DE69907664T2

DE69907664T2 - Verfahren zur Herstellung von wässrigen Formulierungen für ophthalmische Verwendung

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Publication number: DE69907664T2
Application number: DE69907664T
Authority: DE
Inventors: Antonino Asero; Maria Grazia Mazzone; Valeria Moschetti; Anna Rita Blanco
Original assignee: S I F I IND FARMACEUTI Soc; Sifi Industria Farmaceutica Italiana SpA Soc
Current assignee: S I F I IND FARMACEUTI Soc; Sifi Industria Farmaceutica Italiana SpA Soc
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2019-12-23
Also published as: ES2193658T3; PT1075837E; US6277829B1; ITMI991803A1; MXPA00007530A; ITMI991803A0; EP1075837A3; ATE239448T1; EP1075837B1; DK1075837T3; CA2315594A1; IT1313610B1; DE69907664D1; JP2001089378A; EP1075837A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von wässrigen Zubereitungen für die ophthalmische Verwendung. Genauer gesagt, die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ophthahmischen Zubereitungen, die Azithromycin enthalten, sowie alle beliebigen Zubereitungen, erhalten durch ein solches Verfahren, sowie ihre ophthalmische Verwendung gegen bakterielle Augeninfektionen, verursacht durch gram-positive und gram-negative Pathogene (z. B. Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter, Citrobacter, Chlamydia spp.) sowie durch andere Mikroorganismen, die im Allgemeinen bei den üblichsten Augeninfektionen (z. B. Konjunktivitis, Keratitis und Blepharitis) beteiligt sind.
Azithromycin (U.S. 4517359) ist ein gut bekanntes Antibiotikum, das zu der Klasse der Makrolid-Antibiotika (von denen Erythromycin der Vorläufer ist) mit einer strukturellen Ähnlichkeit gehört. Die meisten dieser Antibiotika wurden aus der Fermentation von Streptomices spp. isoliert und im Wesentlichen für die Behandlung von Haut- und Weichgewebeinfektionen, die durch gram-positive Organismen bewirkt worden sind, verwendet, obgleich das Wirkungsspektrum der neueren Makrolide auch einige gram-negative Organismen (z. B. Haemophilus influenzae) einschließt. Ungeachtet der strukturellen Ähnlichkeit kann Azithromycin innerhalb der Klasse der Makrolide als einzigartig angesehen werden, so dass es in eine neue Klasse von Antibiotika, die als Azalide bekannt sind, eingeschlossen wurde. Insbesondere machen die speziellen Eigenschaften des Azithromycins dieses Molekül stabiler, besser verträglich und wirksamer als sein Vorläufer, das Erythromycin (S. Alvarez-Elcoro, M. J. Enzler, "The macrolides: Erythromycin, Clarithromycin and Azithromycin", Mayo Clinic Proceeding, 199, 74: 613–634).
Tatsächlich hat sich gezeigt, dass Erythromycin und seine Salzderivate (z. B. Erythromycin, Lactobionat, Erythromycinglucoheptonat, Erythromycinestolat, Erythromycinsuccinat etc.) in saurem Medium und bei physiologischen Bedingungen oftmals instabil sind, indem Zersetzungsprodukte in den mikrobiologisch inaktiven Strukturen bewirkt werden [P. J. Atkins et al., "Kinetic studies on the decomposition of erythromycin A in aqueous acidic and neutral buffers", Int. J. Pharmaceutics, 1986, 30: 199–207; E. Fieser, S. H. Steffen "Comparison of the acid stability of azithromycin and erithromycin A", J. Antimicrob. Chemother., 1990, (Suppl. A) 25: 39– 47; M. M. Amer, K. F. Takla "Studies on the stability of some pharmaceutical formulations. V-stability of erythromycin", Bulletin of the Faculty of Pharmacy Kairo University).
Weiterhin zeigt Azithromycin selbst im Vergleich zu anderen jüngeren Makroliden eine überlegene antibakterielle Aktivität gegenüber einigen gram-negativen Organismen, während es die gleiche Wirksamkeit gegenüber gram-positiven Organismen beibehält. Dazu kommt noch, dass Azithromycin im Vergleich zu anderen Makroliden eine extensive intracelluläre Teilung in spezifische Gewebe nach der oralen Verabreichung aufweist (R. P. Glaude et al., Antimicrob. Agents and Chemother., 1989, 33(3): 277–82). Die Halbwertszeit des Azithromycins ist so extrem erhöht, dass es nach einmal täglich erfolgender Verabreichung als ausgezeichnetes Antibiotika gegenüber Infektionen des Atmungstrakts, der Haut und der weichen Gewebe ist [A. P. Ball et al., J. Int. Med. Res., 1991, 19(6): 446–50; A. E. Girard et al., Antimicrob. Agents and Chemother., 1987, 31(12): 1948–1954].
Schließlich ist es auch möglich, das Azithromycin auf dem systemischen Weg in Form einer Vielzahl von Zubereitungen und von pharmazeutischen Formen zu verabreichen. Jedoch war es bislang, obgleich die Eigenschaften dieses Moleküls so sind, dass es zur Verwendung als antibakterielles Mittel in der topischen Verabreichung an das Auge privilegiert ist, noch nicht möglich gewesen, wässrige Zubereitungen für die ophthalmische Verwendung herzustellen, die Azithromycin enthalten und die stabil und mit den Strukturen des Auges verträglich sind.
Bei der Bereitstellung einer wässrigen ophthalmischen Zubereitung von Azithromycin schließen die hauptsächlichen Schwierigkeiten, die überwunden werden müssen, die schlechte Wasserlöslichkeit dieses Moleküls ein. Zu diesen Schwierigkeiten gehören auch Sicherheitsprobleme bei der potentiellen ophthalmischen Verwendung eines seiner Salze, die durch Anwendung der klassischen Kriterien der chemischen Synthese erhalten worden sind, wobei zur Reinigung organische Lösungsmittel verwendet worden sind, die für die Strukturen des Auges gefährlich sind und die extrem schwierig und oft nicht vollständig entfernt werden können.
Als ein Beispiel beschreiben die Patentschriften EP-B-0677530 und U.S. 4474768 die Herstellung von verschiedenen Azithromycin-Salzderivaten in Gegenwart von pharmazeutisch annehmbaren organischen Lösungsmitteln, wobei vor ihrer Verwendung in der Therapie in Form von pharmazeutischen Zubereitungen in oralen oder anderen unverträglichen Formen mit der topischen ophthalmischen Verwendung ihre Reinigungsschritte mehrfach wiederholt werden müssen. Es ist auch beschrieben worden, dass es sehr unwahrscheinlich ist, die Schwierigkeiten dieses pharmazeutischen Typs im Wesentlichen wegen der schlechten Löslichkeit der Makrolide in Wasser zu überwinden (V. Andres, "Antibiotic treatment of ophthalmic infection: new developments", J. Hospital Infection, 1995, 30: 268–274). Obgleich die Verwendung der Makrolide in der Augenheilkunde schon angestrebt worden ist, würde es, wenn man nicht auf ophthalmische Formen (z. B. Salben) zurückgreifen möchte, die weniger gut bioverfügbar sind, in irgendeiner Weise erforderlich werden, sie mit Augentropfen des gleichen Wirkprinzips zu kombinieren um irgendwelche in der Oberfläche der Augen verteilte pathogene Stoffe nach der Behandlung vollständig auszulöschen.
Zahlreiche Publikationen beschreiben die Pharmakokinetik des Azithromycins nach der oralen Verabreichung sowie seine potentielle Verwendung zur Behandlung von Infektionen von Strukturen des Auges [K. F. Tabbara et al., "Ocular levels of azithromycin", Arch. Ophthalmol., 1988, 116(12): 1625–1628; Z. A. Karcioglu et al., "Pharmacokinetics of azithromycin in rabbit lachrymal glands and conjunctiva", Ophthalmic Res., 1999, 31(1): 47–52; K. F. Tabbara et al., "Single-Dose azithromycin in the treatment of trachoma. Eine randomisierte Kontrolluntersu chung" Ophthalmology, 1996, 103(5): 842–846; D. M. O'Day et al., "Ocular pharmacokinetics of orally administered azithromycin in rabbits", J. Ocular Pharmacol. 1994, 10(4): 633–641; Z. A. Karcioglu et al., "Pharmacokinetics of azithromycin in trachoma patients: serum and tear levels", Ophthalmology, 1998, 105(4): 658–661] hat aber gezeigt, dass unter keinen Umständen die verwendeten oralen Zubereitungen dazu imstande sind, eine wirksame Gewebekonzentration des Azithromycins in der Augenoberfläche sicherzustellen, wie sie durch topische Verabreichung des Wirkstoffprinzips einer ausgewählten pharmazeutischen Form von Augentropfen erreicht wird.
Obgleich einerseits die Synthese der Azithromycin-Salzderivate verbessert worden ist oder in anderen Fällen es versucht worden ist, die Bioverfügbarkeit sowie die Aktivität durch orale Verabreichung unter Verwendung von Systemen mit kontrollierter Freisetzung zu erhöhen (vergleiche US-PS 5705190 , betreffend Clarithromycin) ist man andererseits noch nicht dazu imstande gewesen, ähnliche Ergebnisse bei der Herstellung von wässrigen stabilen Zubereitungen, die Azithromycin enthalten, zu erhalten, die als wirksame und sichere Produkte bei der antimikrobiellen Therapie von Augeninfektionen verwendet werden sollen.
Die EP-A-0925789 beschreibt die Verwendung von Azithromycin, insbesondere bei einer Konzentration von 0,1 bis 2,5 Gew.-%, zur Herstellung eines topischen Arzneimittels zur Behandlung von Augeninfektionen, sowie eine Zusammensetzung für die topische Anwendung bei der genannten Behandlung, umfassend eine wirksame Menge von Azithromycin, insbesondere mit der oben genannten Konzentration.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, stabile wässrige Zubereitungen für die ophthalmische Verwendung bereitzustellen, die Azithromycin enthalten, und die eine bessere Hornhautpermeabilität des Wirkstoffs bezüglich wässrigen Suspensionen oder lipophilen Formulierungen mit einer überlegenen Bioverfügbarkeit und Verträglichkeit gegenüber den Strukturen des Auges liefern.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zubereitungen herzustellen, deren Herstellungsverfahren nicht die Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln, weder als Co-Lösungsmittel während der Herstellung von Azithromycin-Augentropfen, noch als Ausfällungsmittel während des Reinigungsprozesses bei der synthetischen Herstellung der Azithromycin-Salzderivate einschließen.
Weiterhin ist es anzustreben, dazu imstande zu sein, wässrige ophthalmische Zubereitungen, die Azithromycin enthalten, zu realisieren, die als Augentropfen bei der antimikrobiellen ophthalmischen Therapie verwendbar sind.
Die oben beschriebenen Aufgaben und andere gemäß der vorliegenden Erfindung, welche anhand der folgenden Beschreibung verständlicher werden, sind überraschenderweise durch ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen ophthalmischen Zubereitung, enthaltend Azithromycin, erreicht worden. Dieses Verfahren umfasst die Solubilisierung eines ophthalmisch annehmbaren mehrbasischen Phosphats in einem Konzentrationsbereich von 7,8 bis 68,6 g/l, von Zitronensäuremonohydrat in einer Menge im Bereich von 0,9 bis 35,94 g/l und die nachfolgende Zugabe von Azithromycin in einer Menge im Bereich von 0,1 bis 100 g/l innerhalb eines Temperaturbereichs von 15 bis 25°C, wobei das molare Verhältnis von Azithromycin zu Zitronensäure 1 : 0,67 bis 1 : 1,5 beträgt, wobei der pH-Wert auf einen Wert von 5,5 bis 7,6 und bis zu einer End-Osmolalität zwischen 130 bis 300 mOsm/kg eingestellt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das ophthalmisch annehmbare mehrbasische Phosphat Natriumphosphat, bevorzugter Dinatriumphosphatdodecahydrat.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt das Molverhältnis von Azithromycin zu Zitronensäure 1,5 : 1. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt der pH-Wert im Bereich von 6,4 bis 7,6.
Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hat die Lösung vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von etwa 6,4 bis etwa 7,6, wobei das am meisten bevorzugte Molverhältnis von Azithromycin zu Zitronensäure 1,5 : 1 ist.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gestattet es, eine extrem hohe Löslichkeit des Azithromycins in wässriger Lösung zu erhalten. Zubereitungen, die Azithromycin in Konzentrationen im Bereich von 0,01 bis 10% Gew./Vol. und insbesondere zwischen 0,3 und 5% Gew./Vol. enthalten, werden am meisten bevorzugt.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt umfasst das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nach der Auflösung des Azithromycins die Zugabe mindestens eines Tonizitätsmittels und/oder viskositätserhöhenden Mittels und/oder eines Gelierungsmittels und/oder eines Stabilisierungsmittels und eines Konservierungsmittels in ophthalmisch annehmbaren Mengen.
Wässrige ophthalmische Zubereitungen, erhalten gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, sind neu und sie umfassen gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt in Kombination mit Azithromycin mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel mit einer antibakteriellen Aktivität und/oder ein therapeutisches Steroid- oder Nicht-Steroid-Mittel mit entzündungshemmender Aktivität in ophthalmisch annehmbaren Mengen für das Auge.
Insbesondere wird das therapeutische Mittel mit antibakterieller Aktivität aus der Gruppe, bestehend aus Aminoglykosiden (z. B. Netilmicin), Fluorchinolonen, Tetracyclinen, Polymyxin, Glykopeptiden, Glykoproteinen (z. B. Lactoferrin), natürlichen und/oder synthetischen Peptiden, β-Lactam-Antibiotika sowie anderen antibakteriellen Mitteln ausgewählt, während das therapeutische Steroid-Mittel mit entzündungshemmender Aktivität aus der Gruppe, bestehend aus Desonid-21-phosphat, Dexamethason, Clobetason, Mometason, Betamethason, Fluticason, und anderen ähnlichen entzündungshemmenden Steroid-Mitteln, ausgewählt wird. Nicht-Steroid-Mittel mit entzündungshemmender Aktivität werden aus der Gruppe, bestehend aus Naproxen, Diclofenac, Nimesulid, Flurbiprofen und anderen ähnlichen entzündungshemmenden nicht-steroidalen Mitteln ausgewählt.
Es wird bevorzugt, die Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung als wässrige Lösungen, als Salben- oder Gelformen sowie andere Freisetzungssysteme, die mit den Strukturen des Auges ophthahnisch verträglich sind, zu realisieren.
Die Zubereitungen der vorliegenden Erfindung können mit Vorteil für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von pathologischen Zuständen des Auges, die eine antibakterielle Therapie erfordern, mehr bevorzugt für die Behandlung von Konjunktivitis, Keratitis und Blepharitis, verwendet werden.
Die 1 zeigt das Stabilitätsprofil einer Lösung, enthaltend 2% Azithromycin unter thermischen Stressbedingungen, in Abhängigkeit vom pH-Wert. Der Log-K-Wert (Woche^–1) ist (y-Achse) gegen den pH-Wert (x-Achse) aufgetragen. Die Zubereitungen der Erfindung sind bei einem pH-Wert von 6,4 und einem pH-Wert von 8,7 stabil.
Die 2 zeigt die okulare Verteilung des Azithromycins in der Hornhaut und der Bindehaut (μ/g des Gewebes, y-Achse) als Funktion der Zeit (Stunden, x-Achse) nach topischer Behandlung von Tieren. Die Gewebekonzentrationen des Azithromycins nach 12stündiger Behandlung sind, bezogen auf die anfänglichen drei Instillationen, ungefähr doppelt so groß. Diese Werte werden oberhalb MIC₉₀ für Staphylococcus aureus auch in der Gruppe von Tieren aufrechterhalten, die 12 Stunden lang unbehandelt gelassen wurden.
Die 3 zeigt die Verringerung der bakteriellen Belastung bei drei Gruppen von Kaninchen mit bakterieller Konjunktivitis des Auges. Sie wurden mit verschiedenen Lösungen von Azithromycin-Augentropfen, hergestellt bei einer Vielzahl von Konzentrationen (x-Achse), wie beim Verfahren der vorliegenden Erfindung definiert, behandelt. Dabei wurden die koloniebildenden Einheiten (kbE), ausgedrückt als log kbE/g-Wert des Gewebes (y-Achse) bestimmt. Entsprechend dem Aktivitätsprofil bei jeder getesteten Konzentration wird es ersichtlich, dass die Augentropfen gemäß der vorliegenden Erfindung für die topische Behandlung von bakterieller Konjunktivitis des Auges geeignet sind.
Die 4 zeigt die Verringerung der bakteriellen Belastung bei drei Gruppen von Kaninchen mit einer bakteriellen Keratitis des Auges, die mit verschiedenen Lösungen von Azithromycin-Augentropfen, hergestellt bei einer Vielzahl von Konzentrationen (x-Achse), wie erfindungsgemäß definiert, behandelt worden waren. Dabei wurden die koloniebildenden Einheiten (kbE), ausgedrückt als log kbE/g-Werte des Gewebes (y-Achse) bestimmt.
Aufgrund des niedrigeren Mittelwerts der für die Verringerung der bakteriellen Belastung in den mit Azithromycin (2%) behandelten Hornhäuten bezüglich des Trägers ist es möglich, zu behaupten, dass höhere Konzentrationen des Azithromycins (> 2%), verabreicht in Form einer pharmazeutischen Salbe oder eines pharmazeutischen Gels oder eines anderen Retardsystems für das Auge, für die Augentherapie der bakteriellen Keratitis wirksam sind.
Durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, irgendwel- che Schwierigkeiten bei der Herstellung von wässrigen Zubereitungen zu überwinden, die Azithromycin enthalten. Tatsächlich ist gefunden worden, dass es durch ein Verfahren, bei dem, ohne dass es notwendig ist, die Azithromycinsalze in Gegenwart von organischen Lösungsmittel zu synthetisieren, möglich ist, durch Zugabe eines Zitronensäure/Phosphatpuffers in einem geeigneten Mengenverhältnis zu der Azithromycinsuspension, eine stabile wässrige pharmazeutische Form zu erhalten, die gegenüber den Strukturen des Auges verträglich ist. Wässrige Lösungen von Azithromycin, hergestellt gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wobei der pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 7,6 und die Osmolalität im Bereich von 130 bis 300 liegt, sind dazu imstande, Gewebekonzentrationen zu erreichen, die oberhalb der MIC-Werte der üblichsten Augenpathogene (z. B. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter, Citrobacter, Haemophilus influenzae, Chlamydia spp.) liegen, wodurch sie für die Behandlung der hauptsächlichen bakteriellen Infektionen des Auges wirksam sind.
Ophthalmische Zubereitungen, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, können in ophthalmisch annehmbaren Mengen einen mehrbasischen Phosphatpuffer, viskositätserhöhende Mittel und Gelierungsmittel (z. B. Salze der Hyaluronsure, ophthalmisch annehmbar, mit einem Molekulargewichtsbereich von etwa 200.000 bis etwa 5.000.000 Dalton, Lutrol^® F127 (BASF), Kollidon^® (BASF), Hydroxypropylmethylcellulose, Carbopol^® (Goodrich), Stabilisierungsmittel (z. B. Polyethylenglykol, Propylenglykol, Cremophor^® (BASF), Polysorbat, Ascorbat, ionische Tenside), Konservierungsmittel (z. B. Benzalkoniumchlorid, Cetrimid, Thimerosal, Chlorbutanol, p-Hydroxybenzoat, Polyhexamethylenbiguanid, Clorexidin, Sorbate), Tonizitätsmittel (Natriumchlorid und/oder Kaliumchlorid, Glycerin, Mannit) und/oder andere Exzipientien (z. B. Vaseline, Paraffinöl, Lanolin etc.), die üblicherweise in ophthalmischen Zubereitungen für die Human- und Veterinärmedizin verwendet werden, enthalten.
Der überraschende Effekt der Zitronensäure zur Solubilisierung des Azithromycins zusammen mit der nicht-erwarteten Möglichkeit, eine erhöhte Konzentration von Azalid im physiologischen pH-Bereich zu erhalten, wird zur Herstellung von verschiedenen Azithromycin-Augentropfen mit verschiedenen Konzentrationen und pH-Bereichen ausgenutzt, um die Stabilität, die pharmakokinetischen Verhältnisse, die Sicherheit und die Wirksamkeit dieser Präparate zu untersuchen.
Die folgenden Beispiele dienen nur für illustrative Zwecke. Sie sollen nicht als einschränkend für den Umfang der Erfindung angesehen werden.
BEISPIEL 1
Herstellung von Azithromycin-Auegntropfen
In 80 ml Wasser wurden unter Rühren und bei einer Temperatur von 15 bis 25°C wie folgt Dinatriumhydrogenphosphatdodecahydrat und Citronensäuremonohydrat, Azithromycin und Benzalkoniumchlorid zugegeben. Das Azithromycin wurde erst dann zugesetzt, als die Puffermittel sich vollständig aufgelöst hatten. Nach vollständiger Auflösung aller Bestandteile mit Einschluss geeigneter Tonizitätsmittel, Mittel zur Viskositätserhöhung oder zur Gelierung, Sta bilisatoren und weiteren therapeutischen Mitteln (z. B. Antibiotika, nicht-steroidale oder steroidale entzündungshemmende Arzneimittel) wurden die pH-Werte gemessen und danach, erforderlichenfalls, wurde dieser Wert mit 1M Zitronensäure oder 1M NaOH auf pH = 6,4 bis 7,6 eingestellt. Die Endlösung (100 ml) wurde sterilisiert und in geeigneten Fläschchen verteilt. Einige bei dieser Verfahrensweise erhaltende Zubereitungen sind in der untenstehenden Tabelle gezeigt:
BEISPIEL 2
Stabilitätstest
Unter thermischen Stressbedingungen (60°C ± 2°C) zeigen die wässrigen Zubereitungen die beste Stabilität bei pH = 6,4 und pH = 8,7 (vergleiche 1). Azithromycin-Zubereitungen (Beispiel 1) mit physiologischem pH-Wert (6,4 bis 7,6) und bei einer Temperatur von 25°C ± 2°C; bei 75% ± 5% relativer Feuchtigkeit sind nach 4 Wochen ab ihrer Anfangsherstellung immer noch stabil, wie in der folgenden Tabelle gezeigt wird.
Die Azithromycin-Konzentration beeinflusst die Stabilität des Endprodukts nicht; alle Lösung sind selbst nach 4 Wochen klar sowie farblos.
BEISPIEL 3
Verträglichkeit im Auge
24 Neuseeland-Albino-Kaninchen (12 männliche und 12 weibliche Tiere) mit einem Gewicht von 1,9 bis 2,0 kg wurden beliebig in Gruppen (n = 2) verteilt um topisch mit Azithromycin (2%) Augentropfen oder Plazebo gemäß folgendem Schema behandelt zu werden.
Es wurden acht Behandlungen am ersten Tag und vier an den folgenden Tagen durchgeführt. Ein Tropfen (50 μl) von Azithromycin (2%) Augentropfen oder Plazebo wurde in den Konjunktivalsack des Tieres hinein verabreicht. Nach der Verabreichung wurde das Lid einige Sekunden geschlossen gehalten um den Verlust der Lösung zu verringern und die Verteilung in dem Auge zu gestatten. Unterschiede zwischen jeder behandelten Gruppe und ihrer entsprechenden Kontrolle wurden durch den Mann-Whitney-Test ermittelt.
Unter Verwendung einer Schlitzlampe wurde eine klinische Untersuchung der Augen 0, 1/4, 1/2, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 360, 480 und 672 Stunden nach Beginn der Studie durchgeführt. Die Augen-Verträglichkeit/Toxizität wurde durch Aufzeichnung der klinischen Anzeichen in der Bindehaut (Kongestion, Ödem, Exudat), der Hornhaut (Opazität) und der Iris (Dilatation ) gemäß dem von Draize entwickelten Bewertungssystem ermittelt. Der Grad der Schwere jedes Zeichens geht von 0 bis 3 (0 = normal, 1 = leicht, 2 = mäßig, 3 = schwer).
Nach der klinischen Beobachtung wurden vier Hornhäute für jede Gruppe von Kaninchen für die Abtast-Elektronenmikroskopie (SEM) verarbeitet. Weiterhin wurden nach der Behandlung verschiedene Organe und Gewebe für die histopathologische Untersuchung beiseite gelegt.
Keine klinischen Zeichen, die auf irgendeinen Effekt in Verbindung mit den Azithromycin-Augentropfen (2%) hinweisen, wurden während der 28-tägigen Behandlung beobachtet. Der Draize-Test hat keine signifikante Differenz zwischen den Azithromycin-Augentropfen (2%) und dem Plazebo gezeigt. Die Analyse durch SEM und die histopathologische Untersuchung zeigten keine mit der Behandlung in Verbindung stehenden Veränderungen in den Geweben und den Organen, die untersucht wurden (Auge, Herz, Gehirn, Leber, Niere, Lunge, Dickdarm und Magen). Als Ergebnis scheint es so zu sein, dass die Azithromycin-Augentropfen (2%) nach der topischen Instillation in das Auge von Albino-Kaninchen während einer 28-tägigen Periode gut vertragen werden.
BEISPIEL 4
Azithromycin-Verteilung in der Bindehaut, der Hornhaut und der wässrigen Körperflüssigkeit nach topischer Applikation in das Auge von Albino-Kaninchen
Es wurde eine pharmakokinetische Untersuchung durchgeführt um die Konzentration des Azithromycins in der Hornhaut, der Bindehaut und der wässrigen Körperflüssigkeit zu bestimmen. Zwölf männliche weiße Neuseeland-Kaninchen (Gewicht 1,8 bis 2,3 kg) wurden beliebig in drei Gruppen (bestehend aus jeweils vier Tieren) aufgeteilt. Danach wurde in den unteren Konjunktivalsack beider Augen alle zwei Stunden 50 μl Azithromycin (2%) gemäß dem folgenden Dosierungsschema instilliert:

I. Gruppe: drei Instillationen (die Tiere wurden 6 Stunden nach der ersten Dosierung getötet)
II. Gruppe: sechs Instillationen (die Tiere wurden 12 Stunden nach der ersten Dosierung getötet)
III. Gruppe: sechs Instillationen (die Tiere wurden 24 Stunden nach der ersten Dosierung getötet)

Die Kaninchen wurden durch eine Überdosis Tanax^®, das in die marginale Ohrvene injiziert wurde, getötet. Die mit Azithromycin behandelten Augen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS 0,1M; pH 7) gewaschen und jede Bindehaut wurde kurz vor der Ausschälung entfernt. Die wässrige Körperflüssigkeit wurde mit einer Nadel Nr. 23, angesetzt an eine Insulinspritze von 1 ml, abgezogen. Nach Entfernung wurde die Hornhaut am Limbus exzisiert und von dem Augapfel entfernt. Alle Proben wurden sorgfältig abgewogen und dann sofort bei – 20°C eingefroren.
Die Konzentrationen von Azithromycin im Gewebe oder der wässrigen Körperflüssigkeit wurden durch das folgende mikrobiologische Verfahren bestimmt. Jede Probe wurde gemahlen und mit 1 ml PBS (2 min, 24.000 UpM) homogenisiert. Die Suspension wurde mit dem gleichen Volumen von Aceotnitril vermischt und bei 0°C gelagert. Nach einer Stunde wurden die Proben bei 0°C (12.000 UpM, 10 min) zentrifugiert und die wässrige überstehende Schicht wurde für die Azithromycin-Messung in jeder Probe verwendet. Die wässrige Körperflüssigkeit wurde direkt mit dem Acetonitril vor dem Zentrifugieren vermischt. Die Azithromycin-Konzentrationen für jede Hornhaut, jede Bindehaut und jede wässrige Körperflüssigkeit wurden dreimal bestimmt und es wurde der Mittelwert für jede Gewebeprobe bestimmt und mit einer Standardkurve verglichen. Es wurde eine lineare Beziehung zwischen der Azithromycin-Konzentration (log) und der damit verbundenen Hemmzone gegen Staphylococcus aureus ATCC 29213 bestätigt, wie sich aus den folgenden Regressionslinien ergibt, die für jede Probe bestimmt wurden:

Probe Regressionslinie

Hornhaut Y = 6,3312 x + 7,5975; r = 0,9980

Bindehaut Y = 6,2464 x + 7,3909; r = 0,9999

Kammerwasser Y = 9,2474 x + 4,6451; r = 0,9864
Die Bio-Assaymethode hat eine Erfassungsgrenze von 3,8 μg im Kammerwasser.
Die Azithromycin-Konzentration war sowohl in der Hornhaut als auch der Bindehaut während der ersten zwölf Stunden erhöht (vergleiche die untenstehenden Tabellen und die
2). Insbesondere war die Gewebekonzentration des Azithromycins nach 12 Stunden (sechs Instillationen) etwa doppelt so groß wie diejenige, die nach sechs Stunden Behandlung ermittelt wurde. Am Ende wurde selbst nach 24 Stunden und 6 Instillationen die Konzentration des Azithromycins sowohl der Hornhaut als auch in der Bindehaut oberhalb des MIC₉₀-Werts für Staphylococcus aureus (2,25 μg/ml) gehalten. Diese Werte bestätigen, dass Zubereitungen, die Azithromycin enthalten, wirksam für die Behandlung von bakteriellen Infektionen des Auges, wie Konjunktivitis, Blepharitis und Keratitis, verwendet werden können. Im Kammerwasser wurde keine Azithromycin-Konzentration festgestellt (< 3,8 μg/ml).
HORNHAUT
BINDEHAUT
BEISPIEL 5
Antibakterielle Aktivität in-vitro
Die bakteriostatische/bakterizide Aktivität von Azithromycin in verschiedenen ophthalmischen Lösungen wurde als Funktion von ([H+]) bestimmt. Die Bestimmung der Aktivität wurde durch eine standardisierte Methode, empfohlen vom National Committess for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), durchgeführt. Insbesondere wurden drei Azithromycin- Lösungen mit verschiedenem pH-Wert (6,5, 7,2, 7,8) in Citrat-Phosphat untersucht. Demgemäß wurden drei Aliquots einer Mueller-Hinton-Brühe auf den gleichen pH-Wert der Azithromycin-Lösungen (drei), die getestet werden sollten, eingestellt.
Die MIC-Werte (μg/ml) wurden nach der Standard-Trübungs-Methode nach Inkubation von Azithromycin-Aliquots bei unterschiedlichem pH-Wert im Bereich von 18 bis 24 h gemessen. Die Inkubation für Staphylococcus spp. und Pseudomonas spp. erfordert aerobe Bedingungen, während Streptococcus spp. und Haemophilus spp. teilweis anaerobe Bedingungen während der Periode der Inkubation (5%, CO₂) erfordern.
Die Konzentration des Azithromycins, die dazu imstande ist, das Wachstum der Bakterien nach der Periode der Inkubation zu hemmen, wird als die minimale Hemmkonzentration (MIC) definiert.
Die minimale bakterizide Konzentration (MBC) wurde in der Weise bestimmt, dass in ein geeignetes Kulturmedium 0,1 ml jeder Azithromycin-Konzentration oberhalb des MIC-Wertes einplattiert wurden. Der MBC-Wert von Azithromycin ist als die niedrigste Konzentration definiert, die dazu imstande ist, ein bakterielles Wachstum von weniger als 10 koloniebildenden Einheiten (kbE) zu erfassen.
Wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt wird, wird die antimikrobielle Aktivität (MBC und MIC) der drei getesteten ophthalmischen Lösungen durch den pH-Wert beeinflusst. Insbesondere wurde festgestellt, dass es möglich ist, einen geeigneten pH-Bereich auszuwählen, bei dem die ophthalmischen Lösungen immer noch wirksam sind um die Aktivität von Azithromycin gegen die meisten wichtigen Pathogene, die Augeninfektionen bewirken, zu hemmen.
BEISPIEL 6
Antimikrobielle Aktivität von Azithromycin-Augentropfen
Um die antimikrobielle Aktivität von Azithromycin-Augentropfen reproduzierbar zu testen, wurde ein Kaninchenmodell der Konjunktivits entwickelt. Der Abrieb entlang der inneren Oberfläche des unteren Lids zusammen mit einer radialen 4-mm-Inzision in der Nähe des medialen Kanthus wurde auf beiden Augen von fünfzehn weißen Neuseeland-Kaninchen (1,8 bis 2,0 kg) bewirkt. Bald danach wurden 100 μl einer Suspension, enthaltend 1 × 10⁸/ml S. aureus eines klinischen Augenisolats, in den Konjunktivalsack von beiden Augen alle zwei Stunden dreimal verabreicht. Eine Spaltlampen-Untersuchung wurde durchgeführt und die Zeichen einer Augeninfektion wurden bis zum 5. Tag in 24-Stunden-Intervallen nach der modifizierten McDonald-Shadduck-Skala überwacht. Unmittelbar nach der Untersuchung für die klinische Bewertung wurden Gruppen von zwei oder drei Kaninchen durch intravenöse Injektion von Tanax^® getötet. 24 Stunden nach der Zuführung von S. aureus wurde eine Konjunktivitis bei dem Kaninchen erzeugt, die über die 5-tägige Periode der Augenbeobachtung anhielt. Eine Hyperämie und eine eitrige Absonderung waren die ausgeprägtesten und andauerndsten Zeichen, die bewertet wurden. Dieses experimentelle Modell der Konjunktivitis wurde dann zum Testen der antimikrobiellen Aktivität der Azithromycin-Augentropfen (0,3%, 1%, 2%) verwendet.
Fünfzehn männliche Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von 1,8 bis 2 kg wurden beliebig in Gruppen (n = 3) aufgeteilt um topisch mit Testproben oder Plazebo-Augentropfen 24 Stunden nach der bakteriellen Inokulierung von Staphylococcus aureus behandelt. Die Versuchsbedingungen sind wie folgt zusammengestellt:
Eine Stunde nach der letzten Verabreichung wurden die Tiere durch intravenöse Injektion von Tanax^® getötet. Die chirurgisch entfernten Bindehäute wurden in einer geeigneten Volumenmenge von H2= 0,1% Pepton mit Stomacher^®80Lab Systems (pbi international) gemahlen. Aliquots des überstehenden Produkts wurden filtriert und die zurückgebliebenen Proben wurden auf Blut-Agarplatten (Columbia CNA-Agar) platziert. Die Platten wurden bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert, wonach die koloniebildenden Einheiten (kbE), ausgedrückt als log kbE/g des Gewebes, für jede Bindehaut bestimmt wurden.
Die Verringerung der bakteriellen Belastung in den drei Gruppen der Kaninchen, die mit verschiedenen Augentropfenlösungen von Azithromycin behandelt worden waren, ist in 3 gezeigt. Auf der Basis dieses Aktivitätsprofils werden Azithromycin-Augentropfen als vielversprechender Kandidat für die Behandlung von bakterieller Bindehautentzündung angesehen.
BEISPIEL 7
Antimikrobielle Aktivität von Azithromycin-Auegntropfen
Ein Kaninchenmodell der Keratitis wurde in der Weise realisiert, dass S. aureus in das zentrale Hornhaut-Stroma eingebracht wurde. In beide Augen von acht weißen Neuseeland-Kaninchen (1,8 bis 2,0 kg) wurden intrastromal 10 μl einer Suspension injiziert, die ~ 1 × 10³ μfc/ml Staphylococcus aureus-Okularisolat enthielt. Es wurde eine kritische Untersuchung durch eine Schlitzlampe durchgeführt und die entsprechenden Zeichen für eine Augeninfektion wurden bis zum dritten Tag in 24-Stunden-Intervallen gemäß der modifizierten McDonald-Shadduck-Skala überwacht. Nach jeder Beoabachtung wurden Gruppen von zwei Kaninchen durch intravenöse Injektion von Tanax^® in der marginale Vene des Ohrs getötet. Die unmittelbar nach dem Töten entfernten Hornhäute wurden analysiert um die bakterielle Beladung bzw. Belastung zu bestimmen. 24 Stunden nach der Infektion mit S. aureus ist der Verlust der Hornhaut-Transparenz besonders im Bereich der Inokulation augenscheinlich. Es wurde auch eine Bindehautbeteiligung mit diffuser Rötung sowie eine erhöhte schleimig eitrige Sekrektion beobachtet. Die klinische Darstellung der nachfolgenden Beobachtungen bei 48 bis 72 Stunden zeigen ein schlechtes Ergebnis mit einem vollständigen Verlust der Hornhaut-Transparenz und mit eitriger Absonderung. Diese experimentelle Modell der Keratitis wurde dann zum Testen der antimikrobiellen Aktivität von Azithromycin-Augentrofen (0,3%, 1%, 2%) angewendet.
Sechszehn männliche Albino-Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von 1,8 bis 2,0 kg wurden beliebig in Gruppen (n = 3) aufgeteilt um topisch mit der Testsubstanz oder mit Plazebo-Augentropfen 24 Stunden nach der bakteriellen Inokulation behandelt zu werden. Die experimentellen Bedingungen werden wie folgt zusammengefasst:
Eine Stunde nach der letzten Instillation wurden die Tiere durch intravenöse Injektion von Tanax^® getötet. Die chirugisch entfernten Hornhäute wurden in 3 ml H₂O 0,1% Pepton gemahlen und homogenisiert. Aliquots des überstehenden Produkts wurden in Serien verdünnt (1 : 10) und 0,1 ml jeder Endsuspension mit Einschluss der unverdünnten Probe wurden auf Blut-Agarplatten (Columbia CNA-Agar) ausgebreitet. Die Platten wurden bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert, wonach die koloniebildenden Einheiten (kbE), ausgedrückt als log kbE/g des Gewebes für jede Hornhaut bestimmt wurden.
Die Verringerung der bakteriellen Belastung bei drei Gruppen von Kaninchen, behandelt mit unterschiedlichen Konzentrationen der Augentropfen von Azithromycin ist in 4 gezeigt. Die mittleren Werte der Verringerung der bakteriellen Beladung bzw. Belastung in den mit Azithromycin (2%) behandelten Hornhäuten sind geringfügig niedriger als im Falle derjenigen, die mit dem Träger behandelt worden waren. Jedoch ist es im Hinblick auf die Tatsache, dass ein günstiges pharmakokinetisches Profil für die Hornhaut bestimmt wurde (vergleiche Beispiel 4), möglich, anzunehmen, dass eine gesteigerte Konzentration von Azithromycin (> 2%), die auch als Salbe oder Gel oder als Form eines anderen Freisetzungssystems verabreicht wird, ebenfalls sich als genügend wirksam für die Augentherapie von bakterieller Keratitis erweisen wird.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Azithromycin enthaltenden wässrigen ophthalmischen Zubereitung, umfassend die Solubilisierung von ophthalmisch annehmbarem, mehrbasischem Phosphat in einer Menge im Bereich von 7,8 bis 68,6 g/l und von Zitronensäuremonhydrat in einer Menge im Bereich von 0,9 bis 35,94 g/l, und die nachfolgende Zugabe von Azithromycin in einer Menge im Bereich von 0,1 bis 100 g/l innerhalb eines Temperaturbereichs von 15–25°C, wobei das Molverhältnis von Azithromycin zu Zitronensäure gleich 1 : 0,67 – 1 : 1,5 ist; und wobei der pH-Wert auf einen Wert von 5,5–7,6 und bis zu einer Endosmolalität, die gleich 130–300 mOsm/kg ist, eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis von Azithromycin zu Zitronensäure 1,5 : 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das ophthalmisch annehmbare, mehrbasische Phosphat Dinatriumhydrogenphosphatdodecahydrat ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert im Bereich von 6,4 bis 7,6 liegt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach Solubilisierung des Azithromycins mindestens ein Tonizitätsmittel und/oder ein viskositätserhöhendes Mittel und/oder ein Gelierungsmittel und/oder ein Stabilisierungsmittel und ein Konservierungsmittel in ophthalmisch annehmbaren Mengen zugesetzt wird.
Wässrige, ophthalmische Zubereitung, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche.
Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Kombination mit Azithromycin mindestens ein weiteres ophthalmisch annehmbares therapeutisches Mittel mit antibakterieller Aktivität und/oder ein therapeutisches steroides oder nicht steroides Mittel mit entzündungshemmender Aktivität enthält.
Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das therapeutische Mittel mit antibakterieller Aktivität aus der Gruppe bestehend aus Aminoglycosiden, Fluorchinolonen, Tetracyclinen, Polymyxin, Glycopeptiden, Glycoproteinen, natürlichen und/oder synthetischen Peptiden, β-Lactamderivaten ausgewählt worden ist.
Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das steroide entzündungshemmende Mittel aus der Gruppe bestehend aus Desonid-2l-Phosphat, Dexamethason, Clobetason, Mometason, Betametason und Fluticason ausgewählt worden ist.
Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht steroide entzündungshemmende Mittel aus der Gruppe bestehend aus Naproxen, Diclofenac, Nimesulid und Flurbiprofen ausgewählt worden ist.
Zubereitung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wässrige Lösung, Salbe oder Gel vorliegt.
Verwendung der ophthalmischen Zubereitung nach einem der Ansprüche 6 bis 11 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats, das zur Behandlung von pathologischen Zuständen des Auges, die eine antibakterielle Therapie erfordern, verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der pathologische Zustand des Auges Conjunctivitis, Keratitis oder Blepharitis bedeutet.