DE69803627T2

DE69803627T2 - Immunoassay-Element

Info

Publication number: DE69803627T2
Application number: DE69803627T
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Amano; Hitomi Ito; Toshihisa Ito; Toshihiro Mori; Yoshiki Sakaino; Osamu Seshimoto
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1997-06-13
Filing date: 1998-06-15
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2018-06-16
Also published as: US20050084953A1; EP0884591B1; US7820402B2; DE69803627D1; US20060024770A1; US20030207332A1; EP0884591A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein trockenes Immunoassay-Element, in dem ein homogener Enzymimmunoassay durchgeführt wird. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Immunoassay-Element, umfassend eine Substratschicht, enthaltend ein nichtdiffundierbares Substrat, das in Anwesenheit eines Markierungsenzyms ein diffundierbares Material bildet, und eine Reagensschicht, enthaltend ein Fragmentierungsenzym für die weitere Fragmentierung des diffundierbaren Materials in ein Produkt mit niedrigerem Molekulargewicht, wobei das nichtdiffundierbare Substrat ein Substrat ist, welches selektiv mit dem Markierungsenzym reagiert und wobei eine Reaktion mit dem Fragmentierungsenzym vermieden wird.

Beschreibung des Standes der Technik

Analysen von Bestandteilen, die aus dem lebenden Körper stammen oder von Chemikalien, die in Körperflüssigkeiten vorhanden sind, wie in Blut und Urin, sind nützlich für die Diagnose des Krankheitsbildes oder für die Beurteilung des Heilungsverlaufs, und somit stellen sie wichtige Teile auf dem Gebiet klinischer Tests dar. Der sogenannte Enzymimmunoassay ist als ein Verfahren zur Analyse solcher Bestandteile (Liganden), die allgemein in geringen Mengen in Körperflüssigkeiten vorhanden sind, bekannt. Die Enzymimmunoassays können in heterogene Systeme, bei denen eine B/F (gebunden/frei)-Trennung bewirkt werden muss, und homogene Systeme, bei denen die B/F-Trennung nicht erforderlich ist, eingeteilt werden. Die Reaktionen in dem homogenen System beruhen auf dem Phänomen, dass die enzymatische Aktivität des Markierungsenzyms durch Interferenz beeinflusst wird, die durch Bindung eines Antikörpers an das Antigen (Ligand) verursacht wird, und dass die Inhibierung, bedingt durch die Antigen-Antikörper-Bindung im Allgemeinen ausgenutzt wird. Es wird angenommen, dass die enzymatische Aktivität durch eine sterische Hinderung, verursacht durch das Binden des Enzyms an das Substrat oder eine Änderung in der dreidimensionalen Struktur des Enzyms, unterdrückt wird, wenn der Antikörper, der im Allgemeinen ein großes Molekül ist, an das mit Enzym markierte Antigen gebunden wird.
Wenn das Antigen ein Hochpolymer ist, kann die Unterdrückung der enzymatischen Aktivität durch die Antigen- Antikörper-Bindungsreaktion durch Markierung des Antikörpers mit einem Enzym detektiert werden.
Bei klinischen Routinetests, bei denen eine Reihe von Testproben gehandhabt werden muss, ist es erforderlich, dass die individuellen Proben nach einem einfachen Verfahren analysiert werden können, wünschenswerterweise durch eine automatisierte Verfahrenssequenz.
Um diese Forderung zu erfüllen, wurden trockene Analysenelemente vorgeschlagen (vergleiche beispielsweise nicht geprüfte japanische Patentpublikationen Nrn. 53888/1974 (entsprechend USP 3 992 158), 90859/1980 (entsprechend USP 4 258 001), 164356/1980 (USP 4 292 272), 222769/1985 (EP 0162302A), 77356/1984 (entsprechend EP 0097952A), 102388/1984 und 501866/1986 (USP 4 459 358).
Es ist ein trockenes Analysenelement bekannt, bei dem ein mit Enzym markierter Antikörper verwendet wird und in einer homogenen immunologischen Enzymreaktion umgesetzt wird (vergleiche nichtgeprüfte japanische Patentpublikation Nr. 321360/1989, entsprechend EP 0347839A). Das bekannte trockene Analysenelement umfasst die folgenden drei Reagensbestandteile in der gleichen oder in unterschiedlichen Schichten in der vielschichtigen Verbundstruktur:
(A) Ein Antigen mit hohem Molekulargewicht (ein Kupplungsprodukt aus einem Liganden oder einem Derivat davon mit einer Verbindung mit einem hohen Molekulargewicht; im Folgenden als "polymerisiertes Antigen" bezeichnet);
(B) Ein wasserunlösliches Hochpolymer-Substrat; und
(C) Ein Konjugat aus einem Antikörper gegen den Liganden und einem Enzym für das Substrat.
Das Antigen, das durch Tüpfeln auf das Analysenelement zugeführt wird, bindet durch eine kompetitive Reaktion mit der Reaktion des polymerisierten Antigens an das Antikörper-Enzymkonjugat. Der Komplex aus Antigen-Antikörper- Enzym reagiert mit dem wasserunlöslichen hochpolymeren Substrat unter Bildung eines löslichen Produkts mit niedrigem Molekulargewicht. Andererseits kann der Komplex aus polymerisiertem Antigen und enzymmarkiertem Antikörper, der durch Bindung mit dem polymerisierten Antigen gebildet wurde, keine enzymatische Aktivität gegenüber dem Hochpolymer-Substrat zeigen. Dementsprechend nimmt, wenn die Menge an Antigen in der Probe erhöht wird, das Produkt, das durch enzymatische Reaktion gebildet wird, zu. Dieses Produkt kann in die Detektionsschicht diffundieren, wo die Menge des Produkts durch Messung der optischen Dichte einer Absorption, bedingt durch gefärbte chemische Gruppen, bestimmt wird, wodurch es möglich wird, das Antigen in der Probe quantitativ zu analysieren.
