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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Abzielen
der Integration einer gewünschten
exogenen DNA auf eine spezifische Stelle innerhalb des Genoms einer
Säugetierzelle.
Genauer gesagt beschreibt die Erfindung ein neuartiges Verfahren
zum Identifizieren einer transcriptionsaktiven Zielstelle („Hot Spot") im Säugetiergenom
und zum Einfügen
einer gewünschten
DNA an dieser Stelle durch homologe Rekombination. Die Erfindung
stellt gegebenenfalls auch die Fähigkeit
zur Genamplifikation der gewünschten
DNA an dieser Stelle durch Kointegration eines amplifizierbaren
auswählbaren
Markers, z.B. DHFR, in Kombination mit der exogenen DNA bereit.
Die Erfindung beschreibt außerdem
die Konstruktion neuartiger Vektoren, die zum Erzielen des Obigen
geeignet sind, und stellt weiters durch solche Verfahren produzierte
Säugetierzelllinien
bereit, die eine gewünschte,
an einem Ziel-Hot-Spot integrierte, exogene DNA enthalten.
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Hintergrund
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Die
Technologie zum Exprimieren rekombinanter Proteine sowohl in Prokaryontenals
auch in Eukaryontenorganismen ist gut etabliert. Säugetierzellen
bieten gegenüber
Bakterien oder Hefe erhebliche Vorteile hinsichtlich der Proteinproduktion,
welche von deren Fähigkeit
zum korrekten Zusammensetzen, Glykosylieren und posttranslationellen
Modifizieren rekombinant exprimierter Proteine herrühren. Nach
einer Transfektion in die Wirtszellen können rekombinante Expressionskonstrukte
als extrachromosomale Elemente bewahrt oder in das Wirtszellgenom
integriert werden. Die Erzeugung stabil transfizierter Säugetierzelllinien
bedingt üblicherweise
letzteres; ein DNA-Konstrukt, welches ein Gen, das von Interesse
ist, zusammen mit einem Arzneimittelresistenzgen (einem dominanten
auswählbaren
Marken) codiert, wird in die Wirtszelle eingebracht, und das nachfolgende
Wachstum in Gegenwart des Arzneimittels ermöglicht die Auswahl von Zellen,
welche die exogene DNA erfolgreich integriert haben. In vielen Fällen ist
das Gen, das von Interesse ist, mit einem arzneimittelresistenten
auswählbaren
Marker gekoppelt, welcher in späterer
Folge einer Genamplifikation unterzogen werden kann. Das Gen, welches
Dihydrofolatreduktase (DHFR) codiert, wird am häufigsten für diesen Zweck verwendet. Das
Wachstum von Zellen in Gegenwart von Methotrexat, einem kompetitiven
Inhibitor von DHFR, führt
zu einer gesteigerten DHFR-Produktion durch Amplifikation des DHFR-Gens.
Da flankierende DNA-Bereiche ebenfalls amplifiziert werden, kann
die resultierende Koamplifikation eines DHFR-gekoppelten Gens in
der transfizierten Zelllinie zu einer gesteigerten Proteinproduktion
führen
und dadurch zu einer hochgradigen Expression des Gens, das von Interesse
ist, führen.
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Obgleich
sich dieser Ansatz als erfolgreich erwies, kommt es bei dem System
auf und der zufälligen Natur
des Integrationsvorgangs zu einer Reihe von Problemen. Diese Probleme
existieren, da die Expressionsstärken
von den Auswirkungen der lokalen genetischen Umgebung am Genlocus
stark beeinflusst werden, ein Phänomen,
das in der Literatur gut dokumentiert ist und im Allgemeinen als „Positionseffekte" bezeichnet wird
(siehe z.B. Al-Shawi et al, Mol. Cell. Biol., 10:1192-1198 (1990);
Yoshimura et al, Mol. Cell. Biol., 7:1296-1299 (1987)). Da sich
die große
Mehrheit der Säugetier-DNA
in einem transcriptionell inaktiven Zustand befindet, bieten Verfahren
zur zufälligen
Integration keine Kontrolle über
das transcriptionelle Schicksal der integrierten DNA. Folglich können abhängig von
der Integrationsstelle bei der Expressionsstärke von integrierten Genen
weite Variationen auftreten. Die Integration von exogener DNA in
inaktive oder transcriptionell „stumme" Bereiche des Genoms führt beispielsweise
zu einer geringen oder zu keiner Expression. Im Gegensatz dazu kann
die Integration in eine transcriptionsaktive Stelle zu einer starken
Expression führen.
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Wenn
das Ziel der Arbeit im Erhalten einer hohen Genexpressionsstärke besteht,
was typischerweise das bei Gentechnikverfahren gewünschte Ergebnis
ist, so ist es daher im Allgemeinen notwendig, große Zahlen
von Transfektanten zu screenen, um einen derart hoch produzierenden
Klon zu finden.
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Außerdem kann
eine zufällige
Integration von exogener DNA in das Genom in manchen Fällen wichtige
zelluläre
Gene zerstören,
was zu einem geänderten
Phänotyp
führt.
Diese Faktoren können
die Erzeugung hoch exprimierender, stabiler Säugetierzelllinien zu einem
komplizierten und mühseligen
Vorgang machen.
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„DNA-Vektoren,
die translational geschädigte,
dominante auswählbare
Marker enthalten, können
bei der Expression von Säugetiergenen
verwendet werden, wie beispielsweise im U.S.-Patent Nr. 5,648,267
beschrieben."
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Diese
Vektoren enthalten als dominanten auswählbaren Marker ein translational
geschädigtes
Neomycin-Phosphotransferase (Neo)-Gen, das künstlich so konstruiert wurde,
um ein Intron zu enthalten, in welches ein DHFR-Gen zusammen mit
einem Gen oder Genen, das bzw. die von Interesse ist bzw. sind,
eingebracht wird. Es zeigte sich, dass die Verwendung dieser Vektoren
als Expressionskonstrukte die Gesamtzahl der produzierten arzneimittelresistenten
Kolonien erheblich senkte, wodurch der Screening-Vorgang in Bezug auf
herkömmliche
Säugetier-Expressionsvektoren
erleichtert wurde. Weiters besteht ein erheblicher Prozentanteil
der unter Verwendung dieses Systems erhaltenen Klone in hoch exprimierenden
Klonen. Diese Ergebnisse können
offensichtlich den am auswählbaren
Neo-Marker durchgeführten Modifikationen
zugeschrieben werden. Aufgrund der translationalen Schädigung des
Neo-Gens produzieren transfizierte Zellen nicht genügend Neo-Protein,
um eine Arzneimittelselektion zu überstehen, wodurch die Gesamtzahl
der arzneimittel resistenten Kolonien gesenkt wird. Außerdem enthält ein höherer Prozentanteil
der überlebenden
Klone den Expressionsvektor integriert an Stellen im Genom, wo die
basalen Transcriptionsstärken
hoch sind, was zu einer Überproduktion
von Neo führt,
wodurch ermöglicht
wird, dass die Zellen die Schädigung
des Neo-Gens überwinden.
Gleichzeitig sind die Gene von Interesse, die mit Neo gekoppelt
sind, Gegenstand ähnlicher
erhöhter Transcriptionsstärken. Derselbe
Vorteil ergibt sich auch infolge des innerhalb von Neo geschaffenen,
künstlichen
Introns; das Überleben
hängt von
der Synthese eines funktionellen Neo-Gens ab, welches wiederum von einem
korrekten und effizienten Spleißen
der Neo-Introne
abhängt. Überdies
werden diese Kriterien mit größerer Wahrscheinlichkeit
erfüllt,
wenn sich die Vektor-DNA in einem Bereich integriert hat, der bereits
höchst transcriptionsaktiv
ist.
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Nach
der Integration des Vektors in einen transcriptionsaktiven Bereich
wird die Genamplifikation durch Selektion hinsichtlich des DHFR-Gens
durchgeführt.
Bei Verwendung dieses Systems war es möglich, Klone zu erhalten, die
unter Verwendung niedriger Spiegel von Methotrexat (50 nM) ausgewählt wurden,
welches wenige (<10)
Kopien des Vektors enthielt, die hohe Proteinspiegel (>55pg/Zelle/Tag) absondern.
Dies kann zudem in einem relativ kurzen Zeitraum erzielt werden.
Der Erfolg einer Amplifikation ist jedoch variabel. Manche transcriptionsaktiven
Stellen können
nicht amplifiziert werden, und daher sind Frequenz und Ausmaß einer
Amplifikation von einer bestimmten Stelle nicht vorhersehbar.
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Insgesamt
stellt die Verwendung dieser translational geschädigten Vektoren eine erhebliche
Verbesserung gegenüber
anderen Verfahren zur zufälligen
Integration dar. Wie besprochen, bleibt das Problem einer fehlenden
Kontrolle über
die Integrationsstelle jedoch ein wichtiges Anliegen.
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Ein
Ansatz zur Überwindung
der Probleme einer zufälligen
Integration besteht im Gene-Targeting, wobei die exogene DNA zu
einem spezifischen Locus innerhalb des Wirtsgenoms geleitet wird.
Die exogene DNA wird durch eine homologe Rekombination eingebracht,
welche zwischen DNA-Sequenzen im Expressionsvektor und der entsprechenden
homologen Sequenz im Genom auftritt. Während diese Art der Rekombination
bei Hefe und anderen Pilzorganismen mit großer Häufigkeit natürlich auftritt,
ist sie bei höheren
Eukaryontenorganismen jedoch ein äußerst seltenes Ereignis. Es
wird berichtet, dass die Häufigkeit
einer homologen Rekombination verglichen mit einer nicht homologen
Rekombination (zufälligen
Integration) bei Säugetierzellen
von 1/100 bis 115000 reicht (siehe z.B, Capecchi, Science, 24:1288-1292
(1989); Morrow und Kucherlapati, Curr. Op. Biotech., 4:77-582 (1993)).
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Einer
der frühesten
Berichte, die eine homologe Rekombination in Säugetierzellen beschreiben,
umfasste ein in Maus-Fibroblasten geschaffenes künstliches System (Thomas et al,
Cell, 44:419-428 (1986)). Eine Zelllinie, die eine mutierte, nicht
funktionelle Version des im Wirtsgenom integrierten Neo-Gens enthielt, wurde
geschaffen, und anschließend
wurde mit einer zweiten, nicht funktionellen Kopie von Neo, die
eine andere Mutation enthielt, auf sie abgezielt. Eine Rekonstruktion
eines funktionellen Neo-Gens konnte nur durch Gene-Targeting erfolgen.
