DE69805973T2

DE69805973T2 - Behandlung von herzrythmusstörungen durch hemmung einer multifunktionalen calcium/calmodulin-abhängigen protein kinase

Info

Publication number: DE69805973T2
Application number: DE69805973T
Authority: DE
Inventors: E. Anderson; P. Braun; Howard Schulman; J. Sung
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2002-12-19
Anticipated expiration: 2018-01-31
Also published as: AU6257798A; ATE218854T1; WO1998033491A2; US20030134777A1; JP2001509808A; DE69805973D1; EP0966274B1; US6518245B1; WO1998033491A3; EP0966274A2; US7251525B2; ES2178157T3

Description

Hintergrund der Erfindung

a) Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung von Arrhythmien durch Inhibition einer multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Protein-Kinase (CaM-Kinase), pharmazeutische Zusammensetzungen, die für solche Behandlungen nützlich sind, und Verfahren zur Identifizierung neuer Mittel, die für solche Behandlungen nützlich sind.

b) Beschreibung des Stands der Technik

Arrhythmie ist eine Hauptursache für Todesfälle, die mit dem Herzen zusammenhängen, in den Vereinigten Staaten. Die Verlängerung des Herzwirkungspotentials ist eine wichtige prädisponierende Bedingung für diese Arrhythmien. Viele antiarrhythmische Arzneimittel verlängern direkt die Dauer des Wirkungspotentials und können somit zu diesen Arrhythmien beitragen (d. h. proarrhythmische Wirkungen der antiarrhythmischen Arzneimittel). Trotz ihrer Kosten wurden die implantierbaren Herzfibrillatoren (ICD) die Behandlung der Wahl für Arrhythmien. Zur Verhinderung eines schmerzhaften Schocks erfordern ungefähr 50% der Patienten mit ICD eine zusätzliche Behandlung mit Antiarrhythmie-Mitteln. Somit gibt es ein großes Bedürfnis für die Entwicklung von besseren antiarrhythmischen Arzneimitteltherapien.
Frühe Nachdepolarisationen (EAD) sind depolarisierende Oszillationen beim Wirkungspotential (AP), die während der Repolarisierung auftreten. Eine Ursache von EAD ist der Ca²&spplus;-Einwärtsstrom vom L-Typ (ICa). ICa ist bei Zellmembranpotentialen (Vm) innerhalb des Fensters der Überlappung der ICa-Gleichgewichtsaktivierung und -Inaktivierung vorhanden; und tritt zum Beispiel während der Wirkungspotential-Repolarisierung auf. Die Verlängerung der Wirkungspotential-Repolarisierung kann die Zeit erhöhen, während der Vm in dem Fenster des Strombereiches für ICa vorhanden ist und kann somit die Wahrscheinlichkeit von EAD erhöhen. EAD ist wichtig, weil dies eine mögliche Ursache von letalen Arrhythmien, verbunden mit langen QT-Intervallen, einschließlich Torsade de Pointes ist. Ein langes QT-Intervall reflektiert eine verlängerte Wirkungspotential- Repolarisierung im ventrikulären Myocard und folgt aufgrund einer großen Vielzahl von Zuständen, einschließlich langsame Herztätigkeit und Hypokalämie. Eine wichtige Ursache von langen QT-Intervallen sind antiarrhythmische Arzneimittel und die ventrikulären proarrhythmischen Wirkungen von vielen antiarrhythmischen Mitteln resultieren aufgrund der QT- Intervall-Verlängerung.
Intrazelluläres Ca²&spplus; erhöht sich gleichzeitig mit EAD in isolierten ventrikulären Myocyten (De Ferrari et al. (1995) Circ 91: 2510-2515). Die Erhöhung von intrazellulärem Ca²&spplus; ([Ca²&spplus;]i) hat komplexe Wirkungen auf ICa, einschließlich die indirekte Verstärkung durch einen multifuktionellen Ca²&spplus;/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase-II-Weg (Anderson et al. (1994) Circ Res 75: 854-861) und die direkte Inaktivierung. Die Nettowirkung von erhöhtem [Ca²&spplus;]i in ventrikulären Kaninchenmyocyten nach der Flasch-Photolyse des photolabilen Ca²&spplus;-Chelators Nitr-5 ist eine 40 bis 50%-ige Erhöhung des Peak ICa, was durch eine multifunktionelle Ca²&spplus;/Calmodulin-abhängige Protein-Kinase II mediiert wird, die nachfolgend mit CaM-Kinase II bezeichnet wird. CaM-Kinase II ist wie andere multifunktionelle Ca²&spplus;/Calmodulin-abhängige Proteinkinasen eine ubiquitäre Serin-Threonin-Kinase, die aktiviert wird, wenn Ca²&spplus; an das Ca²&spplus; Bindungsprotein Calmodulin gebunden wird. Wenn es einmal durch Ca²&spplus;/Calmodulin aktiviert ist, kann die CaM-Kinase-II-Aktivierung durch Intersubeinheit-Enzym-Autophosphorylierung verzögert werden, die eine Ca²&spplus; unabhängige Aktivität verleiht, was ermöglicht, dass diese Aktivität während der langen diastolischen Intervalle aufrecht erhalten bleibt, die mit QT-Intervallverlängerung und Trosade de Pointes assoziiert sind. Diese Ca²&spplus;-unabhängige Aktivität wird durch lange stimulierende Pulse verstärkt (De Koninck and Schulman (1998) Science 279: 227-230), wie es mit der verlängerten Wirkungspotential-Repolarisierung auftritt. Es ist möglich, dass durch ICa verursachtes EAD durch erhöhte [Ca²&spplus;]i durch den CaM-Kinase-II Weg verstärkt wird. Jedoch resultieren nicht alle EADs aufgrund von ICa und die EAD können bei Zuständen auftreten, die für die CaM-Kinaseaktivität nachteilig sind, wie verstärktes [Ca²&spplus;]i-Puffern.
Die verzögerten Nachdepolarisierungen (DADs) sind eine andere Ursache von ventrikulären Arrhythmien, die mit einer intrazellulären Calciumüberladung assoziiert sind. Die DADs werden durch einen Einwärtsstrom verursacht, der der Vollendung der Wirkungspotential-Repolarisierung folgt. Dieser Einwärtsstrom ist ein Marker der intrazellulären Calciumüberladung (Thandroyen et al. (1991) Circ Res 69: 810-819). Die intrazelluläre Calciumüberladung ist ein zentrales Merkmal von vielen ventrikulären Arrhythmien, die während der Ischämie auftreten (Lee et al. (1988) Circ 78: 1047-1059) einschließlich ventrikularer Fibrillation.
Die Inhibition der CaM-Kinaseaktivität kann zur Untersuchung der Erleichterung von CaM-Kinase in EADs und DADs verwendet werden. Es gibt mehrere Methoden zum Blockieren der CaM-Kinaseaktivität. Synthetische Pseudosubstrat-Peptid-Inhibitoren von CaM-Kinase ergeben eine spezifische Annäherung an die CaM-Kinaseinhibition und wurden in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich ventrikulären Myocyten verwendet (Braun et al. (1995) J. Physiol 488: 37-55). Es wurde festgestellt, dass die Peptidsequenz KKALHRQEAVDCL (SEQ ID Nr. 1) wie andere ähnliche Peptide CaM-Kinase auf sehr spezifische Weise inhibiert. SEQ ID Nr. 1 ist ein viel weniger effizienter Inhibitor von Proteinkinase A (PKA) und Proteinkinase C (PKC), wobei jeweils ein IC&sub5;&sub0;-Wert von wenigstens 500 umol/l existiert. Myristoylierte Inhibitionspeptide sind Zellmembran durchgängig und könnten somit ebenfalls effektiv sein, wenn sie extrazellulär zugegeben werden.
Eine Vielzahl von Zellmembran durchgängigen CaM-Kinase- und Calmodulin-Inhibitoren sind erhältlich und werden in großem Umfang verwendet (Braun et al. (1995) Ann Rev Physiol 57: 417-445). Ein hauptsächlicher Nachteil dieser Inhibitoren als experimentelle Mittel liegt darin, dass viele von diesen ICa direkt blockieren.
Jedoch wurde über die direkte ICa Blockade durch den CaM-Kinase- Inhibitor KN-93 noch nicht zuvor berichtet. KN-93 (2-[N-(2-Hydroxyethyl)- N-(4-methoxybenzolsulfonyl)]-amino-N-(4-chlorcinnamyl)-N- methylbenzylamin) ist ein Methoxybenzolsulfonamidderivat, das kompetitiv die Bindung von Calmodulin an CaM-Kinase mit einem berichteten Ki-Wert von 0,37 umol/l inhibiert. KN-93 inhibiert CaM-Kinase abhängige Verfahren in PC12h Zellen, Fibroblasten und Magenwandzellen. Es gibt vier Isoformgruppen von CaM-Kinase II (α, β, γ, δ) und die δB und δC-Isoformen wurden im Myocard identifiziert. Die katalytischen und Regulationsdomänen in CaM-Kinase sind in allen bekannten CaM-Kinaseisoformen stark erhalten, so dass Inhibitoren, die mit einem dieser Domänen wechselwirken, in allen Zelltypen, einschließlich Herz-Zellen arbeiten. KN-92 (2-N-(3- Methoxybenzolsulfonyl)-amino-N-(4-chlorcinnamyl)-N-methylbenzylamin) ist ein Verwandter von KN-93 ohne CaM Kinase-Inhibitionsaktivität und wird als experimentelle Kontrolle verwendet. Die direkte ICa-Blockade durch KN-92 wurde zuvor ebenfalls noch nicht erwähnt, und weder KN-93 noch KN- 92 haben annehmbare Effekte auf andere Serin-Threonin-Kinasen wie Protein-Kinase A (PKA) oder Proteinkinase C (PKC).
Zwei allgemeine Annäherungen hingegen werden gegenwärtig zur Unterdrückung der ventrikulären Arthythmien aufgrund der Wirkungspotentialverlängerung zusätzlich zu der ICD-Implantation verwendet. Eine liegt in der Verkürzung des Wirkungspotentials unter Verwendung von antiarrhythmischen Mitteln (z. B. Mexilitin, Pinacidil) oder durch Erhöhung der Herzrate unter Verwendung einer künstlichen Frequenzstimulation oder des β- adrenergischen Mittels Isoproterenol. Die zweite soll indirekt Proteinkinase A (PKA) unterdrücken, was den Calciumstrom vom L-Typ und die Calciumfreisetzung vom sarcoplasmischen Reticulum durch linke sternförmige Ganglionectomie oder mit β-adrenergischen Blockiermitteln verstärkt. Keine dieser Annäherungen ist aus zwei Gründen in großem Umfang anwendbar: 1) die Wirkungspotenzialdauer wird durch eine Zahl von unterschiedlichen ionischen Strömen gesteuert und es ist nicht typisch bekannt, welcher Strom bei einem bestimmten Patienten kritisch ist. Weiterhin sind spezifische Antiarrhythmiemittel nicht für die Modifizierung von vielen dieser ionischen Zufuhren erhältlich. Zusätzlich antworten nicht alle Ursachen der Wirkungspotentialverlängerung auf die Frequenzstimulierung durch die Wirkungspotentialverkürzung. Isoproterenol verkürzt nicht immer das Wirkungspotential, kann selbst arrhythmogen sein, eine Ischeämie verursachen und nur bei einem akuten Anfall verwendet werden. 2) Gegenwärtig wird die Unterdrückung von PKA indirekt durch sternförmige Gangionektomie oder durch β-adrenergische Antagonisten erzielt. β-Adrenergische Antagonisten sind für die Verminderung des Todesfalls aufgrund von Arrhythmie wirksam, aber die Anwendung ist durch die Tatsache beschränkt, dass diese Mittel die Kraft der Herzmuskelkontraktion schwächen.
Ventrikuläre Arrhythmien aufgrund von Ischämie und intrazellulärer Calciumüberladung werden im allgemeinen durch Revaskularisierung (d. h. Coronararterien-Angoplastie oder Coronararterien-Bypassoperation), β- adrenergische Antagonisten und antiarrhythmische Medikationen der Klasse III (z. B. Sotalol und Amiodaron) zusätzlich zu ICD behandelt. Leider ist die Revaskularisierung oft unvollständig und die Auftrittrate von ventrikularer Fibrillation ist signifikant. Antiarrhythmische Mittel der Klasse III können proarrhythmisch sein, indem sie eine exzessive Wirkungspotential-Verlängerung verursachen oder von einer die Verwendung beschränkende Toxizität (z. B. Amiodaron) begleitet sind. Die Verwendung von β- adrenergischen Antagonisten ist ebenfalls wie zuvor diskutiert, beschränkt.
Die artriale Fibrillation ist mit einer signifikanten Morbidität und Mortalität durch Schlaganfall und Herzinsuffizienz begleitet. Die artriale Fibrillation kann durch DAG verursacht werden. Die Aufrechterhaltung der atrialen Fibrillation wird durch intrazelluläre Calciumabhängige Verfahren favorisiert (Tieleman et al (1997) Circ 95: 1945-1953). Gegenwärtige konventionelle Therapien konzentrieren sich auf die Antikoagulation (zur Verhinderung des Schlaganfalls), die ventrikulare Ratensteuerung und antiarrhythmische Mittel. Gegenwärtig erhältliche antiarrhythmische Mittel erreichen nur die Aufrechterhaltung des Sinusrhythmus bei ungefähr 50% der Patienten/Jahr. Kürzliche experimentelle Therapien umfassen künstliche Frequenzstimulierungssysteme und atrinale ICDs.