Das Immunoassay-Element, das in dem japanischen Patent Nr. 2576910-B2 (entsprechend USP 5 569 589 und EP 0451848A) beschrieben wird, ist eine Verbesserung des zuvor erwähnten Immunoassay-Elements. Dieses Immunoassay-Element besitzt eine Reagensschicht, die ein Fragmentierungsenzym für die weitere Fragmentierung des Zersetzungsprodukts durch Umsetzung des Markierungsenzyms enthält, so dass das fragmentierte Produkt mit niedrigem Molekulargewicht für die weitere Sensibilisierung des Elements detektiert wird.
Wenn der Analyt oder Ligand ein makromolekulares Antigen ist, kann das Immunoassay-Element, das in der Beschreibung der japanischen Patentschrift Nr. 2576913-B2 beschrieben wird, verwendet werden.
Diese bekannten Elemente besitzen zwei Komponenten, entweder in der gleichen Schicht oder in unterschiedlicher.
Schichten:
(A) Ein wasserunlösliches Hochpolymer-Substrat; und
(B) ein Konjugat aus einem Antikörper mit dem makromolekularen Antigen und ein Enzym für das Substrat.
Ähnlich enthält das Immunoassay-Element, das in der Beschreibung der japanischen Patentschrift Nr. 2576910-B2 (USP 5 569 589) beschrieben wird, eine Reagensschicht, die ein Fragmentierungsenzym für die weitere Fragmentierung des Zersetzungsproduktes durch die Einwirkung des Markierungssystems enthält, so dass das fragmentierte Produkt mit niedrigem Molekulargewicht unter Verbesserung der Empfindlichkeit detektiert wird.
Ein Immunoassay-Element für die quantitative Analyse eines Liganden durch Bestimmung einer Änderung in der enzymatischen Aktivität wird ebenfalls in der EP-0 503 459-A2 beschrieben. Wenn der Ligand ein Antigen mit niedrigem Molekulargewicht ist, werden kompetitive Reaktionen zwischen dem Ligand, dem enzymmarkierten Antikörper und dem Konjugat aus dem Antigen und einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht ausgenutzt. Wenn der Ligand ein makromolekulares Antigen ist, wird eine Reaktion zwischen dem Liganden und einem enzymmarkierten Antikörper direkt verwendet. Das Immunoassay-Element umfasst eine Substratschicht, enthaltend ein nichtdiffundierbares Substrat, das ein diffundierbares Material in Anwesenheit des Enzyms bildet, und eine Reagensschicht für die Detektion des so gebildeten diffundierbaren Materials. Das nichtdiffundierbare Substrat ist aus einem pulverisierten, unlöslichen Polysaccharid zusammengesetzt. Die Reagensschicht kann weiter ein Fragmentierungsenzym für die weitere Fragmentierung des nichtdiffundierbaren Materials enthalten. Ebenfalls beschrieben werden Verfahren zur quantitativen Analyse, sowohl von Antigenen mit niedrigem Molekulargewicht, als auch von makromolekularen Antigenen, die in irgendwelchen Proben vorhanden sind, durch die Verwendung der erfindungsgemäß beschriebenen Immunoassay-Elemente.
Auf jeden Fall wird das nichtdiffundierbare Substrat nicht in die Reagensschicht wandern. Es wurde weiterhin angenommen, dass das Fragmentierungsenzym niemals rückwärts von der Reagensschicht in die Substratschicht, die über ihr liegt, wandert. Es war daher üblich, dass verneint wurde, dass die Substratspezifität eines nichtdiffundierbaren Substrats sehr wichtig ist, und dass daher irgendein nichtdiffundierbares Substrat ausgewählt werden kann, das sowohl mit dem Fragmentierungsenzym als auch mit dem Markierungsenzym reagieren kann.
Ein Assayelement, bei dem eine Probelösung angewendet wurde, erleidet jedoch eine Diffusion einer löslichen Komponente, wenn auch nur in geringem Ausmass, von der unteren Reagensschicht zu der oberen Substratschicht. Die genannten Erfinder haben diese Diffusion untersucht und gefunden, dass eine sehr geringe Menge des Fragmentierungsenzyms von der Reagensschicht in die Substratschicht auf der Stromaufwärtsseite wandert und mit dem nichtdiffundierbaren Substrat unter Bildung eines Produkts mit niedrigem Molekulargewicht reagiert, und dass dieses Produkt selbst ein Geräusch verursacht, das es kaum verdient, ignoriert zu werden. In der Vergangenheit hatte ein solches Geräusch die Möglichkeit, die Genauigkeit des Assays zu verschlechtern.
Das makromolekulare Substrat, das als nichtdiffundierbares Substrat in der Substratschicht zurückgehalten wird, enthält ein Substrat mit niedrigem Polymerisationsgrad oder ein Substrat mit ungeeignetem kleinen Teilchendurchmesser als Fremdkomponente oder Verunreinigungen in geringer Menge. Einiges von diesem makromolekularen Substrat wandert als Folge des Fortschreitens der Zufuhr der Probenlösung unvermeidlich von der oberen Substratschicht in die untere Reagensschicht. Das makromolekulare Substrat, das in winziger Menge gewandert ist, reagiert mit dem Fragmentierungsenzym in der Reagensschicht, und das Produkt dieser Reaktion kann ebenfalls eine Ursache für ein Geräusch sein.
Die genannten Erfinder haben deshalb ein Immunoassay- Element hergestellt, indem sie ein nichtdiffundierbares Substrat verwenden, wobei ein solches Substrat nur mit dem Markierungsenzym reagiert und eine Reaktion mit dem Fragmentierungsenzym vermieden wird, und sie haben dann das Immunoassay-Element untersucht, um dessen Qualität zu bestimmen, und gefunden, dass dieses Immunoassay-Element den bekannten Immunoassay-Elementen überlegen ist, nicht nur in der Empfindlichkeit, sondern ebenfalls in der Reproduzierbarkeit und der Alterungsbeständigkeit (Lagerungsstabilität).