Homologe Rekombinanten wurden durch Selektion hinsichtlich G418-resistenter Zellen
identifiziert und durch eine Analyse der aus den resistenten Klonen
isolierten, genomischen DNA bestätigt.
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Jüngst wurde über die
Anwendung einer homologen Rekombination zum Austauschen der schweren und
leichten Immunglobulin-Gene an endogenen Loci in Antikörperabsondernden
Zellen berichtet. (LT.S.-Patent Nr. 5,202,238, Fell et al, (1993).)
Dieser besondere Ansatz ist jedoch nichtumfassend anwendbar, da
er sich auf die Produktion von Immunglobulinen in Zellen beschränkt, z.B.
B-Zellen und Myelomzellen, die Immunglobuline endogen exprimieren.
Die Expression ist auch auf Einzelkopie-Genstärken beschränkt, da eine Koamplifikation
nach der homologen Rekombination nicht inkludiert ist. Das Verfahren
wird weiters durch die Tatsache erschwert, dass zur Produktion eines
funktionellen Immunglobulins zwei separate Integrationsvorgänge erforderlich
sind: einer für
das Leichtketten-Gen, gefolgt von einem für das Schwerketten-Gen.
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Über ein
zusätzliches
Beispiel für
ein derartiges System wurde bei NS/0-Zellen berichtet, wo rekombinante
Immunglobuline durch eine homologe Rekombination in den Immunglobulin-Gamma-2A-Locus
exprimiert werden (Hollis et al, internationale Patentanmeldung
# PCT/IB95 (00014).) Die aus dieser Stelle erhaltenen Expressionsstärken waren
extrem hoch – in
der Größenordnung
von 20pg/Zelle/Tag aus einem Einzelkopie-Integranten. Wie beim obenstehenden
Beispiel beschränkt
sich die Expression jedoch auf diese Stärke, da in diesem System kein
amplifizierbares Gen kointegriert ist. Andere Forscher berichteten
ebenfalls über
eine abweichende Glykosylierung rekombinanter Proteine, die in NS/0-Zellen
exprimiert wurden (siehe z.B. Flesher et al, Biotech. and Bioeng.,
48:399-407 (1995)), wodurch die Anwendbarkeit dieses Ansatzes eingeschränkt wurde.
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Das
cre-loxP-Rekombinationssystem vom Bakteriophagen P1 wurde kürzlich adaptiert
und als Mittel zum Gene-Targeting in Eukaryontenzellen verwendet.
Insbesondere würde
die sequenzspezifische Integration exogener DNA in das Eierstock
(CHO)-Zellgenom des chinesischen Hamsters unter Verwendung von Cre-Rekombinase
und einer Reihe Loxhaltiger Vektoren beschrieben. (Fukushige und
Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:7905-7909 (1992).) Dieses System ist attraktiv,
da es für
eine reproduzierbare Expression am selben chromosomalen Ort sorgt.
Es wurde jedoch keine Anstrengung unternommen, einen Chromosomenort
zu identifizieren, aus dem eine Genexpression optimal ist, und wie
beim obenstehenden Beispiel beschränkt sich die Expression auf
Einzelkopie-Grade in diesem System. Es wird auch durch die Tatsache
erschwert, dass für die
Expression eines funktionellen Rekombinase-Enzyms in der Säugetierzelle
gesorgt werden muss.
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Ebenso
wurde berichtet, dass die Anwendung einer homologen Rekombination
zwischen einer eingebrachten DNA-Sequenz und deren endogenem chromosomalem
Locus ein nützliches
Mittel für
die genetische Manipulation in Säugetierzellen
sowie in Hefezellen liefert. (Siehe z.B. Bradley et al, Meth. Enzymol., 223:855-879
(1993); Capecchi, Science, 244:1288-1292 (1989); Rothstein et al,
Meth. Enzymol., 194:281-301 (1991)). Bisher waren die meisten Studien
zum Säugetiergen-Targeting
auf die Genunterbrechung („Knockout") oder die sequenzspezifische
Mutagenese von ausgewählten
Zielgenloci in embryonalen Maus-Stamm (ES)-Zellen gerichtet. Die
Schaffung dieser „Knockout"-Mausmodelle ermöglichte
es den Wissenschaftlern, spezifische Fragen zu Struktur und Funktion
zu untersuchen und die biologische Bedeutung einer großen Zahl von
Mausgenen zu untersuchen. Dieses Forschungsgebiet hat auch wichtige
Implikationen hinsichtlich möglicher
Anwendungen in der Gentherapie.
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Vor
kurzem berichtete Celltech (Kent, Großbritannien) auch über Vektoren,
die angeblich auf transcriptionsaktive Stellen in NSO-Zellen, die
keine Genamplifikation erfordern, abgezielt sind (Peakman et al,
Hum. Antibod. Hybridomas, 5:65-74 (1994)). Es wurde jedoch nicht
berichtet, dass die Pegel der Immunglobulin-Ausscheidung in diesen
nicht amplifizierten Zellen 20pg/Zelle/Tag überschreiten, während in
amplifizierten CHO-Zellen
so hohe Pegel wie 100pg/Zelle/Tag erreicht werden können (Id.).
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Es
wäre höchst wünschenswert,
ein Gene-Targeting-System zu entwickeln, welches in reproduzierbarer
Weise für
die Integration exogener DNA an einer als transcriptionsaktiv bekannten,
vorbestimmten Stelle im Genom sorgt. Es wäre ebenfalls wünschenswert,
wenn ein solches Gene-Targeting-System weiters die Koamplifikation
der eingebrachten DNA nach der Integration ermöglichen würde. Das Design eines solchen
Systems würde
die reproduzierbare und hochgradige Expression jedes geklonten Gens,
das von Interesse ist, in einer Säugetierzelle ermöglichen
und wäre
zweifellos für
viele Forscher von beträchtlichem
Interesse.
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In
dieser Anmeldung stellen wir ein neuartiges Säugetier-Expressionssystem bereit,
das auf einer homologen Rekombination basiert, welche zwischen zwei
künstlichen
Substraten auftritt, die in zwei verschiedenen Vektoren enthalten
sind. Bei diesem System wird insbesondere eine Kombination von zwei
neuartigen Säugetier-Expressionsvektoren,
die als „Markierungs"-Vektor und „Targeting"-Vektor bezeichnet
werden, verwendet.
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Der
Markierungsvektor ermöglicht
im Wesentlichen die Identifikation und Markierung einer Stelle im Säugetiergenom,
die transcriptionsaktiv ist, d.h., einer Stelle, an der die Genexpressionsstärken hoch
sind. Diese Stelle kann als ein „Hot Spot" im Genom betrachtet werden. Nach der
Integration des Markierungsvektors ermöglicht das gegen ständliche
Expressionssystem die Integration einer anderen DNA an dieser Stelle, d.h.,
des Targeting-Vektors, und zwar mittels einer homologen Rekombination,
die zwischen DNA-Sequenzen auftritt,
welche beiden Vektoren gemeinsam sind. Dieses System bietet beträchtliche
Vorteile im Vergleich zu anderen homologen Rekombinationssystemen.
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Im
Gegensatz zu den meisten anderen homologen Systemen, die bei Säugetierzellen
zur Anwendung kommen, weist dieses System keinen Hintergrund auf.
Daher überleben
Zellen, die nur eine zufallige Integration des Vektors durchgemacht
haben, die Selektion nicht. Somit wird jedes Gen, das von Interesse
ist und in das Targeting-Plasmid kloniert wurde, in hohen Stärken aus
dem markierten Hot Spot exprimiert. Demgemäß beseitigt das gegenständliche
Verfahren einer Genexpression im Wesentlichen oder vollständig die
obenstehend im Detail besprochenen Probleme, die Systemen einer
zufälligen
Integration anhaften. Überdies
sorgt dieses System für
eine reproduzierbare und hochgradige Expression von jedwedem rekombinantem
Protein an derselben transcriptionsaktiven Stelle im Säugetiergenom.
Außerdem
kann an dieser bestimmten transcriptionsaktiven Stelle eine Genamplifikation
bewirkt werden, indem als Teil des Markierungsvektors ein amplifizierbarer
dominanter auswählbarer
Marker (z.B. DHFR) inkludiert wird.
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Aufgaben der Erfindung
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Eine
Aufgabe der Erfindung besteht somit in der Bereitstellung eines
verbesserten Verfahrens zum Abzielen einer gewünschten DNA auf eine spezifische
Stelle in einer Säugetierzelle.
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Eine
noch spezifischere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines neuartigen Verfahrens zum Abzielen einer gewünschten
DNA auf eine spezifische Stelle in einer Säugetierzelle durch homologe Rekombination.
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Eine
weitere spezifische Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung
neuartiger Vektoren für das
Erzielen einer sequenzspezifischen Integration einer gewünschten
DNA in einer Säugetierzelle.
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Wiederum
eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung
neuartiger Säugetierzelllinien,
welche eine gewünschte
DNA enthalten, die an einer vorbestimmten Stelle, die für eine hohe
Expression sorgt, integriert ist.
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Eine
noch spezifischere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines neuartigen Verfahrens zum Erzielen einer sequenzspezifischen
Integration einer gewünschten
DNA in einer Eierstock (CHO)-Zelle des chinesischen Hamsters.
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Eine
weitere, noch spezifischere Aufgabe der Erfindung besteht in der
Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens zum Integrieren von Immunglobulin-Genen
oder irgendwelchen anderen Genen in Säugetierzellen an vorbestimmten
Chromosomenstellen, die für
eine hohe Expression sorgen.
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Eine
weitere spezifische Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung
neuartiger Vektoren und Vektorkombinationen, die zum Integrieren
von Immunglobulin-Genen
in Säugetierzellen
an vorbestimmten Stellen, die für
eine hohe Expression sorgen, geeignet sind.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von
Säugetierzelllinien,
welche Immunglobulin-Gene enthalten, die an vorbestimmten Stellen,
die für
eine hohe Expression sorgen, integriert sind.
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Eine
sogar noch spezifischere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines neuartigen Verfahrens zum Integrieren von Immunglobulin-Genen
in CHO-Zellen, die für
eine hohe Expression sorgen, sowie von neuartigen Vektoren und Vektorkombinationen,
welche für
eine solche Integration von Immunglobulin-Genen in CHO-Zellen sorgen.
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Außerdem besteht
eine spezifische Aufgabe der Erfindung in der Bereitstellung neuartiger
CHO-Zelllinien, welche Immunglobulin-Gene enthalten, die an vorbestimmten
Stellen, die für
eine hohe Expression sorgen, integriert sind und durch eine Methotrexat-Selektion amplifiziert
wurden, um sogar noch größere Mengen von
funktionellen Immunglobulinen auszuscheiden.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1 stellt die Abbildung eines erfindungsgemäßen, als
Desmond bezeichneten, markierenden Plasmids dar. Das Plasmid wird
in Kreisform (1a) sowie als linearisierte Version, die für eine Transfektion
verwendet wird (1b), gezeigt.
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2(a) zeigt die Abbildung eines als „Molly" bezeichneten Targeting-Plasmids.
Hier wird gezeigt, wie Molly die anti-CD20-Immunglobulin-Gene codiert,
deren Expression in Beispiel 1 beschrieben wird.
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2(b) zeigt eine linearisierte Version
von Molly nach einem Aufschluss mit den Restriktionsenzymen Kpn1
und Pac1. Diese linearisierte Form wurde zur Transfektion verwendet.
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3 stellt
die potentielle Ausrichtung zwischen im CHO-Genom integrierten Desmond-Sequenzen und
ankommenden Molly-Targeting-Sequenzen dar. Eine mögliche Anordnung
von Molly, das nach einer homologen Rekombination in Desmond integriert
ist, wird ebenfalls dargelegt.
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4 zeigte
eine Southern-Analyse von Einzelkopie-Desmond-Klonen. Die Proben
sind wie folgt:
- Bahn 1: λHindIII-DNA-Größenmarker
- Bahn 2: Desmond-Klon 10F3
- Bahn 3: Desmond-Klon 10C12
- Bahn 4: Desmond-Klon 15C9
- Bahn 5: Desmond-Klon 14B5
- Bahn 6: Desmond-Klon 9B2
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5 zeigt
eine Northern-Analyse von Einzelkopie-Desmond-Klonen. Die Proben
sind wie folgt: Feld A: Northern-untersucht mit CAD- und DHFR-Sonden,
so wie in der Figur angegeben. Feld B: zweites Northern, mit CAD-
und HisD-Sonden untersucht, so wie angegeben. Die in die Felder
A und B geladenen RNA-Proben sind wie folgt:
Bahn 1: Klon 9B2,
Bahn 2; Klon 10C12, Bahn 3; Klon 14B5, Bahn 4; Klon 15C9, Bahn 5;
Kontroll-RNA aus CHO, transfiziert mit einem HisD- und DHFR-haltigen
Plasmid, Bahn 6; nicht transfiziertes CHO.
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6 zeigt
eine Southern-Analyse von Klonen, die sich aus der homologen Integration
von Molly in Desmond ergeben. Die Proben sind wie folgt:
Bahn
1: λHindIII-DNA-Größenmarker,
Bahn 2: 20F4, Bahn 3; 5F9, Bahn 4; 21C7, Bahn 5; 24G2, Bahn 6; 25E1, Bahn
7; 28C9, Bahn 8; 29F9, Bahn 9; 39G11, Bahn 10; 42F9, Bahn 11; 50G10,
Bahn 12; Molly-Plasmid-DNA, mit Bg1II(oberes Band) linearisiert
und mit BgIII und KpnI (unteres Band) abgeschnitten, Bahn 13; nicht
transfiziertes Desmond.
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Die 7A bis 7G enthalten
die Sequenzauflistung für
Desmond.
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Die 8A bis 8I enthalten
die Sequenzauflistung für
Molly-haltiges anti-CD20.
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9 enthält die Abbildung
des Targeting Plasmids, „Mandy", das hier gezeigt
wird, wie es anti-CD23-Gene codiert, deren Expression in Beispiel
5 geoffenbart ist.
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Die 10A bis 10N enthalten
die Sequenzauflistung von „Mandy"; das die in Beispiel
5 geoffenbarten anti-CD23-Gene enthält.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
Erfindung stellt ein neuartiges Verfahren zum Integrieren einer
gewünschten
exogenen DNA an einer Zielstelle innerhalb des Genoms einer Säugetierzelle
durch homologe Rekombination bereit. Die Erfindung stellt ebenso
neuartige Vektoren zum Erzielen der sequenzspezifischen Integration
einer DNA an einer Zielstelle im Genom einer Säugetierzelle bereit.
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Genauer
gesagt sorgt das gegenständliche
Klonierungsverfahren für
eine sequenzspezifische Integration einer gewünschten DNA in einer Säugetierzelle
durch Transfektion einer solchen Zelle mit einem „Markerplasmid", das eine einzigartige
Sequenz enthält,
welche dem Säugetierzellgenom
fremd ist und ein Substrat für
eine homologe Rekombination bereitstellt, gefolgt von einer Transfektion
mit einem „Zielplasmid", das eine Sequenz
enthält,
welche für
eine homologe Rekombination mit der im Markerplasmid enthaltenen,
einzigartigen Sequenz sorgt, und weiters eine gewünschte DNA
umfasst, welche in die Säugetierzelle
zu integrieren ist. Die integrierte DNA codiert typischerweise ein
Protein, das von Interesse ist, wie z.B. ein Immunglobulin oder ein
anderes abgesondertes Säugetierglykoprotein.
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Bei
dem als Beispiel gezeigten, homologen Rekombinationssystem wird
das Neomycin-Phosphotransferase-Gen als dominanter auswählbarer
Marker verwendet. Dieser bestimmte Marker wurde basierend auf den
folgenden, zuvor veröffentlichten
Beobachtungen verwendet;
- (i) die nachgewiesene
Fähigkeit,
auf eine mutierte Version des Neo-Gens abzuzielen und ihre Funktion
wiederherzustellen (zuvor angeführt),
und
- (ii) unsere Entwicklung translational geschädigter Expressionsvektoren,
in denen das Neo-Gen als zwei Exone mit einem Gen, das von Interesse
und im dazwischenliegenden Intron eingefügt ist, künstlich geschaffen wurde; Neo-Exone
werden korrekt gespleißt
und in vivo translatiert, wobei ein funktionelles Protein produziert
und dadurch auf die resultierende Ziellpopulation eine G418-Resistenz übertragen
wird. Bei dieser Anwendung wird das Neo-Gen in drei Exone aufgespalten. Das
dritte Exon von Neo ist am „Marker"-Plasmid vorhanden
und wird nach einer Integration des Markerplasmids in die Säugetierzellen
in das Wirtszellgenom integriert. Die Exone 1 und 2 sind am Targeting-Plasmid
vorhanden und werden durch ein dazwischenliegendes Intron getrennt,
in welches zumindest ein Gen, das von Interesse ist, kloniert wird. Eine
homologe Rekombination des Targeting-Vektors mit dem integrierten
Markierungsvektor führt
zu einem korrekten Spleißen
aller drei Exone des Neo-Gens und dadurch zu einer Expression eines
funktionellen Neo-Proteins (wie durch eine Selektion hinsichtlich
G418-resistenter Kolonien bestimmt). Vor dem Entwickeln des aktuellen
Expressionssystems untersuchten wir im Experiment die Funktionalität eines
solchen dreifach gespleißten
Neo-Konstrukts in Säugetierzellen.
Die Ergebnisse dieses Kontrollversuchs zeigten, dass alle drei Neo-Exone
richtig gespleißt
waren, und wiesen daher auf die Durchführbarkeit der gegenständlichen
Erfindung hin.
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Obgleich
die vorliegende Erfindung unter Verwendung des Neo-Gens und noch
genauer eines dreifach gespaltenen Neo-Gens beispielhaft dargestellt
ist, sollte die allgemeine Methodik allerdings auch bei anderen
dominanten auswählbaren
Markern wirksam sein.
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Wie
detaillierter untenstehend besprochen, bietet die vorliegende Erfindung
zahlreiche Vorteile gegenüber
herkömmlichen
Genexpressionsverfahren, einschließlich sowohl einer zufälligen Integration
als auch von Gene-Targeting-Verfahren. Im Speziellen stellt die
gegenständliche
Erfindung ein Verfahren bereit, welches in reproduzierbarer Weise
eine sequenzspezifische Integration einer gewünschten DNA in einer transcriptionsaktiven
Domäne
einer Säugetierzelle
ermöglicht.
Da das gegenständliche
Verfahren überdies
einen künstlichen „Homologie"-Bereich einführt, der
als einzigartiges Substrat für
eine homologe Rekombination und das Einfügen einer gewünschten
DNA wirkt, erfordert es die Wirksam keit der gegenständlichen
Erfindung nicht, dass die Zelle eine spezifische DNA endogen enthält oder
exprimiert. Somit ist das Verfahren auf alle Säugetierzellen unspezifisch
anwendbar und kann zur Expression jeder Art von rekombinantem Protein
verwendet werden.
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Die
Verwendung eines dreifach gespleißten auswählbaren Markers, z.B. des als
Beispiel dargestellten, dreifach gespleißten Neo-Konstrukts, gewährleistet,
dass alle G418-resistenten
Kolonien, die produziert wurden, aus einem homologen Rekombinationsvorgang
entstehen (zufällige
Integranten produzieren kein funktionelles Neo-Gen und überleben
die G418-Selektion folglich nicht). Die gegenständliche Erfindung macht das
Screenen nach dem gewünschten
homologen Vorgang somit einfach. Weiters scheint die Häufigkeit
von zusätzlichen
zufälligen
Integrationen in einer Zelle, die einen homologen Rekombinationsvorgang
durchgemacht hat, gering zu sein.
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Auf
Basis des Vorangegangenen ist es offensichtlich, dass ein bedeutender
Vorteil der Erfindung dann besteht, dass sie die Anzahl jener Kolonien
erheblich verringert, die gescreent werden müssen, um hoch produzierende
Klone, d.h. Zelllinien, die eine gewünschte DNA enthalten und das
entsprechende Protein in hohen Pegeln absondern, zu identifizieren.
Im Durchschnitt können
Klone, die eine integrierte gewünschte
DNA enthalten, durch Screenen von etwa 5 bis 20 Kolonien identifiziert
werden (im Vergleich zu mehreren tausend, die bei Anwendung von
Standardtechniken einer zufälligen
Integration gescreent werden müssen,
oder mehreren hundert, die bei Verwendung der zuvor beschriebenen
intronischen Insertionsvektoren gescreent werden müssen). Da
die Integrationsstelle vorgewählt
wurde und eine transcriptionsaktive Domäne umfasst, sollte außerdem jedwede,
an dieser Stelle exprimierte, exogene DNA vergleichbare, d.h. hohe
Pegel des Proteins, das von Interesse ist, produzieren.
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Überdies
ist die gegenständliche
Erfindung weiters vorteilhaft, da sie ermöglicht, dass bei Integration des
Markierungsvektors ein amplifizierbares Gen eingefügt wird.
Wird durch homologe Rekombination ein gewünschtes Gen auf diese Stelle
abgezielt, so ermöglicht
die gegenständliche
Erfindung somit eine weitere Verstärkung der Expression des Gens
durch eine Genamplifikation. Diesbezüglich wurde in der Literatur
berichtet, dass verschiedene Genomstellen verschiedene Fähigkeiten
zur Genamplifikation haben (Meinkoth et al, Mol. Cell Biol., 7:1415-1424
(1987)). Daher ist diese Technik weiters vorteilhaft, da sie die
Platzierung eines gewünschten
Gens, das von Interesse ist, an einer spezifischen Stelle, die sowohl
transcriptionsaktiv als auch leicht zu amplifizieren ist, ermöglicht.
Dies sollte daher den Zeitraum, der für die Isolierung solch hoher
Produzenten nötig
ist, erheblich verringern.
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Im
Speziellen ermöglicht
die vorliegende Erfindung die Isolierung solcher Klone im Durchschnitt
nach nur etwa 3-6 Monaten, während
herkömmliche
Verfahren zur Konstruktion hoch exprimierender Säugetierzelllinien 6 bis 9 Monate
benötigen
können.
Dies liegt an der Tatsache, dass herkömmlich isolierte Klone typischerweise
zumindest drei Runden einer Amplifikation von arzneimittelresistentem
Gen unterzogen werden müssen,
um zufriedenstellende Genexpressionsstärken zu erreichen.
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Da
die homolog produzierten Klone aus einer vorgewählten Stelle, die eine hohe
Expressionsstelle ist, generiert werden, sollten weniger Amplifikationsrunden
erforderlich sein, bevor ein zufriedenstellender Produktionsgrad
erreicht wird.
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Ferner
ermöglicht
die gegenständliche
Erfindung die reproduzierbare Selektion hoch produzierender Klone,
wobei der Vektor in einer geringen Kopiezahl, typischerweise einer
Einzelkopie, integriert wird. Dies ist vorteilhaft, da es die Stabilität der Klone
erhöht
und andere mögliche
nachteilige Nebenwirkungen, die mit einer hohen Kopiezahl zusammenhängen, verhindert.
Wie obenstehend beschrieben, wird beim gegenständlichen homologen Rekombinationssystem
die Kombination eines „Markerplasmids" und eines „Targeting-Plasmids", die untenstehend
detaillierter beschrieben sind, verwendet.
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Das „Markerplasmid", das zum Markieren
und Identifizieren eines transcriptionellen Hot Spots verwendet
wird, umfasst zumindest die folgenden Sequenzen:
- (i)
ein DNA-Bereich, der für
das Genom der Säugetierzelle
heterolog oder einzigartig ist und als Homologiequelle fungiert,
ermöglicht
eine homologe Rekombination (mit einer in einem zweiten Zielplasmid
enthaltenen DNA). Genauer gesagt umfasst der einzigartige DNA-Bereich
(i) im Allgemeinen eine Bakterien-, Virus-, Hefe-, synthetische
oder andere DNA, welche im Säugetierzellgenom
normalerweise nicht vorhanden ist und weiters keine erhebliche Homologie
oder Sequenzidentität
zur im Genom der Säugetierzelle
enthaltenen DNA umfasst.
Diese Sequenz sollte sich im Wesentlichen
ausreichend von Säugetier-DNA
unterscheiden, so dass sie sich nicht maßgeblich durch eine homologe
Rekombination mit dem Wirtszellgenom rekombiniert. Die Größe einer
solchen Einzelkopie-DNA beträgt
im Allgemeinen zumindest etwa 2 bis 10 Kilobasen oder mehr, noch
bevorzugter zumindest etwa 10kb, da mehrere andere Forscher bei
einer Zunahme der Größe des Homologiebereichs
eine erhöhte
Häufigkeit
der zielgerichteten Rekombination bemerkt haben (Capecchi, Science,
244:1288=1292 (1989)).
Die Obergrenze für die Größe der Einzelkopie-DNA, die
als Stelle für
eine homologe Rekombination mit einer Sequenz im zweiten Zielvektor
fungiert, wird größtenteils
durch mögliche
Stabilitätsbeschränkungen (wenn
die DNA zu groß ist,
könnte
deren Integration in ein Chromosom nicht leicht sein) und die Schwierigkeiten
beim Arbeiten mit sehr großen
DNAs diktiert.
- (ii) eine DNA, welche ein Fragment einer auswählbaren
Marker-DNA enthält,
typischerweise ein Exon eines dominanten auswählbaren Markergens. Das einzige wesentliche
Merkmal dieser DNA besteht darin, dass sie kein funktionelles auswählbares
Markerprotein codiert, es sei denn, dieses wird in Verbindung mit
einer im Zielplasmid enthaltenen Sequenz exprimiert. Typischerweise
umfasst das Zielplasmid die restlichen Exone des dominanten auswählbaren
Markergens (jene, die nicht im „Targeting"-Plasmid enthalten sind). Ein funktioneller
auswählbarer
Marker sollte im Wesentlichen nur dann produziert werden, wenn eine
homologe Rekombination stattfindet (was zur Kopplung und Expression
dieser Marker-DNA (i)-Sequenz zusammen mit jenem Abschnitt (jenen
Abschnitten) des auswählbaren
Marker-DNA-Fragments führt,
welcher (welche) im Zielplasmid enthalten ist (sind)).
Wie
angemerkt veranschaulicht die vorliegende Erfindung die Verwendung
des Neomycin-Phosphotransferase-Gens als dominanten auswählbaren
Marker, der in die beiden Vektoren „aufgespalten" wird. Andere auswählbare Marker
sollten jedoch ebenfalls geeignet sein, z.B. das Salmonella-Histidinol-Dehydrogenase-Gen,
Hygromycin-Phosphotransferase-Gen,
Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen, Adenosindesaminase-Gen,
Glutaminsynthetase-Gen und Hypoxanthinguanin-Phosphoribosyltransferase-Gen.
- (ii) eine DNA, die ein funktionelles auswählbares Markerprotein codiert,
welcher auswählbare
Macker sich von der auswählbaren
Marker-DNA (ii) unterscheidet. Dieser auswählbare Marker sorgt für die erfolgreiche Selektion
von Säugetierzellen,
bei denen das Markerplasmid erfolgreich in die zelluläre DNA integriert
ist. Noch bevorzugter ist es wünschenswert,
dass das Markerplasmid zwei derartige dominante auswählbare Marker-DNAs umfasst, die
sich an gegenüberliegenden
Enden des Vektors befinden. Dies ist vorteilhaft, da es ermöglicht,
dass Integranten unter Verwendung verschiedener Selektionsmittel
ausgewählt
werden, und weiters ermöglicht,
dass Zellen, die den gesamten Vektor enthalten, ausgewählt werden.
Zusätzlich
kann ein Marker ein amplifizierbarer Marker zur Ermöglichung
einer Genamplifikation sein, so wie zuvor besprochen. Jeder der
unter (ii) aufgelisteten dominanten auswählbaren Marker kann verwendet
werden, genauso wie andere, die im Stand der Technik allgemein bekannt
sind.
-
Überdies
kann das Markerplasmid gegebenenfalls weiters eine seltene Endonuclease-Restriktions-Schnittstelle
umfassen. Dies ist möglicherweise
wünschenswert,
da es eine Furchungsteilung ermöglichen
kann. Falls vorhanden, sollte sich eine solche seltene Restriktions-Schnittstelle
in der Nähe
der Mitte des einzigartigen Bereichs befinden, welcher als Substrat
für eine
homologe Rekombination fungiert. Vorzugsweise umfasst eine solche
Sequenz zumindest etwa 12 Nucleotide. Es wurde berichtet, dass das
Einführen
eines Doppelstrangbruchs mittels ähnlicher Methodik die Häufigkeit
einer homologen Rekombination erhöht. (Choulika et al, Mol. Cell.
Biol., 15:1968-1973 (1995)). Das Vorhandensein einer solchen Sequenz
ist jedoch nicht wesentlich.
-
Das „Targeting
Plasmid" umfasst
zumindest die folgenden Sequenzen:
- (1) denselben
einzigartigen DNA-Bereich, welcher im Markerplasmid vorhanden ist,
oder einen, der eine ausreichende Homologie oder Sequenzidentität zu diesem
aufweist, so dass die DNA in der Lage ist, sich durch eine homologe
Rekombination mit dem einzigartigen Bereich (i) im Markerplasmid
zu vereinigen. Geeignete Arten von DNAs sind obenstehend in der
Beschreibung des einzigartigen DNA-Bereichs (1) im Markerplasmid
beschrieben.
- (2) die restlichen Exone des dominanten auswählbaren Markers, von dem ein
Exon als (ii) im obenstehend aufgelisteten Markerplasmid enthalten
ist. Die wesentlichen Merkmale dieses DNA-Fragments bestehen darin,
dass es nur dann ein funktionelles (auswählbares) Markerprotein ergibt,
wenn sich das Zielplasmid durch eine homologe Rekombination integriert
(wobei eine solche Rekombination zur Kopplung dieser DNA mit dem
anderen Fragment der im Markerplasmid enthaltenen, auswählbaren
Marker-DNA führt),
und weiters darin, dass es das Einfügen einer gewünschten
exogenen DNA ermöglicht.
Typischerweise umfasst diese DNA die restlichen Exone der auswählbaren
Marker-DNA, welche durch ein Intron getrennt sind. Diese DNA kann
beispielsweise die ersten beiden Exone des Neo-Gens umfassen, und
das Markerplasmid kann das dritte Exon (hinteres Drittel von Neo)
umfassen.
- (3) Das Zielplasmid umfasst auch eine gewünschte DNA, z.B, eine, die
ein gewünschtes
Polypeptid codiert, welche vorzugsweise im auswählbaren Marker-DNA-Fragment, das im
Plasmid enthalten ist, eingefügt
ist. Typischerweise wird die DNA in ein Intron eingefügt, das
zwischen den Exonen der auswählbaren
Marker-DATA eingeschlossen ist. Dies gewährleistet, dass die gewünschte DNA
ebenfalls integriert wird, wenn eine homologe Rekombination des
Zielplasmids und des Markerplasmids stattfindet. Dieses Intron kann
natürlich
vorkommen oder in das dominante auswählbare Marker-DNA-Fragment eingebaut
werden.
-
Diese
DNA codiert jedes gewünschte
Protein, vorzugsweise eines, das pharmazeutische oder andere wünschenswerte
Eigenschaften aufweist. Am typischsten codiert die DNA ein Säugetierprotein
und, in den aktuellen Beispielen, die dargelegt sind, ein Immunglobulin
oder Immunadhesin. Die Erfindung beschränkt sich jedoch keineswegs
auf die Produktion von Immunglobulinen.
-
Wie
zuvor besprochen, eignet sich das gegenständliche Klonierungsverfahren
für jegliche
Säugetierzelle,
da es hinsichtlich der Wirksamkeit nicht das Vorhandensein irgendeiner
speziellen Säugetiersequenz oder
von speziellen Säugetiersequenzen
erfordert. Solche Säugetierzellen
umfassen im Allgemeinen jene, die typischerweise für eine Proteinexpression
verwendet werden, z.B. CHO-Zellen, Myelomzellen, COS-Zellen, BHK-Zellen,
Sp2/0-Zellen, NIH 3T3- und HeLa-Zellen. In den nachfolgenden Beispielen
wurden CHO-Zellen verwendet.
Deren Vorteile umfassen die Verfügbarkeit
eines geeigneten Wachstums mediums, ihre Fähigkeit, in einer Kultur effizient
und bis zu einer hohen Dichte zu wachsen, und ihre Fähigkeit
zur Expression von Säugetierproteinen,
wie z.B. Immunglobulinen, in biologisch aktiver Form.
-
Weiters
wurden CHO-Zellen größtenteils
aufgrund der vorherigen Verwendung solcher Zellen durch die Erfinder
für die
Expression von Immunglobulinen ausgewählt (wobei die zuvor beschriebenen
Vektoren, die einen translational geschädigten dominanten auswählbaren
Marker enthalten, verwendet wurden). Somit verfugt das vorliegende
Labor über
eine beträchtliche
Erfahrung mit der Verwendung solcher Zellen für eine Expression. Basierend
auf den nachfolgenden Beispielen kann jedoch vernünftigerweise
erwartet werden, dass bei anderen Säugetierzellen ähnliche
Ergebnisse erhalten werden.
-
Im
Allgemeinen wird eine Transformation oder Transfektion von Säugetierzellen
nach der gegenständlichen
Erfindung gemäß herkömmlichen
Verfahren durchgeführt.
Zum Zwecke eines besseren Verständnisses der
Erfindung werden in den nachstehenden Beispielen die Konstruktion
beispielhafter Vektoren und deren Verwendung bei der Produktion
von Integranten beschrieben.
-
BEISPIEL 1
-
Design
und Herstellung von Marker- und Targeting-Plasmid-DNA-Vektoren Das
hier als „Desmond" bezeichnete Markerplasmid
wurde aus den folgenden DNA-Elementen
zusammengesetzt:
- (a) murines Dihydrofolatreduktase-Gen
(DHFR),
das in einer Transcriptionskassette, umfassend den
Maus-Beta-Globin-Promotor 5" zur
DHFR-Startstelle und ein Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungssignal
3" zum Stopcodan,
eingebaut ist. Die transcriptionelle DHFR-Kassette wurde aus TCAE6,
einem zuvor in diesem Labor geschaffenen Expressionsvektor, isoliert
(Newman et al, 1992, Biotechnology, 10:1455-1460).
- (b) E. coli-β-Galactosidase-Gen – handelsüblich, als
pSV-b-Galactosidase-Kontrollvektor,
Katalog # E1081, von Promega bezogen.
- (c) Baculovirus-DNA, handelsüblich,
als pBAKPAK8, Kat. # 6145-1, bei Clontech erworben.
- (d) Kassette, umfassend Promotor- und Enhancer-Elemente vom
Cytomegalovirus und SV40-Virus. Die Kassette wurde unter Verwendung
eines Derivats des Expressionsvektors TCAE8 durch PCR erzeugt (Reff et
al, Blood, 83:435-445 (1904)). Die Enhancer-Kassette wurde in die
Baculovirus-Sequenz eingefügt,
welche zuerst durch Einfügung
einer multiplen Klonierungsstelle modifiziert wurde.
- (e) E. coli-GUS (Glucuronidase)-Gen, handelsüblich, als pB101, Kat. # 6017-1,
bei Clontech erworben.
- (f) Leuchtkäfer-Luciferase-Gen,
handelsüblich,
als pGEM-Luc (Katalog # E1541) von Promega bezogen.
- (g) S. Typhimurium-Histidinol-Dehydrogenase-Gen (HisD). Dieses
Gen war ursprünglich
ein Geschenk von (Donahue et al, Gene, 18:47-59 (1982)) und wurde
danach in einer Transcriptionskassette, umfassend den Maus-Beta-Globin-Hauptpromotor
5' zum Gen und das
SV40-Polyadenylierungssignal 3' zum
Gen, eingebaut.
- Die in (a)-(g) beschriebenen DNA-Elemente wurden zu einem von
pBR abgeleiteten Plasmid-Grundgerüst kombiniert, um eine aneinandergrenzende
7,7kb-DNA-Strecke zu produzieren, welche in den angefügten Figuren
als „Homologie" bezeichnet wird.
Homologie in diesem Sinn bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die nicht
Teil des Säugetiergenoms
sind und zum Fördern
einer homologen Rekombination zwischen transfizierten Plasmiden,
welche dieselben Homologie-DNA-Sequenzen teilen, verwendet werden.
- (h) Neomycin-Phosphotransferase-Gen von TN5 (Davis und Smith,
Ann. Rev. Micro., 32:469-518 (1978)). Das komplette Neo-Gen wurde
in pBluescript SK- (Strategene-Katalog
# 212205) subkloniert, um eine genetische Manipulation zu ermöglichen.
Danach wurde ein synthetischer Linker an einer einzigartigen Pstl-Stelle
eingefügt,
welche gegenüber
den Codonen für
Aminosäure
51 und 52 von Neo vorkommt. Dieser Linker codierte die DNA-Elemente,
die nötig
waren, um eine künstliche
Donor-Spleißstelle,
eine dazwischenliegende Intron- und eine Acceptor-Spleißstelle
innerhalb des Neo-Gens zu schaffen, wodurch zwei getrennte Exone,
die zur Zeit als Neo-Exon 1 und 2 bezeichnet werden, gebildet wurden.
Das Neo-Exon 1 codiert die ersten 51 Aminosäuren von Neo, während das
Exon 2 die restlichen 203 Aminosäuren
plus dem Stopcodon des Proteins codiert. Eine Not1-Klonierungsstelle
wurde ebenfalls innerhalb des Introns geschaffen.
-
Das
Neo-Exon 2 wurde weiter unterteilt, um die Neo-Exone 2 und 3 zu
produzieren. Dies wurde folgendermaßen erzielt: Ein Satz von PCR-Primern
wurde für
die Amplikation eines DNA-Bereichs, der das Neo-Exon 1, das Intron
und die ersten 111 2/3-Aminosäuren
von Exon 2 codiert, entworfen. Der 3'-PCR-Primer führte zur Einführung einer
neuen 5'-Spleißstelle
unmittelbar nach dem zweiten Nucleotid des Codons für Aminosäure 111
im Exon 2 und generierte daher ein neues kleineres Exon 2. Das DATA-Fragment,
welches nunmehr das ursprüngliche
Exon 1, das Intron und das neue Exon 2 codierte, wurde daraufhin
in einem auf pBR basierenden Vektor subkloniert und vermehrt. Der
Rest des ursprünglichen
Exons 2 wurde als Matrize für
eine weitere Runde einer PCR-Amplifikation, die „Exon 3" hervorbrachte, verwendet. Der 5'-Primer für diese
Amplifikationsrunde führte
an der 5'-Seite
des neu geschaffenen Exons 3, d.h, vor dem letzten Nucleotid des
Codons für
Aminosäure
111, eine neue Acceptor-Spleißstelle
ein. Die resultierenden 3 Exone von Neo codieren die folgenden Informationen:
Exon 1 – die
ersten 51 Aminosäuren
von Neo; Exon 2 – die
nächsten
111 2/3-Aminosäuren,
und Exon 3 – die
letzten 9I 1/3-Aminosäuren
plus den translationalen Stopcodon des Neo-Gens.
-
Das
Neo-Exon 3 wurde zusammen mit den obenstehend erwähnten DNA-Elementen
im markierenden Plasmid „Desmond" eingebaut. Die Neo-Exone
1 und 2 wurden im Targeting-Plasmid „Molly" eingebaut. Die im Intron zwischen den
Exonen 1 und 2 geschaffene Not1-Klonierungsstelle wurde in den nachfolgenden
Klonierungsschritten dazu verwendet, um Gene, die von Interesse
sind, in das Targeting Plasmid einzufügen.
-
Ein
zweites Targeting-Plasmid „Mandy" wurde ebenfalls
erzeugt. Dieses Plasmid ist mit „Molly" beinahe identisch (einige Restriktions-Schnittstellen
am Vektor wurden verändert),
abgesehen davon, dass die ursprünglichen,
in „Molly" enthaltenen HisD-
und DHFR-Gene inaktiviert wurden. Diese Veränderungen wurden eingeführt, da
die Desmond-Zelllinie
nicht länger
in Gegenwart von Histidinol kultiviert wurde, weshalb es unnötig schien,
eine zweite Kopie des HisD-Gens einzubringen. Außerdem wurde das DHFR-Gen inaktiviert,
um sicherzustellen, dass nur ein einziges DHFR-Gen, nämlich jenes,
das an der Desmond-markierten Stelle vorhanden ist, in allen resultierenden
Zelllinien amplifizierbar sei. „Mandy" wurde durch die folgenden Modifikationen
von „Molly" abgeleitet:
- (i) Ein synthetischer Linker wurde in der Mitte
des DHFR-codierenden Bereichs eingefügt. Dieser Linker bildete ein
Stopcodon und verschob den Rest des DHFR-codierenden Bereichs aus dem Raster
und machte daher das Gen unfunktionell.
- (ii) Ein Teil des HisD-Gens wurde deletiert und durch ein PCR-generiertes
HisD-Fragment ersetzt,
dem der Promotor und das Startcodon des Gens fehlten.
-
1 stellt die Anordnung dieser DNA-Elemente
im Markerplasmid „Desmond" dar. 2 stellt die Anordnung dieser Elemente
im ersten Targeting Plasmid „Molly" dar. 3 veranschaulicht
die mögliche
Anordnung der verschiedenen DNA-Elemente im CHO-Genom nach dem Abzielen und Integrieren
von Molly-DNA in Desmond-markierten CHO-Zellen. 9 stellt
das Targeting-Plasmid „Mandy" dar.
-
Die
Konstruktion der Markierungs- und Targeting-Plasmide aus den obenstehend
aufgelisteten DNA-Elementen wurde gemäß herkömmlichen Klonierungstechniken
durchgeführt
(siehe z.B. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook
et al, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory Press, und Current Protocols
in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hgb., 1987, John Wiley
und Söhne).
Alle Plasmide wurden in E. coli XLI blue (Strategene, Kat. # 200236)
vermehrt und erhalten. Unter Anwendung des Promega Wizard Maxiprep-DNA-Reinigungssystems® wurden
gemäß den Richtilinien
des Herstellers in großem
Umfang Plasmidpräparate
hergestellt.
-
BEISPIEL 2
-
Konstruktion einer markierten
CHO-Zelllinie
-
1. Zellkultur- und Transfektionsverfahren
zur Produktion einer markierten CHO-Zelllinie
-
Markerplasmid-DNA
wurde über
Nacht bei 37°C
durch Aufschluss mit Bst1107I linearisiert. Der linearisierte Vektor
wurde ethanolgefällt
und in sterilem TE zu einer Konzentration von 1 mg/ml resuspendiert.
Der linearisierte Vektor wurde durch Elektroporation folgendermaßen in DHFR-Eierstockzellen
(CHO-Zellen), DG44-Zellen des chinesischen Hamsters (Urlaub et al,
Som. Cell and Mol. Gen., 12:555-566 (1986)) eingebracht.
-
Exponentiell
wachsende Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, einmal in
eiskalter SBS (Sucrose-gepufferter Lösung, 272 mM Sucrose, 7 mM
Natriumphosphat, pH 7,4, 1 mM Magnesiumchlorid) gewaschen und danach
in SBS zu einer Konzentration von 107 Zellen/ml
resuspendiert. Nach einer 15-minütigen Inkubation
auf Eis wurden 0,4 ml der Zellsuspension in einer Einweg-Elektroporationsküvette mit
40 μg linearisierter
DNA vermischt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines BTX-Elektrozellmanipulators
(San Diego, CA), der auf 230 Volt, eine Kapazität von 400 Mikrofaraday, einen
Widerstand von 13 Ohm eingestellt war, geschockt. Die geschockten
Zellen wurden danach mit 20 ml vorgewärmten CHO-Wachstumsmedien (CHO-S-SFMII,
Gibco/BRL, Katalog # 31033-012) vermischt und auf 96-Well-Gewebekulturplatten
plattiert. Achtundvierzig Stunden nach der Elektroporation wurden
Selektionsmedien auf die Platten aufgetragen (im Falle einer Transfektion
mit Desmond handelt es sich bei den Selektionsmedien um CHO-S-SFMII
ohne Hypoxanthin oder Thymidin, ergänzt mit 2 mM Histidinol (Sigma-Katalog
# H6647)). Die Platten wurden bis zu 30 Tage lang oder bis manche
der Mulden ein Zeltwachstum aufwiesen in den Selektionsmedien belassen.
Diese Zellen wurden danach aus den 96-Well-Platten entnommen und schließlich auf
120 ml-Spinnkolben expandiert, wo sie ständig in Selektionsmedien gehalten
wurden.
-
BEISPIEL 3
-
Charakterisierung von
markierten CHO-Zelllinien
-
(a) Southern-Analyse
-
Aus
allen stabil wachsenden Desmond-markierten CHO-Zellen wurde genomische
DNA isoliert. Unter Verwendung des Invitrogen Easy®-DNA-Kits
wurde gemäß den Richtlinien
des Herstellers DNA isoliert. Danach wurde genomische DNA über Nacht
bei 37°C
mit HindIII aufgeschlossen und unter Verwendung einer PCR-generierten,
Digoxygenin-markierten Sonde, die für das DHFR-Gen spezifisch war,
einer Southern-Analyse unterzogen. Unter Verwendung eines DIG-Easy-Hybs
von Boehringer Mannheim (Katalog # 1603 558) und eines DIG-Wash-and-Block-Buffer-Sets
(Katalog # 1585 762) wurden gemäß den Richtlinien
des Herstellers Hybridisierungen und Waschungen durchgeführt. Es
wurde angenommen, dass DNA-Proben, die ein mit der DHFR-Sonde hybridisierendes
Einzelband enthielten, Desmond-Klone seien, die aus einer Einzelzelle
entstanden, in welcher eine Einzelkopie des Plasmids integriert
war. Diese Klone wurden für
eine weitere Analyse aufbewahrt. Aus einer Gesamtzahl von 45 isolierten
HisD-resistenten Zelllinien waren nur 5 Einzelkopie-Integranten. 4 zeigt
einen Southern-Blot, der alle 5 dieser Einzelkopie-Desmond-Klone enthält. Die
Namen der Klone sind in der Zeichenerklärung der Figur dargelegt.
-
(b) Northern-Analyse
-
Unter
Verwendung eines TRIzol-Reagens (Gibco/BRL Kat. # 15596-026) wurde
gemäß den Richtlinien
des Herstellers die gesamte RNA aus allen Einzelkopie-Desmond-Klonen isoliert.
10-20 μg
RNA aus jedem Klon wurden auf doppelten Formaldehydgels analysiert.
Die resultierenden Blots wurden mit PCR-generierten, Digoxygenin-markierten
DNA-Sonden auf die (i) DHFR-Botschaft, (ii) HisD-Botschaft und (iii)
CAD-Botschaft untersucht. CAD ist ein trifunktionelles Protein,
das bei der Uridin-Biosynthese eine Rolle spielt (Wahl et al, J. Biol.
Chem., 254, 17:8679-8689 (1979)), und wird in allen Zellarten gleichermaßen exprimiert.
Hier wird es als interne Kontrolle verwendet, um die mengenmäßige Bestimmung
der RNA-Ladung zu unterstützen.
Unter Verwendung der obenstehend erwähnten Boehringer-Mannheim-Reagentien
wurden Hybridisierungen und Waschungen durchgeführt. Die Ergebnisse der Northern-Analyse
werden in 5 gezeigt. Jener Einzelkopie-Desmond-Klon,
der die höchsten
Grade sowohl der HisD- als auch der DHFR-Botschaft aufwies, ist Klon 15C9, der
in Bahn 4 in beiden Feldern der Figur gezeigt wird. Dieser Klon
wurde als „markierte
Zelllinie" bezeichnet
und in zukünftigen
Targeting-Versuchen
bei CHO verwendet, wovon in den nachfolgenden Abschnitten Beispiele
dargelegt sind.
-
BEISPIEL 4
-
Expression
des anti-CD20-Antikörpers
in Desmond-markierten CHO-Zellen C2B8, ein Chimären-Antikörper, der das B-Zelloberflächenantigen
CD20 erkennt, wurde zuvor in unserem Labor kloniert und exprimiert.
(Reff et al, Blood, 83:434-45 (1994)). Ein 4,1 kb-DNA-Fragment,
umfassend die C2B8-Leicht- und Schwerketten-Gene, wurde zusammen
mit den notwendigen Regulationselementen (Eukaryontenpromotor und
Polyadenylierungssignalen) in das künstliche Intron eingefügt, welches
zwischen den Exonen 1 und 2 des Neo-Gens, das in einem von pBR abgeleiteten
Klonierungsvektor enthalten war, geschaffen wurde. Dieses neu generierte
5kb-DNA-Fragment (umfassend Neo-Exon 1, C2B8 und Neo-Exon 2) wurde
herausgeschnitten und zum Aufbau des Targeting-Plasmids Molly verwendet.
Die anderen, bei der Konstruktion von Molly verwendeten DNA-Elemente
sind mit jenen identisch, die zur Konstruktion des zuvor identifizierten,
markierenden Plasmids Desmond verwendet wurden. Eine vollständige Abbildung
von Molly wird in 2 gezeigt.
-
Der
Targeting-Vektor Molly wurde vor der Transfektion durch Aufschluss
mit Kpn 1 und Pac1 linearisiert, ethanolgefällt und in sterilem TE zu einer
Konzentration von 1,5 mg/ml resuspendiert. Das linearisierte Plasmid
wurde im Wesentlichen wie beschrieben in exponentiell wachsende
Desmond-markierte Zellen eingebracht, abgesehen davon, dass bei
jeder Elektroporation 80 μg
DNA verwendet wurden. Achtundvierzig Stunden nach der Elektroporation
wurden 96-Well-Platten mit einem Selektionsmedium – CHO-SSFMII,
ergänzt
mit 400 μg/ml
Geneticin (G418, Gibco/BRL-Katalog # 10131-019) – ergänzt. Die Platten wurden bis
zu 30 Tage lang oder bis in manchen der Mulden ein Zellwachstum
auftrat im Selektionsmedium belassen. Es wurde angenommen, dass
ein solches Wachstum das Ergebnis einer klonalen Expansion einer
einzelnen G418-resistenten Zelle war. Die Überstände aus allen G418-resistenten
Mulden wurden mittels Standard-ELISA-Techniken hinsichtlich einer
CZB8-Produktion analysiert, und alle produktiven Klone wurden schließlich auf 120
ml-Spinnkolben expandiert und weiter analysiert.
-
Kennzeichnung von Antikörper-absondernden
zielgerichteten Zellen
-
Bei
diesem Versuch wurden insgesamt 50 Elektroporationen mit einem Molly-Targeting-Plasmid durchgeführt, wobei
jeder auf separate 96-Well-Platten plattiert wurde. Insgesamt wurden
10 lebensfähige
anti-CD20-Antikörper-absondernde
Klone erhalten und auf 120 ml-Spinnkolben expandiert. Aus allen
Klonen wurde genomische DNA isoliert, und anschließend wurden
Southern-Analysen durchgeführt,
um zu bestimmen, ob die Klone einzelne homologe Rekombinationsvorgänge darstellten
oder ob in denselben Zellen zusätzliche
zufällige
Integrationen stattgefunden hatten. Die Verfahren einer DNA-Isolierung und Southern-Hybridisierung
waren so wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben. Genomische
DNA wurde mit EcoRI aufgeschlossen und mit einer PCR-generierten, Digoxygenin-markierten
Sonde auf ein Segment des konstanten CD20-Schwerkettenbereichs untersucht. Die
Ergebnisse dieser Southem-Analyse sind in 6 dargestellt. Wie
in der Figur ersichtlich, weisen 8 der 10 Klone ein mit der CD20-Sonde
hybridisierendes Einzelband auf, was darauf hinweist, dass in diesen
Zellen ein einzelner homologer Rekombinationsvorgang stattgefunden
hat. Zwei der zehn, die Klone 24G2 und 28C9, zeigen das Vorhandensein
eines zusätzlichen
Bands (zusätzlicher Bänder), was
auf eine zusätzliche
zufällige
Integration an anderer Stelle im Genom hinweist.
-
Wir
untersuchten die Expressionsstärken
des anti-CD20-Antikörpers
in allen zehn Klonen, und die Daten hierfür werden in der unterstehenden
Tabelle 1 gezeigt.
-
Tabelle
1: Expressionsstärke von
anti-CD20-absondernden homologen Integranten
-
Die
Expressionsstärken
sind in Picogramm pro Zelle pro Tag (pg/c/d) des von den einzelnen
Klonen Abgesonderten angegeben und stellten die mittleren Stärken dar,
die aus drei getrennten ELISAs an aus 120 ml-Spinnkolben entnommenen
Proben erhalten wurden.
-
Wie
aus den Daten ersichtlich, besteht bei der Antikörperabsonderung zwischen den
höchsten
und den niedrigsten Klonen eine Abweichung um das ungefähr Zehnfache.
Dies war einigermaßen
unerwartet, da wir aufgrund der Tatsache, dass alle anti-CD20-Gene
in derselben Desmond-markierten Stelle integriert sind, von allen
Klonen ähnliche
Expressionsstärken
erwarteten. Dennoch war dieser beobachtete Expressionsbereich extrem
klein im Vergleich zu jenem, der bei Anwendung irgendeines traditionellen
Verfahrens der zufälligen
Integration oder mit unserem translational geschädigten Vektorsystem beobachtet
wurde.
-
Klon
20F4, der am höchsten
produzierende Einzelkopie-Integrant, wurde für eine weitere Studie ausgewählt. Tabelle
2 (untenstehend) zeigt ELISA- und Zellkulturdaten aus siebentägigen Abläufen zur
Produktion dieses Klons.
-
Tabelle
2: Daten
zum 7-tägigen
Produktionsablauf hinsichtlich 20F4
-
Klon
20F4 wurde am Tag 0 in einer Menge von 2×105ml
in einen 120 ml-Spinnkolben geimpft. An den nachfolgenden sechs
Tagen wurden Zellzählungen
durchgeführt,
die Verdoppelungszeiten berechnet, und 1 ml-Proben des Überstands
wurden aus dem Kolben entnommen und mittels ELISA hinsichtlich abgesondertem
anti-CD20 analysiert.
-
Dieser
Klon sondert im Durchschnitt 3-5 pg Antikörper/Zelle/Tag ab, basierend
auf diesen ELISA-Daten. Dies ist derselbe Pegel, der auch von anderen
hoch exprimierenden Einzelkopieklonen erlangt wird, welche unter
Verwendung der zuvor entwickelten, trans-lational geschädigten, zufälligen Integrationsvektoren
zuvor in unserem Labor erhalten wurden. Dieses Ergebnis weist auf
Folgendes hin:
- (1) dass jene Stelle im CHO-Genom,
die durch den Desmond-markierenden Vektor markiert ist, höchst transcriptionsaktiv
ist und daher eine ausgezeichnete Stelle darstellt, aus der rekombinante
Proteine exprimiert werden können,
und
- (2) dass das Abzielen durch homologe Rekombination unter Verwendung
der gegenständlichen
Vektoren bewerkstelligt werden kann und in einer Häufigkeit
stattfindet, die hoch genug ist, um dieses System zu einer brauchbaren
und wünschenswerten
Alternative zu den zufälligen
Integrationsverfahren zu machen.
-
Um
die Wirksamkeit dieses Systems weiter darzulegen, zeigten wir auch,
dass diese Stelle amplifizierbar ist, was zu sogar noch höheren Stärken der
Genexpression und Proteinabsonderung führt. Eine Amplifikation wurde
erzielt, indem, ausgehend von einer Dichte von 2,5 × 104 Zellen/ml, serielle Verdünnungen
von 20F4-Zellen in 96-Well-Gewebekulturschalen plattiert und diese
Zellen in Medien (CH-SSFMII), die mit 5, 10, 15 oder 20 nM Methotrexat
ergänzt
waren, kultiviert wurden. Antikörper-absondernde
Klone wurden unter Anwendung standardmäßiger ELISA-Techniken gescreent,
und die am höchsten produzierenden
Klone wurden expandiert und weiter analysiert. Eine Zusammenfassung
dieses Amplifikationsversuchs ist in der untenstehenden Tabelle
3 dargelegt.
-
Tabelle
3: Zusammenfassung der 20F4-Amplifikation
-
Eine
Methotrexat-Amplifikation von 20F4 wurde wie im Text beschrieben
vorbereitet, wobei die in obiger Tabelle angegebenen Methotrexat-Konzentrationen
verwendet wurden. Überstände von
allen überlebenden
96-Well-Kolonien wurden mittels ELISA analysiert, und der Bereich
des durch diese Klone exprimierten anti-CD20 ist in Spalte 3 angegeben. Auf
Basis dieser Ergebnisse wurden die am höchsten produzierenden Klone
auf 120 ml-Spinner expandiert und mehrere ELISAs an den Spinnerüberständen durchgeführt, um
die in Spalte 5 angezeigten pg/Zelle/Tag-Expressionsstärken zu
bestimmen.
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Die
Daten zeigen hier deutlich, dass diese Stelle in Gegenwart von Methotrexat
amplifiziert werden kann. Es stellte sich heraus, dass Klone aus
den 10 und 15 nM-Amplifikationen
in einer Größenordnung
von 15-20 pg/Zelle/Tag produzierten.
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Ein
als 20F4-15A5 bezeichneter 15 nM-Klon wurde als die am stärksten exprimierende
Zelllinie ausgewählt.
Dieser Klon entstand aus einer 96-Weil-Platte, in welcher nur 22
Mulden wuchsen, und daher wurde angenommen, dass er aus einer Einzelzelle
hervorging. Ein als 20F4-15A5 bezeichneter 15 nM-Klon wurde als
die am stärksten
exprimierende Zelllinie ausgewählt.
Dieser klon entstand aus einer 96-Well-Platte, in welcher nur 22
Mulden wuchsen, und daher wurde angenommen, dass er aus einer Einzelzelle
hervorging. Dieser Klon wurde danach einer weiteren Methotrexat-Amplifikatiansrunde
unterzogen. Wie obenstehend beschrieben, wurden serielle. Verdünnungen
der Kultur in 96-Well-Schalen plattiert und in einem CHO-SS-FMII-Medium, das mit 200,
300 oder 400 nM Methotrexat ergänzt
war, kultiviert. Überlebende
Klone wurden durch ELISA gescreent, und mehrere hoch produzierende
Klone wurden auf Spinnkulturen expandiert und weiter analysiert. Eine
Zusammenfassung dieses zweiten Amplifikationsversuchs ist in Tabelle
4 dargelegt.
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Tabelle
4: Zusammenfassung einer 20F4-15A5-Amplifikation
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Methotrexat-Amplifikationen
von 20F4-15A5 wurden wie im Text beschrieben vorbereitet und analysiert.
Die am höchsten
produzierenden Mulden, deren Zahlen in Spalte 4 angegeben sind,
wurden auf 120 ml-Spinnkolben expandiert. Die Expressionsstärken der
von diesen Mulden abgeleiteten Zelllinien sind in Spalte 5 in pg/c/d
angegeben.
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Der
am höchsten
produzierende Klon kam aus der 250 nM-Methotrexat-Amplifikation. Der
250 nM-Klon, 20F4-15A5-250A6, entstand aus einer 96-Well-Platte,
in welcher nur Mulden wuchsen, und daher wird angenommen, dass er
aus einer Einzelzelle hervorging. Zusammengenommen weisen die Daten
in den Tabellen 3 und 4 stark darauf hin, dass zwei Methotrexat-Amplifikationsrunden
ausreichen, um Expressionsstärken
von 60 pg/Zelle/Tag zu erreichen, was sich der maximalen Absanderungsleistung
von Immunglobulin in Säugetierzellen
annähert
(Reff, M.E., Curr, Opin. Biotech., 4:573-576 (1993)). Die Fähigkeit,
diese Absanderungsleistung mit nur zwei Amplifikationsschritten
zu erreichen, verstärkt
die Nützlichkeit
dieses homologen Rekombinationssystems weiter. Verfahren einer zufälligen Integration
benötigen
zur Erreichung dieser Expressionsstärke typischerweise mehr als
zwei Amplifikationsschritte und sind hinsichtlich einer leichten
Amplifikation im Allgemeinen weniger verlässlich. Somit bietet das homologe
System ein effizienteres und zeitsparenderes Verfahren zur Erzielung
einer hochgradigen Genexpression in Säugetierzellen.
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BEISPIEL 5
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Expression
eines anti-Mensch-CD23-Antikörpers
in Desmond-markierten CHO-Zellen CD23 ist ein IgE-Rezeptor von geringer
Affinität,
welcher eine Bindung von IgE an B und T-Lymphozyten vermittelt (Sutton, B.J.
und Gould, H.J., Nature, 366:421-428 (1993)). Der monoklonale anti-Mensch-CD23-Antikörper 5E8
ist ein monoklonaler Gamma-I-Antikörper des
Menschen, der vor kurzem in unserem Labor kloniert und exprimiert wurde.
Dieser Antikörper
ist in der gemeinsam übertragenen
Anmeldung Nr. 08/803,085, angemeldet am 20. Februar 1997, geoffenbart.
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Die
Schwer- und Leichtketten-Gene von 5E8 wurden in den Säugetier-Expressionsvektor
N5KG1, ein Derivat des Vektors NEOSPLA, kloniert (Barnett et al,
in Antibody Expression and Engeneering, H.Y. Yang und T. Imanaka,
Hgb., S. 27-40 (1995)), und danach wurden an den Genen zwei Modifikationen
durchgeführt.
Wir beobachteten jüngst
eine Absonderung von Immunglobulin-Leichtketten, die im Vergleich
zu jener schwerer Ketten in anderen Expressionskonstrukten im Labor
etwas stärker
war (Reff et al, 1997, unveröffentlichte
Beobachtungen). Im Versuch, diesen Mangel auszugleichen, änderten
wir das 5E8-Schwerketten-Gen durch Hinzufügung eines stärkeren Promotor/Enhancer-Elements unmittelbar
stromaufwärts
von der Startstelle. In den darauffolgenden Schritten wurde ein
2,9kb-DNA-Fragment, umfassend die 5E8-modifizierten Leicht- und Schwerketten-Gene,
aus dem N5KGI-Vektor isoliert und in den Targeting-Vektor Mandy
eingefügt.
Die Herstellung des 5E8-haltigen Molly und die Elektroporation in
Desmond-15C9-CHO-Zellen
waren im Wesentlichen so, wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben.
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Eine
Modifikation am zuvor beschriebenen Protokoll bestand in der Art
des verwendeten Nährmediums.
Desmond-markierte CHO-Zellen wurden in einem proteinfreien CD-CHO-Medium
(Gibco-BRL, Katalog # AS21206), das mit 3 mg/l rekombinantem Insulin
(3 mg/ml-Ansatz, Gibco-BRL, Katalog # AS22057) und 8 mM L-Glutamin
(200 mM-Ansatz, Gibco-BRL, Katalog # 25030-081) ergänzt war,
kultiviert. Anschließend
wurden in obigem Medium, das mit 400 μg/ml Geneticin ergänzt war,
transfizierte Zellen ausgewählt.
Bei diesem Versuch wurden 20 Elektroporationen durchgeführt und
in 96-Well-Gewebekulturschalen
plattiert. Die Zellen wuchsen und sonderten anti-CD23 in insgesamt
68 Mulden ab, von denen angenommen wurde, dass alle von einer einzigen
G418-Zelle abstammende Klone waren. Zwölf dieser Mulden wurden für eine weitere
Analyse auf 120 ml-Spinnkolben expandiert. Wir glauben, dass die
erhöhte
Anzahl von Klonen, die in diesem Versuch isoliert wurden (68 im
Vergleich zu 10 bei anti-CD20, wie in Beispiel 4 beschrieben), an
einer höheren
Klonierungsleistung und Überlebensrate
von Zellen liegt, die anstatt in einem CHO-SS-FMII-Medium in einem CD-CHO-Medium
gezüchtet
wurden. Die Expressionsstärken
bei diesen in einer Spinnkultur analysierten Klonen reichten von
0,5-3 pg/c/d, was mit den bei den anti-CD20-Klonen beobachteten
Stärken
genau übereinstimmt.
Der am höchsten
produzierende anti-CD23-Klon, der als 4H12 bezeichnet wird, wurde
zur Erhöhung seiner
Expressionsstärken
einer Methotrexat-Amplifikation unterzogen. Diese Amplifikation
wurde in einer Weise vorbereitet, die jener ähnlich ist, welche hinsichtlich
des anti-CD20-Klons in Beispiel 4 beschrieben wurde. Serielle Verdünnungen
von exponentiell wachsenden 4H12-Zellen wurden in 96-Well-Gewebekulturschalen
plattiert und in einem CD-CHO-Medium, das mit 3 mg/l Insulin, 8
mM Glutamin und 30, 35 oder 40 nM Methotrexat ergänzt war,
gezüchtet.
Eine Zusammenfassung dieses Amplifikationsversuchs ist in Tabelle
5 dargelegt.
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Tabelle
5: Zusammenfassung einer ZH12-Amplifikation
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Der
am höchsten
exprimierende Klon, welcher erhalten wurde, war ein 30 nM-Klon,
der aus einer Platte isoliert wurde, auf der 22 Mulden gewachsen
waren. Dieser als 4H12-30G5 bezeichnete Klon sonderte in reproduzierbarer
Weise 18-22 pg Antikörper
pro Zelle pro Tag ab. Dies ist derselbe Expressionsbereich, der auch
bei der ersten Amplifikation des anti-CD20-Klons 20F4 beobachtet
wurde (Klon 20F4-15A5,
welcher 15-18 pg/c/d produzierte, wie in Beispiel 4 beschrieben).
Diese Daten dienen zur weiteren Untermauerung der Beobachtung, dass
eine Amplifikation an dieser markierten Stelle in CHO reproduzierbar
und effizient ist. Eine zweite Amplifkation dieser 30 nM-Zelllinie
ist derzeit im Gange. Es wird erwartet, dass beim anti-CD23-Antikörper in
nur zwei Amplifikationsschritten die Sättigungsgrade einer Expression
zu erzielen sind, wie es bei anti-CD20 der Fall war.
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BEISPIEL 6
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Expression von Immunadhesin
in Desmond-markierten CHO-Zellen
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CTLA-4,
ein Mitglied der Ig-Überfamilie,
ist an der Oberfläche
von T-Lymphozyten zu finden und soll bei der antigenspezifischen
T-Zellaktivierung eine Rolle spielen (Dariavach et al, Eur. J. Immunol., 18:1901-1905
(1988); und Linsley et al, J. Exp. Med., 174:561-569 (1991)). Um
die genaue Rolle des CTLA-4-Moleküls im Aktivierungspfad weiter
zu untersuchen, wurde ein lösliches
Fusionsprotein erzeugt, welches die extrazelluläre Domäne von CTLA-4 umfasste, die
mit einer gekürzten
Form des menschlichen konstanten IgG1-Bereichs gekoppelt war (Linsley
et al(Id.). Vor kurzem exprimierten wir dieses CTLA-4-Ig-Fusionsprotein
im Säugetierexpressionsvektor
BLECH1, einem Derivat des Plasmids NEOSPLA (Barnett et al, in Antibody
Expression and Engineering, H.Y. Yang und T. Imanaka, Hgb., S. 27-40
(1995)). Ein CTLA-4 Ig codierendes 800 bp-Fragment wurde aus diesem
Vektor isoliert und zwischen der SacII- und der Bg1II-Stelle in Molly
eingefügt.
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Die
Herstellung von CTLA-4Ig-Molly und die Elektroporation in Desmond-Klon-15C9-CHO-Zellen wurden
so durchgeführt,
wie im vorhergehenden Beispiel in Bezug auf anti-CD20 beschrieben.
Zwanzig Elektroporationen wurden durchgeführt und wie zuvor beschrieben
in 96-Well-Kulturschalen plattiert. Achtzehn CTLA-4-exprimierende
Mulden wurden aus den 96-Well-Platten isoliert und zur 120 ml-Spinnstufe
weitergetragen. Um zu bestimmen, wie viele der homologen Gene zusätzliche
zufällige
Integranten enthielten, wurden danach an genomischer DNA, die aus
jedem dieser Klone isoliert wurde, Southern-Analysen durchgeführt. Die genomische DNA wurde
mit BgIII aufgeschlossen und mit einer PCR-generierten, Digoxygenin-markierten Sonde
auf den menschlichen konstanten IgG1-Bereich untersucht. Die Ergebnisse dieser
Analyse zeigten, dass 85% der CTLA-4-Klone ausschließlich homologe
Integranten sind; die restlichen 15% enthielten einen zusätzlichen
zufälligen
Integranten. Dieses Ergebnis bekräftigt die Erkenntnisse aus
der Expression des obenstehend besprochenen anti-CD20, wo 80% der
Klone einzelne homologe Integranten waren. Daher können wir
den Schuss ziehen, dass dieses Expressionssystem bei zumindest 80%
aller produzierten Klone in reproduzierbarer Weise einzelne zielgerichtete
homologe Integranten hervorbringt.
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Die
Expressionsstärken
reichten bei den homologen CTIA4-Ig-Klonen von 8-12 pg/Zelle/Tag.
Dies ist etwas höher
als der Bereich, der für
die obenstehend besprochenen anti-CD20-Antikörper- und anti-CD23-Antikörperklone
angegeben wurde. Wir hatten zuvor jedoch die Beobachtung gemacht,
dass eine Expression dieses Moleküls unter Verwendung des intronischen
Insertionsvektorsystems ebenfalls zu Expressionsstärken führte, die
erheblich höher
waren als jene, die bei Immunglobulinen zu erhalten sind. Wir sind
derzeit nicht in der Lage, eine Erklärung für diese Beobachtung zu liefern.
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BEISPiEL 7
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Das Abzielen von anti-CD20
auf eine alternative Desmond-markierte CHO-Zelllinie
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Wie
in einem vorhergehenden Abschnitt beschrieben, erhielten wir 5 Desmondmarkierte
Einzelkopie-CHO-Zelllinien (siehe 4 und 5).
Um zu zeigen, dass der Erfolg unserer Abzielungsstrategie nicht an
irgendeiner einzigartigen Eigenschaft des Desmond-Klons 15C liegt und
nicht nur auf diesen Klon beschränkt
ist, brachten wir anti=CD20-Molly
in den Desmond-Klon 9B2 ein (Bahn 6 in 4, Bahn
1 in 5). Die Herstellung der Molly-DNA und die Elektroparation
in Desmond 9B2 waren genauso wie im vorhergehenden Beispiel in Bezug
auf anti-CD20 beschrieben. Wir erhielten aus diesem Versuch einen
homologen Integranten. Dieser Klon wurde auf einen 120 ml-Spinnkolben
expandiert, wo er im Durchschnitt 1,2 pg anti-CD20/Ze1le/Tag produzierte.
Dies ist eine erheblich niedrigere Expression als jene, die wir
bei Molly, das auf Desmond 15C9 abgezielt hatte, beobachteten. Dies
war jedoch das erwartete Ergebnis, basierend auf unserer Northern- Analyse der Desmond-Klone.
Wie in 5 ersichtlich, sind die mRNA-Pegel aus Klon 9B2
erheblich niedriger als jene aus 15C9, was zeigt, dass die Stelle
in diesem Klon nicht so transcriptionsaktiv wie jene in 15C9 ist.
Daher beweist dieser Versuch nicht nur die Reproduzierbarkeit des
Systems – vermutlich
kann mit Molly auf jede markierte Desmond-Stelle abgezielt werden -, sondern bestätigt auch
die Northern-Daten, die besagen, dass die Stelle in Desmond 15C9
die am stärksten
transcriptionsaktive ist.