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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis mindestens
eines Analyten in einer Probe zu analysierender biologischer Flüssigkeit, umfassend:
- – Inkontaktbringen
der Probe biologischer Flüssigkeit
mit einem Liganden, welcher für
mindestens einen nachzuweisenden Analyten spezifisch ist und welcher
auf mindestens einem Testbereich eines festen Trägers fixiert ist,
- – eine
Bindung zwischen dem mindestens einen nachzuweisenden Analyten und
dem Liganden,
- – eine
Markierung des spezifischen Liganden und dem mindestens einen gebundenen
Analyten durch einen Tracer, und
- – einen
Nachweis des Markierungs-Tracers auf dem spezifischen Liganden und
dem mindestens einen gebundenen Analyten durch Bestimmung einer
Intensität
des Markierungssignals,
- – Inkontaktbringen
der Probe biologischen Flüssigkeit
mit einem Liganden, welcher unspezifisch ist für den mindestens einen Analyten,
wobei der unspezifische Ligand auf einem Kontrollbereich des festen
Trägers
fixiert ist, und in der Lage ist, unspezifischen Interaktionen,
die durch die Probe verursacht sind, Rechnung zu tragen,
- – eine
Adsorption und/oder eine Bindung von unspezifischen Interaktionsfaktoren
der Probe auf dem unspezifischen Liganden,
- – eine
Markierung des unspezifischen Liganden und gebundener Interaktionsfaktoren
mit einem Tracer,
- – einen
Nachweis des Markierungs-Tracers auf dem unspezifischen Liganden
und der gebundenen Interaktionsfaktoren durch Bestimmung einer Intensität des Markierungssignals.
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Nachweisverfahren
sind bereits sehr lange bekannt (siehe zum Beispiel US-A-4376110, US-A-4703017
und US-A-5028535).
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Dieser
Nachweistyp wird allgemein als „Immunodot"-Test bezeichnet.
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Unter
einem festen Träger
kann in der vorliegenden Erfindung ein Substrat verstanden werden, das
vorzugsweise in Form eines Blattes oder einer Membran vorliegt und
das sich zum Beispiel in der Form einer Karte, eines Bandes oder
eines Streifens zeigen kann. Häufig
wird eine zellulöse
Membran, insbesondere aus Nitrocellulose oder aus gemischten Celluloseestern
von Salpetersäure
und von anderen Säuren,
verwendet. Es ist offensichtlich, dass feste Träger, die eine andere Form und/oder
andere Eigenschaften haben, für
die Durchführung
des Verfahrens in Betracht gezogen werden können.
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Unter
einem spezifischen Liganden kann jedes Molekül verstanden werden, für das es
ein komplementäres,
spezifisches Molekül,
das heißt,
den nachzuweisenden Analyten, gibt, und das in der Lage ist, sich
an den festen Träger
anzuheften. Diese letzte Fixierung kann im Verlauf einer Reihe verschiedener
Interaktionen, wie ionischer Bindungen, kovalenter Bindungen, hydrophober
Interaktionen etc., stattfinden.
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Unter
einem Analyten wird jedes Molekül verstanden,
von dem der Nachweis und die Messung der Konzentration durchzuführen sind,
und für
den es ein komplementäres
spezifisches Molekül
gibt. Der spezifische Ligand und der Analyt können zum Beispiel stereokomplementär sein,
was die Fixierung des Analyten auf dem festen Träger durch das Zwischenprodukt
des Liganden, das auf der Oberfläche des
festen Trägers
leicht zugänglich
ist, ermöglicht. Man
kann als Analyten Antigen, Antikörper,
Proteine, Haptene, Nucleinsäuren
etc. in Betracht ziehen. Die Begriffe des spezifischen Liganden
und des Analyten können
sich je nach der Konzeption des Versuchs darüber hinaus auf denselben Molekültyp beziehen.
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Unter
einem Tracer kann man einen spezifischen Molekültyp verstehen, der zu dem
Analyten komplementär
ist und an den ein System gekoppelt ist, das seinen Nachweis ermöglicht,
zum Beispiel ein Enzym, eine radioaktive Markierung, eine fluoreszente
oder lumineszente Markierung, ein gefärbtes Teilchen (Polymer, Gold-
oder Latexteilchen) etc..
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Die
Tests, die sich wie vorstehend beschrieben auf ein Nachweisverfahren,
beziehen, können zum
Nachweis von spezifischen Analyten in biologischen Flüssigkeiten,
wie Serum, Blut, Urin etc. verwendet werden. Immunologische Tests
können
in Betracht gezogen werden. Diese Tests können für semi-quantitative oder quantitative
Verfahren eines oder mehrerer Ziel-Analyten, in einem einzigen Arbeitsgang,
mit oder ohne Verwendung eines spezifischen Geräts für den Nachweis eines Signals
verwendet werden. Bei diesem Testtyp ist die Intensität des Markierungssignals
zur Konzentration des in der Probe nachzuweisenden Analyten direkt
proportional.
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Es
wurden verschiedene Arten von Immuntests auf Festphasen beschrieben,
in welchen die Gegenwart oder Abwesenheit eines Analyten in einer Probe
durch visuelle Interpretation der Ergebnisse bestimmt werden kann
(siehe zum Beispiel US-A-4703017).