AUFGABE UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wurde aufgrund der Basis dieser Kenntnis gemacht, und ihr liegt die Aufgabe zugrunde, ein Immunoassay-Element zur Verfügung zu stellen, das eine hochempfindliche Analyse eines Analyten mit der höchstmöglichen Genauigkeit und Reproduzierbarkeit ermöglicht, und das eine lange Lagerungsstabilität aufweist.
Die oben genannte Aufgabe wird durch ein Immunoassay- Element für die quantitative Analyse eines Antigens durch Bestimmung der Änderung in der enzymatischen Aktivität gelöst, die verursacht wird durch irgendeine
1) Reaktion zwischen dem Antigen und einem enzymmarkierten Antikörper;
2) Reaktion zwischen dem Antigen, einem Antikörper und einem enzymmarkierten Antigen; und
3) Reaktion zwischen dem Antigen, einem enzymmarkierten Antikörper und einem Konjugat des Antikörpers mit einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht, mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als 50.000 Dalton;
wobei das Element eine Substratschicht, enthaltend ein nichtdiffundierbares Substrat, das ein diffundierbares Material in Anwesenheit des Markierungsenzyms bildet, und eine Reagensschicht, enthaltend ein Fragmentierungsenzym zur weiteren Fragmentierung des diffundierbaren Materials in ein Produkt mit niedrigem Molekulargewicht, umfasst, und dadurch gekennzeichnet ist:
dass das Markierungsenzym eine α-Amylase ist, das Fragmentierungsenzym Glucoamylase oder α-Glucosidase ist und das nichtdiffundierbare Substrat carboxylmethylierte Stärke ist, die vorab beschränkt mit einer exo-aktiven Glucosidase von der Stelle der nichtreduzierten terminalen Glucose bis zur Stelle der carboxylmethylmodifizierten Glucoseeinheit oder der Glucose-Kettenverzweigungsstelle abgebaut wurde, so dass das nichtdiffundierbare Substrat nur mit dem Markierungsenzym reagiert und eine Reaktion mit dem Fragmentierungsenzym vermieden wird.
Wenn der Gegenstand für den Assay ein Antikörper ist, wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die oben erwähnt wurde, gelöst durch ein Immunoassay-Element für die quantitative Analyse eines Antikörpers durch Bestimmung der Änderung in der enzymatischen Aktivität, verursacht durch Reaktion zwischen dem Antikörper und einem enzymmarkierten Antigen oder eine Reaktion zwischen dem Antikörper, einem Antigen und einem enzymmarkierten Antikörper, wobei das Element eine Substratschicht, enthaltend ein nichtdiffundierbares Substrat, welches ein diffundierbares Material in Anwesenheit des Markierungsenzyms bildet, und eine Reagensschicht, enthaltend ein Fragmentierungsenzym für die weitere Fragmentierung des diffundierbaren Materials in ein Produkt mit niedrigerem Molekulargewicht, enthält:
dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsenzym α- Amylase ist, das Fragmentierungsenzym Glucoamylase oder α- Glucosidase ist und das nichtdiffundierbare Sabstrat carboxylmethylierte Stärke ist, die vorab beschränkt mit exo- aktiver Glucosidase von der Stelle der nichtreduzierenden terminalen Glucose bis zur Stelle der carboxylmethylmodifizierten Glucoseeinheit oder der Glucose-Kettenverzweigungsstelle abgebaut wurde, so dass das nichtdiffundierbare Substrat nur mit dem Markierungsenzym reagiert und eine Reaktion mit dem Fragmentierungsenzym vermieden wird.
