DE69830325T2

DE69830325T2 - Peptide, die vom Gen env des FIV (Virus der felinen Immuneffizienz) abgeleitet sind sowie auf ihre immunprotektiven Anwendungen

Info

Publication number: DE69830325T2
Application number: DE69830325T
Authority: DE
Inventors: Jennifer Richardson; Anne Moraillon; Pierre Sonigo; Gianfranco Pancino
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1997-10-17
Filing date: 1998-10-15
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2018-10-16
Also published as: CA2306441C; FR2769916A1; JP2001520237A; US6391304B1; WO1999020650A1; FR2769916B1; CA2306441A1; EP1023320B1; JP4477770B2; ATE296314T1; EP1023320A1; DE69830325D1

Description

Diese vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptide, die vom Gen env des FIV (Virus der felinen Immuneffizienz) abgeleitet sind sowie auf ihre immunprotektiven Anwendungen (Prävention und Behandlung der felinen Immundefizienz).
Feline Immuneffizienz wird durch ein Lentivirus verursacht, das Virus der felinen Immundefizienz (FIV), das eine genetische Struktur aufweist, die der der Lentiviren der Primaten (HIV und SIV) ähnlich ist.
Einige Fragmente wurden selektioniert und erlaubten die Entwicklung empfindlicher und spezifischer Tests für die Detektion seropositiver Tiere, wie es in den europäischen Patentanmeldungen Nr. 0 564 477 vom 20. November 1991, Nr. 0 577 458 vom 16. Juni 1993 und in der französischen Patentanmeldung Nr. 94 07062 vom 9. Juni 1994 im Namen der Anmelderin beschrieben ist; diese basieren in der Mehrheit auf dem Protein Env des FIV, das 854 Aminosäuren umfasst und dessen Sequenz in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 577 458 beschrieben ist.
Das Protein Env liefert nach Spaltung zwei Glycoproteinfragmente, die SU (Oberflächenglycoprotein) und TM (Transmembranglycoprotein) genannt werden, in denen neun Domänen definiert wurden, die zusammenhängende B-Epitope der Hüllglycoproteine des FIV umfassen und die während der natürlichen Infektion erkannt werden (G. Pancino et al., J. Virol., 1993, 67, 664–672).
Unter diesen neuen Domänen wurden fünf (SU1–SU5) auf der Ebene des Oberflächenglycoproteins und vier davon (TM1–TM4) auf der Ebene des Transmembranglycoproteins lokalisiert.
Genauer ausgedrückt, die Positionen der Domänen TM1–TM4 im Protein TM sind die folgenden:

– Die Domäne TM1 (51 Aminosäuren) entspricht den Positionen 595–647 des Env-Proteins von FIV;
– die Domäne TM2 (31 Aminosäuren) entspricht den Positionen 681–711 des Env-Proteins von FIV; diese Domäne enthält ein Epitop, das die Sequenz: Cys⁶⁹⁷-Asn-Gln-Asn-Gln-Phe-Phe-Cys-Lys⁷⁰⁵ einschließt (Peptid, das P237 genannt wird),
– die Domäne TM3 (45 Aminosäuren) entspricht den Positionen 744–788 des Env-Proteins von FIV und
– die Domäne TM4 (29 Aminosäuren) entspricht den Positionen 826854 des Env-Proteins von FIV.

