DE69916273T2

DE69916273T2 - Verwendung von gastrin fragmenten oder sythetischen analogen von gastrin zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung der helicobacter pylori assozierten störungen

Info

Publication number: DE69916273T2
Application number: DE69916273T
Authority: DE
Inventors: Michael Y. Chowers; Yehuda Chowers
Original assignee: VECTA Ltd; Vecta Ltd
Current assignee: VECTA Ltd
Priority date: 1998-06-18
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2005-05-19
Anticipated expiration: 2019-06-18
Also published as: EP1087783B1; US20010020005A1; JP2003522105A; ATE263572T1; WO1999065513A3; CA2331834A1; WO1999065513A2; EP1087783A2; AU768612B2; DE69916273D1; AU4388299A; US6815414B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung gewisser Peptide bei der Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen für die Behandlung und/oder Vorbeugung von mit Helicobacter pylori verbundenen Störungen und auf Verfahren für die Behandlung solcher Störungen bei Patienten, die dessen bedürfen.
Die Helicobacter pylori (H. pylori)-Infektion ist verbunden mit etlichen gutartigen und bösartigen menschlichen Erkrankungen [C. P. Dooley et al., N. Engl. J. Med. (1989), 321: 1562–1566; J. Carrick et al., Gut (1989); 30: 790–797; A. Nomura et al., N. Engl. J. Med. (1991), 325: 1132–1136 [siehe Kommentare]; A. Nomura et al., Ann. Intern. Med. (1994), 120: 977–981 [siehe Kommentare]; E. Zucca et al., N. Engl. J. Med. (1998), 338: 804–810]. Die symptomatische Infektion ist jedoch nur die Spitze des Eisberges, die Mehrheit der infizierten Individuen verbleibt ohne Symptome. Weiterhin kann die Infektion, falls sie unbehandelt bleibt, für Jahrzehnte anhalten [W. L. Peterson und W. V. Harford (1991), 86: 671–675], was eine erfolgreiche Wirt-Parasiten-Beziehung darstellt. Diese günstige Wechselwirkung wird widergespiegelt in einer hohen Prävalenz der Infektion, die sich im Bereich zwischen 50% in entwickelten Ländern und bis zu 90% in Entwicklungsländern bewegt [D. Y. Graham et al., Dig. Dis. Sci. (1991), 36: 1084–1088; D. N. Taylor und M. J. Blaser, Epidemiol. Rev. (1991), 13: 42–59].
H. pylori hält sich in der Schleimschicht der menschlichen Magenschleimhaut auf. Wegen dem extrem niedrigen pH-Wert ist der Magen eine unwirtliche Umgebung für die meisten anderen Mikroorganismen. Die Fähigkeit von H. pylori, im Magen zu florieren, wurde Schutzmechanismen, wie seiner Herstellung von Urease, zugeschrieben, wodurch das Bakterium vor der Magensäure durch Schaffung einer basischen Mikroumgebung geschützt wird [D. N. Taylor und M. J. Blaser, Epidemiol. Rev. (1991), 13: 42–59]. Es wurde nun jedoch geltend gemacht, dass H. pylori einen Weg entwickelt haben könnte, einen Wachstumsvorteil in dieser besonderen Nische des Magens zu ziehen, möglicherweise durch Ausnutzen eines Magenfaktors. Ein logischer Kandidat würde einer sein, der durch die H. pylori-Infektion herauf reguliert wird.
Ein solcher Faktor ist das Magenhormon Gastrin. Gastrin wird als ein Prohormon durch innerhalb des Magenantrums lokalisierte G-Zellen hergestellt. Das Prohormon wird später zu kürzeren Peptiden verarbeitet, von denen das häufigste 17 Aminosäuren lang ist und als Gastrin 17 (G17) bezeichnet wird [K. A. Eaton et al., Infect. Immun. (1991), 59: 2470–2475]. Die Gastrin zugeschriebene Hauptrolle innerhalb des Magengewebes ist die Regulation der Säuresekretion. Nach der Infektion werden die Gastrinspiegel als fortwährend erhöht gefunden und die normale physiologische negative Rückkopplungskontrolle der Sekretion ist verloren. Weiterhin werden die Gastrinspiegel nach der H. pylori-Ausrottung reduziert und die normale Rückkopplungskontrolle der Gastrinsekretion wird wieder hergestellt [D. Y. Graham et al., Am. J. Gastroenterol. (1990), 85: 394–398; E. El-Omar et al., Gut (1993), 34: 1060–1065 [siehe Kommentare]; J. W. Konturek et al., Gut (1995), 37: 482–487).
Das Interesse an den Änderungen der Gastrinsekretion und -kontrolle wurde auf seine Rolle bei der Säureproduktion und die resultierende Peptidpathologie gerichtet. Die vorliegende Arbeit wurde jedoch auf mögliche Wechselwirkungen zwischen Gastrin und H. pylori konzentriert.