Um spezifisch zu sein, wird in dem erfindungsgemäßen Immunoassay-Element ein Substrat, das nur mit dem Markierungsenzym eines Antigens (oder eines Antikörpers) reagieren kann und das mit dem Fragmentierungsenzym, das in der Reagensschicht enthalten ist, nicht reagieren kann, als nichtdiffundierbares Substrat, das in der Reagensschicht enthalten ist, verwendet. Als Ergebnis ist die Zersetzung des nichtdiffundierbaren Substrats durch das Fragmentierungsenzym null, und das Geräusch ist dementsprechend nicht vorhanden, selbst wenn das Fragmentierungsenzym aus der Reagensschicht in die Substratschicht an der Stromaufwärtsseite diffundiert, nachdem die Probenlösung durch Tüpfeln aufgebracht wurde. Selbst wenn das nichtdiffundierbare Substrat außerhalb ein nichtlösliches makromolekulares Substrat enthält, das nicht in der Substratschicht zurückgehalten wird, das aber in die Reagensschicht wandert wegen eines nichtgewollten niedrigen Polymerisationsgrads oder eines nichtgewollten kleinen Teilchendurchmessers, wird dieses unlösliche makromolekulare Substrat nicht mit dem Fragmentierungsenzym in der Reagensschicht reagieren. Die Verwendung dieses nichtdiffundierbaren Substrats ergibt eine Verbesserung der Analysen hinsichtlich der Reproduzierbarkeit und der Lagerungsstabilität des Elements.
Als endo-aktive Glucosidase wird ein Markierungsenzym eines Antigens oder eines Antikörpers verwendet, und eine exo-aktive Glucosidase wird als Fragmentierungsenzym in der Reagensschicht verwendet, das nichtdiffundierbare Substrat in der Substratschicht ist ein selektiv reaktives Substrat des Endo-Typs, was bedeutet, ein Substrat mit einer Reaktivität spezifisch für endo-aktive Glucosidase.
Das selektiv reaktive Substrat des Endo-Typs ist carboxylmethylierte Stärke, die der begrenzten Zersetzung mit einer exo-aktiven Glucosidase von der Stelle der nichtreduzierenden terminalen Glucose bis zur Stelle der carboxylmethylierten Glucoseeinheit unterworfen wurde. Unter Verwendung der beschränkt zersetzten carboxylmethylierten Stärke ist es möglich, die Reaktivität mit dem Markierungsenzym weiter zu erhöhen und die Empfindlichkeit des Assays zu verbessern.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Darstellung der Hauptschichtstruktur gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Immunoassay- Elements.
Fig. 2 ist eine Darstellung einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform des Immunoassay-Elements.
Fig. 3 ist eine Darstellung einer noch anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform des Immunoassay-Elements.
Fig. 4 ist ein Diagramm, in dem die Ergebnisse von Beispiel 4 dargestellt sind, d. h. ein Diagramm, wo die Änderungen im Verlauf der Zeit, ausgedrückt durch die optische Dichte, dargestellt sind, wenn eine Pufferlösung, die kein Markierungsenzym enthält, zugeführt wurde, indem auf das Immunoassay-Element auf einem Objektträger 1 (Arbeitsbeispiel) und auf einem Objektträger 2 (Vergleichsbeispiel) aufgetüpfelt wurde.
Fig. 5 ist ein Diagramm, in dem die Ergebnisse von Beispiel 4 dargestellt sind, d. h. ein Diagramm, wo die Eichkurven des Immunoassay-Elements des Objektträgers 1 (Arbeitsbeispiel) und des Objektträgers 2 (Vergleichsbeispiel) dargestellt sind.
Fig. 6 ist ein Diagramm, wo die Ergebnisse von Beispiel 6 dargestellt sind, d. h. ein Diagramm, wo die Eichkurven von dem Immunoassay-Element der CRP-Analyse dargestellt sind, wobei der Objektträger 3 das Arbeitsbeispiel und der Objektträger 4 das Vergleichsbeispiel sind.
Fig. 7 ist ein Diagramm, wo die Ergebnisse von Beispiel 12 dargestellt sind, d. h. die graphische Darstellung, die die Reaktivität von α-Amylase zu glucoamylasebehandelter CM- Stärke, erhalten gemäß Beispiel 9, und nichtglucoamylasebehandelter CM-Stärke (Vergleichsbeispiel) in einer Lösung (Dispersionssystem) erläutert; und
Fig. 8 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse von Beispiel 14 erläutert, d. h. die graphische Darstellung, die die Änderung im Zeitverlauf der optischen Dichte zeigt, erhalten nachdem eine CRP-Lösung mit unterschiedlicher Konzentration auf einen Objektträger 5, hergestellt gemäß Beispiel 13, und einen Objektträger 6 (Vergleichsbeispiel) aufgetüpfelt wurde.

BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Schichtkonstruktion des Immunoassay-Elements:

Fig. 1 zeigt eine erfindungsgemäße Ausführungsform des Immunoassay-Elements. In dieser Zeichnung bedeutet das Bezugszeichen 10 einen transparenten Träger, auf den eine Reagensschicht 12 und eine Substratschicht 14 laminiert sind.
Die Substratschicht 14 besteht aus einem wasserpermeablen Material zusammengesetzt und enthält ein nichtdiffundierbares Substrat für das Markierungsenzym, das ein Konjugat mit dem Antikörper oder dem Antigen bildet.
Die Reagensschicht 12 besteht aus einem wasserpermeablen Material und enthält eine Reagenszusammensetzung für die Detektion des diffundierbaren Materials, das aus der Substratschicht diffundiert oder gewandert ist. Die Reagensschicht 12 enthält weiter ein Fragmentierungsenzym für die weitere Fragmentierung des diffundierbaren Materials in ein Produkt mit niedrigerem Molekulargewicht, so dass die Reagenszusammensetzung das so gebildete Produkt mit niedrigerem Molekulargewicht nachweist.
Das Hauptstrukturelement des erfindungsgemäßen Immunoassay-Elements, wie es in dem vorherigen Absatz beschrieben wurde, ist identisch, unabhängig davon, ob der Analyt ein Antigen mit niedrigem Molekulargewicht oder ein Antigen mit hohem Molekulargewicht ist. Wenn jedoch der Analyt ein Antigen mit niedrigem Molekulargewicht ist, wird das Gemisch auf die Substratschicht 14 getüpfelt oder auf andere Weise zugeführt, wobei das Gemisch das Reaktionsprodukt aus einem Antigen mit niedrigem Molekulargewicht in der Probe mit einem enzymmarkierten Antikörper und das polymerisierte Antigen (d. h. das vernetzte Produkt des Antigens, und der Verbindung mit hohem Molekulargewicht) enthält. Oder das Analyt-Antigen wird mit dem Antikörper und dem enzymmarkierten Antigen vermischt, um eine Konkurrenzreaktion zu verursachen, und das entstehende Reaktionsgemisch wird auf die Substratschicht getüpfelt oder aufgebracht, um die Analyse durchzuführen. In jedem Fall erhöht sich die Menge an gebildetem diffundierbaren Material, wenn die Menge oder der Gehalt an Liganden (Antigen mit niedrigem Molekulargewicht) groß oder hoch ist.
Wenn andererseits der Analyt ein Antigen mit hohem Molekulargewicht oder ein makromolekulares Antigen ist, erfolgt die Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion nur zwischen dem Analyt und dem enzymmarkierten Antikörper, und das Reaktionsgemisch wird auf die Substratschicht 14 aufgetüpfelt oder in anderer Weise zugeführt angewendet. In diesem Fall nimmt die Menge an gebildetem diffundierbaren Material ab, wenn die Menge an Liganden (makromolekulares Antigen) groß ist.
Wenn der Analyt ein Antikörper ist, erfolgt der Assay durch Auftüpfeln oder Zuführen auf die Substratschicht 14 einer gemischten Lösung, die durch Mischen des Analyt- Antikörpers mit einem enzymmarkierten Antigen erhalten wird, und wo beide dann miteinander reagieren können. In diesem Fall nimmt die Menge an diffundierbarem Material, die gebildet wird, ab, wenn die Menge an Analyt-Antikörper groß oder hoch ist. Der Assay erfolgt sonst durch Tüpfeln oder Zuführen einer gemischten Lösung, die durch Mischen des Analyt-Antikörpers mit dem Antigen mit einem enzymmarkierten Antikörper erhalten wird, auf die Substratschicht 14, und wobei diese dann eine Konkurrenzreaktion eingehen können. In diesem Fall nimmt die Menge an gebildetem diffundierbaren Material in dem Verhältnis zu, in dem sich die Menge an verwendetem Analyt-Antikörper erhöht.

Analyt (Substanz, die analysiert werden soll)

