DE69811165T2

DE69811165T2 - Heparin-spezifische Glucanase-enthaltende Additivzubereitung und seine Verwendung

Info

Publication number: DE69811165T2
Application number: DE69811165T
Authority: DE
Inventors: Antoinette F. Antignani; Emy Cheng; Jeffrey M. Evans; Nicholas A. Grippi; Bryan S. Wong
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1997-09-04
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2003-10-09
Anticipated expiration: 2018-08-08
Also published as: US20020192734A1; EP0902289A2; JPH11139987A; EP0902289B1; US6187553B1; CA2242693C; JP4575529B2; US6506573B2; EP0902289A3; DE69811165D1; AU7989298A; CA2242693A1; AU753216B2

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Additivpräparat, das Verfahren zur Herstellung des Additivpräparats und das Verfahren der Verwendung des Additivpräparats. Das Additivpräparat ist insbesondere geeignet zur Verwendung in Blutsammelvorrichtungen, bei denen das Additivpräparat in Kontakt mit einer Blutprobe kommt, die zuvor mit Heparin behandelt wurde. Das Additivpräparat umfasst vorzugsweise eine Zubereitung, die Heparinase und ein Kohlenhydrat umfasst. Die Additivzubereitung wird vorzugsweise durch Sprühtrocknen auf die Innenwand einer Blutsammelvorrichtung aufgetragen. Insbesondere weist die Additivzubereitung der vorliegenden Erfindung auch dann Stabilität auf, wenn sie Gammastrahlung ausgesetzt wird.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Heparin ist ein Antikoagulans, das in chirurgischen Verfahren und in der Dialysetherapie zur Verhinderung der Gerinnung in intravenösen Leitungen und bei der Behandlung von thrombolytischen Störungen verwendet wird. Es beeinflusst die Thrombinaktivität, indem es die Wirkung von Antithrombin III (ATIII) katalysiert und dadurch die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin verhindert, was zu einer Hemmung der Gerinnung führt.
Neben seiner Verwendung als Antikoagulans wird Heparin auch auf eine Vielzahl von klinischen Situationen angewendet. Es wird bei Hämodialysebehandlungen verwendet, um zu verhindern, das Blut während der Dialyse gerinnt, und wird als antithrombotisches Mittel bei der Behandlung von tiefer Venenthrombose und bei der orthopädischen Chirurgie verwendet. Als Prophylaktikum von Thrombose wird es in Verbindung mit verlängerter intermittierender intravenöser Verabreichung von Wirkstoffen und Flüssigkeiten verwendet. Vor kurzem wurde Heparin auch in der fibrinolytischen Therapie verwendet, wo es zusammen mit Promotoren des Fibrinabbaus, wie Gewebe-Plasminogen-Aktivator, Streptokinase oder Urokinase verabreicht wird. Daher findet man im Blut zahlreicher Krankenhauspatienten unterschiedliche Mengen an Heparin.
Patienten, die eine Heparintherapie erhalten oder die Heparin durch intravenöse Leitungen ausgesetzt sind, werden häufig durch eine Vielzahl von Mitteln für die Bewertung ihres hämatologischen Status getestet, um die Heparintherapie selbst zu überwachen, oder für biochemische Assays. Die Gegenwart von Heparin in Blutproben, die von heparinisierten Patienten gesammelt wurden, verursacht jedoch mehrere Probleme, da das Heparin die Gerinnung stört und dadurch die Ergebnisse zweideutig oder unerreichbar macht. Diese Probleme beinhalten bei biochemischen Assays die Verlängerung der Gerinnung und die unzureichende Entfernung von Fibrin, was zu einer ständigen und unvorhersagbaren Gerinnselbildung in Proben ohne hinzugefügte Antikoagulantien führt.
Weiterhin erfordern Proben mit identifizierbaren verlängerten Gerinnungszeiten eine zusätzliche Handhabung und längere Herstellungszeiten, um die Heparinstörung zu entfernen oder in den Griff zu bekommen. Wenn Gerinnsel außerdem nicht identifiziert werden, bevor man die Probe auf einem automatischen Analysator testet, können Gerinnsel, die sich innerhalb des Instruments bilden, zu unvollständigen Testergebnissen und/oder einer Verstopfung des Instruments führen. Daher wird die Genauigkeit des Tests verringert, es können unnötige Ausfallzeiten des Instruments notwendig sein, um die Verstopfung aus dem Instrument zu entfernen, es kann notwendig sein, weitere Proben zu erhalten, um den Test zu wiederholen, und die technische Servicezeit wird erhöht.
US-A-5,262,325 offenbart Heparinasezubereitungen, die mit Ammoniumsulfat stabilisiert werden.
Es ist daher wünschenswert, das Problem der Störung durch Heparin mit einem Verfahren zu lösen, das unmittelbar nach der Blutentnahme Heparin zügig und spezifisch aus Blutproben entfernen könnte. Das Additiv, das benötigt wird, um dies zu erreichen, muss über einen breiten Bereich von Bedingungen funktionieren. Zu diesen Bedingungen gehören unter anderem die schnelle Neutralisation von Heparin, während das Additiv selbst während einer längeren Einwirkungszeit keine Wirkungen auf Blutkomponenten ausüben sollte. Weiterhin sollten die behandelten Proben, die Heparin enthalten, dasselbe Ergebnis liefern wie unbehandelte Proben, die Heparin nicht ausgesetzt waren.
