorgt wird. Der pH-Wert wird unter Verwendung von etwa 1 m bis etwa 6 m HCl auf ungefähr 7,3 eingestellt. Die Lösung wird dann auf getrennte Fläschchen verteilt, wobei jedes Fläschchen die gewünschte Anzahl an Einheiten Faktor VIII:C-Aktivität enthält. Die Lösungen werden anschließend lyophilisiert, so daß getrennte Fläschchen mit gereinigtem Faktor VIII-Komplex-Konzentrat bereitgestellt werden.
Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform der Praxis der vorliegenden Erfindung wird die Faktor VIII-Komplex-Lösung aus der viralen Inaktivierungsstufe (die den Faktor VIII-Komplex enthaltende unreine Proteinfraktion) für eine absatzweise Verarbeitung direkt auf ein gewaschenes, Heparin-gekuppeltes chromatographisches Medium aufgetragen und etwa 30 bis etwa 45 min damit gemischt. Während dieser Zeit bindet der Faktor VIII-Komplex an den Heparin-Liganden auf dem chromatographischen Medium, wobei ein Überstand verbleibt, der vom Faktor VIII-Komplex verschiedene Proteine in Lösung enthält. Das chromatographische Medium wird durch Dekantieren des Überstands entfernt, und das Medium wird dann gewaschen, um ungebundene Proteine zu entfernen. Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform erfolgt das Waschen durch Resuspendieren des Heparin-gekuppelten chromatographischen Mediums mit gebundenem Faktor VIII-Komplex in etwa 5 bis 10 Volumina einer Lösung, die etwa 0,01 bis 0,05 m Puffer, wie Imidazol-Puffer, bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 mit einem Gehalt an einer Salzlösung, wie LiCl, NaCl oder KCl, bei einer Konzentration von etwa 0,1 m bis etwa 0,15 m umfaßt. Vorzugsweise umfaßt die Lösung 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl. Das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium mit dem gebundenen Faktor VIII-Komplex wird aus der Waschlösung durch Dekantieren des Überstands, d. h. der Waschlösung, entfernt. Der Faktor VIII-Komplex bleibt an das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium während des Waschverfahrens gebunden.
Der Faktor VIII-Komplex wird aus dem Heparin-gekuppelten chromatographischen Medium durch Resuspendieren des chromatographischen Mediums in etwa 2 bis etwa 4 Volumina einer gepufferten Lösung mit einem Gehalt an CaCl&sub2; als Elutionsmittel eluiert. Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform handelt es sich bei dem Elutionsmittel um CaCl&sub2; bei einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 0,3 m in einem Puffer mit einem Gehalt an Imidazol bei einer Konzentration von etwa 0,01 m bis etwa 0,05 m und einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5. Vorzugsweise wird das CaCl&sub2;-Elutionsmittel bei einer Konzentration von etwa 0,05 m bis etwa 0,2 m verwendet, und insbesondere beträgt die Konzentration an CaCl&sub2; etwa 0,1 m. Nach der Elutionsstufe wird das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium aus der CaCl&sub2;-Lösung durch Dekantieren des Überstands entfernt, der den eluierten Faktor VIII-Komplex enthält. Der den Faktor VIII-Komplex enthaltende Überstand, der aus dem Heparin-gekuppelten chromatographischen Medium eluiert wurde, wird anschließend durch Ultrafiltration ungefähr 20-fach aufkonzentriert, und die Calciumkonzentration wird auf etwa 0,002 m bis etwa 0,005 m verringert. Ein Histidin-Puffer und ein Glycin- Stabilisator werden zu der ultrafiltrierten Faktor VIII-Komplex-Lösung gegeben, so daß für eine Histidinkonzentration von etwa 0,025 m und eine Glycinkonzentration von etwa 0,28 m gesorgt wird. Der pH-Wert wird unter Verwendung von etwa 1 m bis etwa 6 m HCl auf ungefähr 7,3 eingestellt. Die Lösung wird dann auf getrennte Fläschchen aufgeteilt, wobei jedes Fläschchen eine gewünschte Anzahl Einheiten an Faktor VIII:C-Aktivität enthält. Die Lösungen werden anschließend lyophilisiert, um getrennte Fläschchen mit gereinigtem Faktor VIII-Komplex-Konzentrat bereitzustellen.