Die Substanz, die gemäß der vorliegenden Erfindung analysiert werden soll (im Folgenden einfach als "Analyt" bezeichnet), ist ein Antigen oder ein Antikörper. Das Antigen ist ein Ligand mit antigenen Determinanten und in der Probe enthalten.
Die Probe, die den Analyt enthält, ist nicht beschränkt, und viele Arten von Proben können erfindungsgemäß analysiert werden, wobei die typischen Beispiele Blut (Vollblut, Blutplasma, Blutserum), Lymphflüssigkeit und Urin umfassen. Es ist bevorzugt, suspendierte Teilchen, wie Blutzellen, auszuschließen, wenn solche Teilchen vorhanden sind. Jedoch kann eine Probe direkt auf das erfindungsgemäße Analysenelement aufgetüpfelt werden, ohne dass solche suspendierten Teilchen ausgeschlossen werden, wenn das Analysenelement eine Filterschicht gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält.
Irgendwelche Liganden, einschließlich solcher Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht bis zu Substanzen mit hohem Molekulargewicht, können unter Verwendung des erfindungsgemäßen Analysenelements analysiert werden, soweit jeder Ligand als Antigen wirkt und ein Antikörper dafür bereitgestellt werden kann. Der Ausdruck "Ligand mit Antigenizität" bedeutet, dass er mit dem entsprechenden Antikörper reagieren kann, und dass der Ligand nur ein Epitop besitzen muss. Selbst ein Ligand, dem selbst die Immunogenizität fehlt, kann als Ligand, der erfindungsgemäß analysiert werden soll, dienen, solange er bei der Immunisierung einen Antikörper wie Hapten bilden kann.
Beispiele von Antigenen mit niedrigem Molekulargewicht umfassen Arzneimittel, wie Digoxin, Theophyllin, Phenobabital, Phenytoin, Penicillin, Amikacin, Derivate dieser Arzneimittel (beispielsweise komplexe Arzneimittel mit lebenden Komponenten, wie Proteinen), Prostaglandin und Hormone, wie Testosteron, Progesteron und Thyroxin.
Beispiele von Antigenen mit makromolekularem Gewicht umfassen Hormone, die aus verschiedenen endokrinen Drüsen abgeschieden werden, Plasmaproteine, wie Immunglobulin, Albumin, Ferritin, HCG (humanes Choriongonadotropin) und C-reaktive Proteine (im Folgenden als CRP bezeichnet), Viren, wie HB-Antigen, Bakterien und Antigene, die in den verschiedenen Organen, Blut und Urin vorhanden sind, wie als Protein und α-Phetoprotein, und carcinoembryones Antigen (CEA).
Wenn der Ligand, der analysiert werden soll, ein Antigen mit hohem Molekulargewicht ist, so dass der Ligand bei der Markierung mit einem Enzym eine störende inhibierende Wirkung auf die enzymatische Aktivität des Markierungsenzyms ausübt, reicht es aus, andere niedrigmolekulare Substanzen mit einem Epitop, das dem des Liganden entspricht, auszuwählen und das Konjugat aus einer solchen Substanz und dem Markierungsenzym als enzymmarkiertes Antigen zu verwenden, wie es im Folgenden näher erläutert wird. Der Ausdruck "enzymmarkiertes Antigen", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Konzept, das nicht nur das, was durch Markierung des Liganden (Analyt-Antigen) mit einem Enzym umfasst wird, sondern ebenfalls auch das, das durch Markierung einer Substanz mit einem Enzym erhalten wird, wobei die Substanz ein Epitop aufweist, das mit dem des Liganden gleich ist. Es können nicht nur solche Verbindungen, wie Ligandenderivate, die hinsichtlich der chemischen Struktur analog sind, sondern ebenfalls solche Verbindungen, die sich in ihrer Immunantwort ähnlich verhalten wie die Liganden, an einen Antikörper mit einem Enzym markiert werden und als enzymmarkiertes Antigen verwendet werden.
Die Hochpolymer-Antigene, auf die innerhalb der Beschreibung Bezug genommen wird, umfassen Antigene, die je ein hohes Molekulargewicht zeigen und eine störende (unterdrückende) Wirkung auf die Enzymaktivität des Markierungsenzyms besitzen, beispielsweise mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als 20.000 Dalton, bevorzugt nicht weniger als etwa 50.000 Dalton. Andererseits bedeuten Antigen mit niedrigem Molekulargewicht innerhalb der Beschreibung Antigene, die je ein Molekulargewicht besitzen, das niedrig genug ist, um die Enzymaktivität des enzymmarkierten Antikörpers zu beeinflussen, beispielsweise mit einem Molekulargewicht von weniger als 20.000 Dalton. Es soll jedoch bemerkt werden, dass der zuvor erwähnte spezifische numerische Wert eine beliebige Teillinie ist, und dass die Beurteilung der Erkennung, ob ein Ligand ein Antigen mit niedrigem Molekulargewicht oder ein Antigen mit hohem Molekulargewicht ist, unter Beachtung des Systems erfolgen sollte, ob die Konkurrenzreaktion zwischen dem spezifischen Analyt-Antigen und einem bestimmten gebundenen Produkt aus Hochpolymer-Verbindung (polymerisiertem Antigen) verwendet wird oder nicht.

Polymerisiertes Antigen

Das polymerisierte Antigen, d. h. das gebundene Produkt des Liganden und eines großen Moleküls oder einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht, wird an den Antikörper gebunden, um die Aktivität des Enzyms zu unterdrücken, das mit dem Antikörper konjugiert ist, um das Letztere zu markieren. Das polymerisierte Antigen wird verwendet, wenn der Analyt ein Antigen mit niedrigem Molekulargewicht ist, und es wird nicht verwendet, wenn der Analyt ein Antigen mit hohem Molekulargewicht ist.
Es ist bevorzugt, dass die verwendete Verbindung mit hohem Molekulargewicht wasserlöslich ist und ein Molekulargewicht von nicht weniger als 50.000 Dalton besitzt. Beispiele verwendbarer Verbindungen mit hohem Molekulargewicht sind Proteine, wie Gelatine, Hemocyanin und Ferritin, und Polyethylenglykol. Es reicht aus, dass diese Verbindungen die zuvor erwähnten Bedingungen erfüllen, wenn sie an die Liganden gebunden sind, und solche mit relativ niedrigem Molekulargewicht, wie Rinderserumalbumin, können verwendet werden, indem sie beispielsweise durch Autopolymerisation polymerisiert werden.
Das Verfahren zum Binden des Liganden an die Verbindung mit hohem Molekulargewicht kann unter Beachtung der funktionellen Gruppen beider Reaktionsteilnehmer ausgewählt werden. Verwendbare funktionelle Gruppen umfassen beispielsweise Amino, Carboxyl, Hydroxyl, Thiol, Imidazol und Phenyl. Beispielsweise können die Aminogruppen aneinander durch eine Reihe bekannter Verfahren, wie dem Isocyanatverfahren, dem Glutaraldehydverfahren, dem Difluorbenzolverfahren und dem Benzochinonverfahren, gebunden werden. Eine Aminogruppe kann an eine Carboxylgruppe gemäß einem Verfahren gebunden werden, bei dem die Carboxylgruppe in einen Succinylimidester umgewandelt wird oder gemäß anderer Verfahren, die das Carbodiimidverfahren, das Woodward- Reagensverfahren und das Periodsäureoxidationsverfahren (Nakane-Verfahren), bei dem die Aminogruppe an eine Zuckerkette gebunden wird, umfassen. Wenn die Thiolgruppe verwendet wird, wird eine der Carboxylgruppen in einen Succinylimidester überführt, der mit Cystein zur Einführung einer Thiolgruppe umgesetzt wird, und dann werden beide Gruppen aneinander unter Verwendung des bifunktionellen Verbindungsreagens, welches mit der Thiolgruppe reagiert, gebunden. Die Verfahren, bei denen die Phenylgruppe ausgenutzt wird, umfassen das Diazotierungsverfahren und das Alkylierungsverfahren. Das Bindungsverfahren ist nicht auf die zuvor erwähnten Verfahren beschränkt und kann ausgewählt werden unter den Verfahren, die beschrieben werden in "Method in Immunology and Immunochemistry", Bd. 1 (C. A. Williams, M. W. Chase, Academic Press (1967)) oder "KOSO MEN'EKI SOKUTEI-HO" (Enzyme Immunoassay), herausgegeben von Ishikawa, Kawai und Miyai, Igaku Shoin, 1978. Der Ligand kann an die Verbindung mit hohem Molekulargewicht in irgendeinem gewünschten Verhältnis gebunden sein. Nach Beendigung der Bindungsreaktion wird das Reaktionsprodukt durch Gelfiltration oder durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt, und es kann, wenn gewünscht, gemäß einem Lyophilisierungsverfahren getrocknet werden.
Der Ligand kann per se polymerisiert werden, wobei ein polymerisiertes Antigen erhalten wird. Die Polymerisation des Liganden kann auf ähnliche Weise wie bei den zuvor erwähnten Verbindungsverfahren erfolgen. Beispielsweise kann der Ligand unter Verwendung eines bifunktionellen Vernetzungsmittels, wie Carbodiimid oder Glutaraldehyd, polymerisiert werden.
Anstelle des Liganden kann die Verbindung mit hohem Molekulargewicht an ein Derivat des Liganden mit immunologischer Kreuzreaktivität zu dem entsprechenden Antikörper für den Liganden gebunden werden. Die Derivate des Liganden umfassen nicht nur solche, die analoge chemische Strukturen besitzen, sondern ebenfalls solche, die analoge Verhalten in ihren immunologischen Reaktivitäten aufweisen. Wenn beispielsweise ein Antikörper gegen Theophyllin als Ligand mit Coffein immunologisch kreuzreagiert, können Derivate des Coffeins ebenfalls als Materialien zur Bildung des polymerisierten Antigens verwendet werden.
Wenn der Ligand oder das Derivat davon keine geeignete funktionelle Gruppe enthält, die an die Verbindung mit hohem Molekulargewicht gebunden werden kann, kann eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Thiolgruppe in den Liganden oder das Derivat davon eingeführt werden. Eine solche Gruppe kann über einen Abstandshalter eingeführt werden, um die Bindung davon mit einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht zu erleichtern. Wenn beispielsweise der Ligand Theophyllin ist, kann eine Carboxylgruppe eingeführt werden, um 8-Propylcarboxyltheophyllin zu erhalten, das an die Verbindung mit hohem Molekulargewicht gebunden wird.

