DE69827223T2

DE69827223T2 - Antiangiogene substanz zur behandlung von krebs, arthritis und netzhauterkrankungen

Info

Publication number: DE69827223T2
Application number: DE69827223T
Authority: DE
Inventors: Jack Henkin; P. Noel BOUCK; W. David DAWSON; J. Andrew SCHNEIDER
Original assignee: Abbott Laboratories; Northwestern University
Current assignee: Abbott Laboratories; Northwestern University
Priority date: 1997-03-17
Filing date: 1998-03-16
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2018-03-17
Also published as: JP2009001576A; CA2255661A1; WO1998041542A1; EP0918795B1; ATE280781T1; ES2231973T3; DK0918795T3; PT918795E; EP0918795A1; DE69827223D1; JP2001506671A; CA2255661C; JP4254972B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die nützlich zur Behandlung von Krankheitszuständen sind, die durch Angiogenese entstehen oder dadurch verschlimmert werden. Genauer ausgedrückt betrifft die Erfindung bestimmte Peptide, die Angiogenese hemmen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen umfassen, und die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments, um einen Patienten zu behandeln, der Anti-Angiogenese-Therapie benötigt.
Hintergrund der Erfindung
Angiogenese ist der fundamentale Vorgang, durch den neue Blutgefäße gebildet werden, und sie ist erforderlich für eine Vielzahl normaler Körperfunktionen (wie zum Beispiel Fortpflanzung, Entwicklung und Wundheilung). Obwohl der Vorgang nicht vollständig verstanden wird, wird angenommen, dass er eine komplexe Wechselwirkung von Molekülen mit sich bringt, die das Wachstum von Endothelzellen, den Hauptzellen der kapillaren Blutgefäße, sowohl stimulieren als auch hemmen. Unter normalen Bedingungen scheinen diese Moleküle das Mikrogefäßsystem über längere Zeiträume, die wochenlang oder in manchen Fällen jahrzehntelang dauern können, in einem Ruhezustand (d. h. einem Zustand ohne kapillarem Wachstum) zu halten. Falls jedoch erforderlich (z. B. während der Wundheilung) können sich dieselben Zellen innerhalb eines Zeitraums von 5 Tagen schneller Wachstums und Umsatz unterziehen. (Folkman, J. und Shing, Y., The Journal of Biological Chemistry, 267 (16): 10931–10934, und Folkman, J. und Klagsbrun, M., Science, 235: 442–447 (1987)).
Obwohl die Angiogenese unter normalen Bedingungen ein hochgradig regulierter Vorgang ist, werden viele Krankheiten (bezeichnet als "angiogene Krankheiten") durch andauernde nicht regulierte Angiogenese angetrieben. Anders ausgedrückt, kann nicht regulierte Angiogenese entweder direkt eine bestimmte Krankheit verursachen oder einen vorhandenen Krankheitszustand verschlimmern. Zum Beispiel ist Neovaskularisierung von Augen als die häufigste Ursache von Erblindung genannt worden und bestimmt ungefähr 20 Augenkrankheiten. Bei bestimmten bestehenden Erkrankungen wie zum Beispiel Arthritis dringen neu gebildete Kapillargefäße in die Gelenke ein und zerstören den Knorpel. Bei Diabetes dringen neue Kapillaren, die in der Netzhaut gebildet werden, in den Glaskörper ein, bluten und erzeugen Blindheit. Wachstum und Metastasierung von soliden Tumoren sind ebenfalls von der Angiogenese abhängig (Folkman, J., Cancer Research, 46: 467–473 (1986), Folkman, J., Journal of the National Cancer Institute, 82: 4–6 (1989)). Es ist zum Beispiel gezeigt worden, dass Tumore, die auf mehr als 2 mm anwachsen, ihre eigene Blutversorgung erhalten müssen und dies tun, indem sie das Wachstum neuer Kapillargefäße induzieren. Sobald diese neuen Blutgefäße in den Tumor eingebettet werden, bilden sie ein Mittel für Tumorzellen, in den Kreislauf einzutreten und an entfernte Stellen, wie zum Beispiel Leber, Lunge oder Knochen, zu metastasieren (Weidner, N., et al., The New England Journal of Medicine, 324 (1): 1–8 (1991)).
Thrombospondin-1 (TSP1, MW 450.000) ist ein großes modulares Matrixprotein, das die Neovaskularisierung in vivo hemmt (Good, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, 6624 (1980)). Der Großteil der antiangiogenen Wirkung von TSP1 sitzt in der zentralen 70-kD-Stielregion. Synthetische Peptide wurden hergestellt, die Sequenzen imitieren, die im Properdin-ähnlichen Wiederholungsbereich 1 der zentralen Stielregion des TSP1-Moleküls gefunden wurden. Eines dieser Peptide, das so genannte MaIII, ist ein 19-mer mit der Formel Ser-Pro-Trp-Ser-Ser-Ala-Ser-Val-Thr-Ala-Gly-Asp-Gly-Val-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg (Tolsma, et al., J. Cell. Biol., 122, 497 (1993)). Das MaIII-Peptid blockierte die Neovaskularisierung in vivo in der Rattenhornhaut und hemmte die Migration kultivierter Endothelzellen mit einem ED₅₀ von ungefähr 1 μM.
Obwohl zurzeit mehrere Angiogeneseinhibitoren zur Verwendung bei der Behandlung angiogener Krankheiten entwickelt werden (Gasparini, G. und Harris, A. L., J Clin Oncol 13 (3): 765–782, (1995)), sind mit mehreren dieser Verbindungen Nachteile verbunden. Zum Beispiel ist Suramin ein wirksamer Angiogeneseinhibitor, aber er verursacht (in Dosen, die erforderlich sind, um Antitumorwirkung zu erzielen) beim Menschen eine schwere systemische Toxizität. Andere Verbindungen, wie zum Beispiel Retinoide, Interferone und Antiöstrogene, sind sicher für den menschlichen Gebrauch, haben jedoch nur eine schwache antiangiogene Wirkung. Noch andere Verbindungen können schwierig oder kostenintensiv herzustellen sein. Kurze Peptide sind relativ einfach herzustellen und stellen eine kosteneffektive Möglichkeit dar, Krankheitszustände zu behandeln, bei denen Angiogenese eine Rolle spielt, und gezielte Angiogeneseinhibitoren zu produzieren.
Zusammenfassung der Erfindung
In ihrer Hauptausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
worin T abwesend oder gewählt ist aus einer N-Schutzgruppe und einem Polypeptid mit bis zu 12 Aminosäureresten, die wahlweise mit einer N-Schutzgruppe terminiert sind; U gewählt ist aus Arg und Arg-NR¹R², worin R¹ und R² unabhängig gewählt sind aus Wasserstoff und Alkyl von ein bis vier Kohlenstoffatomen; und Z ist 1– 12 Aminosäurereste, die wahlweise mit einer N-Schutzgruppe terminiert sind, worin mindestens einer der Aminosäurereste ein D-Aminosäurerest ist.
Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben die Formel T-Gly-Val-D-Ile-Thr-Arg-Ile-U, worin T abwesend ist oder gewählt ist aus N-Schutzgruppe und einem Polypeptid von bis zu 12 Aminosäureresten, die wahlweise mit N-Schutzgruppe bedeckt sind, und U gewählt ist aus Arg und Arg-NR¹R².
Stärker bevorzugte Verbindungen sind solche mit der Formel T-Gly-Val-D-Ile-Thr-Arg-Ile-U, worin T abwesend oder Acetyl ist und U gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arg, Arg-NH₂ und Arg-NHCH₂CH₃.
In einer anderen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung Retroisomere der oben genannten Peptide oder Retro-Inverso-Isomere der oben genannten Peptide oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon. Exemplarische Retro- und Retro-Inverso-Isomere werden gewählt aus der Gruppe bestehend aus
worin V abwesend oder eine N-Schutzgruppe ist, W gewählt ist aus D-Arg und D-Arg-NR¹R², X abwesend oder eine N-Schutzgruppe ist und Y gewählt ist aus Gly und Gly-NR¹R².
In einer anderen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten, der eine Antiangiogenese-Therapie benötigt, die ein oben definiertes Peptid in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform bietet die vorliegende Erfindung die Verwendung eines oben definierten Peptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der Antiangiogenese-Therapie benötigt. Eine solche Therapie umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Peptids wie oben definiert an den Patienten.
In einer weiteren Ausführungsform bietet die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Krebs, Arthritis, Psoriasis, Angiogenese des Auges im Zusammenhang mit Infektion oder chirurgischem Eingriff, Makuladegeneration und diabetischer Retinopathie, ein Peptid wie oben definiert in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassend.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung die Verwendung eines oben definierten Peptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Krebs, Arthritis, Makuladegeneration und diabetischer Retinopathie. Eine solche Behandlung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Peptids wie oben definiert an den Patienten.
Ein Peptid mit den Formeln I und IV kann in einem Verfahren der Isolierung des TSP-1-Rezeptors aus Endothelzellen verwendet werden, das die Bindung eines Peptids mit den Formeln I und IV an den Rezeptor, die Isolierung des Peptidrezeptorkomplexes und die Reinigung des Rezeptors umfasst.
Detaillierte Beschreibung
Der Begriff "Alkyl" bezeichnet eine monovalente Gruppe, die von einem gerad- oder verzweigtkettigen gesättigten Kohlenwasserstoff durch das Entfernen eines einzelnen Wasserstoffatoms abgeleitet wird. Alkylgruppen werden beispielhaft gekennzeichnet durch Methyl, Ethyl, n- und iso-Propyl, n-, sec-, iso- und tert-Butyl und dergleichen.
Der Begriff "N-Schutzgruppe", wie hierin verwendet, bezeichnet eine leicht zu entfernende Gruppe, von der im Fachgebiet bekannt ist, dass sie eine Aminogruppe vor unerwünschter Reaktion während synthetischer Verfahren schützt und selektiv entfernt werden kann. Die Verwendung von N-Schutzgruppen zum Schutz von Gruppen vor unerwünschten Reaktionen während eines synthetischen Verfahrens ist im Fachgebiet gut bekannt, und viele solche Schutzgruppen sind bekannt, siehe zum Beispiel T. H. Greene und P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York (1991). Beispiele für N-Schutzgruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Acyl gruppen, einschließlich Acetyl, Trifluoracetyl, Acylisothiocyanat, Aminocaproyl, Benzoyl und dergleichen, und Acyloxygruppen, einschließlich t-Butyloxycarbonyl (BOC) und Carbobenzyloxy und dergleichen.
Der Begriff "Retroisomer", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Peptid, in dem L- und D-Aminosäuren mit den Formeln I und IV vertauscht wurden, d. h., D-Aminosäuren wurden durch L-Aminosäuren ersetzt und L-Aminosäuren wurden durch D-Aminosäuren ersetzt. Eine exemplarisches Retroisomer hat die Formel II. Der Begriff "Retroisomere" schließt Fragmente solcher Isomere ein.
Der Begriff "Retro-Inverso-Isomer", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Peptid, in dem (i) die L- und D-Aminosäuren mit den Formeln I und IV vertauscht wurden, wie im Retroisomer, und (ii) die Sequenz, wenn sie vom N-Terminus zum C-Terminus gelesen wird, vertauscht ist. Ein exemplarisches Retro-Inverso-Isomer hat die Formel III. Der Begriff "Retro-Inverso-Isomere" schließt Fragmente solcher Isomere ein.
Mit "pharmazeutisch verträgliches Salz" sind solche Salze gemeint, die innerhalb des Bereichs der fundierten medizinischen Beurteilung geeignet sind zur Verwendung im Kontakt mit den Geweben von Menschen und niederen Tieren ohne unerwünschte Toxizität, Reizung, allergische Reaktion und dergleichen, und die einem angemessenen Nutzen-Risikoverhältnis entsprechen. Pharmazeutisch verträgliche Salze sind im Fachgebiet gut bekannt. Zum Beispiel beschreiben S. M Berge, et al. pharmazeutisch verträgliche Salze im Detail in J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66: 1–19. Die Salze können in situ während der abschließenden Isolation und Reinigung der Verbindungen der Erfindung oder separat durch Reaktion der freien Basenfunktion mit einer geeigneten organischen Säure hergestellt werden. Repräsentative Säurezusatzsalze schließen folgendes ein: Acetat, Adipat, Alginat, Ascorbat, Aspartat, Benzensulfonat, Benzoat, Bisulfat, Borat, Butyrat, Camphorat, Camphersulfonat, Citrat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Fumarat, Glucoheptonat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptonat, Hexanoat, Hydrobromid, Hydrochlorid, Hydrojodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactobionat, Lactat, Laurat, Laurylsulfat, Malat, Maleat, Malonat, Methansulfonat, 2-Naphthalensulfonat, Nicotinat, Nitrat, Oleat, Oxalat, Palmitat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Phosphat, Pikrat, Pivalat, Propionat, Stearat, Succinat, Sulfat, Tartrat, Thiocyanat, Toluensulfonat, Undecanoat, Valeratsalze und dergleichen. Repräsentative Alkali oder Erdalkalimetallsalze schließen folgendes ein: Natrium, Lithium, Kalium, Kalzium, Magnesium und dergleichen, sowie nicht toxische Ammonium-, quaternäre Ammonium- und Aminkationen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Ammonium, Tetramethylammonium, Tetraethylammonium, Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Triethylamin, Ethylamin und dergleichen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "pharmazeutisch verträglicher Ester" Ester, die in vivo hydrolysieren und solche einschließen, die im menschlichen Körper schnell abgebaut werden, um die Stammverbindung oder ein Salz davon zu hinterlassen. Geeignete Estergruppen schließen zum Beispiel solche ein, die von pharmazeutisch verträglichen aliphatischen Carbonsäuren abgeleitet sind, insbesondere Alkan-, Alken-, Cycloalkan- und alkandionische Säuren, in denen jeder Alkyl- oder Alkenylanteil vorteilhafterweise nicht mehr als 6 Kohlenstoffatome hat. Beispiele für spezielle Ester schließen Formiate, Acetate, Propionate, Butyrate, Acrylate und Ethylsuccinate ein.
Der Begriff "pharmazeutisch verträgliche Prodrugs", wie hierin verwendet, bezeichnet solche Prodrugs der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die innerhalb des Bereichs der fundierten medizinischen Beurteilung geeignet sind zur Verwendung im Kontakt mit den Geweben von Menschen und niederen Tieren ohne unerwünschte Toxizität, Reizung, allergische Reaktion und dergleichen, in Übereinstimmung mit einem angemessenen Nutzen-Risikoverhältnis und wirksam für ihren beabsichtigten Gebrauch, sowie die zwitterionischen Formen, soweit möglich, der Verbindungen der Erfindung. Der Begriff "Prodrug" bezeichnet Verbindungen, die in vivo schnell umgewandelt werden, um die Stammverbindung mit der obigen Formel zu ergeben, zum Beispiel durch Hydrolyse im Blut. Eine ausführliche Abhandlung ist in T. Higuchi und V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Band 14 der A. C. S. Symposium Series, und in Edward B. Roche, Hrsg., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, zu finden.
Soweit nicht durch ein "D"-Präfix anders gekennzeichnet ist die Stereochemie des α-Kohlenstoffs der Aminosäuren und Aminoacylreste in Peptiden, die in dieser Spezifikation und den beigefügten Ansprüchen beschrieben sind, die natürliche oder "L"-Konfiguration. Die Cahn-Ingold-Prelog "R"- und "S"-Bezeichnungen werden benutzt, um die Stereochemie chiraler Zentren bei bestimmten Acylsubstituenten am N-Terminus der Peptide dieser Erfindung zu bezeichnen. Die Bezeichnung "R, S" soll eine racemische Mischung der beiden enantiomeren Formen bezeichnen. Diese Nomenklatur folgt derjenigen, die in R. S. Cahn, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 5, 385–415 (1966) beschrieben ist.
Größtenteils richten sich die Namen natürlich vorkommender und nicht natürlich vorkommender Aminoacylreste, die hierin verwendet werden, nach den Namenskonventionen, die von der IUPAC Commission on the Nomenclature of Organic Chemistry und der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature vorgeschlagen werden, wie in "Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendations, 1974)" Biochemistry, 14 (2), (1975) ausgeführt. Soweit die Namen und Abkürzungen von Aminosäuren und Aminoacylresten, die in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, von diesen Vorschlägen abweichen, werden sie dem Leser im folgenden erläutert.
Es ist im Fachgebiet gut bekannt, dass Modifikationen und Änderungen in der Struktur eines Polypeptids vorgenommen werden können, ohne die biologische Wirkungsweise dieses Peptids wesentlich zu verändern. Zum Beispiel können in einem bestimmten Polypeptid bestimmte Aminosäuren ohne nennenswerten Funktionsverlust durch andere Aminosäuren ersetzt werden. Bei der Durchführung solcher Änderungen können Substitutionen gleicher Aminosäurereste auf der Grundlage der relativen Ähnlichkeit von Seitenkettensubstituenten vorgenommen werden, zum Beispiel deren Größe, Ladung, Hydrophobie, Hydropholie und dergleichen.
Wie im US-Patent Nr. 4,554,101 ausgeführt, wurden den Aminosäureresten die folgenden Hydrophiliewerte zugeordnet:
Arg (+3.0); Lys (+3.0); Asp(+3.0); Glu(+3.0); Ser(+0.3); Asn(+0.2); Gln(+0.2); Gly(0); Pro(–0.5); Thr(–0.4); Ala(–0.5); His(–0.5); Cys(–1.0); Met(–1.3); Val(–1.5)-; Leu(–1.8); Ile(–1.8); Tyr(–2.3); Phe(–2.5); and Trp(–3.4).
Es versteht sich, dass ein Aminosäurerest durch einen anderen ersetzt werden kann, der einen ähnlichen Hydrophiliewert hat (z. B. innerhalb eines Wertes von plus oder minus 2,0), und dass nach wie vor ein biologisch äquivalentes Polypeptid gewonnen werden kann.
In ähnlicher Weise können Substitutionen auf der Grundlage von Ähnlichkeit im hydropathischen Index vorgenommen werden. Jedem Aminosäurerest wurde auf der Grundlage seiner Hydrophobie und Ladungseigenschaften ein hydropathischer Index zugeordnet. Diese Werte des hydropathischen Index sind:
Ile(+4.5); Val(+4.2); Leu(+3.8); Phe(+2.8); Cys(+2.5); Met(+1.9); Ala(+1.8); Gly(–0.4); Thr(–0.7); Ser(–0.8); Trp(–0.9); Tyr(–1.3); Pro(–1.6); His(–3.2); Glu(–3.5); Gln(–3.5); Asp(–3.5); Asn(–3.5); Lys(–3.9); and Arg(–4.5).
Bei der Durchführung einer Substitution auf der Grundlage des hydropathischen Index wird ein Wert von innerhalb plus oder minus 2,0 bevorzugt.
Verbindungen, die als innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet werden, schließen folgendes ein, sind aber nicht darauf beschränkt:
Auswirkung der Verbindungen der Erfindung auf Endothelzell-Migration
Die Wirkung der Peptide der Erfindung auf Endothelzell-Migration wurde in vitro mit Hilfe des Endothelzell-Migrationsassays bestimmt. Dieser Assay wurde im wesentlichen durchgeführt wie von Polverini, P. J. et al., Methods Enzymol, 198: 440–450 (1991) beschrieben. Kurz ausgeführt wurden Kapillar-(Nebennieren-)Endothelzellen vom Rind (bovine capillary endothelial cells, BCE, geliefert von Judah Folkman, Harvard University Medical School) über Nacht in DMEM "ausgehungert", das 0,1% Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA) enthielt. Die Zellen wurden dann mit Trypsin geerntet und in DMEM mit 0,1% BSA bei einer Konzentration von 1,5 × 10⁶ Zellen/ml erneut suspendiert. Die Zellen wurden auf den Boden einer modifizierten Boyden-Kammer mit 48 Vertiefungen (Nucleopore Corporation, Cabin John, MD) gegeben. Die Kammer wurde zusammengebaut und umgekippt und die Zellen wurden 2 Stunden lang bei 37°C an Polycarbonat-Chemotaxis-Membranen (Porengröße 5 μm) haften gelassen, die über Nacht in 0,1% Gelatine eingeweicht und getrocknet worden waren. Die Kammer wurde dann erneut umgekippt und Testverbindungen wurden in die Vertiefungen der oberen Kammer gegeben (zu einem Gesamtvolumen von 50 μl); die Vorrichtung wurde dann für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Membranen wurden entnommen, fixiert und gefärbt (DiffQuick, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) und die Anzahl von Zellen pro 10 Hochkraftfeldern, die in die obere Kammer migriert waren, wurde gezählt. Die Hintergrundmigration zu DMEM + 0,1% BSA wurde subtrahiert und die Daten wurden angegeben als die Anzahl von Zellen pro 10 Hochkraftfelder (400X), die migriert waren, oder, wenn Ergebnisse von mehreren Experimenten kombiniert wurden, als der Prozentsatz maximaler Migration im Vergleich zu einer gleichzeitigen Positivkontrolle. Die Verbindungen der Erfindung hemmen die Zellmigration, wie in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 Wirkung der Verbindungen der Erfindung auf Endothelzell-Migration
Die Hemmung von Angiogenese in vivo wurde mit Hilfe eines Ratten-Hornhaut-Neovaskularisierungsassays gemessen. Dementsprechend wurden 6%ige Hydronpellets, die Peptid alleine oder in Kombination mit 0,15 μM bFGF enthielten, in Rattenhornhäute 1–1,5 mm vom Limbus entfernt implantiert. Nach 7 Tagen wurden die Ratten getötet, mit Kolloidkohlenstoff perfundiert, um die Gefäße sichtbar zu machen, und die Hornhäute wurden entnommen. Starkes Einwachsen der Gefäße wurde als positive angiogene Reaktion bewertet. Induktionskontrolle zeigt eine Reaktion auf 0,15 μM bFGF allein an. Negativkontrollen wurden gegenüber 0,1% BSA durchgeführt, was nicht zum Einwachsen von Gefäßen führt. Die Hemmung von Neovaskularisierung durch Verbindungen der Erfindung ist in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2 Hemmung von Rattenhornhaut-Neovaskularisierung durch die Verbindungen der Erfindung
Die Verbindungen der Erfindung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf diejenigen, die in den Beispielen angegeben sind, haben antiangiogene Wirkung. Als Angiogeneseinhibitoren sind solche Verbindungen nützlich bei der Behandlung sowohl von primären als auch von metastatischen soliden Tumoren, einschließlich Karzinomen der Brust, des Dickdarms, des Rektums, der Lunge, des Oropharynx, des Hypopharynx, der Speiseröhre, des Magens, der Bauchspeicheldrüse, der Leber, der Gallenblase, der Gallenwege, des Dünndarms, der Harnwege (einschließlich Niere, Blase und Urothel), des weiblichen Genitaltrakts (einschließlich Cervix, Uterus und Eierstöcken, ebenso wie Choriokarzinoma und Throphoblastentumoren), des männlichen Genitaltrakts (einschließlich Prostata, Samenblasen, Hoden und Keimzelltumoren), endokriner Drüsen (einschließlich der Schilddrüse, Nebenniere und Hypophyse) und der Haut, sowie Hämangiome, Melanome, Sarkome (einschließlich solcher, die aus Knochen und Weichteilen entstehen, ebenso wie Kaposi-Sarkom) und Tumoren des Gehirns, der Nerven, der Augen und Hirnhäute (einschließlich Astrozytome, Gliome, Glioblastome, Retinoblastome, Neurome, Neuroblastome, Schwannome und Meningiome). Solche Verbindungen können auch nützlich sein bei der Behandlung solider Tumore, die aus hämatologischen Krebsarten entstehen, wie zum Beispiel Leukämien (d. h., Chlorome, Plasmozytome und die Plaques und Tumore von Mycosis fungoides und kutaner T-Zell-Lymphome/Leukämie), sowie bei der Behandlung von Lymphomen (sowohl Hodgkin als auch Non-Hodgkin-Lymphomen). Zusätzlich können diese Verbindungen oder Gene, die deren Expression kodieren, nützlich sein bei der Vorbeugung von Metastasen von den oben beschriebenen Tumoren, entweder, wenn sie alleine verwendet werden, oder in Kombination mit Bestrahlung und/oder anderen Chemotherapeutika.
Weitere Anwendungen schließen die Behandlung und Prophylaxe von Autoimmunkrankheiten ein, wie zum Beispiel rheumatoider, Immun- und degenerativer Arthritis; verschiedener Augenkrankheiten, wie zum Beispiel Retinopathia diabetica, Frühgeborenen-Retinopathie, Hornhauttransplantatabstoßung, retrolentaler Fibroplasie, neovaskulärem Glaukom, Rubeose, retinaler Neovaskularisierung aufgrund von Makuladegeneration, Hypoxie, Angiogenese im Auge im Zusammenhang mit Infektion oder nach chirurgischem Eingriff, und anderen anormalen Neovaskularisierungszuständen des Auges; Hautkrankheiten, wie zum Beispiel Psoriasis; Blutgefäßkrankheiten, wie zum Beispiel Hämangiomen, und Kapillarproliferation innerhalb atherosklerotischer Plaques; Osler-Rendu-Weber-Syndrom; Myocard-Angiogenese; Plaque-Neovaskularisierung; Teleangiektasie, Blutergelenken; Angiofibrom und Wundgranulation. Andere Anwendungen schließen die Behandlung von Krankheiten ein, die durch exzessive oder anormale Stimulation von Endothelzellen gekennzeichnet sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Darmadhäsionen, Morbus Crohn, Atherosklerose, Sklerodermie und hypertropher Narben, d. h., Keloide. Eine andere Verwendung ist die Verwendung als Mittel zur Empfängnisverhütung durch Hemmung der Ovulation und der Plazentabildung. Die Verbindungen der Erfindung sind ebenfalls nützlich bei der Behandlung von Krankheiten mit Angiogenese als pathologischer Folge, wie zum Beispiel Katzenkratzkrankheit (Rochele minalia quintosa) und Geschwüren (Helicobacter pylori). Die Verbindungen der Erfindung sind ebenfalls hilfreich zur Verringerung von Blutungen durch Verabreichung vor Operationen, insbesondere zur Behandlung von operativ entfernbaren Tumoren.
Die Verbindungen der Erfindung können in Kombination mit anderen Verbindungen und Verfahren zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Tumor konventionell durch Operation, Bestrahlung oder Chemotherapie behandelt werden, in Verbindung mit einem Peptid der vorliegenden Erfindung, und dann kann anschließend dem Patienten ein Peptid der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, um die Inaktivität von Mikrometastasen zu verlängern und das Wachstum eventueller primärer Resttumore zu stabilisieren und zu hemmen. Weiterhin können die Verbindungen der Erfindung mit pharmazeutisch verträglichen Bindemitteln und wahlweise mit Matrizen mit verzögerter Freisetzung, wie zum Beispiel biologisch abbaubaren Polymeren, kombiniert werden, um therapeutische Zusammensetzungen zu bilden.
Eine Matrix mit verzögerter Freisetzung, wie hierin verwendet, ist eine Matrix aus Materialien, normalerweise Polymeren, die durch enzymatische oder Säure-Basen-Hydrolyse oder durch Auflösung abbaubar sind. Sobald sie in den Körper eingeführt wird, wirken Enzyme und Körperflüssigkeiten auf die Matrix ein. Eine Matrix mit verzögerter Freisetzung wird vorzugsweise aus biokompatiblen Materialien ausgewählt, wie zum Beispiel Liposomen, Polylactiden (Polymilchsäure), Polyglycoliden (Polymer von Glycolsäure), Polylactid-co-glycolid (Copolymere von Milchsäure und Glycolsäure), Polyanhydriden, Poly(ortho)estern, Polypeptiden, Hyaluronsäure, Kollagen, Chondroitinsulfat, Carbonsäuren, Fettsäuren, Phospholipiden, Polysacchariden, Nucleinsäuren, Polyaminosäuren, Aminosäuren, wie zum Beispiel Phenylalanin, Tyrosin, Isoleucin, Polynucleotiden, Polyvinylpropylen, Polyvinylpyrrolidon und Silikon. Eine bevorzugte biologisch abbaubare Matrix ist eine Matrix aus einem von entweder Polylactid, Polyglycolid oder Polylactid-co-glycolid (Copolymere von Milchsäure und Glycolsäure).
Bei Verwendung in den obigen oder anderen Behandlungen kann eine therapeutisch wirksame Menge einer der Verbindungen der vorliegenden Erfindung in reiner Form oder, dort, wo solche Formen existieren, in pharmazeutisch verträglicher Salzform verwendet werden. Mit einer "therapeutisch wirksamen Menge" der Verbindung der Erfindung ist eine Menge der Verbindung gemeint, die ausreicht, um eine angiogene Krankheit zu behandeln (zum Beispiel, um Tumorwachstum zu begrenzen oder Tumormetastasierung zu verlangsamen oder zu blockieren), bei einem vernünftigen Nutzen-Risikoverhältnis, das auf jede medizinische Behandlung anwendbar ist. Es versteht sich jedoch, dass über den Gesamttagesbedarf an Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vom konsultierenden Arzt innerhalb des Bereichs der fundierten medizinischen Beurteilung entschieden wird. Die spezifische therapeutisch wirksame Dosis für einen bestimmten Patienten hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, die folgendes einschließen: die behandelte Erkrankung, die Schwere der Erkrankung, die Wirkung der spezifischen verwendeten Verbindung, die spezifische verwendete Zusammensetzung, das Alter, Körpergewicht, den allgemeinen Gesundheitszustand, das Geschlecht und die Ernährung des Patienten; die Verabreichungszeit, den Verabreichungsweg und die Ausscheidungsgeschwindigkeit der speziellen verwendeten Verbindung; die Dauer der Behandlung, Medikamente, die in Kombination oder gleichzeitig mit der spezifischen verwendeten Verbindung benutzt werden, und ähnliche Faktoren, die im medizinischen Fachgebiet gut bekannt sind. Es liegt zum Beispiel innerhalb des Standes der Technik, Dosierungen der Verbindung bei Dosen zu beginnen, die niedriger sind als erforderlich, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen, und die Dosierung allmählich zu erhöhen, bis die gewünschte Wirkung eintritt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in Form von Salzen verwendet werden, die von anorganischen oder organischen Säuren abgeleitet sind. Diese Salze schließen folgendes ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Acetat, Adipat, Alginat, Citrat, Aspartat, Benzoat, Benzensulfonat, Bisulfat, Butyrat, Camphorat, Camphorsulfonat, Digluconat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Fumarat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydrojodid, 2-Hydroxy-ethansulfonat (Isethionat), Lactat, Maleat, Methansulfonat, Nicotinat, 2-Naphthalensulfonat, Oxalat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Pikrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Phosphat, Glutamat, Bicarbonat, p-Toluensulfonat und Undecanoat. Wasser- oder öllösliche oder -dispergierbare Produkte werden so gewonnen.
Beispiele für Säuren, die verwendet werden können, um pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze zu bilden, schließen solche anorganischen Säuren ein wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure und solche organischen Säuren wie Maleinsäure, Bernsteinsäure und Citronensäure. Andere Salze schließen Salze mit Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen ein, wie zum Beispiel Natrium, Kalium, Kalzium oder Magnesium, oder mit organischer Basis. Bevorzugte Salze der Verbindungen der Erfindung schließen Phosphat, Tris und Acetat ein.
Die Gesamttagesdosis der Verbindungen dieser Erfindung, die an einen Menschen oder an niederes Tier verabreicht werden kann, kann von ungefähr 0,001 bis ungefähr 1 mg/kg der Körpermasse des Patienten pro Tag reichen. Falls gewünscht, kann die wirksame Tagesdosis für Verabreichungszwecke in mehrere Dosen unterteilt werden; folglich können Einzeldosiszusammensetzungen solche Mengen oder Teiler davon enthalten, um die Tagesdosis zu bilden.
Alternativ kann eine Verbindung der vorliegenden Erfindung als pharmazeutische Zusammensetzungen verabreicht werden, die die betreffende Verbindung in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Bindemitteln enthalten. Ein pharmazeutisch verträglicher Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Bindemittel bezieht sich auf einen nicht toxischen, festen, halbfesten oder flüssigen Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, Verkapselungsmaterial oder eine Hilfsformulierung beliebiger Art. Die Verbindungen können parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, topisch (wie durch Pulver, Salben, Tropfen oder transdermale Pflaster), rektal oder bukkal verabreicht werden. Der Begriff "parenteral", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Verabreichungswege, die intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrasternale, subkutane und intraartikuläre Injektion und Infusion einschließen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur parenteralen Injektion umfassen pharmazeutisch verträgliche sterile wässerige oder nicht wässerige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emul sionen sowie sterile Pulver zur Rekonstitution in sterile injizierbare Lösungen oder Dispersionen direkt vor dem Gebrauch. Beispiele für geeignete wässerige und nicht wässerige Träger, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel oder Bindemittel schließen folgendes ein: Wasser, Ethanol, Polyole (wie zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol, Polyethylenglycol und dergleichen), Carboxymethylzellulose und geeignete Mischungen davon, pflanzliche Öle (wie zum Beispiel Olivenöl) und injizierbare organische Ester, wie zum Beispiel Ethyloleat. Gute Fließfähigkeit kann zum Beispiel durch die Verwendung von Beschichtungsmaterialien aufrechterhalten werden, wie zum Beispiel Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle von Dispersionen und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Stoffen.
Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsstoffe enthalten, wie zum Beispiel Konservierungsstoffe, Benetzungsmittel, Emulgatoren und Dispergiermittel. Die Wirkung von Mikroorganismen kann verhindert werden durch das Einschließen verschiedener antibakterieller und antifungaler Mittel, zum Beispiel Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen. Es kann auch wünschenswert sein, isotonische Mittel einzuschließen, wie zum Beispiel Zucker, Natriumchlorid und dergleichen. Verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form kann erzielt werden durch das Einschließen von Mitteln, welche die Absorption verzögern, wie zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
Injizierbare Depotformen werden hergestellt durch das Bilden mikroeingekapselter Matrizen des Arzneimittels in biologisch abbaubaren Polymeren, wie zum Beispiel Polylactid-Polyglycolid, Poly(orthoestern) und Poly(anhydriden). Je nach dem Verhältnis von Arzneimittel zu Polymer und der Art des jeweils verwendeten Polymers kann die Geschwindigkeit der Arzneimittelfreisetzung kontrolliert werden. Depotinjizierbare Formulierungen werden auch hergestellt durch Einschließen des Arzneistoffs in Liposomen oder Mikroemulsionen, die mit Körpergeweben verträglich sind.
Die injizierbaren Formulierungen können sterilisiert werden, zum Beispiel durch Filtration durch einen Filter, der Bak terien zurückhält, oder durch das Einbauen von Sterilisationsmitteln in Form steriler fester Zusammensetzungen, die in sterilem Wasser oder einem anderen sterilen injizierbaren Medium direkt vor dem Gebrauch aufgelöst oder dispergiert werden können.
Topische Verabreichung schließt das Auftragen auf die Haut oder Schleimhaut, einschließlich Oberflächen der Lunge und des Auges, ein. Zusammensetzungen zur topischen Verabreichung, einschließlich derjenigen zur Inhalation, können als trockenes Pulver hergestellt werden, das unter Druck oder nicht unter Druck gesetzt werden kann. Bei Pulverzusammensetzungen, die nicht unter Druck gesetzt wurden, kann der Wirkstoff in fein aufgeteilter Form, gemischt mit einem größeren pharmazeutisch verträglichen inerten Träger, verwendet werden, der Partikel mit einem Durchmesser von zum Beispiel bis zu 100 Mikrometern umfaßt. Geeignete inerte Träger schließen Zucker, wie zum Beispiel Lactose, ein. Vorzugsweise haben mindestens 95 Gewichtsprozent der Partikel des Wirkstoffs eine effektive Partikelgröße im Bereich von 0,01 bis 10 Mikrometern.
Alternativ kann die Zusammensetzung unter Druck gesetzt werden und ein komprimiertes Gas, wie zum Beispiel Stickstoff, oder ein verflüssigtes Gas-Treibmittel enthalten. Das verflüssigte Treibmittel und die gesamte Zusammensetzung sind vorzugsweise derart, dass sich der Wirkstoff darin nicht in substantiellem Ausmaß auflöst. Die unter Druck gesetzte Zusammensetzung kann auch einen grenzflächenaktiven Stoff enthalten, wie zum Beispiel einen flüssigen oder festen nicht ionischen oberflächenaktiven Stoff, oder sie kann ein fester anionischer oberflächenaktiver Stoff sein. Es wird bevorzugt, den festen anionischen oberflächenaktiven Stoff in Form eines Natriumsalzes zu verwenden.
Eine weitere Form topischer Verabreichung ist Verabreichung auf das Auge. Eine Verbindung der Erfindung wird in einem pharmazeutisch verträglichen ophthalmischen Bindemittel geliefert, so dass die Verbindung in Kontakt mit der Augenoberfläche gehalten wird, und zwar für einen Zeitraum, der es der Verbindung ermöglicht, in die Hornhaut und inneren Bereiche des Auges einzudringen, wie zum Beispiel die Vorderkammer, Hinterkammer, den Glaskörper, das Augenkammerwasser, die Glaskörperflüssigkeit, Hornhaut, Iris-un Ziliarkörper, Linse, Aderhaut/Netzhaut und Lederhaut. Das pharmazeutisch verträgliche ophthalmische Bindemittel kann zum Beispiel eine Salbe, ein pflanzliches Öl oder ein Verkapselungsmaterial sein. Alternativ können die Verbindungen der Erfindung direkt in die Glaskörperflüssigkeit und das Augenkammerwasser injiziert werden.
Zusammensetzungen zur rektalen oder vaginalen Verabreichung sind vorzugsweise Suppositorien, die hergestellt werden können durch Mischen der Verbindungen dieser Erfindung mit geeigneten nicht reizenden Bindemitteln oder Trägern, wie zum Beispiel Kakaobutter, Polyethylenglycol oder einem Suppositorienwachs, die bei Raumtemperatur fest, aber bei Körpertemperatur flüssig sind und daher im Rektum oder der Vaginalhöhle schmelzen und den Wirkstoff freisetzen.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Form von Liposomen verabreicht werden. Wie im Fachgebiet bekannt, werden Liposome im allgemeinen von Phospholipiden oder anderen Lipiden abgeleitet. Liposome werden von mono- oder multi-lamellaren hydrierten Flüssigkristallen gebildet, die in einem wässerigen Medium dispergiert werden. Jedes nicht toxische, physiologisch verträgliche und metabolisierbare Lipid, das in der Lage ist, Liposome zu bilden, kann verwendet werden. Die vorliegenden Zusammensetzungen in Liposomform können zusätzlich zu einer Verbindung der vorliegenden Erfindung Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Bindemittel und dergleichen enthalten. Die bevorzugten Lipide sind die Phospholipide und Phosphatidylcholine (Lecithine), sowohl natürliche als auch synthetische. Verfahren zum Bilden von Liposomen sind im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Band XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), Seite 33 und folgende.
Obwohl die Verbindungen der Erfindung als einziger pharmazeutischer Wirkstoff verabreicht werden können, können sie auch in Kombination mit einem oder mehreren Stoffen verwendet werden, die herkömmlicherweise zur Behandlung von angiogenen Krankheiten an Patienten verabreicht werden. Zum Beispiel haben die Verbindungen der Erfindung kurzfristig den Effekt, Tumore empfindlicher gegenüber herkömmlichen zytotoxischen Therapien, wie zum Beispiel Chemikalien und Bestrahlung, zu machen. Die Verbindungen der Erfindung verbessern auch die Wirksamkeit bestehender zytotoxischer Hilfs-Anti-Krebs-Therapien. Die Verbindungen der Erfindung können auch mit anderen antiangiogenen Mitteln kombiniert werden, um ihre Wirksamkeit zu verbessern, oder mit anderen antiangiogenen Mitteln kombiniert und zusammen mit anderen zytotoxischen Mitteln verabreicht werden. Insbesondere bei der Behandlung solider Tumore können Verbindungen der Erfindung mit IL-12, Retinoiden, Interferonen, Angiostatin, Endostatin, Thalidomid, Thrombospondin-1, Thrombospondin-2, Captopryl, anti-neoplastischen Mitteln, wie zum Beispiel alpha-Interferon, COMP (Cyclophosphamid, Vincristin, Methotrexat und Prednison), Etoposid, mBACOD (Methotrexat, Bleomycin, Doxorubicin, Cyclophosphamid, Vincristin und Dexamethason), PRO-MACE/MOPP (Prednison, Methotrexat (mit Leucovinrettung), Doxorubicin, Cyclophosphamid, Taxol, Etoposid/Mechlorethamin, Vincristin, Prednison und Procarbazin), Vincristin, Vinblastin, Angioinhibinen, TNP-470, Pentosanpolysulfat, Plättchenfaktor 4, Angiostatin, LM-609, SU-101, CM-101, Techgalan, Thalidomid, SP-PG und dergleichen verabreicht werden, ebenso wie mit Bestrahlung.
Die Gesamttagesdosis der Verbindungen der Erfindung, die an einen Menschen oder einen anderen Säugetierwirt in Einzeldosen oder aufgeteilten Dosen zu verabreichen ist, kann Mengen von zum Beispiel 0,0001 bis 300 mg/kg Körpergewicht pro Tag und häufiger 1 bis 300 mg/kg Körpergewicht betragen.
Es versteht sich, dass Mittel, die mit der Verbindung der vorliegenden Erfindung zur Hemmung, Behandlung oder Prophylaxe angiogener Krankheiten kombiniert werden können, nicht auf die obengenannten beschränkt sind, sondern im Prinzip alle Mittel einschließen, die zur Behandlung oder Prophylaxe angiogener Krankheiten nützlich sind.
Die Peptide der Erfindung können zur Erstellung von Affinitätssäulen zur Isolation von Rezeptoren verwendet werden, die für die antiangiogene Aktivität des Peptids der Erfindung relevant sind, zum Beispiel TSP-1-Rezeptor in, zum Beispiel, kultivierten Endothelzellen. Wie im Fachgebiet bekannt, kann die Isolation und Reinigung des Rezeptors von Aminosäuresequenzierung zur Identifikation und Isolation von Polynukleotiden gefolgt sein, die den Rezeptor kodieren. Die rekombinante Expression dieses Rezeptors würde es ermöglichen, dass größere Mengen an Rezeptor produziert werden, zum Beispiel, um eine ausreichende Menge zur Verwendung in Screening-Tests mit hohem Durchsatz zu produzieren, um andere Angiogeneseinhibitoren zu identifizieren.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können für eine Reihe von Anwendungen an Isotope, Enzyme, Trägerproteine, zytotoxische Stoffe, fluoreszierende Moleküle, chemilumineszierende, biolumineszierende und andere Verbindungen chemisch gekoppelt werden. Zum Beispiel kann ein Peptid markiert werden, um das Testen seiner Fähigkeit, Antiseren zu binden, zu erleichtern oder um Zelltypen nachzuweisen, die einen relevanten Rezeptor besitzen. Die Kopplungstechnik wird im allgemeinen auf der Grundlage der funktionellen Gruppen ausgewählt, die an den Aminosäuren des Peptids verfügbar sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Amino, Sulfhydral, Carboxyl, Amid, Phenol und Imidazol. Verschiedene Reagenzien, die verwendet werden, um solche Kopplungen zu erzeugen, schließen unter anderem Glutaraldehyd, diazotiertes Benzidin, Carbodiimid und p-Benzochinon ein.
Die Wirksamkeit der Kopplungsreaktion wird mit verschiedenen Techniken bestimmt, die für die jeweilige Reaktion geeignet sind. Zum Beispiel kann radioaktive Markierung des Peptids mit I¹²⁵ unter Verwendung von Chloramin T und NaI¹²⁵ mit hoher spezifischer Aktivität durchgeführt werden. Die Reaktion wird mit Natriummetabisulfit abgebrochen und die Mischung wird auf Einwegsäulen entsalzt. Das markierte Peptid wird aus der Säule eluiert und Fraktionen werden gesammelt. Aliquote werden aus jeder Fraktion entfernt und Radioaktivität wird mit einem Gammazähler gemessen. Auf diese Art kann ein markiertes Peptid gewonnen werden, das frei von nicht umgesetztem NaI¹²⁵ ist.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können auch als Antigene zur Erzeugung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper verwendet werden. Solche Antikörper können in Diagnoseverfahren und -kits verwendet werden, um das Peptid der Erfindung oder damit verwandte Peptide in einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe nachzuweisen oder zu quantifizieren. Ergebnisse dieser Tests könnten benutzt werden, um die prognostische Relevanz solcher Peptide zu diagnostizieren oder zu bestimmen.
Die Verwendung der Peptide der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung monoklonaler Antikörper bei Tieren, wie zum Beispiel Mäusen, Kaninchen oder Schafen, nutzt Techniken, die im Fachgebiet gut bekannt sind. Falls gewünscht, können die Antikörper dann verwendet werden, um Anti-Idiotyp-Antikörper herzustellen, die wiederum humanisiert werden können wie im Fachgebiet bekannt, um immunologische Reaktionen zu verhindern. Die humanisierten Antikörper können verwendet werden, um Angiogenese zu hemmen oder Kits zum Nachweis des Rezeptors herzustellen, wie hierin beschrieben.
Zur Produktion polyklonaler Antiseren bei Kaninchen, Schafen, Ziegen oder anderen Tieren werden die Peptide der Erfindung, zum Beispiel durch Lysinreste, mit Hilfe von Glutaraldehyd an gereinigtes Rinderserumalbumin gekoppelt. Die Wirksamkeit dieser Reaktion kann bestimmt werden durch Messung des Einbaus von radioaktiv markiertem Peptid. Nicht umgesetztes Glutaraldehyd und Peptid können durch Dialyse getrennt und das Konjugat zur späteren Verwendung aufbewahrt werden.
Serumproben aus der Erzeugung polyklonaler Antiseren oder Mediumproben aus der Produktion monoklonaler Antiseren können zur Bestimmung von Antikörpertiter und insbesondere zur Bestimmung von Antiseren mit hohem Titer analysiert werden. Danach können die Antiseren mit höchstem Titer getestet werden, um folgendes zu bestimmen: a) die optimale Verdünnung des Antiserums für die höchste spezifische Bindung des Antigens und die niedrigste unspezifische Bindung, b) die Fähigkeit, steigende Mengen von Peptid in einer Standard-Verdrängungskurve zu binden, c) potentielle Kreuzreaktivität mit immunologisch verwandten Peptiden und Proteinen (einschließlich Plasminogen, TSP-1 und TSP-1 verwandter Spezies) und d) die Möglichkeit, das Peptid der Erfindung in Extrakten von Plasma, Urin, Geweben und in Zellkulturmedien nachzuweisen.
Titer kann durch mehrere Verfahren bestimmt werden, die im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel Dot Blotting und Dichteanalyse, und auch durch Präzipitation radioaktiv markierter Peptid-Antikörper-Komplexe unter Verwendung von Protein A, sekundären Antiseren, kaltem Ethanol oder Kohle-Dextran, gefolgt von Aktivitätsmessung mit einem Gammazähler. Falls gewünscht, können die Antiseren mit höchstem Titer auf Affinitätssäulen gereinigt werden. Zum Beispiel können die Peptide der Erfindung an ein handelsübliches Harz gekoppelt und benutzt werden, um eine Affinitätssäule zu bilden. Dann können Antiserumproben durch die Säule geführt werden, so dass Antikörper zu den Peptiden der Erfindung sich (über das Peptid) an die Säule binden. Diese gebundenen Antikörper werden anschließend eluiert, gesammelt und zur Bestimmung von Titer und Spezifität ausgewertet.
Kits zur Messung der Verbindungen der Erfindung werden auch als Teil der vorliegenden Erfindung betrachtet. Antiseren, die den höchsten Titer und die höchste Spezifität haben und die Peptide der Erfindung in Extrakten von Plasma, Urin, Geweben und in Zellkulturmedien nachweisen können, können zum Bau von Testkits zur schnellen, verläßlichen, sensitiven und spezifischen Messung und Lokalisierung von Peptiden der Erfindung verwendet werden. Diese Testkits können folgende Techniken verwenden, sind aber nicht darauf beschränkt: kompetitive und nicht kompetitive Assays, Radioimmunoassay (RIA), Biolumineszenz- und Chemilumineszenzassys, fluorometrische Assays, Sandwich-Assays, immunoradiometrische Assays, Dot Blots, Enzym-linked Assays einschließlich ELISA, Mikrotiterplatten, mit Antikörper beschichtete Streifen oder Meßstäbe zum schnellen Testen von Urin oder Blut und Immunozytochemie. Für jedes Kit werden der Bereich, die Sensitivität, die Genauigkeit, Verlässlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit des Assays mit Hilfe von Verfahren bestimmt, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Das oben beschriebene Testkit würde Anweisungen, Antiserum, ein oder mehrere Peptide der Erfindung und möglicherweise radioaktiv markierte Peptide der Erfindung und/oder Reagenzien zur Präzipitation gebundener Peptid-Antikörper-Komplexe bereitstellen. Ein solches Kit wäre nützlich zur Messung des Peptids der Erfindung in biologischen Flüssigkeiten und Gewebeextrakten von Tieren und Menschen mit Tumoren und ohne Tumore, wie im Fachgebiet gut bekannt ist.
Ein anderes Kit kann verwendet werden, um das Peptid der Erfindung in Geweben und Zellen sichtbar zu machen oder zu lokalisieren. Immunhistochemie-Techniken und -Kits zum Beispiel, die solche Techniken verwenden, sind Personen mit grundlegenden Fachkenntnissen gut bekannt. Ein solches Kit liefert Antiseren zu dem Peptid der Erfindung und möglicherweise Blockierserum und sekundäres Antiserum in Verbindung mit einem fluoreszenten Molekül, wie zum Beispiel Fluorescein-Isothiocyanat, oder mit einem anderen Reagenz, das verwendet wird, um das primäre Antiserum sichtbar zu machen. Mit dieser Methodik können entfernte Tumore auf Bereiche der Peptidproduktion oder auf Bereiche des Peptidrezeptors hin untersucht werden. Alternativ kann ein Kit radioaktiv markierte Nukleinsäuren zur Verwendung in In situ-Hybridisierung liefern, um Messenger-RNA zu suchen, die die Verbindung der Erfindung kodiert.
Synthese der Peptide
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können mit jeder Technik synthetisiert werden, die dem Fachmann bekannt ist. Eine Zusammenfassung der vielen Techniken zur Festphasen-Synthese von Peptiden ist in J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 and J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Band 2, Seite 46, Academic Press (New York), 1973, zu finden. Die klassische Lösungs-Synthese ist in G. Schroder und K. Lupke, The Peptides, Band 1, Academic Press (New York), 1965, zu finden.
Im allgemeinen umfassen diese Verfahren das sequentielle Anfügen einer oder mehrerer Aminosäuren oder angemessen geschützter Aminosäuren an eine wachsende Peptidkette. Normalerweise ist entweder die Amino- oder die Carboxylgruppe der ersten Aminosäure durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt. Die geschützte oder derivatisierte Aminosäure kann dann entweder an einen inerten festen Träger gebunden oder in Lösung verwendet werden durch Hinzufügen der nächsten Aminosäure in der Sequenz, wobei die komplementäre (Amino- oder Carboxyl-)gruppe angemessen geschützt ist, unter Bedingungen, die zum Bilden der Amidbindung geeignet sind. Dann wird die Schutzgruppe von diesem neu hinzugefügten Aminosäurerest entfernt und die nächste Aminosäure (angemessen geschützt) wird danach hinzugefügt usw. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der korrekten Sequenz verbunden wurden, werden eventuelle Rest-Schutzgruppen (und eventuell vorhandener fester Träger) nacheinander oder gleichzeitig entfernt, um das endgültige Polypeptid zu liefern. Durch einfache Modifikation dieses allgemeinen Verfahrens ist es möglich, mehr als eine Aminosäure zu einem Zeitpunkt an eine wachsende Kette anzufügen, zum Beispiel durch Kopplung (unter Bedingungen, die Chiralitätszentren nicht racemisieren) eines geschützten Tripeptids mit einem korrekt geschützten Dipeptid, um nach Entschützen ein Pentapeptid zu bilden.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung beinhaltet Festphasen-Peptidsynthese.
Bei diesem besonders bevorzugten Verfahren wird die alpha-Amino-Funktion durch eine säure- oder basenempfindliche Gruppe geschützt. Solche Schutzgruppen sollten die Eigenschaften haben, stabil gegenüber den Bedingungen der Peptidbindungsbildung und gleichzeitig leicht entfernbar zu sein, ohne Zerstörung der wachsenden Peptidkette oder Racemisierung eines der darin enthaltenen Chiralitätszentren. Geeignete Schutzgruppen sind 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), t-Butyloxycarbonyl (Boc), Benzyloxycarbonyl (Cbz), Biphenylisopropyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, (α,α)Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl, 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl und dergleichen. Die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Schutzgruppe wird bevorzugt.
Besonders bevorzugte Seitenketten-Schutzgruppen sind für Seitenketten-Aminogruppen wie in Lysin und Arginin: 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (pmc), Nitro, p-Toluensulfonyl, 4-Methoxybenzensulfonyl, Cbz, Boc und Adamantyloxycarbonyl; für Tyrosin: Benzyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Isopropyl, t-Butyl (t-Bu), Cyclohexyl, Cyclopenyl und Acetyl (Ac); für Serin: t-Butyl, Benzyl und Tetrahydropyranyl; für Histidin: Trityl, Benzyl, Cbz, p-Toluensulfonyl und 2,4-Dinitrophenyl; für Tryptophan: Formyl.
Beim Verfahren der Festphasen-Peptidsynthese wird die C-terminale Aminosäure an einen geeigneten festen Träger oder an ein Harz gebunden. Geeignete feste Träger, die für die oben beschriebene Synthese nützlich sind, sind solche Materialien, die inert gegenüber den Reagenzien und Reaktionsbedingungen der schrittweisen Kondensations-Deprotektions-Reaktionen sowie unlöslich in den verwendeten Medien sind. Der bevorzugte feste Träger für die Synthese von C-terminalen Carboxypeptiden ist 4-Hydroxymethylphenoxymethyl-copoly(styren-1% divinylbenzen). Der bevorzugte feste Träger für C-terminale Amidpeptide ist 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidoethylharz, erhältlich von Applied Biosystems [Stadt, Staat].
Die C-terminal-Aminosäure wird an das Harz mit Hilfe von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) oder O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) gekoppelt, mit oder ohne 4-Dimethylaminopyridin(DMAP)-, 1-Hydroxybenzotriazol(HOBT)-, Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat(BOP)- oder bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid(BOPCl)-vermittelte Kopplung, für von ungefähr 1 bis ungefähr 24 Stunden bei einer Temperatur von zwischen 10° und 50°C in einem Lösungsmittel, wie zum Beispiel Dichlormethan oder DMF. Wenn der feste Träger 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidoethylharz ist, wird die Fmoc-Gruppe mit einem sekundären Amin, vorzugsweise Piperidin, vor Kopplung mit der C-terminal-Aminosäure, wie oben beschrieben, gespalten. Das bevorzugte Verfahren zur Kopplung mit dem entschützten 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidoethylharz ist O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-Tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU, 1 Äquivalent) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT, 1 Äquivalent) in DMF.
Die Kopplung sukzessiver geschützter Aminosäuren kann in einem automatischen Polypeptidsynthetisierer durchgeführt werden, wie er im Fachgebiet gut bekannt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die α-Aminofunktion in den Aminosäuren der wachsenden Peptidkette mit Fmoc geschützt. Das Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe von der N-terminal-Seite des wachsenden Peptids wird durch Behandlung mit einem sekundären Amin, vorzugsweise Piperidin, erreicht. Jede geschützte Aminosäure wird dann in ungefähr 3-fachem molaren Überschuß zugegeben und die Kopplung wird vorzugsweise in DMF durchgeführt. Das Kopplungsmittel ist normalerweise O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU, 1 Äquivalent) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT, 1 Äquivalent).
Am Ende der Festphasensynthese wird das Polypeptid vom Harz entfernt und entschützt, entweder sukzessiv oder in einem einzigen Schritt. Das Entfernen des Polypeptids und das Entschützen können in einem einzigen Schritt durchgeführt werden durch Behandlung des harzgebundenen Polypeptids mit einem Spaltungsreagenz, wie zum Beispiel Thianisol, Wasser, Ethandithiol und Trifluoressigsäure.
In Fällen, in denen der C-Terminus des Polypeptids ein Alkylamid ist, wird das Harz durch Aminolyse mit einem Alkylamin gespalten. Alternativ kann das Peptid durch Umesterung, zum Beispiel mit Methanol, gefolgt von Aminolyse, oder durch direkte Transamidierung entfernt werden. Das geschützte Peptid kann an diesem Punkt gereinigt oder direkt zum nächsten Schritt geführt werden. Das Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen wird mit der oben beschriebenen Spaltungsmischung erzielt.
Das vollständig entschützte Peptid wird durch eine Sequenz chromatographischer Schritte gereinigt, die eine beliebige oder alle der folgenden Arten verwenden: Ionenaustausch auf einem schwach basischen Harz in Acetatform; hydrophobe Adsorptionschromatographie auf underivatisiertem Polystyren-Divinylbenzen (zum Beispiel AMBERLITE^® XAD); Silikageladsorptionschromatographie; Ionenaustauschchromatographie auf Carboxymethylzellulose; Verteilungschromatographie, z. B. auf SEPHADEX^® G-25, LH-20 oder Gegenstromverteilung; Hochdruckflüssigchromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC), insbesondere HPLC mit vertauschten Phasen auf Octyl- oder Octadecylsilyl-Silika-gebundener Phasensäulenfüllung.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Herstellung der neuen Verbindungen der Erfindung weiter zu verdeutlichen.
Herstellung des Spaltungsreagenz
Das Spaltungsreagenz (2 ml) wird hergestellt durch Mischen, in der angegebenen Reihenfolge, von Thioanisol (100 μl), Wasser (50 μl), Ethandithiol (50 μl) und Trifluoressigsäure (1,8 ml). Die frisch hergestellte Mischung wird auf –5°C bis –10°C abgekühlt und verwendet wie unten beschrieben.
Spaltungsverfahren
Eine Mischung aus harzgebundenem Polypeptid und Spaltungsreagenz wird bei 0°C 10–15 Minuten lang und dann bei Raumtemperatur für weitere 1,75 Stunden gerührt. Der Zeitraum wird um 0,5 Stunden für jedes zusätzliche Arginin bis zu insgesamt drei Stunden verlängert. Die Menge an verwendetem Spaltungsreagenz wird mit Hilfe der folgenden Formel ermittelt:
Das Harz wird dann abfiltriert und mit reiner Trifluoressigsäure gespült. Das Filtrat wird dann in Portionen von 0,5 ml in ein Zentrifugenglas gegeben, das ungefähr 8 ml kalten Diethylether enthält. Die Suspension wird dann zentrifugiert und der Überstand wird dekantiert. Das Pellet wird in ungefähr 8 ml Ether erneut suspendiert, weitere 0,5 ml des Filtrats werden hinzufügt und der Vorgang wird wiederholt, bis das gesamte Peptid präzipitiert ist. Das präzipitierte Filtrat wird dann mit Ether gewaschen, getrocknet und lyophilisiert.
Falls das Peptid nicht bei der Zugabe zu Ether präzipitiert, wird die Mischung mit wässeriger 30%iger Essigsäure geschüttelt. Die organische Phase wird dann zweimal mit wässeriger 30%iger Essigsäure extrahiert, und die kombinierten wässerigen Extrakte werden lyophilisiert.
BEISPIEL 1
In die Peptidsynthese-Säulenposition eines Perkin Elmer/Applied Biosynthesis SYNERGY^®-Peptidsynthetisierers wird eine Arg(Pmc)-Peptidsynthesesäule (25 μM Aminosäure; Applied Biosystems) plaziert. Aminosäuren werden sequentiell nach dem folgenden synthetischen Zyklus hinzugefügt:

0. Solvatisierung des Harzes mit DMF für ungefähr 5 Minuten;
1. Aufheben der Blockierung, um die Fmoc-Gruppe von der α-Aminosäurefunktion zu entfernen, mit Hilfe von Piperidin in DMF für ungefähr 15 Minuten;
2. Waschen mit DMF für ungefähr 5 Minuten;
3. Aktivieren der eingeführten Fmoc-geschützten Aminosäure (75 μM) mit einer 0,2 M-Lösung von HBTU (75 μM) und HOBT (75 μM) in DMSO-NMP (N-Methylpyrrolidon) und einer 0,4 M-Lösung von Diisopropylethylamin (150 μM) in DMSO-NMP;
4. Kopplung unter Verwendung einer Lösung der aktivierten Fmoc-geschützten Aminosäure, die in Schritt 3 oben hergestellt wurde, in DMF für ungefähr 30 Minuten; und
5. Waschen mit DMF für 5 Minuten.

Die Aminosäuren werden an das Harz in der folgenden Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen gekoppelt.
Nach Abschluss der Synthese wird das Harz mit THF ungefähr 5 Minuten lang gewaschen, um DMF zu entfernen und das Harz schrumpfen zu lassen. Das Harz wird dann mit Argon für ungefähr 10 Minuten und mit Stickstoff für weitere 10 Minuten gasgetrocknet, um das harzgebundene Peptid (80 mg) zu liefern.
Spaltung wird mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens durchgeführt (40 mg trockenes harzgebundenes Peptid, 700 μl Spaltungsreagenz, Spaltungszeit 2,5 Stunden), um das Rohpeptid (14 mg) zu liefern. Reinigung mit HPLC unter Verwendung einer 7 μm Symmetry Prep C18-Säule (7,8 × 300 mm) mit Lösungsmittelmischungen in einem Gradienten, die von 5% bis 100 Acetonitril-Wasser variieren, mit 0,1 Volumenprozent Trifluoressigsäure über einen Zeitraum von 50 Minuten, gefolgt von Lyophilisation, liefert Gly-Asp-Gly-Val-D-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg (5 mg). MS (FAB) m/z 986 (M + H)⁺.
BEISPIEL 2
Das gewünschte Peptid wird hergestellt durch Planierung von 40 mg des harzgebundenen Peptids, das in Beispiel 1 hergestellt wurde, in den Peptidsynthetisierer und Wiederholen der Schritte 3–5 oben, außer dass die Fmoc-geschützte Aminosäure durch Essigsäure (87 μM) ersetzt und sowohl von HBTU als auch von HOBT 87 μM verwendet werden. Spaltung und HPLC-Reinigung (Gradient von 15% bis 100% Acetonitril-Wasser), wie in Beispiel 1 beschrieben, ergab Ac-Gly-Asp-Gly-Val-D-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg (4 mg).
BEISPIEL 3
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 1, außer dass in der Synthesesäule des Peptidsynthetisierers Amidsyntheseharz verwendet wird. Die Aminosäuren werden unter den angegebenen Bedingungen an das Harz gekoppelt.
BEISPIEL 4
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 2 unter Verwendung des harzgebundenen Peptids, das in Beispiel 3 hergestellt wurde.
BEISPIEL 5
Schritt 1
Eine Mischung aus peptidgebundenem Harz, hergestellt wie in Beispiel 1, und Ethylamin wird in einer Phiole versiegelt und 4 Stunden lang gerührt. Das Ethylamin wird dann verdampft und das Methanol wird zu dem Rückstand gegeben. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat in Vacuo konzentriert. Der Rückstand wird in Methanol-Wasser (3 : 7) aufgenommen und lyophilisiert, um das geschützte Peptid zu liefern.
Schritt 2
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt durch Entschützen des in Schritt 1 hergestellten Peptids mit Hilfe des oben beschrieben Spaltungsreagenz und Verfahrens.
BEISPIEL 6
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 1 durch Kopplung der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 7
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 2, außer dass das harzgebundene Peptid, hergestellt wie in Beispiel 6, verwendet wird. MS(FAB) m/z 856 (M + H)⁺.
BEISPIEL 8
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 3, durch Koppeln der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 9
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 2, außer dass das harzgebundene Peptid verwendet wird, das hergestellt wurde wie in Beispiel 8. MS (FAB) m/z 855 (M + H)⁺, 877 (M + Na)⁺.
BEISPIEL 10
Die gewünschte Peptid wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 5, außer dass das harzgebundene Peptid von Beispiel 1 durch das harzgebundene Peptid von Beispiel 6 ersetzt wird.
BEISPIEL 11
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Ac-Gly-Val-D-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg von Beispiel 7 unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 5. MS (FAB) m/z 883 (M + H)⁺.
BEISPIEL 12
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 1 durch Koppeln der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 13
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 3 durch Kopplung der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 14
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 12 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5.
BEISPIEL 15
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 12 nach dem Verfahren von Beispiel 2.
BEISPIEL 16
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 13 nach dem Verfahren von Beispiel 2. MS (FAB) m/z 1018 (M + H)⁺.
BEISPIEL 17
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Ac-Tyr-Gly-Val-D-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5.
BEISPIEL 18
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 1 durch Kopplung der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 19
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 3 durch Kopplung der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 20
Das gewünschte Peptid wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 19 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5.
BEISPIEL 21
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 18 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 2.
BEISPIEL 22
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 19 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 2.
BEISPIEL 23
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 21 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5.
BEISPIEL 24
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 1 durch Kopplung der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 25
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 3 durch Kopplung der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 26
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 24 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5.
BEISPIEL 27
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 24 nach dem Verfahren von Beispiel 2.
BEISPIEL 28
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 25 nach dem Verfahren von Beispiel 2. MS (FAB) m/z 1018 (M + H)⁺.
BEISPIEL 29
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Ac-D-Tyr-Gly-Val-D-Ile-Thr-Arg-Ile-Arg von Beispiel 27 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5.
BEISPIEL 30
Das gewünschte Peptid wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 3, außer dass 4-Hydroxymethylphenoxymethylharz (Applied Biosystems) verwendet und die Aminosäuren an das Harz in der folgenden Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen gekoppelt werden.
BEISPIEL 31
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 3 durch Kopplung der Aminosäuren an das Harz wie in Beispiel 30 beschrieben.
BEISPIEL 32
Das gewünschte Peptid wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 30 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5.
BEISPIEL 33
Das gewünschte Peptid wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 30 nach dem Verfahren von Beispiel 2.
BEISPIEL 34
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Gly-D-Val-Ile-D-Thr-D-Arg-D-Ile-D-Arg-NH₂ von Beispiel 31 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 2.
BEISPIEL 35
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Ac-Gly-D-Val-Ile-D-Thr-D-Arg-D-Ile-D-Arg von Beispiel 33 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5. MS (FAB) m/e 855 (M + H)⁺.
BEISPIEL 36
Das gewünschte Peptid wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 1 unter Verwendung einer Gly-Peptidsynthese-Säule und unter Kopplung der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 37
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 3 durch Kopplung der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 38
Das gewünschte Peptid wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 36 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5.
BEISPIEL 39
Das gewünschte Peptid wird hergestellt aus dem harzgebundenen Peptid von Beispiel 36 nach dem Verfahren von Beispiel 2.
BEISPIEL 40
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzge bundenen D-Arg-D-Ile-D-Arg-D-Thr-Ile-D-Val-Gly-NH₂ von Beispiel 37 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 2.
BEISPIEL 41
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt aus dem harzgebundenen Ac-D-Arg-D-Ile-D-Arg-D-Thr-Ile-D-Val-Gly von Beispiel 36 unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5. MS (FAB) m/e 855 (M + H)⁺.
BEISPIEL 42
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 1 und unter Kopplung der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 43
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 1 und unter Kopplung der Aminosäuren an das Harz in der angegebenen Reihenfolge unter den angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 44
Die gewünschte Verbindung wird hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 43 aber unter Verwendung von Fmoc-D-Ser(tBu) als Aminosäure 15 und Fmoc-Ser(tBu) als von Aminosäure 14.

Claims

Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, gewählt aus der Gruppe bestehend aus
worin T abwesend ist oder gewählt ist aus einer N-Schutzgruppe und einem Polypeptid von bis zu 12 Aminosäureresten, wahlweise terminiert mit einer N-Schutzgruppe; U ist gewählt aus Arg und Arg-NR¹R² worin R¹ und R² unabhängig gewählt sind aus Wasserstoff und Alkyl von ein bis vier Kohlenstoffatomen; V ist abwesend oder eine N-Schutzgruppe; W ist gewählt aus D-Arg und D-Arg-NR¹R²; X ist abwesend oder eine N-Schutzgruppe; Y ist gewählt aus Gly und Gly-NR¹R²; und Z ist 1–12 Aminosäurereste, wahlweise terminiert mit einer N-Schutzgruppe, worin mindestens einer der Aminosäurereste ein D-Aminosäurerest ist, und worin das Peptid oder das Salz eine antiangiogene Wirksamkeit besitzt.
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 1 definiert gemäß folgender Formel
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 2 definiert, worin U gewählt ist aus Arg und Arg-NHCH₂CH₃.
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 2 definiert, worin T abwesend ist.
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 2 definiert, worin T Acetyl ist.
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 2 definiert, worin T ein Peptid von bis zu 12 Aminosäureresten ist, wahlweise bedeckt mit Acetyl.
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 6 definiert, worin T Gly-Asp- ist, wahlweise terminiert mit Acetyl.
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 2 definiert, gewählt aus der Gruppe bestehend aus
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, gemäß Anspruch 1, das die folgende Formel hat
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 9 definiert, gewählt aus der Gruppe bestehend aus
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 1 definiert, das die folgende Formel hat
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 11 definiert, gewählt aus der Gruppe bestehend aus
Eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten, der eine anti-Angiogenese-Therapie benötigt, die das Peptid von Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Die Verwendung eines Peptids von Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der eine anti-Angiogenese-Therapie benötigt.
Eine Zusammensetzung für die Behandlung einer Erkrankung, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Krebs, Arthritis, Psoriasis, Angiogenese im Auge, assoziiert mit einer Infektion oder einem chirurgischen Eingriff, Makuladegeneration und diabetischer Retinopathie, die das Peptid von Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Die Verwendung eines Peptids von Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Erkrankung, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Krebs, Arthritis, Psoriasis, Angiogenese im Auge, assoziiert mit einer Infektion oder einem chirurgischen Eingriff, Makuladegeneration und diabetischer Retinopathie.
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 2 definiert, gewählt aus der Gruppe bestehend aus
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 1 mit der folgenden Formel definiert
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 18 definiert, worin U gewählt ist aus Arg, Arg-NH₂ und Arg-NHCH₂CH₃, und Z ist wahlweise terminiert mit einer N-Schutzgruppe.
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 18 definiert, gewählt aus der Gruppe bestehend aus
Ein Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wie in Anspruch 1 definiert zur Verwendung als ein therapeutischer Wirkstoff.