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Die
Reaktion auf diese Tests ist dennoch auf eine einfache Alternative
(positiv/negativ) begrenzt, und eine semi-quantitative oder quantitative
Interpretation impliziert, parallel dazu getrennte Versuche mit Standards
(Kontrollen) durchzuführen,
bei denen die Konzentration des Analyten bekannt ist. Die Beziehung
zwischen der beobachteten Reaktion und der Konzentration des Analyten
in der Probe kann demnach durch den Vergleich damit oder Referenzwerten erstellt
werden.
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Außerdem sind
Nachweisverfahren, einschließlich
interner Kalibrierungssysteme bekannt, die die Verwendung mehrerer
Tests zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten einer einzelnen Probe
vermeiden (siehe zum Beispiel US-A-5028535).
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In
der gesamten Anwendung, die darauf abzielt, eine spezifische Interaktion
zwischen zwei oder mehreren organischen Makromolekülen zu messen, besteht
das Hauptproblem darin, dass ein Hintergrundrauschen auftritt, das
auf die unspezifischen Interferenzen zwischen den vorhandenen Molekülen zurückzuführen ist.
Jede zu analysierende Probe enthält
unspezifische Interaktionsfaktoren, wie zum Beispiel interferierende
Moleküle,
die von dem nachzuweisenden Analyten getrennt sind, und die durch
ihre intrinsischen chemischen Eigenschaften die Fähigkeit
haben, sich unspezifisch an den spezifischen Liganden (zum Beispiel
durch nicht stereokomplementäre
Bindung oder durch Adsorption) und spezifisch oder unspezifisch
an den Tracer zu binden. Zum Beispiel können in einem Nachweistest
von spezifischen Antikörpern
andere Immunglobuline als die spezifischen Antikörper, die gegen das Antigen,
das als spezifischer Ligand verwendet wird, einen unspezifischen
Interaktionsfaktor darstellen.
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Als
ein anderer unspezifischer Interaktionsfaktor ist ebenfalls eine
unspezifische Verbindung des nachzuweisenden Analyten mit wenigstens
einem unspezifischen Liganden, das heißt, durch nicht-stereokomplementäre Bindung
oder Adsorption zu verstehen. Das bedeutet, dass der nachzuweisende
Analyt selbst ebenfalls an dem zu bestimmenden Hintergrundrauschen
beteiligt sein kann, was im Gegensatz zu der Information der Patente
US 5.356.782 und
EP 0833157 steht.
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Als
Hintergrundrauschen kann man also die Intensität des unspezifischen Signals
verstehen, das aus einer Gesamtheit an molekularen, unspezifischen
Interaktionsfaktoren, die von den Eigenschaften der Probe (zum Beispiel
der Gegenwart und den verschiedenen Konzentrationen von geeigneten Stoffen,
die sich unspezifisch an den Analyten und den Tracer binden, dem
pH-Wert, der Konzentration an Salzen, dem Gehalt an verschiedenen
Lipiden, wobei die unspezifischen intermolekularen Adsorptionen
bevorzugt sind) oder den Bedingungen, unter denen der Versuch durchgeführt wird
(zum Beispiel Temperatur, Inkubationszeit, Konzentrationen der Probe
und des Tracers) abhängen.
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Unter
dem Potenzial an Hintergrundrauschen ist dagegen die maximale Intensität des unspezifischen
Signals zu verstehen, welche geeignet ist, in einer gegebenen Probe,
unter gegebenen Versuchsbedingungen, auf einem Testbereich erzeugt zu
werden. Per Definition kann also jede Probe durch ein Potenzial
an Hintergrundrauschen charakterisiert werden, welches ihr zueigen
ist und mit ihr intrinsisch verbunden ist.
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Die
Messung des Potenzials an Hintergrundrauschen ergibt den Schwellenwert
der Signalintensität, über dem
eine Probe als positiv angesehen wird, und unter dem sie als negativ
angesehen wird.
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Daraus
ergibt sich, dass, da jede Probe ihre charakteristischen physikalischchemischen
Eigenschaften besitzt, jede Probe dafür geeignet ist, ein Hintergrundrauschen
zu erzeugen, das ihr zueigen ist, und intrinsisch ein Potenzial
an Hintergrundrauschen besitzt, das ihr zueigen ist, und man kann
ihr demnach einen Schwellenwert zuweisen, der ihr zueigen ist.
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Die
Leistungen eines Tests hängen
von der Genauigkeit ab, mit der der Schwellenwert gemessen wird;
es ist demnach wichtig, dass man das Potenzial an Hintergrundrauschen
einer Probe so messen kann, dass man einen Wert erhält, der
Idealerweise durch die spezifische Interaktion korrigiert ist. Darüber hinaus
bestimmt man bei den meisten aktuellen Tests zum Nachweis eines
Analyten in einer Probe biologischer Flüssigkeit auf allgemeine Weise einen
Schwellenwert, der nur auf die Gesamtheit der getesteten Proben
anwendbar ist, ohne der Variabilität des Hintergrundrauschens,
das mit jeder Probe einhergeht, Rechnung zu tragen.
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In
einem ELISA-Test zum Beispiel wird die Bestimmung eines Schwellenwerts
(cut-off) der Signalintensität, über dem
eine getestete Probe als positiv angesehen wird, und unter dem sie
als negativ angesehen wird, indirekt durch mindestens eine Kontrolle,
von der die Konzentration des Analyten bekannt ist, und die parallel
auf mindestens einem äquivalenten
jedoch getrennten Testbereich (zum Beispiel zumindest auf einer
benachbarten Kuvette in einem ELISA-Test) mit der oder den zu analysierenden Probe(n)
getestet wird, durchgeführt.
Der Schwellenwert wird allgemein in Bezug auf die Werte, gegeben durch
eine statistisch signifikante Menge an Proben, die in Bezug auf
den nachzuweisenden Analyten als negativ angesehen wurden, definiert:
eine statistische Behandlung der Verteilung dieser Werte erlaubt eine
Berechnung des Schwellenwerts, der bei der Interpretation der Ergebnisse
in Funktion der gewünschten
Leistungen (Spezifität
und Empfindlichkeit des Tests) zu verwenden ist (siehe, zum Beispiel, M.P.
BOUNAUD, et J-F. MORIN, Evaluation analytique d'un nouvel immunodosage, Arbeitsgruppe
Nr. 13 des 10. Colloquiums CORATA, 1993). Obwohl diese Art des Ansatzes
der Variabilität
des Schwellenwerts in Abhängigkeit
der Bedingungen, unter denen der Test ausgeführt wird, Rechnung trägt (wobei die
Kontrollen immer unter denselben Bedingungen parallel zu den Proben
getestet wurden), wird die Variabilität des Hintergrundrauschens,
das durch die verschiedenen Proben selbst erzeugt wird, nicht in Betracht
gezogen (da die Kontrollen der Gegenwart einer mehr oder weniger
großen
Anzahl an unspezifischen Interaktionsfaktoren in einer mehr oder
weniger großen
Konzentration innerhalb jeder Probe nicht Rechnung tragen können). Dies
ist dafür
geeignet, die Empfindlichkeit des Tests stark zu begrenzen und zu
fälschlicherweise
negativen Interpretationen für bestimmte
Proben zu führen,
insbesondere im Fall einer Kombination eines hochspezifischen Tests
(für den
der Schwellenwert notwendigerweise nahe an dem maximalen Signal
in einer negativen Menge liegt) und einer schwach positiven Probe,
die desto eher ein schwaches Potenzial an Hintergrundrauschen besitzen
würde.
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Das
Dokument
DE 197 31
465 A1 , das zum Prioritätszeitpunkt
des vorliegenden Patentanspruchs noch nicht veröffentlicht war, beschreibt
ein System interner Kontrolle(n), das es erlaubt, den Wert einer
oder mehrerer unspezifischer Interaktionen, die von einem oder mehreren
Interferenzfaktoren, die jeder Probe zueigen waren, erzeugt wurden, unabhängig zu
messen. Nichtsdestoweniger lässt
die Durchführung
solcher interner Kontrollen vermuten, dass die verschiedenen Interferenzfaktoren
bekannt und definiert sind, und dass mit jedem definierten Interferenzfaktor
eine unterschiedliche Kontrolle verbunden ist. Dieser Ansatz erlaubt
es, die spezifische Signalintensität in bezug auf jede der unspezifischen Interaktionen,
die definiert wurden, genau zu messen; dagegen erlaubt es das System
nicht, durch die Vermittlung einer einzigen und einzigartigen Kontrolle,
eine umfassende Bewertung des allgemeinen Hintergrundrauschens,
das möglicherweise
durch die Gesamtheit bekannter oder unbekannter Interaktionsfaktoren,
welche in der Probe vorhanden sind, erzeugt wird, zu erhalten.
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Für dieses
Problem liefert kein vorheriges Dokument eine Lösung.
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Demnach
beläuft
sich, ohne die Möglichkeit der
Bewertung eines geeigneten Reaktionsschwellenwerts für die analysierte
Probe, die Interpretation der Ergebnisse der meisten Immunodot-Tests
auf die zwei folgenden Möglichkeiten:
der Test ist positiv, wenn auf der Höhe des Testbereichs eine Färbung sichtbar
ist, und der Test ist im Falle einer nicht auftretenden Färbung negativ.
Wenn das System effektiv funktioniert, und zwar in den Fällen, bei
denen eine starke Färbung
oder eine vollständige
Abwesenheit der Färbung
deutlich ist, ist offenkundig, dass die Interpretation der Ergebnisse
der Subjektivität
des Betrachtenden unterworfen ist, wenn nur eine Spur einer Färbung sichtbar
ist. Diese Spur kann die Reflexion einer spezifischen Antigen-Antikörper-Interaktion,
jedoch einfach auch nur ein Hintergrundrauschen sein.
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Die
vorliegende Erfindung hat zum Ziel, diese Probleme dadurch zu lösen, dass
sie ein Verfahren von der Art wie vorstehend beschrieben bereitstellt,
das die Einrichtung einer in den Test integrierten Auto-Standardisierung
mit einer unterschiedlichen Reaktionsschwelle für jede Probe erlaubt, die hinsichtlich
der Funktion der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Probe
selbst und den Bedingungen, unter denen der Test ausgeführt wird,
variabel sein kann.