Bei der steigenden Nachfrage nach einer Reduktion der Umsatzzeit und nach fibrinfreien Serumproben besteht daher ein Bedürfnis, restliches Heparin aus Proben zu entfernen, die von heparinisierten Patienten entnommen wurden.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft eine gammastrahlungsstabile Additivzubereitung, die ein für Heparin spezifisches, abbauendes Glucanase-Enzym und einen Stabilisator umfasst. Die Zubereitung kann effektiv als Additiv in einem Röhrchen verwendet werden, um restliches Heparin in Proben, die von heparinisierten Patienten entnommen wurden, zu neutralisieren und die Gerinnung zu beschleunigen. Außerdem ist die Zubereitung strahlungsstabil. Wenn die Additivzubereitung in einem Blutsammelröhrchen verwendet wird, ist sie nützlich, um Störungen durch Heparin in einer Blutprobe effektiv zu minimieren, ohne die klinische Analyse zu stören.
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Additivzubereitung, umfassend:
(a) ein für Heparin spezifisches, abbauendes Glucanase-Enzym; und
(b) einen Stabilisator, der aus Trehalose, Mannit oder Mannose ausgewählt ist.
Die Additivzubereitung umfasst vorzugsweise ein für Heparin spezifisches, abbauendes Glucanase-Enzym, wie vorzugsweise Heparinase.
Vorzugsweise soll der Stabilisator der Additivzubereitung während des kontrollierten Trocknens und der Lagerung der Zubereitung bei erhöhter Temperatur für Heparinase-Stabilität sorgen, so dass die Heparinase stabil sein kann.
Eine effektive Additivzubereitung, die Heparinase und Trehalose umfasst, kann auf die Wand eines Röhrchens aufgesprüht und im Röhrchen durch kontrolliertes Trocknen und vorherige Entfernung von Sauerstoff im Röhrchen durch Rückspülen mit einem alternativen Gas strahlungsstabil gemacht werden.
Die Additivzubereitung kann weiterhin eine Pufferlösung umfassen, so dass die Zubereitung pH-Änderungen widersteht.
Am meisten bevorzugt umfasst die Additivzubereitung:
(a) 50 IE/ml bis 80 IE/ml des für Heparin spezifischen, abbauenden Glucanase-Enzyms;
(b) 8 Gew.-% bis 12 Gew.-% eines Stabilisators; und
(c) 15 ml eines 150 millimolaren (mM) Puffers.
Die Heparinase-Einheit ist eine Internationale Einheit (IE), bei der es sich um die Menge an Heparinase handelt, die die Bildung von 1 Mikromol Doppelbindungen pro Minute bewirkt, bezogen auf einen molaren Extinktionskoeffizienten von 5,1 bei 232 nm für die Abbauprodukte, die ungesättigten Uronsäuren.
Am meisten bevorzugt wird die Additivzubereitung in einer Sammelvorrichtung, wie einem Blutsammelröhrchen, verwendet, wobei der Zubereitung durch Sprühtrocknen auf die Innenseite des Röhrchens aufgetragen wird.
Additivzubereitung der vorliegenden Erfindung sind geeignet, um für eine Neutralisation von Heparin und eine Gerinnung von Blutproben zu sorgen.
Ein weiteres Attribut der Additivzubereitung besteht darin, dass sie stabil ist, wenn sie erhitzt, getrocknet und bestrahlt wird.
Vorteile des Additivs bestehen darin, dass es eine Heparinneutralisation einer Blutprobe von einem heparinisierten Patienten schneller und vollständiger erreicht als mit anderen verfügbaren Verfahren. Wenn die Additivzubereitung in einem Blutsammelröhrchen verwendet wird, ist sie daher geeignet, um Heparin im Wesentlichen aus einer Blutprobe zu entfernen, ohne die klinische Analyse zu stören. Die Kombination der Heparinase und Trehalose im richtigen Verhältnis ist nützlich, um die Störung der Gerinnung aufgrund der Gegenwart von Heparin zu beseitigen. Daher wird die Additivzubereitung die Deaktivierung von restlichem Heparin in Proben, die von heparinisierten Patienten gewonnen wurden, unterstützen. Dieses Verfahren reduziert die Handhabung von Proben von heparinisierten Patienten, wobei die laufende Handhabung die manuelle Entfernung von latentem Fibrin aus langsam gerinnenden Proben erfordert. Daher umgeht das Verfahren die Notwendigkeit einer Identifizierung von problematischen Proben oder Patientenpopulationen.
Ein Vorteil der Additivzubereitung, die Heparinase und Trehalose sowie Sauerstoffentfernung umfasst, ist eine einzigartige wärme- und strahlungsstabile Zubereitung. Die Zubereitung ergibt im Wesentlichen eine Rückgewinnung von 50% bis 60% nach der Einstrahlung.
Ein wichtiges Attribut der Zubereitung der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie auch dann Stabilität zeigt, wenn sie Gammastrahlung ausgesetzt wird.
Ein Verfahren zum Schützen von Heparinase vor einer Denaturierung während des Trocknens und während der Bestrahlung umfasst die Schritte des Einbaus einer effektiven Menge Trehalose in die Heparinase. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, um Heparinase bei einer Temperatur oberhalb Umgebungstemperatur zu trocknen, indem man Trehalose in die Heparinase einbaut, die sprühgetrocknet werden soll, und anschließend vor der Bestrahlung Sauerstoff entfernt, indem man das Röhrchen mit einem Gasgemisch von CO&sub2;/H&sub2; im Verhältnis 80 : 20 rückspült.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht eines typischen Blutsammelröhrchens mit einem Stopfen.
Fig. 2 ist eine Längsschnittansicht des Röhrchens von Fig. 1 entlang der Linie 2-2, das die sprühgetrocknete Additivzubereitung der vorliegenden Erfindung umfasst.

