DE69810925T2

DE69810925T2 - Verwendung eines kationischen Polymer zur Herstellung von Nukleinsäure-Komplexe und verwandte Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69810925T2
Application number: DE69810925T
Authority: DE
Inventors: Hanno V.J. Kolbe; Otmane Boussif
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1998-08-28
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2004-01-08
Anticipated expiration: 2018-08-29
Also published as: CA2281442A1; EP0987029B1; AU4472799A; DE69810925D1; ATE231399T1; ES2191269T3; DK0987029T3; AU750696B2; JP2000135082A; EP0987029A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Komplexe und Zusammensetzungen, die kationische Polymere und Nukleinsäuren umfassen. Spezieller betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Übertragen von Nukleinsäuren in eine Zelle, spezieller eine Säugerzelle.
Gentherapie ist allgemein in erster Linie zur Anwendung bei vererbbaren Mangelkrankheiten (zystische Fibrose, Dystrophien, Hämophilien,...) konzipiert worden, wo eine dauerhafte Heilung durch Einführen eines funktionellen Gens bewirkt werden kann. Jedoch könnte eine viel größere Gruppe von Erkrankungen, ganz besonders erworbene Erkrankungen (Krebs, AIDS, multiple Sklerose,...), durch vorübergehendes Konstruieren von Wirtszellen zum Erzeugen vorteilhafter Proteine behandelbar sein.
Eine andere Anwendung von Gentherapie ist Impfung. Diesbezüglich kann das immunogene Produkt, das durch die Nukleinsäure, die in Zellen eines Wirbeltiers eingeführt wird, kodiert wird, exprimiert und sezerniert werden oder durch die Zellen im Rahmen der Haupthistokompatibilitätsantigene präsentiert werden, wodurch eine Immunantwort gegen das exprimierte Immunogen ausgelöst wird. Eine funktionelle Nukleinsäure kann durch die verschiedensten Techniken in Zellen eingeführt werden, was entweder zu einer vorübergehenden Expression des Gens von Interesse, als vorübergehende Transfektion bezeichnet, oder zu einer dauerhaften Transformation der Wirtszellen führt, die aus einem Einbau der Nukleinsäure in das Wirtsgenom resultiert.
Eine erfolgreiche Gentherapie hängt von der effizienten Abgabe und Expression genetischer Information innerhalb der Zellen eines lebenden Organismus ab. Die meisten Abgabemechanismen, die bis heute verwendet werden, beteiligen Virusvektoren, insbesondere Adeno- und Retrovirusvektoren. Viren haben verschiedene und äußerst raffinierte Mechanismen zum Erreichen dieses Ziels entwickelt, die Durchqueren der Zellmembran, Entschlüpfen aus Endosomen und lysosomalen Abbau und schließlich Abgabe ihres Genoms an den Kern, gefolgt von der Expression des Virusgenoms, einschließen. Folglich sind Viren bei vielen Genabgabeanwendungen bei Impfung oder bei Menschen angewandter Gentherapie verwendet worden. Die Verwendung von Viren leidet an vielen Nachteilen: Retrovirusvektoren können großdimensionierte DNS (z. B. das Dystrophingen, etwa 13 kb) nicht einbauen, das Retrovirusgenom wird in Wirtszellen-DNS integriert und kann so genetische Veränderungen in der Empfängerzelle verursachen, und infektiöse Viruspartikel könnten sich innerhalb des Organismus oder in der Umgebung verbreiten; Adenovirusvektoren können eine starke Immunantwort bei behandelten Patienten auslösen (Mc Coy et al., 1995, Human Gene Therapy, 6, 1553-1560; Yang et al., 1996, Immunity, 1, 433-442). Dennoch sind Virusvektoren trotz dieser Nachteile zur Zeit wegen ihrer Effizienz die nützlichsten Abgabesysteme.
1990 haben Wolff et al. (Science, 247, 1465-1468) gezeigt, dass die Injektion nackter RNS oder DNS ohne irgendein spezielles Abgabesystem direkt in einen Mausskelettmuskel zu einer Expression von Reportergenen innerhalb der Muskelzellen führt. Obgleich diese Ergebnisse zeigen, dass eine Nukleinsäure von selbst in bestimmten Zellen in vivo endgültig gelangen kann, bleibt die Effizienz der Transfektion, die tatsächlich beobachtet wird, dennoch sehr begrenzt, insbesondere aufgrund der polyanionischen Beschaffenheit von Nukleinsäuren, die deren Durchgang durch negativ geladene Zellmembranen beschränkt.
Verschiedene Verfahren sind in der Literatur vorgeschlagen worden, die auf der Verwendung nicht-viraler synthetischer Vektoren basieren, um die intrazellulare Aufnahme von Nukleinsäuren zu verbessern, die potentielle Vorteile in Bezug auf großtechnische Herstellung, Sicherheit, das Abzielen auf transfizierbare Zellen, geringe Immunogenität und die Kapazität zum Abgeben großer DNS-Fragmente bieten. So schlugen Felgner et al. (Nature, 337, 387-388) 1989 die Verwendung kationischer Lipide vor, um die Einführung großer anionischer Moleküle wie Nukleinsäuren, in Zellen zu erleichtern. Diese kationischen Lipide können Komplexe mit anionischen Molekülen bilden, wobei sie folglich dazu neigen, die negativen Ladungen dieser Moleküle zu neutralisieren, wobei gestattet wird, den Komplex zu verdichten, und seine Einführung in die Zelle begünstigt wird. Beispiele Lipidvermittelter Transfektionsverbindungen sind DOTMA (Felgner et al., 1987, PNAS, 84, 7413 -7417), DOGS oder Transfectam^TM(Behr et al., 1989, PNAS, 86, 6982-6986), DMRIE oder DORIS (Felgner et al., 1993, Methods 5, 67-75), DC-CHOL (Gao et Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285), DOTAP^TM(McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2, 674-622) oder Lipofectamine^TM.