Die CaM-Kinaseinhibition kann den früheren antiarrhythmischen Strategien überlegen sein, weil CaM-Kinase Charakteristiken aufweist, die es ermöglichen, dass dieses als Bewirker einer positiven proarrhythmischen Antwort für EAD und DAD fungiert und somit eine zentralere Rolle bei der EAD- und DAD-Induktion als andere Effektoren wie PKA spielt. Der Calciumstrom vom L-Typ erhöht intrazelluläres Calcium direkt durch Transmembran- Calciumfluss und indirekt durch Calcium-induzierte Freisetzung von Calcium von dem sarcoplasmischen Reticulum. Erhöhtes intrazelluläres Calcium führt zu erhöhter CaM-Kinaseaktivität, wodurch weiterhin EAD während der Wirkungspotential-Verlängerung favorisiert wird. Im Gegensatz dazu wird die PKA-Aktivität nicht durch erhöhtes intrazelluläres Calcium verstärkt. Direkte CaM-Kinaseinhibitoren sind erhältlich (oben) und die CaM- Kinaseinhibition reduziert nicht die Stärke der Kontraktion im isolierten Herzen, was nahelegt, dass dies bei Patienten anwendbar ist, die β- adrenergische Antagonisten nicht tolerieren. Kürzliche Experimente unter Verwendung von genetisch behandelten Mäusen, bei denen neuronale CaM- Kinase-Isoformen fehlen, legen nahe, dass die systemische CaM- Kinaseinhibition nicht zu nicht-tolerierbaren Nebenwirkungen führt. Es ist wahrscheinlich, dass redundante CaM-Kinaseisoformen oder andere Signaltransduktionsmechanismen teilweise die Inaktivität eines CaM- Kinase-Subtyps kompensieren, so dass die tatsächlichen Wirkungen des KO oder andere Inhibitionsstrategien weniger schädlich als vermutet sind. Somit kann die CaM-Kinaseinhibition als Behandlung für Arrythmien, die mit exzessiven Wirkungspotentialverlängerungen und EADs zusammenhängen, und für Arrhythmien, die mit intrazellulärer Calciumüberladung wie atrialer Fibrillation und ventrikularer Fibrillation zusammenhängen, sehr nützlich sein kann.
Die Wirkungspotentialverlängerung favorisiert einen erhöhten Calciumstrom vom L-Typ, und diesr Strom ist vermutlich die unmittelbare Ursache der Arrhythmien, aber weil Calcium für die Herzmuskelfunktion essentiell ist, ist die direkte Blockade des Calciumstroms vom L-Typ keine sinnvolle antiarrhythmische Strategie. Inhibitoren für den Ca²&spplus;-Strom vom L-Typ sind nicht sehr wirksame antiarrhythmische Mittel für atriale und ventrikulare Fibrillation ebenso wie die für die meisten Arten von ventrickularer Tachycardie. Das Fehlen einer ventrikularen antiarrhythmischen Wirksamkeit für ICa-Antagonisten bei klinisch tolerierten Dosen kann resultieren, weil die Menge der ICa-Inhibition unzureichend ist, um die meisten EADs zu verhindern oder zu beenden. Die Kombination eines ICa-Antagonisten mit einem CaM-Kinaseinhibitor kann jedoch wirksam sein.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung gibt Medikamente zur Behandlung und Verhinderung von Arrhythmien bei menschlichen Subjekten durch die Verabreichung eines multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase-Inhibitors an den Menschen in einer Menge an, die ausreichend ist, um frühe Nachdepolarisierungen, verzögerte Nachdepolarisierungen oder intrazelluläre Calciumüberladung zu unterdrücken.
Ebenso werden pharmazeutische Zusammensetzungen angegeben, umfassend einen multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase-Inhibitor und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten.
Ein anderer Aspekt dieser Erfindung gibt Verfahren zur Identifizierung von Mitteln an, die zur Behandlung von Arrhythmien nützlich sind, und gibt mögliche Strategien für die Entwicklung eines therapeutischen, antiarrhythmischen Mittels an, das systemisch verabreicht werden kann.
Gemäß einem anderen Merkmal gibt diese Erfindung Medikamente zur Behandlung und Verhinderung von Arrhythmien an, wodurch ein multifunktioneller Calcium/Calmodulin-abhängiger Proteinkinase-Inhibitor in Kombination mit einem zweiten antiarrhythmischen Mittel verabreicht wird, um die Sicherheit und Wirksamkeit der Behandlung zu erhöhen.
Gemäß einem anderen Merkmal gibt diese Erfindung Verfahren zur Behandlung und Verhinderung von Arrhythmien an, worin die Verabreichung eines multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase- Inhibitors mit der Behandlung des Patienten mit einem antiarrhythmischen Mittel kombiniert wird.
Diese Erfindung gibt ebenfalls die Verabreichung eines multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase-Inhibitors in Kombination mit einem zweiten antiarrhythmischen Mittel an, zur Blockade von proarrhythmischen Wirkungen aufgrund der Wirkungspotentialverlängerung, die durch das zweite antiarrythmische Mittel verursacht wird.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1(A) Experimentelles Design für frühe Nachdepolarisierungen (EAD), die durch Clofilium in einem isolierten Kaninchenherzen induziert sind, das mit dem inaktiven Analog KN-92 vorbehandelt ist. Die Datenaufzeichnungen zeigen (von oben nach unten) einphasische Wirkungspotentiale (MAP) und den linken ventrikularen (LV) Druck. Die horizontalen Linien zu der linken Seite der LV-Druckauftragungen (von oben nach unten) zeigen 100 mmHg und 0 mmHg und 850 ms für die Panels A und B an. Alle Experimente mit isolierten Herzen bestanden aus 3 Perioden. Eine vierte Periode (experimentelle Periode 4) wurde nur bei den Herzen mit EAD zugegeben. Die experimentellen Perioden sind mit 1 bis 4 angegeben (obere Seite für die Panels A und B). Die Messungen der experimentellen Periode 1 bedeuten Kontrolle und nach > 10 min Stabilisierung. Die Messungen der experimentellen Periode 2 erfolgten 10 min nach der Zugabe des inaktiven KN-93 Analogs, KN-92 (0,5 umol/l). Die Messungen der Periode 3 folgen nach der Zugabe von Clofilium (7,5 umol/l) und werden bei der EAD-Initiierung oder von der längsten Wirkungspotentialdauer, die über 30 min aufgezeichnet ist, aufgezeichnet. Multiple EADs werden als 2 Oszillationen während der Repolarisierung bei den MAP-Aufzeichnungen bei der experimentellen Periode 3 gesehen. Sekundärerhöhungen beim LV-Druck, die mit EADs zusammenfallen, werden ebenfalls bei der LV-Druckaufzeichnung bei der experimentellen Periode 3 gesehen. Die Messungen der experimentellen Periode 4 folgen der EAD-Beendigung durch Zugabe von Nifedipin (10 umol/l) (oben gezeigt) oder Cd²&spplus; (200 bis 500 umol/l) (Daten nicht gezeigt). Die horizontalen Striche zeigen die experimentellen Bedingungen für beide Panels A und B an. (B) Experimentelles Design für isolierte Kaninchenherzen, die mit CaM Kinaseinhibitor KN-93 behandelt sind. Die Anordnung der Datenaufzeichnungen ist die gleiche wie bei Fig. 1(A) (oben). Die experimentellen Perioden sind ebenfalls gleich wie bei Fig. 1(A) (oben), mit der Ausnahme, dass der aktive CaM-Kinaseinhibitor KN-93 (0,5 umol/l) 10 min vor der Messung der Periode 2 zugegeben wurde. Die Periode 4 wurde weggelassen, weil die EADs innerhalb von 30 min nach der Zugabe von Clofilium nicht auftraten. (C) Eine kontinuierliche Aufzeichnung der EAD-Beendigung durch Nifedipin (10 uM) in einem Herz, das bei einer Zykluslänge von 1500 ms angetrieben wurde. Die Datenaufzeichnungen zeigen MAP mit einzelnen EADs (oben) und LV-Druck (unten). Die horizontalen Linien bis zur linken Seite der LV-Druckaufzeichnungen zeigen 50 mmHg und 0 mmHg Druckniveaus an (von oben nach unten). Die EAD-Beendigung tritt vor der ersten feststellbaren Verminderung (d. h. > 10% unterhalb der Basislinie) beim LV-Druck auf. Der vertikale Pfeil markiert den ersten Schlag bei der EAD-Beendigung.
Fig. 2. Der linke ventrikulare entwickelte Druck (LVDP, Panel A) und Zwischenschlagintervalle (Panel B) bei isolierten Kaninchenherzen. LVDP wird als Peak des systolischen Drucks minus dem diastolischen Enddruck definiert. Die Ziffern 1 bis 4 entsprechen den experimentellen Prioden, die in den Fig. 1A und B angezeigt sind. Die in den Panels A und B angegebenen Daten sind Clofilium (7,5 umol/l, n = 21); der CaM- Kinaseinhibitor KN-93 (0,5 umol/l, n = 10, offene Kreise) oder das inaktive Analogon KN-92 (0,5 umol/l, n = 11, gefüllte Kreise); EAD- Beendigung, Nifedipin (10 umol/l, n = 7) oder Cd²&spplus; (200-500 umol/l, n = 4). Die experimentelle Periode 4 beinhaltet nur Daten von Herzen, die EADs demonstrieren. Bei dieser letzten Gruppe ist n = 11 weil 3 MAP- Aufzeichnungen bei der EAD-Beendigung verloren gingen. LVDP bei der experimentellen Periode 4 wird von dem ersten Schlag nach der EAD-Beendigung wie in Fig. 1C gezeigt, verwendet. A. Herzen, die mit KN-93 vorbehandelt sind, erhöhten LVDP nach der Clofilium-Behandlung (Panel A, experimentelle Periode 3) nicht. LVDP erhöhte sich signifikant nach der Clofilium- Zugabe bei Herzen, die mit dem inaktiven Analogon KN-92 behandelt sind: *p = 0,014 im Vergleich zu Periode 1; **p = 0,002 im Vergleich zu mit KN- 92 behandelten Herzen bei Periode 3. B. Zwischenschlag-Intervalle erhöhten sich im Vergleich zu Kontrollperiodenintervallen sowohl bei mit KN-93 (**p = 0,002) behandelten Herzen als auch bei mit dem inaktiven Analogon KN-92 (*p = 0,049) behandelten Herzen. Keine signifikante Unterschiede gab es bei Zwischenschlag-Intervallen bei Herzen, die mit dem CaM-Kinase- Inhibitor KN-93 oder dem inaktiven Analogon KN-92 behandelt wurden.
Fig. 3 Die Dauern des monophasischen Potentials (MAP) bei 50% (APD&sub5;&sub0;, Kreise) und 90% (APD&sub9;&sub0;, Quadrate) - Repolarisierung zur Basislinie in isolierten Kaninchenherzen. Die Ziffern 1 bis 4 entsprechen den experimentelen Perioden, die in den Fig. 1A und B gezeigt sind. Die ausgefüllten Symbole sind für Herzen, die mit dem inaktiven Analogon KN-92 vorbehandelt sind. Die offenen Symbole sind für Herzen, die mit dem CaM- Kinaseinhibitor KN-93 vorbehandelt sind. Der Datensatz ist der gleiche wie in Fig. 2. p = 0,004 und **p < 0,001, verglichen mit den entsprechenden APDs bei der Periode 1. Keine signifikanten Unterschiede bei den MAP- Dauern gab es bei Herzen, die mit dem CaM-Kinaseinhibitor KN-93 oder dem inaktiven Analogon KN-92 behandelt waren. Die MAP-Dauern waren nicht signifikant unterschiedlich während der frühen Nachdepolarisierungen (EAD) und dem ersten Schlag nach der EAD-Beendigung durch Nifedipin (10 umol/l) oder Cd²&spplus; (200-500 umol/l).
Fig. 4 Prozentsatz der Calcium-unabhängigen CaM- Kinaseaktivität in isolierten Kaninchenherzen. Die maximalen (d. h. Ca²&spplus;/Calmodulin-abhängig) und Ca²&spplus;-unabhängigen CaM-Kinaseaktivitäten wurden von den linken ventrikularen (LV) Gewebehomogenaten, wie in Beispiel 5, experimentelle Methoden beschrieben, untersucht. Alle Herzen waren anfangs unter Kontrollbedingungen isoliert. Eine Stabilisierungsperiode von ≥10 min wurde für jedes isolierte Herz verwendet, um die Abwesenheit von EADs sicherzustellen, wie durch monophasische Wirkungspotentiale (MAPs) angezeigt wird, die durch einen Katheter, der über den LV- Epicardium angeordnet ist. Um die CaM-Kinaseaktivität zu untersuchen, wurde ein linkes ventriculares Epicardial-Stück (1-2 g Gewebe) von den Herzen in jeder der drei Gruppen wie folgt geschnitten: 1) Kontrolle (n = 5), Stück entfernt nach ≥10 min Stabilisierungsperiode; 2) Clofilium (n = 5), Stück nach Zugabe von 7,5 umol/l Clofilium entfernt und ≥10 min EADS, wie durch MAP-Aufzeichnungen verifiziert wurde; 3) KN-93, Clofilium (n = 6), Stück ≥10 min nach Zugabe von 7,5 umol/l Clofilium in mit 0,5 u mol/l KN-93 vorbehandelten Herzen entfernt. *p = 0,015 im Vergleich zur Kontrollgruppe und dem KN-93, Clofilium-Gruppe.
Fig. 5. Wirkungen von KN-93 und KN-92 bei der CaM- Kinaseaktivität in vitro. CaM-Kinaseaktivität im linken ventrikulären Gewebehomogenat wurde wie bei Beispiel 5, experimentelle Methoden, beschrieben, untersucht. Die Aufzeichnung zeigt, dass eine Erhöhung der Konzentrationen von KN-93, aber nicht dem inaktiven Analogon KN-92, eine direkte Inhibition der Herz-CaM-Kinaseaktivität erzeugen. Die durchgezogene Linie bedeutet eine Anpassung an die KN-93-Daten unter Verwendung der Hill-Gleichung. Die gestrichelte Linie zeigt die erwartete Inhibition der CaM-Kinaseaktivität nach Berücksichtigung der Konzentration an zugegebenem Calmodulin im Versuch (150 nmol/l), wobei die kompetitive Wechselwirkung zwischen KN-93 und Calmodulin mit CaM-Kinase gegeben ist (Sumi et al. (1991) Biochem Biophys Res commun 181: 968-975). Der Ki-Wert für die Inhibition durch KN-93, berechnet von der gestrichelten Kurve, ist 2,58 umol/l.
Fig. 6 KN-93-und KN-92-Wirkungen auf den L-Typ Ca²&spplus;-Strom (ICa). (A). Peak-Gleichgewicht-Spannungs-Spannungs-(I-V)-Beziehung für ICa während der Kontrollbedingungen (ausgefüllte Quadrate) und nach der Zugabe des inaktiven Mittels KN-92 (0,5 umol/l ausgefüllte Kreise und 1,0 umol/L ausgefüllte Quadrate) zum Zellbad. Der Beginn zeigt übereinander gelagerte Rohströme und den Befehlsspannungsschritt (300 ms) vom ventrikularen Myocyt, der zum Aufbau der I-V-Beziehung verwendet wird. Die horizontale Linie markiert die Nullstrom-Linie. (B). Aufzeichnungen erfolgen wie bei A (oben) mit der Ausnahme, dass der CaM-Kinaseinhibitor KN-93 zum Zellbad (0,5 umol/l offene Kreise und 1,0 umol/l offene Quadrate) gegeben wurde. (C). Dosis-Antwort-Beziehungen für das Peakgleichgewicht ICa, aufgezeichnet während der Befehlsspannungsschritte von einem Haltepotential von -80 mV bis zu einem Testpotential von 0 mV, und den CaM Kinaseinhibitor KN-93 (offene Kreise) oder das inaktive Analogon KN-92 (gefüllte Kreise). Die Daten werden als Fraktion der Kontrolle ICa ausgedrückt. Die Gesamtzahl der während jeder aufgetragenen Messung untersuchten Zellen ist in Klammern angegeben. KN-93 und KN-92 waren gleich potente Peak-Gleichgewichts-ICa-Inhibitoren bei der Konzentration, die zur Unterdrückung der frühen Nachdepolarisierungen bei dieser Studie verwendet wurde, aber KN-93 war ein effektiverer ICa-Inhibitor bei 1,0 umol/l. (D). Die Zeitabhängigkeit der ICa-Wiedergewinnung von der Inaktivierung. Der Peak ICa wurde von einem Haltepotential von -80 mV bis zu einem Testpotential von 0 mV für 300 ms (P1) angegeben. Progressiv längere Intervalle (10-2500 ms) wurden zwischen P1 und einem zweiter. Puls (P2) eingefügt. Der Peak ICa während P2 wurde als Fraktion des Peaks ICa während P1 ausgedrückt. Die Daten werden für Kontrollbedingungen (gefüllte Quadrate) in der Gegenwart von 0,5 umol/l KN-92 (ausgefüllte Kreise) oder 0,5 umol/L1 KN-93 (offene Kreise) aufgezeichnet.
Fig. 7 CaM-Kinase-Inhibition unterdrückt durch Frequenzsteuerung induzierten Einwärtsstrom. Isolierte Herzzellen werden angetrieben (0,5 Hz, T = 32ºC), wobei eine Klemmbefehl-Wellenform mit verlängerter Wirkungspotentialspannung angewandt wurde. (A) Eine Verlängerung des Wirkungspotentials wurde digitalisiert und als Spannungsklemmbefehl- Wellenform für Stromaufzeichnungen verwendet. Das Befehlsmembranpotential ist auf der Ordinate und die Zeit (für Panels A - C) auf der Abszisse (B). Einwärtsströme, die nach der Entwicklung der Befehlswellenform in 5/6 Zellen entwickelt sind, die mit einem Kontrollpeptid (SEQ ID Nr. 2, 20 umol/l) dialysiert sind, das keine CaM-Kinaseinhibitionsaktivität aufweist. Zellmembran-Ströme sind auf der Ordinate für beide Panels B und C als Bezug angegeben. (C) Einwärtsströme entwickelten sich nicht in irgendwelchen Zellen (0/5), die mit dem aktiven CaM-Kinase- Inhibitionspeptid (SEQ ID Nr. 1, 20 umol/l) dialysiert sind. Zusätzlich verhinderte Ryanodin (10 umol/l), ein Blocker der intrazellulären Calciumfreisetzung ebenfalls die Entwicklung des Einwärtsstroms in 2/2 getesteten Zellen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Wir haben ein Medikament zur Behandlung von Arrhythmien entwickelt, worin ein multifunktioneller Calcium/Calmodulin-abhängiger Proteinkinase- Inhibitor den Patienten in einer Menge verabreicht wird, die zum Unterdrücken von frühen Nachdepolarisierungen, verzögerten Nachdepolarisierungen oder einer intrazellulären Calciumüberladung ausreichend ist. Diese Erfindung gibt ebenfalls Mechanismen zur Verhinderung des Auftretens von Arrhythmien durch die Verabreichung eines multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Protein-Kinase-Inhibitors an den Patienten in einer Menge an, die zur Unterdrückung von frühen Nachdepolarisierungen, verzögerten Nachdepolarisierungen oder intrazellulärer Calciumüberladung ausreichend ist.
Der Ausdruck "CaM-Kinase" wird hierin verwendet, um irgendein Mitglied der multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase- Familie allgemein anzugeben, während der Ausdruck "CaM Kinase II" hierin nur verwendet wird, um die multifunktionelle Calcium/Calmodulin-abhängige Protein-Kinase II (und deren Isoformen) zu bezeichnen.
Ein "Inhibitor" der CaM-Kinase ist eine Verbindung, die die Aktivität des Enzyms vermindern kann (im allgemeinen über nicht kovalentes Binden des Inhibitors am Enzym). Der Inhibitor kann eine reversible Inhibition ergeben. Eine reversible Inhibition kann aus einer kompetitiven Inhibition, nicht-kompetitiven Inhibition, unkompetitiven Inhibition oder einer gemischten Inhibition bestehen. Ein "Inhibitor" der CaM-Kinase kann ebenfalls ein irreversibler Inhibitor oder ein Suizid-Inhibitor sein. Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung wird ein Inhibitor einer multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II in einem Medikament zur Behandlung und Verhinderung von Arrhythmien verwendet. Jedoch wird die Verwendung von Verbindungen, die andere Mitglieder der Familie der multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Protein- Kinasen inhibieren, ebenfalls durch diese Erfindung vorgesehen. Die Familie der multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinasen umfassen CaM Kinase I, CaM Kinase II und CaM Kinase IV. Jedes dieser Mitglieder existiert zusätzlich in einer Vielzahl von Isoformen. Es wird im allgemeinen vom Fachmann verstanden, dass ein Inhibitor von einem der multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Protein-Kinasen die anderen Mitglieder der Familien ebenso wahrscheinlich inhibiert, und zwar auf Grund der strukturellen Konversation unter den Typen (Enslen et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 15520-15527).
Gemäß einem anderen Merkmal dieser Erfindung können Isoformspezifische Inhibitoren als Mittel mit verstärkter Spezifität zur Verhinderung und Behandlung von Arrhythmien verwendet werden (Braun et al. (1995) J. Physiol 488: 437-55). Gemäß einem noch anderen Merkmal können Organ-spezifische CaM-Kinaseinhibitoren verwendet werden. Die Herz- Spezifität einer multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase kann durch Kombination eines CaM-Kinaseinhibitors mit Herzzell- spezifischen Epitop-Erkennungssequenzen erreicht werden. Die Verwendung von Organ- oder Isoform-spezifischen Inhibitoren kann helfen, die Wirksamkeit und die Sicherheit der systemischen Abgabe des Arzneimittels sicherzustellen.
Existierende CaM-Kinaseinhibitoren wie KN-93 und irgendeines der Inhibitionspeptide wie KKALHRQEAVDCL (SEQ ID Nr. 1) können bei den Verfahren zur Behandlung von Arrhythmien, die hierin beschrieben sind, verwendet werden. Beide Inhibitoren agieren kompetitiv, aber an unterschiedlichen Stellen an der Kinase. KN-93 bindet und verhindert die Aktivierung durch Calmodulin, während SEQ ID Nr. 1 an der katalytischen Stelle bindet, wobei die Wechselwirkung mit Substratmolekülen verhindert wird. Andere allgemeine Organ spezifische oder Isoform spezifische CaM- Kinaseinhibitoren können ebenfalls bei der Behandlung von Arrhythmie verwendet werden, wie es durch diese Erfindung vorgesehen wird.
Die Verabreichung des Inhibitors an Patienten kann durch irgendeine einer Vielzahl von Verfahren erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind. Gemäß einem bevorzugten Merkmal wird der Inhibitor systemisch verabreicht. Gemäß einem weiter bevorzugten Merkmal wird der CaM- Kinaseinhibitor intravenös verabreicht. Andere mögliche Verfahren der Abgabe umfassen die orale Abgabe, Bolus-Injektion oder kontinuierliche parenterale Pumpeninfusion, den kutanen Weg oder kutane iontophoretische Abgabe und intrakoronare oder intrapericardiale Abgabe oder Gentransfertherapie, wie kürzlich von Griffith et al. (Griffith et al. (1993) Neuron 10: 501-509) beschrieben, aber sind darauf nicht beschränkt.
Eine "Arrhythmie" ist eine Störung des natürlichen Herzrythmus. Erfindungsgemäß kann die Arrhythmie irgendeine atriale oder ventrikulare Arrhythmie sein, die mit einem verlängerten Wirkungspotential, frühen Nachdepolarisierungen, verzögerten Nachdepolarisierungen oder einer intrazellulären Calciumüberladung verbunden ist. Herzzustände, die solche Arrythmien beinhalten, umfassen langes QT-Syndrom, Cardiomyopathie und die proarrhythmischen Wirkungen gewisser Medikationen, einschließlich antiarrhythmische Arzneimittel und Ischämia, sind aber darauf nicht beschränkt. Andere strukturelle Abnormalitäten des Herzens, Abnormalitäten des elektrischen Herzsystems und Erkrankungen können ebenfalls Arrhythmien verursachen, die durch diese Erfindung behandelt werden können. Eine bestimmte klinische Indikation für die Intervention ist das Vorhandensein von verlängerten QT-Intervallen (> 480 ms). Die zu behandelnde Arrhythmie kann lebensbedrohlich sein. Ein bevorzugtes Merkmal dieser Erfindung ist die Behandlung von ventrikularer Tachycardie, eine Arrhythmie, die mit frühen Nachdepolarisationen assoziiert ist. Die Behandlung von atrialer und ventrikularer Fibrillation, Arrhythmien, die mit DAD und intrazellulärer Überladung verbunden sind, wird ebenfalls durch diese Erfindung gegeben.
Eine ausreichende Menge oder eine effektive Menge eines multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase-Inhibitors gemäß dieser Erfindung ist eine Menge, die zur Unterdrückung von frühen Nachdepolarisationen (EADs), verzögerten Nachdepolarisationen (DADs) oder intrazellulärer Calciumüberladung ausreichend ist. Frühe Nachdepolarisationen sind depolarisierende Oszillationen im Wirkungspotential, und deren wahrscheinliches Auftreten wird durch die Verlängerung der Wirkungspotential- Repolarisation erhöht. Es gibt ebenfalls eine mögliche Ursache von einigen letalen Arrhythmien. Verzögerte Nachdepolarisationen sind ein Marker einer intrazellulären Calciumüberladung und ebenfalls die Ursache einiger letaler Arrythmien.
Eine effektive Menge des Inhibitors variiert mit der Aktivität des Inhibitors. Gemäß einem Merkmal der Erfindung werden von etwa 0,05 bis etwa 5,0 mg des Inhibitors pro kg Körpergewicht des Subjektes verabreicht. Gemäß einem bevorzugten Merkmal werden von etwa 0,3 bis etwa 3,0 mg/kg verabreicht. Gemäß einem anderen Merkmal kann diese Dosis alle 30 bis 60 min wiederholt werden, bis eine Unterdrückung der frühen Nachdepolarisierungen erzielt wird, solange dies nicht durch die Entwicklung von Hypertension aufgrund der Ca-Kanalblockadewirkung beschränkt wird. Gemäß einem anderen Ausführungsbeispiel wird ein myristoyliertes CaM- Kinaseinhibitionspeptid in einer Dosis von etwa 2 bis etwa 20 umol/kg Körpergewicht verabreicht.
In einem Ausführungsbeispiel kann die Verabreichung eines CaM- Kinaseinhibitors ebenfalls mit der Verabreichung eines zweiten antiarrhythmischen Mittels an den Patienten kombiniert werden. Diese Kombination kann Vorteile bezüglich der Wirksamkeit als auch bezüglich der Sicherheit ergeben. Gemäß einem bevorzugten Merkmal wird der CaM- Kinaseinhibitor dem Patienten zusammen mit einem zweiten antiarrhythmischen Mittel verabreicht, das bekanntermaßen eine proarrhythmische Wirkung hat. Existierende antiarrhythmische Mittel, die einem Patienten in Kombination mit dem CaM-Kinaseinhibitor verabreicht werden können, umfassen K-Kanalblocker, wie antiarrhythmische Arzneimittel der Klasse 1A oder III. Gemäß einem Merkmal der Erfindung werden die Mittel der Klasse Ia Procainamid (1,0 g i.v. Verabreichungsdosis mit 1-3 mg/min i.v.) oder Chinidin ( 70 mg/kg/24 h) mit einem CaM-Kinaseinhibitor verabreicht. Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung werden die Mittel der Klasse III Dofetilid (8 ug/kg i.v.) oder d-Sotalol (5,7 mg/kg/24 h p.o.) mit einem CaM-Kinaseinhibitor verabreicht.
Gemäß einem anderen Merkmal kann die Verabreichung eines CaM- Kinaseinhibitors ebenfalls mit der Verabreichung eines β-adrenergischen Antagonisten kombiniert werden, um die Wirksamkeit der antiarrhythmischen Therapie zu erhöhen. Gemäß einem Merkmal der Erfindung wird der β- adrenergische Antagonist Atenolol (50-100 mg/Tag p.o./i.v.), Propranalol (60 mg/6 h p.o. oder 30 mg/6 h i.v.) oder Metoprolol (50-100 mg/6 h p.o./i.v.) mit einem CaM Kinaseinhibitor verabreicht.
In einem anderen Ausführungsbeispiel kann die Verabreichung eines CaM- Kinaseinhibitors ebenfalls mit der Verabreichung eines Calcium- Kanalblockers kombiniert werden, um die Wirksamkeit der antiarrhythmischen Therapie zu erhöhen. Gemäß einem Merkmal der Erfindung wird der Calciumkanalantagonist Nifedipin (10-30 mg/6 h p.o.), Verapamil (80- 120 mg/6 h p.o. oder 0,075-0,15 mg/kg i.v.), Diltiazem (30-90 mg/6 h p.o. oder 0,075-0,15 mg/kg i.v.), Mibefradil (50-100 mg/Tag p.o.) mit einem CaM-Kinaseinhibitor verabreicht.
Gemäß einem anderen Merkmal der Erfindung kann die Verabreichung eines CaM-Kinaseinhibitors mit einer Behandlung kombiniert werden, die eine antiarrhythmische Vorrichtung anwendet. Diese Kombination ist bei der Behandlung und Verhinderung von Arrhythmien nützlich. Bei einem bevorzugten Merkmal ist die antiarrhythmische Vorrichtung ein implantierbarer Herz- Defibrillator (nachfolgend ebenfalls als implantierbarer Cardioverter- Defibrillator bezeichnet). Zum Beispiel kann die Verabreichung eines CaM Kinaseinhibitors mit einem implantierbaren Atrium-Cardiodefibrillator zur Behandlung der Atriumfibrillation kombiniert werden. In einem anderen Ausführungsbeispiel kann die Verabreichung eines CaM-Kinaseinhibitors mit einem implantierbaren ventrikularen Cardiodefibrillator zur Behandlung der ventrikularen Fibrillation kombiniert werden. Gemäß einem weiteren Merkmal kann die Verabreichung eines CaM-Kinaseinhibitors mit einem permanenten Schrittsystem zur Verhinderung der Atriumfibrillation kombiniert werden.
In einem anderen Merkmal gibt diese Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung eines Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinaseinhibitors und eines pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten an. In einer bevorzugten Zusammensetzung wird ein Inhibitor der CaM-Kinase II verwendet. Ein "pharmazeutisch akzeptabler Exzipient" oder "Träger" ist eine therapeutisch inerte Substanz, die als Verdünnungsmittel oder Zufuhrvehikel für das Inhibitormedikament dient. Die Auswahl von geeigneten Trägern für die pharmazeutische Zusammensetzung ist dem Fachmann leicht möglich und wird zum Teil durch den spezifischen gewählten CaM-Kinaseinhibitor vorgeschrieben. Typische pharmazeutische Zusammensetzungen, die für CaM-Kinase II-Inhibitoren nützlich sind, sind in Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19. Aug. 1995, Mack Publishing Co., Easton, PA beschrieben, deren Offenbarung hierin eingefügt wird. Mögliche pharmazeutische Exzipienten umfassen Polymere, Harze, Weichmacher, Füllstoffe, Bindemittel, Schmiermittel, Gleitmittel, Schmiermittel, Gleitmittel, Auflösemittel, Lösemittel, Colösungsmittel, Puffersysteme, Tenside, Konservierungsmittel, Süßstoffe, Geschmacksmittel, Farbstoffe oder Pigmente vom pharmazeutischen Grad und Viskositätsmittel.
Ein Verfahren zur Identifizierung der für die Behandlung oder Verhinderung von Arrythmie nützlichen Mittel wird ebenfalls erfindungsgemäß angegeben. Das Screening für neue antiarrhythmische Mittel kann durch Bestimmen durchgeführt werden, ob das Mittel die CaM-Kinase II-Aktivität inhibiert. Ein Test für die CaM-Kinase II-Inhibition wird hierin beschrieben; jedoch sind alternative Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren durch Kombination mit CaM Kinase II im Bereich dieser Erfindung. Der Test für die CAM Kinase II Inhibition kann in vivo erfolgen, erfolgt aber bevorzugt in vitro. Die Fähigkeit einer untersuchten Verbindung für die Inhibition der Aktivität von CaM Kinase II in einem angemessenen Ausmass zeigt an, dass die Verbindung antiarrhythmische Eigenschaften hat.
Diese Erfindung gibt ebenfalls Medikamente zur Unterdrückung der frühen und verzögerten Nachdepolarisierungen und intrazellulären Calciumüberladung in einem Säuger an. Diese Unterdrückung wird durch die Verabreichung eines Inhibitors einer multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase an das Subjekt erzielt. Gemäß einem bevorzugten Merkmal ist der Inhibitor ein CaM Kinase II Inhibitor.
Ein anderer Aspekt dieser Erfindung gibt Medikamente zur Behandlung von Arrhythmie bei einem Menschen durch Verminderung der Aktivität einer CaM Kinase beim Menschen an. Diese Verminderung der Aktivität kann durch eine Vielzahl von Wegen erzielt werden, die jeweils leicht durch den Fachmann ermittelt werden können. Die Aktivität der CaM-Kinase wird durch die Verabreichung eines CaM-Kinase-Inhibitors an das Subjekt vermindert. Die Aktivität einer CaM-Kinase kann durch andere Mittel wie durch Verminderung des Ausmasses der Expression einer CaM-Kinase in einem Menschen durch eine Antiwahrnehmungsstrategie oder ähnliches Verfahren erzielt werden. Diese Erfindung wird in allen Aspekten durch unsere Feststellung ermöglicht, dass EADs und DADs aufgrund von ICa und/oder intrazellulären Calcium-Überladung resultieren und durch eine multifunktionellen Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase erleichtert werden.
In unseren Experimenten wurden EADs mit monophasischen Aktionspotential (MAP) Cathetern aufgezeichnet. Zuverlässige EAD-Induktion wurde unter Verwendung von Hypokalämie, verlangsamter Herzschlag und das antiarrhythmische Mittel der Vaughn-Williams Klasse III Clofilium in isolierten Perfusions-Kaninchen-Herzen erzielt. Wir zeigten zunächst eine Rolle für ICa in Clofilium - induzierten EADs unter Verwendung der spezifischen ICa-Antagonisten Nifedipin und Cd²&spplus; (Beispiel 1). Die EAD-Beendigung durch ICa-Antagonisten schien eine direkte Wirkung der ICa-Blockade und nicht eine Sekundärwirkung der [Ca²&spplus;]i-Verarmung zu sein, und zwar wegen 1) des schnellen Beginns (Fig. 1 und 2) des Auftretens vor einem signifikanten Verlust von LVDP (Fig. 2). Das Fehlen der MAP-Verkürzung bei der EAD-Beendigung ist ein weiterer Beweis, dass die EAD-Beendigung eine direkte Wirkung der ICa-Blockade und der Sekundärwirkung auf die MAP-Dauer ist (Fig. 3).
Weitere Studien in isolierten Kaninchenherzen untersuchten die Rolle der CaM-Kinase bei der Erleichterung von EADs unter Verwendung des aktiven CaM-Kinase-Inhibitors KN-93. Parallele Experimente mit dem inaktiven Analogon KN-92 dienten als Kontrolle (Beispiele 2 und 3, Fig. 1-3). Unsere Experimente zeigten, dass das CaM-Kinase-Inhibitionsmittel KN-93, aber nicht dessen inaktives Analogon KN-92 die Induktionsfähigkeit der EADs in dem gesamten Herzmodell unabhängig von anderen Faktoren, die bekanntermasen die EADs fördern, verminderten. Die Wirkungspotentialdauer war in Herzen, die mit KN-92 oder KN-93 vor oder nach Clofilium vorbehandelt waren, nicht unterschiedlich (Fig. 3). Gleichermassen waren die Herzraten bei den mit KN-92 und KN-93 vorbehandelten Herzen nicht unterschiedlich (Fig. 2). Spannungsklemmexperimente vom Gesamtzellmodus mit isolierten ventrikularen Myocyten von Kaninchen ergaben, dass KN-93 und KN-92 gleich starke direkte Blocker von ICa bei der Konzentration (0,5 umol/l) waren, die bei dem isolierten Herzexperiment verwendet wurde (Beispiel 6, Fig. 6). Jedoch wurde die ventrikulare CaM-Kinaseaktivität signifikant durch KN-93 (Ki ≤ 2,58 umol/l) aber nicht durch KN-92 inhibiert, was auf denErgebnissen eines in vitro-Assay basiert (Beispiel 5, Fig. 5).
Bestätigende Ergebnisse wurden mit einem zweiten CaM-Kinaseinhibitor, einem hochspezifischen Pseudo-Substrat-Peptid und einer angemessenen Kontrolle erhalten (Beispiel 7). Die Spezifizität der verwendeten Peptide schließt die Möglichkeit aus, dass PKA und PKC wichtige Mediatoren des arrhythmogenen Calciumstroms während dieser EADs sind.
Die Clofilium induzierte Erhöhung der Wirkungspotentialdauer erhöht vermutlich den Ca²&spplus;-Zugang über ICa. Zusätzlich zur Mediation der Ca²&spplus; Verstärkung von ICa wechselwirkt CaM-Kinase mit anderen [Ca²&spplus;]i- abhängigen Verfahren in ventrikularen Myocyten. CaM-Kinase erleichtert sowohl die Ca²&spplus;-Aufnahme durch das sarkoplasmische Reticulum als auch die Freisetzung durch den Ryanodin-Rezeptor. Die erwartete Nettowirkung der CaM-Kinaseaktivierung in ventrikularen Myocyten ist erhöhtes LVDP. Clofilium erhöhte LVDP in mit KN-92, aber nicht in mit KN-93 vorbehandelten Herzen (Fig. 2). Wenn sie einmal durch [Ca²&spplus;]i aktiviert ist, geht CaM- Kinase II eine Intersubeinheit-Autophosphrylierung ein, was zu einer Ca²&spplus;-unabhängigen CaM-Kinase II Aktivität führt. Die Messung der Ca²&spplus; unabhängigen Aktivität durch CaM-Kinase ergibt somit eine wichtige Maßnahme der CaM-Kinase-Aktivierung. Wir stellten fest, dass die Ca²&spplus;- unabhängige Aktivität signifikant während der EADs erhöht wird und dass diese Erhöhung durch die Vorbehandlung mit dem CaM-Kinaseinhibitor KN-93 (Beispiel 4, Fig. 4) bei der gleichen Konzentration, die EADs unterdrückt, verhindert wird.
In einer zusätzlichen Experimentenreihe wandten wir die repetitive Stimulation von isolierten Herzzellen unter Verwendung einer Spannungsklemme mit einer verlängerten Wirkungspotential-Wellenform an (Beispiel 8, Fig. 7). Einwärtsströme entwickelten sich konsistent in Zellen, die mit einem inaktiven Kontrollpeptid behandelt waren (Fig. 7B). Diese Einwärtsströme unterliegen verzögerten Nachdepolarisierungen und resultieren bekanntermaßen von einer intrazellulären Calciumüberladung (Thandroyen et al. (1991) Circ Res 69: 810-819). Einwärtsströme wurden in allen Zellen, die mit einem spezifischen CaM-Kinaseinhibitionspeptid behandelt waren verhindert (Beispiel 8, Fig. 7C). Ryanodin, ein Mittel, das eine intrazelluläre Calciumüberladung durch Blockade der Freisetzung von Calcium von intrazellulären Lagern verhindert, verhinderte ebenfalls die Entwicklung des Einwärtsstroms in einer separaten Zellgruppe. Somit ist die CaM Kinaseinhibition bei der Verhinderung der Einwärtströme wirksam, die bekanntermaßen eine intrazelluläre Calciumüberladung verursachen und den DADs unterliegen.
Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass CaM-Kinase während der EADs aktiviert wird. Die Feststellungen, dass 1) CaM-Kinaseinhibition die EAD-Induktionsfähigkeit reduziert und 2) EADs und MAP-Dauerverlängerung die CaM-Kinaseaktivität zusammen erhöhen, legt nahe, dass CaM-Kinase ein proarrhythmischer Effektor mit positivem Feedback für EADs ist. Die CaM- Kinaseinhibition unterdrückte ebenfalls Einwärtsströme, die mit DADs und intrazellulärer Calciumüberladung verbunden sind. Daher haben wir festgestellt, dass CaM-Kinase ein neues antiarrhythmischen Arzneimittel ist.
Die folgenden spezifischen Beispiele sollen diese Erfindung erläutern und nicht den Umfang der Ansprüche beschränken.

Beispiele

Beispiel 1

Clofilium - induzierte frühe Nachpolarisationen durch Ca²&spplus;- Stromantagonisten vom L-Typ.
Das experimentelle Design für die isolierten Herzexperimente ist in Fig. 1A gezeigt. Alle Clofilium-induzierten EADs wurden durch ICa- Antagonisten Cd²&spplus; (200 bis 500 umol/l) oder Nifedipin (10 umol/l) beendet. Die EAD-Beendigung trat bei < 10 s von einer feststellbaren Verminderung (> 10% von der vorhergehenden Basislinie) bei LVDP nach Zugabe von ICa- Antagonisten zum Perfusat auf. Die EAD-Beendigung trat, bevor sich LVDP signifikant verminderte (Fig. 2A) und ohne eine Änderung des Zwischenschlagintervalls auf (Fig. 2B). Die Wirkungspotentialdauer wurde bei dem ersten Schlag der EAD-Beendigung nicht verkürzt. Die EAD-Beendigung durch ICa-Antagonisten war aufgrund einer Sekundärwirkung auf [Ca²&spplus;]i unwahrscheinlich, weil LVDP bei der anfänglichen Beendigung nicht signifikant unterdrückt wurde. Die EAD-Beendigung durch ICa-Antagonisten war nicht aufgrund einer Sekundärwirkung auf die MAP-Dauer oder die Herzrate. Diese Ergebnisse stützten die Hypothese, dass Clofilium induzierte EADs direkt durch ICa erfolgen.

Experimentelle Methoden

New Zealand weisse Kaninchen mit irgendeinem Geschlecht (2,7-3,2 kg) wurden mit einem Heparinbolus (150 U/kg IV) behandelt und durch Pentobarbital (50 mg/kg IV) Überdosis getötet. Die Herzen wurden schnell herausgenommen und in eiskalte Tyrodelösung für die Dissektioon des Extracardialgewebes gegeben (Die Tyrodelösung setzte sich aus (mmol/Li) NaCl (130,0), NaHCO&sub3; (20,0), Glucose (5,6), KCl (3,0), CaCl&sub2; (2,0), NaH&sub2;PO&sub4; (1,8), MgCl&sub2;4H&sub2;O (0,7) zusammen. Die Aorta wurde kanüliert und mit Tyrodelösung retrograd perfuriert. Das Perfusat (200 ml) wurde durch ein Wärmebad rezirkuliert und der Einfülldruck auf 20 cmH&sub2;O eingestellt. Die Rezirkulationszeit war ungefähr 1 min. bezogen auf die Zeit zur Verminderung des linken ventrikularen Drucks (LV) nach der Zugabe von ICa-Blockern zu dem rezirkulierenden Perfusat. Die Temperatur wurde unter Verwendung einer Thermistorsonde aufgezeichnet, die in dem rechten Ventrikel (RV) positioniert war und bei 33 ± 1ºC durch ein Rü+ckführsystem mit geschlossener Luke gehalten war. Das Perfusat wurde heftig mit 95% O&sub2;, 5% CO&sub2; geblubbert und der pH während der Experimente aufgezeichnet und mit 1N NaOH oder HCl je nach Erfordernis auf 7,4 eingestellt. Beide Atrien wurden entfernt und Abläufe in den RV- und LV-Apices angeordnet. Ein Elektrocardiogram (ECG)-Draht wurde mit dem LV-Apex und der proximalen Pulmonararterien vernäht. Epicardialschritt-Steuerungsdrähte wurden in die RV-freie Wand eingeführt. Der langsame Herzschlag wurde durch Zerdrücken des AV- Knotens mit einer Zange erzeugt. Die Epicardial-Schrittsteuerung behielt eine minimale Zykluslänge von 1500 ms (Herzrate 40 Schläge/Minute) bei. Der Schrittsteuerungs-Output wurde auf die zweifache diastolische Schwelle eingestellt. In den meisten Experimenten wurde der LV-Druck kontinuierlich mit einem Festzustand-Transducer (Camino Laboratories), der in einem mit Saline gefüllten Latexballon angeordnet war, kontinuierlich aufgezeichnet. Der Ballon wurde mit einer Naht aus einem Handtaschenfaden um den linken Atrialrest gesichert und der Druck wurde eingestellt, um den LV entwickelten Druck (LVDP) zu maximieren, wobei der LV diastolische Enddruck < 10 mmHg gehalten wurde. LVDP (Peak systolischer Druck - Peak diastolischer Druck)-Messungen werden als Mittelwert von 3 benachbarten Schlägen mit Ausnahme während der irregulären Rhythmen und bei der EAD- Beendigung angegeben. Während der irregulären Rhythmen wurde die LVDP- Messung als Mittelwert von 3 Schlägen nach den längsten Zwischenschlag- Intervallen angegeben. Der LVDP wird als erster Schlag ohne einen EAD nach der ICa-Blockade angegeben (Fig. 1C). Die LVDP-Stabilität wurde als < 10% Zwischenschlag-Variationsfähigkeit definiert.
In den meisten Experimenten wurde eine einzelne MAP-Elektrode (EP- Technologies Inc., Sunnyvale, CA) über das LV-Epicardium mit einem Macro- Manipulator positioniert. Das Herz wurde gegen einen einstellbaren Stopp gegenüber dem Epicardial-MAP-Katheter zur Minimierung der Herzbewegung positioniert. In einer Vorserie von Experimenten zum Testen der Konkordanz der Endocardial- und Epicardial-EADs wurde der LV-Ballon weggelassen und gepaarte MAP-Katheter wurden einander gegenüberliegend an der freien LV-Epicardial und -Endocardialwand angeordnet. MAP-Aufzeichnungen für das Vorhandensein und die Abwesenheit von EADs waren bis auf einen Fall in allen übereinstimmend, was vermuten lässt, dass die Epicardial-MAP- Aufzeichnung ein valides Verfahren zur Ermittlung von EADs von LV- Epicardium und -Endocardium in diesem isolierten Herzmodell ist. Alle MAP-Signale wurden von (0 bis 100 Hz) mit einem Direktstrom-gekoppelten Voramplifizierer (EP Technologies Inc., Sunnyvale, Ca) amplifiziert und direkt auf einen Diagrammaufzeichner (Gould 2600S) bei 100 mm/s aufgezeichnet. Daten von einigen Experimenten wurden digitalisiert (Neurocorder) und auf einem Videobandaufzeichner gelagert. Eine akzeptable MAP- Katheterposition wurde durch eine stabile Wirkungspotential- Konfiguration, die frei von EADs oder verzögerten Nachdipolarisierungen (DADs) während einer > 10 min Kontrollperiode ist, bestätigt. Die MAP- Amplitude wurde als Unterschied zwischen Phase 2 und Phase 4 definiert. Die MAP-Amplitude zu Beginn der Experimente war 10,4 (±1,26) mv. Die MAP-Dauer wurde von Beginn der Phase 0 bis zur 50%-(APD&sub5;&sub0;) und 90%-(APD%)- Repolarisierung gemessen. Wenn vorhanden, waren die EADs in den APD- Messungen enthalten. Alle MAP-Dauern sind als Mittelwert von 3 aufeinander folgenden Schlägen angegeben, mit Ausnahme nach der EAD-Beendigung, worin der erste Schlag nach der EAD-Beendigung durch Cd²&spplus; oder Nifedipin verwendet wurde. Schlag-zu-Schlag-Intervalle wurden von Beginn der Phase 0 unter Verwendung von den folgenden MAPs gemessen. Schlag-zu-Schlag- Intervalle während der irregulären Rhythmen werden als längste Intervalle angegeben, die während der Messungsperiode vorhanden sind.
Die EADs wurden als diskrete Oszillationen bei der MAP- Repolarisierung mit der Neigung des Tangens bis zum Beginn der Oszillation > 0,0 definiert (Fig. 1). Die EADs hatten bei den meisten (> 90%) Schlägen über eine 1minütige Periode oder einem stabilen, bigeminalen, alternierenden Muster, das als induzierbar zu klassifizieren ist, vorhanden zu sein. Wenn diese Kriterien erfüllt waren, setzten sich die EADs für > 2 min fort und erforderten immer eine ICa-Blockade für die Terminierung. Multiple EADs wurden als > 1 EAD-Auftritt pro Schlag definiert (Fig. 1). Die CaM-Kinase-Inhibitionsexperimente bestanden aus 4 Perioden (Fig. 1A). Die erste Periode (> 10 min) war die Kontrolle und ergab die stabilen Basislinienwerte für MAPs, LVDP, Herzrate und Rhythmus. Die zweite Periode folgte der Zugabe von KN-92 oder KN-93 zum Perfusat und dauerte 10 min. Die dritte Periode folgte der Zugabe von Clofilium zum Perfusat und dauerte 30 min oder bis die EADs auftraten. Wenn keine EADs auftraten, wurden die längsten MAP-Dauern verwendet. MAP- und LVDP- Messungen wurden bei 10 min Intervallen und zum Zeitpunkt des EAD- Auftretens während der dritten Periode durchgeführt. Die vierte Periode bestand nur aus Experimenten, bei denen die EADs auftraten und die Messungen folgten der Zugabe von Nifedipin (10 umol/l) oder Cd²&spplus; (200-500 umol/l) zum Perfusat.

Beispiel 2

Frühe Nachdepolarisierungen werden durch Vorbehandlung mit dem CaM- Kinaseinhibitor KN-93 verhindert.
Wir untersuchten, ob CaM-Kinase zur ventrikularen EAD-Initiierung und -Beibehaltung beiträgt, so dass es eine Rolle bei der Verstärkung von ICa spielt. Dies wurde getestet unter Verwendung des CaM-Kinaseinhibitors KN-93 und dessen inaktiven Analogon KN-92. Die Entscheidung, KN-93 und KN-92 bei 0,5 umol/l zu verwenden, basiert auf unsere Feststellung, dass diese Mittel gleichermaßen gegenüber ICa-Antagonisten bei dieser Konzentration wirksam sind (Fig. 6C).
Isolierte Herzen, die mit dem CaM-Kinaseinhibitor KN-93 (0,5 umol/l) vorbehandelt sind, entwickeln weniger wahrscheinlich EADs als Antwort auf Clofilium (7,5 uM) (EADs in 4/10 Herzen), als Herzen, die mit dem inaktiven Analogon KN-92 vorbehandelt sind (EADs in 10/11 Herzen) (0,5 umol/l) (P = 0,024). Die EAD-Induktion durch Clofilium war in Herzen, die mit KN-92 (EADs in 10/11 Herzen) vorbehandelt waren, im Vergleich zu Herzen ohne irgendeine Art der Vorbehandlung nicht unterschiedlich (EAD in 8/8 Herzen), was nahelegt, dass das inaktive Analogon KN-92 keine Wirkung auf die EAD-Induktionsfähigkeit durch Clofilium hat (Daten nicht gezeigt). Wenn die EADS als einzelne oder multiple Oszillationen während der MAP-Repolarisierung subklassifiziert wurden, traten multiple EADs häufig bei Herzen auf, die mit dem inaktiven Analogon KN-92 vorbehandelt waren (7/11) im Vergleich zu solchen, die mit dem CaM- Kinaseinhibitor KN-93 vorbehandelt waren (1/10) (p = 0,024). Die Unterschiede bei der EAD-Induktionsfähigkeit in Herzen, die mit KN-93 und KN- 92 vorbehandelt waren, folgten nicht aufgrund der Unterschiede der MAP- Dauer (Fig. 3) oder der Herzrate (Fig. 2). Diese Feststellungen legen nahe, dass die KN-93-Unterdrückung der EAD unabhängig von bekannten Faktoren ist, die EADs erleichtern, wie Herzrate und Wirkungspotentialdauer.

Beispiel 3

CaM-Kinaseinhibition verhinderte den erhöhten linken vertrikularen entwickelten Druck während der Wirkungspotential-Verlängerung und frühen Nachdepolarisierungen

Der linke ventrikulare entwickelte Druck erhöhte sich signifikant im Vergleich zur Kontrolle nach der Zugabe von Clofilium zu dem Bad in Herzen, die mit dem inaktiven Analogon KN-92 (Fig. 2A) vorbehandelt sind. Erhöhungen des linken ventrikularen entwickelten Drucks traten beim Schritt mit MAP-Dauerverlängerung (Fig. 3) und EADs aber ohne eine Änderung der Herzrate auf (Fig. 2B). Die KN-93-Vorbehandlung verhinderte vollständig die Erhöhung von LVDP durch Clofilium (Fig. 2A) ohne Reduktion der MAP-Dauerverlängerung (Fig. 3) oder Änderung der Herzrate (Fig. 2B). Erhöhtes LVDP während der MAP-Verlängerung und EAD ist aufgrund der CaM-Kinase mediierten ICa-Steigerung möglich.

Beispiel 4

Ca²&spplus;-unabhängige CaM-Kinaseaktivität wird während der frühen Nachdepolarisierungen erhöht

Einmal durch erhöhte [Ca²&spplus;]i aktiviert wird die CaM-Kinase II- Aktivität Ca²&spplus;-unabhängig über die Intersubeinheit-Phosphorylierung. Somit ist die Ca²&spplus;-unabhängige CaM-Kinaseaktivität ein Marker für die CaM- Kinaseaktivierung. Weil die EADs aufgrund von ICa in diesem isolierten Herzmodell auftreten, hypothetisierten wir, dass die EADs mit erhöhter Ca²&spplus;-unabhäniger CaM-Kinaseaktivität assoziiert sind. Die Ca²&spplus;-unabhängige CaM-Kinaseaktivität erhöhte sich signifikant in Herzen, was EADs nach Clofilium demonstriert, im Vergleich zu Herzen ohne Clofiliumbehandlung oder EADs (Fig. 4). Keine signifikante Erhöhung der Ca²&spplus;-unabhängigen CaM-Kinaseaktivität trat im Vergleich zur Kontrolle in Herzen, die mit KN-93 (0,5 uMol/l) vor Clofilium behandelt waren, auf (Fig. 4). Diese Feststellungen zeigen, dass die EADs mit einer Erhöhung der Ca²&spplus;- abhängigen CaM-Kinaseaktivität assoziiert sind und die Konzentration von KN-93, die zur Unterdrückung der EADs bei diesen Experimenten verwendet wird, ausreichend ist, um die CaM-Kinaseaktivierung signifikant zu inhibieren. Diese Erhöhung der Ca²&spplus;-unabhängigen CaM-Kinaseaktivität ist mit der Hypothese konsistent, dass die CaM-Kinase ein proarrhythmisches signalisierendes Molekül für EADs ist.

Beispiel 5

KN-93 inhibiert CaM-Kinaseaktivität im Kaninchen-Myocardium

In vitro-Messungen der CaM-Kinaseaktivität im LV-Gewebehomogenat zeigen, dass KN-93 ein Inhibitor der CaM-Kinase mit Ki < 2,58 umol/l ist (Fig. 5). Das inaktive Analogon KN-92 verursacht keine annehmbare Inhibition der CaM-Kinaseaktivität. Diese Feststellungen sind ähnlich zu früheren Feststellungen, die für Pheochromocytoma (PC12)-Zellen von Ratten berichtet wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass KN-92 eine valide Kontrolle für die CaM-Kinaseinhibition durch KN-93 ist.

Experimentelle Methoden

Das linke ventrikulare Homogenat wurde wie folgt hergestellt: nach der Entfernung des Herzens wurde es innominal Ca²&spplus;-freier, eiskalter HEPES-gepufferter Tyrodelösung gegeben. 1 bis 2 g der freien linken Ventricularwand wurde abgeschnitten, grob zerhackt und in 5 bis 10 ml kaltem Homogenisierungspuffer (mmol/l: 20 PIPES, 1 EDTA, 1EGTA, 2DTT, 10 Natriumpyrophosphat und 50-100 ug/ml Leupeptin) bei pH 7,0 suspendiert. Die Gewebesuspension wurde bei 4ºC unter Verwendung von 3 bis 10 s Schüben eines Polytron mit 30 s Pause zwischen den Schüben homogenisiert. Das Homogenat wurde dann bei 10000 · g 20 min bei 4ºC unter Verwendung eines JA-20 Rotors zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und direkt bei dem Assay verwendet. Die Proteinkonzentration wurde durch das Bradford- Verfahren unter Verwendung von BSA als Standard gemessen.
Der Assay der CaM-Kinaseaktivität wurde essentiell wie von Waldmann et al. beschrieben mit einigen wenigen Modifizierungen durchgeführt. Der Assay wurde 3fach in einem Endvolumen von 50 ul, umfassend 540 mmol/l PIPES, pH 7,0, 10 mmol/l MgCl&sub2;, 0,1 mg/ml BSA, 10 umol/l Autocamitid 3 (synthetisches Kinasesubstrat), 150 mmol/l Calmodulin, 1 mmol/l CaCl&sub2; oder 1 mmol/l EGTA, und durch Erhöhen der Konzentrationen (0-100 umol/l) KN-93 oder KN-92 durchgeführt. 30 bis 50 ug des Gewebehomogenates wurden pro Assay-Rohr zugegeben und die Proben wurden dann bei 30ºC 1 min präinkubiert. Die Kinasereaktion wurde dann durch Zugabe von 50 umol/l (Ende) γ³²P-ATP ( 400 cpm/pmol) begonnen, und die Inkubation wurde für weitere 1 bis 2 min durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 ul kalter Trichloressigsäure (30% G/V) beendet und Proben wurden auf Eis für ≥2 min gegeben. Calcium/Calmodulin-abhängige Phosphorylierung des Autocamtid-3-Substrates wurde dann wie beschrieben quantifiziert. Calcium/C almodulin-unabhängige CaM-Kinaseaktivität wurde wie oben beschrieben quantifiziert, aber Ca²&spplus; wurde von der Assaylösung weggelassen. Die Daten, die die Inhibition der CaM-Kinaseaktivität durch KN-93 beschreiben, wurden entsprechend der Hill-Gleichung angepasst.

Beispiel 6

KN-92 und KN-93 sind gleich starke direkte Blocker des Ca²&spplus;-Stromes vom L-Typ

Wir untersuchten die relative L-Typ Ca²&spplus;-Strom (ICa)- Blockadefähigkeit von KN-92 und KN-93 in einzelnen ventrikularen Myocyten unter Verwendung der Gesamtzell-Spannungsklemmmethode. Diese Untersuchungen wurden wegen der Beobachtung, dass Clofilium induzierte EADs durch ICa-Blockaden im isolierten Kaninchenherzen terminiert werden, und der Feststellungen durchgeführt, dass andere CaM-Kinaseinhibitionsmittel ICa blockieren. Weil CaM-Kinase ICa verstärken kann, versuchten wir, die CaM- Kinaseaktivität durch Dialyse von Zellen über die aufzeichnende Micropipette mit dem schnellen Ca²&spplus;-Chelator BAPTA (20 mmol/l) zu blockieren, so dass nur direkte Effekte von KN-92 und KN-93 bei ICa gemessen wurden. Die externe Anwendung von KN-92 (0,5 umol/l 9 oder KN-93 (0,5 umol/l) verursachte eine gleich starke Gleichgewichtsinhibition des Peaks ICa (36,2 ± 1,9%, KN-92 und 36,2 ± 4,3% KN-93) in isolierten ventrikularen Myocyten von Kaninchen (Fig. 5). Geschätzte IC&sub5;0-Werte waren ungefähr 1 umol/l für beide Mittel. Weder KN-92 noch KN-93 verschoben die scheinbare Spannungsabhängigkeit der ICa-Aktivierung. Die Menge der ICa-Inhibition durch 0,5 umol/l KN-92 oder KN-93 ist scheinbar unzureichend, um EADs in diesem Modell zu unterdrücken (Beispiel 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass KN-92 eine valide Kontrolle für die direkten ICa-Blockierwirkungen von KN-93 in den isolierten ventrikularen Myocyten von Kaninchen ist, weil diese Mittel äquivalente ICa-Antagonisten-Wirkungen bei der Konzentration (0,5 umol/l) haben, die zur Unterdrückung von EADs verwendet werden (Fig. 6C).

Experimentelle Methoden

Einzelne ventrikulare Myocyten wurden hergestellt, wie zuvor von Anderson et al (1994) Circ Res, 75: 854-861 beschrieben ist. Die Standard Ca²&spplus;-haltige Lösung für die Myocytenherstellung setzte sich zusammen aus (mmol/l) NaCl 137,0, HEPES (freie Säure) 10,0, NaH&sub2;PO&sub4; 0,33, Glucose 10,0, KCl 5,4, CaCl&sub2; 1,8, und MgCl&sub2; 2,0. Die nominal-Ca²&spplus;-freie Lösung war identisch, mit der Ausnahme, dass CaCl&sub2; weggelassen wurde. Die geringe Ca²&spplus;- Lösung enthielt 0,2 mmol/l CaCl&sub2;. Die Kollagenaselösungen wurden mit 1% BSA (G/V) und ungefähr 60 U/ml Collagenase (Worthington Biochemicals) und ungefähr 0,1 U/ml Typ XIV Protease (Sigma Chemical Co) hergestellt. Die Myocyt-Badlösung enthielt (mmol/l) NaCl 137,0, CsCl 20,0, Glucose 10,0, HEPES 10,0, KCl 5,4, CaCl&sub2; 1,8, MgCl&sub2; 0,5 und Tetrodotoxin 0,03, der pH wurde mit 10 N NaOH auf 7,4 eingestellt. Die intrazelluläre Pipettenlösung enthielt (mmol/l) CsCl 130,0, 4Cs BAPTA 10,0 (molekulare Proben), Phosphocreatin 5,0, NaGTP 1,0 und MgATP 1,0; der pH wurde mit 10 N CsOH auf 7,2 eingestellt.
New Zealand weiße Kaninchen (2 bis 3 kg Körpergewicht) wurden durch Pentobarbital-(50 mg/kg IV)-Überdosis getötet. Die Herzen wurden schnell exzensiert und in eiskalte nominal Ca²&spplus;-freie HEPES-gepufferter Myocytenbadlösung gegeben. Die Aorta wurde kanüliert und das Herz auf Retrograd- Weise mit einem nominal Ca²&spplus;-freien Perfusat 15 min bei 37ºC perfundiert. Anschließend folgte eine 15minütige Perfusion mit Collagenase-haltiger nominal Ca²&spplus;-freier Lösung. Die Endperfusion erfolgte mit Collagenasehaltiger niedriger Ca²&spplus;- (0,2 mmol/l)-Lösung. Das LV und Septum wurden abgeschnitten, grob zerkleinert und in einem Becherglas mit einer Lösung mit geringem Ca²&spplus; mit 1% (W/V) Rinderserumalbumin (BSA) bei 37ºC gegeben. Myocyten wurden durch mildes Rühren dispergiert, in seriellen Aliquoten gesammelt und dann in Standard-Salzlösung mit 1,8 mmol/L Ca²&spplus; gehalten. Alle Lösungen wurden heftig oxygeniert.
Isolierte ruhende ventrikulare Myocyten wurden mit der Weg-Klemm- Methode bei der Gesamtzellaufzeichnungskonfiguration unter Verwendung eines Axopatch 1B Amplifizierers (Axon Instruments) untersucht. Mikropipetten wurden von Glaskapillarrohren (VWR) gezogen und bis zu einem Spitzenwiderstand von 1 bis 3 M Ω wärmepoliert, wenn sie mit der intrazellularen Lösung gefüllt waren.
Die Zellmembran wurde von -40 mV auf +60 mV für 200 ms in 10 mV Schritten von einem Haltepotential von -40 mV bei einer Stimulation von 1,0 Hz gebracht. Dieses Protokoll wurde mit 60 s Pausen zwischen den Serien der Spannungsklemmschritte wiederholt, und der Transmembranstrom wurde bei 2 kHz als Probe gezogen. Spannungsklemmprotokolle und der Datenerwerb wurden unter Verwendung von PCLAMP-Software (Version 6,0, Axon Instruments) an einem Mikrocomputer (Gateway 2000) mit einem A/D, D/A- Konverter (Digidata 1200, Axon Instruments) durchgeführt. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur (20 bis 23ºC) auf der Stufe eines Diaphotinvertierten Mikroskops (Nikon Corp.) durchgeführt. Rein makroskopisches ICa wird unter diesen Aufzeichnungsbedingungen beobachtet. Schnelles intrazelluläres Ca²&spplus;-Puffern mit BAPTA (10 mmol/l) und die langen (60 s) Reste zwischen den Spannungsschritt-Protokollen wurden gewählt, um die CaM-Kinaseaktivierung zu minimieren, so dass die direkte ICa-Blockade durch KN-93 oder KN-92 unabhängig von einer Wirkung auf die CaM-Kinase gemessen wurde. Die Peak-ICa-Stabilität wurde definiert, wenn der Peak ICa < 10% zwischen den Spannungsschritten variierte. Die direkte ICa-Blockade durch KN-92 oder KN-93 wurde nach einer stabilen Kontrollperiode untersucht. KN-92 oder KN-93 wurde zu dem Bad bei erhöhenden Konzentrationen gegeben. Der Peak-ICa-Stabilität etablierte sich vor der Änderung zu der nächsten KN-92- oder KN-93-Konzentration.

Beispiel 7

Frühe Nachdepolarisierungen werden ebenfalls durch Vorbehandlung mit hoch spezifischen CaM-Kinaseinhibitionspeptiden verhindert
Experimente, die bei isolierten Kaninchenherzen unter Verwendung von hoch spezifischen CaM-Kinaseinhibitionspeptiden durchgeführt wurden, bekräftigten weiterhin die Ergebnisse, die unter Verwendung des Inhibitors KN-93 erhalten wurden (Beispiele 2 und 3). Es wurde vorher berichtet, dass das Peptid der Sequenz KKALHRQEAVDCL (SEQ ID Nr. 1) CaM-Kinase, aber nicht PKA oder PKC inhibieren. Ein zweites Peptid, KKALHAQERVDCL (SEQ ID Nr. 2), das CaM Kinase nicht inhibiert, wurde als Kontrolle verwendet.
Wirkungspotentiale wurden in isolierten ventrikularen Myocyten von Kaninchen induziert, die in einer Stromklemme mit geringem (1,0 mM) extrazellulärem Kalium zur Favorisierung der EAD-Induktion untersucht wurden. Die EADs wurden in der Hauptzahl der Kontrollzellen, die mit einem inaktiven Peptid dialysiert waren, (11/15), aber nicht in Zellen (4/15) induziert, die mit dem CaM-Kinaseinhibitionspeptid dialysiert wurden. Die EADs, die in mit dem Kontrollpeptid behandelten Zellen gesehen werden, neigten dazu, komplex und repititiv zu sein (d. h. multipel), aber nur einzelne EADs waren in mit Inhibitionspeptid behandelten Zellen vorhanden.
Weiterhin ergaben Messungen des L-Typ-Calciumfenster-Stroms unter Verwendung eines verlängerten EAD haltigen Wirkungspotentials als Spannungsklemm-wellenform, dass eine Erhöhung des Stroms durch Dialyse mit dem CaM-Kinaseinhibitionspeptid verhindert wurde (Daten nicht gezeigt). Das Kontrollpeptid hatte keine signifikante Wirkung auf diesen Calciumstrom. Diese Ergebnisse sind mit der Erhöhung des arrhythmogenen L-Typ Calciumfensterstroms durch CaM-Kinase konsistent.

Beispiel 8

Einwärtsströme, assoziiert mit verzögerten Nachdepolarisierungen und intrazellulärer Calcium-Überladung werden durch CaM-Kinaseinhibition unterdrückt.
Isolierte Herzzellen (experimentelle Methoden, Beispiel 6) wurden in einer Spannungsklemme (0,5 Hz) unter Verwendung einer verlängerten Wirkungspotentialwellenform stimuliert (Fig. 7A). Schnelle Schrittsteuerung favorisiert die intrazellulare Calciumüberladung. Einwärtsströme, die als Antwort zu der schnellen Schrittsteuerung entwickelt werden, sind ein Marker für die intrazelluläre Calciumüberladung und sind die Basis für die arrhythmogenen verzögerten Nachdepolarisierungen (DAD). Die Hauptzahl der Zellen (5/6), die mit einem inaktiven Kontroll-Peptid (SEQ ID Nr. 2) behandelt sind, entwickelten Einwärtsströme (Fig. 7B). Die Behandlung einer zweiten Gruppe mit dem aktiven CaM-Kinaseinhibitionspeptid (SEQ ID Nr. 1) verhinderte vollständig die Einwärtsströme (Einwärtsströme in 0/5 Zellen) (Fig. 7C). Ryanodin (10 umol/l) verhindert die intrazelluläre Calciumüberladung durch Blockieren der Freisetzung von Calcium von intrazellulären Vorräten und verhinderte ebenfalls die Entwicklung von Schrittsteuerungsindizierten Einwärtsströmen (2/2 des untersuchten Zellen). Diese Ergebnisse zeigten an, dass die CaM-Kinaseinhibition die intrazelluläre Calciumüberladung und die Entwicklung von mit DAD verbundenen Strömen verhindern kann.

Experimentelle Methoden

Die Wirkungspotential-Aufzeichnung wurde in der folgenden Badlösung durchgeführt: (mmol/l): NaCl 140,0, Glucose 10,0, HEPES 5,0, KCl 5,4, CaCl&sub2; 2,5, MgCl&sub2; 1,0; pH wurde mit 10 N NaOH auf 7,4 eingestellt. Die intrazelluläre Pipettenlösung für die Wirkungspotentialaufzeichnung enthielt (mmol/l): K-Aspartat 120,0, HEPES 10,0, EGTA 10,0, Na&sub2;ATP 5,0, MgCl&sub2; 4,0, CaCl&sub2; 3,0; pH wurde mit 1 N KOH auf 7,2 eingestellt. Wenn nichts anderes angegeben ist, waren alle Chemikalien von Sigma.
Die Zellen wurden bei 0,1 Hz in der Gesamtzellkonfiguration in einem Stromklemmmodus mit 0,1 bis 1,0 nA Pulsen eines depolarisierenden Stroms (1,25 · Schwelle) für 2 bis 3 ms bei Raumtemperatur (20º-23ºC) stimuliert. Die Wirkungspotentiale wurden bei 2 KHz mit geringem Durchgang filtriert und bei 2,5 KHz mit einem 12-Bit Analog-Digital-Konverter (Digidata 1200 B, Axon Instruments) als Proben gezogen. Eine lange Wirkungspotential-Wellenform wurde digitalisiert und für die Anwendung als Spannungsbefehl unter Verwendung PClamp 6.03 gelagert.
Isolierte Zellen wurden mit der Wirkungspotential-Befehlswellenform unter Verwendung der Spannungsklemm-Methode (Experimentelle Methoden, Beispiel 6) untersucht. Zellen wurden bei 0,5 Hz und 32ºC (Wärmestufe von Warner Instrumetns) für bis zu 100 Schläge stimuliert. Die Aufzeichnungslösungen waren denen für die Wirkungspotential-Aufzeichnung identisch, mit der Ausnahme, dass der Calciumpuffer EGTA von der intrazellulären Lösung weggelassen wurde, um die intrazeluläre Calciumüberladung zu favorisieren. Das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Einwärtsstromes der Nachpolarisierung wurde festgestellt.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER
(A) Anderson, Mark E. Schulman, Howard Braun, Andrew P. Sung, Ruey J.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verfahren zur Behandlung von Arrhythmie durch Inhibition einer multifunktionellen Calcium/Calmodulin- abhängigen Proteinkinase
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDIERENDE ADRESSE:
(A) ADRESSE: Heller Ehrman White & McAuliffe
(B) STRASSE: 525 University Avenue
(C) STADT: Palo Alto
(D) STAAT: Californien
(E) LAND: USA
(F) PLZ: 94301-1900
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Ausgabe #1.0, Version #1.30
(vi) ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) PATENTANWALT/INFORMATION
(A) NAME: Schmonsees, William
(B) REGISTRATIONS-NR: 31796
(C) REFERENZ/AKTENNUMMER: 23550-0001
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: (650) 324-7000
(B) TELEFAX: (650) 324-0638

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Amninosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: NEIN
(x) PUBLIKATIONS-INFORMATION:
(A) AUTOREN: Braun, Andrew P. Schulman, Howard
(C) JOURNAL: Journal of Physiol
(D) BAND: 488
(F) SEITEN: 37-55
(G) DATUM: 1995
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NR. 1: Von 1 bis 13 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Amninosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: NEIN
(x) PUBLIKATIONS-INFORMATION:
(A) AUTOREN: Braun, Andrew P. Schulman, Howard
(C) JOURNAL: Journal of Physiol
(D) BAND: 488
(F) SEITEN: 37-55
(G) DATUM: 1995
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NR. 2: Von 1 bis 13 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2

Claims

1. Verwendung eines Inhibitors einer multifunktionellen Ca²&spplus; Calmodulin-abhängigen Proteinkinase in einer Menge, die zur Unterdrückung der frühen Nachdepolarisierungen, verzögerten Nachdepolarisierungen oder intracellulären Calciumüberladung ausreichend ist, zur Herstellung eines Medikamentes, das zur Verhinderung oder Behandlung von Arrhythmie geeignet ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Inhibitor ein CaM Kinase II Inhibitor ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Inhibitor 2-[N-(2- Hydroxyethyl)-N-(4-methoxybenzolsulfonyl)]-amino-N-(4-chlorcinnamyl)-N- methylbenzylamin ist.

4. Verwendung nach Ansrpuch 1, worin der Inhibitor das Peptid mit der Sequenz KKALHRQEAVDCL (SEQ ID Nr. 1) ist.

5. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament durch ein Mittel verabreicht wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus intravenöser Infusion, parenteraler Pumpeninfusion, transkutaner Verabreichung, intracoroner Arterieninfusion und Intrapericardial-Infusion.

6. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Arrhythmie ventriculare Tachycardie, ventriculare Fibrillation oder Atrial-Fibrillation ist.

7. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Inhibitor in einer Dosis von etwa 0,05 mg bis etwa 5,0 mg pro kg Körpergewicht, bevorzugt von etwa 0,3 mg bis etwa 3,0 mg pro kg Körpergewicht verabreicht wird.

8. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament weiterhin ein zweites antiarrhythmisches Mittel enthält.

9. Verwendung nach Anspruch 8, worin das zeite antiarrhythmische Mittel ein Kaliumkanal-Antagonist ist.

10. Verwendung nach Anspruch 8, worin das zweite antiarrhythmische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Kaliumkanal-Blocker, einem β-adrenergischen Rezeptor-Antagonist und einem Calcium-Kanalblocker.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Inhibitor einer multifunktionellen Ca²&spplus;/Calmodulin-abhängigen Protein-Kinase in einer Menge, die zum Unterdrücken der frühen Nachdepolarisierungen, verzögerten Nachdepolarisierungen oder intracellulären Calcium-Überladung wirksam ist und weiterhin umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin der Inhibitor ein CaM Kinase II Inhibitor ist.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, umfassend von etwa 3 mg bis etwa 350 mg des Inhibitors, bevorzugt von etwa 20 mg bis etwa 200 mg des Inhibitors.

14. Verfahren zum Identifizieren von Mitteln, die zur Behandlung von Arrhythmien nützlich sind, umfassend das Aussetzen des Mittels einer CaM Kinase II und die Bestimmung, ob die Aktivität der CaM Kinase II vermindert wird.

15. Verwendung eines Inhibitors einer multifunktionellen Ca²&spplus;/Calmodulin-abhängigen Protein-Kinase für die Herstellung eines Medikamentes, das zur Verminderung der proarrhythmischen Wirkungen aufgrund der Wirkungspotentialverlängerung eines antiarrhythmischen Arzneimittels geeignet ist.

16. Verwendung nach Anspruch 15, worin der Inhibitor ein CaM Kinase II Inhibitor ist.

17. Verwendung eines Inhibitors einer multifunktionellen Ca²&spplus;/Calmodulin-abhängigen Protein-Kinase für die Herstellung eines Medikamentes, das zum Unterdrücken von frühen Nachdepolarisierungen, verzögerten Nachdepolarisierungen und einer intracellulären Calciumüberladung geeignet ist.

18. Verwendung nach Anspruch 17, worin der Inhibitor ein CaM Kinase II Inhibitor ist.

19. Verwendung eines Ca²&spplus;/Calmodulin-abhängigen Kinaseinhibitors für die Herstellung eines Medikamentes, das zur Behandlung von Arrhythmie geeignet ist, umfassend die Verminderung der Aktivität einer Ca²&spplus;/Calmodulin-abhängigen Kinase in einem Subjekt.