Ausführliche Beschreibung

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Additivzubereitung vorzugsweise;
(a) Heparinase; und
(b) Trehalose.
Heparinase ist eine Zusammensetzung, die die Störung der normalen Blutfunktion durch Heparin beseitigen kann. Die Heparinase, die in der Additivzubereitung der vorliegenden Erfindung vorhanden ist, ist so ausgewählt, dass sie restliches Heparin in Proben, die von heparinisierten Patienten gewonnen wurden, neutralisiert.
Heparinase 1 (EC 4.2.2.7) ist ein Enzym, das von Flavobacterium heparinum, einem Gram-negativen nichtpathogenen Bakterium, abgeleitet ist. Heparinase spaltet Heparin an 11 aktiven Zentren (α-glycosidischen Bindungen), einschließlich der ATIII-Bindungsstelle, und kann Heparin in einer Probe deaktivieren und so die normale Gerinnselbildung ermöglichen.
Die bevorzugte Heparinase in der Additivzubereitung ist eine Heparinase, die von Flavobacterium heparinum isoliert ist. Sie hat eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0, einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und bei 37ºC, wobei die Antikoagulans-Komponente bei einem pH-Wert von etwa 7,0, einer Leitfähigkeit zwischen 3 und 12 Millisiemens nicht an ein polysulfatiertes Harz bindet und die Heparinase bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Leitfähigkeit zwischen 3 und 12 Millisiemens an ein polysulfatiertes Harz bindet. Das Verfahren der Herstellung und Verwendung von Antikoagulans-freier Heparinase ist in US-A-5,338,677 und 5,262,325 beschrieben. Eine hochgradig gereinigte bakterielle Heparinase ist von IBEX Technologies, St. Laurent, Quebec, Kanada, erhältlich.
Vorzugsweise ist Heparinase in der Additivzubereitung in einer Menge von 50 IE/ml bis 80 IE/ml und am meisten bevorzugt etwa 65 IE/ml vorhanden.
Ein Stabilisator ist eine Komponente, die für den Schutz von Enzymen und Proteinen sorgen kann, indem er die makromolekulare Struktur derselben während des Trocknens aufrechterhält.
Stabilisatoren sind typischerweise durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, für einen Schutz gegenüber chemischem Abbau während der Bestrahlung und Lagerung bei erhöhter Temperatur zu sorgen.
Für die Additivzubereitung ist eine spezifische Auswahl von Stabilisatoren erforderlich, so dass die Aktivität von Heparinase während des Erhitzens, Trocknens und/oder der Bestrahlung aufrechterhalten wird.
Am meisten bevorzugt handelt es sich bei dem Stabilisator in der Additivzubereitung um Trehalose.
Vorzugsweise ist Trehalose in der Additivzubereitung in einer Menge von 8 Gew.-% bis 12 Gew.-% und am meisten bevorzugt 10 Gew.-% vorhanden.
Trehalose, α-D-Glucopyranosyl-α-D-glucopyranosid, ist ein natürlich vorkommendes nichtreduzierendes Disaccharid, das typischerweise mit dem Zellschutz verbunden ist. Es ist bekannt, dass manche Organismen, sowohl pflanzliche als auch tierische, einer Austrocknung bis auf sehr geringe Niveaus des Körperwassers während Dürrebedingungen widerstehen können. Zu diesen Organismen gehören Cysten von Salinenkrebschen (Artemia salina), die Rose von Jericho (Selaginella lepidophylla) und die Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae). Ihnen allen ist ein Merkmal gemeinsam, die Gegenwart von großen Mengen Trehalose in ihren Zellen.
Es gibt zwar keine allgemein anerkannte Ansicht darüber, wie Trehalose ihre schützenden Wirkungen auf Zellen ausübt, doch besagt eine Hypothese, dass sie an die Stelle des an Membrankomponenten des lebenden Organismus gebundenen Wassers tritt und eine Denaturierung aufgrund des Verlusts von gebundenem (strukturellem) Wasser verhindert. Es hat sich auch gezeigt, dass die Wirkung nicht nur in lebenden Zellen ausgeübt wird, sondern überraschenderweise auch bei Makromolekülen selbst im gereinigten isolierten Zustand.
