DE69824001T2

DE69824001T2 - Reagenz zum nachweis und weiterverfolgen von virusinfektionen

Info

Publication number: DE69824001T2
Application number: DE69824001T
Authority: DE
Inventors: Denis Tranchand Bunel; Helène GRAS MASSE; Claude Auriault; Andre Tartar; Eric Diesis; Brigitte Bourez
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1997-07-04
Filing date: 1998-07-03
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2018-07-04
Also published as: WO1999001767A1; EP0993616A1; AU8446598A; US6818219B1; ATE267397T1; JP2001517247A; AU746231B2; EP0993616B1; DE69824001D1; FR2765688A1; FR2765688B1; CA2295962A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagens zur Detektion und Verfolgung viraler Infektionen, wie z.B. der, die durch das Epstein-Barr-Virus oder EBV, das das verursachende Agens der infektiösen Mononukleose ist, durch das Hepatitis-C-Virus (HCV) oder das Virus der humanen Immundefizienz (HIV) hervorgerufen werden, und seine Anwendungen zur Detektion einer Virusinfektion bzw. viralen Infektion, insbesondere einer EBV-Infektion, ganz gleich in welchem Infektionsstadium (Primärinfektion, gesunde Träger und induzierte Tumore).
EBV ist ein Herpes-Virus, das vorzugsweise B-Lymphozyten und Epithelzellen infiziert.
Dieses lymphozytische Virus entkommt der immunologischen Überwachung. Im Allgemeinen wird das Virus von gesunden Trägern ohne besondere Symptome getragen; unter Immundefizienzbedingungen jedoch, wie z.B. SIDA oder eine Chemotherapie nach Transplantation sowie in den endemischen Zonen wie in Afrika oder in Asien wird das onkogene Potential des EBV freigesetzt und führt zum Auftreten verschiedener Tumore, wie z.B. das afrikanische Burkitt-Lymphom, undifferenziertes Karzinom des Nasopharynx, bestimmte Lymphome und die Hodgkin-Krankheit.
Derzeit wird die EPV-Serumdiagnose entweder mit Hilfe der Paul-Bunnell-Reaktion (Detektion von heterophilen Antikörpern), ein einfaches und schnelles, aber nicht spezifisches Verfahren (LINDERHOLM M. et al., J. Clin. Microbiol., 1994, 32, 1, 259–261) oder mit Hilfe von Immunfluoreszenz-Tests (IF), die für jede Antigenklasse (VCA, EA und EBNA) spezifisch sind, durchgeführt.
Die Entwicklung eines einfacheren und kostengünstigeren Diagnosetests, der ein immunenzymatisches Verfahren verwendet, wie das ELISA-Verfahren, ist in diesem Zusammenhang besonders wünschenswert und so wurden mehrere Tests vorgeschlagen (M. GORGIEVSKY-HRISOHO et al., J. Clin. Microbiol., 1990, 28, 2305–2311; JM. MIDDELDORP et al., J. Virol. Methods, 1988, 21, 133–159).
Die im Stand der Technik vorgeschlagenen immunenzymatischen Verfahren zeigen in der Mehrheit den Hauptnachteil, dass es ihnen an Detektionsempfindlichkeit mangelt (M. GORGIEVSKY-HRISOHO et al., vorstehend genannt; JM. MIDDELDORP et al., vorstehend beschrieben). Um dieses Problem des Mangels an Empfindlichkeit zu lösen, haben verschiedene Autoren vorgeschlagen, verschiedene Antigene in Kombination zu verwenden; solche Kombinationen erhöhen die Empfindlichkeit des Tests, in dem diese Kombinationen verwendet werden, nicht aber die Spezifität. Die Kombinationen von Antigenen, die im Stand der Technik vorgeschlagen wurden, umfassen z.B. das Antigen p47–52 (Hauptantigen EA-D, kodiert durch das offene Leseraster, das BMRF1 genannt wird, Zugangsnummer SWISS-PROT P03191), das Antigen p38 (kodiert durch das offene Leseraster, BALF2 genannt, Zugangsnummer SWISS-PROT P03227) und das Antigen gp125 oder gp110 (kodiert durch das offene Leseraster, BALF4 genannt, Zugangsnummer SWISS-PROT P03188) (W.M.J. Van GRUNSVEN et al., J. Virol., 1993, 67, 3908–3916).
Vor kurzem wurde gezeigt, dass ein Capsidantigen mit 18 kDa (VCAp18), das durch das offene Leseraster BFRF3 kodiert wird (Zugangsnummer SWISS-PROT P14348) in gesunden Trägern des EBV in einer Immunoblotanalyse erkannt wird; es scheint keine homologen Sequenzen mit den anderen humanen Herpes-Viren aufzuweisen, und zwar im Gegensatz zu anderen Hauptproteinen, wie z.B. VCAp40 (Sequenz, die durch das offene Leseraster, das BdRFl genannt wird, kodiert wird, Zugangsnummer SWISS-PROT P03219) und gp125/110 (R. BAER et al., Nature, 1984, 310, 207–211; M.S. CHEE et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 1990, 154, 125–170; A.J. DAVIDSON, J. Gen. Virol., 1986, 67, 1759–1816). Die Karte der antigenen Domänen des Antigens VCAp18 wurde erstellt und die antigene Hauptdomäne wurde in der C-terminalen Region des Proteins lokalisiert (W.M.J. Van GRUNSVEN et al., J. Infect. Dis., 1994, 170, 13–18).
Allerdings haben die ELISA-Tests, die mit diesem Capsidantigen VCAp18 durchgeführt wurden, den Nachteil:

– sie zeigen keine ausreichende Empfindlichkeit und Spezifität für die Menge der produzierten Anti-VCA-Ig zu detektieren (falsch-positive Resultate und/oder falsch-negative Resultate); was die falsch-negativen Resultate angeht, so resultieren sie im Wesentlichen aus der geringen Größe des synthetischen Peptids VCAp18/SEQ ID NO: 2 (24 Aminosäuren, SEQ ID NO: 2 des Sequenzprotokolls), das folglich nicht von allen VCA-positiven Individuen erkannt werden kann, und/oder aus der Heterogenität der Reaktivität der Antikörper gegenüber dem synthetischen Peptid im Vergleich zu demselben Peptid in seiner natürlichen Umgebung;
– sie ermöglichen keine unterschiedliche Diagnose der verschiedenen Stufen der EBV-Infektion und/oder der durch EBV induzierten Pathologien als Funktion des isotypischen Profils der produzierten Ig (IgG, IgA und IgM), und dies trotz der Verwendung des C-terminalen Fragments des Proteins VCAp18 (SEQ ID NO: 1 des Sequenzprotokolls) als Reagens.

Auf eine ähnliche Situation trifft man mit anderen Viren, z.B. HCV oder HIV; tatsächlich bietet die Verwendung ei nes oder mehrerer immundominanter Fragmente keine ausreichende Empfindlichkeit, um falsch-negative Ergebnisse zu vermeiden.
Deswegen hat sich die Anmelderin das Ziel gesetzt, ein neues Reagens zur Detektion viraler Infektionen bereitzustellen, das geeignet ist, in immunenzymatischen Tests eingesetzt zu werden, das gleichzeitig spezifisch und empfindlich ist und das es ermöglicht, eine Steigerung der Empfindlichkeit von mindestens 15 bis 30% im Vergleich zu Reagentien des Standes der Technik zu erhalten.
Deshalb hat sich die Anmelderin auch zum Ziel gesetzt, ein neues Reagens zur Detektion von Infektionen durch EBV bereitzustellen, das geeignet ist, in immunenzymatischen Tests verwendet zu werden, das gleichzeitig spezifisch und empfindlich ist und das eine differentielle Diagnose des Stadiums der Infektion und/oder der Pathologie in Funktion des vorherrschenden Isotyps ermöglicht; in der Tat ist das Vorliegen von humanen Anti-VCA-IgM im Wesentlichen das Zeichen einer Primärinfektion, ist das Vorliegen von humanen Anti-VCA-IgG im Wesentlichen ein Hinweis auf eine vergangene Infektion (im Allgemeinen gesunde Träger), während das Vorliegen von humanen Anti-VCA-IgA das Auftreten eines Tumors nahe legt. Ein derartiges Reagens entspricht im Rahmen der immunenzymatischen Tests, insbesondere des ELISA-Typs, den Anforderungen der Praxis besser als die Reagentien des Standes der Technik.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reagens zur Diagnose einer durch ein Virus hervorgerufenen Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen ein Gemisch umfasst, bestehend aus (1) einem immundominanten Fragment eines Proteins des Virus, das höchstens 60 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen 20 und 30 Aminosäuren, umfasst und (2) einem Gemisch (als Mixotop bezeichnet), kombinatorischer, konvergierender Peptide, die von dem immundominanten Fragment abgeleitet sind, wobei die Peptide durch vollständige oder partielle künstliche Degeneration des immundominanten Fragments mittels systematischem oder partiellem Ersetzen jeder Aminosäure durch eine andere nach einer passenden Austauschbarkeitsmatrize erhalten wurden.
Im Sinn der Erfindung versteht man unter Mixotop das Gemisch aller kombinatorischen Peptide, die ausgehend von dem ausgewählten immundominanten Fragment durch künstliche oder konstruierte Degeneration erhalten werden; sie werden vorzugsweise im Verlauf einer einzigen Synthese erhalten und stellen das peptidische Antigen und seine Variabilität in seiner Funktion der Erkennung einer Antikörperpopulation dar; ausgehend von demselben Peptid können verschiedene Mixotope erhalten werden. Die Faktoren, die bei der Konstitution eines Mixotops eingreifen, sind:

– einerseits die prozentuale Degeneration des ausgewählten, nativen, immundominanten Fragments (vollständige oder partielle Degeneration); die konservierten Aminosäuren (isoliert oder eine Sequenz bildend) sind im Fall einer partiellen Degeneration vorzugsweise, wenn es EBV betrifft, die, die bei der Strukturierung des Proteins VCAp18 eingreifen, und
– andererseits der Auswahlmodus der Substitution der Aminosäuren des nativen immundominanten Fragments; für jede Position der gewählten, nativen, immundominanten Sequenz des Fragments wird der Ersatz von Aminosäuren auf der Basis der Austauschmatrize ausgewählt; diese wurde von H.M. GEYSEN et al. (J. Mol. Recog., 1988, 1, 32–41) entwickelt oder modifiziert, wie es in 16 dargestellt ist, wobei die Toleranz der Antikörpererkennung berücksichtigt wurde. Dabei wird die Funktion der Substitution der Aminosäuren in den linearen Epitopen be rücksichtigt: für eine gegebene Position wählt man vorzugsweise die Aminosäuren, die die höchste prozentuale "Ersetzbarkeit" aufweisen. Dennoch ist es vorteilhaft, vor einer Degeneration die Konformation der natürlichen Epitope zu berücksichtigen.

Das Mixotop im Sinn der vorliegenden Erfindung, das aus konvergierenden kombinatorischen Peptiden besteht, die aus einem nativen immundominanten Fragment stammen, stellen somit eine künstliche und nicht-natürliche De-Entartung der nativen Struktur durch den systematischen oder partiellen Ersatz jeder Aminosäure durch eine andere auf der Grundlage der Ersetzbarkeitsmatrize von GEYSEN oder der Matrize von 16 dar.
Ebenso versteht man im Sinn der Erfindung unter konstruierter Ersetzbarkeitsmatrize eine Matrize, die die natürlichen Variationen oder die häufig in der Entwicklung beobachteten Variationen nicht reproduziert; die Ersetzbarkeitsmatrize von GEYSEN oder die Matrize gemäß 16 sind besonders angepasste Matrices.
Im überraschender Weise ermöglichen die Reagentien gemäß der Erfindung es, Resultate zu erhalten, die verlässlich, reproduzierbar, sehr empfindlich und sehr spezifisch sind, und zwar in dem Maße, wie die Kombinationen gemäß der Erfindung einen synergistischen Effekt in der Detektion der durch das Virus induzierten Antikörper zeigen; insbesondere erhält man ganz allgemein, um welches Virus es sich auch handelt (z.B. HIV, HCV, EBV), eine Empfindlichkeitssteigerung von 15 bis 30%.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Reagens zur Diagnose gemäß der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, dass es für die Diagnose von Infektionen durch EBV im Wesentlichen ein Gemisch umfasst, bestehend aus (1) einem C-terminalen Fragment des viralen Capsidanti gens mit 18 kDA (Protein VCAp18, SEQ ID NO: 1), des Epstein-Barr-Virus (EBV), das höchstens 60 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen 20 und 30 Aminosäuren, umfasst, und (2) einem Gemisch (als Mixotop bezeichnet) kombinatorischer, konvergierender Peptide, die von dem C-terminalen Fragment oder dem Peptid VCAp18 abgeleitet sind.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Reagenses gemäß der Erfindung ist das C-terminale Fragment des Proteins VCAp18 aus der Gruppe ausgewählt, die aus den Peptiden VCAp18/SEQ ID NO:2, VCAp18/SEQ ID NO:3, VCAp18/SEQ ID NO:4 und VCAp18/SEQ ID NO:5 besteht.
In unerwarteter Weise verbessert die Kombination eines C-terminalen Fragments des Peptids VCAp18 mit einem Mixotop, das von dem Fragment abgeleitet ist, unabhängig davon, welche Konfiguration das gewählte C-terminale Fragment hat, in deutlicher Weise die Empfindlichkeit und die Spezifität der immunenzymatischen Serumdiagnostik für EBV; wenn man einen ELISA-Test, der ein Reagens gemäß der Erfindung, wie es oben definiert ist, verwendet, mit einem ELISA-Test, der in einzigartiger Weise ein VCAp18-Peptid verwendet, so erhält man mit dem erfindungsgemäßen Reagens in effektiver Weise eine Empfindlichkeit von 100% und eine Spezifität von 100% infolge der Bindung der Gruppe der Ig (G, A und M) gegen VCA an das Reagens.
Die Reagentien gemäß der Erfindung ermöglichen es in überraschender Weise, verlässliche reproduzierbare, sehr empfindliche und sehr spezifische Resultate zu erhalten, wobei die Kombinationen gemäß der Erfindung eine synergistische Wirkung bei der Detektion der Gruppe an produzierten humanen Anti-VCA-Ig zeigen.
Das Gemisch degenerierter Peptide, das künstlich produziert wird, wird im Verlauf einer selben Synthese mit dem nativen Peptid kombiniert. Eine solche Kombination er laubt es, die Reaktivität des Gemisches von Antigen, die gegenüber den natürlicherweise durch das Virus induzierten Antikörpern produziert wurden, in unerwarteter weise zu erhöhen.
Unter diesen Bedingungen ist es möglich, Empfindlichkeiten in der Größenordnung von 100% bzw. 97% in Populationen nach Infektion und Populationen von Primär-Infizierten und Primär-Infizierten zu erhalten, wobei in allen durchgeführten Tests eine Spezifität von 100% verwirklicht wird.
Beispielsweise:

– für das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 kann man auf diese weise die drei folgenden Mixotope erhalten: – das Mixotop, das eine Degeneriertheit der Gesamtheit der Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:2 entspricht, im Folgenden als Mixotop MIXO bezeichnet, – das Mixotop, in dem die Prolinreste des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:2 vorzugsweise konserviert werden, wobei diese bei der Konformation besonders beteiligt sind; dieses Mixotop, das im Folgenden Mixotop MIXO(P) genannt wird, entspricht einer partiellen Degeneration der Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:2 und – das Mixotop, in dem auf einmal die Prolinreste und die Sequenz Gly Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO:6) des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:2 vorzugsweise konserviert werden; dieses Mixotop, im Folgenden MIXO(P, G) genannt, entspricht einer partiellen Degeneration der Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:2.
– für das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:3 kann man auf diese Weise die folgenden Mixotope erhalten: – das Mixotop, das eine Degeneration der Gesamtheit der Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:3 entspricht, – das Mixotop, in dem der Prolinrest und/oder die Serinreste der repetitiven Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:3 vorzugsweise konserviert werden; dieses Mixotop entspricht einer partiellen Degeneration der Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:3, – das Mixotop, in dem der Prolinrest und die Alaninreste der repeptiven Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:3 vorzugsweise konserviert sind; dieses Mixotop entspricht einer partiellen Degeneration der Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:3 und – das Mixotop, in dem der Prolinrest, die Serinreste und die Alaninreste des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:3 vorzugsweise gleichzeitig konserviert sind.
– für das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:4 kann man auf diese Weise die folgenden Mixotope erhalten: – das Mixotop, das eine Degeneriertheit der Gesamtheit der Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:4 entspricht, – das Mixotop, in dem die Reste Serin, Prolin und/oder Alanin und/oder die Sequenz Gly Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO:6) und/oder die Sequenz Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala (SEQ ID NO:7) des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:4 vorzugsweise konserviert sind; das Mixotop entspricht einer partiellen Degeneration der Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:4.
– für das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:5 kann man auf diese Weise die folgenden Mixotope erhalten: – das Mixotop, das eine Degeneration der Gesamtheit der Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:5 entspricht, – das Mixotop, in dem die Reste Serin und/oder Alanin des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:5 vorzugsweise konserviert sind; das Mixotop entspricht einer partiellen Degeneration der Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:5, – das Mixotop, in dem die Serinreste und die Sequenz Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala (SEQ ID NO:7) des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:5 vorzugsweise konserviert sind; das Mixotop entspricht einer partiellen Degeneration der Sequenz des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:5.