Während auf dem Gebiet der Detektion nun eine Kombination von Reagenzien zur Detektion des FIV zur Verfügung steht, ist die Situation auf dem Gebiet der Immunprotektion komplexer.
Das Peptid TM2 beispielsweise kann die Bildung von Antikörpern induzieren, die einen zu dem gesuchten entgegengesetzten Effekt haben, d.h. den Effekt der Verstärkung der viralen Infektion anstelle eines Schutzeffektes.
Man hat insbesondere beobachtet, dass Impfungen mit Hüllpräparaten des FIV eine Beschleunigung oder klinische Verschlimmerung der viralen Infektion mit sich ziehen.
Obgleich es üblicherweise bekannt ist, dass die Funktion der Antikörper herkömmlicherweise durch Neutralisationsversuche der Virusinfektion in Zellkultur ermittelt wird, haben die beobachteten Resultate gezeigt, dass die Mehrzahl der neutralisierenden Antikörper gegen die Virus-Hüllproteine gerichtet sind, dass aber eine Impfung mit lentiviraler Hülle trotz Induktion von neutralisierenden Antikörpern nicht den Erhalt eines zweckdienlichen Schutzes gegenüber experimentellen Infektionen erlaubt (R.P. Johnson, Curr. Opinion in Immunol. 1996, 8, 554–560).
Nach einer Immunisierung mit dem Hüllglycoprotein des FIV und einer virulenten Belastung hat man insbesondere entweder eine Verringerung der Viruslast (M.J. Hosie et al., Vaccine, 1996, 14, 405–411) oder eine Verschlimmerung der Primärinfektion (K.H. Siebelink et al., J. Virol., 1995, 69, 3, 3704–3711) bei den Katzen beobachtet. In dieser zuletzt genannten Untersuchung (K.H. Siebelink et al., 1995, vorher zitiert) wird die Verschlimmerung der Infektion durch das FIV auch bei den Tieren beobachtet, die einer passiven Übertragung von Plasma von immunisierten Katzen unterzogen worden waren; solche Resultate weisen auf die Möglichkeit hin, dass es die Antikörper sind, die eine Verstärkung der in vivo beobachteten Infektion induzieren.
Die Möglichkeit, dass die gegen die Hülle des FIV gerichtete Immunantwort für den Wirt schädlich ist, wurde von den Erfindern in einem Impfungsexperiment mit dem Gen env bestätigt, das zu einer Beschleunigung der Infektion führte.
Jedenfalls sind sowohl die Existenz einer Kausalitätsverbindung zwischen der Verschlimmerung der Infektion und dem Vorliegen von Antikörpern als auch die Existenz einer Ver bindung zwischen dem erreichten Schutzgrad und dem Vorliegen von Antikörpern schwer zu begründen und zeigen die Komplexität, auf die man bei der Entwicklung von Zusammensetzungen trifft, die gegenüber dem Lentivirus und insbesondere gegen FIV wirksam schützen. In der Tat wurde das Vorliegen von Antikörpern im Serum von Patienten, die mit HIV-1 infiziert waren, in bestimmten Untersuchungen mit dem Fortschreiten der Krankheit in Korrelation gebracht (G. Fust et al., AIDS, 1994, 8, 603–609, J. Homsy et al., J. Virol., 1990, 64, 1437–1440).
Es ist insbesondere stark möglich, dass die Antikörper, die die lentivirale Infektivität erhöhen, gleichermaßen den Grad der Schutzimmunität, der während der natürlichen Infektion erhalten wird, nach Impfung mit Untereinheiten des Hüllproteins verringern können.
Obwohl die Induktion von Antikörpern, die die virale Infektion in vitro neutralisieren, bis dato als guter Indikator angesehen wurde, um die Sequenzen zu selektionieren, die geeignet sind, eine Schutzimmunität zu induzieren, zeigen die vorstehend angeführten Resultate, dass es tatsächlich keine Korrelation neutralisierende Aktivität/Schutz gibt (D. Matteuci et al., J. Virol., 1996, 70, 617–622).
Außerdem greifen die Bedingungen bei der Messung der Aktivität und die Wahl der Viren, mit denen die Tests durchgeführt werden, in die Interpretation der Resultate ein.
Als Parameter, die besonders Einfluss nehmen, kann man nennen: das zur Messung der Restinfektivität verwendete Zellsubstrat und die Passagen des Virus, die Verwendung von Primärisolaten im Vergleich zu Viren, die an das Labor angepasst sind.
Die Selektion von monoklonalen Antikörpern mit hohem Neutralisationsvermögen, die gegen die Konformationsepitope gerichtet sind, hat nahe gelegt, dass diskontinuierliche Epitope für den Schutz wichtig sind. Aber die Identifizierung und die Synthese von Mimotopen zur vaccinalen Verwendung sind besonders schwer zu erreichen.
Peptide, die kontinuierliche Epitope darstellen, sind ein Reagens, das ganz an Impfzwecke angepasst ist. Das am besten untersuchte bekannte neutralisierende Epitop von HIV-1 ist die Hauptdomäne, die das Oberflächenglycoprotein neutralisiert, die Domäne V3 (J. Goudsmit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 4478–4482; T.J. Palker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 1932–1936; J.R. Rusche et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 3198–3202). Diese Region ist jedenfalls hypervariabel, und die Neutralisation ist im Wesentlichen auf das Virushomologe beschränkt.
Ein Peptid, das von der Region V3 des FIV abgeleitet ist, das neutralisierende Antikörper induziert, hat bei immunisierten Katzen keinen antiviralen Schutz induziert (Lombardi, J. Virol., 1994, 68, 8374–8379). Dies zeigt, dass in vitro-Neutralisation nicht direkt Schutzvermögen bedeutet.
Unter Berücksichtigung der Komplexität der Reaktivität des Immunsystems gegenüber den Lentivirus-Proteinen und der Tatsache, dass nicht alle neutralisierenden Antikörper systematisch Schutzaktivität haben, hatten die Erfinder sich die Aufgabe gestellt, synthetische Peptide wie die, die in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 577 458 beschrieben sind, zur Herstellung eines Medikaments zu verwenden, das geeignet ist, einen gewissen Schutzgrad gegen die Infektion mit FIV aufzubauen, und neue synthetische Peptide zu selektionieren, die fähig sind, einen gewissen Schutzgrad gegen die virulente Belastung mit einem Primärstamm von FIV zu induzieren; ein derartiger Schutz wird durch Verringerung oder Unterdrückung der viralen Belastung während der akuten Infektion beobachtet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des 19 Aminosäure-Peptids der folgenden SEQ ID NO: 1:
Lys-Lys-Gly-Leu-Gln-Gln-Leu-Gln-Glu-Trp-Glu-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile-Gly-Asn (SEQ ID NO: 1)
zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder die Prävention von Infektionen mit FIV
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch das Peptid der SEQ ID NO: 1, das fähig ist, einen gewissen Schutzgrad (präventiv oder therapeutisch) gegen eine Infektion mit FIV zu induzieren.
Überraschenderweise beobachtet man eine Verringerung oder eine Suppression in der Viruslast während einer akuten Infektion nur nach Immunisierung mit dem Peptid mit SEQ ID NO: 1.
Das 19-Aminosäure-Peptid mit SEQ ID NO: 1, das auch als TM3-19 bezeichnet wird, ist ein Fragment des Peptids, das der Domäne TM3 entspricht.
Eine systematische Analyse der funktionellen Aktivität der Antikörper, die gegen die verschiedenen vorher genannten Domänen (SU1–SU5 und TM1–TM4) gerichtet sind, hat nur die Identifizierung einer einzelnen Domäne, SU2, erlaubt, die in der dritten variablen Region lokalisiert ist, als eine Domäne, die fähig ist, Antikörper zu induzieren, die die virale Infektivität von Zellen in Kultur neutralisieren (A. de Ronde et al., Virology, 1994, 198, 257–264; S. Lombardi et al., J. Virol., 1993, 67, 4742–4749; J. Richardson et al., J. Gen. Virol., 1996, 77, 759–771).
Drei Domänen (SU2, SU5 und TM3-19), die von der Mehrheit der infizierten Katzen erkannt werden, wurden von den Erfindern als "Kandidaten" für Immunogene ausgewählt. Obgleich die Domäne SU2 die Produktion von neutralisierenden Antikörpern induziert, so ist doch nur das Fragment, das die Sequenz SEQ ID NO: 1 enthält, als Schutzmittel gegen die Infektion wirksam.
In überraschender Weise weisen die Sequenz TM3-19 oder die Sequenzen mit weniger als 50 Aminosäuren, die sie enthalten, eine Schutzaktivität (sowohl präventiv wie auch schützend auf), obgleich sie die Produktion von neutralisierenden Antikörpern nicht induzieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine immunprotektive und/oder vaccinale Zusammensetzung gegen eine Infektion mit FIV, dadurch gekennzeichnet, dass sie im Wesentlichen aus wenigstens dem Peptid der SEQ ID NO: 1 und wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel besteht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine immunprotektive Zusammensetzung, wie sie oben definiert ist, zur Verwendung in der Prävention (Vakzin) oder der Behandlung von Infektionen mit FIV.
Die Beurteilung der Viruslast durch FIV und/oder die Überwachung der Wirksamkeit der Impfung oder der Behandlung in einer biologischen Probe kann durch ein Verfahren verwirklicht werden, das umfasst:

(a) die Extraktion von viraler RNA aus einer zu analysierenden biologischen Probe;
(b) Herstellung einer Reihe von Proben, die jeweils eine unterschiedliche Zahl einer Kompetitions-RNA enthalten, die ausgehend von einer konservierten Region des Gens gag, in die wenigstens eine Modifikation eingeführt worden war, erhalten wurde;
(c) getrenntes Mischen des in (a) erhaltenen RNA-Extrakts mit jeder Probe der Reihe, die in (b) erhalten wurde;
(d) inverse Transkription der RNA, die in den verschiedenen in (c) erhaltenen Gemischen vorliegt, um die entsprechende cDNA zu erhalten;
(e) Amplifikation der in (d) erhaltenen cDNA mit Hilfe von Primern, die in der Gruppe ausgewählt werden, die aus den Sequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 besteht;
(f) Trennung der Amplifikationsprodukte und
(g) Detektion der Anzahl der Kopien von viraler Anfangs-RNA durch zweckdienliche quantitative Analyse wie z.B. Vergleichsdensitometrie und Entwicklung des Verhältnisses Produktdichte der Kompetitions-RNA/Produktdichte der Wild-RNA, die in der Anfangsprobe vorliegt, als Funktion der Kopienzahl der Kompetitions-RNA, die jedem Gemisch zugesetzt wird.