Andere nicht-virale Abgabesysteme sind entwickelt worden, die auf Polymer-vermittelter Transfektion basieren. Es hat viele Berichte über die Verwendung für eine zellulare Abgabe anionischer Polymere wie zum Beispiel Polyamidoamin (Haensler et Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4, 372-379), dendritisches Polymer (WO 95/24221), Polyethylenimin oder Polypropylenimin (WO 96/02655), Polylysin (US-A-S 595 897 oder FR-A-2 719 316), gegeben.
Jedoch haben mehrere Untersuchungen (zum Beispiel Mahato et al., J. Pharm. Sci., 1995, 84, 1267-1271, Thierry et al., 1995, PNAS 92, 9742-9746) gezeigt, dass die Übertragungseffizienz der komplexierten Nukleinsäuren in die Zellen, insbesondere im Fall von in vivo-Übertragung, in Abhängigkeit von der Wechselwirkung zwischen den Komplexen und den Zellmembranen, dem beteiligten Zelltyp, der Lipidzusammensetzung der kationischen Komponenten, der Größe der mit den anionischen Molekülen gebildeten Komplexe und insbesondere dem Verhältnis der positiven zu negativen Ladungen der verschiedenen Komponenten des Komplexes variieren kann. Zur Zeit ist sehr wenig bezüglich der Mechanismen, die die Wechselwirkung der Komplexe mit den Zellmembranen und die Übertragung der Komplexe in die Zelle ermöglichen, bekannt und die laufende Forschung bleibt äußerst empirisch. Folglich besteht ein Bedarf, verbesserte Verfahren zum Steigern der intrazellularen Aufnahme von Nukleinsäuren zu entwickeln, die auf Komplexen mit Eigenschaften, die von den schon beschriebenen verschieden sind, basieren.
Polyvinylamin ist schon in Arzneimitteln als Hypercholesterinämieregulator in speziellen Diäten (EP-A-580 078, EP-A-580 079) verwendet worden, aber regt keinen Fachmann an, es bei einer Gentherapieanwendung zu verwenden.
US-A-S 629 184 beschreibt Zusammensetzungen für eine zellulare Aufnahme von Polynucleotiden, die Copolymere aus Vinylalkohol und wechselnden Anteilen Vinylamin (von 0,5 bis 75 Mol-%) umfassen. Diese Autoren haben ihre Zusammensetzungen in vitro geprüft und haben daraus geschlossen, dass im Allgemeinen hohe Aminoanteile zu einer in einem Zerfall der Zellen resultierenden Zytotoxizität führen, während niedrigere Anteile zu einer endosomalen/lysosomalen Verteilung der Polynucleotide führen.
Die Französischen Patentanmeldungen FR 97/09209 und FR 97/15807 (Anmeldenummern) zeigen, dass Polyallylamine der allgemeinen Formel
mit p im Bereich von 2 bis 1000
relativ toxisch für Zellen sind und deshalb für Gentherapieanwendungen nicht angezeigt sind.
Der Anmelder hat jetzt neue Komplexe und Zusammensetzungen identifiziert, die kationische Polymere umfassen, die überraschenderweise ein effizientes System bereitstellen, um die zelluläre Abgabe von Nukleinsäure in Zellen mit geringer Toxizität zu erreichen, und die deshalb eine Anwendung bei einer in vivo-Gentherapie finden können.
So betrifft die vorliegende Erfindung zuerst einen Komplex, umfassend:
a) mindestens ein Polymer der allgemeinen Formel
wobei:
der Polymerisationsgrad p von 2 bis 1000000 beträgt, vorzugsweise von 10 bis 10000, stärker bevorzugt von 50 bis 2000,
R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander in jeder [CH-CH₂]-Wiederholungseinheit aus H, einem Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder einem Arylrest mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind,
n 0 oder 1 ist, mit der Maßgabe, dass mindestens ein n in der gesamten Länge des Polymers 1 ist und
b) mindestens eine Nukleinsäure.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Alkyl- oder Arylrest gegebenenfalls wiederholt werden, kann linear oder verzweigt sein und kann gegebenenfalls substituiert sein. Außerdem können R₁, R₂ und/oder R₃ verknüpft sein, um das Molekül zu cyclisieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der Polymerisationsgrad p ausgewählt, um Polymere mit einer Molekülmasse, die im Bereich zwischen 1 und 1000 kDa, vorzugsweise zwischen 7 und 450 kDa liegt, zu erhalten.
Die Polymere können zum Beispiel gemäß dem Verfahren synthetisiert werden, das in E. A. Lewis, J. Barker, T. St. Pierre (1981) "Calorometric Titration of Poly(vinylamine) and Poly(iminoethylene)", Macromolecules, 14, 546-551 beschrieben ist.
Außerdem kann das Polymer des Komplexes aufgrund der Anwesenheit der Aminofunktionen und der Reste R1, R2 und/oder R3 direkt oder über einen Spacer wie heterobifunktionelle reaktionsfähige Gruppen wie SPDP oder SCMC, und funktionalisiertes PEG, die einem Fachmann gut bekannt sind, substituiert sein (Mattson et al. 1993, Mol. Biol. Reports, 17, 167-183). Die Substituenten können mindestens ein Element aus denjenigen sein, die allgemein in wissenschaftlichen Veröffentlichungen offenbart sind: Markierungsmoleküle (zum Beispiel vgl. Moleküle, die in US-A-4 711 955 offenbart sind), die zum Beispiel ein Sichtbarmachen der Verteilung des Polymers oder der komplexierten Nukleinsäure nach in vitro- oder in vivo-Verabreichung ermöglichen; Zelltargetmoleküle (Liganden) oder Haftmoleküle; Elemente, die eine Penetration in die Zelle, eine Lyse von Endosomen oder sogar einen intrazellularen Transport auf den Kern zu erleichtern. Diese Elemente können ganz oder teilweise aus Zuckern, Glycol, Peptiden (z. B. GRP, Gastrin freisetzendes Peptid), Oligonucleotiden, Lipiden (insbesondere denjenigen mit C2-C22), Hormonen, Vitaminen, Antigenen, Antikörpern (oder Fragmenten davon), spezifischen Membranrezeptorliganden, Liganden, welche zur Reaktion mit einem Antiliganden befähigt sind, fusogenen Peptiden, Kernlokalisationspeptiden oder einer Kombination dieser Verbindungen, z. B. Galactosylreste, um auf den Asialoglycoproteinrezeptor auf der Oberfläche von Hepatozyten abzuzielen, INF-7-fusogeneN Peptid, das von der HA-2 Untereinheit des Influenzavirushämagglutinins (Plank et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918 -12924) zur Membranfusion abgeleitet ist, oder eine Kernsignalsequenz, die vom T-Antigen des SV40-Virus (Lanford und Butel, 1984, Cell 37, 801-813) oder vom EBNA-1 Protein des Epstein-Barr-Virus (Ambinder et al., 1991, J. Virol. 65, 1466-1478) abgeleitet ist, zusammengesetzt sein. Außerdem können die Aminogruppen und Reste R₁, R₂ und/oder R₃ des Polymers gemäß der Erfindung ganz oder teilweise mit hydrophilen Resten R substituiert sein, wie denjenigen, die in den Französischen Patentanmeldungen FR 97/09209 und FR 97/15807 beschrieben sind, deren Inhalt hiermit als Teil der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen ist.
Solche substituierten Polymere können leicht unter Verwendung der Techniken, die in der Literatur beschrieben sind, insbesondere durch chemische Kupplung, ganz besonders unter Verwendung von Schutzgruppen wie der Trifluoracetyl-, Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl-) oder BOC-Gruppe (tert.-Butyloxycarbonylgruppe) an der Amineinheit erhalten werden. Selektive Entfernung einer Schutzgruppe erlaubt dann Kuppeln des Targetelementes und dann vollständige Schutzgruppenabspaltung aus dem Polymer (T. W. Greene und P. G. M. Wuts, 1991, Protective Groups in Organic Synthesis, Hrsg. J. Wiley & Sons, Inc., New York).
Um Komplexe mit Nukleinsäuren zu bilden, liegen Polymere gemäß der Erfindung in kationischer Form vor. Dies bedeutet, entweder a) liegen sie durch Binden eines Protons an mindestens ein an dem Aminorest vorliegenden Stickstoffatom in einer protonierten Form vor, oder b) liegen sie durch Binden mit z. B. -CH₃, -C₂H₅ oder -CH₂CH₂OH an mindestens ein an dem Aminorest vorliegenden Stickstoffatom in Ammoniumform vor oder c) liegen sie in den Formen a) und b) vor. In diesen Fällen würden die kationischen Polymere mit einem oder mehreren biologisch verträglichen Anionen, wie zum Beispiel Trifluoracetat, Monoethylsulfat, Acetat, Jodid, Chlorid, Bromid usw., verbunden sein.
Die in dem Komplex enthaltene Nukleinsäure kann ein DNS- und/oder RNS-Fragment, einzel- oder doppelsträngig, linear oder kreisförmig, natürlich oder synthetisch, modifiziert oder nicht (vgl. US-A-S 525 711, US-A-4 711 955 oder EP-A-302 175 für Modifikationsbeispiele) sein, wobei ein Fragment oder ein Teil einer Nukleinsäure ohne Größenbeschränkung definiert wird. Sie kann unter anderem eine Genom-DNS, eine cDNS, eine mRNS, eine Antisense-RNS, eine ribosomale RNS, ein Ribozym, eine tRNS oder eine solche RNS kodierende DNS sein. "Polynucleotide" und "Nukleinsäuren" sind in Bezug auf die vorliegende Erfindung Synonyme. Die Nukleinsäure kann auch in Form eines Plasmids oder linearen Polynucleotids vorliegen, das mindestens eine Kodierungssequenz der Nukleinsäure enthält, die transkribiert und translatiert werden kann, um ein Polypeptid, Ribozym, Antisense- oder anderes Molekül von Interesse nach Abgabe an eine Zelle zu erzeugen. Die Nukleinsäure kann auch ein Oligonucleotid sein, das an die Zelle, z. B. für Antisense- oder Ribozymfunktionen, abzugeben ist. Gemäß der Erfindung kann die Nukleinsäure auch zusammen mit Virusproteinen oder kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren formuliert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform können sowohl DNS als auch RNS an Zellen abgegeben werden, um darin ein Polypeptid von Interesse zu bilden, das innerhalb der Zelle bleiben kann oder das von der Zelle sezerniert werden wird. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist Plasmid-DNS bevorzugt. Falls die Nukleinsäuren die richtige genetische Information enthalten, werden sie die Synthese relativ großer Mengen des kodierten Polypeptids steuern. Wenn die an die Zellen abgegebenen Nukleinsäuren ein immunisierendes Polypeptid kodieren, kann die Verwendung gemäß der Erfindung angewandt werden, um eine verbesserte und effektive Immunität gegen infektiöse Mittel, einschließlich intrazellulärer Viren, und auch gegen Tumorzellen zu erreichen. Die zur Expression durch eine Targetzelle notwendige genetische Information umfasst alle die Elemente, die zur Transkription der DNS zu mRNS und zur Translation von mRNS zum Polypeptid erforderlich sind. Transkriptionspromotoren, die zur Verwendung in verschiedenen Wirbeltiersystemen geeignet sind, sind gut bekannt. Zum Beispiel schließen geeignete Promotoren die Viruspromotoren RSV, MPSV, SV40, CMV oder den 7,5k-Vaccinia-Promotor, induzierbare Promotoren usw. ein. Die Nukleinsäuren können auch Intronsequenzen, Targetsequenzen, Transportsequenzen und Sequenzen, die an Replikation oder Integration beteiligt sind, einschließen. Die Sequenzen sind in der Literatur beschrieben worden und können durch Fachleute leicht erhalten werden. Die Nukleinsäuren können auch mit speziellen Komponenten wie Spermin stabilisiert sein.
Gemäß der Erfindung kann die Nukleinsäure zu den exprimierenden Targetzellen homolog oder heterolog sein. Vorteilhafterweise kodiert die Nukleinsäure ein Polypeptid, insbesondere ein therapeutisches oder prophylaktisches Polypeptid, ganz oder teilweise. Selbstverständlich ist ein Polypeptid ein beliebiges Translationsprodukt eines Polynucleotids ungeachtet der Größe und egal, ob glykosyliert oder nicht, und schließt Peptide und Proteine ein. Therapeutische Polypeptide schließen als hauptsächliches Beispiel diejenigen Polypeptide ein, die defekte oder mangelhafte Proteine bei einem Tier ersetzen können, oder diejenigen, die durch toxische Effekte wirken, um schädliche Zellen zu beschränken oder aus dem Körper zu entfernen. Sie können auch Immunität verleihende Polypeptide sein, die als endogene Immunogene wirken, um eine humorale oder zelluläre Antwort oder beides hervorzurufen. Beispiele kodierter Polypeptide gemäß der Erfindung sind ein Enzym, Hormon, Cytokin, Membranrezeptor, strukturelles Polypeptid, Transportpolypeptid, Adhäsin, Ligand, Transkriptionsfaktor, Transduktionsfaktor, Replikationsfaktor, Stabilisationsfaktor, Antikörper, ganz besonders CFTR, Dystrophin, die Faktoren VIII oder IX, E6 oder E7 aus HPV, MUC1, BRCA1, Interferon β, Interferon γ, Interleukin IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, GM-CSF (Granularzyten-Makrophagen koloniestimulierender Faktor), das tk-Gen aus dem Herpes Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1), p53, VEGF. Das Polynucleotid kann auch einen Antikörper kodieren. Diesbezüglich umfasst Antikörper das ganze Immunglobulin einer beliebigen Klasse, chimäre Antikörper und hybride Antikörper mit zwei- oder mehrfachen Antigen- oder Epitopspezifitäten und Fragmente wie F(ab)₂, Fab', Fab einschließlich hybrider Fragmente und Antiidiotypen (US-A-4 699 880).
In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist die Größe der kationischen Polymer/Nukleinsäure-Komplexe gemäß der Erfindung von kleiner Größe (weniger als 5 μm, vorteilhafter weniger als 500 nm und vorzugsweise liegt sie im Bereich zwischen 20 und 200 nm). Die Komplexgröße kann zur optimalen Verwendung bei einer besonderen Anwendung ausgewählt werden.
Messungen der Komplexgröße können durch eine Anzahl von Techniken erreicht werden, die dynamische Laserlichtstreuung (Photonenkorrelationsspektroskopie, PCS) und auch andere Techniken, die Fachleuten bekannt sind, (vgl. Washington, Particle Size Analysis in Pharmaceutics and other Industries, Ellis Horwood, New York, 1992, 135-169) einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Die Erfindung ist auch auf Verfahren zum Herstellen der Komplexe gerichtet, die dadurch gekennzeichnet sind, dass ein oder mehrere Polymere mit einer oder mehreren Nukleinsäuren gemischt werden, und dass der Komplex dann gewonnen wird.
Die Konzentration der negativ geladenen Nukleinsäure, die dem kationischen Polymer zugesetzt werden kann, um die Komplexe der Erfindung zu bilden, beträgt von 10 μg bis 5000 μg pro ml Arzneimittel. In einer bevorzugten Ausführungsform der Endung beträgt die Konzentration der Nukleinsäure 100 μg/ml bis 1000 μg/ml.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfasst der Komplex ferner mindestens einen Hilfsstoff, der geeignet ist, die Bildung des Komplexes zwischen dem kationischen Polymer und der Nukleinsäure zu verbessern oder den Transport des Komplexes durch die Zellmembran zu erleichtern und endosomalen Abbau zu verhindern.
Deshalb betrifft die Erfindung auch einen Komplex, wobei der Hilfsstoff aus positiv oder negativ geladenen, neutralen oder zwitterionischen Lipiden, zum Beispiel einem Triglycerid, einem Diglycerid, Cholesterin (vgl. zum Beispiel US-A-S 438 044), und insbesondere einem positiv oder negativ geladenen, neutralen oder zwitterionischen Lipid, das Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylcholin, Phosphocholin, Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Sphingomyelin, Ceramid oder Cerebrosid ist oder sich davon ableitet, einem kationischen Lipid, wie zum Beispiel Glycerolipide (vgl. PCT/FR 98/00250) oder PEGylierte Lipide (siehe WO 98/08489) oder lysomotropen Mittel wie Chloroquin ausgewählt ist.
Das Verhältnis des Polymers zu dem Hilfsstoff (auf einer Basis von Gewicht zu Gewicht) kann im Bereich von 1 : 0,1 bis 1 : 10 liegen, aber dieses Verhältnis kann gemäß dem Verbindungstyp angepasst werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gewichtsverhältnis 1 : 1. Ein Fachmann kann mit diesen kleineren Einstellungen umgehen. Es ist auch möglich, ein Gemisch positiv oder negativ geladener, neutraler und/oder zwitterionischer Lipide zu verwenden.
Die Komplexe der Erfindung, auch Polyplexe genannt, können auch durch ihr theoretisches Ladungsverhältnis (+/-) gekennzeichnet werden, das das Verhältnis der durch das kationische Polymer bereitgestellten positiven Ladungen zu den durch die Nukleinsäure bereitgestellten negativen Ladungen in dem Komplex ist, wobei angenommen wird, dass alle potentiell kationischen Reste tatsächlich im kationischen Zustand sind und alle potentiell anionischen Reste tatsächlich im anionischen Zustand sind. Im Allgemeinen erleichtert ein Überschuss positiver Ladungen am Komplex das Binden des Komplexes an die negativ geladene Zelloberfläche. Um solch ein Verhältnis zu erhalten, soll die Berechnung alle negativen Ladungen in der Nukleinsäure in Betracht ziehen und soll dann die Menge an kationischem Polymer einstellen, die notwendig ist, um das gewünschte theoretische Ladungsverhältnis, das vorstehend angegeben ist, zu erhalten. Die Mengen und die Konzentrationen der anderen Bestandteile sollen als Funktion ihrer jeweiligen Molmassen und ihrer Zahl an positiven Ladungen eingestellt werden. Das Verhältnis ist nicht speziell beschränkt: Mengen werden so ausgewählt, dass das Verhältnis zwischen der Zahl an positiven Ladungen in dem kationischen Polymer und der Zahl an negativen Ladungen in der Nukleinsäure zwischen 0,05 und 20, ganz besonders zwischen 2,5 und 15 und vorzugsweise etwa 2,5 bis 10 beträgt.
Die Erfindung umfasst auch ein Arzneimittel, das mindestens einen Komplex, wie vorstehend offenbart, umfasst. Die Arzneimittel sind besonders nützlich für die Abgabe von Polynukleotiden an Zellen oder Gewebe eines Individuums im Bereich eines gentherapeutischen Verfahrens, aber sie sind nicht auf eine solche Verwendung beschränkt. Der Begriff "Gentherapieverfahren" wird vorzugsweise als Verfahren zur Einführung eines Polynukleotids in Zellen entweder in vivo oder durch Einführung in Zellen in vitro, gefolgt von einer Reimplantation in ein Individuum, verstanden. Insbesondere betrifft "Gentherapie" den Fall, bei dem das Genprodukt in ein Zielgewebe exprimiert wird, und auch den Fall, wo das Genprodukt abgesondert wird, insbesondere in den Blutstrom. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäure, Polynukleotid, Oligonukleotide oder Gen Synonyme.
Vorzugsweise umfasst das Arzneimittel außerdem einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Der Träger ist vorzugsweise isotonisch, hypotonisch oder schwach hypertonisch und weist eine relativ geringe Ionenstärke auf, wie sie durch eine Saccharoselösung bereitgestellt wird. Außerdem kann es beliebige relevante Lösungsmittel, wässrige oder teilweise wässrige flüssige Träger, die steriles, pyrogenfreies Wasser umfassen, Dispersionsmedien, Beschichtungen und Äquivalente enthalten. Der pH-Wert der pharmazeutischen Zubereitung wird passend eingestellt und gepuffert.
Das Arzneimittel gemäß der vorliegenden Erfindung kann an ein Wirbeltiergewebe verabreicht werden. Diese Verabreichung kann durch intradermale, subdermale, intravenöse, intramuskuläre, intranasale, intrazerebrale, intratracheale, intraarterielle, intraperitoneale, intravesikale, intrapleurale, intrakoronare oder intratumorale Injektion mittels einer Spritze oder anderer Vorrichtungen durchgeführt werden. Die transdermale Verabreichung wird auch in Erwägung gezogen, wie auch Inhalations- oder Aerosolwege.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Arzneimittel an Zielgewebe des Wirbeltierkörpers verabreicht werden, die diejenigen von Muskel, Haut, Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Knochenmark, Thymus, Herz, Lymphe, Knochen, Knorpel, Bauchspeicheldrüse, Niere, Gallenblase, Magen, Darm, Hoden, Eierstock, Gebärmutter, Mastdarm, Nervensystem, Auge, Drüsen, Bindegewebe, Blut, Tumor usw. einschließen.
Auf eine in vivo-Gentherapie angewandt, erlaubt diese Erfindung die wiederholte Verabreichung an den Patienten ohne irgendein Risiko, dass die verabreichte Zubereitung eine signifikante Immunreaktion auslöst. Die Verabreichung kann durch eine einzelne oder wiederholte Dosis, einmal oder mehrere Male nach einer bestimmten Zeitdauer erfolgen. Die wiederholte Verabreichung erlaubt eine Verminderung in der Dosis des zu einem einzelnen Zeitpunkt verabreichten Wirkstoffs, insbesondere DNS. Der Verabreichungsweg und die geeignete Dosis variieren als Funktion verschiedener Parameter, zum Beispiel des einzelnen Patienten, der Krankheit, die behandelt wird, oder der Nukleinsäure, die übertragen wird.
Die Erfindung betrifft spezieller ein Arzneimittel, das mindestens einen der vorstehend beschriebenen Komplexe umfasst und auch mindestens einen Hilfsstoff einschließt, der die Transfektionskapazität des Komplexes verbessern kann. Hilfsstoffe können aus Chloroquin, protischen, polaren Verbindungen wie Propylenglycol, Polyethylenglycol, Glycerin, EtOH, 1-Methyl-L-2-pyrrolidon oder deren Derivaten, oder aprotischen, polaren Verbindungen, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Diethylsulfoxid, Di-n-propylsulfoxid, Dimethylsulfon, Sulfolan, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff, Acetonitril oder deren Derivaten ausgewählt sein.
Gemäß der Erfindung schließen "Zellen" Prokaryontenzellen und Eukaryontenzellen, Hefezellen, Pflanzenzellen, menschliche oder tierische Zellen, insbesondere Säugerzellen ein. Insbesondere Krebszellen sollten erwähnt werden. Die Erfindung kann in vivo auf den Interstitial- oder Luminalraum von Geweben in den Lungen, der Luftröhre, der Haut, den Muskeln, dem Gehirn, der Leber, dem Herz, der Milz, dem Knochenmark, dem Thymus, der Harnblase, dem lymphatischen System, dem Blut, der Bauchspeicheldrüse, dem Magen, den Nieren, den Eierstöcken, den Hoden, dem Mastdarm, dem peripheren oder zentralen Nervensystem, den Augen, den lymphatischen Organen, dem Knorpel und dem Endothel angewandt werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Zelle eine Muskelzelle, eine Stammzelle des hämopoetischen Systems oder eine Atemwegszelle, ganz besonders eine Luftröhren- oder Lungenzelle und vorzugsweise eine Zelle des respiratorischen Flimmerepithels sein.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Übertragen einer Nukleinsäure in Zellen, wobei das Verfahren das Zusammenbringen der Zellen mit mindestens einem Komplex oder einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfasst. Dieses Verfahren kann durch direkte Verabreichung des Komplexes oder der Zusammensetzung an Zellen des Tiers in vivo oder durch in vitro-Behandlung von Zellen, die von dem Tier gewonnen und dann wieder in den Tierkörper eingeführt wurden (ex vivo-Verfahren), angewandt werden. Bei der in vitro-Anwendung werden auf einem geeigneten Medium kultivierte Zellen mit einer Suspension, die aus Komplexen oder der Zusammensetzung der Erfindung besteht, in Kontakt gebracht. Nach einer Inkubationszeit werden die Zellen gewaschen und wiedergewonnen. Die Einführung des Wirkstoffs kann (schließlich nach Lyse der Zellen) durch irgendein geeignetes Verfahren bestätigt werden.
Das Einführungs- oder Übertragungsverfahren ist allein gut bekannt. "Einführung oder Übertragung" bedeutet, dass der negativ geladene Wirkstoff in die Zelle übertragen wird und sich am Ende des Verfahrens innen in der Zelle oder innerhalb ihrer oder auf ihren Membranen befindet. Falls der Wirkstoff eine Nukleinsäure ist, wird dies "Transfektion" genannt. Die Transfektion kann durch irgendein angemessenes Verfahren, zum Beispiel durch Messen der Expression des Gens oder durch Messen der Konzentration des exprimierten Proteins oder seiner mRNS oder durch Messen seiner biologischen Wirkung bestätigt werden.
Im Fall einer in vivo-Behandlung gemäß der Erfindung kann sich der Patient vor Verabreichung der vorstehend beschriebenen pharmazeutischen Zubereitungen einer Behandlung zur Verminderung von Makrophagen unterziehen, um die Transfektionsrate zu verbessern. Solch eine Technik ist in der Literatur beschrieben (man schaue insbesondere nach bei Van Rooijen et al., 1997, TibTech, 15, 178-184).
Die Erfindung betrifft spezieller die Verwendung von Polymeren der allgemeinen Formel:
wobei:
der Polymerisationsgrad p von 2 bis 10⁶, vorzugsweise von 10 bis 10⁴, stärker bevorzugt von 50 bis 2000 beträgt,
R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander in jeder [CH-CH₂]-Wiederholungseinheit aus H, einem Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder einem Arylrest mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind,
n 0 oder 1 ist, mit der Maßgabe, dass mindestens ein n in der gesamten Länge des Polymers 1 ist,
oder eines Komplexes zwischen dem Polymer und der Nukleinsäure zur Herstellung eines Arzneimittels zur Gentherapieverwendung und spezieller zur Verwendung bei einem Verfahren zur intrazellulären Abgabe von Nukleinsäuren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der Polymerisationsgrad p ausgewählt, um Polymere mit einem Molekulargewicht zu erhalten, das im Bereich zwischen 1 und 1000 kDa, vorzugsweise zwischen 7 und 450 kDa, liegt.
Außerdem kann das Polymer gemäß seiner kationischen Eigenschaft auch zur Herstellung von Arzneimitteln zur Therapie, bei der eine intrazelluläre Abgabe eines anionischen Moleküls notwendig ist, verwendet werden. Solche anionischen Moleküle sollten nicht einschränkend als Nukleinsäure verstanden werden und können auch aus Proteinen, Arzneistoffen usw. bestehen.
Schließlich betrifft die Erfindung eine Zelle, die mit einem Komplex, wie dem vorstehend beschriebenen, transfiziert ist, insbesondere eine Prokaryontenzelle, eine Hefe- oder Eukaryontenzelle, vor allem eine Säugerzelle und ganz besonders eine kanzeröse Zelle. Die Erfindung ist besonders wirksam für Atemwegszellen, insbesondere Luftröhren- oder Lungenzellen, und noch mehr für Zellen des respiratorischen Flimmerepithels.
1: A549-Zellen (menschliche Lungenkrebszellen) wurden mit 2 μg pTG11033 und der gewünschten Menge des gewünschten Polymers transfiziert, um die gewünschten N/P-Äquivalente (2,5, 5 bzw. 10 Äqu.; vgl. Legende) zu erreichen. Die Expression wurde 48 Stunden später gestoppt. Die schwarzen Balken stellen die Ergebnisse der Transfektion in Gegenwart von Chloroquin (100 μM) dar.
BEISPIELE
Zellen
A549-Zellen (Lungenkrebszelllinie) werden in einer Kultur in DMEM-Medium, das mit 10% fetalem Kalbsserum, 286 mg/ml Glutamin und 2 g/l Glucose ergänzt ist, in einem Inkubator bei 37°C und 5% CO₂ gehalten. 24 Stunden vor der Transfektion werden die Zellen in eine Platte mit 48 Vertiefungen geätzt, um 60-80% Konfluenz zum Transfektionszeitpunkt zu erreichen.
Plasmid
pTG11033 (FR 97/09209 und FR 97/15807) Plasmid, das das Photinus pyralis-Luciferasegen unter der Kontrolle des Zytomegalievirus-Enhancers/Promotors kodiert und das Intron HMG1 enthält, wird verwendet.
Lösungen
Die Aminopolymerlösungen wurden durch Auflösen gewogener Mengen der entsprechenden Hydrochloridsalze in destilliertem Wasser hergestellt. Die Konzentrationen sind als monomeres Poly(aminhydrochlorid) ausgedrückt; wir haben das Polymer als vollständig protoniert betrachtet (MM von 79 Da/Monomer).
Herstellung von Polymer/DNS-Polyplexen und Protokoll der Transfektion
Die Polymer/DNS-Komplexe wurden folgendermaßen erhalten: 2 μg Plasmid und die gewünschte Menge kationisches Polymer [aus 10 mM (als protoniertes Amin) Stammlösungen, in Wasser bei einem pH-Wert von 7,4; 1 N/P-Äquivalent entspricht der Menge Polymer, die notwendig ist, um eine Aminogruppe (N) pro Phosphatgruppe (P) der Nukleinsäure (330 Da mittlere MM) zu haben] wurden jeweils in 50 μ1 5 %iger Glucoselösung verdünnt und verwirbelt. Die zwei Lösungen wurden dann gemischt und vorsichtig verwirbelt. Nach 30 min wurden die Komplexe den Zellen zugesetzt. Vor Zusetzen der Transfektionskomplexe wurde das Medium (DMEM, GIBCO BRL) entfernt und durch 0,5 ml serumfreies Medium ersetzt. Unmittelbar danach wurde die Platte 5 min bei 1500 U/min (etwa 280 g) zentrifugiert. Nach 3 h wurde das Medium durch 0,5 ml Medium ersetzt, das mit 10% fetalem Kalbsserum ergänzt war. Wenn die Transfektion in Gegenwart von 100 μM Chloroquin durchgeführt wurde, wurden dem Medium genau vor dem Zusetzen der Polyplexe 5 μl einer 10 mM Chloroquinlösung zugesetzt. Nach 48 h wurde das Medium entfernt, 100 μl Lysepuffer (Promega) wurden zugesetzt, und die Zellen wurden bis zur Analyse auf Luciferaseaktivität bei -80°C eingefroren. 20 μl des Überstands wurden unter Verwendung des Luciferase-Testsystems (Promega) in Platten mit 96 Vertiefungen (Biolumat LB 9500, Berthold, Wilbach, Deutschland) analysiert. Jede Transfektion wurde dreifach ausgeführt. Die Werte sind als mittlere relative Lichteinheiten (RLU) pro mg Zellprotein (BCA Test, Pierce) angegeben.
Wie die Mehrzahl synthetischer Vektoren hängt die Transfektionseffizienz vom Polymer/DNS-Verhältnis ab. Die optimale Expression wurde immer mit einem Verhältnis von negativen zu positiven Ladungen zwischen 2,5 und 5 erhalten. Bei allen geprüften Verhältnissen wurde keine signifikante Toxizität gesehen. Wir haben auch gezeigt, dass die Transfektion in Gegenwart von 100 μM Chloroquin eine höhere Transgenexpression erlauben konnte.

Claims

Komplex, umfassend: a) mindestens ein Polymer der allgemeinen Formel:
wobei: der Polymerisationsgrad p von 2 bis 1000000 beträgt, R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander in jeder [CH-CH₂]-Wiederholungseinheit aus H, einem Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder einem Arylrest mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, n 0 oder 1 ist, mit der Maßgabe, dass mindestens ein n in der gesamten Länge des Polymers 1 ist, und b) mindestens eine Nukleinsäure.
Komplex gemäß Anspruch 1, wobei p 10 bis 10000 beträgt.
Komplex gemäß Anspruch 2, wobei R₁, R₂ und R₃ H sind.
Komplex gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Polymer auch eines oder mehrere Targetelemente enthält, welche an das Stickstoffatom oder an einen der Reste R₁, R₂ und R₃ des Polymers gebunden sind.
Komplex gemäß Anspruch 4, wobei das Targetelement ganz oder teilweise aus Zuckern, Glycolderivaten, Peptiden, Oligonucleotiden, Lipiden, Hormonen, Vitaminen, Antigenen, Antikörpern, spezifischen Membranrezeptorliganden, Liganden, welche zur Reaktion mit einem Antiliganden befähigt sind, fusogenen Peptiden, Kernlokalisationspeptiden oder einer Kombination dieser Verbindungen ausgewählt ist.
Komplex gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, wobei die Nukleinsäure aus cDNS, Genom-DNS, Plasmid-DNS, Messenger-RNS, Antisens-RNS, Ribozymen, Transfer-RNS, ribosomaler RNS oder DNS, welche derartige RNS-Arten kodiert, ausgewählt ist.
Komplex gemäß Anspruch 6, wobei die Nukleinsäure eine therapeutisch nützliche Gensequenz enthält und die Elemente deren Expression ermöglichen.
Komplex gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, wobei die Komplexgröße weniger als 5 μm beträgt.
Komplex gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, wobei das Verhältnis zwischen der Zahl an positiven Ladungen in dem Polymer und der Zahl der negativen Ladungen in der Nukleinsäure zwischen 0,05 und 20 beträgt.
Komplex gemäß den Ansprüchen 1 bis 9, ferner mindestens einen Hilfsstoff umfassend, welcher aus positiv oder negativ geladenen, neutralen und zwitterionischen Lipiden ausgewählt ist.
Komplex gemäß Anspruch 10, wobei der Hilfsstoff aus Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylcholin, Phosphocholin, Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE), Sphingomyelin, Ceramid oder Cerebrosid oder einem ihrer Derivate ausgewählt ist.
Komplex gemäß Anspruch 10, wobei der Hilfsstoff eine kationische Lipidverbindung ist.
Komplex gemäß den Ansprüchen 10 bis 12, wobei das Verhältnis des Polymers zu dem Hilfsstoff 1 : 0,1 bis 1 : 10 (w/w) beträgt.
Arzneimittel, umfassend mindestens einen Komplex gemäß den Ansprüchen 1 bis 13.
Arzneimittel gemäß Anspruch 14, wobei die Konzentration der negativ geladenen Nukleinsäure 10 μg bis 5000 μg pro ml der Zusammensetzung beträgt.
Arzneimittel gemäß Anspruch 15, wobei die Konzentration 100 μg bis 1000 μg pro ml der Zusammensetzung beträgt.
Arzneimittel gemäß Anspruch 16, ferner mindestens einen Hilfsstoff umfassend, welcher aus Chloroquin, protischen, polaren Verbindungen, wie Propylenglycol, Polyethylenglycol, Glycerin, Ethanol, 1-Methyl-L-2-pyrrolidon oder deren Derivaten, oder aprotischen, polaren Verbindungen, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Diethylsulfoxid, Di-n-propylsulfoxid, Dimethylsulfon, Sulfolan, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff Acetonitril oder deren Derivaten ausgewählt ist.
Verfahren zum Übertragen einer Nukleinsäure in Zellen, wobei das Verfahren das Zusammenbringen der Zellen mit mindestens einem Komplex gemäß den Ansprüchen 1 bis 13 oder einer Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 14 bis 17 umfasst.
Verwendung eines Polymers der allgemeinen Formel:
wobei: der Polymerisationsgrad p von 2 bis 1000000 beträgt, R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander in jeder [CH-CH₂]-Wiederholungseinheit aus H, einem Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder einem Arylrest mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, n 0 oder 1 ist, mit der Maßgabe, dass mindestens ein n in der gesamten Länge des Polymers 1 ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur intrazellularen Abgabe von anionischen Molekülen.
Verwendung eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur intrazellularen Abgabe von Nukleinsären.
Verwendung gemäß Anspruch 19 oder 20, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung durch intramuskuläre Injektion, durch Inhalation, durch intratracheale Injektion, durch Einflößen, durch Aerosolierung oder durch topische Anwendung bestimmt ist.
Verwendung eines Komplexes gemäß den Ansprüchen 1 bis 13 oder einer Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 14 bis 17 zur in vitro Übertragung mindestens einer Nukleinsäure in eine Zelle.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.
Zelle, welche durch einen Komplex gemäß den Ansprüchen 1 bis 13 transfiziert wurde.
Verfahren zur Herstellung eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, umfassend Mischen mindestens eines der Polymere mit mindestens einer Nukleinsäure und Isolieren des Komplexes.