Die verschiedenen Mixotope, die einer partiellen Degeneration des gewählten Peptids VCAp18 entsprechen, konservieren eine native Sequenz, die vorzugsweise in die Strukturierung des Proteins VCAp18 eingreift.
Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform ist das Reagens gemäß der vorliegenden Erfindung auf einem festen Träger, vorzugsweise auf Mikrotiterplatten, fixiert.
Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagenses liegt das Verhältnis C-terminales Peptid zu Mixotop in dem Gemisch zwischen 1:10 und 1:100.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Diagnose einer viralen Infektion durch ein immunenzymatisches Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Reagens zur Diagnose gemäß der Erfindung umfasst.
Insbesondere, wenn die vorliegende Erfindung Infektionen durch EBV betrifft, ist Gegenstand der Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose durch ein immunenzymatisches Verfahren, umfassend:

– Inkontaktbringen eines zu analysierenden Serums mit einem Reagens, wie es oben definiert wurde,
– Zusatz von humanen Anti-Ig-Antikörpern, die an ein Enzym gebunden sind, und
– qualitative und/oder quantitative Entwicklung von Anti-VCA-Antikörpern, die gegebenenfalls in dem zu analysierenden Serum vorliegen, durch Zusatz des Substrats des Enzyms.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens umfasst es:

– die Fixierung eines Reagenses gemäß der Erfindung auf einem Träger, z.B. einer Mikrotiterplatte,
– Zusatz des zu analysierenden Serums und
– Detektion der Fixierung der Anti-VCA-Antikörper, die in dem Serum vorliegen, durch Zusatz von humanen Anti-Ig-Antikörpern (G-A-M), die an ein Enzym gebunden sind, und
– qualitative und/oder quantitative Entwicklung durch Zusatz des Substrats des Enzyms mittels Spektralphotometer.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Überwachung und differentiellen Detektion der Stadien einer Infektion durch EBV durch ein immunenzymatisches Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

– Fixierung eines Reagenses gemäß der Erfindung auf einem Träger, wie einer Mikrotiterplatte,
– Zusatz des zu analysierenden Serums,
– Detektion der Fixierung der Anti-VCA-Antikörper, die gegebenenfalls in dem Serum vorliegen, durch Zusatz von humanen Anti-Ig-Antikörpern, die an ein Enzym gebunden sind, wobei die Antikörper aus der Gruppe, bestehend aus humanen Anti-IgG-Antikörpern, humanen Anti-IgM-Antikörpern und humanen Anti-IgA-Antikörpern ausgewählt sind, und
– qualitative oder quantitative Entwicklung durch Zusatz des Substrates des Enzyms mittels Spektralphotometer.

Die Primärinfektion induziert die Bildung von Antikörpern, die gegen die verschiedenen Antigene des EBV gerichtet sind; es handelt sich insbesondere um Antikörper, die gegen das virale Capsidantigen (VCA) gerichtet sind, um Antikörper, die gegen das Kernantigen (EBNA) gerichtet sind, Antikörper die gegen das frühreife Antigen (EA) gerichtet sind, und Antikörper, die gegen das Membranantigen (MA) gerichtet sind.
Diese unterschiedlichen Antikörper treten nicht in demselben Stadium der Infektion auf; insbesondere die Anti-VCA-Ig sind sehr frühreife Produkte und bleiben während der gesamten Dauer des Lebens des Wirts vorhanden. Dies impliziert, dass die Detektion der IgM und IgG gegen VCA im humanen Serum den diagnostischen Wert (besonders interessant) erhöht, um eine Primärinfektion durch EBV zu begründen.
Nach dem Isotyp der Anti-VCA-Ig, die in dem zu analysierenden Serum detektiert werden, ist es möglich, die gesunden Träger des Virus (Vorherrschen der IgG), die Primärinfektionen (Vorherrschen der IgM) oder das Auftreten eines Tumors, insbesondere von Krebs des Nasopharynx (Vorherrschen der IgA) zu unterscheiden.
In überraschender Weise ermöglicht es das erfindungsgemäße Reagens, die Anti-VCA-IgA zu detektieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur frühen Detektion von Krebs des Nasopharynx durch ein immunenzymatisches Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