Wie nachfolgend gesehen werden wird, stimuliert Gastrin positiv das Wachstum von H. pylori, eine Erkenntnis, welche weiter die erfolgreiche Anpassung von H. pylori an den menschlichen Wirt beispielhaft erläutert und die Basis für die vorliegende Erfindung bereitstellt.
Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Peptides, welches ein synthetisches Analogen von Gastrin oder einem Gastrinfragment ist, und welches die wachstumsfördernde Wirkung von Gastrin auf H. pylori hemmt, bei der Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von mit H. pylori assoziierten Störungen. Bei der Verwendung gemäß der Erfindung kann diese Verbindung ein synthetisches Analogon von G17 sein, wobei es vorzugsweise die folgende Aminosäuresequenz umfasst: Trp-Met-Asp-PheNH₂.
Kurze Beschreibung der Figuren
1A bis 1B: Wachstumskinetiken von H. pylori in der Anwesenheit von Gastrin
Die Bakterien wurden in flüssigen Medien wachsen gelassen unter Verwendung von mikroaerophilen Bedingungen mit steigenden Gastrinkonzentrationen. Die Wachstumsrate wurde beurteilt durch die optische Dichte (OD). T bezeichnet die Zeit in Stunden.
1(A) zeigt eine repräsentative Wachstumskurve eines Isolates über 48 Stunden.
1(B) zeigt die kumulierten Wachstumsdaten von 5 unterschiedlichen klinischen Isolaten mit (3,7 pM) oder ohne Gastrin. Das Wachstum wird bei 0 h und 48 h verglichen (gezeigt als ein Mittelwert mit SEM).
2A bis 2F: Die Gastrin-Wachstumsstimulierung ist bakterien- und peptidspezifisch
Wachstumskinetische Analyse unterschiedlicher Bakterien mit Gastrin:
2A: wachstumskinetische Analyse von C. jejuni mit Gastrin;
2B: wachstumskinetische Analyse von E. coli mit Gastrin;
2C: wachstumskinetische Analyse von H. pylori mit dem gastrischen Peptid Somatostatin;
2D: wachstumskinetische Analyse von H. pylori mit EGF.
2E: wachstumskinetische Analyse von H. pylori mit dem menschlichen Gastrinrezeptoragonisten Pentagastrin;
2F: wachstumskinetische Analyse von H. pylori mit dem menschlichen Gastrinrezeptoragonisten CCK-8.
Die Bakterien wurden wachsen gelassen unter Verwendung von flüssigen Medien und die Wachstumsrate wurde beurteilt durch die optische Dichte (OD). T bezeichnet die Zeit in Stunden. Mit Ausnahme der aeroben Bedingungen, die für das Wachstum von E. coli verwendet wurden, waren sämtliche Wachstumsbedingungen identisch. Ein Experiment ist repräsentativ für drei (jedes durchgeführt mit einem unterschiedlichen Isolat).
3: Gastrinaufnahmeuntersuchung
H. pylori-(H. P.)-, E. coli-(E. C.)-, S. pneumonia-(S. P.)- und C. jejuni-(C. J.)-Bakterien wurden für 45 Minuten mit ¹²⁵I-markiertem Gastrin inkubiert. Die Inkubation geschah bei 4°C oder 37°C. Nach der anfänglichen Inkubation wurde Proteinase K (P. K.) für 30 Minuten hinzugefügt, wonach die Bakterien gewaschen und geblottet wurden. Ein Experiment ist repräsentativ für zwei.
4: Konkurrenz unterschiedlicher Peptide um die ¹²⁵I-markierte Gastrinaufnahme durch H. pylori
Bakterien wurden in der Anwesenheit von 500 nmol/l ¹²⁵I-markiertem Gastrin und steigenden Konzentrationen von entweder unmarkiertem Gastrin (G), CCK-8 (CCK), Pentagastrin (Pen), Somatostatin (Som) oder EGF für 45 Minuten inkubiert. Die Bakterien wurden gewaschen und die in den Bakterienpellets verbleibende Radioaktivität wurde bestimmt. Ein Experiment ist repräsentativ für drei.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die H. pylori-Infektion ist verbunden mit Zwölffingerdarmgeschwür, Magengeschwür, Magenadenokarzinom und B-Zell-Lymphom. Es wurde auch in Verbindung gebracht mit kardiovaskulären Erkrankungen, insbesondere Atherosklerose und Ischämie, da von ihr gezeigt wurde, dass die Infektion häufiger ist in Patienten, die an diesen Erkrankungen leiden. Das Bakterium hält sich innerhalb der Magenschleimhaut auf, eine einzigartige Nische, die unwirtlich ist für andere Mikroorganismen. Gastrin, ein Magenhormon, wird fortdauernd nach der H. pylori-Infektion erhöht. Es wurde nun herausgefunden, dass menschliches Gastrin das H. pylori-Wachstum in einem spezifischen, dosisabhängigen Mechanismus stimuliert, was einen neuen Ansatz für die Behandlung von H. pylori-Infektionen nahe legt.
Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, stimuliert das menschliche Hormon Gastrin das H. pylori-Wachstum signifikant in einer dosisabhängigen Weise. Diese Wirkung war reproduzierbar in sämtlichen untersuchten bakteriellen Isolaten. Die Wachstumsstimulation geschah bei physiologischen Gastrinkonzentrationen, wie sie im Blut und im Lumen des Magens gefunden werden [C. R. Mueller et al., Surgery (1991), 110: 1116–1124; K. Yamashita et al., Gastroenterology (1998), 115: 1123–1130].
Die Aufnahme von Gastrin durch H. pylori und die stimulierende Wachstumswirkung waren hochspezifisch und wurden nicht nachgewiesen mit Kontrollbakterien oder durch andere Peptide, die im Magenantrum oder -lumen vorhanden waren. Weiterhin legte die kalte Ligandeninhibition nahe, dass die Wirkung über eine spezifische Gastrinbindungsstelle vermittelt wurde. Gastrin, CCK-8 und Pentagastrin haben eine strukturelle Ähnlichkeit und aktivieren menschliche Gastrin/CCKB-Rezeptoren. In den vorliegenden Experimenten konkurrierten sowohl CCK-8 als auch Pentagastrin mit Gastrin um die Bindung an H. pylori, stimulierten jedoch nicht das bakterielle Wachstum. Die Konkurrenz durch strukturelle verwandte Verbindungen unterstützt die Annahme, dass eine spezifische Bindungsstelle bei der Gastrinaufnahme durch H. pylori involviert ist. Die Tatsache, dass die biologische Aktivität nur mit Gastrin erhalten werden konnte, wiederholt die spezifische Wechselwirkung von H. pylori mit diesem Hormon.
In Anbetracht der vorliegenden Ergebnisse könnte die Wirt-Parasiten-Wechselwirkung zwischen dem menschlichen Wirt und H. pylori angesehen werden, als ob sie entwickelt wurde, um Gastrin durch das Bakterium auszunützen. H. pylori kolonisiert bevorzugt das gastrische Antrum, die anatomische Örtlichkeit von Gastrin produzierenden G-Zellen [E. Gayerdorffer et al., Gastroenterology (1992), 102: 1575–1582]. Zusätzlich resultiert die Infektion in Hypergastrinämie und einem Verlust der negativen Rückkopplungskontrolle auf die Gastrinsekretion, was möglicherweise zu der fortdauernden Aussetzung der Bakterien an hohe Spiegel von Gastrin führt.
Das histologische Kennzeichen der H. pylori-Infektion ist die chronische Antrumentzündung. Als ein Ergebnis dieser Entzündung wurden erhöhte Spiegel entzündungsfördernder Cytokine dokumentiert [J. E. Crabtree et al., Gut (1991), 32: 1473–1477; R. Karttunen et al., Gut (1995), 36: 341–345; L. A. Noach et al., Scand. J. Gastroenterol. (1994), 29: 425–429; J. E. Crabtree et al., Scand. J. Immunol. (1993), 37: 65–70]. Unter Verwendung von in vitro-Kulturen wurde gezeigt, dass endokrine Zellen Gastrin in Antwort auf die Stimulierung mit solchen entzündlichen Cytokinen produzieren können [F. S. Lehmann et al., Am. J. Physiol. (1996), 270: 783–788; N. Weigert et al., Gastroenterology (1996), 110: 147–154; I. L. Beales et al., Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. (1997), 9: 773–777; J. L. Wallace et al., Am. J. Physiol. (1991), 261: G559–564]. Folglich kann H. pylori tatsächlich von der Immunantwort des Wirtes profitieren, welche die Heraufregulation eines bakteriellen Wachstumsfaktors in Gang setzt.
Modelle, basierend auf Eigenschaften von H. pylori und der Wirt-Parasiten-Wechselwirkung, wurden vorgeschlagen. Lee schlug vor, dass die außergewöhnlich geringe Größe des H. pylori-Genoms und die geringe Anzahl regulatorischer Gene anzeigen könnten, dass das Bakterium gut an ein hochspezifisches einzelnes Habitat angepasst ist [A. Lee, N. Engl. J. Med. (1998), 338: 832–833]. Die Erkenntnis, dass H. pylori Gastrin, ein Magenhormon, verwendet, steht in Übereinstimmung mit diesem Vorschlag. Weiterhin führte die Chronizität und Dauerhaftigkeit der H. pylori-Infektion in dem menschlichen Wirt Blaser dazu, vorzuschlagen, dass die Interaktion zwischen Bakterium und Wirt wechselseitig reguliert wird. Solch eine Regulation lässt auf eine gleichzeitige Entwicklung schließen [M. J. Blaser, J. Clin. Invest. (1997), 100: 759–762). Eine erhöhte Gastrinsekretion als eine Folge der Infektion und die mögliche Ausnutzung von Gastrin durch das Bakterium passt zu diesem Konzept.