Die Kompetitions-RNA gemäß Stufe (b) wird in dem Fall erhalten, in dem die Modifikation eine Deletion ist, und zwar durch:

(i) Amplifikation der konservierten Region mit Hilfe der Primer der Sequenz SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5,
(ii) Durchführung der Deletion durch Mutagenese durch PCR des 3'-Teils des in (i) erhaltenen Produkts mit Hilfe der Primer mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 5,
(iii) Ersetzen des 3'-terminalen Teils des in (i) erhaltenen Produkts durch das Fragment, das die in (ii) erhaltene Deletion trägt, und
(iv) Produktion der Kompetitions-RNA, indem das in (iii) erhaltene Endprodukt als Matrize verwendet wird.

Außer den vorstehenden Ausführungsformen umfasst die Erfindung noch andere Ausführungsformen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen, wobei sich die Beschreibung auf Ausführungsbeispiele des Verfahrens gemäß der Erfindung sowie auf die beigefügten Zeichnungen bezieht; unter den Zeichnungen ist:
1 eine Darstellung der Oberflächen (SU)- und Transmembran (T M)-Glycoproteine der Hülle des FIV in Dia grammform. Die Peptide SU2, SU5 und TM3-19
werden als Immunogene eingesetzt. Die proteolytischen Spaltungsstellen, die das Peptidsignal (♦) eliminieren und die reifen Hüllglycoproteine (↓) erzeugen, sind gekennzeichnet. Die Positionen entsprechen denen der Hüllglycoproteine des Stamms Wo. Die Zone (-❏-) entspricht der Zwischenmembrandomäne; die Zone -❏- entspricht dem Peptidsignal;
2 entspricht einer Analyse der Untergruppen von Lymphozyten. Die Zahl der zirkulierenden CD4⁺-Lymphozyten wird in der Form eines Mittelwertes ausgedrückt, und zwar während der Immunisierung und nach virulenter Belastung während der akuten Infektion;
3 veranschaulicht die Viruslast im Plasma während der Primärinfektion. Die Viruslast, bestimmt durch RT-PCR wird mit Hilfe der Zahl der Kopien der viralen RNA/ml Plasma (Ordinate) als Funktion der Anzahl der Tage (Abszisse) ausgedrückt. Die gestrichelte Linie entspricht den Plasmas, in denen virale RNA, obgleich sie detektiert wird, in Werten unter 30 Kopien/Reaktion vorhanden ist (
Kopien/ml Plasma); die punktierte Linie entspricht der Nachweisgrenze (
Kopien/ml Plasma).
4 veranschaulicht die Viruslast in den Geweben. Sie wird als Kopienzahl an viraler RNA/μg Gesamt-RNA (Ordinate) für jede Katze ausgedrückt. Sie wird durch RT-PCR bestimmt. Die erhaltenen Resultate werden für die axillaren Ganglien (∎), die Milz (❏) und die Thymusdrüse (❏) dargestellt.
Es muss ebenfalls selbstverständlich sein, dass diese Beispiele allein zur Erläuterung des Gegenstands der Erfindung angeführt werden, für den sie in keiner Weise eine Beschränkung darstellen sollen.
BEISPIEL 1: Material und Verfahren, die zur Veranschaulichung der Schutzaktivität der Peptide gemäß der Erfindung verwendet werden.
1. Gewebekultur
Der Klon ID 10 (R. Osborne, J. Gen. Virol., 1994, 75, 3641–3645) von Katzen-Nierenfibroblasten (Crandell's-Katzennierenzellen oder CrFK) wird in DMEM-Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, das durch Hitze inaktiviert worden war (Fetal cal-Serum oder FCS), 100 EI/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, kultiviert. Die feline lymphoide T-Zelllinie FL-4 (J. Yamamoto et al., Intervirology, 1991, 32, 361-375), die in chronischer Weise mit dem FIV-Stamm Petaluma infiziert ist (N.C. Pedersen et al., Science, 1987, 235, 790–793) wird in RPMI-1640-Medium, komplementiert mit FCS und den vorher genannten Antibiotika (vollständiges RPMI-Medium) kultiviert.
Die einkernigen Zellen von peripherem Katzenblut (Peripheral blood mononuclear cells oder PBM-Zellen) werden durch Dichtegradienten-Zentrifugation aus dem Blut von nicht-infizierten Katzen isoliert und während 3 Tagen in einem vollständigen RPMI-Medium, das 5 μg/ml Concanavalin A, 50 μM 2-Mercaptoethanol (2-ME) und 10 mM HEPES enthält, aktiviert.
2. Virus
Die Isolate von FIV-Petaluma (N.C. Pedersen et al., Science, 1987, 235, 790–793) und Wo (A. Moraillon et al., Vet. Microbiol., 1992, 31, 41–54) werden jeweils ausgehend von den Überständen der Zelllinie FL-4 und der infizierten Katzen-PBM-Zellen erhalten. Das Isolat Wo wurde nur bei einkernigen Zellen (PBMC) einer begrenzten Zahl an Passagen unterworfen.
3. Peptide
Die Peptide sind in den Domänen des Hüllglycoproteins enthalten, die vorher als kontinuierliche Epitope B enthaltend definiert wurden (G. Pancino et al., J. Virol., 1993, 67, 664–672).
Sie weisen die Sequenzen auf, die im Sequenzprotokoll entsprechend der folgenden Tabelle gezeigt werden:

SU2 SEQ ID NO: 2

SU5 SEQ ID NO: 3

TM3-19 (759–777) SEQ ID NO: 1
Die Position dieser Peptide in der Sequenz env ist in 1 dargestellt. Die Nummerierung entspricht derjenigen der Sequenz Wo (Pancino et al., Virology, 1993, 192, 659–662).
4. Immunisierung und virulente Belastung
Gruppen aus vier Katzen mit 4 1/2 Monaten werden subkutan mit 120 μg FIV-Peptid (etwa 250 μg Peptid, gebunden an KLH (keyhole limpet haemocyanin = Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin), das in Freunds vollständigem Adjuvans emulgiert ist, immunisiert.
Vier Wiederholungen werden subkutan in Freunds unvollständigem Adjuvans verabreicht, und zwar im Allgemeinen in Intervallen von 2 bis 3 Wochen, obgleich der Zeitraum zwischen den zwei letzten Injektionen 7 Wochen beträgt.
Als negative Kontrolle verwendet man vier Katzen, die dem selben Protokoll an subkutanen Injektionen nur mit Adjuvans unterworfen werden.
Die Entwicklung der Immunantwort wird regelmäßig überwacht.
Die Katzen werden einer virulenten Belastung bzw. einem Virus-Belastungstest 1 Woche nach der letzten Immunisierung durch intraperitonale Inokulation mit 10 CID₅₀ FIV-Wo-Isolat unterzogen, wobei der CID₅₀-Wert der Dosis entspricht, die geeignet ist, um 50 % der Katzen zu infizieren.
Mit dem Blut, das jede Woche entnommen wird, werden die folgenden Tests durchgeführt: Zählung der T CD4⁺-Lymphozyten, Isolierung des Virus, Bestimmung der viralen RNA im Plasma (kompetitive RT-PCR) und serologische Analysen.
Die Katzen werden 5 Wochen nach der virulenten Belastung getötet. Die lymphoiden Organe (Milz, Thymusdrüse, axillare lymphatische Ganglien) werden isoliert und in flüssigem Stickstoff für die Extraktion der RNA gefroren.
5. Serologische Analysen
Die Produktion von Antikörpern wird vor der Belastung durch einen ELISA beurteilt, wobei ein immobilisiertes Peptid (SU2, SU5, TM2 oder TM3-19) und eine Immunpräzipitation verwendet wurden. Nach der Belastung wird die Serokonversion durch einen ELISA überwacht, der immobilisierte Hüllpeptide und ein rekombinantes Capsid-Protein von FIV verwendet.
6. ELISA
Der ELISA mit den immobilisierten Hüllpeptiden, die den immogenen Domänen entsprechen, SU2 und TM2, und mit dem rekombinanten Protein p25 (Capsidprotein von FIV), das immobilisiert ist, wird durchgeführt, wie es bei A. Avraméas et al. (Res. Virol., 1993, 144, 209–218) beschrieben ist.
Mikroplatten (Immunolon II, Dynatech) werden mit 0,5 μg/Vertiefung für die Peptide und mit 0,1 μg/Vertiefung für das Protein p25 überzogen.
Die Tests werden zweifach durchgeführt, und die Resultate werden als Mittelwerte ausgedrückt.
Die Anti-Peptid-Titer vor der Belastung werden als Logarithmus des Kehrwerts der letzten Verdünnung des Serums, die eine Extinktion (405 nm) von über 0,1 liefert, ausgedrückt.
Nach der Belastung wird die Serokonversion gegen die Hüllpeptide und das Protein p25 für Serumverdünnungen von 1:25 und 1:100 beurteilt.
Die Extinktionswerte (405 nm) werden durch Subtraktion der Extinktionswerte, die durch Bindung mit einem immobilisierten Kontrollpeptid erhalten werden, korrigiert.
Die Assays werden bezüglich der Bindung eines Gemisches von Seren von FIV-infizierten Katzen mit einem Peptid, das die immundominante Domäne des Transmembranglycoproteins von FIV darstellt (TM2), normalisiert (A. Avraméas et al., Res. Virol., 1993, 144, 209–218).
7. Immunpräzipitation
Die am Tag des Versuchs (mit einer Verdünnung 1/40) gesammelten Seren werden verwendet, um die von den FL-4-abgeleiteten Hüllproteine, die metabolisch markiert sind, und einkernige feline Zellen (PBM-Zellen), die mit dem FIV-Stamm Wo infiziert wird, einer Immunpräzipitation zu unterwerfen, wie es in G. Pancino et al. (Virology, 1995, 206, 796–806) beschrieben ist.
8. Tests auf Neutralisation und Reduktion der viralen Infektivität
Die Detektion der Antikörper, die die Infektion der CrFK durch den FIV-Stamm Petaluma neutralisieren, wird wie vor her beschrieben durchgeführt (J. Richardson et al., J. Gen. Virol., 1996, 77, 759–771).
Für den Test auf Reduktion der viralen Infektivität werden Reihenverdünnungen (1/50, 1/100, 1/200, 1/400) einer Stammsuspension von Isolat Wo und eine einzelne Serumverdünnung (1/5) in vollständigem RPMI-Medium, das 50 μM 2-ME und 10 mM HEPES enthält, hergestellt.
Das Katzenserum wird mit einem gleichen Volumen der Reihenverdünnungen des Virus vermischt und in einem Endvolumen von 100 μl während 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
Die Konzentration an PBM-Zellen, die durch ein Mitogen aktiviert sind, wird auf 4·10⁶ ml in vollständigem RPMI-Medium, das 2-ME, HEPES und 200 E/ml humanes rekombinantes IL-2 enthält, eingestellt. In die Röhrchen gibt man 0,1 ml Zellsuspension (4·10⁵ Zellen).
Nach Inkubation über Nacht wird virales Inokulum gewonnen, indem man die Zellen zweimal mit 0,5 ml vollständigem RPMI-Medium wäscht.
Die Zellen werden dann in 0,2 ml Katzenserum, verdünnt in vollständigem RPMI-Medium, das 2-ME, HEPES und 100 E/ml IL-2 umfasst, wieder in Suspension gebracht, dann in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen übertragen.
Die Hälfte des Mediums wird 4 Tage nach der Infektion ersetzt.
Aliquots von 10 μl werden 7 Tage nach der Infektion für eine Analyse der inversen Transkriptase-Aktivität gewonnen.
9. Analyse der Untergruppen von Lymphozyten
Die Zählung der TCD4⁺-Lymphozyten wird in regelmäßigen Intervallen vor der Belastung, am Tag der Belastung und in regelmäßigen Intervallen während der akuten Infektion durchgeführt.
Die TCD4⁺-Lymphozyten werden durch Strömungszytometrie unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern (Clinisciences) gezählt.
10. Isolierung des Virus
Die Plasmavirämie wird durch Kultur der Zellen PBM bestimmt (D.D. Ho et al., N. Engl. J. Med., 1989, 321, 1621–1625).
Die Infektion wird durch Bestimmung des p25 durch ELISA (Petcheck IDEXX) in den Kulturüberständen bestimmt, die 14 und 21 Tage nach Inokulierung verschiedener Plasmavolumina (0,2, 2, 10, 40, 200 oder 1000 μl) erhalten worden waren. Die erste Plasmaverdünnung, die eine positive Kultur ergibt, wird als Grenzpunkt angesehen.
Die Plasmavirämie wird in TCID₅₀/ml Plasma ausgedrückt (→Dosen, die geeignet sind, 50 % der Gewebekulturen zu infizieren).
11. Herstellung der RNA
- Plasma-RNA
Das Plasma wird filtriert (0,45 μm) und die nicht an Zellen gebundene RNA wird direkt mit Hilfe des Kits Viral RNA (Qiagene) aus dem filtrierten Plasma extrahiert und in 50 μl Wasser nach Instruktionen des Herstellers eluiert, dann wird die RNA in Aliquots aufgeteilt und bei –80°C gelagert.
- Gewebe-RNA
Die gefrorenen Gewebe von Milz und Thymusdrüse werden pulverisiert und unverzüglich in dem Lysepuffer, der mit dem RNA-Extraktions-Kit geliefert wurde (RNeasy, Quiagene) mit Hilfe eines Gewebehomogenisators (Ultra-Turrax) dispergiert. Die axillaren lymphatischen Ganglien, die gefroren waren, werden direkt in Lysepuffer dispergiert; RNA wird dann unter Verwendung des RNeasy-Kits nach den Instruktionen des Herstellers extrahiert.
Die kontaminierende DNA wird durch Hydrolyse mit DNAse 1 (RQ1.RNase-freie DNase, Promega) eliminiert.
12. Kompetitive RT-PCR
Eine konservierte Region des Gens gag des FIV wird als Zielsequenz für die inverse Transkription der kompetitiven RNA und die ineinandergeschaltete PCR-Amplifikation ausgewählt.
Die Amplifikation der nativen Zielsequenz liefert ein Anfangsprodukt aus 312 Basenpaaren und ein verschachteltes Produkt aus 165 Basenpaaren, das den Nucleotiden 1059–1370 und den Nucleotiden 1157–1321 des FIH-Klons 34TF10 entspricht (R.L. Talbott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5743–5747).
- Molekulare Konstruktionen
Die Zielsequenz mit 312 Basenpaaren wird ausgehend von einem Plasmid (pKSgag), das das Gen gag des FIH-Stamms Wo enthält (G. Pancino et al., Virology, 1993, 67, 664–672), amplifiziert, indem als 5'-Primer die Sequenz SEQ ID NO: 4 (SKWoG107) verwendet wurde, welche die 5'-Sequenz der Zielmatrize und eine KpnI-Stelle umfasst, und als 3'-Primer die Sequenz SEQ ID NO: 5 (RXWoG139) verwendet wurde, die die Sequenz 3' der Zielmatrixe und eine XbaI-Stelle enthält, und unter denselben Bedingungen wie nachfolgend angegeben gearbeitet wurde, um die durch Deletion modifizierte Sequenz zu erhalten.
Das Amplifikationsprodukt wird in die Stellen, die dem Plasmid pBluescript KS+ entsprechen, subkloniert, was zu dem Plasmid pBSQCgag führt.
Um eine Matrize für die Synthese der Kompetitions-RNA herzustellen, beseitigt man 31 Nucleotide in der gag-Sequenz durch PCR.
Der 3'-Teil der nativen Sequenz wird amplifiziert, indem man einen 5'-Primer, SHΔWoG128 (SEQ ID NO: 6), komplementär zur natürlichen HindIII-Stelle (Nucleotide 1241–1246) und eine Diskontinuität von 31 Nucleotiden aufweisend, verwendet und einen 3'-Primer, RXWoG139 (SEQ ID NO: 5), der die 3'-Sequenz der Zielmatrize und eine XbaI-Stelle umfasst, verwendet, und zwar unter den folgenden Bedingungen: Die native Sequenz (10 ng pBSQCgag) wird in einem Endvolumen von 100 μg amplifiziert, das 2,5 mM MgCl₂, 200 μM dNTP, 1 x handelsüblichen Puffer und 2,5 E Taq-Polymerase (GibcoBRL) und 0,2 μM jedes Primers enthält. Die DNA wird während 3 min bei 94°C denaturiert, 30 Amplifikationszyklen unterworfen (94°C 30 s/55°C 30 s/72°C 30 s) und einer Verlängerung bei 72°C während 7 min in Gegenwart der Primer der SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 5 unterworfen.
Das Amplifikationsprodukt wird gereinigt, durch die Enzyme HindIII und XbaI verdaut und an die Stelle des Fragments, das pBSQCgag entspricht, eingesetzt, was zu dem Plasmid pBSQCΔgag führt.
- Synthese der Kompetitions-RNA
Die Kompetitions-RNA wird ausgehend vom Transkriptionsprodukt des Plasmids pBSQCΔgag, das durch XbaI linearisiert worden war, synthetisiert, wobei die T3-RNA-Polymerase verwendet wird (Promega Gemini-Kit).
Die DNA-Matrize wird mit der RQ1 Rnase-freien DNase (Promega) hydrolysiert. Die Kompetitions-RNA wird durch Absorption an Siliziumdioxid (Rneasy, Qiagene) gereinigt und durch Messung der Extinktion bei 260 nm quantitativ bestimmt. Die RNA wird in Aliquots aufgeteilt und bei –80°C gelagert.
- Kompetitive RT-PCR
Für die cDNA-Synthese werden 2,5 μl virale RNA mit 2,5 μl, die verschiedene Kopienzahlen an Kompetitions-RNA enthalten, gemischt; typischer Weise stellt man verschiedene Proben von Kompetitions-RNA ausgehend von 5 halblogarithmischen Verdünnungen, die die in der biologischen Proben geschätzten Kopienzahlen einrahmen, her.
Die RNA wird bei 65°C während 5 min denaturiert und unverzüglich auf Eis gestellt. Es werden die Reagenzien für die inverse Transkription (15 μl) zugesetzt.
Die Endreaktionsgemische enthalten 0,3 E/ml aleatorische Hexanucleotide (Sequenzen aus sechs Nucleotiden, die zufallsbedingt angeordnet sind, die theoretisch die Amplifikation jedes RNA-Fragments ermöglichen) (Pharmacia), 0,5 mM dNTP, 10 mM DTT, 1x Handelspuffer (Gibco BRL) und 100 E Superscript II (Gibco BRL) in einem Volumen von 20 μl enthalten.
Die Reaktionen werden zunächst für 10 min bei 25°C durchgeführt, um eine Hybridisierung der Primer zu begünstigen, danach werden sie bei 42°C während 50 min durchgeführt. Die inverse Transkriptase wird durch Inkubation bei 95°C für 5 min inaktiviert.
Als Vergleich werden alle RNA-Proben auch direkt durch PCR amplifiziert, um die vollständige Eliminierung der DNA, die gegebenenfalls in der biologischen Probe vorliegt, zu bestätigen.
Die in hohem Maße konservierten Sequenzen werden als Primer ausgewählt. Die komplementäre DNA wird durch ineinandergeschachtelte PCR amplifiziert, wobei verwendet werden:
als externe Primer:
SWoG107 5'-CAATATGTAGCACTTGACCCAAAAAT-3' (1059–1084; SEQ ID NO: 7) und RWoG139 5'-TCTTGCTTCTGCTTGTTGTTCTTGAG-3' (1370-1345; SEQ ID NO: 8) und
als interne Primer:
SWoG116 5'-CTCTGCAAATTTAACACCTACTGACA-3' (1157–1182; SEQ ID NO: 9) und RWoG133 5'-GCTGCAGTAAAATAGGGTAATGGTCT-3' (1321-1296; SEQ ID NO: 10)
Für die erste Amplifikation werden die PCR-Reagenzien (80 μl) im Gemisch mit 20 μl cDNA zugesetzt.
Genauer ausgedrückt, das Reaktionsgemisch enthält: 200 μM dNTP, 1,5 mM MgCl₂, 0,1 μM jedes externen Primers, 0,8x Handelspuffer (Gibco BRL) und 0,25 E Taq-Polymerase.
Die DNA wird während 3 min bei 94°C denaturiert, 28 Amplifikationszyklen (94°C 30 s/55°C 30 s/72°C 30 s) und eine Verlängerung bei 72°C während 7 min unterworfen.
Für die ineinandergeschachtelte Amplifikation werden 2 μl des Produktes der ersten Amplifikation in 98 μl Reaktionsgemisch, das 200 μM dNTP, 1,5 mM MgCl₂, 0,5 μM jedes internen Primers, 1x Handelspuffer (Gibco BRL) und 0,25 E Taq-Polymerase (Gibco BRL) enthält, transferiert.
Die DNA wird während 3 min bei 94°C denaturiert, 28 Amplifikationszyklen (94°C 30 s/52°C 30 s/72°C 30 s) und einer Verlängerung bei 72°C während 7 min unterworfen.
- Analyse
Die Amplifikationsprodukte (10 μl) werden einer Elektrophorese auf 2,75 % Agarosegel unterworfen.
Die digitalen Bilder der mit Ethidiumbromid gefärbten Gele werden mit Hilfe des Appligene-Bildgebers erhalten und die densitometrischen Analysen werden mit der Software Image NIH durchgeführt. Die Dichte des Kompetitionsproduktes wird als Funktion des Unterschiedes zwischen der Länge der nativen Sequenz und der Kompetitionssequenz eingestellt.
Der Logarithmus des Verhältnisses Dichte des Kompetitionsproduktes/Dichte des nativen Produktes wird als Funktion des Logarithmus der Kopienzahl von Kompetitions-RNA, die jeder Reaktion zugesetzt wird, gezeichnet.
Die beste Einstellung wird durch das Verfahren der kleinsten Quadrate bestimmt und die Zahl der Kopien nativer RNA entspricht dem Schnittpunkt der X-Achse (M. Piatak et al., Biotechniques, 1993, 14, 70–80).
13. Statistische Analyse
Die Fläche unter der Kurve (J. Dawson, Drug Information J., 1994, 28, 723–732) wird aus den Diagrammen, welche das Verhältnis Kopien viraler RNA/ml Plasma/Zeit darstellen, errechnet und durch Test von Mann-Whitney verglichen.
Beispiel 2: Beurteilung der humoralen Reaktion, die mit TM3-19 erhalten wird und ihre Schutzwirkungen
1. Entwicklung einer humoralen Antwort bzw. Reaktion gegen Hüllpeptide
Um den Einfluss der humoralen Immunität gegen besondere Domänen der Hüllglycoproteine während einer Primärinfektion mit FIV zu beurteilen, werden Katzen mit den Peptiden (1), die den Hülldomänen entsprechen, welche die fortlaufenden Epitope B, die während einer natürlichen Infektion erkannt werden, umfassen, immunisiert.
Alle immunisierten Katzen entwickeln mit den als Immunogene verwendeten Hüllpeptiden eine starke Antikörperreaktion, die durch ELISA bestimmt wird.
Die Resultate dieser ELISA sind in der folgenden Tabelle I zusammengefasst:
TABELLE I Antikörperantwort während der Immunisierung

a: Titer, ausgedrückt durch den Logarithmus des Kehrwerts der letzten Serumverdünnung, für die die Extinktion bei 405 nm über 0,1 liegt.
b: Immunpräzipition der Hüllglycoproteine aus FL-4-Zellen, die metabolisch markiert sind (Gruppen SU2 und SU5), oder infizierten PBM-Zellen (Gruppe TM3-19).

Am Tag des Versuchs bzw. der Belastung liegen die Titer, ausgedrückt durch den Kehrwert des Logarithmus der Serumverdünnung, zwischen 4,40 und 5,61.
Die Erkennung der Hüllglycoproteine wird durch Immunpräzipition des biosynthetisch markierten Hüllglycoproteins mit den Seren, die am Tag des Versuchs bzw. der Belastung ge sammelt wurden, bestimmt, was in Tabelle I zusammengefasst ist.
Die Seren aller mit dem Peptid SU5 immunisierten Katzen und drei der vier Katzen (324, 325 und 327), die mit dem Peptid SU2 immunisiert waren, immunpräzipitieren die Glycoproteine des Stamms Petaluma, die ausgehend von den Lysaten der Zellen FL-4, die chronisch infiziert waren, erhalten wurden.
In dem Maß, in dem das Peptid TM3-19, das sich von der Sequenz Env des FIV Wo ableitet, vier unterschiedliche Reste von 19 bezüglich der Petaluma-Sequenz umfasste, wurde die Fähigkeit der Seren zur Immunpräzipitation vor Belastung der durch das Peptid TM3-19 immunisierten Katzen gegen die Hüllglycoproteine des Stamms Wo getestet, welche aus Lysaten der PBM-Zellen nach akuter Infektion durch das FIV Wo erhalten worden waren.
Obgleich lediglich die Seren von 2 Katzen (346, 347), die mit dem Peptid TM3-19 immunisiert waren, das Hüllprotein des Stamms Wo präzipitieren, ist die Immunpräzipitation der viralen Hülle ausgehend von akut infizierten PBM-Zellen weniger wirksam als ausgehend von lymphoblastenartigen Zelllinien, die chronisch infiziert sind.
2. Aktivität der Antikörper, die gegen die Hüll eptide gerichtet sind, in einem biologischen Test
Um die Funktion der Antikörper zu ermitteln, werden die Katzenseren, die gegen das Peptid SU2 gerichtet sind, auf ihren neutralisierenden Wert gegenüber der Infektion der CrFK durch den FIV-Stamm Petaluma getestet.
Lediglich eine Katze (327), die durch das Peptid SU2 immunisiert ist, entwickelt neutralisierende Antikörper: die letzte Verdünnung, die die Infektion um wenigstens 50 % reduziert, ist 1/160.
Die Seren der Katzen, die mit den Peptiden SU5 und TM3-19 immunisiert wurden, neutralisieren das FIV Petaluma nicht (gemessen bei der Zelllinie CrFK).
Infolge der Diversität der Sequenz der Hüllglycoproteine der Stämme Petaluma und Wo und insbesondere auf dem Niveau der Domäne TM3 wurde auch die funktionelle Aktivität in einem homologen Test untersucht.
In dem Maße, in dem der Stamm Wo nicht zur Passage auf CrFK-Zellen angepasst war, wurde der Einfluss der Antikörper auf die Infektion der felinen PBMC-Zellen untersucht.
In einem Test auf Verringerung der Infektivität, der durch ein Mitogen aktivierte PBMC-Zellen verwendet, modifizieren die Seren, die gegen die Peptide SU2 und TM3-19 gerichtet sind, die Infektion durch FIV Wo nicht, obwohl neutralisierende Aktivität für eines der Seren, das gegen das Peptid SU2 gerichtet ist, beobachtet wird, wenn die Zellen CrFK als Zellsubstrat verwendet werden.
3. Isolierung des FIV nach virulenter Belastung
Nach dem Versuch bzw. der Belastung sind alle Katzen infiziert, wie es durch Isolierung des FIV in den PBM-Zellen nach Inokulation des entnommenen Plasmas 2 und 3 Wochen nach der Belastung bestimmt wurde.
4. Serokonversion nach virulenter Belastung
Nach Belastung mit dem FIV-Stamm Wo zeigt die Mehrzahl der Katzen eine humorale Antwort gegenüber den viralen Bestandteilen, wie es durch den ELISA mit den Peptiden SU2 und TM2, abgeleitet von den externen Glycoproteinen und den Transmembranglycoproteinen des rekombinanten Capsidproteins veranschaulicht wird.
Die Resultate sind in der folgenden Tabelle II dargestellt.
TABELLE II

^a Werte, erhalten durch ELISA, der mit den Hüllpeptiden SU2 und TM2 und dem rekombinanten Capsidprotein von FIV p25 für Reihenverdünnungen von 1/25 (Peptide) und 1/00 (p25) durchgeführt wurde; diese Werte werden als optische Dichte (siehe Beispiel 1) ausgedrückt;
^b Werte, nicht dargestellt für die Katzengruppe, die mit SU2 geimpft war (Seropositive vor virulenter Belastung).

Die Entwicklung einer humoralen, antiviralen Antwort ist bei drei Katzen (346, 348, 349), die mit dem Peptid TM3-19 immunisiert waren, im Vergleich zur Antwort der Kontrollkatzen schwächer und verzögert, obgleich die letzte Katze (347) dieser Gruppe eine starke und schnelle Antwort in Form von Antikörpern entwickelt hat.
Fünf Wochen nach dem Versuch bzw. der Belastung hat keine der Katzen, die mit dem Peptid TM3-19 immunisiert waren, eine nachweisbare Antikörperantwort gegenüber dem Peptid SU2 entwickelt, obgleich die Kontrollkatze detektierbare Antworten aufweisen.
Während die meisten (11/12) der Katzen, die mit den Peptiden SU2 und SU5 immunisiert worden waren, und der Katzen, die einmal Adjuvans erhalten hatten, nach 4 Wochen eine bedeutende Antwort gegen das Peptid TM2 entwickeln, weisen alle Katzen außer einer (347), die mit dem Peptid TM3-19 immunisiert waren, eine schwache oder nicht detektierbare Antwort auf.
Obgleich nach 5 Wochen alle Kontrollkatzen gut auf das Protein p25 reagieren, reagiert eine Katze (348), die mit dem Peptid TM3-19 immunisiert war, nicht und unter den drei anderen Katzen entwickeln zwei Tiere (346, 349) nur schwache Antworten.
5. Hämatologische Modifikationen während der akuten Infektion
Um den Immunisierungseffekt auf die mit einer Primärinfektion verbundene Pathologie zu beurteilen, werden die zirkulierenden CD4⁺-Lymphozyten vor und nach der Belastung mit dem FIV-Stamm Wo gezählt.
Die Zahl der CD4⁺-Lymphozyten ist in 2 dargestellt.
Obgleich die Tendenzen durch eine individuelle Heterogenität maskiert sind, zeigen die Mehrzahl der Katzen, die mit den Peptiden SU2 und SU5 immunisiert sind, sowie die Katzen, die nur das Adjuvans erhalten haben, eine progressive Verringerung der CD4⁺-Lymphozytenzahl nach der Infektion (2).
Trotz eines gewissen Schwankungsgrades zeigt die Zahl der CD4⁺-Lymphozyten bei den Katzen der Gruppe TM3-19 keine bedeutende Verringerung, wie sie bei den anderen Gruppen während der akuten Infektion beobachtet wird (2).
6. Plasmatische Viruslast, bestimmt durch RT-PCR
In dem Maße, wie man erwarten konnte, eine bedeutende Immunität durch Impfung mit nur einer Domäne der Hüllglycoproteine zu erhalten, war es notwendig, ein quantitatives Verfahren zur Beurteilung der Viruslast zu entwickeln, das die Detektion moderater Verringerungen, der viralen Disseminierung ermöglicht, die aber eine besonders wichtige Bedeutung haben.
Daher haben die Erfinder eine kompetitive RT-PCR entwickelt, die die quantitative Bestimmung der viralen RNA im Plasma und in den Geweben ermöglicht.
Dieser Assay ermöglicht die Detektion von 10 RNA-Kopien während einer Reaktion, was die untere Grenze der Detektion auf 1430 RNA-Kolonien/ml Plasma festlegt, wenn virale RNA aus 140 μl Plasma extrahiert wird.
Nach Belastung mit 10 CID₅₀ Wo-Isolat ist die virale RNA 2 Wochen nach der Infektion im Plasma durch RT-PCR detektierbar.
Bei den Katzen, die nur das Adjuvans erhalten haben, beobachtet man einen Peak der Zahl der viralen RNA-Kopien bei 3 Wochen, der bis zu 2,5 × 10⁹ Kopien pro ml Plasma erreichen kann (3).
Das Vorliegen von Antikörpern, die gegen eine Domäne gerichtet sind, von der bekannt ist, dass sie neutralisierende Antikörper SU2, induziert, vor der Belastung scheint den Verlauf der Primärinfektion nicht zu modifizieren.
Unter den Katzen, die mit dem Peptid SU5 immunisiert wurden, folgt die akute Infektion von drei Katzen einer ähnlichen Kinetik wie die der Kontrollkatzen, obgleich die Infektion bei einer der Katzen verzögert auftritt.
Der Verlauf der Infektion bei den Katzen, die mit dem Peptid TM3-19 immunisiert wurden, unterscheidet sich im Allgemeinen von dem, der bei den Kontrollkatzen beobachtet wird.
Obgleich die Infektion bei einer der Katzen (347) schnell auftritt, tritt die Infektion bei den drei anderen Katzen dieser Gruppe verzögert auf.
Außerdem war es nicht möglich, eine plasmatische Virämie bei einer der Katzen (348) während des Messzeitraums zu detektieren.
Die Zahl der Kopien viraler RNA, die bei den mit dem Peptid TM3-19 immunisierten Katzen beobachtet wird, übersteigt niemals 3,1 × 10⁶ Kopien pro ml, was eine deutliche Verringerung im Vergleich zu der in der Gruppe der Kontrollkatzen beobachteten Virämie anzeigt.
Diese Werte wurden analysiert und mit der vereinigten Fläche unter der Kurve (J.D. Dawson, Drug Information J., 1994, 28, 723–732) für 3 und 4 Wochen nach der Belastung verglichen.
Nach dem Test von Mann-Whitney ist die Verringerung der Viruslast, die bei den mit dem Peptid TM3-19 immunisierten Katzen im Vergleich zu den Kontrollkatzen beobachtet wird, sowohl nach 3 wie auch nach 4 Wochen signifikant (p=0,02).
7. Plasmatische Virämie
Für die Katzen, die mit dem Peptid TM3-19 immunisiert wurden, und die Kontrollkatzen wird die plasmatische Viruslast 3 Wochen nach der Belastung durch Virusisolat beurteilt.
Die Zahl der Kopien viraler RNA, bestimmt durch kompetitive RT-PCR, wird mit der plasmatischen Virämie, bestimmt durch Kultur der PBM-Zellen, verglichen.
Die Resultate sind in der folgenden Tabelle III angegeben.
TABELLE III

^α: Die plasmatische Virämie wird durch kompetitive RT-PCR gemessen und als Zahl der Kopien viraler RNA/ml Plasma ausgedrückt.
^β: Die plasmatische Virämie wird durch Kultur der PBM-Zellen gemessen und in TCID₅₀/ml Plasma ausgedrückt.

Die Immunisierung mit dem Peptid TM3-19 vor der virulenten Belastung zieht eine deutliche Verringerung (etwa 3 logs) des infektiösen Viruswertes im Plasma von 3/4 der Katzen sehr früh im Verlauf der Primärinfektion mit sich.
Diese Werte bestätigen, dass die reduzierten Werte für virale RNA, die für die Katzen, die mit dem Peptid TM3-19 immunisiert wurden, im Vergleich zu denen, die mit den Kontrollkatzen erhalten werden, gut die Verringerung des plasmatischen Titers des infektiösen Virus widerspiegeln.
8. Viruslast in den Geweben, bestimmt durch kompetitive RT-PCR
Die Viruslast in den Geweben wird 5 Wochen nach der Belastung durch Zählung der Zahl der Kopien viraler RNA in den lymphatischen axillaren Ganglien und der Thymusdrüse durch kompetitive RT-PCR beurteilt.
In dem Maß, wie das amplifizierte Fragment (Amplicon) im Intron der subgenomischen viralen RNA lokalisiert ist, stellen die gezählten Kopien viraler RNA vollständige Transkripte, entweder intrazelluläre oder in den viralen Partikeln verkapselte extrazelluläre, dar.
Die virale RNA wird in allen untersuchten Geweben und bei allen Katzen detektiert (4).
Die Werte für virale RNA in den axillaren lymphatischen Ganglien sind bei drei Katzen (346, 348 und 349), die mit dem Peptid TM3-19 immunisiert wurden, schwächer als bei den Katzen, die mit den Peptiden SU2 und SU5 immunisiert wurden, und bei den Kontrollkatzen.
Der Wert für virale RNA in der Milz ist bei einer Katze (348), die mit dem Peptid TM3-19 immunisiert worden war, besonders schwach.
Dagegen ist die Virusbelastung in der Thymusdrüse in den vier Virusgruppen ähnlich und ist im Allgemeinen höher als in den anderen untersuchten Geweben.
Eine erhöhte Viruslast in der Thymusdrüse wurde auch in einer frühreifen Phase der Infektion durch in situ- Hybridisierung beobachtet (A.M. Beebe et al., J. Virol., 1994, 68, 3080–3091).
Es ist nicht möglich, zu wissen, ob die stärker auftretende Infektion der Thymusdrüse (i) ihren Reichtum an Zellen, die vorzugsweise zu Beginn der Infektion infiziert werden, (ii) eine wichtige Fähigkeit, virale Partikel einzufangen, oder (iii) die sequenzielle Natur der Kolonisation (Gewebe, untersucht vor Ausbrechen der akuten Infektion) widerspiegelt.
Diese Resultate zeigen, dass die Immunisierung mit zwei Peptiden, die sich vom Oberflächenglycoprotein ableiten (SU2 und SU5), den Verlauf der Infektion nicht modifiziert, die Immunisierung mit dem Peptid TM3-19, das aus der proximalen, membranären, extrazellulären Domäne des Transmembranglycoproteins abgeleitet ist, die virale Disseminierung in signifikanter Weise verzögert.
Diese Resultate zeigen auch, dass die Induktion von Antikörpern, die die virale Infektion in vitro neutralisieren, nicht unbedingt eine gute Korrelation mit dem gesuchten immunitären Schutz darstellen.
Die Korrelation neutralisierender Aktivität/Schutz ist problematisch, insbesondere in dem Maße, wie die gemessene Aktivität von den Bedingungen des eingesetzten Assays und insbesondere von dem zur Messung der Rest-Infektivität verwendeten Zellsubstrat abhängt.
In der Tat unterscheidet sich die Neutralisation der lentiviralen primären Isolate grundsätzlich von der Neutralisa tion des Virus, das an einer Vermehrung in Zellkultur angepasst ist.
Die Resultate, die mit den Peptiden gemäß der Erfindung erhalten werden, zeigen auch, dass sie die Infektion in deutlicher Weise verzögern.
Aus dem Vorstehenden geht hervor, dass sich die Erfindung keineswegs auf die Durchführungsformen, die Ausführung und die Anwendung, die explizit beschrieben wurden, beschränkt; sie umfasst im Gegenteil alle Varianten, die dem Fachmann einfallen, ohne den Rahmen und den Umfang der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung des Peptids der SEQ ID NO:1 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder die Prävention von Infektionen mit FIV.
Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es durch SEQ ID NO:1 definiert ist.
Immunprotektive Zusammensetzung gegen eine Infektion mit FIV, dadurch gekennzeichnet, dass sie im Wesentlichen aus wenigstens dem Peptid der SEQ ID NO:1 nach Anspruch 1 und wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 3 zur Verwendung in der Prävention von Infektionen mit FIV.
Zusammensetzung nach Anspruch 3 zur Verwendung in der Behandlung von Infektionen mit FIV.