– Fixierung eines Reagenses gemäß der Erfindung auf einem Träger, wie einer Mikrotiterplatte,
– Zusatz des zu analysierenden Serums,
– Detektion der Fixierung der Anti-VCA-Antikörper, die gegebenenfalls in dem Serum vorliegen, durch Zusatz von humanen Anti-IgA-Antikörpern, die an ein Enzym gebunden sind, und
– qualitative oder quantitative Entwicklung durch Zusatz des Substrates des Enzyms mittels Spektralphotometer.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Kit oder eine Kassette zur Diagnose einer viralen Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass er/sie mindestens ein Reagens zur Diagnose gemäß der Erfindung umfasst.
Außer den vorstehenden Ausführungsformen umfasst die Erfindung noch andere Ausführungsformen, die aus der folgenden Beschreibung, die sich auf Beispiele zur Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sowie auf die angefügten Zeichnungen bezieht, hervorgehen. Bei den Figuren:
stellt 1 die Reaktivität des Ig-G-A-M von 46 Seren, die EBV-positiv (-⎕- ) sind, und von 28 Seren, die EBV-negativ (-O-) sind, dar, wobei diese durch Immunfluoreszenz charakterisiert wurden, mit dem Peptid SEQ ID NO:2, das auf einem festen Träger mit 0,1 μg/Vertiefung (1A und 1B) oder mit 1 μg/Vertiefung (1C) fixiert ist, dar. Die horizontale Linie stellt den Schwellenwert dar, der dem Mittelwert entspricht, welcher mit den negativen Seren (EBV-negativen) + 3 Abweichungsstandards (SD) erhalten wurde. Die 1B veranschaulicht den Vergleich zwischen den Titern, die für Anti-VCA-IgG durch einen Immunfluoreszenztest (IF) erhalten wurden, mit dem Extinktionswert (A492), der mit einem ELISA unter Verwendung eines Peptids SEQ ID NO:2 erhalten worden war. In der 1B stellt das Symbol -∎ - die Seren dar, die EBV-positiv, SEQ ID NO:2-negativ sind. Die 1A und 1C tragen auf der Abszisse die Nummer der Seren und auf der Ordinate die Extinktion bei 492 nm, während die 1B auf der Abszisse die IF-Titer und auf der Ordinate die in ELISA erhaltenen Extinktionen trägt.
Die 2 stellt den Effekt der Mixotope MIXO, MIXO(P) und MIXO(P, G) auf die Reaktivität der IgG-A-M der EBV-positiven (-⎕ -)-Seren und der EBV-negativen (-O-)-Seren bei zwei unterschiedlichen Konzentrationen dar: 0,1 μg/Vertiefung (2A, 2C und 2E) oder 10 μg/Vertiefung (2B, 2D, 2F) in einem ELISA-Test. Die horizontale Linie stellt den Schwellenwert dar, der dem Mittel aus drei Serumkontrollen + 3 SD entspricht. Diese verschiedenen Figuren umfassen auf der Abszisse die Nummer der Seren und auf der Ordinate die Extinktion bei 492 nm.
Die 3 veranschaulicht den Vergleich des Verhaltens von EBV-positiven Seren gegenüber dem Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 (3A) und unterschied lichen Mixotopen: MIXO (3B), MIXO(P) (3C), MIXO(P, G) (3B) dar; die falschnegativen Ergebnisse, die mit dem Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 erhalten wurden (3A, -∎-), definieren den Schwellenwert. Die Angaben dieser 3 stellen die Extinktionswerte, die durch ELISA erhalten wurden, für alle EBV-positiven Seren als Funktion ihres IFA-Titers dar. Das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 und die Mixotope werden in fester Phase in den Konzentrationen 0,1 bzw. 10 μg/Vertiefung verwendet.
Die 4 veranschaulicht die Wirkung der Assoziation Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 + Mixotope: MIXO (4A), MIXO(P) (4B) oder MIXO(P, G) (4C) auf die Reaktivität von IgG-A-M der Seren, die EBV-positiv (-⎕-) und EBV-negativ (-O-) sind, in den ELISA-Tests. Jede Vertiefung der Mikrotiterplatten wird nacheinander mit 0,1 μg Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 und 10 μg eines der vorstehend genannten Mixotope überzogen und mit den Seren in Kontakt gebracht.
Die 5A und 5B veranschaulichen die Entwicklung der humanen serologischen Antworten des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:2 (-∎-) und der drei vorstehend genannten Mixotope (MIXO (-⟡- ) MIXO(P) (-∆-) und MIXO(P, G) (-O-) auf zwei unterschiedliche Konzentrationen des Überzugs; die 5C veranschaulicht die Entwicklung der serologischen Reaktionen des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:2 (-∎-) und der drei vorher erwähnten Mixotope in Kombination mit dem Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2: VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO (-⟡-), VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P) (-∆-) und VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) (-O-). Für jedes Experiment wurden die Seren, die mit dem Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 eine Extinktion bei 492 nm unter 1,3 zeigen, selektioniert und die senkrechte Linie stellt die Grenze zwischen den EBV-positiven und EBV-negativen Seren dar.
Die 6 veranschaulicht die Bindungsinhibierungen der Antikörper verschiedener EBV-positiver Seren (Serum 298 6967, Serum 298 7943, Serum 299 0723 und Serum 299 1372) an einer festen Phase, die das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 (-⎕-), MIXO (-⟡-), MIXO(P) (-∆-) oder MIXO(P, G) (-O-) enthält, bei steigenden Konzentrationen des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:2. Diese Figur umfasst auf der Abszisse die Konzentration an Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 und auf der Ordinate das Verhältnis A/Ao.
Die 7 stellt Klotz-Diagramme dar, die die Bindung des Antikörpers verschiedener EBV-positiver Seren (Serum 298 6967, Serum 298 7943, Serum 299 0723 und Serum 299 1372) an feste Phasen, die das Peptid (VCAp18/SEQ ID NO:2 (-⎕-), MIXO (-⟡-), MIXO(P) (-∆-) oder MIXO(P, G) (-O-) enthalten.
8 veranschaulicht die Reaktivität von IgG-A-M (8A) und die getrennten Reaktivitäten der verschiedenen Isotypen G, A und M (8B) von EBV-positiven Seren (Personen, die in der Vergangenheit eine Infektion hatten, -⎕-) und von EBV-negativen Seren (-O-) gegenüber dem erfindungsgemäßen Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G).
Die 9 erläutert die Reaktivitäten des Isotyps IgM gegenüber dem erfindungsgemäßen Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO (P, G) bei EBV-positiven Seren (Infektion in der Vergangenheit, -⎕-) und bei negativen Seren (-O-), die nicht behandelt wurden (9A), die mit Anti-IgG-Antikörpern behandelt wurden (9B) oder die durch Vor-Adsorption der IgG behandelt wurden (9C).
Die 10 stellt den Vergleich der Reaktivitäten IgG-A-M (10A und 10B) und IgG (10C und 10D) von humanen Seren von Patienten, die in der Vergangenheit eine Infektion hatten, gegenüber dem erfindungsgemäßen Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) mit einem IFA-Test zur Detektion der Anti-VCA-IgG und einem Behring-ELISA-Test zur Detektion der Anti-(VCA-EBNA-EA)-IgG dar. Die Angaben sind die Extinktionswerte, die mit ELISA für alle EBV-positiven Seren erhalten wurden, als Funktion ihrer IFA-Titer oder der Extinktionswerte, die mit dem Behring-ELISA-Test erhalten wurden.
Die 11 erläutert die IgG-A-M-Reaktivität (11A) und die getrennten Reaktivitäten der verschiedenen Isotypen G, A und M (11B) EBV-positiver Seren (Primärinfektion, -⎕-) und EBV-negative Seren (-O-), gegenüber dem erfindungsgemäßen Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G).
Die 12 erläutert die Reaktivitäten des Isotyps IgM gegenüber dem erfindungsgemäßen Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) in EBV-positiven Seren (Primärinfektion, -⎕-) und EBV-negativen Seren (-O-), die nicht behandelt (12A), durch Anti-IgG-Antikörper (12B) oder durch Vor-Adsorption der IgG behandelt sind (12C).
Die 13 veranschaulicht den Vergleich der IgM-Reaktivität in Seren von primär-infizierten Patienten gegenüber dem erfindungsgemäßen Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) mit einem Behring- ELISA-Test für die Detektion der Anti-(VCA-EBNA-EA)-IgG.
Die 14 veranschaulicht den Vergleich der Detektion der IgG in den Seren von Personen, die in der Vergangenheit infiziert waren, erhalten durch IFA (14A) oder durch einen ELISA-Test, der das erfindungsgemäße Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) verwendet (14B) mit der Reaktivität von IgM in Seren von Patienten, die in der Vergangenheit eine Infektion hatten, erhalten mit einem ELISA-Test unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Reagenses VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G).
Die 15 veranschaulicht den Vergleich des Extinktionswertes, der durch Detektion der IgG in den Seren von primär-infizierten Personen erhalten wurde, mit einem Behring-ELISA-Test VCA-EBNA-EA oder einem ELISA-VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G)-Test gemäß der Erfindung mit der IgM-Reaktivität, die mit Hilfe eines ELISA-Tests erhalten wurde, der das erfindungsgemäße Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) verwendet.
Die 16 stellt eine Ersetzungsmatrize für Aminosäuren dar, die bezüglich der von H.M. GEYSEN (vorher zitierte Literaturstelle) modifiziert ist und der Symmetrie Rechnung trägt; die fettgedruckten Werte sind in der Matrize von GEYSEN angegeben, die Werte 0, die statistisch nicht signifikant sind, werden willkürlich beibehalten oder durch den Wert ersetzt, der durch die symmetrische Ersetzung erhalten wird.
Es ist jedoch selbstverständlich, dass diese Beispiele nur zur Erläuterung des Gegenstands der Erfindung ange führt werden und für diese keinerlei Beschränkung darstellen.
BEISPIEL 1: Herstellung von Reagentien gemäß der Erfindung
a) Synthese des Peptids:
Das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 wird synthetisiert, indem die herkömmliche Strategie in fester Phase des Boc- Benzyl- (oder Fmoc-)Typs in der automatischen Peptidsynthese verwendet wurde (Modell 430A, Applied Biosystems Inc.). Die Schutzgruppen der Seitenketten sind die Folgenden: Asn (Trt), Gln (Trt), Asp (OChx), Glu (OChx), Ser (Bzl), Thr (Bzl), Arg (Tos), Cys (4-MeBzl) und His (Dnp) (siehe R.C. SHEPPARD, Peptide Synthesis, Comp. Org. Chem., 1979, 5, 321–363).
Die Aminosäuren werden eingeführt, indem das Aktivierungsprotokoll HBTU/HOBt mit einer systematischen doppelten Kopplung auf einem Boc-Gln-Pam-Harz verwendet wird (Applied Biosystems). Nach Thiolyse der Dinitrophenyl-Dnp-Gruppe, gefolgt von einer abschließenden Entschützung und der Spaltung mit Fluorwasserstoffsäure wird das gespaltene und entschützte Peptid präzipitiert und mit kaltem Diethylether gewaschen, dann in 5%iger Essigsäure gelöst und lyophilisiert.
Das Peptid wird an einer 5 mm × 250 mm-Säule, 100 A Nucleosil C18, für präparative RP-HPLC (Macherey Nagel, Düren, Deutschland) auf über 90% gereinigt und das Peptid wird danach charakterisiert.
Die Homogenität wird durch analytische HPLC an einer Vydac-C18-Säule, die mit einem Lösungsmittelsystem (TFA-Acetonitril-Wasser) eluiert wurde, in einem Shimatsu-Gerät bestätigt. Die Identität wird durch Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung und durch Massenspektrometrie, aufgezeichnet mit einem Massenspektrometer Bio Ion 20 Plasma (Bio Ion AB, Uppsala, Schweden) bestätigt ([M + H]^– errechnet: 2494,7; gefunden: 2495,4).
b) Herstellung verschiedener Mixotope:
Diese werden hergestellt, wie es in H. GRAS-MASSE et al., Peptide Research, 1992, 5, 4,211–216 beschrieben ist.
Kurz ausgedrückt, äquimolare Mengen an geschützten Aminosäuren werden abgewogen und in Kopplungsreaktionen eingesetzt.
Um die Kinetikdifferenzen bei den Reaktivitäten der verschiedenen Aminosäuren auszugleichen, wird eine erste Kopplung mit 1 mmol (Gesamtmenge) Boc-Aminosäure (oder einem Gemisch von Boc-Aminosäuren) durchgeführt. Eine zweite Kopplung, die 2 mmol (Gesamtmenge) verwendet, wird danach systematisch durchgeführt. Nach einer Spaltung mit Fluorwasserstoffsäure wird das rohe Peptid in TFA (30 ml) gelöst und durch Zugabe des Peptids in eine kalte Diethyletherlösung (300 ml) präzipitiert.
Nach Zentrifugation wird das Präzipitat in Wasser gelöst und lyophilisiert. Nach Oxidation der Lösung bei neutralem pH mit Luft werden die Mixotope durch Filtration auf Gel auf einer TSK HW40S-Säule (Merck, Darmstadt, Deutschland) gereinigt. Ein Aliquot jedes gereinigten Mixotops wird dann während 24 Stunden mit einem Gemisch aus 6N HCl:Phenol (10:1) einer Säurehydrolyse unterworfen um eine Bestimmung der Zusammensetzung aus Aminosäuren durchzuführen.
c) Beispiele für verschiedene Reagentien gemäß der Erfindung:
Die Sequenz des Peptids SEQ ID NO:2 und der Mixotope, die daraus abgeleitet sind, sind in der folgenden Tabelle I dargestellt. TABELLE I

– Reagens 1: Gemisch aus Peptid SEQ ID NO:2 + Mixotop MIXO (vollständige Degeneration der Struktur, wie sie in Tabelle I dargestellt ist),
– Reagens 2: Gemisch aus Peptid SEQ ID NO:2 + Mixotop MIXO(P),
– Reagens 3: Gemisch aus Peptid SEQ ID NO:2 + Mixotop MIXO(P, G).