Die Therapie der peptischen Ulcuserkrankung vor der Entdeckung der zentralen Rolle von H. pylori wurde auf Mittel basiert, die in der Lage sind, Magensäure zu reduzieren. Basierend auf der Metaanalyse vielfacher Wege, die darauf zielten, peptische Ulci zu heilen, wurde gezeigt, dass es keinen Vorteil gibt, den pH-Wert über 3 für mehr als 18 Stunden täglich anzuheben. Immer noch werden zahlreiche Gruppen an Mitteln verwendet, um die Magensäure zu reduzieren. Die wichtigsten dieser Mittel sind die H2-Rezeptorantagonisten und die Protonenpumpeninhibitoren. H2-Rezeptorantagonisten wirken durch Hemmen der Histamin-H2-Rezeptoren auf den Belegzellen. Protonenpumpeninhibitoren wirken durch die Inhibition der H⁺K⁺-ATPase der Belegzellen, die verantwortlich ist für die Säuresekretion aus den Zellen.
Gegenwärtige Therapien der H. pylori-Infektionen bestehen gewöhnlich aus Kombinationen von zwei antibiotischen Mitteln gemeinsam mit einem begleitenden Mittel, das gewöhnlich entweder ein Protonenpumpeninhibitor oder Wismut ist. Die Antibiotikaresistenz von H. pylori ist weit verbreitet, mit steigender Prävalenz [S. L. Hazell, Eur. J. Clin. Infect. Dis. (1999), 18: 83–86]. Die mit H. pylori verbundene Infektion ist ein eher gewöhnliches Phänomen, was in einer massiven Verwendung von Antibiotika resultiert, welche manchmal auch symptomatischen Trägern verschrieben werden. Diese massive Verwendung kann die Option der Behandlung dieser Erkrankung durch gegenwärtig erhältliche Arzneimittel ausschöpfen und die Resistenz des Bakteriums kann später das Ausmaß des Erfolges der Therapie der H. pylori-Infektion angreifen, ebenso wie andere infektiöse Agenzien, die resistent werden können, als eine Sekundärwirkung der übermäßigen Verwendung von Antibiotika.
Die vorliegenden Erkenntnisse legen nahe, dass Gastrin der Faktor sein könnte, auf dem H. pylori gedeiht, und bei seinem Fehlen wird das Bakterium nicht in der Lage sein, in dem Magenantrum zu überleben. Der durch Gastrin für H. pylori bereitgestellte Wachstumsvorteil kann der Grund für die Fähigkeit dieses Bakteriums sein, in diesem unwirtlichen Habitat zu florieren.
Es ist diese neu entdeckte Beziehung zwischen Gastrin und H. pylori, die die Basis für alternative, nicht auf Antibiotika basierende verbesserte Therapien zahlreicher Erkrankungen, die mit der H. pylori-Infektion verbunden sind, insbesondere jene des Gastrointestinaltraktes, bereitstellt.
Folglich bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung eines Peptides, das ein synthetisches Analogon von Gastrin ist oder eines Fragmentes von Gastrin ist, und welches den wachstumsverstärkenden Effekt von Gastrin auf H. pylori inhibiert, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung und/oder Vorbeugung von mit H. pylori verbundenen Störungen. Wahlweise umfassen die Zusammensetzungen weiterhin pharmazeutisch annehmbare Träger, Hilfsmittel oder Verdünnungsmittel.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann besonders geeignet sein für die Behandlung und/oder Vorbeugung von mit H. pylori assoziierten gastrointestinalen Störungen, besonders mit H. pylori assoziierten peptischen Magen- und/oder Zwölffingerdarmerkrankungen. Zusätzlich können die Zusammensetzungen für die Behandlung von Gastritis, Duodenitis, nicht ulcerativer Dyspepsie, Lymphom des schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebes, für die Vorbeugung von Magenkarzinom und bei der Behandlung atherosklerotischer kardiovaskulärer Erkrankungen verwendet werden.
Der aktive Bestandteil in den pharmazeutischen Zusammensetzungen ist in der Lage, die Gastrinaufnahme durch H. pylori zu inhibieren und kann ein kompetitiver Inhibitor der Gastrinaufnahme durch H. pylori oder ein Antagonist des menschlichen oder des Gastrinrezeptors von H. pylori sein.
Bevorzugte Peptide sind synthetische Analoga von Gastrin oder eines Fragmentes von Gastrin, umfassend eine Aminosäuresequenz, entsprechend dem C-Terminus von Gastrin oder einem Gastrinfragment, vorzugsweise G17. Solche bevorzugten Peptide umfassen die Aminosäuresequenz: Trp-Met-Asp-PheNH₂. Besondere Beispiele synthetischer Peptide, die als das aktive Prinzip in den Zusammensetzungen verwendet werden können, sind Pentagastrin oder Cholecystokinin (CCK)-8.
Pentagastrin ist ein synthetisches Gastrinanalogon, das die biologische Wirkung von Gastrin ausübt. Die hauptsächliche klinische Verwendung dieser Verbindung war die Stimulation der Säuresekretion in einem diagnostischen Test, der benötigt wurde für den Ausschluss von Achlorhydrie (die Säurestimulation geschieht innerhalb von 10 Minuten und erreicht ihren Gipfel innerhalb von 20 bis 30 Minuten). Pentagastrin ersetzte die Verwendung von Histamin in solchen Untersuchungen, da es mildere Nebenwirkungen hat.
Synthetische Peptide, die in der Erfindung verwendet werden, können in der Form eines Dimeres, eines Multimeres oder in einer erzwungenen Konformation vorliegen, wobei die erzwungene Konformation erhalten wird durch innere Brücken, kurz reichende Zyklisierungen, Ausdehnungen oder durch andere chemische Modifikation.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind nützlich für die Behandlung und/oder Vorbeugung von mit H. pylori assoziierten Störungen in einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, durch die Applikation einer therapeutisch wirksamen Menge des Peptides an diesen Patienten, welches den wachstumserhöhenden Effekt von Gastrin auf H. pylori inhibiert.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden im Allgemeinen Salze, vorzugsweise in physiologischer Konzentration, wie z. B. PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) oder Natriumchlorid (0,9% w/v), und ein Puffermittel, wie z. B. Phosphatpuffer in der obigen PBS, enthalten. Die Zubereitung pharmazeutischer Zusammensetzungen ist im Stand der Technik wohl bekannt, siehe z. B. die US-Patente mit den Nrn. 5,736,519, 5,733,877, 5,554,378, 5,439,688, 5,418,219, 5,354,900, 5,298,246, 5,164,372, 4,900,549, 4,755,383, 4,639,435, 4,457,917 und 4,064,236. Der aktive Bestandteil der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, das heißt das Peptid oder pharmakologisch annehmbare Salze davon, wird vorzugsweise mit einem Auszugsmittel, einem Trägermittel, einem Verdünnungsmittel und wahlweise einem Konservierungsmittel oder mit pharmazeutisch annehmbaren Vehikeln, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, siehe z. B. die obigen US-Patente, vermischt. Beispiele von Auszugsmitteln schließen Glukose, Mannitol, Inositol, Suchrose, Lactose, Fructose, Stärke, Maisstärke, mikrokristalline Zellulose, Hydroxypropylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose und Polyvinylpyrrolidon ein. Wahlweise kann auch ein Verdickungsmittel hinzugefügt werden, wie ein natürlicher Gummi, ein Zellulosederivat oder ein Acryl- oder Vinylpolymer.
Die pharmazeutische Zusammensetzung wird in fester, flüssiger oder halbfester Form bereitgestellt. Eine feste Zubereitung kann durch Vermischen der obigen Bestandteile zubereitet werden, um eine puderige Zubereitung bereitzustellen. Alternativ wird die pharmazeutische Zusammensetzung als eine lyophilisierte Zubereitung bereitgestellt. Die flüssige Zubereitung wird bevorzugt als eine wässrige Lösung, wässrige Suspension, ölige Suspension oder als eine Mikrokapsel-Zusammensetzung bereitgestellt. Eine halbfeste Zusammensetzung wird bevorzugt als ein wässriges oder öliges Gel oder Unguentum bereitgestellt. Ungefähr 0,001 bis 60% w/v, vorzugsweise ungefähr 0,05 bis 25% w/v des aktiven Mittels wird in der Zusammensetzung bereitgestellt.
Eine feste Zusammensetzung kann zubereitet werden durch Vermischen eines Auszugsmittels mit einer Lösung des aktiven Mittels, das in der Zusammensetzung der Erfindung umfasst ist, schrittweises Hinzufügen einer kleinen Menge an Wasser und durch Verkneten der Mischung. Nach dem Trocknen, vorzugsweise im Vakuum, wird die Mischung pulverisiert. Eine flüssige Zusammensetzung kann zubereitet werden durch Auflösen, Suspendieren oder Emulgieren der aktiven Verbindung in Wasser, einer Pufferlösung oder Ähnlichem. Eine ölige Suspension kann zubereitet werden durch Suspendieren oder Emulgieren der aktiven Verbindung in einer ölhaltigen Basis wie Sesamöl, Olivenöl, Maiskeimöl, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Lanolin, Provaseline, Paraffin, Isopar, Silikonöl, Fettsäuren von 6 bis 30 Kohlenstoffatomen oder den entsprechenden Glycerol- oder Alkoholestern. Puffer schließen Sorensen-Puffer [Ergeb. Physiol (1912), 12: 393], Clark-Lubs-Puffer [J. Bact. (1917), 2(1): 109 und 191], MacIlvaine-Puffer [J. Biol. Chem. (1921), 49: 183], Michaelis-Puffer (Die Wasserstoffionenkonzentration, S. 186, 1914) und Kolthoff-Puffer [Biochem. Z. (1926), 179: 419] ein.
Eine Zusammensetzung kann zubereitet werden als ein wässriges Gel, z. B. für die transnasale Applikation. Eine wässrige Gelbasis wird aufgelöst und dispergiert in wässriger Lösung, enthaltend einen Puffer und dieses aktive Mittel, und die Lösung wird erwärmt oder abgekühlt, um ein stabiles Gel zu ergeben.
Vorzugsweise wird die Zusammensetzung durch die intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Applikation verabreicht. Von der oralen Applikation wird erwartet, dass sie weniger wirksam ist, besonders da die wirksame Verbindung ein Peptid ist, weil das Peptid verdaut werden könnte, bevor es aufgenommen wird. Selbstverständlich wird diese Überlegung weniger auf ein aktives Peptid zutreffen, das modifiziert wird, z. B. indem es ein cyclisches Peptid ist, indem es nicht natürlich vorkommende Aminosäuren wie D-Aminosäuren enthält, oder durch eine andere Modifikation, die die Resistenz des Peptides auf den Bioabbau verstärkt. Die Zersetzung im Verdauungstrakt kann reduziert werden durch die Verwendung gewisser Zusammensetzungen, z. B. durch Einschließen des Peptides in Mikrokapseln, wie Liposomen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch an andere Schleimhäute verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird dann in der Form eines Zäpfchens, Nasensprays oder einer Sublingualtablette bereitgestellt. Die Dosis des Peptides kann von dem zu behandelnden Zustand, dem Alter des Patienten, dem Körpergewicht und dem Applikationsweg abhängen und wird durch den begleitenden Arzt bestimmt werden. Die Dosen des Peptides bewegen sich im Bereich von 0,1 μg/kg bis 100 mg/kg oder höher, vorzugsweise von 0,5 μg/kg bis 5 mg/kg, bevorzugter von 0,1 μg/kg bis 1 mg/kg, am bevorzugtesten bei ungefähr 100 μg/kg.
Die Aufnahme des Peptides kann erleichtert werden durch eine Anzahl an Methoden. Zum Beispiel kann ein nichttoxisches Derivat der Choleratoxin-B-Untereinheit oder der strukturell verwandten Untereinheit B des hitzelabilen Enterotoxins des enterotoxischen E. coli zu der Zusammensetzung hinzugefügt werden, siehe US-Patent 5,554,378.
Alternativ kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung ein bioabbaubares Polymer, ausgewählt aus Poly-1,4-butylensuccinat, Poly-2,3-butylensuccinat, Poly-1,4-butylenfumarat und Poly-2,3-butylensuccinat, umfassen, wobei das Peptid als das Pamoat, Tannat, Stearat oder Palmitat davon eingeschlossen wird. Solche Zusammensetzungen sind z. B. im US-Patent 5,439,688 beschrieben.
Weiterhin kann eine Zusammensetzung eine Fettemulsion sein. Die Fettemulsion kann zubereitet werden durch Hinzufügen von ungefähr 0,1 bis 2,4 w/w eines Emulgierungsmittels wie z. B. einem Phospholipid, einer Emulgierungshilfe, einem Stabilisator zu einem Fett oder Öl, durch mechanisches Mischen, unterstützt von Erhitzen und/oder der Entfernung von Lösungsmitteln, durch Hinzufügen von Wasser und isotonischem Agens und wahlweise durch Anpassen durch Hinzufügen des pH-Mittels, isotonischen Mittels. Die Mischung wird dann homogenisiert. Vorzugsweise enthalten solche fetten Emulsionen ein Mittel zum Anpassen der elektrischen Ladung, wie saure Phospholipide, Fettsäuren, Gallensäuren und Salze davon. Saure Phospholipide schließen Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol und Phosphatidinsäure ein. Gallensäuren schließen Deoxycholinsäure und Taurocholinsäure ein. Die Zubereitung solcher pharmazeutischer Zusammensetzungen ist in US 5,733,877 beschrieben.
Die Erfindung wird nun detaillierter in den folgenden Beispielen beschrieben werden, die lediglich erläuternd sind und nicht in irgendeinem Sinne den Schutzumfang der Erfindung limitieren.
Beispiele
Materialien und Methoden
Bakterielle Kulturen und Wachstumsanalysen
Bakterien wurden aus klinischen Isolaten erhalten, die als Teil der Routineaufarbeitung für den H. pylori-Nachweis kultiviert wurden. Es wurden für die Studie keine Bakterien besonders gewonnen. Die Wachstumskurvenanalysen wurden durchgeführt unter Verwendung von fünf unterschiedlichen Isolaten. Die endoskopische Diagnose schloss sowohl peptische Pathologien als auch normal erscheinende Mukosa ein. Nach der Endoskopie wurden die Biopsien in balancierter Salzlösung für nicht länger als eine Stunde aufbewahrt. Anschließend wurden die Biopsieproben zerkleinert und auf Schokoladen- oder Colombia-Agarplatten ausgestrichen. Um mikroaerophile Bedingungen zu erzeugen, wurden die Bakterien bei 37°C in versiegelten Gefäßen wachsen gelassen unter Verwendung von Kits, die anaerobes Gas erzeugen (Oxoid, BR- 38). Die Bakterien wurden erneut unter ähnlichen Bedingungen alle 2–4 Tage ausgestrichen. Für die Experimente wurden Bakterien in Hirn-Herz-Infusion oder flüssige Brucella-Nährlösungsmedien (Gibco) übertragen, welche mit 10% Kälberserum ergänzt wurden (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). Jede Probe wurde mit 0,02 OD 600 beimpft, was 1,6 × 10³ CFU/100 μL entspricht. Gastrin oder Kontrollpeptide wurden in unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt, wie angezeigt.
Das H. pylori-Wachstum macht mikroaerophile Bedingungen notwendig. Die wiederholte Probennahme aus demselben Röhrchen würde in der Unterbrechung solcher Bedingungen resultieren. Um dieses Problem zu überwinden, wurden vielfache Proben bei der Anzahl der beurteilten Zeitpunkte in jedem Experiment verwendet. Jede Probe enthielt identische Bakterienzahlen und Gastrinkonzentrationen. Eine unterschiedliche Probe wurde zu jedem Zeitpunkt beurteilt. Das Wachstum wurde durch OD-Werte beurteilt.
Sämtliche Bakterien wurden aus klinischen Isolaten erhalten. Wachstumskinetische Experimente mit C. jejuni wurden bei ähnlichen Bedingungen wie oben für H. pylori beschrieben durchgeführt. Wachstumskinetische Experimente mit E. coli wurden unter ähnlichen Bedingungen wie den obigen durchgeführt, jedoch in einer aeroben Umgebung.
Gastrin und Kontrollpeptide
Gastrin 17, Cholecystokinin (CCK)-8 (Fragment 26–33), Pentagastrin, Somatostatin 14 und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) wurden von Sigma (St. Louis, MO) erhalten. Lyophilisierte Peptide wurden in einer Stammlösung, die Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 1 : 1 enthielt, auf eine Konzentration von 1 mg/ml aufgelöst, wie vorgeschlagen durch den Hersteller, und mit sterilem entmineralisiertem Wasser auf die angezeigten Konzentrationen verdünnt.
Radioaktive Gastrinaufnahme
Um die markierte Gastrinaufnahme zu beurteilen, wurden Bakterienpellets in 200 μl Brucella-Nährlösung, enthaltend 500 nmol/l ¹²⁵I-markiertes Gastrin (IncStar Pharmatrade) resuspendiert. Die Inkubation wurde entweder bei 4°C oder bei 37°C für 45 Minuten durchgeführt. Die Bakterien wurden dreimal in PBS gewaschen, resuspendiert und für 30 Minuten in Brucella-Nährlösung, enthaltend Proteinase K (Promega), in einer Konzentration von 25 ng/ml inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien gewaschen, in 100 μl BPS resuspendiert, von denen 10 μl auf Mikrozellulosefilter geblottet wurden, und Autoradiographie für 7 Tage durchgeführt wurde. Aufgenommenes ¹²⁵I wurde unter Verwendung eines Gammazählers quantifiziert.
Kalte Inhibitionsuntersuchung
Für die kalte Inhibitionsuntersuchung wurden Bakterienpellets in 200 μl Brucella-Nährlösung, enthalten 500 nmol/l ¹²⁵I-markiertes Gastrin resuspendiert. Nicht markiertes Gastrin in steigenden Konzentrationen (1250–5000 nmol/l) wurde anschließend hinzugefügt. Die Bakterien wurden für 45 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach sie ausgedehnt mit PBS gewaschen wurden. Der Einbau von ¹²⁵I-markiertem Gastrin wurde unter Verwendung eines Gammazählgerätes bestimmt. Als Kontrollen wurden Bakterien mit ¹²⁵I-markiertem Gastrin (500 nmol/l) in der Anwesenheit von CCK-8, Pentagastrin, Somatostatin oder EGF in den angezeigten Konzentrationen inkubiert.
Ergebnisse
Um die Wirkung von G17 auf das Wachstum von H. pylori abzuschätzen wurden die Bakterien mit steigenden Gastrinkonzentrationen wachsen gelassen. Die Zugabe von Gastrin zu den Wachstumsmedien hatte eine dosisabhängige Wirkung auf die Wachstumskurve. Gastrin verkürzte die Anlaufphase, erhöhte die Wachstumsrate in der logarithmischen Phase und steigerte die Endzelldichte in der stationären Phase (1A). 1B zeigt das Wachstum von fünf unterschiedlichen klinischen Isolaten in der Anwesenheit von Gastrin zum Zeitpunkt 0 und 48 h. Wie gezeigt, wurde eine ähnliche Wirkung von Gastrin für alle fünf Isolate festgestellt.
Um die Spezifität der Gastrinwirkung zu untersuchen, wurden wachstumskinetische Studien unter Verwendung eines langsam wachsenden mikroaeorophilen Darmbakteriums und einem gram-negativen aeroben Darmbakterium durchgeführt. Wie in 2A–B gezeigt, hatte Gastrin keine Wirkung auf das Wachstum von Campylobacter jejuni oder Escherichia coli. Um zu untersuchen, ob andere Peptide auch eine positive Wirkung auf das Wachstum haben könnten, ähnlich wie Gastrin auf H. pylori, wurde H. pylori in der Anwesenheit von Somatostatin, das im Magenantrum produziert wird, und EGF, einem Wachstumsfaktorpeptid, das in dem Magenlumen gefunden wird, wachsen gelassen. Zusätzlich wurden, da in Menschen die Gastrin- und CCKB-Rezeptoren homolog sind, die Gastrin/CCKB-Rezeptoragonisten CCK-8 und Pentagastrin, die eine strukturelle Homologie zu Gastrin haben, hinsichtlich ihrer Wirkung auf das Wachstum von H. pylori untersucht. Wie in den 2C–F gezeigt, hatte keines der Peptide eine Wirkung auf das Wachstum von H. pylori, wodurch gezeigt wird, dass die positive Wachstumswirkung von Gastrin spezifisch war.
Um zu wissen, ob die Aufnahme von Gastrin durch H. pylori spezifisch war und ob Gastrin durch H. pylori aufgenommen oder an die äußere Oberfläche gebunden worden war, wurden H. pylori und Kontrollbakterien mit ¹²⁵I-markiertem Gastrin bei 4°C oder bei 37°C inkubiert. Nach dieser anfänglichen Inkubation wurden die Bakterien mit Proteinase K co-inkubiert, um Oberflächenproteine zu verdauen. Der markierte Gastrineinbau wurde beurteilt durch Autoradiographie und CPM-Bestimmung. Wie in 3 gezeigt, war die Aufnahme von Gastrin durch die Bakterien spezifisch für H. pylori, da keine Markierung mit Kontrollbakterien festgestellt wurde. Weiterhin baute nur H. pylori, inkubiert bei 37°C, das ¹²⁵I-markierte Gastrin ein. Solch eine Temperaturabhängigkeit legt nahe, dass ein energieabhängiger Mechanismus für die Aufnahme von Gastrin verantwortlich ist. Ferner wurde keine Reduktion bei den radioaktiven Zählungen nach der Co-Inkubation mit Proteinase K festgestellt (vor der Proteinase-K-Inkubation – 311 CPM, nach der Inkubation mit Proteinase K – 385 CPM), was nahe legt, dass das Gastrin in das Bakterium eintrat und folglich vor der Proteinase-K-Verdauung geschützt war.
Um zu untersuchen, ob Gastrin in das Bakterium durch einen nicht spezifischen Mechanismus oder durch eine Wechselwirkung mit einer spezifischen Bindungsstelle eintrat, wurde die Aufnahme von markiertem Gastrin konkurriert unter Verwendung von nicht markiertem Gastrin und von Kontrollpeptiden. Wie in 4 gezeigt, konnte die Aufnahme von markiertem Gastrin durch H. pylori mit einem Überschuss an unmarkiertem Gastrin inhibiert werden. Ähnlich zu unmarkiertem Gastrin hemmte die Co-Inkubation der Bakterien in der Anwesenheit von CCK-8 und Pentagastrin die Aufnahme von markiertem Gastrin in einer dosisabhängigen Weise. Im Gegensatz dazu wurde keine Inhibition der Gastrinaufnahme gezeigt durch EGF oder Somatostatin.
Die kalte Ligandenkonkurrenz oder Inhibition der Gastrinaufnahme durch Peptide, die bekannt sind dafür, dass sie geteilte Rezeptoren in Menschen aktivieren, das Temperaturprofil der Gastrinbindung und der Schutz gegen die Proteinase-K-Verdauung, alles dies legt die innere Lokalisierung eines möglichen Rezeptors oder Kanals mit spezifischer struktureller Begrenzung nahe.

Claims

Verwendung eines Peptids, bei dem es sich um ein synthetisches Analogon von Gastrin oder ein Gastrinfragment handelt und das die wachstumsfördernde Wirkung von Gastrin auf H. pylori inhibiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von mit H. pylori assoziierten Störungen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Peptid zum Inhibieren der Gastrinaufnahme durch H. pylori befähigt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin es sich bei dem Peptid um einen kompetitiven Inhibitor der Gastrinaufnahme durch H. pylori handelt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Peptid ein synthetisches Analogon des G17-Fragments von Gastrin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Peptid die Aminosäuresequenz Trp-Met-Asp-PheNH₂ umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin es sich bei dem Peptid um Pentagastrin oder Cholecystokinin (CCK)-8 handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung und/oder Vorbeugung von mit H. pylori assoziierten gastrointestinalen Störungen bestimmt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung und/oder Prävention von mit H. pylori assoziierten gastrischen und/oder duodenalen Verdauungserkrankungen bzw. peptischen Erkrankungen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung der Gastritis, Duodenitis, der nicht ulcerativen Dyspepsie, dem Mukosa-assoziierten Lymphgewebslymphom oder der Atherosclerosis oder die Vorbeugung von gastrischen Carcinomen ist.