Beispiel 1

Herstellung einer unreinen Proteinfraktion, die Faktor VIII enthält

40 g Cryopräzipitat wurden in 120 ml destilliertem Wasser mit einem Gehalt an etwa 80 Einheiten Heparin pro ml Wasser gelöst. Die Heparin-Lösung wurde bei einer Temperatur von etwa 30ºC gemischt, bis sich das Cryopräzipitat vollständig gelöst hatte (ungefähr 10 Minuten), um eine Cryopräzipitat/Heparin-Lösung bereitzustellen. Nachdem sich das Cryopräzipitat gelöst hatte, wurde der pH-Wert der Cryopräzipitat/Heparin-Lösung auf etwa 7 unter Verwendung von etwa 0,1 m HCl eingestellt, und die Lösung wurde für weitere 20 bis 30 Minuten gerührt.
Eine wäßrige PEG-Lösung mit einem Gehalt an etwa 31,5 % PEG, 0,22 % Natriumcitrat-Dihydrat und 0,08 % Citronensäure-Monohydrat bei einem pH- Wert von 6,2 wurde anschließend zu der Cryopräzipitat/Heparin-Lösung gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 3,5 % PEG erhielt. Der pH- Wert der PEG/Cryopräzipitat/Heparin-Lösung wurde auf etwa 6,3 mit verdünnter Essigsäure eingestellt. Die Lösung mit eingestelltem pH-Wert wurde für ungefähr 15 Minuten bei einer Temperatur von etwa 27ºC gemischt. Die Zugabe von PEG führte zur Ausfällung von verschiedenen verunreinigenden Proteinen, während der Faktor VIII-Komplex in Lösung blieb.
Das PEG-Präzipitat wurde von der den Faktor VIII-Komplex enthaltenden Überstandslösung durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand, d. h. die den Faktor VIII-Komplex enthaltende unreine Proteinfraktion, wurde gewonnen. Der Überstand wurde anschließend behandelt, um Viren zu inaktivieren, die möglicherweise in Blutprodukten vorhanden sind, und zwar durch Zugabe einer Lösung mit einem Gehalt an etwa 0,3 % Tri-n-butylphosphat sowie etwa 1 % TWEEN-80 und Inkubation bei 25ºC für etwa 30 Minuten.
Die viral inaktivierte Überstandslösung, d. h. die viral inaktivierte, den Faktor VIII-Komplex enthaltende, unreine Proteinfraktion wurde durch Filtration geklärt und anschließend für die weitere Reinigung des Faktor VII-Komplexes durch Affinitätschromatographie an einem Heparin-gekuppelten chromatographischen Medium aufgefangen.

Beispiel 2

Herstellung eines Heparin-gekuppelten chromatographischen Mediums und Test auf die Faktor VIII-Komplex-Bindungskapazität