Diese Reagentien sind vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 μg/Vertiefung für das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 und in einer Konzentration von 10 μg/Vertiefung für die Mixotope auf einem festen Träger (Mikroplatte) fixiert.
BEISPIEL 2: Immunenzymatischer Test, der ein Reagens gemäß der Erfindung zur Serumdetektion des EBV verwendet.
A. Material und Verfahren:
– ELISA:
Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Nunc, Maxisorb, Rocksilde, Dänemark) werden während einer Nacht bei 4°C entweder mit 0,2 ml Peptid VCRp18/SEQ ID NO:2 oder mit einem Mixotop (0,5 μg/ml in 50 mM NaHCO₃, pH 9,6) oder nacheinander mit 0,2 ml Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 (0,5 μg/ml) und 0,2 ml Mixotop (50 μg/ml) überzogen.
Jede Vertiefung wird dann mit 0,1 M Phosphatpuffer, der 1,8% NaCl enthält, pH 7,4, (PBS) gewaschen und ihre überschüssigen Bindungsstellen werden durch Albumin blockiert (Zusatz von 0,3 ml 2% BSA (Rinderserumalbumin) in PBS, bei 37°C, für 60 Minuten).
Nach 3 Waschgängen mit 0,3 ml 0,5% PBS-Tween 20 (Sigma) (PBS-Puffer T) werden die zu untersuchenden humanen Seren in PBS-T, das Rinderserumalbumin (BSA) 2% enthält, verdünnt und in den Vertiefungen, die das erfindungsgemäße Reagens, wie es oben präzisiert wurde, enthalten, 120 Minuten lang bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre inkubiert.
Nach 4 Waschgängen werden die Konjugate Peroxidase-Ziegeanti-humane-IgG-A-M-Antikörper (Diagnostic Pasteur), die in dem Puffer PBS-T, der 2% BSA enthielt, 1:10000 verdünnt waren, 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
Der konjugierte Antikörper, der sich an Ig, die an dem Träger fixiert sind, bindet, wird auf seine Peroxidaseaktivität unter Verwendung als Substrat o-Phenylendiamindihydrochlorid und H₂O₂ in einem 0,05 M-Citratpuffer, pH 5,5, während 30 Minuten in der Dunkelheit und bei Umgebungstemperatur entwickelt.
Die Reaktion wird durch Zusatz von 4 N H₂SO₄ (50 μl) blockiert. Die Extinktion wird mit einem automatischen Mehrkanal-Lesegerät (M_R 5000, Dynatech) gegen einen Blindwert bei 492 nm (A₄₉₂) aufgezeichnet.
Der Mittelwert A₄₉₂ + 3 Standardabweichungen (SD) der EBV-negativen Proben wird in dem ELISA-Test als Schwellenwert verwendet.
– Messung der Affinität der Bindung an den Antikörper:
Die Bindungsspezifität der positiven Seren an verschiedene Mixotope in fester Phase wird durch die Absorption der Antikörper durch das native Antigen VCAp18/SEQ ID NO:2 in Lösung beurteilt, wobei das Verfahren von B. FRIGUET et al. (J. Immunol. Methods, 1985, 77, 305–319) verwendet wurde.
Grundlage dieses Verfahrens ist die Messung der Konzentration an freiem Antikörper durch ein indirektes ELISA-Verfahren, wenn das Antigen VCAp18/SEQ ID NO:2 und die Antikörper in Lösung in einem Gleichgewicht vorliegen.
Das Antigen VCAp18/SEQ ID NO:2 wird in verschiedenen Konzentrationen (10^–10 M bis 2·10^–6 M) zunächst in Lösung (PBS-T-Puffer + 2% BSA) mit einem EBV-positiven Serum in konstanter Konzentration (1/50) bis zum Erreichen des Gleichgewichtszustands inkubiert.
Nach 18-stündiger Inkubation bei 4°C werden 200 μl jedes Gemisches in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die vorher mit dem Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 (0,2 ml, entspricht 0,5 μg/ml) oder einem Mixotop (50 μg/ml, 0,2 ml) in 50 mM NaHCO₃, pH 9,6, überzogen wurden, transferiert und 60 Minuten bei 20°C inkubiert.
Nach Waschen mit dem PBS-T-Puffer werden die gebundenen Immunglobuline durch Zugabe von Ziege-Antikörpern gegen humane IgG-A-M, die an Peroxidase gebunden sind, detektiert.
Der konjugierte Antikörper, der an Ig bindet, wird durch die Peroxidaseaktivität entwickelt, wie es oben beschrieben wurde. Dieses Verfahren liefert die Verdrängungskurven der Bindung A/Ao als log(ao). Eine genaue Bestimmung der mittleren Affinität des Serums, das die anti-VCAp18-Antikörper enthält, wird durch die folgende Gleichung angegeben Ao/(Ao – A) – 1/ν = 1 + Kd/ao, in der ao die Konzentration an gesamtem löslichen Antigen ist, A und Ao die Extinktionen bei 492 nm mit oder ohne blockierendes Antigen sind und ν die Fraktion gebundener Antikörper ist, wenn die verschiedenen, bei FRIGUET et al. dargelegten Bedingungen erfüllt sind.
B. Resultate
a) Bindung Serumantikörper-C-terminale Domäne des Peptids VCAp18/SEQ ID NO:2 (ELISA VCAp18/SEQ ID NO:2):
Die Reaktivität der humanen Anti-VCA-Ig-G-M-A gegenüber dem Peptid VCAp18/171–194 wird durch einen ELISA-Test für verschiedene Seren analysiert: 46 EBV-positive Seren und 28 EBV-negative Seren, die nach Durchführung eines Behring-ELISA-Tests selektioniert und durch IFA bestätigt worden waren (Detektion der Anti-VCR-IgG, Immunoconcept, USA).
Wie in W.M.J. Van GRUNSVEN, J. Infect. Dis, 1994, 170, 13–19 präzisiert wurde, zeigt die C-terminale Domäne des Proteins VCAp18 eine wichtige Immunreaktivität (1A).
Wenn die Mikrotiterplatten mit einer Konzentration von 0,1 μg/Vertiefung überzogen werden, wird dieses Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 von den Antikörpern der Mehrzahl der EBV-positiven Seren erkannt.
Unter Verwendung von 3 Standardabweichungen über dem Mittelwert, die mit negativen Serenkontrollen erhalten wurden, als untere Detektionsgrenze, werden eine erhöhte Bindungsempfindlichkeit (89%) und eine optimale Spezifität (100%) in der Analyse der Anti-VCAp18-Reaktion beobachtet (1A).
Um die Möglichkeit der Erhöhung der Empfindlichkeit des Tests als Funktion der Menge der Peptide, die die Platten überziehen, zu bewerten, wurde eine andere Konzentration für die Beschichtung (Menge, die die Platten überzieht), d.h. 1 μg/Vertiefung untersucht; in einem solchen Fall beobachtet man eine Verringerung der Spezifität auf 98% (1C).
Der Vergleich der Titer, die bei IF erhalten wurden, und der Extinktionswerte, die bei ELISA erhalten wurden, zeigte für kein Serum eine klare Korrelation, im Wesentlichen aufgrund einer deutlichen Variabilität der Extinktionen, die für die Seren, die schwache oder Zwischen-IF-Titer aufweisen, mit ELISA erhalten wurden (1B).
Die EBV-positiven Seren, die der Detektion durch ELISA (-∎- in 1B) entkommen, zeigen durch IF nachweisbare Titer bei der 160. oder der 320. (Verdünnungsgrenzen), was bestätigt, dass das Antigen VCA durch diese vier Seren, die für das Peptid VCAp18-negativ sind, erkannt wird.
b) Bindung Serumantikörper-Mixotope (ELISA VCA-Mixotop):
Die Mixotope wurden als Antigene in fester Phase in zwei Konzentrationen, d.h. 0,1 μg und 10 μg/Vertiefung, getestet (2).
Nach Überziehen der Vertiefungen mit einer Konzentration von 0,1 μg ist die Empfindlichkeit klar unzureichend: nur 26, 10 und 10 der 46 IgG-A-M-positiven Seren reagieren mit MIXO, MIXO(P) bzw. MIXO(P, G) (2A, C, E).
Nach Überziehen mit den Mixotopen in einer Konzentration von 10 μg/Vertiefung ist die Detektion der positiven Seren bei Erhöhung der Extinktionen viel empfindlicher. Mit den Mixotopen MIXO, MIXO(P) bzw. MIXO(P, G) werden 46, 36 und 27 der 46 EBV-positiven Seren detektiert (2B, D, F). Jedoch ist der Schwellenwert infolge einer gewachsenen Schwankung der Extinktionen, die mit den negativen Kontrollseren beobachtet werden, erhöht.