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Das
gestellte Problem wurde durch ein Verfahren, wie vorstehend beschrieben,
gelöst,
wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet wird, dass:
mindestens
ein unspezifischer Ligand fixiert ist auf einem Kontrollbereich
eines Schwellenwertes, mit einer Konzentration dergestalt, dass
die Intensität
des Markierungssignals, welches dort in einer Schwellenwert-Probe
aus biologischer Flüssigkeit
festgestellt wurde, der Intensität
dieser Schwellenwert-Probe auf dem Testbereich entspricht,
wobei
der mindestens eine unspezifische Ligand des Schwellenwert-Kontrollbereichs
in der Lage ist, einem Potenzial an Hintergrundrauschen Rechnung
zu tragen, erzeugt auf mindestens einem Testbereich durch eine Gesamtheit
von unspezifischen Interaktionsfaktoren, welche mit den Eigenschaften
der Probe selbst und mit den Bedingungen, unter denen der Test ausgeführt wird,
zusammenhängen,
und
wobei das Verfahren einen Vergleich umfasst zwischen der Markierungs-Signalintensität des Testbereichs
und des Schwellenwert-Kontrollbereichs, welche erhalten werden durch
die zu analysierende Probe, wobei die Probe als positiv zu erachten
ist, wenn die Intensität
des Markierungssignals des Versuchsbereichs größer ist, verglichen mit der
Intensität
des Schwellenwert-Kontrollbereichs.
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Die
Probe biologischer Flüssigkeit,
die Schwellenwert-Probe genannt wird, ist eine Probe aus einer statistisch
signifikanten Menge, die bei einer Analyse derselben durch Standard-Referenzverfahren
als negativ diagnostiziert wurde, die jedoch bei ihrer Anwendung
auf einem Testbereich eines Immunodot-Nachweisverfahrens eine Markierungssignal- Intensität ergab,
die einem Schwellenwert entsprach, wie er statistisch oder geschätzt (je
nachdem, ob das Ablesen mit oder ohne Messgerät durchgeführt wird) hinsichtlich der
Verteilung der durch die Gesamtheit der negativen Proben dieser Menge
gegebenen Werte berechnet werden kann. In dem Fall, in dem keine
negative Probe der Menge genau den Schwellenwert der Signalintensität, wie er berechnet
oder geschätzt
wurde, ergibt, kann die Schwellenwert-Probe, die für die Kalibrierung
verwendet wurde, eine Probe sein, bei der sich die Signalintensität dem Schwellenwert
mit ausreichender Genauigkeit annähert, oder sie kann ein künstlich hergestellter
Kalibriergeräts
sein (im Allgemeinen ein gelöstes
positives Serum), der die gewünschte
Signalintensität
ergibt und der deshalb für
die Schwellenwert-Probe
als repräsentativ
erachtet wird.
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Die
Intensität
des Markierungssignals, die auf dem Kontrollbereich eines Schwellenwertes
mit dieser Schwellenwert-Probe erzielt wird, ist somit ausschließlich auf
ein Hintergrundrauschen zurückzuführen, ob
dies nun aus Interferenzen außerhalb des
Analyten oder aus unspezifischen Bindungen des Analyten auf dem
unspezifischen Liganden resultieren. Die Erfahrungen haben gezeigt,
dass die Intensität
des Markierungssignals der Proben, die auf dem Kontrollbereich des
Schwellenwertes getestet wurden, bei der Anwendung des Nachweisverfahrens
gemäß der Erfindung,
von Probe zu Probe variierte und somit dem Wert eines Hintergrundrauschens
entsprach, das der jeweiligen Probe zueigen war. Darüber hinaus
ist es bemerkenswert, festzustellen, dass die Intensität des Markierungssignals auf
dem Kontrollbereich eines Schwellenwerts über der liegt, die auf dem
Testbereich erzielt wurde. Das System trägt demnach durchaus einem Potential
an Hintergrundrauschen Rechnung, das in einer Probe auf einem Testbereich
erzeugt werden kann, und nicht dem Hintergrundrauschen, das tatsächlich von dieser
Probe auf diesem Testbereich erzeugt wurde. Durch den Vergleich
mit der Intensität
des Markierungssignals, das auf dem Testbereich erzielt wurde, erhält man eine
direkte und automatisch korrigierte Bestimmung des positiven oder
negativen Charakters der Probe, je nachdem ob die Intensität auf dem Testbereich
größer oder
kleiner ist als die Intensität auf
dem Kontrollbereich des Schwellenwertes.
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Es
ist zu bemerken, dass, für
das Verfahren gemäß der Erfindung
der unspezifische Ligand des Kontrollbereichs des Schwellenwertes
einem Potenzial an Hintergrundrauschen, das durch unspezifische
Interaktionen, die durch die Probe hervorgerufen wurden, erzeugt
wird, Rechnung trägt,
Interaktionen, die weder unbedingt bekannt noch definiert sind. Ein
solcher Nachweis umfasst darüber
hinaus einen einzigen und einzigartigen Kontrollbereich des Schwellenwerts
für jede
zu analysierende Probe.
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Gemäß einer
vorteilhaften Umsetzungsform der Erfindung umfasst das Verfahren
- – ein
Inkontaktbringen der Probe zu analysierender biologischer Flüssigkeit
mit mindestens einem Liganden, welcher unspezifisch gegenüber dem mindestens
einen Analyten ist und welcher fixiert ist auf einem Kontrollreaktionsbereich
des festen Trägers,
- – eine
Adsorption und/oder eine Bindung von unspezifischen Interaktionsfaktoren
der Probe auf dem mindestens einen unspezifischen Liganden des Kontrolheaktionsbereichs,
- – eine
Markierung des mindestens einen unspezifischen Liganden des Kontrollreaktionsbereichs und
der gebundenen Interaktionsfaktoren mit einem Tracer,
- – einen
Nachweis des Markierungs-Tracers auf dem mindestens einen unspezifischen
Liganden des Kontrollreaktionsbereichs und der gebundenen Interaktionsfaktoren
durch Bestimmung einer Markierungssignalintensität,
- – wobei
der mindestens eine unspezifische Ligand des Kontrollreaktionsbereichs
so auf diesem fixiert ist, dass die Intensität des bestimmten Markierungssignals
nachweisbar ist, wenn das Nachweisverfahren unter Standardbedingungen
angewendet wurde.
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Das
Verfahren erlaubt es, sich dessen zu versichern, dass die Reihenfolge
der Testabschnitte eingehalten wurde und dass die verschiedenen
verwendeten Bestandteile funktionieren. Der Versuch ist nicht gültig, wenn
auf dem Kontrollreaktionsbereich nicht eine erhöhte Markierungssignalintensität erscheint.
Damit der mindestens eine unspezifische Ligand des Kontrollbereichs
einen wirksamen Nachweis gewährleistet,
kann man seine Konzentration oder seine Eigenschaften verändern.
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Die
Erfahrungen haben gezeigt, dass, was die Kontrollbereiche des Schwellenwerks
betrifft, die Kontrollreaktionsbereiche Markierungssignalintensitäten zeigen,
die variabel sind, das heißt,
die der analysierten Probe entsprechen, und dies, weil alle von ihnen
eine Signalintensität
auf Grund eines Hintergrundrauschens umfassen, die der Probe entspricht.
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Gemäß einer
verbesserten Umsetzungsform der Erfindung umfasst das Verfahren
- – ein
Inkontaktbringen der Probe biologischer Flüssigkeit mit mindestens einem
weiteren Liganden, welcher spezifisch ist für mindestens einen weiteren
nachzuweisenden Analyten und welcher fixiert ist auf mindestens
einem weiteren Testbereich des festen Trägers,
- – eine
Bindung zwischen dem mindestens einen weiteren Analyten und seinem
spezifischen Liganden,
- – eine
Markierung des mindestens einen weiteren Liganden und des mindestens
einen weiteren gebundenen Analyten mittels eines Tracers und
- – einen
Nachweis des Markierungs-Tracers auf dem mindestens einen weiteren
Liganden und dem mindestens einen weiteren gebundenen Analyten durch
Bestimmung einer Markierungssignalintensität,
- – wobei
jeder weitere spezifische Ligand in seinem weiteren Testbereich
in einer Konzentration so fixiert ist, dass die Intensität des Markierungssignals,
welche dort für
eine Schwellenwertprobe für
den korrespondierenden weiteren Analyten festgestellt wurde, gleich
oder geringer ist verglichen mit der Markierungssignalintensität, die in dem
Schwellenwert-Kontrollbereich erhalten wurde, und
- – einen
Vergleich zwischen der Markierungssignalintensität jedes weiteren Testbereichs
und jener des Bereichs der Schwellenwert-Kontrolle, welche erhalten
wurden durch die zu analysierende Probe, wobei diese als positiv
zu erachten ist für
einen weiteren Analyten, wenn die Markierungssignalintensität des weiteren
Testbereichs, welcher diesem weiteren Analyten entspricht, größer ist
als die des Schwellenwert-Kontrollbereichs.
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Es
ist des weiteren möglich,
den Nachweis mehrerer verschiedener Analyten durchzuführen, indem
man sich auf einen einzigen Schwellenwert-Kontrollbereich für jede Probe
bezieht.
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Der
mindestens eine unspezifische Ligand, der auf dem Schwellenwert-Kontrollbereich fixiert
ist, kann mit dem mindestens einen unspezifischen Liganden, der
auf dem Kontrollreaktionsbereich fixiert ist, übereinstimmen, jedoch in einer
schwächeren Konzentration.
Er kann ebenfalls unterschiedliche Stoffe beinhalten.
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Der
mindestens eine unspezifische Ligand der Schwellenwert-Kontrolle
kann zum Beispiel umfassen:
- – einen
Antikörper,
einschließlich
monoclonaler Antikörper,
die oder die nicht gegen ein oder mehrere in der Probe enthaltene
Antigene gerichtet sind, zum Beispiel gegen Immunglobuline tierischer
oder menschlicher Art,
- – ein
Antigen, das oder das nicht gegen ein oder mehrere Antikörper gerichtet
ist, das/die in der Probe enthalten ist/sind,
- – ein
Protein, wie das Protein A, das Protein G oder das Protein L, das
in der Lage ist, an das Fragment Fc bestimmter Immunglobuline zu
binden,
- – einen
natürlichen
Stoff, wie Rinderserumalbumin (BSA) oder Kuhmilchproteine (zum Beispiel Casein),
der in der Lage ist, über
den Umweg von nichtstereokomplementären Protein-Protein-Interaktionen
unspezifisch an bestimmte Polypeptide zu binden,
- – eine
synthetische oder nicht-synthetische Sequenz aus Aminosäuren, wie
zum Beispiel ein synthetisches Peptid, ein Hapten, Polylysin, die
in der Lage ist, unspezifische Interaktionen mit bestimmten organischen
Molekülen
durchzuführen,
- – eine
synthetische oder natürliche
Nucleotidsequenz, wie zum Beispiel DNA (einzel- oder doppelsträngig) oder
RNA.
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Die
Auswahl des Liganden oder des Gemischs aus Liganden der idealen
Schwellenwert-Kontrolle hängt
im Allgemeinen von der Art des Tests und demnach von den Eigenschaften
der unspezifischen Interaktionsfaktoren ab, die in der Lage sind,
sich in diesem besonderen Fall zu zeigen, ist jedoch nicht darauf
beschränkt.
Die ideale Konzentration des Liganden oder des Gemischs aus Liganden, die
auf dem Schwellenwert-Kontrollbereich aufzubringen sind, wird ihrerseits
ausschließlich
während des
Kalibrierungsverfahrens wie zuvor beschrieben, definiert.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren einen Kit zum Nachweis
eines Analyten.
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Dieser
Kit umfasst:
- – einen festen Träger,
- – einen
Liganden, welcher spezifisch für
mindestens einen nachzuweisenden Analyten ist und welcher fixiert
ist auf mindestens einem Testbereich des festen Trägers, und
welcher nach Inkontaktbringen mit der zu analysierenden Probe an den
mindestens einen nachzuweisenden Analyten bindet, in Anwesenheit
desselben,
- – einen
Tracer, der in der Lage ist, den spezifischen Liganden und den mindestens
einen gebundenen Analyten zu markieren, indem er seinen Nachweis
durch Bestimmung einer Markierungssignalintensität ermöglicht,
- – einen
Liganden, der unspezifisch ist gegenüber dem mindestens einen Analyten
und der auf einem Kontrollbereich des festen Trägers fixiert ist und der nach Inkontaktbringen
mit der zu analysierenden Probe an ihm eine Adsorption und/oder eine
Bindung unspezifischer Interaktionsfaktoren ermöglicht, welche durch die Probe
verursacht sind, und
- – einen
Tracer, der in der Lage ist, den unspezifischen Liganden und die
gebundenen Interaktionsfaktoren zu markieren, indem sein Nachweis durch
Bestimmung einer Markierungssignalintensität ermöglicht wird,
wobei
dieser Kit darüber
hinaus, erfindungsgemäß, mindestens
einen unspezifischen Liganden enthält, der auf dem Schwellenwert-Kontrollbereich
des festen Trägers
in einer derartigen Konzentration fixiert ist, dass die Markierungssignalintensität, die hier
für eine
Schwellenwertprobe biologischer Flüssigkeit bestimmt wurde, der
Intensität
dieser Schwellenwertprobe auf dem Testbereich entspricht, wobei
der mindestens eine unspezifische Ligand des Schwellenwert-Kontrollbereichs
in der Lage ist, einem Potenzial an Hintergrundrauschen Rechnung
zu tragen, das auf mindestens einem Testbereich durch eine Gesamtheit
an unspezifischen Interaktionsfaktoren, die mit den Eigenschaften
der Probe selbst und mit den Bedingungen, unter denen der Test ausgeführt wird, zusammenhängen, erzeugt
wird,
wobei die zu analysierende Probe als positiv zu erachten
ist, wenn die Markierungssignalintensität des Testbereichs größer ist
als diejenige des Schwellenwert-Kontrollbereichs.
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Besondere
Details hinsichtlich des Nachweisverfahrens und des Kits gemäß der Erfindung sind
in den nachfolgenden Patentansprüchen
aufgeführt.
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Andere
Details und Besonderheiten der Erfindung ergehen aus der nachfolgenden
Beschreibung, unter Bezugnahme auf die angehängten Zeichnungen.
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1. Bestimmung der Konzentration
des spezifischen Liganden auf dem Testbereich
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Der
spezifische Ligand für
den nachzuweisenden Analyten wird in Reihe verdünnt, im Allgemeinen in einer
physiologischen Kochsalzlösung
in 10 Konzentrationen, die im Allgemeinen von 1 bis 0,1 μg/ml variieren.
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Jede
Verdünnung
wird in Form von Tröpfchen
von 1 Mikroliter auf verschiedene Abschnitte einer Membran, im Allgemeinen
aus Nitrocellulose aufgebracht, wobei die Gesamtheit ein Bändchen darstellt.
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Die
so hergestellten Bändchen
werden auf einer Menge an statistisch signifikanten positiven und negativen
Proben, gemäß einem
für den
Fachmann gängigen
Verfahren hergestellt.
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Die
ideale Konzentration des spezifischen Liganden (hier Konzentration
X genannt) ist jene, die die beste visuelle Unterscheidung zwischen
der positiven Probe, die die schwächste Intensität ergibt
und der negativen Probe, die die stärkste Intensität ergibt, gewährleistet.
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2. Bestimmung der Konzentration
des mindestens einen unspezifischen Liganden auf dem Schwellenwert-Kontrollbereich
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Der
spezifische Ligand wird in der vorstehend bestimmten Konzentration
(hier Konzentration X genannt) auf einem Abschnitt der Membran aufgebracht,
und dieser Testbereich dient hier als Bezugnahme.
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Der
mindestens eine unspezifische Ligand wird in Reihe verdünnt und
wie unter 1 beschrieben, auf dem Rest der freien Membranabschnitte
der Bändchen
aufgebracht.
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Die
Bändchen
werden mit derselben Menge an Proben getestet.
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Eine
negative Probe, die auf dem Testbereich (die den spezifischen Liganden
der Konzentration X enthält)
eine Schwellenintensität
ergibt, dergestalt, dass sie gemäß einem
dem Fachmann geläufigen
Verfahren berechnet oder geschätzt
werden kann, wird verwendet, um den Schwellenwert zu kalibrieren:
die ideale Konzentration (hier Konzentration Y genannt) des unspezifischen
Liganden ist jene, die auf dem Kontrollbereich des Schwellenwerts
eine Färbungsintensität ergibt,
die mit jener übereinstimmt,
die auf dem Testbereich beobachtet wurde.
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Die
Gesamtheit der anderen Proben erlaubt die Validierung des so bestimmten
Schwellenwerts: alle positiven Proben ergeben eine höhere Intensität gegenüber dem
Schwellenwert und alle negativen Proben ergeben eine gegenüber dem
Schwellenwert geringere Intensität,
ungeachtet der Spezifitätsgrenzen
und der Testempfindlichkeit, so, wie durch das Berechnungs- beziehungsweise
Schätzungsverfahren
geboten. Die Intensität
des bestimmten Schwellenwerts variiert selbst als Folge der physikalisch-chemischen
Eigenschaften jeder Probe.
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3. Test mehrerer
Analyten
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Die
Entwicklung eines Tests mehrerer Analyten beinhaltet in einem ersten
Schritt, das unter 1 und 2 vorstehend beschriebene Verfahren für einen
einzigen dieser Analyten zu verfolgen. Man bestimmt demnach die
ideale Konzentration des mindestens einen unspezifischen Liganden
(hier Konzentration Y genannt) für
diesen Analyten. Der mindestens eine unspezifische Ligand wird in
der vorstehend bestimmten Konzentration (sei Konzentration Y) auf
einem Membranabschnitt aufgebracht, und dieser Bereich dient hier
als Bezugnahme.
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Die
anderen spezifischen Liganden der anderen Analyten werden jeder
in Reihe verdünnt
und, wie unter 1, auf dem Rest der freien Membranabschnitte der
Bändchen
aufgebracht. Die Bändchen werden
auf einer für
die anderen, oben genannten Analyten statistisch signifikanten Menge
an Proben getestet.
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Entsprechend
zu dem unter 2 beschriebenen Verfahren bestimmt man also die ideale
Konzentration jedes anderen spezifischen Liganden der anderen Analyten
mit Bezug auf den mindestens einen unspezifischen Liganden der Konzentration
Y, das heißt
als Funktion eines einzigen und gleichen Schwellenwerts.
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Zusätzlich ist
es im Allgemeinen möglich, eine
Reaktionskontrolle in den Test einzufügen, indem man auf einen Membranabschnitt
eine gesättigte
Konzentration des mindestens einen unspezifischen Liganden der Schwellenwert-Kontrolle
platziert (Konzentration im Allgemeinen 50 bis 100 Mal höher als
die Konzentration, die für
die Schwellenwert-Kontrolle verwendet wird).
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BEISPIELE
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A. Immunodot-Test für den Nachweis
von anti-Pyruvat-Dehydrogenase-Antikörper (M2)
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Immunodot
an 3 Membranbereichen: 1 Reaktionskontrolle, 1 Schwellenwertkontrolle,
1 Testbereich.
- – Verdünnungslösung der Liganden: 0,15 M NaCl in
destilliertem H2O
- – Spezifischer
Ligand: Pyruvat-Dehydrogenase (SIGMA P-7032) zu 0,25 mg/ml
- – Unspezifischer
Ligand der Schwellenwert-Kontrolle: Ziegen-Immunglobulin gegen das
ganze menschliche IgG Molekül
(SIGMA I-1886) zu 0,017 mg/ml.
- – Unspezifischer
Ligand der Reaktionskontrolle: Ziegen-Immunglobulin gegen das ganze
menschliche IgG Molekül
(SIGMA I-1886) zu 1 mg/ml.
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Man
trägt 1 μl von jedem
Liganden auf den entsprechenden Membranbereich auf, dann lässt man
es 24 Stunden bei Umgebungstemperatur trocknen.
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B. Immunodot-Test für den Nachweis
von antinucleären
Antikörpern
(ENA)
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Immunodot
an 8 Membranbereichen: 1 Reaktionskontrolle, 1 Schwellenwertkontrolle,
6 Testbereiche für
folgende anti-ENA-Antikörper:
Sm, RNP, SSA, SSB, JO-1, Scl-70.
- – Verdünnungslösung der
Liganden: 0,15 M NaCl in destilliertem H2O
- – Spezifische
Liganden: Sm-Antigen (IMMUNOVISION SMA-3000) zu 0,16 mg/ml, RNP-Antigen (IMMUNOVISION
SRC-3000) zu 0,19 mg/ml, SSA-Antigen
(IMMUNOVISION SSA-3000) zu 0,15 mg/ml, SSB-Antigen (IMMUNOVISION SSB-3000)
zu 0,08 mg/ml, JO-1-Antigen (IMMUNOVISION JO1-3000) zu 0,07 mg/ml,
Scl-70-Antigen (IMMUNOVISION SCL-3000) zu 0,07 mg/ml.
- – Ligand
der Schwellenwert-Kontrolle: Ziegen-Immunglobulin gegen das ganze
menschliche IgG Molekül
(SIGMA I-1886) zu 0,022 mg/ml.
- – Ligand
der Reaktionskontrolle: Ziegen-Immunglobulin gegen das ganze menschliche
IgG Molekül
(SIGMA I-1886) zu 1 mg/ml.
-
Man
trägt 1 μl von jedem
Liganden auf den entsprechenden Membranbereich auf, dann lässt man
es 24 Stunden bei Umgebungstemperatur trocknen.