Trehalose wird in der vorliegenden Erfindung verwendet, um die Stabilität der Heparinase zu erhalten. Heparinase kann nur für kurze Zeit gelagert werden, und die Stabilität von Heparinase wird beim Erhitzen und bei Bestrahlung verringert. Durch Kombination von Trehalose mit Heparinase bleibt die Stabilität der Heparinase erhalten, wenn sie erhitzt und/oder getrocknet wird, und durch Entfernung von Sauerstoff wird die Stabilität weiter konserviert, wenn bestrahlt wird.
Vermutlich konserviert Trehalose die Struktur und Funktion von Heparinase im trockenen Zustand aufgrund von Wasserstoffbrücken von Trehalosemolekülen über ihre Hydroxygruppen zu geeigneten Gruppen an dem Makromolekül. Auf diese Weise nimmt Trehalose den Platz von strukturellen (gebundenen) Wassermolekülen ein, so dass es keinen Zusammenbruch der makromolekularen Struktur beim Sprühtrocknen der Zubereitung und später, wenn die Zubereitung bestrahlt wird, gibt. Die Trehalose wirkt als Trockengerüst, das die strukturelle Integrität der Heparinase erhält.
In der Zubereitung der vorliegenden Erfindung kann auch eine Pufferlösung verwendet werden, um ein wässriges Medium für die Zubereitung zu erhalten, das Änderungen im pH-Wert widersteht.
Zu den Puffern, die in der Zubereitung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, gehören Tris, Natriumchlorid und Natriumphosphat. Der am meisten bevorzugte Puffer ist Natriumphosphat aufgrund seiner pH-Pufferungskapazität.
Vorzugsweise ist Natriumphosphat in der Additivzubereitung in einer Menge von 15 ml einer 150 mM Lösung vorhanden.
Die Additivzubereitung der vorliegenden Erfindung wird wie folgt für das Sprühtrocknen vorbereitet:
(a) Messen der Aktivität der Heparinase;
(b) Einstellen der Aktivität der Heparinase auf 50 IE/ml bis 80 IE/ml durch Hinzufügen von 15 ml eines 150 mM Natriumphosphat-Puffers zu der Heparinase;
(c) Hinzufügen von 8 Gew.-% bis 12 Gew.-% Trehalose zu der Heparinase unter Bildung der Additivzubereitung;
(d) Filtern der Zubereitung durch ein 0,22-um-Filter zur Entfernung von mikrobiellen Verunreinigungen; und
(e) Sprühbeschichten der Innenseite des Röhrchens (6 ml Kapazität) mit 10 bis 20 Mikroliter der gefilterten Zubereitung.
Weitere Bestandteile, die in verschiedenen Additivzubereitungen, die sich auf Gerinnungsaktivatoren beziehen, herkömmlich oder wünschenswert sind, können ebenfalls zu der Zubereitung gegeben werden, solange sie die Gesamteigenschaften der Additivzubereitungszusammensetzung nicht beeinträchtigen. Zu diesen Gerinnungsaktivatoren gehören unter anderem Siliciumoxid, Thrombin und Eleginsäure.
Falls gewünscht, kann die Additivzubereitung auch Gele und Tenside enthalten.
Am meisten bevorzugt kann die Additivzubereitung der vorliegenden Erfindung in Blutsammelvorrichtungen verwendet werden, insbesondere in Blutsammelröhrchen. Bei den Blutsammelröhrchen kann es sich entweder um eine evakuierte Blutsammelvorrichtung oder um eine nichtevakuierte Blutsammelvorrichtung handeln. Die Blutsammelvorrichtung besteht vorzugsweise aus Kunststoff, wie unter anderem Polyethylenterephthalat oder Polypropylen, oder Glas.
Wir beziehen uns nun auf die Zeichnungen, bei denen sich überall in den mehreren Ansichten gleiche Bezugszeichen auf gleiche Teile beziehen. Fig. 1 zeigt ein typisches Blutsammelröhrchen 10 mit einem offenen Ende 16, einem geschlossenen Ende 18 und einem Stopfen 14, der einen unteren ringförmigen Teil oder Saum 15 umfasst, der sich in das Röhrchen hinein erstreckt und gegen die Innenwand 12 des Röhrchens drückt, um den Stopfen 14 an Ort und Stelle zu halten.