In überraschender Weise wird der Verlust der Bindungsspezifität (11 Seren falsch positiv) nur beobachtet, wenn man das Antigen MIXO verwendet (2B, D, F); mit den zwei anderen Mixotopen wird kein falsch-positives Ergebnis beobachtet.
Der Vergleich der IF-Titer und der Extinktionswerte, die durch ELISA erhalten wurden, ist für jedes der 46 IFA-positiven Seren in 3 dargestellt. Die bei ELISA beobachteten Extinktionen sind bezüglich der Resultate, die mit dem IF-Test erhalten werden, erhöht; diese Resultate sind insbesondere für die Seren interessant, die bezüglich IFA schwache Titer oder Titer im Zwischenbereich aufweisen.
Die Tests, die VCAp18-negativ, IF-positiv sind, sind durch ausgefüllte Quadrate in 3 symbolisiert.
c) Bindung Serumantikörper-erfindungsgemäßes Reagens (Kombinationen Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 + Mixotop) (ELISA VCAp18/SEQ ID NO:2 + Mixotop):
Um die Erhöhung der Empfindlichkeit der Detektion mit Hilfe des erfindungsgemäßen Reagenses zu zeigen, verwendet man Kombinationen, die das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2, das eine Mikrotiterplatte mit 0,1 μg/Vertiefung bedeckt, mit verschiedenen Mixotopen, die die Mikrotiterplatte mit 10 μg/Vertiefung bedecken, umfassen.
Wie es in 4 (A, B, C) dargestellt ist, werden alle EBV-positiven Seren mit den drei Kombinationen detektiert.
Beim ELISA-Test wird eine Heterogenität der Resultate mit den EBV-negativen Seren beobachtet, wenn die Degeneration des Mixotops steigt. Wie in den 4A und 4B gezeigt ist, ziehen die Kombinationen MIXO und MIXO(P) mit dem Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 das Vorliegen von 4 oder 5 Seren mit sich, die fälschlich positiv sind. Dennoch liefert die Kombination mit dem Antigen MIXO(P, G) eine optimale Bindungsgempfindlichkeit (100%) und eine optimale Spezifität (100%) bei der enzymatischen Sero-Diagnose von VCA-EBV (4C).
Die erhaltenen Resultate sind in der folgenden Tabelle II angegeben.
d) Relevanz der Kombinationen Peptid VCAp18/Mixotope für die Serumdiagnose des EBV:
Eine genauere Analyse der Verteilung der individuellen Reaktionen auf das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2, seine Mixotope und ihre Kombinationen (erfindungsgemäßes Reagens) ist in 5 dargestellt.
Alle Seren, die einen Extinktionswert von unter 1,3 in einem ELISA-Test, der nur das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 verwendet, zeigen, wurden selektioniert. Jedes Serum wird durch 4 Symbole dargestellt, die den Extinktionen entsprechen, die erhalten werden, wenn man es mit den verschiedenen Antigenen in fester Phase reagieren lässt.
In bestimmten Fällen ist das Signal deutlich erhöht, wenn man die Mixotope als Antigene in fester Phase verwendet, einschließlich für die IF-positiven VCAp18-SEQ ID NO:2-negativen Seren.
Wie es in 5C dargestellt ist, liegen fast alle erhaltenen Extinktionen, wenn man die positiven Seren mit dem erfindungsgemäßen Reagens testet, über den Extinktionen, die mit dem Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 allein erhalten werden.
Die 3 Kombinationen detektieren in wirksamer Weise alle EBV-positiven Seren, die mit den Mixotopen ein schwaches Signal zeigen.
Das Signal, das mit den negativen Seren bei den erfindungsgemäßen Kombinationen erhalten wird, ist im Allgemeinen schwächer, als wenn diese Seren mit dem Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 allein getestet werden, außer man verwendet die vollständig degenerierte Konstruktion MIXO.
Die vollständig degenerierten Mixotope, die ausgehend von den Peptiden am Ende des C-terminalen Teils des Proteins VCAp18 erhalten wurden und kein Prolin enthalten, verleihen dem erfindungsgemäßen Reagens wirksam die gesuchten Eigenschaften.
e) Beurteilung der Affinität der Mixotope für die Serumantikörper im Vergleich zu Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 mittels ELISA:
Das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 wird in diesen ELISA-Inhibierungsexperimenten verwendet um seine Fähigkeit, die Bindung der humanen, EBV-positiven Seren an verschiedene Mixotope, die in fester Phase verwendet werden, zu inhibieren, zu beurteilen.
6 stellt einige Inhibierungsassays dar.
Wie in dieser 6 dargestellt ist, kann die Bindung der humanen Seren an 3 Mixotope spezifisch und stark inhibiert werden, indem die Konzentrationen an Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 erhöht werden.
Außerdem geben das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 in fester Phase und die verschiedenen Mixotope in fester Phase Kurven einer parallelen Verschiebung, was das Vorliegen einer gemeinsamen Antikörperpopulation anzeigt, die gegenüber dem nativen Peptid und den degenerierten Peptiden empfindlich ist.
7 stellt Klotz-Diagramme der Bindung der EBV-positiven Seren an Antikörper dar, gemessen durch ELISA nach dem Verfahren von FRIGUET et al., das vorher beschrieben wurde. Die Werte für die Dissoziationskonstanten werden ausgehend von der linearen Regression der Resultate, die in 6 ausgedrückt sind, abgeleitet. Man beobachtet eine Erhöhung der Affinitätskonstanten um ei nen Faktor von 10 bis 400 für die verschiedenen Mixotope, verglichen mit dem Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2.
Der Mittelwert von Kd für VCAp18/171–194, MIXO, MIXO(P) und MIXO(P, G) ist in diesen Experimenten 0,81 ± 0,62 mM, 0,06 ± 0,01 mM, 2,40 ± 1,54 nM bzw. 4,75 ± 3,75 nM.
BEISPIEL 3: Immunenzymatischer Test, der ein erfindungsgemäßes Reagens verwendet, für die differentielle Serumdetektion der humanen Anti-VCA-IgG, -IgM und -IgA und seine Rolle in der Diagnostik verschiedener Pathologien.
a) Bindung Serumantikörper-erfindungsgemäßes Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) bei gesunden Trägern:
Die Reaktivität der humanen IgG-A-M, IgG, IgA und IgM gegen VCA mit dem erfindungsgemäßen Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) wird mit Hilfe eines ELISA-Tests analysiert, wobei die Seren, die durch IF als EBV-negativ und EBV-positiv charakterisiert worden waren (46 EBV-positive und 28 EBV-negative) verwendet werden.
Der Schwellenwert wird als drei Variationsstandards über dem Mittelwert der EBV-negativen Seren, die für jeden Isotyp bestimmt wurden, definiert.
Mit diesem Kriterium wird in keinem ELISA ein falsch positives Serum beobachtet.
Wie in Beispiel 1, c) oben (siehe auch 4C) dargestellt wurde, zeigt das Reagens Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G), das als Antigen in fester Phase verwendet wurde, eine optimale Bindungsempfindlichkeit von 100 und eine Spezifität von 100 in der serologischen Diagnostik von EBV mittels IgG-A-M durch ein immunenzymatisches Verfahren.
Dieselbe Gruppe an Seren, die durch IF positiv sind, wurde auf ihre IgM-, IgG- und IgA-Reaktivität mit einem ELISA-Test untersucht, wobei als Reagens ein VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G)-Gemisch verwendet wurde.
Um die Isotyp-spezifischen Tests durchzuführen, geht man wie folgt vor:
Man arbeitet wie in Beispiel 1 zur Herstellung der Mikrotiterplatten beschrieben.
Jedoch können die Seren, die zur Analyse der IgM verwendet werden, vor Inkubation der zu analysierenden Seren unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen wie folgt behandelt werden:

– um die IgG zu eliminieren (Voradsorption der IgG oder Vorbehandlung mit einem humanen Anti-IgG-Serum (Diagnostic Pasteur, Marnes-La-Vallée, Frankreich)) oder
– um die IgM mit einer Lösung zu resolubilisieren, die den rheumatoiden Faktor absorbiert (Behringwerke AG, Marburg, Deutschland),

Zur Entwicklung geht man wie folgt vor:
Nach 4 Waschgängen werden die konjugierten Ziege-Antikörper (auch sekundäre Antikörper genannt), die gegen die humanen Ig(G-A-M), die IgG, die IgA und die IgM (Diagnostic Pasteur, Marnes-La-Coquette, Frankreich) gerichtet sind, 1/10.000 in einem PBS-T-Puffer + 2% BSA verdünnt, 60 Minuten bei 37°C inkubiert.
Die zweiten konjugierten Antikörper, die an Serum Ig binden, die auf dem Träger fixiert sind, werden wie in Beispiel 1 beschrieben entwickelt.
Wie in 8B gezeigt ist, reagieren alle Seren außer 2 mit den IgG positiv; jedoch haben diese zwei IgG-negativen Seren erhöhte IgA- und IgM-Reaktivitäten, wie es durch die ausgefüllten Quadrate in 8B angezeigt wird. Diese Resultate stehen in Übereinstimmung mit der Bindungsempfindlichkeit von 100% und der in IgG-A-M-Test erhaltenen Spezifität (4C oder 8A) und mit der Tatsache, dass die Seren von gesunden Trägern (eine in der Vergangenheit erfolgte Infektion) eine schwache IgA- und IgM-Reaktivität zeigen (8B).
Jedoch sind 91% dieser Seren von Personen, die in der Vergangenheit infiziert waren (gesunde Träger), IgM-positiv, unter diesen haben 78% einen Restgehalt an IgM (DO unter 1), verglichen mit dem Extinktionswert, der für die IgG erhalten wurde; nur 39% der Seren sind IgA-negativ; dies ist in dem Maße ein überaschendes Resultat, als die Mehrzahl der Patienten als Gesunde oder Genesende, d.h. IgM- und IgA-Negative, angesehen wurden.
Es wurde lediglich ein Serum detektiert, das gleichzeitig erhöhte Gehalte an IgM und an IgG hatte, während es IgA-negativ war, was wahrscheinlich einen reinfizierten oder primär-infizierten Patienten anzeigt.
Um die Spezifität der IgM-Reaktion zu zeigen, wurden die Seren der gesunden Trägern mit den Präzipitationsreagentien der IgG behandelt: Serum, behandelt mit einem Anti-IgG-Serum oder mit Resolubilisierungsreagentien der IgM oder Reagentien, die eine Dekomplexierung der IgM ermöglichen: Serum, behandelt mit einer Lösung, die geeignet ist, den rheumatoiden Faktor zu absorbieren.
9 vergleicht die drei durchgeführten ELISA (nicht-behandeltes Serum, Serum, das mit einem Absorptionsmittel behandelt war, und Serum, das mit Anti-IgG-Serum behandelt war). Man weist keine signifikante Differenz nach, ein schwächeres Signal wird für ELISA beobachtet, der an Seren durchgeführt wurde, die mit den Präzipitierungsreagentien für IgG behandelt worden waren.
Der ELISA-Test mit VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) zur Detektion der Ig(G-A-M) oder der IgG wurde mit einem herkömmlichen Immunfluoreszenzverfahren verglichen, das als Antigen VCA oder eine Kombination VCA-EBNA-EA zur Detektion der IgG in jedem der 46 IFA-positiven Seren (Behring-Verfahren) verwendet wurde, wie es in 10 dargestellt ist.
Wie in den 10A und 10C dargestellt ist, entsprechen erhöhte IFA-Titer erhöhten Extinktionswerten, wenn ELISA-Tests VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) zur Detektion der Ig(G-A-M) oder der IgG durchgeführt werden.
Im Übrigen wird eine deutliche Erhöhung der Werte, die bei dem ELISA-Test mit VCAp18/SEQ ID NO:2-MIXO(P, G) erhalten werden, für IF-Titer, die schwach oder im Zwischenbereich liegen, beobachtet.
Diese Situation ist für die Detektion der IgG-A-M besonders wichtig und zeigt die Relevanz der Detektion von IgG-A-M (10A, C).
Derselbe Typ eines Resultats wird für 10D beobachtet, der einen ELISA-Test, der das Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) verwendet und einen han delsüblichen Behring-ELISA für die Detektion der IgG vergleicht.
Die zwei EBV-positiven Seren, die der Detektion mit Hilfe des Reagenses VCAp18/SEQ ID NO:2-MIXO(P, G) entkommen, zeigen IF-Titer, die schwach sind oder im Zwischenbereich liegen (80. und 320.) und liegen unter dem Mittelwert, der im Behring-ELISA-Test zur Detektion der IgG beobachtet wurde.
Dieses Resultat ist in dem Maße haltbar, wie eine andere Antigengruppe, einschließlich EA und EBNA, im Behring-Test verwendet wird.
Die 10B vergleicht den ELISA-Test mit VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) zur Detektion der IgG-A-M gemäß der Erfindung und dem Behring-ELISA-Test für die Detektion der IgG. Zwischen den Reaktivitäten von IgG und IgG-A-M wird keine klare Korrelation beobachtet, was nahe legt, dass die erfindungsgemäße Kombination sehr spezifisch ist und zur Bindung aller humanen Isotypen beiträgt, einschließlich des Typs M, der als der Isotyp angesehen wird, der die geringste Affinität hat und der ganz zu Beginn der Infektion produziert wird.
b) Untersuchung der Bindung der Serumantikörper an das erfindungsgemäße Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G), bei primär-infizierten Patienten
Die Reaktivität der humanen IgG-A-M, IgG, IgA und IgM gegen VCA mit dem erfindungsgemäßen Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) wird mit Hilfe eines ELISA-Tests analysiert, wobei 28 EBV-negative Seren, die als Kontrollen selektioniert wurden, und 40 EBV-positive Seren, die von primär-infizierten Patienten erhalten wurden, und mit einem ELISA-Test (EBNA-VCA-EA) positive Resultate auf Detektion der IgM liefern und negative Resultate mit einem Behring-ELISA-Test auf die Detektion von humanem IgG gegen EBNA1 liefern, erhalten wurden.
Die Resultate, die mit dem ELISA-Test, der das erfindungsgemäße Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) verwendet, für die Detektion der IgG-A-M erhalten wurden, werden in 11A dargestellt und eine Studie der isotypischen Reaktion der verschiedenen Seren wird in 11B dargestellt.
Nur sechs der EBNA1-negativen Seren zeigen ein Resultat über dem Schwellenwert (cut off) für die Reaktivität gegenüber den IgG-A-M (11A).
Alle diese Seren gehören zu der Gruppe, die aus IgG- negativen Seren (40%) besteht. Zwei von diesen reagieren mit einem Test und werden als falsch-negativ angesehen.
Darüber hinaus gibt es zwei einzelne, die IgM-negativ sind (11B). Als Folge dieser IgM-Negativität wurden diese zwei Seren zur Bestätigung ihrer Seropositivität durch Immunfluoreszenz (IF) getestet. Die erhaltenen Titer entsprechen den Werten im 10. und im 40. Diese sehr schwachen Titer zeigen ein frühreifes Stadium der Infektion durch EBV an. Eine Erklärung könnte die Detektion eines Antigens als EA, das in den handelsüblichen Kits enthalten ist, oder wahrscheinlicher eine Kreuzreaktion mit einem anderen Virus der Herpes-Gruppe (CMV, HSV ...) sein.
Im Übrigen weisen die 4 anderen Seren, die ebenfalls IgG-negativ sind, einen schwachen IgM- und IgA-Wert auf, was ein frühreifes Stadium einer Primärinfektion anzeigt.
Die Spezifität der IgM-Reaktivität wurde untersucht, indem die IgG-Reaktivität durch die Fällmittel neutralisiert wurde.
Wie in den 12A und 12B dargestellt ist, zeigen die nicht-behandelten Seren und die behandelten Seren (RF-Absorptionsmittel) keinen Reaktivitätsunterschied.
Dagegen induziert die Voradsorption der IgG zwei falsch negativ Resultate (12B). Jedoch sind diese zwei letzten Seren IgG-A-M-positiv. Das eine von diesen wird nur IgA-positiv entwickelt, während das andere eine starke IgG-Reaktion und eine schwache IgA-Reaktion liefert.
13 vergleicht einen ELISA-Test, der ein erfindungsgemäßes Reagens (VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G)) für die Detektion der IgG verwendet, und einen Behring-ELISA-Test zur spezifischen Detektion der Anti-EBV-IgM, bei dem ein Kernextrakt der durch EBV infizierten Zellen als Antigen verwendet wird.
Man beobachtet keine Korrelation zwischen den mit diesen zwei ELISA-Tests erhaltenen Werten. Mit dem erfindungsgemäßen Reagens wird eine Verschiebung der Extinktionswerte beobachtet. Ein Serum, das ein schwer zu interpretierendes Resultat mit dem Behring-Test zeigt, wird mit dem ELISA, der ein erfindungsgemäßes Reagens verwendet, wirksam detektiert, ebenso wie die spezifische Detektion der IgM und der IgG gegen VCA erfolgt.
c) Relevanz des erfindungsgemäßen Reagenses VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) für die differentielle Serumdiagnostik der durch eine Infektion mit EBV produzierten Isotypen.
Die Unterscheidung zwischen einer vergangenen Infektion (gesunder Träger) und einer Primärinfektion die bisher auf der IgM- und IgG-Reaktivität beruht, die mit den Behring-ELISA-Tests erhalten wurden, verwendet das Reagens VCA + EBNA + EA für die Detektion der IgM und IgG.
Die 14 und 15 veranschaulichen die Vergleichsresultate, die mit dem erfindungsgemäßen Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) für die Detektion der humanen IgM-Reaktion in zwei EBV-positiven Populationen, untersucht bezüglich ihres IgG-Wertes, bestimmt durch das erfindungsgemäße Verfahren und durch klassische Verfahren, erhalten wurden.
Die Extinktionswerte, die mit den Patienten, die in der Vergangenheit eine Infektion gezeigt haben (gesunde Träger), erhalten werden, werden auf der X-Achse aufgetragen (14A). Diese Situation stimmt mit den Resultaten überein, die in der klassischen Serologie mit diesem Patiententyp erhalten wurden (IgM-negative und IgG-positive, wie sie mit einem Immunfluoreszenztest bestimmt wurden).
Lediglich eines dieser Seren hat ein starkes IgM-positives Signal mit dem erfindungsgemäßen Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) gegeben, was eine Primärinfektion (14A) anzeigt. Außerdem erhält man während der Immunfluoreszenz ein wichtiges IgG-Signal, man beobachtet nur ein schwaches IgG-Signal.
