DE69930653T2

DE69930653T2 - Reinigung von fibrinogen aus milch durch den einsatz von kationenaustauschchromatographie

Info

Publication number: DE69930653T2
Application number: DE69930653T
Authority: DE
Inventors: Graham Mccreath
Original assignee: Pharming Intellectual Property BV
Current assignee: Pharming Intellectual Property BV
Priority date: 1998-09-24
Filing date: 1999-09-24
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2019-09-25
Also published as: PT1115742E; DE69930653D1; US6740736B2; WO2000017234A1; EP1115742B1; ES2262340T3; WO2000017234A8; US20020025932A1; AU6104999A; ATE321775T1; DK1115742T3; EP1115742A1

Description

Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen die Proteinreinigung und im Speziellen die Reinigung von Fibrinogen aus Milch von transgenen Tieren unter Verwendung der Kationenaustauschchromatographie.
Fibrinogen, das Hauptstrukturprotein im Blut, welches für die Bildung von Gerinnseln verantwortlich ist, besteht als Dimer von drei Polypeptidketten; die Aα (66,5 kD), Bβ (52 kD) und γ (46,5 kD) sind durch 29 Disulfidbindungen miteinander verbunden. Der Zusatz von Asparagin-verbundenen Kohlenhydraten zu den Bβ und γ-Ketten resultiert in einem Molekül mit einem Molekulargewicht von 340 kD. Fibrinogen weist eine dreiknotige Struktur auf, einem als E-Domäne bezeichneten zentralen Knötchen, welches die Amino-Termini aller 6 Ketten, einschließlich des Fibrinopeptids (FP) besitzt, während die zwei als D-Domänen bezeichneten distalen Knötchen die Carboxy-Termini der Aα, Bβ und γ-Ketten enthalten. Fibrinogen wird an dem Amino-Terminus der Aα und Bβ-Ketten proteolytisch gespalten, wodurch Fibrinopeptide A und B (FpA & FpB) freigesetzt werden und durch Thrombin, einer Serinprotease, die aus ihrer inaktiven Form durch Faktor Xa umgewandelt wird, ins Fibrin-Monomer umgewandelt. Die resultierenden Fibrin-Monomere lagern sich nicht-kovalent zu Protofibrillen durch DE Kontakte an benachbarten Fibrin-Molekülen zusammen. Dies zwingt einen halb-versetzten überlappenden Fibrinpolymerketten-Bildungsmodus auf. Kontakte werden ebenfalls der Länge nach zwischen benachbarten D-Domänen (DD Kontakte) aufgebaut, was zu einer lateralen Aggregation führt. Eine andere Serinprotease, Faktor VIII, wird proteolytisch durch Thrombin in der Gegenwart von Ca²⁺ in die aktive Form gespalten. Dieser aktivierte Faktor XIII (Faktor XIIIa) katalysiert die Vernetzung von polymerisiertem Fibrin durch Ausbilden von Isopeptid-Bindungen zwischen Lysin und Glutamin-Seitenketten. Die ersten Glutamyl-Lysyl-Bindungen, die gebildet werden, treten am C-terminalen Ende der γ-Ketten auf, wodurch D-D-Vernetzungen entstehen. Im Anschluss bilden sich mehrere Vernetzung zwischen benachbarten Aα-Ketten aus, wobei der Vernetzungsprozess dem Gerinnsel sowohl biologische Stabilität (Resistenz gegenüber Fibrinolyse) als auch mechanische Stabilität verleiht [Siebenlist and Mosesson, Progressive Cross-Linking of Fibrin γ chains Increases Resistance to Fibrinolysis, Journal of Biological Chemistry, 269:28414–2841, 1994].
Der Koagluationsprozess kann leicht zu einem selbsterhaltenden adhäsiven System konstruiert werden, indem es das Fibrinogen und Faktor XIII als eine Komponente und Thrombin und Ca²⁺ als die zweite Komponente, die den Polymerisierungsprozess katalysiert, aufweist. Diese adhäsiven Systeme, die im Fachgebiet als „Fibrin-Dichtstoff oder „Fibrin-Gewebe-Klebstoff bekannt sind, haben viele Anwendungen in chirurgischen Prozeduren und als Abgabevorrichtungen für eine Vielzahl von pharmazeutisch aktiven Verbindungen gefunden [Sierra, Fibrin Sealent Adhesive Systems: A Review of Their Chemistry, Material Properties and Clinical Applications, Journal of Biomaterials Applications, 7:309–352, 1993; Martinowitz and Spotnitz, Fibrin Tissue Adhesives, Thrombosis and Haemostasis, 78:661–666, 1997; Radosevich et al., Fibrin Sealent: Scientific Rationale, Production Methods, Properties and Current Clinical Use, Vox Sanguinis, 72:133–143, 1997].
Es ist geschätzt worden, dass der jährliche klinische Bedarf in den Vereinigten Staaten an Fibrin-Dichtstoffen jene 300 kg/Jahr, die mittels derzeitigen, von Plasmafraktionierern verwendeten, Cryopräziptiationsverfahren geerntet werden können, bei weitem übersteigt. Alternative Quellen für Fibrinogen, bei weitem die Hauptkomponente in Fibrin-Dichstoffen, sind deshalb erforscht worden, wobei rekombinante Quellen favorisiert werden [Butler et al, Current Progress in the Production of Recombinant Human Fibrinogen in the Milk of Transgenic Animals, Thrombosis and Haemostasis, 78:537–542, 1997]. Während Zellkultursysteme die Fähigkeit bewiesen haben kleine Mengen (1–4 μg/ml) an Fibrinogen zu produzieren, ist gezeigt worden, dass Säugetiere in der Lage sind, transgenes humanes Fibrinogen bis zu Konzentrationen von 5,0 g/L in ihrer Milch zu erzeugen, wodurch dieses ein kommerziell brauchbares Verfahren für das Herstellen von humanem Fibrinogen wird [Prunkard et al., Highlevel expression of recombinant human Fibrinogen in the milk of transgenic mice, Nature Biotechnology, 14:867–881, 1996; Cottingham et al., Human fibrinogen from the milk of transgenic sheep. In: Tissue Sealants: Current Practice, Future Uses. Cambridge Institute, Newton Upper Falls, MA, March 30-April 2, 1996, (abstract)].
Es sind Unterschiede zwischen rekombinantem humanen Fibrinogen und Fibrinogen, welches aus menschlichem Plasma gereinigt wurde, festgestellt worden. Aus menschlichem Plasma gereinigtes Fibrinogen weist zwei alternativ gespleißte γ-Ketten (γ und γ') auf. Im Gegensatz dazu, weist das rekombinante humane Fibrinogen nur die Hauptform γ auf. Weiters ist die Glycosylierung der Beta- und Gamma-Ketten (es gibt keine N-gebundene Glycosylierung der Alpha-Kette) des rekombinanten humanen Fibrinogens zu jener auf Plasma-abgeleitetem Fibrinogen etwas unterschiedlich, ist aber zu der Glycosylierung, wie sie auf anderen Proteinen gefunden wird, in der Milch von transgenen Tieren exprimierten werden, ähnlich. Zusätzlich ist die Ser3 der Alpha-Kette des rekombinanten humanen Fibrinogens etwas höher phosphoryliert als die Alpha-Kette von Plasma-abgeleitetem Fibrinogen, obwohl der Unterschied in der Phosphorylierung zu keinem funktionellen Unterschied führt. Weiters gibt es nachweisbare Unterschiede in der Heterogenität, die durch die C-terminale Proteolysis von einer Vielzahl von äußerst Protease-sensitiven Stellen auf der Alpha-Kette verursacht werden. Unterschiede einer ähnlichen Größenordnung werden ebenfalls zwischen Plama-abgeleiteten Fibrinogen aus unterschiedlichen Quellen beobachtet.
Eine andere treibende Kraft für die Entwicklung von vollständig auf rekombinantem Fibrin basierenden Dichtstoffen, kommt von der Tatsache, dass kommerziell erhältliche Klebstoffe von zusammengemischtem („pooled") Plasma stammt. Da von Blut stammende Produkte mit der Übertragung von Humanen Immundefizienz-Virus (HIV), Hepatis-Virus, und anderen äthiologischen Agenzein in Verbindung gebracht wurden, ist die Akzeptanz und die Verfügbarkeit solcher Klebstoffe beschränkt. Während die Einbindung von viralen Entfernungs- und Inaktivierungsprozeduren die Sicherheit dieser Produkte erhöht hatte (zum Beispiel, US Patent Nrn.: 4.960.757 und 5.116.950), ist von Plasma-stammendes Fibrinogen nach wie vor nicht risikolos. Die Verwendung von autologem Plasma reduziert das Risiko der Krankheitsübertragung, jedoch können autologe Klebstoffe nur in ausgewählten Operationen, bei denen der Patient in der Lage ist, Blut vor der Operation zu spenden, verwendet werden.
Während die Hauptverwendung von Fibrinogen für die Herstellung von Kleb- oder Dichtstoffen gedacht ist, weist Fibrinogen andere Anwendungen auf dem medizinischen Gebiet auf, zum Beispiel für das Beschichten von polymeren Gegenständen, wie in US Patent Nr. 5,272,074 offenbart ist, und die Sorge, um die Sicherheit betrifft alle diese anderen medizinischen Anwendungen.
Verschiedene Verfahren für die Reinigung von Fibrinogen sind beschrieben worden, wobei in den meisten Fällen, das Ausgangsmaterial entweder Plasma oder üblicherweise Cryopräzipitat oder Cohn Fraktion 1 war, wobei beide von diesen reich an Fibrinogen sind. Schwartz et al., [US Patente 4.362.567; 4.377.572; 4.414.976] haben ein Verfahren für die Herstellung eines Fibrinogen-Gewebe-Klebstoffes mittels der Cryopräzipitation von Plasma als Hauptreinigungsschritt offenbart. Burnouf et al., (1990) [Biochemical and Physical Properties of a Solvent-Detergent-Treated Fibrin Glue, Vox Sang 58:77–84] beschreibt ein Verfahren für die Herstellung eines Fibrinogenkonzentrates aus 1501 humanem Plasma. Nach dem Auftauen von antikoaguliertem Plasma bei 37°C, wurde das Plasma einer 10% Ethanolfällung unterzogen.
Nach der Auflösung des ausgefällten Fbrinogens wurde ein Lösungsmittel-Detergenz virales Inaktivierungsverfahren verwendet, gefolgt von zwei weiteren Ethanolfällungsprozeduren, um die Lösungsmittel-Detergenz-Chemikalien zu entfernen. Das endgültige Material wird in Bezug auf den Protein-Inhalt als 93,5% rein angegben und wird unter dem Markenamen Biocoll^© verkauft.
Vila et a., (1985) [A Rapid Method for Isolation of Fibrinogen From Human Plasma by Precipitation with PEG 6000, Thrombosis Research 39:651–656] beschreibt ein Verfahren, wobei Fibrinogen aus mit Zitrat versetztem Plasma unter Verwendung einer 8% PEG 6000-Lösung ausgefällt wurde. Nach der Auflösung wurde das Fibrinogen weiters mit Hilfe eines 2 mol/l Essigsäure-Acetat-Puffers pH 4,6 ausgefällt. Eine endgültige Ausfällung mit Ammoniumsulfat wird verwendet, um ein Produkt mit 93 ± 6+% gerinnungsfähigem Protein und mit einer Ausbeute von 60 ± 9% Ausbeute zu erhalten. Unter Verwendung ähnlicher Techniken haben Masri et al., (1983) [Isolation of Human Fibrinogen of High Purity and in High Yield using PEG 1000, Thrombosis and Haemostasis, 49:116–119] ebenfalls Fibrinogen aus Thrombinfreiem Plasma mittels einer PEG 1000-Ausfällung gereinigt. Eine dreistufige Ausfällungstechnik wurde verwendet, um ein Produkt mit 98% gerinnungsfähigem Protein mit einer Ausbeute von 65–70% Ausbeute zu erhalten.
Es ist aus der Literatur erwiesen, dass die Reinigung von Fibrinogen aus Plasma im Allgemeinen mit Hilfe von Präzipitationstechniken durchgeführt wird. In vielen Beispielen führt dies zu relativ reinem Produkt, es ist jedoch zweifelhaft, dass ein Verfahren, welches nur auf einer Ausfällung basiert, für die Reinigung von humanem Fibrinogen aus Milch verwendet werden könnte. Fibrinogen weist eine Neigung für das Binden von anderen Plasmaproteinen auf, einschließlich, jedoch nicht exklusiv, Plasminogen, tPA, Faktor XIII und Fibronektin, welche während der Präzipitationstechniken oft mitgereinigt werden. Zahlenangaben von einigen dieser Proteine werden oft in den Herstellerspezifikationen angegeben. Diese Verunreinigung kann im von humanem Plasma-stammenden Fibrinogen toleriert werden, welches für das Verwenden in Menschen bestimmt ist, da die verunreinigenden humanen Proteine in Menschen wahrscheinlich nicht antigen sein würden. Es ist jedoch nicht akzeptabel, dass hohe Konzentrationen dieser Proteinen inhumanem Fibrinogen-Produkt, welches aus nicht-humaner tierischer Milch hergestellt wurde, vorhanden ist, da von diesen Proteinen, aus der Milch einer unterschiedlichen Spezies, erwartet werden würde, dass sie in Menschen artigen sein würden. Infolgedessen wird erwartet, dass jedes Reinigungsschema aus Milch mehrere Chromatographie-Techniken beinhalten würde.
Die Reinigung von Fibrinogen aus humanem Plasma unter Verwendung der Säulenchromatographie wurde durch Dempfle und Keen (1987) [Purification of Human Plasma Fibrinogen by Chromatography On Protamine-Agarose, Thrombosis and Haemostasis, 46:19–27] beschrieben. Fibrinogen wurde in einem Einzelschritt-Vorgang mit einer Ausbeute von 65–80% und einer Gerinnbarkeit von > 90% gewonnen. Die Verwendung von Protamin-Agarose ist im Fachgebiet bekannt und wurde in großen Umfang für die Reinigung von Fibrinogen in kleinem Maßstab aus Plasma und aus rekombinanten Quellen, einschließlich Säugetier-Zellkultur [Lord et al., Purification and characterization of recombinant human fibrinogen, Blood Coagulation and Fibrinolysis 4:55–59, 1993] und Hefe [Roy et al., Secretion of Biologically Active Recombinant Fibrinogen by Yeast, Journal of Biological Chemistry, 270:23761–23767, 1995] verwendet. Obwohl diese Technik sehr spezifisch ist, machen die Kosten der Chromatographie-Medien und die erwartete Labilität des biologischen Liganden es für einen kommerziellen Großmaßstab nicht brauchbar. Andere Beispiele von sehr spezifischen chromatographischen Schritten sind in der Literatur verfügbar, einschließlich der Verwendung von Peptidliganden [Kuyas et al., Isolation of Human Fibrinogen and ist Derivatives by Affinity Chromatography on GlyProArgProLys-Fractogel, Thrombosis and Haemostasis, 63:439–444, 1990] und sogar die Verwendung von monoklonalen Antikörper enthaltenden Säulen [Takebe et al., Calcium Ion Dependent Monoclonal Antibody Against Human Fibrinogen: Preparation, Characterization and Application to Fibrinogen Purification, Thrombosis and Haemostasis, 73:662–667, 1995]. Jedoch bleibt, wie oben beschrieben, die Verwendung von solchen teuren und empfindlichen chromatographischen Materialien in einem industriell-möglichen Maßstab unerschwinglich teuer.
Als eine Alternative zu der Verwendung von biologischen Liganden, wurde die Anionenaustauschchromatographie während der Reinigung von Fibrinogen aus Plasma benutzt, obwohl dies in den meisten Fällen in einem analytischen Maßstab durchgeführt wurde, wo ihre Inkorporation das Subfraktionieren von Fibrinogen-Spezies ist [Kuyas et al., A Subfraction of Human Fibrinogen With High Sialic Acid Content and Elongated γ-Chains, Journal of Biological Chemistry, 257:1107–1109, 1982]. Eine Anionenaustausch-Reinigungstechnik für Fibrinogen wurde von Bernard et al. ( EP 0 555 135 A1 ) offenbart, in welcher Fibrinogen aus behandeltem Cryopräzipitat in 120 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,8 gebunden und mit 200 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,8 eluiert wurde. Dieses Verfahren führte zu einer höheren Selektivität in Bezug auf das eluierte Fibrinogen.
Beim Entwickeln eines Reinigungsverfahrens von transgener Milch ist es im Allgemeinen akzeptiert, dass das Entfernen von Kasein von hoher Priorität ist (Wilkins & Velander, „Isolation of Recombinant Proteins from Milk", Journal of Cellular Biochemistry 49:333–338 [1992]). Kasein ist eine Mischung aus größtenteils nicht-löslichen Proteinen, die als mizellare Suspension vorhanden sind (der Rest der Proteine in Milch werden Molkeproteine genannt). Kaseinmicellen sind nicht filtrierbar und blockieren leicht die Verfahrensausrüstung. Diese Eigenschaft verhindert, dass Milk vor der Kaseinentfernung oder Solubilisierung. mittels herkömmlichen Chromatographie-Säulen bearbeitet wird. Dies hat die neueste Entwicklung von Techniken für die Kaseinentfernung oder Solubilisierung angeregt. Zum Beispiel hat Denman [„Isolation of Components of Interest from Milk", PCT WO 94/19935] ein Verfahren zum Solubilisieren von Kaseinmicellen durch den Zusatz von positiv-geladenen Mitteln offenbart. Dies führt dazu, dass Milch für die Verarbeitung zugänglicher gemacht wird. Diese Technik entfernt jedoch das Kasein nicht, und die verwendeten Mittel sind für die großtechnische Verarbeitung unerschwinglich teuer. Kutzko et al., [„Purification of Biologically Active Peptides From Milk", PCT WO 97/42835] offenbarte ein Verfahren für die Trennung einer löslichen Milchkomponente aus Milch mittels tangentialer Flussfiltration. Diese Technik schließt das Hinzufügen eines Chelatbildners zu der Milch ein, um das Kasein vor dem Auftragen auf eine Ultrafiltrationsapparatur aufzulösen, wobei die Komponente von Interessse im Permeat gesammelt wird und das gelöste Kasein im Retentat zurückbleibt. Diese Technik war ebenfalls für Milch nützlich, in welcher die Kaseinfraktion nicht gelöst wurde. Es wird jedoch erwartet, dass diese Technik für Peptide und kleine Proteine geeigneter ist. Obwohl diese Technik für das Bereitstellen einer Kasein-freien Lösung nützlich ist, bietet sie keine signifikante Reinigung des transgenen Proteins, außer sie ist mit einer anderen Einheitsoperation, zum Beispiel, Chromatographie verbunden. Es ist daher offensichtlich, dass während Milch dem Verarbeiten mittels der oben beschriebenen Techniken zugänglicher gemacht werden kann, ein Verfahren, welches die gleichzeitige Kasein-Entfernung und Fibrinogen-Reinigung aufweist, signifikante ökonomische Vorteile haben würde.
Im kleinen Maßstab kann die Entfernung von Kasein mittels Zentrifugation erfolgen; da jedoch die Zentrifugationskraft sehr hoch sein muss, ist diese Technik für industrielle Anwendungen keine brauchbare Technik. Die Kaseinentfernung in der Lebensmittelindustrie wurde historisch durch die Zugabe von Lab (Chymosin) oder durch die Verwendung von Säure durchgeführt, wobei beide zu einer Kaseinausfällung führen [Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry-1: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982]. Diese Techniken sind abermals keine allgemein anwendbaren oder bevorzugten Techniken für die Reinigung von humanen Proteinen aus Milch, beispielsweise stammt Lab von Tieren und müsste aus einer kontrollierten Quelle, die Pathogen frei ist, erhalten werden. Die Säure-Ausfällung ist, während sie kosteneffektiv und effizient ist, nicht allgemein anwendbar, da der niedere pH-Wert zu einem Abbau oder einer Ausfällung des humanen Proteins führt, außer das humane Protein ist säurestabil.
Die Ausfällung von Kasein mit niederen Salzkonzentrationen und polymeren Ausfällungsmitteln ist in der Literatur beschrieben worden. Es sind zum Beispiel 17% Natriumsulfat und 22% Ammoniumsulfat verwendet worden, um Kaseinmicellen vor der weiteren Fraktionierung von Molkeproteinen auszufällen [Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry-1: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982]. Lee und Antonsen [PCT WO 97/09350] offenbarten, dass die Ausfällung von Kasein mit PEG als ein früher Schritt in der Reinigung von transgenem Alpha-1-Antitrypsin aus Schafsmilch verwendet wird. Ähnlicherweise treten Wilkins & Velander, (1992) [Isolation of Recombinant Proteins from Milch, Journal of Cellular Biochemistry 49:333–338] für die Verwendung der PEG-Ausfällung von Kasein als ein für Schritt in der transgenen Proteinreinigung ein.
Ein bedeutendes Hindernis in Bezug auf die Reinigung von Fibrinogen aus Milch ist die Trennung der Kaseinfraktion. Fibrinogen und Kaseinmicellen haben mehrere Charakteristika gemeinsam, vor allem ihre relativ unlösliche Natur und die Neigung für die Selbstaggregation. Sie können beide als relativ hydrophob mit einer Neigung an sowohl andere Proteine als auch Oberflächen nicht-spezifisch zu binden, betrachtet werden. Die für Kasein und Fibrinogen gemeinsamen, ähnlichen Eigenschaften werden ebenfalls durch die Tatsache demonstriert, dass beide leicht durch Präzipitation gereinigt werden. Von den Nachweisen in der Literatur wird es folglich unwahrscheinlich sein, dass ausschließlich die Präzipitation als eine eigenständige Technik für die Entfernung von Fibrinogen von Kasein verwendet werden könnte. Infolgedessen würde ein Verfahren für die Fibrinogen-Reinigung aus Milch, welches sowohl die Kaseinentfernung als auch die Fibrinogen-Reinigung kombiniert, signifikante Vorteile aufweisen.
Folglich besteht im Fachgebiet ein Bedarf für ein Verfahren zum Gewinnen von gereinigtem Fibrinogen aus Milch (deren transgener Ursprung dem Fibrinogen den Vorteil einer signifikanten Ausbeute und Sicherheit in Bezug auf die virale Nicht-Kontamination gibt), wobei das Verfahren in der bevorzugten Ausführungsform hoch gereinigtes, nicht-antigenes Fibrinogen in einer einfachen, kosteffektiven und effizienten Weise bereitstellt. Ein großes Hindernis ist die Trennung von Fibrinogen von Kasein, welche aufgrund bestimmter Ähnlichkeiten in ihren Eigenschaften schwierig ist.
Kationenaustauschchromatographie (CEX) ist eine Trennungstechnik, welche die Interaktion zwischen positiv-geladenen Gruppen auf einem Protein und negativ-geladenen Gruppen auf dem Substrat ausnutzt. Da der pH-Wert die Ladungen auf Proteinen beeinflusst, wirkt sich der pH-Wert des Mediums, in welchem die CEX ausgeführt wird, stark auf die Trennleistung aus. Die CEX-Substrate können in 2 Hauptgruppen unterteilt werden; jene, die eine negative Ladung auf dem Substrat über einen großen pH-Bereich aufrechterhalten (starke CEX Substrate) und jene, die eine negative Ladung auf dem Substrat über einen schmalen pH-Bereich aufrechterhalten (schwache CEX Substrate). Starkte Kationenaustausch-Substrate enthalten im Allgemeinen Sulfonsäure-Derivate als funktionelle Gruppen (z.B. Sulfonate, S-Typ oder Sulfopropyl-Gruppen, SP-Typ). Um die Leistung des CEX Substrates bezüglich Bindung zu maximieren, ist der pH-Wert des Mediums, in welchem die Trennung durchgeführt wird, im Allgemeinen unterhalb des isoelektrischen Punktes des zu bindenden Proteins (der isoelektrische Punkt oder pI eines Proteines ist der pH-Wert, bei welchem das Protein keine Nettoladung trägt, bei pH-Werten über dem pI, weist das Protein eine negative Nettoladung auf und bei pH-Werten unterhalb des pIs, weist das Protein eine positive Nettoladung auf und wird an das CEX Substrat binden). CEX wurde im großen Umfang in der Trennung von Milchproteinen, insbesondere der Kaseinfraktion verwendet. Zum Beispiel beschrieb Law et al. [Quantitative Fractionation of Ovine Casein by Cation-Exchange FPLC, Milchwissenschaft, 45:279–282, 1992] die Trennung von Kasein in Unterfamilien mittels einer Mono S^TM-Säule bei pH 5,0. Ähnlicherweise beschrieben Leaver und Law [Preparative-scale Purification of Bovine Caseins on a Cation Exchange Resin, Journal of Dairy Reserach, 59:557–561, 1992] die Trennung von Rinderkasein von Säure-ausgefälltem Gesamtkasein an einer S-Sepharose Fast Flow^TM bei pH 5,0. Molkeproteine wurden ebenfalls mittels CEX-Chromatographie getrennt. Zum Beispiel beschreibt Hahn et al. [Bovine Whey Fractionation based on Cation-Exchange Chromatography, Journal of Chromatography A, 795:277–287, 1997] die Trennung der Hauptmolkeproteine bei pH 4,6 mittels Milch, die angesäuert wurde, um die Kaseinfraktion zu entfernen. Dieses Verfahren ist jedoch für die Reinigung von Fibrinogen aus Milch ungeeignet, da die Kaseinentfernung durch Ansäuerung das Fibrinogen ausfällen würde.
Die Isolierung von Lactoferrin aus Milch mittels CEX ist in WO 95/22258 offenbart (Gene Pharming Europe BV). Die Lehre von WO 95/22258 würde jedoch nicht als anwendbar für die Reinigung von Fibrinogen aufgrund der Unterschiede in den Eigenschaften von Lactoferrin und Fibrinogen betrachtet werden, und außerdem würde die erhöhten Ionenstärke- Bedingungen, unter welchen die Milch mit dem CEX Harz in WO 95/22258 kontaktiert wird, dazu führen, dass Fibrinogen nicht an das CEX Harz bindet.
Die Verwendung von CEX in der Reinigung von Fibrinogen ist nicht als angebracht betrachtet worden, da berichtet wurde, dass Fibrinogen einen pI von 5,5 hat und deshalb als ein saures Protein betrachtet werden kann, das mehr für die Anionenaustauschchromatographie geeignet ist [Marguerie et al., The Bindung of Calcium to Bovine Tibrinogen, Biochimica et Biophysica Acta, 490:94–103, 1977; Weisel and Cederholm-Williams, Fibrinogen and Fibrin: Characterization, Processing and Applications, Handbook of Biodegradable Polymers (Series: Drug Targetting and Delivery) 7:347–365, 1997]. Das Problem der Kaseinentfernung für ein saures Protein wurde von Van Cott et al. (Affinity Purification of biologically Active and Inactive Forms of Recombinant Human Protein C Produced in Porcine Mammary Gland, Journal of Molecular Recognition, 2:4407–414 [1996]) hervorgehoben, welcher frührer von signifikanten Verlusten von saurem Protein C berichtet, wenn herkömmliche Zentrifugation- oder Präzipitationsschritte verwendet werden, um die Kaseinfraktion zu entfernen. Die Solubilisierung von Kaseinmicellen mittels EDTA, gefolgt von Anionenaustauschchromatographie führte nach wie vor zu Kaseinverunreinigungen von humanem Protein C. Bis zu 20% Verunreinigung von Protein C durch Kasein sogar nach einer hoch selektiven Immunaffinitätschromatographie, war ersichtlich, wenn vor dem Immunaffinitätschromatographie-Schritt keine hohen Salzkonzentrationen verwendet wurden. Die Konsequenzen der Verwendung von hohen Salzkonzentrationen in diesem Schritt waren, dass bis zu 20% des Proteins C nicht an die Immunoaffinitätssäule banden.
Einigermaßen überraschend für die Erfinder war daher die Tatsache, dass Fibrinogen direkt aus Milch an CEX Substrate bei pH Werten oberhalb des berichteten pI des Proteins gebunden werden kann und dass diese Eigenschaft verwendet werden kann, um eine sehr wirksame Reinigungstechnik zu entwickeln. Die Mehrheit der Milchproteine, einschließlich Kasein, sind von Natur aus relativ sauer, und können durch die Verwendung von Änderungen des pHs oder der Ionenstärke an der Bindung an die CEX Säule gehindert oder können vom Fibrinogen getrennt werden. Eine solche Feststellung begründet einen Teil dieser Erfindung. Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist, dass die vorige Entfernung der Kaseinfraktion, durch die Verwendung von Präzipitationstechniken, die von Fachleuten bevorzugt werden, nicht notwendig ist. Es wird angenommen, dass dieser Vorteil einen signifikanten ökonomischen Anreiz für den Einbau von CEX in ein Reinigungsprotokoll für die Herstellung von Fibrinogen aus transgenen nicht-menschlichen Quellen bereitstellt.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Patentanmeldung beschreibt Techniken, bei welchen Kationenaustauschchromatographie bei der Reinigung von transgenem Fibrinogen aus Milch verwendet wird. Die Technik kann auf Vollmilch, Magermilch oder eine Milchfraktion unter Verwendung einer Vielzahl von Chromatographie-Kontaktierungsarten angewendet werden. Da die vorherige Entfernung on Kasein nicht erforderlich ist, kann die Verwendung von Präzipitationsmitteln und Zentrifugationsausrüstung vermieden werden und deshalb kann die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens verbessert werden. Fibrinogen kann mit einer hohen Ausbeute (bis zu 95%) in einem sehr reinen Zustand (bis zu 90%) mit sehr geringer Kasein-Kontamination gesammelt werden und so kann der Schritt als die Vereinigung von Kasein-Entfernung und substantielle Fibrinogen-Reinigung in eine Einzeleinheitsoperation betrachtet werden. Das Fibrinogen erfordert keine weitere Reinigung oder im Anschluss davon eine nur geringfügige Reinigung mittels herkömmlicher Proteinreinigungstechniken.
Diese Erfindung basiert auf der Feststellung, dass die Kationenaustauschchromatographie, bei einem pH-Wert der höher als der berichtete pI von Fibrinogen ist, bei der Reinigung von Fibrinogen aus Milch verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung beschreibt, unter anderem, ein Verfahren, bei welchem die Kationenaustauscherchromatographie bei einem pH-Wert, der höher als der berichtete pI von Fibrinogen ist, bei der Reinigung von Fibrinogen aus Milch verwendet wird, welches somit die substantielle Reinigung von Fibrinogen, während der gleichzeitigen Entfernung der Kaseinfraktion, ermöglicht. In der vorliegenden Erfindung ist der Bedarf an teurer Filtrationsausrüstung, wie von Kutzko (WO 97/42835) dargelegt, für die Entfernung von unlöslichen Milchkomponenten nicht notwendig. Vor der Kationenaustauschchromatographie wird die Milch einfach mittels kontinuierlichen Durchflusszentrifugen, welche in der milchverarbeitenden Industrie allgegenwärtig sind entfettet. Als solches verbindet die Kationenaustauschchromatographie-Reinigungsprozedur die Kasein-Entfernung und die substantielle Fibrinogenreinigung in eine Einzeleinheitsoperation und es wird angenommen, dass dies einen signifikanten ökonomischen Anreiz für die Einführung dieser Technik ist. Insbesondere wird Milch, welche Chelatbildner oder andere Mittel enthalten kann, die in der Lage sind die Kaseinmicellstruktur zu zerreißen, unter pH Bedingungen in Kontakt mit einem CEX-Substrat gebracht, die die Adsorption von Fibrinogen begünstigen, jedoch die Bindung von Milchproteinen verhindern. Das Substrat wird dann gewaschen und mit einer Reihe von Puffern mit geeignetem pH und/oder Ionenstärke eluiert, was zu der Trennung von Fibrinogen von Milchproteinen in einer im Wesentlichen gereinigten Form führt. Die Technik kann auf Vollmilch, Magermilch oder eine Milchfraktion angewendet werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt ein Chromatogramm und ein Elektrophorogramm, die die Selektivität von CEX für Fibrinogen und die Reinheit des eluierten Produktes demonstriert.
2 zeigt ein Chromatogramm und ein Elektrophorogramm, die zeigen, dass Kombinationen von pH und Ionenstärke bei der Herstellung von sehr reinem Fibrinogen aus Milch mittels CEX verwendet werden können.
3 zeigt ein Chromatogramm und ein Elektrophorogramm, die zeigen, dass die vorherige Auflösung von Kasein bei der Reinigung von Fibrinogen aus Milch mittels CEX nicht erforderlich ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, bei welchem Fibrinogen im Wesentlichen aus Milch mittels Kationenaustauschchromatographie bei einem pH-Wert von größer als 5,5, jedoch kleiner als 8,0 gereinigt wird. Der pH-Wert wird ausgewählt, um ein Mittel für die Bindung von Fibrinogen an ein CEX Substrat bereitzustellen, welches vom starken oder schwachen Typ, wie oben beschrieben sein kann. Es wird angenommen, obwohl die Erfindung nicht so gelesen werden sollte, als ob sie auf diese Theorie beschränkt ist, dass die treibende Kraft für die Fibrinogen-Bindung an das CEX Substrat die Aα-Ketten sein können, die bekanntermaßen basischer sind als entweder die Bβ- oder γ-Ketten [Weinstein and Deykin, 1978, Low Solubility Examined by Two-Dimensional Sodium Dodecyl Sulfate Gel Electrophoresis and Isoelectric Focussing, Thrombosis Research, 13:361–377] und können deshalb ermöglichen, dass das Fibrinogen bei einem pH Wert, der höher als der berichtete pI Wert ist, bindet.
Dementsprechend stellt die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Gewinnen von Fibrinogen aus Milch bereit, wobei das Verfahren aufweist:

a) In Kontakt bringen der Milch mit einem Kationenaustauscher-Chromatographie-Substrat unter Bedingungen, bei welchen das Fibrinogen an das Substrat bindet;
b) Gegebenenfalls Waschen des Substrats um ungebundene Komponenten zu entfernen; und
c) Entfernen des gebundenen Fibrinogens vom Substrat unter Verwendung von Spülmitteln, wobei die Spülmittel eine erhöhte Ionenstärke oder einen erhöhten pH oder beides im Vergleich zu den Bedingungen im Schritt (a) haben.

Wie hierin verwendet, betrifft der Ausdruck „Fibrinogen" das Hauptstrukturprotein, welches für die Bildung von Gerinnseln verantwortlich ist und schließt die gesamte Glycoproteinform von Fibrinogen sowie andere verwandte Fibrinogenarten ein, einschließlich verkürztem Fibrinogen, Aminosäuresequenzvarianten (Muteine oder polymorphe Varianten) von Fibrinogen, eine Fibrinogenart, die zusätzliche Reste aufweist, und jede natürlich vorkommende allelische Fibrinogen-Variante.
Wie hierin verwendet, wird Milch als die Flüssigkeit verstanden, die von den tierischen Brustdrüsen sekretiert wird und umfasst Vollmilch, Magermilch und jede Milchfraktion. Vor der Kationenaustauschchromatographie kann die Milch mittels kommerziellen kontinuierlichen Durchflusszentrifugen entfettet werden, die in der Milch-verarbeitenden Industrie allgegenwärtig sind. Die Milch kann von jedem säugendem Tier, insbesondere jedoch jene, die Milch in Mengen produzieren, wie Kühe, Schafe, Ziegen, Kaninchen oder sogar Kamele oder Schweine gewonnen werden.
Das Fibrinogen kann in Milch natürlich vorkommen. Es wird jedoch wahrscheinlicher von transgenen Quellen stammen, d.h. als Ergebnis einer genetischen Manipulation eines Milchgebenden Tieres, wie ein Schaf oder ein Kuh, so dass ein Nukleinsäurematerial, das Fibrinogen kodiert in der Brustdrüse des Tieres exprimiert wird und das Fibrinogen in die Milch sekretiert wird. Die vorliegende Erfindung ist für die Reinigung von Fibrinogen an sich oder von Fibrinogen, welches auf eine Art verändert wurde, um die trangene Expression und/oder die Isolierung zu erleichtern, wie durch die Fusion an andere Proteine, nützlich. Das Fibrinogen kann humanes Fibrinogen oder Fibrinogen von jedem anderen geeigneten Tier, wie ein Schaf oder ein Kuh sein. Für die medizinische Verwendung ist es bevorzugt, vom Patienten stammende Proteine zu verwenden. In Fällen wo das Fibrinogen rekombinant kodiert ist, so dass das Fibrinogen von einer Spezies anders als die Spezies in welcher das Fibrinogen exprimiert wird, stammt, kann das Glycosylierungsmuster vom Glycosylierungsmuster des natürlich vorkommenden Fibrinogens verschieden sein. Somit kann humanes Fibrinogen, welches in einem transgenen nicht-menschlichen Tier exprimiert wird, ein zu natürlich vorkommendem Fibrnogen unterschiedliches Glycosylierungsmuster aufweisen. Die vorliegende Erfindung ist für das Reinigen von jedem beliebigen transgenen Fibrinogen geeignet.
Wie hierin verwendet, sind Kationenaustauschchromatographie (CEX)-Substrate Chromatographieharze, die negativ-geladene Gruppen enthalten. Die Proteine werden auf der Basis der Interaktion zwischen negativ-geladenen Gruppen im Harz und positiv-geladenen Gruppen auf einem Protein getrennt. Wie oben beschrieben, können sie in zwei Hauptarten zusammengefasst werden: jene, die eine negative Ladung auf dem Substrat über einen großen pH-Bereich aufrechterhalten (starke CEX Substrate) und jene, die eine negative Ladung auf dem Substrat über einen schmalen pH-Bereich aufrechterhalten (schwache CEX Substrate). Starkte Kationenaustausch-Substrate enthalten im Allgemeinen Sulfonsäure-Derivate als funktionelle Gruppen (z.B. Sulfonate, S-Typ oder Sulfopropyl-Gruppen, SP-Typ). Beide Substratarten sind gedeckt.
Zu Beispielen von geeigneten starken CEX Substraten zählen S-Sepharose FF, SP-Sepharose FF, SP-Sepharose Big Beads (alle Amersham Pharmacia Biotechnology) und Fractogel EMD-SO₃ 650 (M) (E. Merck, Deutschland). Zu Beispielen von schwachen Kationenaustausch-Substraten zählt CM Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotechnology).
Die Bedingung in Schritt (a) unter welcher Fibrinogen in Milk an das Substrat bindet ist jene, wo das Substrat und die Milch einen pH-Wert aufweisen, der höher als der pI-Wert von Fibrinogen ist.
Der pI-Wert, oder isoelektrische Punkt, eines Proteines ist der pH-Wert, bei welchem das Protein keine Nettoladung trägt. Bei pH-Werten über dem pI-Wert, weist das Protein eine negative Nettoladung auf und bei pH-Werten unterhalb des pI-Werts, weist das Protein eine positive Nettoladung auf. Wie hierin verwendet, wird der pI-Wert von Fibrinogen mit pH 5,5 angenommen, in Übereinstimmung mit berichteten Quellen [Marguerie et al., The Bindung of Calcium to Bovine Tibrinogen, Biochimica et Biophysica Acta, 490:94–103, 1977; Weisel and Cederholm-Williams, Fibrinogen and Fibrin: Characterization, Processing and Applications, Handbook of Biodegradable Polymers (Series: Drug Targetting and Delivery) 7:347–365, 1997].
Vorzugsweise ist die Bedingung in Schritt (a) so, dass der pH-Wert des Substrats und der Milch größer als pH 5,5, vorzugsweise bei etwa pH 6,0 ist.
Sobald Fibrinogen an das Substrat gebunden ist, wird das Substrat vorzugsweise mit einem Spülmittel bei geeignetem pH-Wert und Ionenstärke gewaschen, um die Mehrheit der nicht-Fibrinogen-Komponenten zu entfernen. Ein geeignetes Spülmittel würde ein Puffer mit pH 6,0 oder mit höherem pH-Wert sein, wie ein Puffer mit einem pH-Wert größer als 5,5 jedoch kleiner als 14, vorzugsweise zwischen pH 6,0–8,5. Ein Beispiel ist Tris-Acetat-Puffer bei einem pH-Wert von 6,0–8,5, der 0–0,2 M Natrium oder Kaliumchlorid enthält. Im Allgemeinen hängt die erforderliche Natrium oder Kaliumchlorid-Konzentration (oder jedem anderen Salz, das zum Erhöhen der Lösungsleitfähigkeit und Ionenstärke nützlich ist), um nicht-Fibriongenkomponenten aus dem Substrat zu entfernen, während gebundenes Fibrinogen zurückgehalten wird, vom eingesetzten pH-Wert ab. Es wurde deshalb gefunden, dass wenn ein niederer pH-Wert (5,5–6,5) verwendet wird, die erforderliche Salzkonzentration im Bereich von 0–0,15 M liegt. Wenn der pH-Wert der Salzlösung erhöht wird, zum Beispiel, auf mehr als 6,5 (dies hat die Auswirkung, dass die Stärke der Interaktion zwischen gebundenem Fibrinogen und CEX Substrat geschwächt wird), die erforderliche Salzkonzentration im Allgemeinen im Bereich von 0–0,1 M liegt. Diese Erfindung sollte im Hinblick auf die oben gegebenen Bedingungen nicht als einschränkend betrachtet werden, da jene, die mit dem Fachgebiet vertraut sind, zu den oben genannten unterschiedliche Bedingungen etablieren können, um das gleiche Ergebnisse zu erzielen.
Fibrinogen kann dann von der Säule eluiert werden, indem entweder die Ionenstärke oder pH-Wert oder beide des Spülmittels in Bezug auf das Spülmittel im Schritt (b) erhöht wird (oder im Bezug auf die Bedingungen in Schritt (a), wenn es keinen Schritt (b) gab). Ein geeignetes Spülmittel ist ein Puffer mit einem pH-Wert von größer als 5,5, jedoch kleiner als 9,0, vorzugsweise zwischen pH-Wert 6,0–8,5; und mit einer Ionenstärke von zwischen 0–1,0 M, vorzugsweise 0,025–0,2M. Das Spülmittel in Schritt (c) hat eine Ionenstärke von gleich oder größer als 0,1 M, wenn ihr pH-Wert 5,5–6,5 war. Auf ähnliche Weise, wenn das Spülmittel in Schritt (c) einen pH-Wert von 6,5–8,5 aufweist, würde die Ionenstärke des Spülmittels im Allgemeinen größer als oder gleich 0,05 M sein. Es kann für die Ionenstärke des eluierten Produkts im Schritt (c) wünschenswert sein, kleiner als 0,2 M zu sein, wenn das Fibrinogen mittels eines anderen Ionenaustauscher-Schritts weiter verarbeitet werden soll. Diese Erfindung sollte im Hinblick auf die oben gegebenen Bedingungen nicht als einschränkend betrachtet werden, da jene, die mit dem Fachgebiet vertraut sind, zu den oben genannten unterschiedliche Bedingungen etablieren können, um das gleiche Ergebnisse zu erzielen. Die Erfindung ist für die klein-, mittelgroß- und großtechnische Ausführung geeignet.
Das gemäß dem Verfahren gewonnene Fibrinogen wird getrennt oder isoliert und ist zumindest zu 60%, bevorzugt zu. 80%, bevorzugter zu 90% frei von anderen Komponenten. Die Gewinnungsraten von Fibrinogen in Milch mit diesem Verfahren der Erfindung sind zumindest etwa 65%, bevorzugt 85%, bevorzugter 90%, und am meisten bevorzugt 95% des Gesamtfibrinogens in der Milch. Vorzugsweise sind die Gewinnungsraten im Bereich von etwa 65% zu etwa 90%, bevorzugter im Bereich von etwa 65% bis 95%. Das Fibrinogen kann dann weiters mittels Techniken, die Fachleuten bekannt sind, gereinigt werden, zum Beispiel unter Verwendung von Anionenaustausch-Chromatographie wie von Kuyas et al. beschrieben wurde [A subfraction of human fibrinogen with high sialic acid content and elongated γ chains, Journal of Biological Chemistry 257 1107–1109 (1982) und Bernard et al( EP 0 555 135 A1 )].
Die Milch kann ein oder mehrere Mittel enthalten, die in der Lage sind, Kaseinmicellen zu zerreißen. Kaseinmicellen sind Micellestrukturen, die in der Milch durch eine Mischung aus größtenteils unlöslichen Proteinen, die nicht filtrierbar sind und leicht die Verfahrensausrüstung blockieren, gebildet werden. Zu Beispielen von solchen Mitteln zählen Chelatbildner wie EDTA und EGTA mit einer Konzentration von 20–100 mM oder Zitrat mit einer Konzentration von 50-200 mM. Andere Mittel, wie jene in Denman, WO 94/19955 und Denman, US 5.756.687 offenbart sind, können wenn gewünscht auch verwendet werden, obwohl die Verwendung dieser Mittel die Lösungsionenstärke auf einen Punkt erhöht, der die Fibrinogenbindung verhindert oder reduziert, und die Kosten können ebenfalls für den kommerziellen Maßstab unerschwinglich sein.
Das Verfahren kann mit dem Substrat in einem Batchformat oder einem Säulenformat durchgeführt werden. Im Batchformat kann die Milch oder Milchfraktion mit dem CEX Substrat in einem gut gerührten Tank kontaktiert werden. Die Trennung des CEX Substrats von der Milch kann dann durch Sedimentation erleichtert oder durch Zentrifugation unterstützt werden. Im Säulenformat, welches bevorzugt ist, würde die Milch oder Milchfraktion durch eine Säule, welcher bereits CEX Substrat zugefügt wurde, gepumpt werden. Die Säulenformate werden bevorzugt, da sie zu einer besseren Adsorptionseffizienz führen. Dieses Säulenformat könnte als entweder ein „Füllkörper"- oder „Fest"-Bettformat betrachtet werden. Wenn die Kaseinauflösung nicht durchgeführt wird, können Batch-Techniken bevorzugt werden, obwohl die Säulenchromatographie mittels herkömmlichen „Füllkörperbettkontaktoren" durchgeführt werden, unter der Voraussetzung, dass die Substrat-Kügelchengröße von einer ausreichenden Größe ist, so dass sie nicht mit Kasein verstopft oder auf andere Art blockiert werden. Es ist vorgesehen, dass die Verwendung von „Expanded bed" oder „fluidisierten Bett"-Kontaktoren auch geeignet ist (Noppe et al. Simple Two-Step Procedure fort he Preparation of Highly Active Pure Equine Lysozyme, Journal of Chromatography A719 327–331 (1996) und Hjorth, Expanded-Bed Adsorption in Industrial Bioprocessing: Recent Developments, Trends in Biotechnology, 15 230–235 (1997)).
Expanded und fluidiserte Bettkontaktoren können so betrachtet werden, dass sie Eigenschaften sowohl von der Batchadsorptionstechniken als auch von den Füllkörper (Fest) Bettkontaktoren aufweisen. Wie in der obgenannten Literaturstelle dargelegt ist, ermöglichen sie das Verarbeiten von Feststoff-enthaltendem oder partikulärem Ausgangsmaterial. Dies wird aufgrund der Tatsache erreicht, dass das Ausgangsmaterial auf die Säulen, die das Adsorptionssubstrat (normalerweise in Kügelchenform) enthalten, am Boden der Säule aufgetragen wird, während der obere Teil der Säule locker ist und den Harzkügelchen ist es möglich, sich in Aufwärtsrichtung zu bewegen. Parameter wie Flussrate und Ausgangsmaterialviskosität und Dichte kontrollieren dann das Ausmass der Bettausweitung, d.h. die Suspension des Substratekügelchens. Sobald die Substratkügelchen suspendiert werden, wird der Raum zwischen den Kügelchen größer (der Bettleerraum wird größer), so dass den Partikel und suspendierten Feststoffe ermöglicht wird, ungehindert durch das Bett zuwandern. Dies ist im Gegensatz zum Auftragen von Partikel-enthaltendem Ausgangsmaterial auf eine konventionelle Füllkörper- oder Festbettsäule in welchen die Substratkügelchen als Filter für die Partikel agieren würden und eventuell verstopfen können; die Verstopfung macht sich durch einen Anstieg des Druckabfalls über die Säule und eine Abnahme der Flussrate der Flüssigkeit durch die Säule bemerkbar. Die Ausdrücke expanded und fluidisiert werden häufig intereinander vertauscht. In Ausdrücken der chemischen Verfahrenstechnik würde fluidisiertes Bett ein Bett von Substratkügelchen darstellen, welche einen höheren Grad an Rückmischen zeigen, als durch Expanded Beds gezeigt werden würde. In bestimmten Umständen, zum Beispiel, wenn das Ausgangsmaterial eine geringe Konzentration an Partikeln aufweist, muss die Verwendung von Expanded oder fluidisierten Betten nicht notwendig sein. Wenn die Substratkügelchen von ausreichender Größe sind (> 100um), sind die Räume zwischen den Kügelchen groß genug, um den Durchgang kleiner Partikel zu ermöglichen. Ein Beispiel eines solchen Substrats wäre Sepharose Big Beads (Amersham Pharmacia Biotechnology), welches mit einer Vielzahl von Austauschgruppen erhältlich ist.
In dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung der Kationenaustauschchromatographie zum Gewinnen von Fibrinogen aus Milch bereitgestellt.
Die für den ersten Aspekt der Erfindung beschriebenen Präferenzen treffen auch auf den zweiten Aspekt der Erfindung zu.
Die folgenden Beispiele sind angeführt, um bei der Erklärung der Erfindung zu assistieren, ohne dass sie einschränkend sind.
Beispiel 1:
Milch von einem transgenen Mutterschaf, welches humanes Fibrinogen mit 5g/l exprimiert, wurde aus einem gefrorenen Zustand aufgetaut und dann mittels Zentrifugation bei niederer Geschwindigkeit (2000 rpm, 15 Minuten) entfettet, wonach die Magermilch gesammelt wurde. Zu dieser Milch wurde dann eine Lösung von 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei pH 8,0 hinzugefügt, um die Endkonzentration von EDTA auf 100 mM zu bringen. Der Proben pH-Wert wurden dann auf 6,0 eingestellt, indem 25 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Essigsäure (Tris-Acetat)-Puffer mit einem pH-Wert von 4,2 hinzugefügt wurden. Die Zugabe erfolgte vorsichtig, damit das Kasein nicht ausfiel. 0,6 ml dieser Probe wurde auf eine 2,4 ml SP-Sepharose^TM FF Säule injiziert, die vorher mit 25 mM Tris-Acetat-Puffer, pH 6,0, bei einer linearen Flussrate von 88 cm/h äqulibriert wurde. Die Säule wurde mit der obigen Lösung bei der gleichen Flussrate gewaschen, bis kein Protein im Effluent mehr beobachtet wurde, wie durch Messen der Optischen Dichte bei 280 nm bestimmt wurde. Die Säule wurde dann gespült mit erstens 25 mM Tris-Acetat-Puffer bei pH 7,5, zweitens mit 25 mM Tris-Acetat-Puffer bei pH 8,5 und zuletzt mit 1M Kaliumchlorid (KCl) in 25 mM Tris-Acetat bei pH 7,7.
Das Chromatogramm dieses Experimentes, wie in 1 gezeigt, zeigt, dass ein Großteil des Materials nicht an diese Säule band und dass das Material von der Säule, nach dem Spülen mit jedem der Puffer eluiert wurde. Die Natriumdodecylsulfat Polyacylamidgel-Elektrophorese (SDA-PAGE, 8–16% Novex)-Analyse des in 1b gezeigten Experimentes zeigt, dass Fibrinogen in der Milch (Bahn 1) effektive durch das CEX Substrat gebunden wurde und in der Durchfluss-Fraktion nicht vorhanden war (Bahn 2). Nicht-Fibrinogen Kompenenten, besonders Kasein und β-Lactoglobulin, die an die Säule gebunden sind, wurden effektive durch Ändern des pH-Werts des Spülpuffers auf 7,5 und 8,5 (Bahn 3 und 4) entfernt, während das gebundene Fibrinogen durch Spülen der Säule mit 1 M KCl (Bahn 5) eluiert wird. Das eluierte Fibrinogen ist von hoher Reinheit, wenn es mit kommerziell erhältlichem (Enzyme Research Laboratories, UK) von Plasma-stammendem reinen Fibrinogen-Standard (Bahn 6) verglichen wird
Beispiel 2
In einem anderen Beispiel, welches unter verfeinerten Bedingungen durchgeführt wurde, kann demonstriert werden, dass die Entfernung von Nicht-Fibrinogen-Komponenten von der CEX Säule unter Verwendung einer Puffer-Lösung bei pH 8,5 durchgeführt werden kann. Dieses führt zu einem sehr ähnlichen Elutionsmuster wie in Beispiel 1, außer dass die pH 7,5 Elution nicht erforderlich ist, was zu einem auf der Verarbeitungszeit basierenden Vorteil führt. Die SDS-PAGE demonstrierte wieder die Selektivität der Bindung des Fibrinogens an die CEX Säule, was durch ihre Abwesenheit in der Durchfluss-Fraktion (Bahn 2) im Vergleich zu dem Ausgangsmaterial (Bahn 1) ausgewiesen wurde. Gebundenes Fibrinogen kann von der Säule durch Elution mit 0,1 M KCl in einem Puffer bei pH 8,5 entfernt werden. Die hohe Reinheit des eluierten Materials (Bahnen 5–7) ist offensichtlich, wenn die Reinheit des kommerziell erhältlichen von Plasma-stammenden Fibrinogen-Standards (Bahn 8) untersucht wurde.
Beispiel 3
In einem weiteren Beispiel der Anwendbarkeit dieser Technik, wurde eine zu der in Beispiel 2 äquivalenten Prozedur mit einer Prozedur verglichen, in welcher kein EDTA zu der Milch hinzugefügt wurde. Für diese Anwendung wurde SP Sepharose Big Beads verwendet. Dieses Substrat weist eine Partikelgröße auf, die größer als die von SP Seqharose FF ist und für die Verwendung mit Partikel-enthaltendem Ausgangsmaterial besser geeignet ist, da es nicht die gleichen Einschlussphänomene zeigt, wie sie oft von kleinen Substratpartikel gezeigt werden. Die in 3 gezeigten Chromatogramme demonstrieren, dass die mit beiden Substraten erreichte Trennung außergewöhnlich ähnlich ist. Die SDS-Page-Analyse (Bahnen 4 und 9) der zwei eluierten Fibriniogen-Produkte bestätigt die ähnlich hohe Reinheit, die mit beiden Techniken erreicht wurde, was illustriert, dass die Kasein-Resolubilisierung oder Entfernung für die Säulenchromatographie nicht zwingend erforderlich ist.

Claims

Verfahren zum Gewinnen von Fibrinogen aus Milch, welches Folgendes aufweist: d) In Kontakt bringen der Milch mit einem Kationenaustauscher-Chromatographie-Substrat unter Bedingungen, bei welchen das Substrat und die Milch einen pH-Wert, welcher höher als der pI-Wert von Fibrinogen ist, aufweist und das Fibrinogen an das Substrat bindet; e) Gegebenenfalls Waschen des Substrats um ungebundene Komponenten zu entfernen; und f) Entfernen des gebundenen Fibrinogens vom Substrat unter Verwendung von Spülmitteln, wobei die Spülmittel eine erhöhte Ionenstärke oder einen erhöhten pH oder beides im Vergleich zu den Bedingungen im Schritt (a) haben.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das gewonnene Fibrinogen zumindest zu 60% rein ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der pH des Substrats und der Milch größer als pH 5,5, vorzugsweise bei etwa pH 6,0 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Schritte (b) und (c) bei einem pH der größer als pH 5,5 jedoch geringer als pH 14,0 ist, durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei: – das Waschen im Schritt (b) unter Verwendung von Spülmitteln durchgeführt wird, welche eine Ionenstärke von 0–0,15M und einen pH von 5,5 bis 6,5 oder eine Ionenstärke von 0–0,1M und einen pH von größer als 6,5 aufweisen; und/oder – die Spülmittel im Schritt (c) eine Ionenstärke von gleich oder größer als 0,10M und einen pH von 5,5 bis 6,5, oder eine Ionenstärke von gleich oder größer als 0,05M und einen pH von größer als 6,5 aufweisen;
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Milch Vollmilch, Magermilch, Milchmolke, oder eine Milchfraktion ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Milch ein oder mehrere Mittel, das/die in der Lage ist/sind die Kaseinmicellen zu zerreißen, beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Mittel ein Chelatbildner wie zum Beispiel EDTA, EGTA oder Zitrat ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Substrat in einem Säulenformat wie zum Beispiel Festbettabsorption, expanded bed Absorption oder fluidisierten Bettabsorption oder in einem Batchformat sein kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Fibrinogen transgenes Fibrinogen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Fibrinogen humanes Fibrinogen ist.
Verwendung der Kaseinaustauscher-Chromatographie zum Gewinnen von Fibrinogen aus Milch, wobei die Chromatographie bei einem pH der höher als der pI-Wert von Fibrinogen ist, durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das gewonnene Fibrinogen zumindest zu 60% rein ist.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Milch ein oder mehrere Mittel das/die in der Lage ist/sind Kaseinmicellen zu zerreißen, beinhaltet.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Mittel ein Chelatbildner wie zum Beispiel EDTA, EGTA, oder Zitrat ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12–15, wobei die Kationenaustauscherchromatographie in einem Säulenformat wie zum Beispiel Festbettabsorption, expanded bed Absorption oder fluidisierten Bettabsorption oder in einem Batchformat sein kann.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei das Fibrinogen transgenes Fibrinogen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei das Fibrinogen humanes Fibrinogen ist.