-
C. Immunodot-Test für den Nachweis
von doppelsträngigen
Anti-DNA-Antikörpern
-
Immunodot
an 3 Membranbereichen: 1 Reaktionskontrolle, 1 Schwellenwertkontrolle,
1 Testbereich.
- – Verdünnungslösung der Liganden: 0,15 M NaCl, 20
mM Tris-HCl, pH 7,5.
- – Spezifischer
Ligand: doppelsträngiger
DNA-Extrakt aus Kälberthymus
(SIGMA D4522) zu 0,2 mg/ml.
- – Unspezifische
Liganden der Schwellenwertkontrolle (die angezeigten Konzentrationen
entsprechen den Endkonzentrationen im Gemisch): Gemisch aus einzelsträngiger DNA
(SIGMA D8899) zu 10 μg/ml,
Histon H1 (IMMUNOVISION HIS-1011) zu 2,5 μg/ml, Histon H2a (IMMUNOVISION
HIS 1002) zu 2,5 μg/ml,
Histon H2b (IMMUNOVISION HIS-1013) zu 2,5 μg/ml, Histone H3/H4 (IMMUNOVISION
HIS-1014) zu 2,5 μg/ml, BSA
zu 5 μg/ml.
- – Unspezifische
Liganden der Reaktionskontrolle (die angegebenen Konzentrationen
entsprechen den Endkonzentrationen im Gemisch): Ziegen-Immunglobulin
gegen das ganze menschliche IgG Molekül (SIGMA I-1886) zu 0,5 mg/ml und
von Immunglobulin von Kaninchen-Antikörper gegen das menschliche
IgM Molekül
(μ-Kette) (SIGMA
I-0140) zu 0,5 mg/ml.
-
Man
trägt 1 μl von jedem
Liganden auf den entsprechenden Membranbereich auf, dann lässt man
es 24 Stunden bei Umgebungstemperatur trocknen.
-
Die
angehängten 1 und 2 veranschaulichen
einen Vergleich der Interpretation der Ergebnisse, die durch ein
klassisches Nachweisverfahren und durch das Verfahren gemäß der Erfindung erzielt
wurden.
-
1 zeigt
fünf Bändchen 1 bis 5,
die im Handel erhältlich
sind, auf welchen Tropfen eines spezifischen Liganden für einen
in den Testbereichen 6 bis 10 bestimmten Analyten
aufgebracht worden sind. Jedes dieser Bändchen ist ebenfalls mit einem Kontrollreaktionsbereich 11 bis 15 ausgestattet,
wo ein unspezifischer Ligand in einer erhöhten Konzentration aufgebracht
wird, was eine Kontrolle darüber erlaubt,
ob die Reaktion auf angemessene Weise abläuft.
-
Des
Weiteren werden fünf
Proben auf den nachzuweisenden Analyten gemäß eines Verfahrens analysiert,
das für
sich bekannt ist, und hier nicht detailliert beschrieben wird. Am
Ende des Immunodot-Tests wird in jedem Bereich eine Signalintensität bestimmt.
Bei diesem Test handelt es sich um ein visuelles Signal, aber es
könnte
sich auch um ein Verfahren handeln, das die Erzeugung eines Signals
erlaubt, das durch Radiometrie, Fluoreszenz, Lumineszenz, etc. gemessen
werden kann. Wie festzustellen ist, ergeben die fünf Zonen
der Reaktionskontrolle 11 bis 15 ein sehr starkes
Signal, demnach sind die Tests gültig.
Es ist zu bemerken, dass die Signalintensitäten dieser Bereiche 11 bis 15 untereinander leicht
variabel sind, und zwar auf eine Weise, die auf der Zeichnung nicht
dargestellt werden kann, sie sind jedoch für das freie Auge wahrnehmbar.
-
Bereich 6 erlaubt
eine deutliche Verlangsamung, wenn die Probe negativ ist, und die
Proben, die den anderen Bereichen der Tests 7-16 entsprechen,
werden wahrscheinlich vom Laboranten als positiv bestimmt werden.
-
2 zeigt
fünf Bändchen 1' bis 5' gemäß der Erfindung,
auf denen sich die Testbereiche 6' bis 10' und die Kontrollreaktionsbereiche 11' bis 15' befinden und
die mit den Bereichen 6 bis 15 der Bändchen 1 bis 5,
die in der 1 veranschaulicht sind, identisch
sind, und demnach dieselbe Signalintensität ergeben.
-
Diese
Bändchen 1' bis 5' zeigen darüber hinaus
jedes einen Schwellenwert-Kontrollbereich 16 bis 20,
welche wie vorstehend beschrieben ausgeführt wurden. Die Signalintensitäten dieser
Bereiche sind von einer Bändchen
zur anderen leicht variabel, was zeigt, dass jede zu analysierende
Probe ein Potenzial an Hintergrundrauschen darstellt, das ihr entspricht.
-
Aus
dem veranschaulichten Test ergibt sich, dass die Probe, die der
Bändchen 3' entspricht,
unerwarteterweise als negativ zu betrachten ist. Ihre Signalintensität ist deutlich
niedriger als die der Schwellenwert-Kontrollzone. Der Schluss, den
man aus dem Test ziehen kann, war für den Fachmann, der das Nachweisverfahren
gemäß 1 verwendet
hat, nicht vorherzusehen.