100 g ACTIGEL-A wurden in 1000 ml 0,1 m Phosphatpuffer bei einem pH- Wert von 6,8 gewaschen und äquilibriert. Ein Kupplungsgemisch mit einem Gehalt an 50 000 Einheiten Heparin in 0,1 m Phosphatpuffer bei einem pH- Wert von 6,8 mit 0,1 m NaCNBH&sub3; wurde zu einem gleichen Volumen an gewaschenem ACTIGEL-A gegeben, so daß man eine Endkonzentration von 250 Einheiten Heparin pro ml ACTIGEL-A erhielt, und es erfolgte eine Inkubation für 18 Stunden bei Raumtemperatur unter konstanter Rotation auf einem Labquake-Taumelmischer. Das Kupplungsgemisch wurde dann über einen Büchner-Trichter unter Verwendung eines gesinterten Glasfilters mit mittlerer Porengröße filtriert. Das Retentat, d. h. das chromatographische Heparin-gekuppelte ACTIGEL-A-Medium, wurde in mehreren Volumina einer Lösung mit einem Gehalt an 0,1 m Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,8 und 0,5 m NaCl gewaschen. Das gewaschene Heparin-gekuppelte ACTIGEL-A-Medium wurde anschließend bei 23ºC in 0,1 m Ethanolamin bei einem pH-Wert von 6,8 für 2 Stunden inkubiert, um nicht umgesetzte Aldehydgruppen zu desaktivieren. Schließlich wurde das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium über einen Büchner-Trichter unter Verwendung eines gesinterten Glasfilters mit mittlerer Porengröße abfiltriert und dann mit 1 m NaCl und anschließend mit 0,1 m Imidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl gewaschen und auf seine Fähigkeit zur Bindung von Faktor VIII-Komplex getestet.
Um die Faktor VIII-Komplex-Bindung zu testen, wurde eine unreine Proteinfraktion mit einem Gehalt an 100 Einheiten Faktor VIII:C-Aktivität in einem Faktor VIII-Komplex, die mittels eines Verfahrens, wie des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens, bereitgestellt wurde, absatzweise zu einer 5 ml umfassenden Probe des Heparin-gekuppelten chromatographischen Mediums gegeben und 30 Minuten gemischt. Der Überstand wurde dann von dem chromatographischen Medium dekantiert, und das Medium wurde gewaschen, indem es in 50 ml 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 mit einem Gehalt an 0,15 m NACl resuspendiert wurde. Nachdem das chromatographische Medium sich abgesetzt hatte, wurde die Waschlösung dekantiert. Der dekantierte Überstand und die Waschlösung wurden vereinigt, um eine Probe des ausströmenden Materials zu bilden. Nachdem alle ungebundenen Proteine von dem Medium gewaschen worden waren, wie es durch die Extinktion des ausströmenden Materials unter Verwendung eines Spektrophotometers Modell Nr.2600, das von Gilford Co., Walnut Creek, Californien, bezogen wurde, bestimmt wurde, wurde der gebundene Faktor VIII-Komplex durch Resuspendieren des Mediums in 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH- Wert von 6,8 mit einem Gehalt an 0,1 m CaCl&sub2; eluiert. Nachdem das Medium sich abgesetzt hatte, wurde der Überstand dekantiert. Dieses Verfahren wurde wiederholt, bis kein weiteres Protein mehr aus dem Medium eluiert wurde. Diese Proben wurden vereinigt, um eine Eluatprobe zu bilden. Die Proben des Eluats und des ausströmenden Materials wurden auf die Faktor VIII :C-Blutgerinnungsaktivität unter Verwendung einer Gerinnungsvorrichtung untersucht, die von General Diagnostics, Durham, North Carolina, unter der Warenbezeichnung "COAG-A-MATE XC" bezogen wurde. Es wurde festgestellt, daß die Faktor VIII:C-Aktivität im ausströmenden Material, d. h. der Faktor VIII:C, der nicht an das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium gebunden wurde, 45 Einheiten betrug. Es wurde festgestellt, daß die Faktor VIII:C-Aktivität in der Eluatprobe, d. h. der Faktor VIII:C, der an das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium gebunden und anschließend eluiert wurde, 20 Einheiten betrug.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 100 000 Einheiten an Heparin zugegeben wurden, um ein Heparin-gekuppeltes chromatographisches Medium mit einer Endkonzentration von 500 Einheiten Heparin pro ml ACTIGEL-A bereitzustellen. Es wurde festgestellt, daß die Faktor VIII:C-Aktivität in den Proben des ausströmenden Materials und des Eluats 16 Einheiten bzw. 48 Einheiten betrug.

Beispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 200 000 Einheiten an Heparin zugegeben wurden, um ein Heparin-gekuppeltes chromatographisches Medium mit einer Endkonzentration von 1000 Einheiten Heparin pro ml ACTIGEL-A bereitzustellen. Es wurde festgestellt, daß die Faktor VIII:C-Aktivität in den Proben des ausströmenden Materials und des Eluats 6 Einheiten bzw. 78 Einheiten betrug.

Beispiel 5

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 400 000 Einheiten an Heparin zugegeben wurden, um ein Heparin-gekuppeltes chromatographisches Medium mit einer Endkonzentration von 2000 Einheiten Heparin pro ml ACTIGEL-A bereitzustellen. Es wurde festgestellt, daß die Faktor VIII:C-Aktivität in den Proben des ausströmenden Materials und des Eluats 3 Einheiten bzw. 65 Einheiten betrug.
Tabelle 1 gibt die Ergebnisse der Beispiele 2 bis 5 wieder. Tabelle 1 Beispiel Einheiten an Heparin pro ml ACTIGEL-A Faktor VIII:C-Aktivität im Eluat Faktor VIII-C-Aktivität im ausströmenden material
Wie in den Beispielen 2 bis 5 gezeigt wird, wurde, wenn eine unreine Proteinlösung mit einem Gehalt an 100 Einheiten Faktor VIII:C auf 5 ml des chromatographischen Heparin-gekuppelten ACTIGEL-A-Mediums aufgetragen wurde, die optimale Bindung des Faktor VII-Komplexes erzielt, wenn das aktivierte Harz 1000 Einheiten an Heparin pro ml Harz enthielt.