Fig. 2 zeigt die Verwendung der Additivzubereitung der vorliegenden Erfindung in einem typischen Blutsammelröhrchen. Eine Additivzubereitung 20 ist auf der Innenwand des Röhrchens gezeigt.
Eine interessierende Blutprobe kann in das Röhrchen 10 übertragen werden, das die Additivzubereitung 20 umfasst, wobei die Probe mit der Additivzubereitung in Berührung kommt, so dass sich die Zubereitung schnell in der Probe auflöst und gegebenenfalls vorhandenes Heparin neutralisiert. Dann lässt man das Röhrchen 10 gerinnen, und danach wird es zentrifugiert, und das Serum der Probe ist fertig für die Analyse.
Das Verfahren zur Herstellung einer Sammelvorrichtung mit der Additivzubereitung der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:
(a) Herstellen einer Additivzubereitung, die ein Gemisch aus 150 mM Natriumphosphat-Puffer, 50 IE/ml bis 80 IE/ml Heparinase und 8 Gew.-% bis 12 Gew.-% Trehalose bei einem pH-Wert von 6,95 bis 7,05;
(b) Filtern der Zubereitung durch ein 0,22-um-Filter;
(c) Auftragen von 10 bis 20 ul der Additivzubereitung auf die innere Wandfläche einer Sammelvorrichtung mit einer Einrichtung, die einen feinen Nebel der Zubereitung erzeugt;
(d) Trocknen der aufgetragenen Zubereitung durch Anwenden eines Luftstrahls oder Gebläsewinds auf die Innenwand der beschichteten Vorrichtung bei 25 bis 30ºC während eines Zeitraums von 5 bis 10 Minuten;
(e) Vakuumtrocknen der Sammelvorrichtung während 2 Stunden bei 35ºC und unter 80 kPa (600 Millimeter Hg);
(f) Entfernen von Sauerstoff aus der Vorrichtung durch Rückspülen der Vorrichtung mit einem Gasgemisch von CO&sub2;/H&sub2; (80 : 20);
(g) Verschließen der Vorrichtung mit einem Stopfen; und
(h) Bestrahlen der Vorrichtung und der Zubereitung mit Gammastrahlung innerhalb von 2 bis 5 Stunden nach Schritt (g) mit 1,5 Mrad.
Vorzugsweise wird die Additivzubereitung mit einer Vorrichtung des volumetrischen Typs, wie einer Verdrängungspumpe, in die Sammelvorrichtung, wie ein Blutsammelröhrchen, eindosiert und ausgegeben. Die Zubereitungskonzentration (Menge der Heparinase und Trehalose pro Volumeneinheit der Zubereitung) wird mit dem Ausgabevolumen maßgeschneidert, so dass die gewünschte Menge der Zubereitung in die Vorrichtung ausgegeben wird. Eine weitere Sprühtechnik ist das Ultraschallsprühen.
Die Additivzubereitung der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um die physiologischen Wirkungen von Heparin auf Blutkomponenten in einem Gemisch von Blutkomponenten und von Heparin in einem Blutsammelröhrchen zu beseitigen, und zwar nach dem folgenden Verfahren:
(a) Herstellen einer Additivzubereitung, die Heparinase, Trehalose und einen Puffer umfasst;
(b) Auftragen der Additivzubereitung durch Sprühbeschichtung auf die Innenwand eines Blutsammelröhrchens;
(c) Trocknen der aufgetragenen Zubereitung durch Anwendung eines Luftstrahls oder Gebläsewinds auf die Innenwand des beschichteten Röhrchens bei 25 bis 30ºC und während 5 bis 10 Minuten;
(d) Vakuumtrocknen der aufgetragenen Zubereitung während 2 Stunden;
(e) Entfernen des Sauerstoffs aus dem Röhrchen durch Rückspülen des Röhrchens mit einem Gasgemisch von CO&sub2;/H&sub2; (80/20);
(f) Verschließen des Röhrchens mit einem Stopfen;
(g) Bestrahlen der Röhrchen innerhalb von 2 bis 5 Stunden nach dem Verschließen mit 1,5 Mrad;
(h) Einfüllen einer heparinhaltigen Blutprobe in das Röhrchen;
(i) Mischen der Probe im Röhrchen mit der Additivzubereitung durch 5- bis 10maliges Umdrehen von Hand; und
(j) Gerinnenlassen der Probe.
Die folgenden Beispiele sind nicht auf irgendeine spezielle Ausführungsform der Erfindung beschränkt, sondern nur beispielhaft.

Beispiel 1

Verfahren zur Herstellung der Additivzubereitung

Eine Additivzubereitung wurde hergestellt, indem man in einem Gefäß mit der geeigneten Größe während einer ausreichenden Zeit, um Homogenität zu gewährleisten, mischte, so dass eine Zubereitung mit den folgenden Bestandteilen entstand: Tabelle 1
Zuerst wurde die Aktivität der Heparinase gemessen. Dann wurde die Aktivität der Heparinase durch Zugabe von etwa 15 ml 150 mM Natriumphosphat auf etwa 50 bis etwa 80 IE/ml eingestellt.
Dann wurden etwa 8 bis etwa 12 Gew.-% Trehalose zu der Heparinase gegeben, um die Additivzubereitung zu bilden. Dann wurde die Zubereitung durch einen 0,22-um-Filter gefiltert, um mikrobielle Verunreinigungen zu entfernen.

Beispiel 2

Verfahren zur Vorbereitung einer Sammelvorrichtung mit der Additivzubereitung

Etwa fünfzehn (15) Mikroliter der Zubereitung, die in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde durch Sprühbeschichtung in jeweils 100 Röhrchen (Vacutainer Brand Plus Serumröhrchen, 6 ml, Katalognummer 367815, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) eingebracht. Jedes Röhrchen wurde dann bei etwa 25 bis etwa 30ºC an der Luft getrocknet. Dann wurden die Röhrchen etwa 2 Stunden lang bei etwa 35ºC und unter etwa 80 kPa (600 mm Hg) getrocknet. Nach den 2 Stunden wurden die Röhrchen mit einem Gasgemisch von CO&sub2;/H&sub2; (80/20) rückgespült, mit einem Stopfen verschlossen und innerhalb von 2 bis 5 Stunden nach dem Verschließen bestrahlt.

Beispiel 3

Stabilität der Additivzubereitung

Die Additivzubereitung, die in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde auf Hitze- und Bestrahlungsstabilität getestet. Ein Röhrchen, das nur sprühgetrocknete Heparinase (keine Trehalose) enthielt, ein Röhrchen, das die Zubereitung der vorliegenden Erfindung, wie sie in den Beispielen 1 und 2 hergestellt wurde, enthielt (mit Sauerstoffentfernung und Rückspülen), und ein Röhrchen, das die Zubereitung der vorliegenden Erfindung, wie sie in den Beispielen 1 und 2 hergestellt wurde, jedoch ohne Sauerstoffentfernung (kein Rückspülen) enthielt, wurden auf Wärmestabilität getestet. Wie in Tabelle 2 angegeben ist, wurden die Röhrchen bei 25ºC bzw. 40ºC aufbewahrt, und dann wurde die prozentuale Rückgewinnung an Heparinase anhand der Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Ergebnisse der Heparinase-Rückgewinnung (% rückgewonnene Heparinase-Aktivität vs. berechnete aufgetragene Heparinase-Aktivität)
Wie durch die in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse gezeigt wird, liefert die Trehalose Temperaturstabilität für die Rückgewinnung der Heparinase. Auf der Basis der in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse wird vermutet, dass der Heparinase-Abbau während der Bestrahlung mit restlicher Feuchtigkeit und/oder der Anwesenheit von Sauerstoff verbunden ist. Daher kann der Heparinase-Abbau während der Bestrahlung mit Kombinationen von Trocknen und Sauerstoffentfernung eingedämmt werden, indem man den Sammelbehälter rückspült, wie in diesem Beispiel gezeigt ist.

Beispiel 4

Vergleichende Analyse der Gerinnung von heparinisiertem Blut mit und ohne Heparinase

Ein Aliquot von mit Lithiumheparin behandeltem Vollblut wurde in gleichem Maße in Röhrchen Nr. 2, das die Additivzubereitung der vorliegenden Erfindung enthielt, wie sie in den Beispielen 1 und 2 hergestellt wurde, und in Röhrchen Nr. 3, das keine Additivzubereitung enthielt, übertragen. Ein Aliquot unbehandeltes Vollblut (kein Heparin) wurde in Röhrchen Nr. 1 gegeben, bei dem es sich um eine Kontrolle handelte, die kein Heparin oder Heparinase enthielt. Jede Probe wurde bewertet, um zu bestimmen, ob das Heparin in der Blutprobe neutralisiert wurde. Jedes Röhrchen wurde in Abständen von 5 bis 10 Minuten auf Anzeichen einer Gerinnung untersucht, und die endgültigen Gerinnungszeiten sind in Tabelle 3 gezeigt.
Die Zubereitung der vorliegenden Erfindung neutralisierte Heparin in humanem Blut, indem sie das Eintreten der normalen Gerinnselbildung in 40 Minuten erlaubte, wie durch die Ergebnisse gezeigt wird, die für Röhrchen Nr. 2 angegeben sind. Bei Röhrchen Nr. 3, das Heparin enthielt, aber nicht die Zubereitung der vorliegenden Erfindung enthielt, gerann die Blutprobe nicht, sondern blieb durch das Heparin antikoaguliert. Röhrchen Nr. 1 ohne Heparin oder Heparinase ließ das Blut in 15 Minuten gerinnen. Tabelle 3 Gerinnungsstudie mit heparinisiertem Blut, das in Röhrchen gesammelt wurde, die Heparinase enthalten
* nach Bestrahlung mit Verlust von 50%

Claims

1. Additivzubereitung, umfassend:

(a) ein für Heparin spezifisches, abbauendes Glucanase-Enzym; und

(b) einen Stabilisator, der aus Trehalose, Mannit oder Mannose ausgewählt ist.

2. Additivzubereitung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem für Heparin spezifischen, abbauenden Glucanase-Enzym um Heparinase handelt.

3. Additivzubereitung gemäß Anspruch 1, umfassend:

(a) 50 IE/ml bis 80 IE/ml des für Heparin spezifischen, abbauenden Glucanase-Enzyms;

(b) 8 Gew.-% bis 12 Gew.-% des Stabilisators; und

(c) 15 ml eines 150 millimolaren (mM) Puffers.

4. Verfahren zur Beseitigung der physiologischen Wirkungen von Heparin auf Blutkomponenten in einem Gemisch von Blutkomponenten und Heparin in einem Blutsammelröhrchen, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Herstellen einer Additivzubereitung, die ein für Heparin spezifisches, abbauendes Glucanase-Enzym und einen Stabilisator, der aus Trehalose, Mannit oder Mannose ausgewählt ist, umfasst;

(b) Auftragen der Additivzubereitung auf die Innenwand eines Blutsammelröhrchens durch Sprühbeschichtung;

(c) Trocknen der aufgetragenen Zubereitung durch Anwendung eines Luftstrahls oder Gebläsewinds auf die Innenwand des beschichteten Röhrchens bei 25 bis 30ºC und während 5 bis 10 Minuten;

(d) Vakuumtrocknen der Innenwand des Röhrchens während 2 Stunden;

(e) Entfernen des Sauerstoffs aus der Innenwand des Röhrchens durch Rückspülen des Röhrchens mit einem gasförmigen Gemisch von CO&sub2; und H&sub2;;

(f) Verschließen des Röhrchens mit einem Stopfen;

(g) Bestrahlen der Röhrchen innerhalb von 2 bis 5 Stunden nach dem Verschließen mit 1,5 Mrad;

(h) Einfüllen einer heparinhaltigen Blutprobe in das Röhrchen;

(i) Mischen der Probe im Röhrchen mit der Additivzubereitung durch 5- bis 10maliges Umdrehen von Hand; und

(j) Gerinnenlassen der Probe.

5. Verfahren zur Herstellung einer Additivzubereitung, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Messen der Aktivität von Heparinase;

(b) Mischen der Heparinase mit 150 mM Natriumphosphat, so dass die Aktivität der Heparinase auf 50 bis 80 IE/ml eingestellt wird;

(c) Hinzufügen von 8 bis 12% Trehalose zu dem Gemisch; und

(d) Filtern des Gemischs durch ein 0,22-um-Filter.

6. Röhrchen (10) zum Präparieren einer Heparinprobe für die Gerinnung, umfassend ein oberes Ende (16), ein unteres Ende (18), eine Seitenwand, die sich von dem oberen Ende (16) zu dem unteren Ende (18) erstreckt und eine äußere und eine innere Oberfläche (12) beinhaltet, wobei sich auf der inneren Oberfläche des Röhrchens eine durch Sprühbeschichtung aufgetragene Additivzubereitung (20) befindet, die ein Gemisch aus einem Puffer, Heparinase und Trehalose umfasst.

7. Verfahren zur Herstellung eines Röhrchens für die Handhabung einer Heparinprobe für die Gerinnung, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen eines Behälters mit einem offenen Ende, einem geschlossenen Ende, einer Seitenwand, die sich zwischen dem offenen Ende und dem geschlossenen Ende erstreckt und eine innere Wandfläche und eine äußere Wandfläche beinhaltet;

(b) Herstellen einer Additivzubereitung, die ein Gemisch aus Natriumphosphat, Heparinase und Trehalose umfasst;

(c) Auftragen der Zubereitung auf die innere Wandfläche des Röhrchens in Form eines feinen Nebels;

(d) Trocknen der Zubereitung durch Anwenden eines Gebläsewinds während eines ausreichenden Zeitraums, so dass die Zubereitung trocknet und eine trockene Zubereitung zurückbleibt;

(e) Vakuumtrocknen der Innenwand des Röhrchens während 2 Stunden bei 35ºC und unter 80 kPa (600 Millimeter Hg);

(f) Entfernen von Sauerstoff aus dem Röhrchen durch Rückspülen mit einem gasförmigen Gemisch von CO&sub2;/H&sub2; in einem Mischungsverhältnis von 80 : 20;

(g) Verschließen des Röhrchens mit einem Stopfen; und

(h) Bestrahlen des Röhrchens und der Zubereitung mit Gammastrahlung.