Dieses Resultat bestätigt eine Reinfektion (oder eine Konvaleszenzphase) in dem Maße, wie die IgA-Reaktion negativ ist; dieses Resultat zeigt das Interesse des erfindungsgemäßen Reagenses in der Detektion verschiedener Isotypen.
Außerdem beobachtet man im ELISA-Test, der mit dem erfindungsgemäßen Reagens durchgeführt wird, eine Verschiebung entlang der X-Achse nach rechts.
Im Fall von primär-infizierten Patienten sind die Werte, die mit den ELISA-Tests erhalten werden, entlang der Y-Achse verstreut.
In der Tat zeigen die 15 (A und B) eine Verteilung in der Diagonalen.
Die Isotypen M und G treten nach Beginn der Infektion nacheinander, aber fast gleichzeitig auf.
Folglich ist es nicht überraschend, den Isotyp G in den Seren von primär-infizierten Patienten zu detektieren.
Eine relativ wichtige Untergruppe von Seren, die weder in der Diagonalen, noch entlang der Y-Achse, aber nahe der X-Achse liegt, zeigt eine latente oder persistente Phase der Infektion für diese Seren in dem Maße an, wie die meisten von ihnen IgA-positiv sind. Diese Situation scheint weniger für die 15B zuzutreffen, in der man einen Rückgang der Anzahl von Seren entlang der X-Achse beobachtet.
In überraschender Weise ermöglichen die erfindungsgemäßen Reagentien auch die Detektion der globalen Ig-Reaktivität (IgG-A-M), wie auch die Detektion der Reaktivität jedes Isotyps (IgG, M oder IgA).
Die oben beschriebenen Resultate sind in der folgenden Tabelle III angegeben.
Diese Tabelle zeigt die Resultate, die für 86 Seren von Personen, die gesunde Träger sind, oder primärinfizierten Personen erhalten werden, wenn nur das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 verwendet wird; für diese zwei Populationen beobachtet man 60% bzw. 51% positive Antworten ohne Spezifitätsverlust.
Legende der Tabelle III: nb = nicht bestimmt; L = Seren von gesunden Trägern (IgM-negativ und IgG-positiv); P = Seren von primär-infizierten Patienten (IgM-positiv und in den meisten Fällen IgG-positiv). Es gibt keine Hinweis bezüglich der IgA mit konventionellen ELISA.
Wenn das erfindungsgemäße Reagens VCAp18/SEQ ID NO:2 + MIXO(P, G) verwendet wird, erreichen die Prozentwerte der positiven Resultate, die in den zwei Populationen erhalten werden, 97% bzw. 100%. Dieses letzte Resultat (Tabelle III, *) hängt von den selektionierten Verwendungskonzentrationen für das Peptid VCAp18/SEQ ID NO:2 ab und betrifft die Gesamt-IgG-A-M-Reaktivität.
Wenn man die Gesamtheit der Resultate betrachtet, so wird zwischen dem klassischen Verfahren und dem Verfahren, das ein erfindungsgemäßes Reagens verwendet (gute Empfindlichkeit) eine gute Korrelation (98,8%) beobachtet.
Dies beweist die Relevanz der IgG-A-M-Serumdetektion, die gewöhnlich als wenig empfindlich und nur IgG-spezifisch angesehen wird.
Wenn man die einzelnen Empfindlichkeiten von IgG, IgA und IgM mit den Resultaten vergleicht, die bei der IgG-A-M-Detektion gemäß der Erfindung erhalten werden, so entspricht die Letztgenannte etwa der Summe der Resultate, die für jeden Isotyp erhalten werden; insbesondere war keines der Isotyp-positiven Seren negativ, wenn eine globale Reaktivität von Ig(GAM) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen wurde.
Diese Resultate zeigen die Spezifität und die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Reagenses.
Außerdem zeigen diese Resultate, dass die Seren der Personen, die in der Vergangenheit eine Infektion hatten, Restwerte an IgM aufweisen.
Die IgM-Reaktivitäten sind überraschend, da sie zu den Resultaten im Gegensatz stehen, die mit den Tests des Standes der Technik beobachtet wurden.
Diese Resultate legen insbesondere nahe, dass die IgM zusammen mit den IgG während eines langen Zeitraums nach der Infektion noch vorliegen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Reagens zur Diagnose einer durch ein Virus hervorgerufenen Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen ein Gemisch umfasst, bestehend aus (1) einem immundominanten Fragment eines Proteins des Virus, das höchstens 60 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen 20 und 30 Aminosäuren, umfasst, und (2) einem Gemisch (als Mixotop bezeichnet) kombinatorischer, konvergenter Peptide, die von dem immundominanten Fragment abgeleitet sind, wobei die Peptide durch vollständige oder partielle künstliche Degeneration des immundominanten Fragments durch systematisches oder partielles Ersetzen jeder Aminosäure durch eine andere nach einer passenden Austauschbarkeitsmatrize erhalten wurden.
Reagens zur Diagnose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es für die Diagnose von Infektionen durch EBV im Wesentlichen ein Gemisch umfasst, bestehend aus (1) einem C-terminalen Fragment Proteins VCAp18, SEQ ID NO. 1 des Epstein-Barr-Virus (EBV), das höchstens 60 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen 20 und 30 Aminosäuren, umfasst, und (2) einem Gemisch oder Mixotop kombinatorischer, konvergenter Peptide, die von dem C-terminalen Fragment abgeleitet sind.
Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das C-terminale Fragment des Proteins VCAp18 aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Peptiden VCAp18/SEQ ID NO. 2, VCAp18/SEQ ID NO. 3, VCAp18/SEQ ID NO. 4 und VCAp18/SEQ ID NO. 5 besteht.
Reagens nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Mixotop einer Degeneration der Gesamtheit der Sequenz des ausgewählten Peptids VCAp18 entspricht.
Reagens nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Mixotop einer partiellen Degeneration der Sequenz des ausgewählten Peptids VCAp18 entspricht.
Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn das Peptid das Peptid VCAp18/SEQ ID NO. 2 ist, die Prolinreste und/oder die Sequenz Gly Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO. 6) vorzugsweise konserviert sind/ist.
Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn das Peptid das Peptid VCAp18/SEQ ID NO. 3 ist, die Prolin- und/oder Serin- und/oder Alanin-Reste der sich wiederholenden Sequenzen vorzugsweise konserviert sind.
Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnetnet, dass, wenn das Peptid das Peptid VCAp18/SEQ ID NO. 4 ist, die Serin- und/oder Prolin- und/oder Alanin-Reste und/oder die Sequenz Gly Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO. 6) und/oder die Sequenz Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala (SEQ ID NO. 7) des Peptids VCAp18/SEQ ID NO. 4 vorzugsweise konserviert sind.
Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn das Peptid das Peptid VCAp18/SEQ ID NO. 5 ist, vorzugsweise die Serin- und/oder Alanin-Reste und/oder die Sequenz Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala (SEQ ID NO. 7) des Peptids VCAp18/SEQ ID NO. 5, konserviert sind.
Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens an einem festen Träger, vorzugsweise Mikrotiterplatten, fixiert ist.
Reagens nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnetv, dass das Verhältnis C-terminales Peptid des Proteins SEQ ID NO. 1: Mixotop in dem Gemisch zwischen 1:10 und 1:100 liegt.
Verfahren zur Diagnose einer viralen Infektion durch ein immunenzymatisches Verfahren, dadurch gekennzeichnetnet, dass es ein Reagens zur Diagnose nach einem der Ansprüche 1 bis 11 verwendet.
Verfahren zur Diagnose nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Diagnose einer Infektion mit EBV durch ein immunenzymatisches Verfahren umfasst: – In-Kontakt-bringen eines zu analysierenden Serums mit einem Reagens nach einem der Ansprüche 2 bis 11, – Zusatz von humanen anti-Ig-Antikörpern, die an ein Enzym gebunden sind, und – qualitative und/oder quantitative Entwicklung von anti-VCA-Antikörpern, die ggf. in dem zu analysierenden Serum vorliegen, durch Zusatz des Substrats des Enzyms.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnetnet, dass es umfasst: – die Fixierung eines Reagens nach einem der Ansprüche 2 bis 11 auf einem Träger wie einer Mikrotierplatte, – Zusatz des zu analysierenden Serums und – Detektion der Fixierung der anti-VCA-Antikörper, die in dem Serum vorliegen, durch Zusatz von humanen anti-Ig-Antikörpern (G-A-M), die an ein Enzym gebunden sind, und – qualitative und/oder quantitative Entwicklung durch Zusatz des Substrats des Enzyms mittels Spektralphotometer.
Verfahren zur Überwachung und differenziellen Detektion der Stadien einer Infektion durch EBV durch ein immunenzymatisches Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – Fixierung eines Reagens nach einem der Ansprüche 2 bis 11 auf einem Träger wie einer Mikrotiterplatte, – Zusatz des zu analysierenden Serums, – Detektion der Fixierung der anti-VCA-Antikörper, die ggf. in dem Serum vorliegen, durch Zusatz von humanen anti-Ig-Antikörpern, die an ein Enzym gebunden sind, wobei die Antikörper aus der Gruppe bestehend aus humanen anti-IgG-Antikörpern, humanen anti-IgM-Antikörpern und humanen anti-IgA-Antikörpern ausgewählt sind, und – qualitative oder quantitative Entwicklung durch Zusatz des Substrates des Enzyms mittels Spektralphotometer.
Verfahren zur frühen Detektion von Krebs des Nasopharynx durch ein immunenzymatisches Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – Fixierung eines Reagens nach einem der Ansprüche 2 bis 11 auf einem Träger wie einer Mikrotiterplatte, – Zusatz des zu analysierenden Serums, – Detektion der Fixierung der anti-VCA-Antikörper, die ggf. in dem Serum vorliegen, durch Zusatz von humanen anti-IgA-Antikörpern, die an ein Enzym gebunden sind, und – qualitative oder quantitative Entwicklung durch Zusatz des Substrates des Enzyms mittels Spektralphotometer.
Kit oder Kassette zur Diagnose einer viralen Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass er/sie mindestens ein Reagens zur Diagnose nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfasst.