DE69900714T2

DE69900714T2 - Verfahren und vorrichtung zur laminaren strömung an einer sensoroberfläche

Info

Publication number: DE69900714T2
Application number: DE69900714T
Authority: DE
Inventors: Magnus Malmqvist; Hakan Roos; Hakan Sjoedin; Stefan Sjoelander; Ralph Stalberg; Mattias Tidare
Original assignee: Biacore AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1998-01-20
Filing date: 1999-01-19
Publication date: 2002-06-27
Anticipated expiration: 2019-01-20
Also published as: US20060134800A1; JP2002509248A; US7582487B2; US7736587B2; US20090263285A1; DE69900714D1; US7811515B2; US20100260642A1; WO1999036766A1; JP4340766B2; EP1021703B1; US20090263284A1; US7105356B2; US20010055817A1; US6200814B1; EP1021703A1; US8021626B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Steuerung einer Fluidströmung über eine Sensoroberfläche innerhalb einer Durchflußküvette und spezieller die Verwendung von Techniken laminarer Strömungen zum Positionieren einer Fluidströmung über einem oder mehreren diskreten Sensorgebiet(en) innerhalb einer Durchflußküvette sowie die Verwendung derselben bei der Herstellung von Sensoroberflächen und bei damit zusammenhängenden analytischen Verfahren, Geräten und Systemen.

Hintergrund der Erfindung

Geräteausstattungen zur Echtzeit-Biomolecular Interaction Analysis (BIA) ist von Biacore AB (Uppsala, Schweden) unter dem Markennamen BIAcore (nachfolgend "das BIAcore- Instrument") kommerziell erhältlich. Das BIAcore-Instrument benutzt "Surface Plasmon Resonance (SPR)" zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Molekülen an der Oberfläche eines Sensorchips und enthält eine Verarbeitungseinheit mit Flüssigkeitshandling- und optischen Systemen, einen Sensorchip und einen Computer zur Steuerung und Datenauswertung. Ein Molekül, als "Ligand" bezeichnet, wird auf der Oberfläche des Sensorchips immobilisiert und das andere Molekül, der "Analyt", strömt über die Oberfläche des Sensorchips. Da der Analyt mit dem immobilisierten Liganden wechselwirkt, wird SPR verwendet, um eine Brechungsindexänderung an der Oberfläche des Sensorchips zu messen. Selektive Wechselwirkungen des Analyts mit dem immobilisierten Liganden verleihen dieser Technik Spezifität und ermöglicht auch eine Analyse von Wechselwirkungen in komplexen Mischungen.
Das BIAcore-Instrument ist ausgiebig verwendet worden, und eine große Menge an Literatur ist betreffend seines Betriebs und seiner Anwendbarkeit veröffentlicht worden. Zum Beispiel offenbart die veröffentlichte PCT WO 90/05295 ausführlicher die Konstruktion und den Betrieb des BIAcore-Instruments, während die veröffentlichten PCT-Anmeldungen WO 90/05303 und WO 90/05305 auf zahlreiche Sensoroberflächen zur Verwendung damit gerichtet sind. Ferner beschreiben die von BIAcore AB veröffentlichten BIAtechnology-, BIAapplication- und BIAcore-Handbücher in einiger Ausführlichkeit den Betrieb und die Konstruktion des BIAcore-Instruments.
Allgemein wechselwirkt ein in einer flüssigen Probe vorhandener Analyt mit dem damit assoziierten Liganden, z. B. einer Dextranmatrix, die an die Oberfläche des Sensorchips gebunden ist. Die Bindung des Analyten durch den Liganden führt zu einer Brechungsindexerhöhung, die in Echtzeit durch eine Änderung des durch SPR gemessenen Resonanzwinkels überwacht wird. Die Daten nehmen die Gestalt eines Sensorgramms an, das das Signal in Resonanzeinheiten (Resonance Units (RU)) als Funktion der Zeit darstellt. Ein Signal von 1000 RU entspricht der Bindung von ungefähr 1 ng Analyt pro mm² (Johnsson et al., Anal. Biochem. 198: 268-277, 1991; Fagerstam et al., J. Chromatography 597: 397- 410, 1992, Stenberg et al., Colloid and Interface Science 143: 513-526, 1991).
Während des Betriebs des BIAcore-Instruments wird die Probe unter Verwendung einer Integrated Micro-Fluidic Cartridge (IFC) zum Sensorchip gefördert. Die IFC besteht aus einer Reihe von hochgenau gegossenen Kanälen in einer Platte aus Hartsiliciumpolymer, die Probenschleifen und Strömungskanäle für Puffer- und Probenzufuhr bilden. Die IFC wird durch einen Andockmechanismus in dem BIAcore-Instrument in Kontakt mit dem Sensorchip gedrückt. Eine repräsentative IFC, wie sie von dem BIAcore-Instrument verwendet wird, ist in Fig. 1A dargestellt, die die Kanäle und Ventile (aus Sicht von oben) darstellt, wobei das Nebenbild eine Seitenansicht desselben zeigt und eine Durchflußküvette darstellt, die anhand des Pressens der IFC gegen den Sensorchip gebildet ist.
Die Probenströmung durch die IFC wird durch einen Satz von pneumatisch betätigten Membranventilen gesteuert, die die Probe durch die zahlreichen Kanäle zur Sensoroberfläche des Sensorchips leiten. Auf diese Weise erlaubt das BIAcore-Instrument (z. B. BIAcore 2000) eine Einzel- oder Mehrkanalanalyse in bis zu vier Durchflußküvetten. Beispielsweise Fig. 1B stellt eine Probe dar, die durch drei Durchflußküvetten in Reihe (als FC 1, FC 2 und FC 3 markiert) tritt. Obwohl nicht speziell in Fig. 1B dargestellt, kann die Probe auch durch genau eine einzige Durchflußküvette zur Analyse (z. B. FC 1) hindurchtreten.
Die vorhandenen BIAcore-Instrumente verwenden Durchflußküvetten mit einem Querschnittsgebiet von 0,05 · 0,5 mm und einer Länge von 2,4 mm, was ein Volumen von ungefähr 60 Nanolitern (nl) ergibt, und mit einem gesamten Sensoroberflächengebiet in jeder Durchflußküvette von näherungsweise 1,2 mm². Ein fokussiertes einfallendes Licht beleuchtet näherungsweise 1,6 mm der Länge der Sensoroberfläche jeder Durchflußküvette, wobei der Detektor ungefähr 0,17 mm der Breite der Sensoroberfläche abbildet. Dies entspricht einem Sensorgebiet innerhalb jeder Durchflußküvette von ungefähr 0,3 mm². Jede Durchflußküvette in dem BIAcore-Instrument enthält ein einziges Sensorgebiet. Wenn die Probe vier unterschiedliche Sensorgebiete berühren soll, ist somit ein Durchgang der Probe durch vier separate Durchflußküvetten erforderlich (z. B. FC 1, FC 2, FC 3 und FC 4).
Während die gegenwärtig in dem BIAcore-Instrument verwendete Probenzufuhr zu Mehrfachdurchflußküvetten zahlreiche Vorteile bietet und den Stand der Technik in Bezug auf Probenzuführtechniken darstellt, werden Verbesserungen daran unverändert gewünscht. Zum Beispiel im Zusammenhang mit kinetischen Messungen ist es wichtig, daß die Probe in einem genau definierten Volumen oder einer genau definierten "Scheibe" mit minimaler Dispersion an Probe-Puffer-Grenzen zugeführt wird. Eine derartige Probenscheibe wird durch Umschalten zwischen Proben- und Pufferströmung in der IFC mit Hilfe der pneumatischen Ventile geschaffen. Während Dispersion durch Geringhalten von Totvolumen zwischen den Ventilen und Durchflußküvetten minimiert wird, gibt es weiterhin Perioden am Anfang und am Ende der Probeneinführung, in denen die Konzentration der Probe durch Dispersion verdünnt wird (z. B. Mischen der Probe mit dem fließenden Puffer im System). Ferner erhöht sich die Dispersion mit der Anzahl der Durchflußküvetten in Reihe (wie in Fig. 1B dargestellt). Besagte Dispersion führt zu einer zeitlichen Nacheilung sowohl des Anstiegs als auch des Abfalls des Sensorgramms am Anfang und am Ende der Probeneinführung. Diese sogenannten "Anstiegs- und Abfallzeiten" begrenzen die Fähigkeit, schnelle Reaktionskinetiken (Wechselwirkungen mit hohen Geschwindigkeitskonstanten) aufzulösen. Ein Weg zur Lösung dieser Begrenzung besteht darin, die Durchflußmenge zu erhöhen. Unglücklicherweise bedeutet das Erhöhen der Durchflußmenge einen erhöhten Probenverbrauch. Es bestehen auch praktische und Gestaltungsbegrenzungen beispielsweise hinsichtlich Flüssigkeitsdruck, der eine obere Grenze für die Durchflußmenge liefert.
Zusätzlich können Temperaturvariationen zwischen Durchflußküvetten die Probenanalyse negativ beeinflussen. Da Brechungsindex, Reaktionskinetiken und Massentransport des Analyts zur Sensoroberfläche temperaturempfindlich sind, ist es wichtig, daß derartige Messungen bei gesteuerten Temperaturen durchgeführt werden. Aufgrund physikalischer Trennung der Durchflußküvetten und somit der Sensoroberflächen können Temperaturschwankungen zwischen Durchflußküvetten eine Meßfehlerquelle darstellen. Ferner erlauben die in den Fig. 1A und 1B dargestellten Durchflußküvetten keine gesteuerte Probenzufuhr zu diskreten Gebieten innerhalb einer einzelnen Durchflußküvette noch erlauben sie eine Immobilisierung von unterschiedlichen Liganden an diskreten Sensorgebieten innerhalb einer einzelnen Durchflußküvette. Statt dessen werden derartige Modifikationen nur innerhalb separater Durchflußküvetten erzielt und sind sie somit von den obengenannten Beschränkungen begleitet.
Dementsprechend besteht ein Bedarf in dem Fachgebiet an verbesserten Probezuführtechniken im Zusammenhang mit auf Durchflußküvetten basierenden Detektionsinstrumenten, wie z. B. das BIAcore-Instrument, sowie an anderen Instrumenten mit ähnlichem Design und ähnlicher Betriebsart. Letztendlich kann jedes Instrument, das eine meßbare Änderung einer mit einer auf einer Durchflußküvette basierenden Sensorstruktur verbundenen Eigenschaft von verbesserten Probenzuführtechniken äprofitieren. Derartige Verbesserungen sollten schnelle Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeiten zwischen Probe und Puffer liefern, eine Steuerung einer konstanten Temperatur über mehrfache Sensorgebiete aufrechterhalten und eine Vielzahl von Probenzuführtechniken zu mehrfachen Sensorgebieten innerhalb der Durchflußküvette erlauben.
Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse und liefert weitere damit verbundene Vorteile.
Die WO 96/35940 offenbart ein Verfahren zum Aufbringen von kolloidalem Gold auf einer Wellenschicht unter Verwendung von flüssigkeitsmäßig getrennten laminaren Strömungen kolloidaler Ströme und Pufferströme. Die kolloidalen Ströme sind durch einen Pufferstrom voneinander getrennt. Die kolloidalen Ströme bringen Goldkolloidstreifen auf der Wellenführungsschicht auf.
Die WO 97/01087 offenbart ein Verfahren zur Analyse von fließfähigen Proben. Ein Probenfluid strömt von einer Einlaßöffnung zu einer Auslaßöffnung und ein Referenzfluid strömt von einer anderen Einlaßöffnung zu derselben Auslaßöffnung, wobei die Strömungsrichtungen entgegengesetzt zueinander sind. Beide Strömungen sind laminar, so daß die zwei Strömungen sich an einer scharfen Trennlinie bzw. Trennfläche treffen. Die Trennlinie zwischen den zwei Fluidströmen läuft transversal zur Richtung der zwei Fluidströme und kann durch Variieren der relativen Durchflußmengen der zwei Fluidströme zu den jeweiligen Einlaßöffnungen oder davon weg bewegt werden. Eine weitere Ausführungsform offenbart eine Durchflußküvette mit mehreren Einlaßöffnungen, die eine Reihe von parallelen laminaren Strömungen von Proben- und Referenzfluiden hervorrufen. Die Referenzströmungen wirken als Trennwände zwischen den Probenströmungen. Die Durchflußmengen können durch Verschieben der Trennwände reguliert werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Kurz gesagt ist die vorliegende Erfindung auf die Steuerung einer Fluidströmung über einer Sensoroberfläche innerhalb einer Durchflußküvette und spezieller auf die Verwendung von Techniken laminarer Strömungen zum Positionieren der Fluidströmung über einem oder mehreren diskreten Sensorgebiet(en) in der Durchflußküvette gerichtet. Noch genauer kann eine Grenzfläche zwischen den zwei Strömungen durch Variieren der individuellen Durchflußmengen von wenigstens zwei laminaren Fluidströmungen seitlich über die Sensoroberfläche innerhalb der Durchflußküvette bewegt werden. Auf diese Weise können die Strömungen steuerbar innerhalb der Durchflußküvette über einem oder mehreren diskreten Sensorgebiet(en) positioniert werden und erlaubt dies ferner einen weiten Bereich von Oberflächenmodifikation und/oder Wechselwirkung an den diskreten Sensorgebieten.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert ein Verfahren zum Sensibilisieren einer Sensoroberfläche, die angeordnet ist, um von einer Flüssigkeitsströmung passiert zu werden. Der Begriff "Sensibilisieren" bedeutet jeder Prozeß bzw. jede Aktivierung der Sensoroberfläche, der/die dazu führt, daß die Oberfläche mit einem gewünschten Analyten spezifisch wechselwirken kann. Dieses Verfahren umfaßt ein Bereitstellen einer laminaren Strömung eines ersten Sensibilisierfluids und einer laminaren Strömung einer zweiten Flüssigkeit benachbart zur Strömung des ersten Sensibilisierfluids, so daß die zwei laminaren Strömungen gemeinsam über die Sensoroberfläche mit einer Grenzfläche zueinander strömen, wobei zumindest das erste Fluid die Sensoroberfläche sensibilisieren kann, und Einstellen der relativen Durchflußmengen einer oder beider laminarer Strömungen, um die Grenzfläche zwischen den Strömungen so zu positionieren, daß jede laminare Strömung ein definiertes Gebiet der Sensoroberfläche zur selektiven Sensiblisierung derselben berührt.
In einer Ausführungsform wird die Sensoroberfläche durch Berühren der Oberfläche mit einem ersten Fluid, das dieselbe sensiblisiert, und einem zweiten Fluid sensibilisiert, das die Oberfläche nicht sensibilisiert. In einer Variante dieser Ausführungsform wird die Prozedur derart wiederholt, daß das erste Fluid durch ein Fluid ersetzt wird, das die Sensorfläche nicht sensibilisert, und das zweite Fluid durch ein Fluid ersetzt wird, das die Sensoroberfläche anders als das erste Fluid sensibilisieren kann, um zwei unterschiedlich sensibilierte Gebiete zu erzeugen, die optional durch ein nicht-sensiblisiertes Gebiet der Sensoroberfläche voneinander beabstandet oder dazu benachbart sind. In weiteren Ausführungsformen kann ein stufenartiger Gradient durch Variieren der relativen Durchflußmengen der laminaren Strömungen zum seitlichen Verschieben der Grenzfläche und Liefern eines Gradientsensibilisierten Gebietes auf der Sensoroberfläche oder alternativ durch kontinuierliches Variieren der relativen Durchflußmengen der laminaren Strömungen zum Erzeugen eines kontinuierlichen Gradientsensibilisierten Gebietes erzeugt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine zusätzliche laminare Strömung eines dritten Fluids auf der anderen Seite der Strömung des ersten Sensibilisierfluids bereitgestellt, so daß die laminare Strömung des ersten Sensibilisierfluids zwischen den laminaren Strömungen der zweiten und dritten Fluide liegt. Dies ermöglicht es, daß die Strömung des ersten Fluids seitlich auf der Sensoroberfläche positioniert wird. Wenn die zweiten und dritten Fluide, die dieselben oder unterschiedliche Flüssigkeiten sein können, nicht die Sensoroberfläche sensibilisieren können, kann ein Streifen oder eine Reihe von Sensibilisisierfluid auf der Sensoroberfläche steuerbar positioniert werden. Durch aufeinanderfolgendes Wiederholen der obigen Prozedur mit wenigstens einem anderen ersten Sensibilisierfluid und mit variierten relativen Durchflußmengen der zweiten und dritten Fluide können zwei oder mehr Reihen von sensibilisierten Oberflächengebieten auf der Sensoroberfläche bereitgestellt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Verfahren zum Erzeugen entweder einer Reihe oder einer Matrix mit sensiblisierten Gebieten auf der Sensoroberfläche verwendet. Dies kann durch Wiederholen der Prozedur mit einem anderen Sensibilisierfluid oder -fluiden und Anlegen der laminaren Strömungen unter einem Winkel, typischerweise quer, zur ursprünglichen Strömungsrichtung erzielt werden. Derartige Reihen oder Matrizen weisen eine Anzahl von vorteilhaften Anwendungen auf, wie sie ausführlicher unten beschrieben werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung liefert ein Verfahren zur Analyse einer Fluidprobe auf einen oder mehrere Analyten. Diese Verfahren umfaßt ein Sensibilisieren einer Sensoroberfläche durch Immobilisieren eines Analyt-spezifischen Liganden auf der Sensoroberfläche durch hierin beschriebene Verfahren, Berühren der Sensoroberfläche mit der Fluidprobe und Detektieren der Wechselwirkung des Analyts in der Fluidprobe mit dem sensiblisierten Gebiet bzw. Gebieten der Sensoroberfläche. Ein oder mehrere nicht- sensbilisierte(s) Gebiet(e) kann/können als ein Referenzgebiet oder Referenzgebiete verwendet werden oder alternativ kann/können ein oder mehrere Gebiet(e), das/die mit einem Steuerliganden sensibilisiert ist/sind, verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung liefert ein Verfahren zum Analysieren einer Fluidprobe auf einen Analyten, wo eine laminare Strömung des Fluids die Probenströmung auf dem gewünschten sensibilisierten Gebiet bzw. Gebieten positionieren soll. Das Verfahren umfaßt ein Bereitstellen eines sensibilisierten Gebietes auf der Sensoroberfläche einer Durchflußküvette, wobei das sensibilisierte Gebiet selektiv mit dem Analyten wechselwirken kann; Leiten einer ersten laminaren Strömung der Fluidprobe über die Sensoroberfläche, aber nicht in Kontakt mit den sensibilisierten Gebiet; Leiten einer zweiten laminaren Strömung eines Fluids, das fähig ist, mit dem sensibilisierten Gebiet zu wechselwirken, über die Sensoroberfläche, wobei die zweite laminare Strömung benachbart zur ersten laminaren Strömung verläuft und damit eine Grenzfläche bildet; Einstellen der relativen Durchflußmengen der ersten und/oder zweiten laminaren Strömungen, so daß die erste laminare Strömung der Fluidprobe über das sensibilisierte Gebiet tritt; und Detektieren einer Wechselwirkung eines Analyts in der Fluidprobe bei Kontakt mit dem sensibilisierten Gebiet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung liefert ein Verfahren zum Analysieren einer Fluidprobe auf einen Analyten, wo die gesamte Sensoroberfläche sensibilisiert ist und nur ein Teil der sensibilisierten Oberfläche mit der Probenströmung in Kontakt gebracht wird, während der andere Teil als ein Referenzgebiet verwendet wird. Auf diese Weise können Ausbluten sowie andere unkontrollierbare Ereignisse auf der Sensoroberfläche durch Referenzmessung herausgenommen werden. Dieses Verfahren umfaßt ein Bereitstellen einer sensibilisierten Oberfläche, die selektiv mit dem Analyten wechselwirken kann; Leiten einer ersten laminaren Strömung der Fluidprobe über einen ersten Teil der sensibilisierten Oberfläche (d. h. ein erstes Sensorgebiet); simultanes Leiten einer zweiten laminaren Strömung eines Fluids, das mit der sensibilisierten Oberfläche über dem Rest der sensibilisierten Oberfläche (d. h. einem zweiten Sensorgebiet) nicht wechselwirken kann, wobei die zweite laminare Strömung benachbart zur ersten laminaren Strömung verläuft und das zweite Sensorgebiet als ein Referenzgebiet dient; und Detektieren einer Wechselwirkung eines Analyts in der Fluidprobe mit dem ersten Sensorgebiet. In einer weiteren Ausführungsform werden die relativen Durchflußmengen der ersten und/oder zweiten laminaren Strömungen derart eingestellt, daß die erste laminare Strömung über wenigstens einen Bereich des zweiten Sensorgebietes tritt, und eine Wechselwirkung eines Analyts in der Probenströmung mit diesem neu kontaktierten Bereich des zweiten Sensorgebietes detektiert wird.
Weitere Aspekte der Erfindung liefern Verfahren zur Untersuchung der Assoziation oder Dissoziation eines Analyts mit oder von einer Sensoroberfläche, wo Techniken laminarer Strömungen verwendet werden, um eine Probenfluidströmung schnell seitlich in einer Durchflußküvette zu einer Position zu verschieben, wo die Probenströmung ein sensibilisiertes Sensorgebiet berührt. Das Verfahren zur Untersuchung der Assoziation umfaßt ein Bereitstellen einer Durchflußküvette mit einem sensibilisierten Sensorgebiet auf einer Sensoroberfläche derselben, das mit dem Analyt wechselwirken kann; Leiten einer Fluidprobe in einer ersten laminaren Strömung durch die Durchflußküvette; Leiten eines analytfreien Fluids in einer zweiten laminaren Strömung durch die Durchflußküvette, wobei die zweite laminare Strömung benachbart zur ersten laminaren Strömung verläuft und damit eine Grenzfläche bildet; Einstellen der relativen Durchflußmengen der Fluidströmungen zum Plazieren der Grenzfläche zwischen den laminaren Strömungen, so daß die Probenfluidströmung nicht das sensibilisierte Sensorgebiet berührt; Ändern der relativen Durchflußmengen der laminaren Strömungen zum seitlichen Verschieben der Grenzfläche, so daß die Probenströmung das sensibilisierte Sensorgebiet berührt; und Bestimmen einer Assoziation eines Analyts mit dem sensibilisierten Sensorgebiet. In ähnlicher Weise umfaßt das Verfahren zur Untersuchung der Dissoziation ein seitliches Verschieben der Probenströmung, so daß die Probenströmung nicht länger mit dem sensibilisierten Sensorgebiet in Kontakt steht; und Bestimmen einer Dissoziation eines Analyts von dem sensibilisierten Sensorgebiet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung liefert ein Sensorgerät mit einer Durchflußküvette mit einem Einlaßende und einem Auslaßende; wenigstens einer Sensoroberfläche an einer zwischen den Einlaß- und Auslaßenden angeordneten Wandfläche in der Durchflußküvette; wobei die Durchflußküvette wenigstens zwei Einlaßöffnungen an dem Einlaßende und wenigstens eine Auslaßöffnung an dem Auslaßende aufweist, so daß durch die jeweiligen Einlaßöffnungen in die Durchflußküvette eintretende separate laminare Fluidströmungen nebeneinander durch die Durchflußküvette strömen und die Sensoroberfläche berühren können. In einer Ausführungsform des Sensorgerätes weist die Durchflußküvette zwei Einlaßöffnungen und wenigstens eine Auslaßöffnung auf und ist sie vom Y- Durchflußküvettentyp (d. h. mit zwei Einlässen und einem einzigen Auslaß). In einer weiteren Ausführungsform weist die Durchflußküvette drei Einlaßöffnungen und wenigstens eine Auslaßöffnung zum Herstellen von drei laminaren Fluidströmungen in einer Sandwichweise durch die Durchflußküvette auf und ist sie vom Ψ-Durchflußküvettentyp (d. h. mit drei Einlässen und einem einzigen Auslaß).
In einer weiteren Ausführungsform ist die Durchflußküvette ein zweidimensionaler Typ. Eine Variante einer derartigen zweidimensionalen Durchflußküvette weist wenigstens zwei erste Einlässe und wenigstens einen ersten Auslaß, und in einer Winkelbeziehung zum Fluiddurchgang zwischen diesen (gewöhnlich quer), wenigstens zwei zweite Einlässe und wenigstens einen zweiten Auslaß auf. Eine repräsentative Durchflußküvette dieses Typs stellt eine zweidimensionale Ψ-Küvette dar. Eine weitere Variante einer zweidimensionalen Durchflußküvette weist eine Sensoroberfläche auf, die drehbar innerhalb der Durchflußküvette angebracht ist, um zu ermöglichen, daß sie in zwei Dimensionen von Fluidströmungen passiert wird. Die Sensoroberfläche kann wenigstens zwei benachbarte Sensorgebiete in der Strömungsrichtung der Durchflußküvette, insbesondere wenigstens ein Sensorgebiet und wenigstens ein Referenzgebiet, aufweisen. Vorzugsweise ist wenigstens ein Sensorgebiet fähig, mit einem Analyten spezifisch zu wechselwirken.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung liefert ein Sensorsystem mit einer Durchflußküvette mit einem Einlaßende und einem Auslaßende; wenigstens einem Sensorgebiet auf einer Sensoroberfläche in der Durchflußküvette zwischen den Einlaß- und Auslaßenden; wobei die Durchflußküvette wenigstens zwei Einlaßöffnungen an dem Einlaßende und wenigstens eine Auslaßöffnung an dem Auslaßende aufweist; Mitteln zum Anlegen von laminaren Fluidströmungen durch die Einlaßöffnung, so daß die laminaren Fluidströmungen nebeneinander durch die Durchflußküvette über die Sensoroberfläche treten; Mitteln zum Variieren der relativen Durchflußmengen der laminaren Fluidströmungen zum Variieren der jeweiligen seitlichen Erstreckungen der laminaren Strömungen über der Sensoroberfläche mit dem Sensorgebiet bzw. den Sensorgebieten; und Detektionsmitteln zum Detektieren von Wechselwirkungsereignissen an dem Sensorgebiet bzw. den Sensorgebieten.
Diese und weiter Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen und die folgende ausführliche Beschreibung ersichtlich werden. Ferner sind bestimmte Referenzen hierin zum Zwecke der Klarheit und Vollständigkeit zitiert worden. Besagte Referenzen werden hierin durch Bezugnahme in deren Vollständigkeit aufgenommen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A (Stand der Technik) stellt die Kanäle und Ventile in einer IFC aus Sicht von oben dar, während das Nebenbild eine Seitenansicht davon zeigt, wie die Durchflußküvetten durch Pressen des Sensorchips gegen die IFC gebildet werden. Fig. 1B (Stand der Technik) stellt eine Probenströmung durch drei von vier Durchflußküvetten dar (die leeren und vollen Kreise geben jeweilige offene und geschlossene Ventile wieder).
Die Fig. 2A und 2B stellen eine Y-Durchflußküvette mit zwei laminaren Strömungen (eine Pufferströmung und eine Probenströmung) dar.
Fig. 3A stellt die benachbart zum Sensorgebiet positionierte Probengrenzfläche dar, während Fig. 3B das das Sensorgebiet bedeckende Probenfluid zeigt.
Fig. 4A stellt eine Y-Durchflußküvette mit zwei Sensorgebieten dar, wobei sich die Probenströmung anfänglich benachbart zu beiden Sensorgebieten befindet, während Fig. 4B die Grenzfläche zeigt, die derart verschoben ist, daß die Probenströmung eines der Sensorgebiete berührt.
Fig. 5A und 5B stellen eine repräsentative Ψ-Durchflußküvette mit zwei Pufferströmungseinlässen und einem Probenströmungseinlaß dar.
Fig. 6 gibt eine Diffusion in einer Y-Durchflußküvette über Kontaktzeit, t, wieder, wobei f die Durchflußmenge, L die Länge der Durchflußküvette und A das Querschnittsgebiet der Durchflußküvette ist.
Fig. 7A stellt die Konzentration der Probe zu unterschiedlichen Kontaktzeiten in einem Querschnitt der Y-Durchflußküvette dar, während Fig. 7B die Konzentration der Probe zu unterschiedlichen Kontaktzeiten in einem Querschnitt der Ψ-Durchflußküvette zeigt.
Fig. 8 stellt die Bildung eines Gradienten in der Y-Durchflußküvette durch Änderung der Proben- und Pufferdurchflußmengen während einer Sensibilisierung der Sensoroberfläche dar.
Fig. 9 stellt eine Y-Durchflußküvette mit zwei diskreten Sensorgebieten dar.
Fig. 10 stellt eine Ψ-Durchflußküvette mit drei diskreten Sensorgebieten dar.
Fig. 11A stellt eine repräsentative zweidimensionale (2D) Ψ-Durchflußküvette dar, wobei Fig. 11B einen Querschnitt derselben zeigt.
Die Fig. 12A bis 12E stellen die Erzeugung von sensibilisierten Reihen auf der Sensoroberfläche und eines überlappenden Sensorgebietes dar.
Die Fig. 13A bis 13E stellen die Erzeugung einer sensibilisierten Matrix der vorliegenden Erfindung dar.
Fig. 14B stellt eine Durchflußküvette mit zwei sensibilisierten Gebieten und einen nicht- sensibilisierten Gebiet dar, wobei die Probenströmung alle drei Gebiete berührt. Fig. 14B stellt eine alternative Ausführungsform mit zwei sensibilisierten Gebieten und einem nicht- sensibilisierten Gebiet dar, wobei die Probenströmung ein sensibilisiertes Gebiet und das nicht-sensibilisierte Gebiet berührt.
Fig. 15 stellt eine repräsentative Y-Durchflußküvette dar.
Fig. 16 stellt eine repräsentative eindimensionale (1D)-Ψ-Durchflußküvette dar.
Fig. 17A stellt die Diffusionsbreite der 1D-Ψ-Durchflußküvette, gemessen 2 mm und 10 mm von dem Einlaß für unterschiedliche Durchflußmengen (d. h. unterschiedliche Kontaktzeiten), dar, und Fig. 17B stellt die Diffusionsbreite gegenüber der Kontaktzeit graphisch dar.
Fig. 18 stellt die Diffusionsbreiten von unterschiedlichen Proteinen und Molekülen bei unterschiedlichen Durchflußmengen und unterschiedlichen Konzentrationsgrenzen graphisch dar.
Fig. 19 ist ein schematischer Querschnitt einer Ψ-Küvette mit der relativen Probenkonzentration auf der y-Achse und Länge auf der x-Achse, senkrecht zur Strömungsrichtung (die Positionierbreite ist die Breite, wo die Probenkonzentration > 99,9% ist und die Separationsbreite ist, wo die Probenkonzentration < 0,1% ist).
Die Fig. 20A, 20B, 20C und 20D stellen die Verwendung einer Ψ-Durchflußküvette zur Dialyse dar.
Die Fig. 21A und 21B geben den Teil des Sensorgramms wieder, der jeweils die Anstiegs- und Abfallzeiten für unterschiedliche Durchflußküvetten zeigt, und Fig. 21C zeigt eine graphische Darstellung der Anstiegszeit gegenüber Probenströmung.
Fig. 22 präsentiert einen Vergleich der Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeitskonstanten für repräsentative Y-, IFC3- und IFC4-Durchflußküvetten.
Die Fig. 23A bis 23F stellen eine Sensibilisierung an zwei diskreten Sensorgebieten und eine selektive Analyse von für derartige diskrete Sensorgebiete spezifische Analyten dar.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie oben erwähnt, ist die vorliegende Erfindung allgemein auf die Steuerung einer Fluidströmung über einer Sensoroberfläche unter Verwendung von Techniken laminarer Strömungen, um das Fluid (auch hierin als "Probenströmung" oder "Probe" bezeichnet) in Kontakt mit einem oder mehreren diskreten Gebiet(en) auf der Sensoroberfläche (genannt "Sensorgebiete") zu bringen, als auch auf die Herstellung von Sensoroberflächen und in analytischen Verfahren sich darauf beziehende Geräte und Systeme gerichtet. Im Zusammenhang mit der Herstellung einer Sensoroberfläche kann ein Gigant mit einem diskreten Sensorgebiet auf der Sensoroberfläche (hierin als "Sensibilisierung" bezeichnet) durch selektives Berühren des diskreten Sensorgebietes der Sensoroberfläche mit einer den Liganden enthaltenden Probe unter laminaren Strömungsbedingungen in einer Durchflußküvette assoziiert werden. Die Konfiguration und Abmessungen der Durchflußküvetten dieser Erfindung können in Abhängigkeit von der spezifischen Anwendung und/oder dem Detektionsverfahren breit variieren.
Für diesen Zweck enthalten repräsentative Detektionsverfahren, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Massendetektionsverfahren, wie z. B. piezoelektrische, optische, thermooptische und Oberflächeakustikwellen (Surface Acoustic Wave (SAW))-Verfahren und elektrochemische Verfahren, wie z. B. potentiometrische, konduktometrische, amperometrische und kapazitive Verfahren. Hinsichtlich optischer Detektionsverfahren enthalten repräsentative Verfahren diejenigen, die Massenoberflächenkonzentration detektieren, wie z. B. reflektions-optische Methoden, einschließlich Verfahren interner und externer Reflexion, winkel-, wellenlängen- oder phasenaufgelöst, z. B. Ellipsometrie und Oberflächenspektroskopie (evanescent wave spectroscopy (EWS)), wobei letztere surface plasmon resonance (SPR)-Spektroskopie einschließt, Brewsterwinkel-Refraktometrie, Grenzwinkelrefraktometrie, gestörte Totalreflexion (frustrated total reflection (FTR)), Oberflächenwellenellipsometrie, scattered total internal reflection (STIR), optische Wellenleitersensoren, auf Oberflächenwellen basierendes Abbilden, wie z. B. grenzwinkelaufgelöstes Abbilden, Brewsterwinkel- aufgelöstes Abbilden, SPR-Winkel-aufgelöstes Abbilden und dergleichen. Ferner können auch photometrische Verfahren auf der Grundlage von z. B. abklingender Fluoresenz (evanescent fluorescence (TIRF)) und Phosphoresenz verwendet werden sowie Hohlleiterinterferometer. Während die vorliegende Erfindung nachfolgend im Zusammenhang mit SPR-Spektroskopie dargestellt wird, sollte es verständlich sein, daß die Erfindung nicht auf diese Art beschränkt ist. Stattdessen kann irgendeine Geräteausstattung oder Technik, bei der eine Probe mit einer Sensoroberfläche innerhalb einer Durchlußküvette unter laminarem Strömungsbedingungen in Kontakt gebracht wird, von dieser Erfindung profitieren.
Wie oben erwähnt, bringt die vorliegende Erfindung ein Berühren einer Probe mit einem oder mehreren diskreten Sensorgebiet(en) auf der Sensoroberfläche unter laminaren Strömungsbedinungen in einer Durchflußküvette mit sich. Wie hierin verwendet, entspricht der Begriff "laminare Strömung" einer Reynolds-Zahl unter 2000 und vorzugsweise unter 20. Die Reynolds-Zahl (Re) wird dazu verwendet, den Charakter einer Flüssigkeitsströmung über der Sensoroberfläche zu beschreiben und kann durch die folgende Gleichung (1) ausgedrückt werden:
Re =vdρ/u (1),
weil V die mittlere lineare Durchflußgeschwindigkeit (m/s) ist, d der Durchmesser der "Leitung" (m) ist, ρ die Dichte des Fluids (kg/m³) und u die absolute Viskosität des Fluids (Ns/m²) ist. Im Zusammenhang mit einer Durchlußküvette mit einem rechteckigen Querschnitt wird der Leitungsdurchmesser geeigneterweise durch den hydraulischen Durchmesser (Dh) ersetzt, der durch das vierfache des Querschnittsgebietes geteilt durch den Umfang der Durchflußküvette (d. h. Dh = 2wh/(w + h) gegeben ist, wobei w und h jeweils die Breite und die Höhe der Durchflußküvette sind). Somit kann die Reynolds-Zahl einer Durchflußküvette mit einem rechteckigen Querschnitt durch Gleichung (2) genauer wiedergegeben werden:
Re = VDhρ/u (2).
Es sollte angemerkt werden, daß die Gleichung (2) von der Annahme ausgeht, daß die Sensoroberfläche ideal glatt und mit einer Krümmung versehen ist, die vernachlässigt werden kann. Somit kann jede Unregelmäßigkeit, sichtbare Krümmung der Oberfläche oder scharfe Biegungen in der Durchflußküvette zur Bildung von örtlicher Turbulenz führen und sollte vermieden werden. Ferner wird eine laminare Strömung in der Durchflußküvette am besten in gewisser Entfernung vom Eintritt des Fluids in die Durchflußküvette erzielt. Für diesen Zweck haben Weber und Prudy (Anal. Chim. Acta 100: 531, 1978) die folgende Gleichung (3) zur Sicherstellung einer laminaren Strömung in einer Entfernung von einem Durchflußküvetteneingang (Le) vorgeschlagen:
Le 0.05·ReDh (3).
Wie in dem obigen Hintergrundabschnitt erwähnt, begrenzen die Anstiegs- und Abfallzeiten einer auf einer Durchflußküvette basierenden Messung (d. h. die Zeit, die benötigt wird, damit die Probenkonzentration von 0% auf 100% über der Sensoroberfläche ansteigt und dann auf 0 zurückfällt) die Fähigkeit, schnelle Reaktionskinetiken aufzulösen. Am Anfang und am Ende einer Probeneinführung wird die Probe durch Dispersion mit der Trägerlösung (z. B. Puffer) verdünnt. Somit gibt es statt sofortiger Anstiegs- und Abfallzeiten eine zeitliche Nacheilung aufgrund von Dispersion der Probe. Besagte Dispersion kann, als eine erste Näherung, durch einen kinetischen Prozeß erster Ordnung entsprechend Gleichung (4) beschrieben werden:
dC/dt = kLqx(C&sub0; - C) oder dC/dt + kLqxC = kLqxC&sub0; (4),
wobei kLqx die Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeitskonstante ist, C&sub0; die Konzentration der Probe und C die Konzentration der Probe an der Sensoroberfläche ist.
In dem BIAcore-Instrument wird die Konzentration der Probe an der Sensoroberfläche, C, von der Dispersion in der Durchlußküvette beherrscht. Multiplizieren der Gleichung (4) mit dem Integrationsfaktor ekLqx und Integrieren derselben ergibt die folgende Gleichung (5):
C = C&sub0;(1 - e-kLqxt) (5).
Diese Gleichung beschreibt näherungsweise den Anstieg der Probenkonzentration an der Sensoroberfläche während eines Flüssigkeitsaustausches. Die von dem Flüssigkeitsaustausch erforderliche Zeit kann z. B. als die Zeit zum Erreichen von 99% des Endwertes definiert werden. Unter Verwendung von Gleichung (5) kann somit die Anstiegszeit ausgedrückt werden durch Gleichung (6):
0.99 = C/C&sub0; = (1 - e-kLqxt) Anstiegszeit = t0,99 = 4.6/ KLqx0.99 (6).
Wenn die Anstiegszeit auf 99% bekannt ist, kann somit die Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeitskonstante kLqx, anhand der Gleichung (6) berechnet werden. In ähnlicher Weise wird die Gleichung erster Ordnung für den Flüssigkeitsaustausch während des Abfalls beschrieben durch Gleichung (7):
C = C&sub0;·ekLqxt (7),
die die folgende Gleichung (8) für die Zeit ergibt, die zum Abfallen auf 1% des Plateauwerts benötigt wird:
0.01 = (ekLqxt) Abfallzeit = t0.01 = 4.6/kLqx0.01 (8).
Um eine experimentelle Beziehung zwischen Anstiegszeit (oder Abfallzeit) und Durchflußmenge zu erhalten, kann die Anstiegszeit auf 99% der Konzentration im stationären Zustand (oder Abfallzeit auf 0,01%) gemessen und gegen Probenströmung gemäß Gleichung (9) aufgetragen werden:
Anstiegszeit = Va·60/Probenströmung (9)
wobei Va dem Probenvolumen (ul) entspricht, das während eines Fluidaustausches verschoben werden muß. In Gleichung (9) ist die Probenströmung als ein Probenvolumen pro Zeiteinheit (ul/min) ausgedrückt und die Anstiegszeit in Sekunden (somit das Vorhandensein der 60 sec/min-Umwandlung) gemessen. Experimentelle Ergebnisse für repräsentative Durchflußküvetten dieser Erfindung werden in Beispiel 4 präsentiert. Durch Bestimmen von Va anhand experimenteller Daten kann die Gleichung (9) verwendet werden, um Anstiegszeiten für unterschiedliche Probenströmungen zu berechnen.
Ferner kann Gleichung (9) auch verwendet werden, um einen Ausdruck für die Zeit zum Ansteigen auf 99% der ursprünglichen Konzentration zu erhalten. Durch Kombinieren der Gleichungen (6) und (9) kann die Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeitskonstante ausgedrückt werden als Gleichung (10):
Unter geeigneten Bedingungen kann diese Gleichung verwendet werden, um die Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeitskonstante für unterschiedliche Durchflußküvetten zu berechnen. Je größer KLqx ist, desto schneller sind die Reaktionskinetiken, die gemessen werden können. Ein Vergleich von Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeiten wird in Beispiel 4 für unterschiedliche Durchflußmengen durch repräsentative Durchflußküvetten dieser Erfindung präsentiert.
In Bezug auf geeignete Durchflußküvetten zur Verwendung in der Praxis dieser Erfindung können derartige Durchflußküvetten eine Zahl von Formen annehmen, wobei deren Gestaltung in Abhängigkeit von der beabsichtigten Anwendung und/oder Verwendung breit variieren kann. Während mehrere repräsentative Durchflußküvetten hierin zu Darstellungszwecken offenbart sind, sollte man erkennen, daß jeder Typ von Durchflußküvette, der geeignet ist, um eine flüssige Probe mit einer Sensoroberfläche unter laminaren Strömungsbedinungen in Kontakt zu bringen, bei der Umsetzung dieser Erfindung verwendet werden kann.
In einer Ausführungsform weist eine Durchflußküvette dieser Erfindung zwei Einlässe und einen Auslaß auf, so daß zwei Flüssigkeitsströme über deren jeweilige Einlässe in die Durchflußküvette eintreten und sich durch die Durchflußküvette nebeneinander bewegen und unter laminaren Strömungsbedingungen den Auslaß verlassen. Eine Sensoroberfläche ist entlang eines Wandbereiches des Innenvolumens der Durchflußküvette angeordnet, so daß wenigstens einer der Flüssigkeitsströme die Sensoroberfläche berührt. Eine repräsentative Durchflußküvette dieser Ausführungsform ist in den Fig. 2A und 2B dargestellt und hierin als "Y-Durchflußküvette" bezeichnet.
Unter Bezugnahme auf Fig. 2A ist dort eine Querschnittansicht einer Y-Durchflußküvette 200 dargestellt, die Einlaßarme 210 und 220 und ein Auslaßende 250 aufweist. Die Durchflußküvette weist eine innere Länge 1, Breite w und Höhe h (nicht gezeigt) auf. Ein erstes Fluid (wie z. B. ein Puffer), dargestellt durch einen Pfeil 230, tritt über einen Einlaß 210 in die Durchflußküvette 200 ein, und ein zweites Fluid (wie z. B. eine Probe), durch einen Pfeil 240 dargestellt, tritt durch einen Einlaß 220 (in Fig. 2A ist das zweite Fluid 240 zu Darstellungszwecken schattiert) ein. Die ersten und zweiten Fluide legen eine Länge 1 der Durchflußküvette unter laminaren Strömungsbedinungen zurück, so daß eine Grenzfläche 290 das erste Fluid 230 von dem zweiten Fluid 240 trennt, wobei beide Fluide das Auslaßende 250 der Durchflußküvette verlassen, wie es durch einen Pfeil 270 gezeigt ist.
Eine isometrische Ansicht einer repräsentativen Y-Durchflußküvette ist in Fig. 2B dargestellt. In dieser Figur weist eine Y-Durchflußküvette 201 Einlaßarme 235 und 245 auf, die jeweils Einlässe 215 und 225 enthalten und einen gemeinsamen Auslaß 255 aufweisen. Ein erstes Fluid, durch einen Pfeil 245 wiedergegeben, tritt über einen Einlaß 215 in die Durchflußküvette, während eine zweites Fluid, durch einen Pfeil 275 wiedergegeben, über einen Einlaß 225 in die Durchflußküvette eintritt. Die zwei Fluide bewegen sich in Richtung eines Auslasses 255 unter laminaren Strömungsbedinungen, so daß eine Grenzfläche 295 das erste Fluid 265 vom zweiten Fluid 275 trennt, wobei beide Fluide den Auslaß 255 verlassen, wie es durch einen Pfeil 285 dargestellt ist.
Wenn die zwei Fluide sich durch die in den Fig. 2A und 2B dargestellte Y- Durchflußküvette bewegen, kommt wenigstens eines der Fluide mit einem diskreten Sensorgebiet entlang eines Wandbereiches innerhalb des inneren Volumens der Durchflußküvette in Kontakt, wie es durch Sensorgebiete 260 und 261 in den jeweiligen Fig. 2A und 2B dargestellt ist. Die Wechselwirkung zwischen dem Fluid und dem Sensorgebiet kann eine Vielzahl von Wechselwirkungen mit sich bringen, wie es unten ausführlicher beschrieben wird. Besagte Wechselwirkungen können durch Verwendung von Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Sensortechniken detektiert werden, die das Sensorgebiet von der "Rückseite", das heißt von der gegenüberliegenden Seite des mit dem Fluid in Kontakt befindlichen Sensorgebietes abtasten. Alternativ können besagte Wechselwirkungen durch Sensortechniken detektiert werden, die das Sensorgebiet von der "Vorderseite", das heißt von der mit dem Fluid in Kontakt befindlichen Seite des Sensorgebietes abtasten. Ein derartiges Detektieren kann zur selben Zeit, zu der das Fluid mit dem Sensorgebiet in Kontakt steht, oder zu einer gewissen nachfolgenden Zeit durchgeführt und kann durchgeführt werden, während das Sensorgebiet mit der Durchflußküvette verbunden oder davon getrennt ist.
Durch Verwendung wenigstens zweier laminarer Strömungen ist es möglich, die Fluide in der Durchflußküvette in einer gesteuerten Weise zu führen, wodurch somit das erste Fluid (z. B. eine Probe) in selektivem Kontakt mit einem Sensorgebiet in der Durchflußküvette gebracht wird. Zum Beispiel stellt Fig. 3A eine Durchflußküvette 300 dar, die der Durchflußküvette 200 von Fig. 2A ähnelt, aber ein Sensorgebiet 320 aufweist, das näherungsweise entlang der Mittellinie der Durchflußküvette angeordnet ist. In dieser Ausführungsform kann eine Bewegung oder Verschiebung der Grenzfläche verwendet werden, um die Probenströmung in Kontakt mit dem Meßgebiet zu bringen. Genauer treten eine Probenströmung (durch einen Pfeil 350 wiedergegeben) und eine Pufferströmung (durch einen Pfeil 340 wiedergegeben) in die Durchflußküvette, legen sie die Länge der Durchflußküvette unter laminarem Strömungsbedingungen zurück und verlassen sie die Durchflußküvette, wie es durch einen Pfeil 360 wiedergegeben ist. Für Darstellungszwecke ist die Probenströmung 350 schattiert. Die Durchflußmengen der Proben- und Pufferströmungen sind so ausgewählt, daß sich eine Grenzfläche 380 an einer Position innerhalb der Durchflußküvette befindet, so daß die Probenströmung nicht mit dem Sensorgebiet 320 in Kontakt ist. Die Proben- und/oder Pufferdurchflußmengen werden dann eingestellt, um die Grenzfläche 380 zu einer Positionsgrenzfläche 381 zu verschieben, wie es in Fig. 3B gezeigt ist, wodurch somit die Probenströmung 350 mit einem Sensorgebiet 320 in Kontakt gebracht wird. In dieser Ausführungsform sind die Anstiegs- und Abfallzeiten, wie oben diskutiert, nur durch die Bewegung der Grenzfläche von einer nicht in Kontakt mit dem Sensorgebiet (siehe Grenzfläche 380 von Fig. 3A) befindlichen ersten Position zu einer zweiten Position, so daß die Probenströmung mit dem Sensorgebiet (siehe Grenzfläche 381 von Fig. 3B) in Kontakt steht, begrenzt. Das zum Bewegen der Grenzfläche von der ersten zur zweiten Position erforderliche Probenvolumen ist ein Bruchteil des Volumens der Durchflußküvette selbst.
In einem weiteren Aspekt dieser Ausführungsform können Mehrfachsensorgebiete in der Durchflußküvette verwendet werden. Wie in Fig. 4A dargestellt, weist eine Durchflußküvette 400 Sensorgebiete 420 und 430 auf, wobei Probenströmung (das durch einen Pfeil 455 dargestellte schattierte Fluid), Pufferströmung (durch einen Pfeil 465 dargestellt) und Grenzfläche 470 derart sind, daß die Probenströmung mit jedem der Sensorgebiete 420 oder 430 nicht in Kontakt steht. Die Durchflußmengen der Probe und des Puffers werden dann eingestellt, um die Probenströmung 455 mit dem Sensorgebiet 430 durch Bewegung der Grenzfläche 470 in Fig. 4A zu einem Ort zwischen den Sensorgebieten 420 und 430 zu bringen, wie es in Fig. 4B als Grenzfläche 471 dargestellt ist. Die Vorteile des Bewegens der Grenzfläche auf diese Weise sind dieselben wie oben unter Bezugnahme auf die Fig. 3A und 3B diskutiert. Zusätzlich kann das mit der Pufferströmung in Kontakt befindliche Sensorgebiet 420 für eine Vielzahl von Zwecken, wie unten diskutiert, verwendet werden, die die Verwendung als eine interne Referenz einschließen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Durchflußküvette mit mehr als zwei Einlässen offenbart. Ein Vertreter dieser Ausführungsform ist eine Durchflußküvette mit drei Einlässen, wie es in Fig. 5A gezeigt ist, hierin auch als "Ψ- Durchflußküvette" bezeichnet. Unter Bezugnahme auf Fig. 5A tritt die Probenströmung (durch einen Pfeil 535 dargestellt) durch einen mittleren Einlaß 531 in die Ψ-Durchflußküvette 500. Eine erste Strömung (wie durch einen Pfeil 525 dargestellt) tritt durch einen Einlaß 521 in die Ψ-Durchflußküvette 500, und eine zweite Strömung (durch einen Pfeil 545 dargestellt) tritt über einen Einlaß 441 ein. Alle drei Strömungen bewegen sich durch die Durchflußküvette, nebeneinander und unter laminarer Strömung, und verlassen die Durchflußküvette, wie es durch einen Pfeil 565 wiedergegeben ist. Wiederum zu Darstellungszwecken sind die mittlere Strömung 535 und die erste Strömung 525 schattiert worden.
Somit sind zwei Grenzflächen 550 und 552 zwischen der mittleren Strömung (z. B. Probenströmung) und den ersten und zweiten Strömungen (z. B. Pufferströmungen) vorhanden. Durch Einstellen der relativen Durchflußmengen der drei Strömungen können sowohl die Position als auch die Breite der mittleren Strömung selektiv gesteuert werden. Wie es in Fig. 5B dargestellt ist, kann z. B. die mittlere Strömung 535 zur unteren Seitenwand der Durchflußküvette durch geeignete Steuerung der Durchflußmengen der ersten Strömung 525 und zweiten Strömung 545 verschoben werden. Somit werden die Grenzflächen 550 und 552 von Fig. 5A zu den jeweiligen Orten 551 und 553 verschoben, wie es in Fig. 5B gezeigt ist.
Bei niedrigen linearen Strömungsgeschwindigkeiten ist die Strömung durch sowohl die Y- als auch die Ψ-Durchflußküvetten laminar und findet somit kein aktives Mischen der Fluidströme statt. Im Zusammenhang mit der Y-Durchflußküvette treten die zwei Fluide mit einer gemeinsamen Durchflußgeschwindigkeit durch die Durchflußküvette, und die Position der Grenzfläche wird durch die Geschwindigkeiten der eintretenden Strömungen bestimmt. Die folgende Gleichung (11) beschreibt die Situation in einer Dünnschicht-Durchflußküvette (d. h. einer Durchflußküvette mit einem rechteckigen Querschnitt und mit w > > h):
Grenzfläche = w·erste Strömung/erste Strömung + zweite Strömung (11),
wobei w die Breite der Durchflußküvette und h die Höhe der Durchflußküvette ist. Somit kann die Grenzfläche durch Variieren der ersten und zweiten Strömungsgeschwindigkeiten über die Breite der Durchflußküvette bewegt werden.
In Bezug auf die Ψ-Durchflußküvette kann der Ort der zwei Grenzflächen unter laminaren Strömungsbedingungen (d. h. "Grenzfläche 1" und "Grenzfläche 2") in der Durchflußküvette durch Variieren der ersten und zweiten Durchflußmengen ("erste Pufferströmung" und "zweite Pufferströmung") und der Probendurchflußmenge ("Probenströmung") gesteuert werden, wie es durch die Gleichungen (12a) und (12b) angenähert ist.
Grenzfläche 1 = erste Pufferströmung + Probenströmung /erste Pufferströmung + zweite Pufferströmung + Probenströmung (12a),
Grenzfläche 2 = weite Pufferströmung/erste Pufferströmung + zweite Pufferströmung + Probenströmung (12b),
wobei w die Durchflußküvettenbreite (und w > > h vorausgesetzt) ist.
Eine genauere Berechnung der Position der Grenzfläche(n) erfordert eine Korrektur der obigen Gleichungen mit dem Ausdruck für das Geschwindigkeitsprofil (Brody et al., Biophysical Journal 71: 3430-3441, 1996). Das Geschwindigkeitsprofil ist eine Parabel mit einer Geschwindigkeit von Null dicht bei den Durchflußküvettenwänden und einer maximalen Geschwindigkeit in der Mitte der Durchflußküvette. Ein Richten einer mittleren Strömung mit zwei benachbarten Strömungen mit gleichen Durchflußmengen plaziert die mittlere Strömung in der Mitte der Durchflußzelle (wie in Fig. 5A dargestellt). Wenn jedoch eine der zwei benachbarten Strömungen eine Durchflußmenge von z. B. 5% der Gesamtdurchflußmenge aufweist, wird diese Strömung tatsächlich mehr als 5% des Querschnittsgebietes der Durchflußküvette einnehmen. Dies liegt daran, daß die lineare Durchflußgeschwindigkeit dicht bei der Durchflußküvettenwand niedriger als die lineare Durchflußgeschwindigkeit in der Mitte ist. Dieselbe Volumenstrommenge erfordert einen breiteren Teil der Durchflußküvette dicht bei der Wand als in der Mitte der Durchflußküvette.
Zusätzlich erfordert ein Richten einer Probenströmung innerhalb einer Durchflußküvette unter Verwendung einer separaten Strömung (z. B. ein Puffer), daß die Diffusion der Probe auf das Gebiet dicht an der Grenzfläche zwischen den zwei Strömungen begrenzt wird. Andernfalls wird die Diffusion auf die Richtwirkung der Probenströmung einwirken und wird statt zweier (oder mehr) getrennter Strömungen, eine "Verschmierung" von Proben und Puffer resultieren. Da Diffusion ein zeitabhängiger Prozeß ist, sollten die linearen Durchflußmengen der Probe und des Puffers ausgewählt werden, um Diffusion in dichter Nachbarschaft zur Grenzfläche zu begrenzen. Diffusion in einer Durchflußküvette kann als ein eindimensionales Phänomen betrachtet werden, da der Konzentrationsgradient parallel zur Grenzfläche vernachlässigbar ist. Solange die Konzentration an den Seitenwänden in der Durchflußküvette konstant ist, kann von der Annahme ausgegangen werden, daß die Breite der Durchflußküvette unendlich ist. Die Kontaktzeit an der Grenzfläche ist dieselbe wie die Zeit, die die Strömung benötigt, um ein Molekül durch die Durchflußküvette bei einer gewissen linearen Durchflußmenge zu übertragen, wie in Fig. 6 dargestellt, wo t die Kontaktzeit (sec.) ist, f die Gesamtvolumenstrommenge (m³/sec) ist, A das Querschnittsgebiet der Durchflußküvette (m²) ist, u die lineare Durchflußgeschwindigkeit (m/sec) ist und D die Diffusionskonstante (m²/sec) ist. Somit kann die Kontaktzeit als die Länge der Durchflußküvette geteilt durch die lineare Durchflußgeschwindigkeit ausgedrückt werden, und ist die mittlere Diffusionsbreite näherungsweise . Das dunkle Gebiet von Fig. 6 entspricht 100%, das graue Gebiet entspricht 100 - 50% und das hellgraue Gebiet entspricht 50-0% der ursprünglichen Probenkonzentration.
Der Ausdruck für die Konzentration als eine Funktion der Entfernung und Zeit ist vom Fickschen zweiten Gesetz abgeleitet, das die Lösung von Gleichung (13) für eine mit einer Y- Durchflußküvette einhergehenden eindimensionalen Diffusion aufweist:
Kurz gesagt, stellt die Gleichung (13) den Ausdruck für die Konzentration als eine Funktion von Entfernung und Zeit dar, wo x (Entfernung) senkrecht von der Grenzfläche gemessen ist (d. h., x ist 0 an der Grenzfläche). In ähnlicher Weise wird im Zusammenhang mit der Ψ- Durchflußküvette der Ausdruck für die Konzentration als eine Funktion von Entfernung und Zeit durch die Gleichung (14) gegeben:
Die Fig. 7A und 7B sind graphische Wiedergaben der jeweiligen Gleichungen (13) und (14) für unterschiedliche Kontaktzeiten, wo die x-Achse die Entfernung x von der Grenzfläche ist, wie oben diskutiert, und die y-Achse die relative Konzentration (im Bereich von 0 bis 100%) ist.
In der vorangehenden Diskussion sind repräsentative Durchflußküvetten dieser Erfindung offenbart, die eine laminare Strömung innerhalb der Durchflußküvette kontrollieren können, insbesondere in Bezug auf Probenströmungsposition und -breite. Derartige Durchflußküvetten weisen eine Vielzahl von Verwendungen auf. In einer Ausführungsform kann die Durchflußküvette zum selektiven Inkontaktbringen einer Probe mit einem Sensorgebiet innerhalb der Durchflußküvette verwendet werden. Auf diese Weise kann eine Durchflußküvette mit Mehrfachsensorgebieten verwendet werden, wobei die Probenströmung selektiv mit einem oder mehreren der Sensorgebiete durch die oben beschriebenen Techniken kontaktiert wird. Zum Beispiel stellen die oben diskutierten Fig. 4A und 4B eine Durchflußküvette mit zwei Sensorgebieten dar, wobei eine Probenströmung selektiv mit einem der Sensorgebiete in Kontakt gebracht wird. Es sollte jedoch erkannt werden, daß Mehrfachsensorgebiete verwendet werden können und daß die Probenströmung selektiv mit jedem Sensorgebiet unter laminaren Strömungsbedingungen in Kontakt gebracht werden kann.
In einem weiteren Aspekt enthält die Probenströmung einen Liganden, der zum Sensibilisieren eines diskreten Sensorgebietes in einer Durchflußküvette verwendet wird. Wie hierin verwendet, bedeutet "Sensibilisieren" oder ("Sensibilisierung") jeder Prozeß oder jede Aktivierung des Sensorgebietes, der/die dazu führt, daß das Sensorgebiet mit einem gewünschten Analyten spezifisch wechselwirken kann. Die resultierende Oberfläche wird hierin als ein "sensibilisiertes Sensorgebiet" oder ein "sensibilisiertes Gebiet" bezeichnet.
Wie hierin verwendet, sind die Begriffe "Ligand" und "Analyt" breit ausgelegt und umfassen sie eine breite Vielzahl von Wechselwirkungen. Zum Beispiel kann das Sensorgebiet der Durchflußküvette durch Immobilisieren eines Analyt-spezifischen Liganden an selbigem sensibilisiert werden. Repräsentative Liganden in diesem Zusammenhang schließen, ohne aber darauf beschränkt zu sein, das folgende ein (in der folgenden Liste, ist ein repräsentativer Bindungspartner in Klammern identifiziert): Antigen (spezifischer Antikörper), Antikörper (Antigen), Hormon (Hormonrezeptor), Hormonrezeptor (Hormon), Polynukleotid (komplementäres Polynukleotid), Avidin (Biotin), Biotin (Avidin), Enzym (Enzymsubstrat oder -inhibitor), Enzymsubstrat oder -inhibitor (Enzym), Lektine (spezifische Kohlehydrate), spezifische Kohlehydrate (Lektine), Fett (fettbindendes Protein oder Membran-assoziiertes Protein), fettbindendes Protein oder Membran-assoziiertes Protein (Fett), Polynukloetid (polynukleotidbindendes Protein) und polynukleotidbindendes Protein (Polynukleotid) sowie allgemeinere Typen von Wechselwirkungen, wie z. B. Protein (Protein), Protein (Polynukleotid), Polynukleotid (Protein), DNA (DNA), DNA (RNA) und RNA (DNA)- Wechselwirkungen und Wechselwirkungen zwischen kleinen organischen synthetischen Zusammensetzungen und Proteinen oder Nukleinsäuren.
Geeignete Liganden schließen auch zahlreiche chemische Zusammensetzungen ein, die z. B. zum Aufbauen einer chemischen Bibliothek verwendet werden können, einschließlich bifunktionale Zusammensetzungen. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, daß Liganden dieser Erfindung und der in der Probenströmung vorhandene korrespondierende Analyt einen breiten Bereich von Molekülen einschließen, die zum Erzeugen eines sensibilisierten Oberflächengebietes verwendet werden können, um eine Vielzahl von Aufgaben durchzuführen, die einschließen, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Binden, Hybridisieren, Kombinationschemie und andere komplexe Formationen auf der Sensoroberfläche. Alle derartigen Wechselwirkungen sind im Umfang von Analyt-Liganden- Wechselwirkungen enthalten, wenn dieser Begriff im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird. Ferner enthalten derartige Wechselwirkungen, ohne aber darauf beschränkt zu sein, kovalente sowie nicht-kovalente Kräfte, wie z. B. elektrostatische, hydrophobe, Dispersions-, von der Waals- oder Wasserstoffbindungs-Kräfte oder irgendeine Kombination derselben.
Wie oben bemerkt, kann der Ort der Probenströmung innerhalb der Durchflußküvette sowie die Breite der Probenströmung bei der Umsetzung der Erfindung gesteuert werden. Dies erlaubt eine Immobilisierung eines Liganden in einer schmalen Reihe innerhalb der Durchflußküvette. Zum Beispiel kann ein Grandient innerhalb der Durchflußküvette durch selektives Lenken einer Probenströmung über die Sensoroberfläche während des Immobilisierens des Liganden darauf geschaffen werden. Dieser Aspekt der Erfindung ist in Fig. 8 dargestellt, worin eine Y-Durchflußküvette 800 Sensorgebiete 820, 830, 840 und 850 enthält. Eine Probenströmung (durch einen Pfeil 865 dargestellt) und eine Pufferströmung (durch einen Pfeil 875 dargestellt) werden in die Durchflußküvette eingeführt und fließen darin unter laminaren Strömungsbedingungen, wobei sie die Durchflußküvette, wie durch einen Pfeil 885 wiedergegeben, verlassen. Anfänglich ist die Probenströmung nur mit dem Sensorgebiet 820 in Kontakt, wobei eine Grenzfläche 825 zwischen einer Probenströmung 865 und einer Pufferströmung 875 zwischen den Sensorgebieten 820 und 830 angeordnet ist. Die Proben- und Pufferströmungen werden dann so eingestellt, daß die Probenströmung mit dem Meßgebiet 830 in Kontakt gebracht wird, wobei die Grenzfläche 835 nun zwischen den Sensorgebieten 830 und 840 angeordnet ist. Dies wird dann wiederholt, um die Grenzfläche 845 zwischen die Sensorgebiete 840 und 850 zu bringen, wobei das Sensorgebiet 850 als eine Kontrolle dient. Die Länge der Zeit, die die Probenströmungen über die Sensorgebiete 820, 830 und 840 fließen, liefert einen Gradienten in Bezug auf die Menge von immobilisierten Liganden, der an die Oberfläche jedes Sensorgebietes gebunden wird. Man sollte bemerken, daß die zahlreichen Grauschattierungen von Fig. 8 beabsichtigt sind, um die Menge an gebundenem Liganden auf jedem Sensorgebiet darzustellen - das heißt, dunkel bis hell gibt eine höhere Menge an gebundenem Liganden zu einer niedrigeren Menge an gebundenem Liganden wieder. Während dieser Aspekt der Erfindung in Fig. 8 als Stufengradient dargestellt ist, könnte in ähnlicher Weise ein kontinuierlicher Gradient erzeugt werden.
In einer alternativen Ausführungsform kann eine Y-Durchflußküvette verwendet werden, um diskrete Sensorgebiete mit unterschiedlichen Liganden zu sensibilisieren. Wie in Fig. 9 dargestellt, können die Sensorgebiete 910 und 911 mit unterschiedlichen Liganden durch Einführen einer ersten Probenströmung, die einen ersten Liganden enthält (durch einen Pfeil 520 dargestellt), in eine Durchflußküvette 900 unter laminaren Strömungsbedingungen mit einer zweiten Strömung (durch einen Pfeil 930 dargestellt) sensibilisiert werden. Auf diese Weise wird das Sensorgebiet 911 mit dem ersten Liganden sensibilisiert. Eine zweite Strömung 930 kann in einer Ausführungsform eine Pufferströmung oder in einer anderen Ausführungsform eine zweite Probenströmung sein, die einen zweiten Liganden enthält, wobei in diesem Fall das Sensorgebiet 910 simultan mit der Sensibilisierung des Sensorgebietes 911 mit dem ersten Liganden mit dem zweiten Liganden sensibilisiert wird. Wenn die zweite Strömung eine Pufferströmung ist, kann die Pufferströmung nachfolgend durch die zweite Probenströmung ersetzt werden, wobei in diesem Fall das Sensorgebiet 910 mit dem zweiten Liganden zeitlich nachfolgend zum Sensibilisieren des Sensorgebietes 911 mit dem ersten Liganden sensibilisiert wird. In dieser Ausführungsform kann die erste Probenströmung bleiben oder durch eine erste Pufferströmung ersetzt werden.
Im Zusammenhang mit einer Ψ-Durchflußküvette sind weitere Sensibilisierpermeationen möglich. Zum Beispiel können zwei oder mehr Sensorgebiete durch selektives Positionieren der den Liganden enthaltenden Probenströmung innerhalb der Durchflußküvette mit denselben oder unterschiedlichen Liganden sensibilisiert werden. Somit können in einer Ausführungsform drei Sensorgebiete mit demselben oder einem anderen Liganden sensibilisert werden, wie es in Fig. 10 dargestellt ist. Unter Bezugnahme auf Fig. 10 ist eine einen ersten Liganden enthaltende Probenströmung (durch einen Pfeil 1010 dargestellt und zu Darstellungszwecken schattiert) innerhalb einer Durchflußküvette 1000 zwischen einer ersten und einer zweiten Strömung (durch jeweilige Pfeile 1011 und 1012 dargestellt) gerichtet, so daß das Sensorgebiet 1820 mit dem ersten Liganden sensibilisiert wird. Die Sensorgebiete 1021 und 1022 können dann durch Lenken einer Probenströmung innerhalb der Durchflußküvette in der Weise, daß sie das gewünschte Sensorgebiet berührt, sensibilisiert werden, wodurch selbige mit dem in der Probenströmung enthaltenen Liganden sensibilisiert wird. Auf diese Weise kann eine Zahl von Sensorgebieten innerhalb der Durchflußküvette durch irgendeine Zahl von gewünschten Liganden sensibilisiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine zweite Probenströmung über die Sensoroberfläche innerhalb der Durchflußküvette unter einem gewissen Winkel, typischerweise senkrecht zur ersten Probenströmung, geleitet werden, um dadurch überlappende Sensorgebiete zu erzeugen. Diese Ausführungsform wird allgemein hierin als eine zweidimensionale oder "2D"-Durchflußküvette bezeichnet. Die Verwendung derartiger 2D-Durchflußküvetten bei der Umsetzung dieser Erfindung erlaubt eine Sensibilisierung von überlappenden Sensorgebieten innerhalb einer Durchflußküvette. Eine repräsentative 2D- Durchflußküvette dieser Erfindung ist in Fig. 11A dargestellt. Diese Figur gibt die Kombination zweier Ψ-Durchflußküvetten (eine "2D-Ψ-Durchflußküvette") wieder, so daß die Probenströmungen unter rechten Winkeln zueinander sind. Während Fig. 11A eine 2D- Ψ-Durchflußküvette darstellt, sollte es verständlich sein, daß eine 2D-Y-Durchflußküvette in ähnlicher Weise oder eine 2D-Ψ-Durchflußküvette mit mehr als den sechs in Fig. 11A dargestellten Einlässen (d. h. 3 Einlässe mal 2 Ψ-Durchflußküvetten) oder irgendeine Kombination von Y- und Ψ-Durchflußküvetten mit irgendeiner Anzahl von Einlässen verwendet werden kann.
Unter Bezugnahme auf Fig. 11A weist eine Durchflußküvette 1100 Puffereinlässe 1122, 1123, 1126 und 1127 und Probeneinlässen 1130 und 1132 auf. Eine erste Probenströmung (durch einen Pfeil 1131 dargestellt) tritt durch die Durchflußküvette und tritt über einen Auslaß 1150 heraus. In ähnlicher Weise kann eine zweite Probenströmung (durch einen Pfeil 1133 dargestellt) durch Hindurchtretenlassen durch die Durchflußküvette unter einem Winkel relativ zur ersten Probenströmung, in diesem Fall senkrecht, sequentiell aufgebracht werden und geht sie über einen Auslaß 1152 hinaus. Der Ort und die Breite der ersten und zweiten Probenströmungen werden in der oben in Bezug auf die Ψ-Durchflußküvette beschriebenen Weise gesteuert. Unter Bezugnahme auf Fig. 11B wird dort eine Seitenansicht von Fig. 11A gegeben. Die Durchflußküvette weist ein zentrales Plateau 1140 auf, das die ersten und zweiten Probenströmungen lenkt, um eine Sensoroberfläche 1160 zu berühren. Im Falle von Fig. 11B ist die erste Probenströmung 1131 dargestellt.
Durch Verwendung einer Durchflußküvette dieser Erfindung kann eine breite Vielzahl von sensibilisierten Sensorgebieten erzeugt werden. Zum Beispiel kann eine 2D-Ψ-Durchflußküvette von Fig. 11A verwendet werden, um sensibilisierte Matrizen herzustellen, wie es in Fig. 12 dargestellt ist. Fig. 12A zeigt eine Probenströmung (durch einen Pfeil 1210 dargestellt) mit einem ersten Liganden, die quer über die Sensoroberfläche 1220 gerichtet ist, um ein sensibilisiertes Gebiet 1222 zu liefern, wie es in Fig. 12B gezeigt ist. Eine zweite Probenströmung mit einem zweiten Liganden ist quer über die Sensoroberfläche 1220 gerichtet, wie es durch einen Pfeil 1230 von Fig. 12C dargestellt ist, um ein sensibilisiertes Gebiet 1240 zu liefern, wie es in Fig. 12D dargestellt ist, das mit dem sensibilisierten Gebiet 1222 überlappt. Dieses Überlappungsgebiet ist somit mit zwei unterschiedlichen Liganden sensibilisiert, die sequentiell aufgebracht sind.
Man wird erkennen, daß besagte selektive Sensibilisierung einer Sensoroberfläche eine Vielzahl von Sensibilisieroptionen erlaubt. Zum Beispiel in dem Ausmaß, wie der in der zweiten Probenströmung 1230 von Fig. 12C enthaltene zweite Ligand mit dem ersten Liganden des sensibilisierten Gebietes 1222 wechselwirkt, kann das resultierende Überlappungsgebiet 1260 wie in Fig. 12E dargestellt werden. Kurz gesagt, ist ein diskretes Gebiet auf der Sensoroberfläche mit einem ersten Liganden, gefolgt von einem zweiten Liganden, sensibilisiert worden. Wenn der erste Ligand z. B. ein bifunktionales Reagens ist, das auf der Sensoroberfläche immobilisiert ist, kann der zweite Ligand mit dem immobilisierten Reagens reagieren, um ein Gebiet oder einen "Fleck" auf der Sensoroberfläche zu liefern, das/der mit einem immobilisierten bifunktionalen Reagens (d. h. der erste Ligand) mit einem daran gebundenen zweiten Liganden selektiv modifiziert worden ist.
Wie es in Fig. 13A dargestellt ist, werden in ähnlicher Weise durch Lenken von unterschiedlichen Strömen (durch Pfeile 1310, 1320 und 1330 dargestellt), die jeweils einen anderen Liganden enthalten, sensibilisierte Gebiete 1311, 1321 und 1331 mit drei unterschiedlichen immobilisierten Liganden auf der Sensoroberfläche 1350 erzeugt, wie es in Fig. 13B gezeigt ist. Unter Bezugnahme auf Fig. 13C werden drei Probenströmungen, die durch Pfeile 1360, 1370 und 1380 dargestellt sind, wobei jede denselben oder unterschiedliche Liganden enthält, quer über die Sensoroberfläche 1350 gelenkt, was sensibilisierte Gebiete 1391, 1392 und 1393 liefert. Auf diese Weise ist jedes überlappende sensibilisierte Gebiet von Fig. 13D analog zur in Fig. 12D dargestellten sensibilisierten Oberfläche und können sie als sensibilisierte Gebiete 1370 bis 1378 wiedergegeben werden, wie es in Fig. 13E gezeigt ist.
Ein Fachmann auf dem Gebiet wird den breiten Bereich von Anwendungen, den eine derartige zweidimensionale Matrix liefert, leicht anerkennen. Grundsätzlich kann jede Wechselwirkung, die an diskreten Orten auf der Sensoroberfläche der Durchflußküvette erfaßt werden kann, gemessen werden. Zum Beispiel ist eine repräsentative Wechselwirkung die DNA-Sequenzierung durch Hybridisierung, wobei die Matrix durch die folgenden Kopplungsprozeduren unter Verwendung laminaren Fluidströmungen in zwei Dimensionen, wie oben beschrieben, hergestellt werden kann. Als erstes weist die Sensoroberfläche (wie z. B. eine Dextran-beschichtete Oberfläche mit daran gebundenem Streptavidin) einen daran immobilisierten Liganden (wie z. B. biotinylierte Oligonukleotide) in definierten Bändern 1311, 1321 und 1331 auf, wie es in Fig. 13B dargestellt ist. Derartige Bänder werden durch Hindurchtretenlassen von Probenströmungen 1310, 1320 und 1330 über eine Sensoroberfläche 1350 erzeugt, wie es in Fig. 13A dargestellt ist, wobei jede Probenströmung ein anderes biotinyliertes Oligonukleotid enthält. Komplementäre DNA- Oligonukleotide werden dann quer über die Sensoroberfläche gelenkt, wie es durch Pfeile 1360, 1370 und 1380 in Fig. 13C dargestellt ist, was ein Muster aus immobilisierten komplementären DNA-Oligonukleotiden liefert, wie es in Fig. 13E gezeigt ist, wobei jedes Gebiet (1370 bis 1378) eine unterschiedliche immobilisierte komplementäre DNA wiedergibt.
Die das aktive Reagens enthaltende Flüssigkeitsströmung kann auf irgendeine Breite, von der gesamten Breite des Sensorgebietes bis zu sehr schmalen Abmessungen, positioniert werden. Es können unterschiedliche Flüssigkeiten und Reaktionsbedingungen in den Flüssigkeitsströmen eingesetzt werden, die die Reagenzien positionieren. Derartige Situationen können verwendet werden, um aktive Zwischenverbindungen zu schützen, die gebildet werden, wenn Nachbarlinien gebildet werden, bevor die Reagenzien der zweiten Dimension eingeführt werden. In der Tat kann diese Erfindung verwendet werden, um irgendeine Art von chemischen Synthesen auf definierten Gebieten auf einer Sensoroberfläche durchzuführen. Organische Lösungsmittel können verwendet werden, wo Reagenzien schwer in Wasser zu lösen sind. Es ist auch möglich, die Diffusion von Substanzen aus organischen Lösungsmitteln in Wasserphasen in dem Strömungssystem zu verwenden, um z. B. Proteine vor einer Denaturierung in Kontakt mit organischen Flüssigkeiten zu schützen. Ferner können chemische Bibliotheken durch schrittweise Reaktionen auf Sensoroberflächen erzeugt werden. Es können komplexe Moleküle mit relativ wenigen molekularen Bausteinen aufgebaut werden. Diese Erfindung kann auch zum Aufbau von Polymeren in definierten Gebieten auf einer Sensoroberfläche, wie z. B. Peptiden oder Oligonukleotiden, in definierten Sequenzen verwendet werden. Durch Verwendung von Schutz oder ... in unterschiedlichen Dimensionen sowie größere oder kleinere Gebiete zur Aktivierung können definierte Sequenzen aufgebaut werden.
Eine weitere Anwendung dieser Erfindung besteht in der Untersuchung, wie mehrfache biomolekulare Komplexe gebildet werden und wie sie funktionieren. Ein Beispiel stellt Epitop-Mapping eines Antigens zum Auffinden der Bindungsorte für eine Reihe von Antikörpern im Verhältnis zueinander dar. Durch die für einen zweidimensionalen Aufbau von Reaktionsgebieten beschriebene Prozedur kann somit Epitop-Mapping durchgeführt werden. Dies kann z. B. durch direktes Messen der Wechselwirkungen zur Bildung von Komplexen durch Techniken, wie z. B. SPR-Detektion, oder Analyse von gebundenem Material, nachdem das letzte Molekül eingeführt worden ist, durch Fluoreszenz vorgenommen werden. Eine beispielhafte Prozedur sieht wie folgt aus: Auf einer mit RAMFc-Antikörper bedeckten Oberfläche werden unterschiedliche Linien in einer Richtung für alle analysierten Antikörper direkt aus dem Kulturfluid gebildet; die gesamte Oberfläche wird durch einen Blockierantikörper durch eine Wechselwirkung durch einen irrelevanten Antikörper bedeckt; die gesamte Oberfläche wird durch ein Antigen bedeckt, das alle Linien mit einen immobilisierten primären monoklonalen Antikörper absorbiert; in der zweiten Dimension werden dieselben Antikörper eingeführt und wird der gebildete Komplex für die zweite Wechselwirkung für jedes Gebiet gemessen; und es wird eine Regeneration der gesamten Oberfläche durchgeführt. Eine weitere Situation eines ähnlichen Typs liegt dann vor, wenn eine Reihe von z. B. Proteinen einen aktiven Komplex bildet und die Reihenfolge der adsorbierenden Substanzen kritisch ist. Es können unterschiedliche Kombinationen von Substanzeinführung eingeführt werden und das resultierende Reaktionsmuster beobachtet werden.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Sensoroberflächen mit einem oder mehreren sensibilisierten Sensorgebieten darauf offenbart. Derartige Sensoroberflächen können für eine breite Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel können derartige Oberfläche mit einem anderen Liganden an jedem sensibilisierten Gebiet sensibilisiert werden. Eine Probe kann dann mit allen sensibilisierten Gebieten in Kontakt gebracht werden und basierend auf der Position des sensibilisierten Gebietes auf der Sensoroberfläche kann eine Wechselwirkung zwischen der Probe und irgendeinen vorgegebenen Liganden bestimmt werden. Ein Inkontaktbringen der Sensoroberfläche mit der Probe in dieser Ausführungsform muß nicht in der Durchflußküvette stattfinden, da die gesamte Oberfläche mit der Probe in Kontakt gebracht werden kann. Wenn ein selektives Inkontaktbringen der Sensoroberfläche mit der Probe gewünscht ist, kann alternativ ein derartiges Inkontaktbringen innerhalb einer Durchflußküvette dieser Erfindung stattfinden.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Probenströmung durch Techniken laminarer Strömungen über eine Sensoroberfläche mit einem oder mehreren diskreten Sensorgebiet(en) geleitet. Wie oben in Bezug auf eine Sensibilisierung mit einer einen Liganden enthaltenden Probenströmung diskutiert, kann eine einen Analyten (im Gegensatz zu einem Liganden) enthaltende Probenströmung durch die Techniken laminarer Strömungen dieser Erfindung quer über eine sensibilisierte Oberfläche (die durch die Technik laminarer Strömungen dieser Erfindung oder andere Techniken sensibilisiert sein kann) gelenkt werden, wodurch eine Wechselwirkung mit Liganden auf dem Sensorgebiet erlaubt wird. Die hierin beschriebenen Techniken laminarer Strömungen erzielen extrem schnelle Anstiegs- und Abfallzeiten, die es ermöglichen, schnelle Reaktionskinetiken zusätzlich zur Standardbindungsanalyse zu messen.
Diesbezüglich und in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine Bewegung der Grenzfläche verwendet werden, um eine einen Analyten enthaltende Probenströmung in Kontakt mit einem Sensorgebiet zu bringen. Dies kann durch Bezugnahme auf Fig. 3A dargestellt werden. Unter Bezugnahme auf diese Figur weist eine Y-Durchflußküvette 300 ein sensibilisiertes Sensorgebiet 320 auf, und sind eine Probenströmung (das durch einen Pfeil 350 dargestellte schattierte Fluid) und eine Pufferströmung (durch einen Pfeil 340 dargestellt) derart eingestellt, daß sich eine Grenzfläche 380 an einer Position in der Durchflußküvette befindet, so daß die Probenströmung nicht mit dem sensibilisierten Sensorgebiet in Kontakt steht. Die Proben- und Pufferdurchflußmengen werden dann eingestellt, um die Grenzfläche zu einer Position 381 zu bewegen, wie es in Fig. 3B gezeigt ist, wodurch somit eine Probenströmung 350 mit dem sensibilisierten Sensorgebiet 320 in Kontakt gebracht wird. In dieser Ausführungsform sind die Anstiegs- und Abfallzeiten, wie oben ausführlicher diskutiert, nur durch die Bewegung der Grenzfläche von einer ersten Position, die nicht mit dem Sensorgebiet in Kontakt steht (siehe Fig. 3A), zu einer zweiten Position von der Art, daß die Probenströmung mit dem Sensorgebiet in Kontakt steht (siehe Fig. 3B), begrenzt. Das zum Bewegen der Grenzfläche von der ersten zur zweiten Position erforderliche Probenvolumen ist ein Bruchteil des Durchflußküvettenvolumens selbst. Anstelle eines Umschaltens von Pufferströmung zur Probenströmung mit Ventilen in gewisser Entfernung von dem Sensorgebiet (z. B. ein Volumen von ungefähr 0,5 ul für das BIACORE-Instrument) kann somit die Grenzfläche mit nur einem Bruchteil des Volumens der Durchflußküvette (z. B. 0,05 ul) bewegt werden. Da die Anstiegszeit proportional zum Volumen ist, das verschoben werden muß, verringert eine zehnfache Abnahme des Volumens die Anstiegszeit um ungefähr das Zehnfache. Ähnliche Vorteile werden mit kürzeren Abfallzeiten erzielt.
Derartige schnelle Anstiegs- und Abfallzeiten sind notwendig, wenn schnelle Reaktionskinetiken gemessen werden. Zum Beispiel können die Techniken dieser Erfindung verwendet werden, um Assoziation und Dissoziation zu untersuchen. In einer Ausführungsform kann ein Analyt über ein sensibilisiertes Sensorgebiet geleitet werden. Die Probenströmung kann dann vom Kontakt mit dem sensibilisierten Sensorgebiet verschoben werden, und die Dissoziationsgeschwindigkeit kann detektiert werden. Alternativ kann eine Probenströmung schnell auf ein sensibilisiertes Sensorgebiet verschoben werden, wodurch eine Detektion und eine Analyse von Assoziationskinetiken ermöglicht werden.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Mehrfachsensorgebiete innerhalb einer einzigen Durchflußküvette für Analysezwecke verwendet werden. In einem Aspekt kann die Durchflußküvette zwei Sensorgebiete enthalten. Wie in Fig. 4A dargestellt, weist die Durchflußküvette 400 Sensorgebiete 420 und 430 auf, wobei die einen Analyten enthaltende Probenströmung (das durch einen Pfeil 455 dargestellte schattierete Fluid), Pufferströmung (durch einen Pfeil 465 dargestellt) und eine Grenzfläche 470 derart sind, daß die Probenströmung mit keinem der Sensorgebiete in Kontakt steht. Die Durchflußmengen von Puffer und Probe werden dann eingestellt, um die Probenströmung 455 durch Bewegen der Grenzfläche 470 zu einem Ort zwischen den Sensorgebieten 420 und 430, wie in Fig. 4B als Grenzfläche 471 dargestellt, mit dem Sensorgebiet 430 in Kontakt zu bringen. Die Vorteile des Bewegens der Grenzfläche auf diese Weise sind dieselben wie oben diskutiert. Da die Mehrfachsensorgebiete in dichter Nachbarschaft in derselben Durchflußküvette angeordnet sind, sind ferner zeitliches Nacheilen und Temperaturvariationen zwischen den zwei Sensorgebieten vernachlässigbar, was die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Probenanalyse erhöht.
Außerdem erlaubt die Fähigkeit zum Steuern der Anordnung der Probenströmung in der Durchflußküvette in Kombination mit Mehrfachsensorgebieten einen breiten Bereich von Anwendungen. Unter Bezugnahme auf die Fig. 4A und 4B kann z. B. das Sensorgebiet 420 ein nicht-sensibilisiertes oder sensibilisiertes Sensorgebiet sein. Somit kann das Sensorgebiet 420 von den Fig. 4A und 4B als eine nicht-sensibilisierte oder blanke Steuerung (d. h. ohne oberflächenimmobilisierten Liganden) oder eine sensibilisierte Steuerung (d. h. mit daran gebundenem immobilisierten Liganden) verwendet werden. Eine blanke Steuerung kann eine unspezifische Bindung an dem Sensorgebiet (z. B. an der Dextran-Matrix) detektieren, während eine sensibilisierte Steuerung Informationen über eine unspezifische Bindung an sowohl der Matrix als auch dem immobilisierten Liganden liefern wird. Auf diese Weise können Masseneffekte und unspezifische Bindung "heraussubtrahiert" werden. Eine derartige Subtraktion wird am besten erzielt, wenn die Immobilisierungsgrade des Liganden für das sensibilisierte Sensorgebiet und sensibilisierte Steuerung dieselben sind. Dies ist besonders wichtig, wenn hohe Immobilisierungsgrade verwendet werden (z. B., wenn der Analyt ein kleines Molekül ist). Dieser Aspekt der Erfindung wird weiter in Beispiel 5 dargestellt.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung können Mehrfachsensorgebiete in einer Vielzahl von Verfahren verwendet werden. Wie durch die Fig. 14A und 14B dargestellt, kann z. B. eine Durchflußküvette 1400 einen immobilisierten Liganden auf sensibilisierten Sensorgebieten 1440 und 1460 und einem nichtsensibilisierten Sensorgebiet 1450 aufweisen. Die Ligandenimmobilisierung kann unter Verwendung von oben beschriebenen Techniken bewerkstelligt werden, um die den Liganden enthaltende Probenströmung mit dem Liganden über die Sensoroberfläche zu lenken. Jedoch wird ein Fachmann auf dem Gebiet erkennen, daß eine Sensibilisierung der Sensorgebiete vor einem Abtasten mit einer einen Analyten enthaltenden Probenströmung durch Verfahren erwirkt werden kann, die von den hierin beschriebenen Techniken laminarer Strömungen verschieden sind. Zum Beispiel können diskrete sensibilisierte Sensorgebiete durch aktuell bekannte Techniken, wie z. B. Oberflächenmodifikationstechniken unter Verwendung von Maskierung (z. B. Fotolithographie) hergestellt werden. Eine Probenströmung, die einen Analyten enthält, kann dann in die Durchflußküvette gelenkt werden, wie es durch einen Pfeil 1430 wiedergegeben wird, so daß die Probenströmung Sensorgebiete 1440,1450 und 1460 berührt. Auf diese Weise kann das nicht-sensibilisierte Sensorgebiet 1450 als eine Steuerung dienen und können die sensiblisierten Sensorgebiete 1440 und 1460 dieselben oder unterschiedliche damit verbundene Liganden aufweisen. Diese Technik weist einen besonderen Vorteil bei der Analyse von Fluiden mit Mehrfachanalyten, wie z. B. Analyse von Körperflüssigkeiten auf, wobei die Analyten unter Verwendung dieser Technik simultan analysiert werden könnten.
Wie in Fig. 14B dargestellt, kann eine Durchflußküvette 1400 alternativ einen immobilisieren Liganden auf den sensibilisierten Sensorgebieten 1450 und 1460 aufweisen, wobei das Sensorgebiet 1440 als eine nicht-sensibilisierte Steuerung dient. Sowohl eine Probenströmung, die einen Analyten enthält (dargestellt durch einen Pfeil 1432 und zu Darstellungszwecken schattiert) als auch eine Pufferströmung (dargestellt durch einen Pfeil 1434) können in die Durchflußküvette gelenkt werden, so daß die Proben- und Pufferströmungsgrenzfläche 1465 zwischen den Sensorgebieten 1460 und 1450 liegt. Auf diese Weise dient das sensibilisierte Sensorgebiet 1450 als das Grundanalysegebiet, wobei beide Sensorgebiete 1440 und 1460 als Steuerungen dienen (d. h., Sensorgebiete 1440 - Probenströmung, kein immobilisierter Ligand; Sensorgebiet 1460 - Pufferströmung, mit immobilisierten Liganden). In dieser Ausführungsform kann eine Verschiebung der Probenströmung, die den Analyten enthält, über mehrfache diskrete Sensorgebiete bewerkstelligt werden. Somit kann eine unabhängige Analyse von in einer Probenströmung enthaltenen Analyten nahezu simultan durch bloßes Verschieben der Probenströmung über das interessierende Sensorgebiet durchgeführt werden. Dies könnte auch unter Verwendung von mehrfachen Puffer- und Probenströmungen bewerkstelligt werden.
Die obigen Techniken erlauben auch die Detektion von Ionenaustausch in der Durchflußküvette (siehe Beispiel 3). Genauer gesagt, kann die Diffusion über der Grenzfläche zur membranfreien Dialyse (z. B. werden kleine Moleküle schneller als große Moleküle über die Grenzfläche diffundieren) verwendet werden. Durch Verwendung eines Chromatographieelutionsmittels (z. B. Inline- oder Probenfraktionen) als Probenströmung werden der Salzgehalt (z. B. Ionenaustauschchromatographie) oder der Gehalt eines organischen Lösungsmittels (z. B. Chromatographie mit umgekehrten Phasen) variieren. Diese Variation erlaubt eine direkte Detektion durch Injektion und Insitu-Dialyse in der Durchflußküvette, wodurch eine Verdünnung oder Vordialyse der Probe vermieden wird.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein Analyt, der in einer Wasserphase schwer zu lösen ist, durch die Durchflußküvette in einer organischen Probenströmung geleitet werden, in eine benachbarte Wasserströmung diffundieren gelassen werden und dann in einer oder mehreren der oben dargestellten Technik(en) verwendet werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Darstellung, aber nicht zur Begrenzung gebracht.

BEISPIELE

Beispiel 1

Repräsentative Durchflußküvetten

Dieses Beispiel offenbart repräsentative Durchflußküvetten sowie die Verwendung derselben im Zusammenhang mit dieser Erfindung. Insbesondere werden unterschiedliche Y- und Ψ- Durchflußküvetten dargestellt.
Eine repräsentative Y-Durchflußküvette verwendet die Einlässe für Strömungskanäle 1 und 2 und den Auslaß für einen Strömungskanal 2 einer kommerziell erhältlichen IFC 4 für ein BIAcore 1000-System (BIACORE AB Uppsala, Schweden). Unter Bezugnahme auf Fig. 15 tritt eine Probenströmung aus einem Einlaß 1510 in eine Y-Durchflußküvette 1500 und tritt der Puffer aus einem Einlaß 1520 in die Y-Durchflußküvette. Sowohl die Probe als auch der Puffer verlassen die Y-Durchflußküvette über einen Auslaß 1530. Sowohl die Proben- als auch die Pufferströmung werden durch Schneiden eines zusätzlichen Kanals in die IFC 4 in die Durchflußküvette gelenkt, um zu ermöglichen, daß sowohl die Probe als auch der Puffer simultan durch die Durchflußküvette laufen gelassen werden. Das Volumen der Y- Durchflußküvette beträgt 180 nl (d. h. das Dreifache des Volumens von kommerziell erhältlichen BIAcore-Durchflußküvetten).
Eine repräsentative eindimensionale ("1D") Ψ-Durchflußküvette ist in Fig. 16 dargestellt, wo eine Probenströmung über einen Einlaß 1610 in eine Ψ-Durchflußküvette 1600 eintritt, wobei Pufferströmungen durch Einläße 1670 und 1630 eintreten und alle Strömungen durch einen Auslaß 1640 heraustreten. Die Ψ-Durchflußküvette ist aus PMMA hergestellt und verwendet Pharmacia 500-Pumpen mit 500 ul-Hamilton-Spritzen zum Zuführen von Fluidströmung zur Durchflußküvette.

Beispiel 2

Diffusion von Fluidströmungen

Dieses Beispiel faßt Experimente zusammen, die auf eine Diffusion von Fluidströmungen gerichtet sind, wenn sie durch die repräsentative Ψ-Durchflußküvette von Beispiel 1 hindurchtreten. Wie oben im Zusammenhang mit Fig. 6 genannt, erfordert ein Lenken von Fluidströmungen in einer Durchflußküvette unter laminarer Strömung, daß die Diffusion der Probe auf ein Gebiet nahe an der Grenzfläche zwischen den Strömungen begrenzt wird. Wenn dies nicht der Fall ist, wird Diffusion auf die Richtwirkung der Probenströmung einwirken und statt zweier getrennter Strömungen wird ein "Verschmieren" von Strömungen resultieren.
In diesem Experiment wird die Diffusionsbreite nach ungefähr 0,3 Sekunden bestimmt, die die Zeit ist, die zum Transportieren eines Moleküls durch die Durchflußküvette des BIAcore- Instruments bei einer Durchflußmenge von 10 ul/min benötigt wird. Die Diffusionsbreite (siehe Fig. 17A) wurde als die Breite einer Farbänderung eines Indikators gemessen, die durch Okularuntersuchung mit einer Panasonic WV-Ks 152-Videokamera und einem an dem Arbeitsprozessor angebrachten Mikroskop gemessen wurde. Die Diffusionsbreite für unterschiedliche Kontaktzeiten an der Grenzfläche wurde mit gefittet, wobei C eine für jeden pH gefittete dimensionslose Konstante ist (siehe Fig. 17B). Die experimentelle Diffusionsbreite wurde dann für unterschiedliche Kontaktzeiten anhand der gefitteten Konstanten C abgeschätzt.
Tabelle zeigt die experimentellen Ergebnisse und die theoretisch berechneten Werte für die Diffusion von Protonen. Die theoretischen Werte sind mit Gleichung (14) berechnet. Die zum Erhalten einer Farbverschiebung erforderliche pH-Änderung wurde mit einem pH-Messer und durch Okularuntersuchung gemessen. In diesen Experimenten betrug die pH-Änderung 0,4 pH-Einheiten für Phenolrot (phenol red (PR)) und 0,6 pH-Einheiten für Bromphenolblau (bromophenol blue (BB)). Da eine als eine Farbänderung in einem 100 ml-Behälter wahrgenommene Konzentrationsänderung nicht dieselbe wie für eine Dünnschicht- Durchflußküvette sein kann, ist die theoretische Diffusionsbreite für BB für drei unterschiedliche Konzentrationsänderungen (d. h. pH-Verschiebungen) berechnet. Die Spalte "Indikatordiffusion" in Tabelle 1 beschreibt die Verbreiterung des Farbänderungsbandes aufgrund der Indikatordiffusion in das saure Fluid. Die Fehler in dem PR- und dem BB-Teil von Tabelle 1 zeigen eine zunehmende Tendenz, wenn die pH-Differenz zwischen den zwei Fluiden abnimmt. Es wird angenommen, daß dieses Verhalten sich aufgrund eines Abflachens des Konzentrationsgradienten ergibt, wenn die Konzentrationsdifferenz zwischen den zwei Fluiden abnimmt. Ein steilerer Konzenttationsgradient ergibt eine scharfe Farbänderung, während ein flacherer Konzentrationsgradient eine diffuse Farbänderung ergibt. Demzufolge wird eine unkorrekte Abschätzung der erforderlichen pH-Änderung für eine Farbverschiebung zunehmende Fehler ergeben, wenn die Konzentrationsdifferenz zwischen den zwei Fluiden abnimmt. Tabelle 1 Diffusion von Protonen in die Indikatoren Phenol rot und Bromophenol blau
In der obigen Tabelle 1 ist C eine Konstante anhand des Fittens von an die experimentell gemessenen Diffusionsbreiten, ist "Exp. Breite" die Diffusionsbreite von Protonen in das Indikatorfluid, die anhand der experimentellen Daten zur Zeit 0,3 sec (entspricht der Zeit, die zum Transport eines Moleküls durch eine BIAcoreTM Durchflußküvette bei einer Durchflußmenge von 10 ul/min benötigt wird) erhalten wurde, und ist "pH-Änderung" in dem theoretischen Teil die erforderliche pH-Änderung während einer Okularuntersuchung des Indikatorfluids. In dem BB-Teil ist die theoretische Diffusionsbreite für drei unterschiedliche pH-Änderungen berechnet, da die Farbänderung des BB schwer zu bestimmen war. Die Spalte "Konzentrationsänderung" ist die entsprechende Konzentrationsänderung zur bestimmten pH-Änderung (d. h., wie viele Indikatormoleküle proteolysiert sein müssen, bevor eine Farbänderung gesehen werden könnte), und ist "theoretische Breite" die theoretische Diffusionsbreite, die anhand der erforderlichen Konzentrationsänderung für eine Farbänderung des Indikators berechnet wurde. Die Diffusion des Indikators in das saure Fluid ist in der Spalte "Indikatordiffusion" berechnet.
Der pH für PR wurde 1,0 pH-Einheiten unter pKa für PR eingestellt, während der pH für BB 0,1 pH-Einheiten unter dem pKa eingestellt wurde. Somit ist die erforderliche Konzentrationsänderung für eine Farbänderung für BB größer als PR. Die Differenz beim Einstellen des pH für die Indikatoren ergibt sich anhand der Schwierigkeiten, zwischen der blauen, blaugrün-gelben und der gelben Farbe für BB zu unterscheiden. Die Abschätzung, daß 0,6 pH-Einheiten für eine Farbänderung von BB genug sind, kann nicht genau sein, und es ist wahrscheinlicher, daß die erforderliche Konzentrationsänderung zwischen 1 und 2 pH- Einheiten betrug. Die Ergebnisse in der Tabelle 1 zeigen, daß die abgeleitete Theorie verwendet werden kann, um die Diffusion in der Dünnschicht-Durchflußküvette vorherzusagen. Ferner zeigen die Tests mit Phenolrot, daß es möglich ist, die Diffusion in viskoseren Medien, wie Glycerol, mit wünschenswerter Präzision zu berechnen.
Für diesen Zweck zeigt Fig. 18 die berechnete Diffusionsbreite für einige Proteine mit zahlreichen Größen sowie für einige kleine Moleküle, während Tabelle 2 die berechnete Diffusionsbreite in Zahlen angibt. Ferner liefert die Tabelle 2 die Information, die notwendig ist, um zu berechnen, wie viele schmale Bänder von immobilisierten Molekülen auf der Sensoroberfläche in der Durchflußküvette plaziert werden können. Wenn man beispielsweise IgG bei einer Durchflußmenge von 100 ul/min und einer Trennung von 0,1% betrachtet, beträgt die Diffusionsbreite zwischen der Grenzfläche und 0,1% 5 um und die Breite zwischen der Grenzfläche und 99,9% auch 5 um. Wenn 99,9% der ursprünglichen Konzentration zur Detektion in einem Band mit einer Breite von 10 um erforderlich sind, dann beträgt die Separationsbreite 30 um (siehe Fig. 19). 30 um schmale Bänder in Durchflußküvetten mit einer Breite 500 um ergeben 16 mögliche Bänder in der Durchflußküvette. Dieselbe Berechnung für Saccharose ergibt 10 Bänder in der Durchflußküvette. Es sollte jedoch bemerkt werden, daß die Anzahl der Bänder durch Verwendung eines kürzeren Sensorgebietes erhöht werden kann, was zu einer Abnahme der Diffusionsbreite und somit einer Zunahme der Anzahl von potentiellen Bändern in der Durchflußküvette führen wird. Tabelle 2 Diffusionsbreite (um) für einige Proteine und kleine Moleküle

Beispiel 3

IONENAUSTAUSCH/ON-LINE DIALYSE

Die Fig. 20 zeigt, wie ein Ionenaustausch oder eine Online-Dialyse unter Verwendung der Techniken der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann. Die Fig. 20A und 20B stellen einen Ionenaustausch mit niedriger Ionenkonzentration in dem benachbarten Puffer dar. Die Fig. 20C und 20D demonstrieren einen Ionenaustausch, wenn die Ionenkonzentration in dem benachbarten Puffer hoch ist. Die in Fig. 20 gezeigten Bilder sind für zwei unterschiedliche Durchflußmengen: 10 ul/min in den Fig. 20A und 20C, und 100 ul/min in den Fig. 20B und 20D. Die Entfernung zwischen den zwei Grenzflächen beträgt 12 um in 20A, 20B, 20C und 20D. Unter Bezugnahme auf Fig. 20A beträgt die Durchflußmenge 10 ul/min und ist die Konzentration von Salz und Protonen für den benachbarten Puffer niedrig. Die Salzkonzentration in der Probenströmung nimmt auf 10% und die Protonenkonzentration auf 6% der ursprünglichen Konzentration ab. In der Fig. 20B beträgt die Durchflußmenge 100 ul/min, nimmt die Salzkonzentration auf näherungsweise 30% der ursprünglichen Konzentration ab und nimmt die Protonenkonzentration auf näherungsweise 20% der ursprünglichen Konzentration in der Probe ab. In den Fig. 20C und 20D weist der benachbarte Puffer eine hohe Konzentration von Salz und Protonen auf.

BEISPIEL 4

AUSTAUSCHGESCHWINDIGKEITEN FÜR REPRÄSENTATIVE DURCHFLUßKÜVETTEN

Eine Saccharoselösung (5 Gew.-%) wurde zum Messen der Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeit in der repräsentativen Y-Durchflußküvette von Beispiel 1 (siehe Fig. 15) verwendet und mit einer Durchflußküvette eines kommerziell erhältlichen BIAcore 2000 (bezeichnet als eine "IFC 3-Durchflußküvette") und eines kommerziell erhältlichen BIACore 1000 (bezeichnet als eine "IFC 4-Durchflußküvette") verglichen. Die IFC 3- und IFC 4- Durchflußküvetten weisen beide ein Volumen von 60 nl auf, aber unterscheiden sich in Bezug auf die Kanäle, die zu den Durchflußküvetten führen, und auf die Verschiebung der Ventile.
In diesem Experiment schließt die Bezugnahme auf die IFC 3- und IFC 4-Durchflußküvetten die Kanäle, Ventile und 60 nl-Durchflußküvetten ein.
Die Anstiegszeit wurde als diejenige Zeit gemessen, die erforderlich ist, um 99% des Plateauwerts für unterschiedliche Durchflußmengen durch die getesteten Durchflußküvetten zu erreichen. Ein graphisches Darstellen der Anstiegszeit gegenüber der Durchflußmenge und ein Fitten dieser Kurve mit Gleichung (9) ergibt eine konstante Va. Mit dieser Konstante ist es möglich, sowohl die Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeit für unterschiedliche Durchflußmengen als auch die Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeitskonstante für die Durchflußküvette zu berechnen.
Ein schneller Flüssigkeitsaustausch während des Anstiegs in der Y-Durchflußküvette wurde wie folgt bewerkstelligt. Bevor die Probe in die Durchflußküvette eingeführt wurde, wurde nur Puffer durch die Durchflußküvette laufengelassen. Die Probenströmungsventile schalteten um und die Probe trat in die Durchflußküvette ein. Die Probenströmung füllte nur einen schmalen Teil der Durchflußküvette auf. Beim Flüssigkeitsaustausch schloß das Ventil zur Pufferströmung und die Probenströmung verschob den Puffer und füllte die Durchflußküvette auf. Der Abfall wurde in derselben Weise wie der Anstieg vorgenommen. Der Puffer trat in die Durchflußküvette ein und füllte nur einen schmalen Teil der Durchflußküvette auf. Das Probenströmungsventil schloß und die Pufferströmung verschob die Probenströmung. Die Zeit, die zum Zudecken des Sensorgebietes erforderlich war, entsprach der Bewegung der Grenzfläche über das Sensorgebiet und der Dispersion der Grenzfläche. In diesem Zusammenhang war das Sensorgebiet ein Gebiet von näherungsweise 1,6 mm mal 0,17 mm, das sich zwischen dem Einlaß 2 und Auslaß 2 von Fig. 15 befand (wobei die gesamte Sensoroberfläche grob 2,4 mm mal 0,8 mm betrug).
Die Fig. 21A und 21B vergleichen die Sensorgramme für die Y-, IFC 3- und IFC 4- Durchflußküvetten. Um eine experimentelle Beziehung zwischen der Anstiegszeit und der Durchflußmenge zu erhalten, wurde die Anstiegszeit auf 99% der Konzentration des stationären Zustands gemessen und graphisch gegenüber der Probenströmung (siehe Fig. 21C) entsprechend Gleichung (9) aufgetragen.
Die Gleichung (10) wurde verwendet, um die Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeitskonstante für unterschiedliche Durchflußmengen zu berechnen. Um eine gültige Abschätzung der Reaktionsgeschwindigkeiten zu erhalten, KLqx > > als die An-Geschwindigkeit und die Aus-Geschwindigkeit. Je größer KLqx ist, desto schnellere Kinetiken können gemessen werden. Die Ergebnisse dieser Berechnung sind in Fig. 22 vorhanden, die einen Vergleich der Flüssigkeitsaustauschgeschwindigkeiten für unterschiedliche Durchflußküvetten bei unterschiedlichen Durchflußmengen zeigt.
In den BIAcore IFC 3- und IFC 4-Durchflußküvetten ist die Grenzfläche über die Länge des Sensorgebietes ausgewaschen und beträgt die Länge des Detektionsgebietes das Zehnfache der Breite. In der Y-Durchflußküvette ist die Grenzfläche über dem Sensorgebiet in einer zur Breite der Durchflußküvette parallelen Richtung (d. h. quer zur Seitenwand) verschoben. Somit beträgt die Entfernung, die die Grenzfläche zurücklegen muß, zehnmal weniger als für die IFC 3- oder IFC 4-Durchflußküvetten. Diese Bewegung quer zur Strömungsrichtung kombiniert mit der geringen Dispersion der Y-Durchflußküvette erklärt, weshalb der Austausch von Fluiden viel schneller in der Y-Durchflußküvette durchgeführt werden kann.
Der schnellere Flüssigkeitsaustausch während des Anstiegs für die Y-Durchflußküvette als für den Abstieg (siehe Fig. 22) ergibt sich aufgrund der Tatsache, daß die erforderliche Probenströmung vor dem Anstieg geringer als während des Abfalls relativ zur Gesamtströmung in der Durchflußküvette ist. Die höhere Strömung vor dem Abfall für die Y- Durchflußküvette ist erforderlich, um das Sensorgebiet abzudecken (d. h., die Grenzfläche ist weiter von dem Probenströmungsanlaß entfernt). Das Pufferströmungsventil in den IFC 3- und IFC 4-Durchflußküvetten ist näher an der Durchflußküvette als die Probenströmungsventile plaziert (d. h., die Dispersion in den IFC 3- und 4-Durchflußküvetten ist für den Flüssigkeitsaustausch zur Pufferströmung geringer als für den Flüssigkeitsaustausch zur Probenströmung). Diese zwei Effekte zusammen erklären die Verbesserung des Anstiegs im Vergleich zum Abfall.

Beispiel 5

SENSIBILISIERUNG UND ANALYSE

Dieses Experiment stellt die Verwendung einer repräsentativen Y-Durchflußküvette dieser Erfindung zum Immobilisieren zweier unterschiedlicher Liganden auf diskreten Sensorgebieten dar. Die Immobilisierung wurde mit zwei Fluidströmungen vorgenommen, die durch die Durchflußküvette nebeneinander unter laminaren Strömungsbedingungen hindurchtreten. Ein BIAcore 2000 wurde für dieses Experiment unter Verwendung der Y- Durchflußküvette von Fig. 15 benutzt. Die Fig. 23A zeigt das Ergebnis der Immobilisierung eines ersten Liganden (d. h. biotinyliertes 15-meres Oligonukleotid, genannt "R1") über einem Sensorgebiet 1 und den Umriß Y-Durchflußküvette während der Immobilisierung. Während der Immobilisierung gab es keine Reaktionen von den Sensorgebieten 2 und 3. Das Sensorgramm zeigt einen Masseneffekt anhand der Immobilisierungsströmung, aber nicht anhand der Pufferströmung über dem Sensorgebiet 2 und 3. Während der Immobilisierung eines zweiten Liganden (d. h. ein anderes biotinyliertes 15-meres Oligonukleotid, genannt "R2") über einem Sensorgebiet 3, gab es keine Reaktion von den Sensorgebieten 1 und 2, wie durch Fig. 23B gezeigt. Diese Sensorgramme zeigen deutlich, daß die Y-Durchflußküvette für eine Immobilisierung von zwei unterschiedlichen Liganden in einer einzigen Durchflußküvette sehr gut ist.
Fig. 23C zeigt die Injektion eines Analyten (d. h. ein 16-meres Oligo, genannt "R4", Komplementär zu R1). Die gesamte Sensoroberfläche wurde mit dem Analyten in Kontakt gebracht. Obwohl der Analyt mit beiden sensibilisierten Gebieten (d. h. Sensorgebiete 1 und 3) in Kontakt war, gab nur die spezifische Wechselwirkung mit dem Sensorgebiet 1 eine Reaktion. Der nicht wechselwirkende Ligand und das nicht-sensibilisierte Gebiet können als Referenzen verwendet werden. Fig. 23C zeigt einen Masseneffekt von allen Sensorgebieten, wobei dieser Masseneffekt in Fig. 23E heraussubstrahiert ist. Fig. 23D zeigt die Injektion eines anderen Analyten (ein 16-meres komplementäres Oligo, genannt "R5", Komplementär zu R2). Der Masseneffekt beträgt ungefähr 100 RU, aber der Masseneffekt kann subtrahiert werden, wie es in Fig. 23F gezeigt ist.
Anhand des vorangehenden wird es ersichtlich sein, daß zahlreiche Modifikationen vorgenommen werden können, ohne aus dem Umfang der Erfindung, wie er durch die Ansprüche definiert ist, zu gelangen, obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung hierin zu Darstellungszwecke diskutiert worden sind.

Claims

1. Ein Verfahren zum Sensibilisieren einer Sensoroberfläche, die zum Passieren von einer Flüssigkeitsströmung in einer Durchflußküvette angeordnet ist, das umfaßt:

Bereitstellen einer laminaren Strömung eines ersten Sensibilisierfluids und einer laminaren Strömung eines zweiten Fluids benachbart zur Strömung des ersten Sensibilisierfluids, so daß die zwei laminaren Strömungen gemeinsam in derselben Richtung über die Sensoroberfläche mit einer Grenzfläche zueinander strömen, wobei die Grenzfläche parallel zur Strömungsrichtung verläuft und zumindest das erste Sensibilisierfluid die Sensoroberfläche sensibilisieren kann, und

Einstellen der relativen Durchflußmengen des ersten Sensibilisierfluids und zweiten Fluids, um die Grenzfläche seitlich zu verschieben, so daß das erste Sensibilisierfluid ein diskretes Sensorgebiet der Sensoroberfläche zur selektiven Sensibilisierung derselben berührt.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Fluid nicht mit der Sensoroberfläche wechselwirkt, um dadurch ein sensibilisiertes Gebiet und ein nicht- sensibilisiertes Gebiet auf der Sensoroberfläche zu erzeugen.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in einem weiteren Schritt das erste Sensibilisierfluid durch ein Fluid ersetzt wird, das nicht mit der Sensoroberfläche wechselwirkt, und das zweite Fluid durch ein zweites Sensibilisierfluid ersetzt wird, das die Sensoroberfläche anders als das erste Sensibilisierfluid sensibilisieren kann, um zwei unterschiedlich sensibilisierte Gebiete zu erzeugen, die optional durch ein nicht- sensibilisiertes Gebiet auf der Sensoroberfläche voneinander beabstandet sind.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die relativen Durchflußmengen der laminaren Strömungen variiert werden, um die Grenzfläche seitlich zu verschieben und ein Gradient-sensibilisiertes Gebiet auf der Sensoroberfläche zu liefern.

5. Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die relativen Durchflußmengen der laminaren Strömungen kontinuierlich variiert werden, um ein kontinuierliches Gradient-sensibilisiertes Gebiet auf der Sensoroberfläche zu liefern.

6. Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine zusätzliche laminare Strömung eines dritten Fluids auf der anderen Seite der Strömung des ersten Sensibilisierfluids bereitgestellt wird, so daß die laminare Strömung des ersten Sensibilisierfluids zwischen den laminaren Strömungen des zweiten und dritten Fluids liegt.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zweiten und dritten Fluide nicht fähig sind, die Sensoroberfläche zu sensibilisieren.

8. Das Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit wenigstens einem anderen sensibilisierenden ersten Fluid und mit variierten relativen Durchflußmengen der zweiten und dritten Fluide wiederholt wird, um wenigstens zwei benachbarte sensibilisierte Oberflächengebiete auf der Sensoroberfläche zu liefern.

9. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensibilisierung der Sensoroberfläche ein Immobilisieren eines Analyt-spezifischen Liganden an der Sensoroberfläche umfaßt.

10. Das Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt-spezifische Ligand aus der Gruppe bestehend aus Antigen, Antikörper, Antikörper-Fragment, Oligonucleotid, Kohlenhydrat, Oligosaccharid, Rezeptor, Rezeptor-Fragment, Phospholipid, Protein, Hormon, Avidin, Biotin, Enzym, Enzymsubstrat, Enzyminhibitor und organisch synthetischer Verbindung ausgewählt ist.

11. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Sensibilisierfluid ein Gebiet auf der Sensoroberfläche sensibilisiert und ein zweites Sensibilisierfluid quer zur Richtung des ersten Sensibilisierfluids aufgebracht wird, um ein überlappendes Sensibilisiergebiet auf der Sensoroberfläche zu liefern.

12. Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Sensibilisierfluid ein Gebiet auf der Sensoroberfläche sensibilisiert und wenigstens zwei unterschiedliche zweite Sensibilisierfluide quer zur Richtung des ersten Sensibilisierfluids aufgebracht werden, um wenigstens zwei überlappende Sensibilisiergebiete auf der Sensoroberfläche zu liefern.

13. Das Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei unterschiedliche erste Sensibilisierfluide wenigstens zwei parallele Gebiete auf der Sensoroberfläche sensibilisieren und wenigstens zwei unterschiedliche zweite Sensibilisierfluide quer zur Richtung des ersten Sensibilisierfluids aufgebracht werden, um eine Matrix aus überlappenden sensibilisierten Gebieten auf der Sensoroberfläche zu liefern.

14. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11-13, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens der Ligand des ersten Sensibilisierfluids oder des zweiten Sensibilisierfluids ein Analyt-spezifischer Ligand ist.

15. Das Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt-spezifische Ligand aus der Gruppe bestehend aus Antigen, Antikörper, Antikörper-Fragment, Oligonucleotid, Kohlenhydrat, Oligosaccharid, Rezeptor, Rezeptor-Fragment, Phospholipid, Protein, Hormon, Avidin, Biotin, Enzym, Enzymsubstrat, Enzyminhibitor und organisch synthetischer Verbindung ausgewählt ist.

16. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens der Ligand des ersten Sensibilisierfluids oder des zweiten Sensibilisierfluids ein bifunktionaler Ligand ist.

17. Das Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensibilisierung die sukzessive Hinzufügung von chemischen Anteilen begründet, um eine Verbindungssynthese zu erzielen.

18. Das Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensibilisierung die sukzessive Hinzufügung von Peptid- oder Oligonucleotidanteilen begründet, um eine Peptid- oder Oligonucleotidsynthese zu erzielen.

19. Ein Verfahren zum Analysieren einer Fluidprobe auf einen Analyten, das ein Sensibilisieren eines diskreten Sensorgebietes auf einer Sensoroberfläche durch das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-16, Berühren des Sensorgebietes mit der Fluidprobe und Detektieren von Wechselwirkung zwischen dem Analyten und dem Sensorgebiet umfaßt.

20. Das Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein nicht- sensibilisiertes Gebiet auf der Sensoroberfläche als eine Referenz benutzt wird.

21. Das Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein sensibilisiertes Gebiet auf der Sensoroberfläche als eine Referenz benutzt wird.

22. Ein Verfahren zum Analysieren einer Fluidprobe für einen Analyten, das umfaßt:

Bereitstellen einer Durchflußküvette mit einer damit verbundenen Sensoroberfläche, wobei die Sensoroberfläche darauf wenigstens zwei diskrete Sensorgebiete aufweist;

selektives Inkontaktbringen der Fluidprobe mit wenigstens einem der diskreten Sensorgebiete durch Hindurchtretenlassen der Fluidprobe durch die Durchflußküvette unter laminaren Strömungsbedingungen mit einem zweiten Fluid unter laminaren Strömungsbedingungen, so daß die zwei laminaren Strömungen gemeinsam in derselben Richtung durch die Durchflußküvette mit einer Grenzfläche zueinander strömen, wobei die Grenzfläche parallel zur Strömungsrichtung verläuft und wobei ein wahlweiser Kontakt mit dem wenigstens einen diskreten Sensorgebiet durch Einstellen der relativen Durchflußmengen der Fluidprobe und des zweiten Fluids zum seitlichen Verschieben der Grenzfläche kontrolliert wird.

23. Das Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluidprobe unter laminaren Strömungsbedingungen mit dem zweiten Fluid und ferner mit einem auf der anderen Seite der Strömung des Probenfluids angeordneten dritten Fluid durch die Durchflußküvette tritt, so daß die laminare Strömung des Probenfluids zwischen den zweiten und dritten Strömungen liegt.

24. Das Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die relativen Durchfußmengen des Probenfluids und der zweiten Strömung eingestellt werden, um das Probenfluid in Kontakt mit einem der wenigstens zwei diskreten Sensorgebiete zu bringen, das nicht vorher in Kontakt mit dem Probenfluid stand.

25. Das Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die relativen Durchflußmengen der zweiten und dritten Strömungen eingestellt werden, um den Probenfluß in Kontakt mit einem der wenigstens zwei diskreten Sensorgebiete zu bringen, das nicht vorher in Kontakt mit dem Probenfluid stand.

26. Das Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß eines der wenigstens zwei diskreten Sensorgebiete ein sensibilisiertes Sensorgebiet ist.

27. Das Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß eines der wenigstens zwei diskreten Sensorgebiete ein sensibilisiertes Referenzgebiet ist.

28. Das Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß eines der wenigstens zwei diskreten Sensorgebiete ein nicht-sensibilisiertes Referenzgebiet ist.

29. Das Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-sensiblisierte Gebiet vorher ein sensibilisiertes Sensorgebiet war.

30. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23-29, ferner umfassend:

in einer ersten Stufe, Einstellen der relativen Durchflußmengen der laminaren Strömungen, um die Grenzfläche zwischen den laminaren Strömungen derart zu plazieren, daß die Probenfluidströmung nicht das Sensorgebiet berührt;

in einer zweiten Stufe, Ändern der relativen Durchflußmengen der laminaren Strömungen, um die Grenzfläche seitlich derart zu verschieben, daß die Probenströmung das Sensorgebiet berührt; und

Bestimmen einer Assoziation eines Analyts in der Probenströmung mit dem Sensorgebiet.

31. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 22-29, ferner umfassend:

in einer ersten Stufe, Einstellen der relativen Durchflußmengen der laminaren Strömungen, um die Grenzfläche zwischen den laminaren Strömungen derart zu plazieren, daß die Probenfluidströmung das Sensorgebiet berührt;

in einer zweiten Stufe, Ändern der relativen Druchflußmengen der laminaren Strömungen, um die Grenzfläche seitlich derart zu verschieben, daß die Probenströmung nicht das Sensorgebiet berührt; und

Bestimmen einer Dissoziation eines Analyts von dem Sensorgebiet.

32. Ein System mit:

einer Durchflußküvette mit einem Einlaßende und einem Auslaßende, wobei sich wenigstens eine Sensoroberfläche auf einer Wandfläche innerhalb der Durchflußküvette zwischen den Einlaß- und Auslaßenden befindet, die Durchflußküvette wenigstens zwei Einlaßöffnungen am Einlaßende und wenigstens eine Auslaßöffnung am Auslaßende aufweist, so daß separate laminare Fluidströmungen, die durch die jeweiligen Einlaßöffnungen in die Durchflußküvette eintreten, Seite an Seite in derselben Richtung durch die Durchflußzelle über die Sensoroberfläche strömen können;

Mitteln zum Anlegen von laminaren Fluidströmungen durch die Einlaßöffnungen, so daß die laminaren Fluidströmungen Seite an Seite durch die Durchflußzelle über die Sensoroberfläche mit einer Grenzfläche zueinander treten, die parallel zur Richtung der laminaren Fluidströme verläuft; und

Mitteln zum Variieren der relativen Durchflußmengen der laminaren Fluidströme zum seitlichen Verschieben der Grenzfläche über der Sensoroberfläche.

33. Das System nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußküvette zwei Einlaßöffnungen und wenigstens eine Auslaßöffnung aufweist.

34. Das System nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußküvette drei Einlaßöffnungen und wenigstens eine Auslaßöffnung aufweist, um das Herstellen von drei benachbarten laminaren Strömungen in Sandwich-Weise durch die Durchflußküvette zu erlauben.

35. Das System nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußküvette ferner wenigstens zwei zusätzliche Einlaßöffnungen und wenigstens eine zusätzliche Auslaßöffnung aufweist, die im wesentlichen quer zum Fluidweg zwischen den Einlaß- und Auslaßenden angeordnet sind.

36. Das System nach irgendeinem der Ansprüche 33-35, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensoroberfläche in der Durchflußküvette drehbar angebracht ist.

37. Das System nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensoroberfläche darauf wenigstens zwei diskrete Sensorgebiete aufweist.

38. Das System nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß eines der wenigstens zwei diskreten Sensorgebiete ein Referenzgebiet ist.

39. Das System nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß eines der wenigstens zwei diskreten Sensorgebiete mit einem Analyten speziell wechselwirken kann.

40. Das System nach irgendeinem der Ansprüche 32-39, und ferner umfassend:

ein Detektionsmittel zum Detektieren von Wechselwirkungsereignissen auf der Sensoroberfläche.

41. Das System nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektionsmittel einen optischen Sensor umfaßt.

42. Das System nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Sensor auf einem Messen einer abklingenden Welle basiert.

43. Das System nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Sensor ein SPR-Sensor ist.