Beispiel 6

Reinigung des Faktor VIII-Komplexes durch Heparin-Affinitätschromatographie

5 ml an chromatographischem Heparin-gekuppeltem ACTIGEL-A-Medium, das gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 hergestellt worden war, wurden in eine Säule gepackt, die mit 50 ml 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH- Wert von 6,8 mit 0,15 m NaCl gewaschen wurde. Eine unreine Proteinfraktion, die gemäß einem Verfahren hergestellt wurde, wie dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, und insgesamt 18 Einheiten an Faktor VIII: C-Aktivität enthielt, wurde auf die Säule, d. h. das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium, das in die Säule gepackt war, aufgetragen, und die Durchflußgeschwindigkeit der Säule wurde bei 0,35 ml pro min gehalten. Das aus der Säule ausströmende Material wurde gesammelt, und die Säule wurde mit 50 ml 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl gewaschen. Die Elution des Faktor VIII-Komplexes wurde mit 15 ml 0,1 m CaCl&sub2; in 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 durchgeführt. Alle Proben des ausströmenden Materials und des Eluats wurden auf die Faktor VIII:C-Blutgerinnungsaktivität mit Hilfe einer COAG-A-MATE XC-Gerinnungsvorrichtung untersucht.
Von den 18 Einheiten an Faktor VIII:C-Aktivität, die auf die Säule aufgetragen wurden, wurden 15,9 Einheiten mit 0,1 m CaCl&sub2; eluiert. Der gewonnene Faktor VIII:C wies eine spezifische Aktivität von 57,7 Einheiten/mg auf. In diesem Beispiel und in den Beispielen 7, 8 und 9 bezieht sich "%" auf den Anteil an Faktor VIII:C-Aktivität, der in der Probe gewonnen wurde, im Vergleich zur gesamten Faktor VIII:C-Aktivität, die an das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium gebunden wurde.

Beispiel 7

Das Verfahren von Beispiel 6 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine unreine Proteinfraktion mit einem Gehalt an insgesamt 19,8 Einheiten Faktor VIII:C-Aktivität auf eine 5 ml fassende Heparin-Affinitätschromatographiesäule aufgetragen wurde. Von den 19,8 Einheiten an Faktor VIII:C-Aktivität, die auf die Säule aufgetragen wurden, wurden 12,8 Einheiten mit 0,1 m CaCl&sub2; eluiert. Der gewonnene Faktor VIII-Komplex wies eine spezifische Aktivität von 49,2 Einheiten Faktor VIII:C/mg auf.
Tabelle 2 gibt die Ergebnisse der Beispiele 6 und 7 wieder. Tabelle 2 Faktor VIII:C-Aktivität Beispiel 6 Beispiel 7 Aufgegeben auf die Säule (Einheiten) Eluat (Einheiten) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg)

Beispiel 8

Das Verfahren von Beispiel 6 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine Säule, die 50 ml Heparin-gekuppeltes chromatographisches ACTIGEL-A- Medium, das gemäß Beispiel 4 hergestellt wurde, enthielt, verwendet wurde. Eine unreine Proteinfraktion, die nach einem Verfahren, wie dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, hergestellt worden war und insgesamt 1004 Einheiten an Faktor VIII:C-Aktivität enthielt, wurde auf die Säule aufgegeben, und die Durchflußgeschwindigkeit der Säule wurde bei 2 ml pro min gehalten. Von den 1004 Einheiten an Faktor VIII:C-Aktivität, die auf die Säule aufgegeben wurden, wurden 398 Einheiten mit 0,1 m CaCl&sub2; eluiert. Der gewonnene Faktor VIII-Komplex wies eine spezifische Aktivität von 66 Einheiten Faktor VIII:C-Aktivität/mg auf.

Beispiel 9

Das Verfahren von Beispiel 8 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine unreine Proteinfraktion mit einem Gehalt an 390 Einheiten an Faktor VIII:C-Aktivität auf die Heparin-gekuppelte Chromatographiesäule aufgegeben wurde.
Von den 390 Einheiten an Faktor VIII:C-Aktivität, die auf die Säule aufgegeben wurden, wurden 315 Einheiten mit 0,1 m CaCl&sub2; eluiert. Der gewonnene Faktor VIII-Komplex wies eine spezifische Aktivität von 50 Einheiten Faktor VIII:C-Aktivität/mg auf.
Tabelle 3 gibt die Ergebnisse der Beispiele 8 und 9 wieder. Tabelle 3 Faktor VIII:C-Aktivität Beispiel 8 Beispiel 9 Aufgegeben auf die Säule (Einheiten) Eluat (Einheiten) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg)
Wie in den Beispielen 6 bis 9 gezeigt wurde, betrug die mittlere spezifische Aktivität des eluierten Faktor VIII-Komplexes 55,73 Einheiten Faktor VIII:C-Aktivität/mg.

Beispiel 10

Vergleich der Affinitätselution mit der ionischen Elution

5 ml an chromatographischem Heparin-gekuppeltem ACTIGEL-A-Medium, das gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 hergestellt wurde und 1000 Einheiten an gebundenem Heparin pro ml ACTIGEL-A aufwies, wurden in eine Säule gepackt und mit 50 ml 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 mit 0,15 m NaCl gewaschen. In zahlreichen Experimenten, die in diesem Beispiel kombiniert wurden, wurden unreine Proteinfraktionen, die nach einem Verfahren, wie dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, hergestellt worden waren und die 15 bis 42 Einheiten an Faktor VIII: C-Aktivität enthielten, getrennt auf die Säule aufgegeben. Die Durchflußgeschwindigkeit der Säule wurde bei 0,4 ml/min gehalten. Für jeden einzelnen "Säulenansatz" wurde das aus der Säule ausströmende Material gesammelt, und die Säule wurde gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine aus dem Heparin-gekuppelten chromatographischen Medium mit 50 ml 0,02 m Imidazol- Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl eluiert worden waren. Der Faktor VIII-Komplex wurde anschließend mit 15 ml 0,1 m CaCl&sub2; in 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 eluiert. Die Proben des ausströmenden Materials und des Eluats wurden auf Faktor VIII:C-Aktivität mit Hilfe der COAG-A-MATE XC-Gerinnungsvorrichtung untersucht. Die spezifische Aktivität des bei diesen Experimenten gewonnenen Faktor VIII-Komplexes lag im Bereich von 30 bis 60 Einheiten Faktor VIII:C-Aktivität/mg.

Beispiel 11

Das Verfahren von Beispiel 10 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Elution des Faktor VIII-Komplexes mit 0,5 m NaCl anstelle von 0,1 m CaCl&sub2; durchgeführt wurde. Die spezifische Aktivität des bei diesen Experimenten gewonnenen Faktor VIII-Komplexes lag im Bereich von 5 bis 10 Einheiten Faktor VIII:C-Aktivität/mg.
Tabelle 4 gibt die Daten wieder, die in zahlreichen Experimenten gesammelt wurden, und spiegelt die Ergebnisse der Beispiele 10 und 11 wider. Tabelle 4 Faktor VIII:C-Aktivität Beispiel 10 Beispiel 11 Aufgegeben auf die Säule (Einheiten) Eluat-Faktor VIII:C-Aktivität (Einheiten/ml) Eluat-Proteingehalt (mg/ml) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg) bis
Wie in den Beispielen 10 und 11 gezeigt wurde, ist die spezifische Aktivität an Faktor VIII:C, die durch Affinitätselution mit 0,1 m CaCl&sub2; gewonnen wird, höher als die, die durch ionische Elution mit 0,5 m NaCl gewonnen wird, und zwar aufgrund der Elution von zusätzlichem verunreinigendem oder inaktivem Protein mit 0,5 m NaCl.

Beispiel 12

Optimierung der [lution von Faktor VIII-Komplex aus dem Heparingekuppelten chromatographischen Medium mit CaCl&sub2;

5 ml des Heparin-gekuppelten chromatographischen Mediums, das 1000 Einheiten an gebundenem Heparin pro ml ACTIGEL-A aufwies und gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 bereitgestellt wurde, wurden in eine Säule gepackt und mit 50 ml einer Lösung mit einem Gehalt von 0,02 m Imidazol bei einem pH-Wert von 6,8 und 0,15 m NaCl gewaschen. Eine unreine Proteinfraktion, die Faktor VIII:C in einem Faktor VIII-Komplex enthielt und nach einem Verfahren, wie dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, bereitgestellt wurde, mit insgesamt 62,4 Einheiten an Faktor VIII: C-Aktivität wurde auf eine Säule aufgetragen, die das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium enthielt. Das aus der Säule ausströmende Material wurde gesammelt, und das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium wurde mit 50 ml an 0,02 m Imidazolpuffer bei einem pH-Wert von 6,8 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl gewaschen. Das ausströmende Material und die Waschlösung, d. h. das aus der Säule ausströmende Material, wurden vereinigt. Der Faktor VIII-Komplex wurde anschließend mit 10 ml an 0,05 m CaCl&sub2; in 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 eluiert. Die Proben des aus der Säule ausströmenden Materials und des Eluats wurden auf Faktor VIII:C-Blutgerinnungsaktivität mit Hilfe einer COAG-A-MATE XC- Gerinnungsvorrichtung untersucht. Es wurde festgestellt, daß die Faktor VIII-C-Aktivität in den Proben des ausströmenden Materials und des Eluats 18,9 Einheiten bzw. 26,2 Einheiten betrug. Die spezifische Aktivität des eluierten Faktor VIII-Komplexes betrug 50,4 Einheiten an Faktor VIII:C- Aktivität/mg.

Beispiel 13

Das Verfahren von Beispiel 12 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Elution der Faktor VIII-Komplex-Aktivität unter Verwendung einer Lösung mit einer CaCl&sub2;-Konzentration von 0,1 m durchgeführt wurde. Die Faktor VIII:C-Aktivität in den Proben des aus der Säule ausströmenden Materials und des Eluats betrug 14,1 Einheiten bzw. 36,8 Einheiten. Die spezifische Aktivität des eluierten Faktor VIII:C betrug 34,5 Einheiten/mg.

Beispiel 14

Das Verfahren von Beispiel 12 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Elution der Faktor VIII-Komplex-Aktivität unter Verwendung einer Lösung mit einer CaCl&sub2;-Konzentration von 0,2 m durchgeführt wurde. Die Faktor VIII:C-Aktivität in den Proben des aus der Säule ausströmenden Materials und des Eluats betrug 19,4 Einheiten bzw. 36,3 Einheiten. Die spezifische Aktivität des eluierten Faktor VIII:C betrug 30,6 Einheiten/mg.
Wie in den Beispielen 12 bis 14 gezeigt wurde, ist die Anzahl der Einheiten an Faktor VIII:C-Aktivität im Eluat geringer, wenn die Elutionslösung 0,05 m CaCl&sub2; enthält, als wenn die CaCl&sub2;-Konzentration hoch ist, wie 0,1 m oder 0,2 m. Die spezifische Aktivität des Faktor VIII:C im eluierten Faktor VIII-Komplex ist geringer, wenn die Elutionslösung 0,2 m CaCl&sub2; enthält, als wenn die CaCl&sub2;-Konzentration geringer ist, wie 0,1 m oder 0,05 m.

Beispiel 15

Eigenschaften des Faktor VII-Komplexes, der durch Heparin-Affinitätschromatographie gereinigt wurde

50 ml chromatographisches Heparin-gekuppeltes ACTIGEL-A-Medium, das gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 hergestellt wurde, wurden in eine Säule gepackt und mit 500 ml 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 mit 0,15 m NaCl gewaschen. Eine unreine Proteinfraktion, die nach einem Verfahren, wie dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, hergestellt wurde, mit insgesamt 390 Einheiten Faktor VIII:C-Aktivität wurde auf die Säule, d. h. das in die Säule gepackte Heparin-gekuppelte chromatographische Medium, aufgetragen, und die Durchflußgeschwindigkeit der Säule wurde bei 2 ml pro min gehalten. Das aus der Säule ausströmende Material wurde gesammelt, und die Säule wurde mit 500 ml 0,02 m Imidazol- Puffer bei einem pH-Wert von 6,8 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl gewaschen. Die Elution des Faktor VIII-Komplexes erfolgte mit 100 ml 0,1 m CaCl&sub2; in 0,02 m Imidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 6,8.
Der aus dem Heparin-gekuppelten chromatographischen Medium eluierte Faktor VIII-Komplex wurde durch Ultrafiltration etwa 20-fach aufkonzentriert, und die Calciumkonzentration wurde auf etwa 0,002 m bis etwa 0,005 m verringert. Ein Histidin-Puffer und ein Glycin-Stabilisator wurden zu der ultrafiltrierten Faktor VIII-Komplex-Lösung gegeben, so daß für eine Histidinkonzentration von etwa 0,025 m und eine Glycinkonzentration von etwa 0,28 m gesorgt wurde. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von etwa 1 m bis etwa 6 m HCl auf ungefähr 7,3 eingestellt. Die Lösung wurde dann auf getrennte Fläschchen verteilt, wobei jedes Fläschchen eine gewünschte Anzahl an Einheiten an Faktor VIII:C-Aktivität enthielt. Die getrennten Fläschchen wurden anschließend bei -70ºC eingefroren und lyophilisiert.
Das Faktor VIII-Komplex-Konzentrat wurde durch Zugabe von 10 ml Wasser und Mischen für eine Minute rekonstituiert. Der rekonstituierte Faktor VIII-Komplex wurde anschließend auf die Faktor VIII: C-Blutgerinnungsaktivität mit Hilfe einer COAG-A-MATE XC-Gerinnungsvorrichtung und auf die Faktor VIII:R-Aktivität unter Verwendung eines Ristocetin-Cofaktor Assay-Reagenzsatzes, der unter der Warenbezeichnung HELENA von Helena Laboratories, Beaumont, Texas, vertrieben wird, untersucht. Eine Einheit an Faktor VIII:R-Aktivität ist als die Menge an Faktor VIII:R in 1 ml Plasma definiert.
Ein Fläschchen an rekonstituiertem Faktor VIII-Komplex enthielt 42 Einheiten/ml Faktor VIII:C-Aktivität und 64 Einheiten/ml Faktor VIII:R- Aktivität. Die spezifische Aktivität an Faktor VIII:C betrug 35 Einheiten/mg, und die an Faktor VIII:R betrug 53 Einheiten/mg. Die Proteinkonzentration des rekonstituierten Faktor VIII-Komplexes betrug 1,2 mg/ml.
Die vorstehende Beschreibung beispielhafter Ausführungsformen der Verfahren zur Herstellung von Faktor VIII-Komplex-Konzentraten dient nur der Erläuterung. Aufgrund von Variationen, die für den Fachmann offensichtlich sind, soll die vorliegende Erfindung nicht auf die speziellen Ausführungsformen, die vorstehend beschrieben wurden, beschränkt sein. Der Schutzumfang der Erfindung wird durch die nachstehenden Ansprüche definiert.

Claims

1. Verfahren zur Abtrennung des Faktor VIII-Komplexes aus einer unreinen Proteinfraktion, die den Faktor VIII-Komplex enthält, umfassend:

Bereitstellung einer wäßrigen Lösung der unreinen Proteinfraktion, die den Faktor VIII-Komplex enthält;

Auftragen der unreinen Proteinfraktionslösung auf ein Heparin-gekuppeltes chromatographisches Medium zur Bindung des Faktor VIII-Komplexes an den Heparin-Liganden des chromatographischen Mediums, dadurch gekennzeichnet, daß:

der Faktor VIII-Komplex aus dem chromatographischen Medium unter Verwendung einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an CaCl&sub2; als Elutionsmittel eluiert und der Faktor VIII-Komplex aus dem Eluat gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das CaCl&sub2; in der Lösung in einer Konzentration von etwa 0,01 m bis etwa 0,3 m vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das CaCl&sub2; in der Lösung in einer Konzentration von etwa 0,05 m bis etwa 0,2 m vorliegt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration an CaCl&sub2; größer als etwa 0,05 m ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Konzentration an CaCl&sub2; etwa 0,1 m beträgt.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die wäßrige CaCl&sub2;-Lösung einen pH-Wert von etwa 6,5 bis 7,5 hat und einen Imidazol-Puffer mit einer Konzentration von etwa 0,01 m bis etwa 0,05 m umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der pH-Wert bei etwa 6,8 gehalten wird und der Imidazol-Puffer eine Konzentration von etwa 0,02 m aufweist.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die unreine Proteinfraktion, die den Faktor VIII-Komplex enthält, aus Cryopräzipitat stammt.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die unreine Proteinfraktion auf das Heparin-gekuppelte chromatographische Medium in einem absatzweisen Verfahren aufgetragen wird.