Antikörper

Antikörper werden in dem Assaysystem verwendet, bei dem die Probe, die das Analyt-Antigen enthält, mit dem Antikörper und dem enzymmarkierten Antigen unter Bildung einer Konkurrenzreaktion vermischt wird. Ein spezifischer Antikörper gegen den Liganden, der ein Analyt ist, wird für ein solches Assaysystem verwendet. Wenn ein Derivat des Liganden zur Herstellung des enzymmarkierten Antigens verwendet wird, wird ein Antikörper, der mit der antigenen Determinante, die mit dem Liganden und dem Derivat davon gemeinsam ist, reagiert, verwendet. Der Antikörper kann ein polyklonaler Antikörper, erhalten nach einem üblichen Verfahren, sein, zur Verbesserung der Empfindlichkeit wird jedoch bevorzugt ein monoklonaler Antikörper verwendet. Der Antikörper kann ein Proteinfragment, wie F(ab')&sub2;, Fab' oder Fab, sein.

Enzymmarkiertes Antigen

Das enzymmarkierte Antigen wird verwendet, wenn eine Probe, die ein Analyt-Antigen enthält, mit einem Antigen und einem enzymmarkierten Antigen vermischt wird und sie eine Konkurrenzreaktion eingehen sollen. Es wird auch verwendet, wenn die Probe, die den Analyt-Antikörper enthält, mit dem enzymmarkierten Antigen vermischt wird und sie eine Bindungsreaktion eingehen können und die Menge des Antigens auf der Grundlage der Änderung der Aktivität des Markierungsenzyms bestimmt wird.
Wenn der Analyt ein Antigen (Ligand) ist, ist das enzymmarkierte Antigen das Bindungsprodukt des Liganden (oder einer ligandenähnlichen Substanz, die ein Epitop mit dem Liganden teilt) mit einem Enzym. Wenn der Ligand eine Substanz mit einem solch niedrigen Molekulargewicht wie ein Arzneimittel ist, kann er direkt an das Enzym gebunden werden. Wenn der Ligand eine Substanz mit großem Molekulargewicht wie ein Protein ist, der, wenn er in nichtmodifizierter Form an das Enzym gebunden ist, enzymatische Aktivität stört, kann das Protein fragmentiert werden, und ein Fragment davon kann als Substanz, markiert mit einem Enzym, verwendet werden.
Das so fragmentierte Protein, das als Folge ein niedrigeres Molekulargewicht annehmen kann, muss nur ein Epitop mit dem intakten Protein teilen (nämlich den Liganden).
Der Ligand und das Enzym können nach dem gleichen Verfahren, wie es zur Bindung zwischen dem Antigen (Liganden) und der Verbindung mit hohem Molekulargewicht verwendet wurde, wie oben erwähnt, konjugiert werden.
Anstelle des Liganden kann das Enzym an ein Derivat des Liganden, der immunologische Kreuzreaktivität zu dem entsprechenden Antikörper für den Liganden hat, gebunden werden. Die Derivate des Liganden umfassen nicht nur solche mit einer analogen chemischen Struktur, sondern ebenfalls solche, die ein analoges Verhalten in ihren immunologischen Reaktivitäten zeigen. Wenn beispielsweise ein Antikörper gegen Theophyllin als Ligand immunologisch mit Coffein kreuzreagiert, können Derivate des Coffeins ebenfalls als Materialien zur Bildung des enzymmarkierten Antigens verwendet werden.
Wenn der Ligand oder ein Derivat davon keine geeignete funktionelle Gruppe enthält, die an das Enzym gebunden werden kann, kann eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Thiolgruppe in den Liganden oder das Derivat davon eingeführt werden. Eine solche Gruppe kann über einen Abstandshalter (bzw. Spacer) zur Erleichterung der Bindung an das Enzym eingeführt werden. Wenn beispielsweise der Ligand Theophillin ist, kann eine Carboxylgruppe eingeführt werden, um 8-Propylcarboxyltheophyllin zu erhalten, das an das Antigen gebunden wird.

Enzymmarkierte Antikörper

Der enzymmarkierte Antikörper wird verwendet, wenn eine gegebene Probe, die einen Antikörper enthält, als Analyt mit einem Antigen und einem enzymmarkierten Antikörper vermischt wird und sie eine Konkurrenzreaktion eingehen sollen. Er wird auch verwendet, wenn die Probe, die das Antigen als Analyt enthält, mit dem enzymmarkierten Antikörper vermischt wird und sie eine Bindungsreaktion eingehen können und die Menge an Antigen auf der Grundlage der Änderung der Aktivität des Markierungsenzyms bestimmt wird. Wenn das Analyt-Antigen eine Substanz mit niedrigem Molekulargewicht ist, wird der enzymmarkierte Antikörper verwendet, um eine Konkurrenzreaktion des Antigens, das in der Probe enthalten ist, mit einem polymerisierten Antigen und dem enzymmarkierten Antikörper einzugehen.
In dem Reaktionssystem, in dem die Konkurrenzreaktion zwischen dem Analyt-Antikörper, dem Antigen und dem enzymmarkierten Antikörper stattfindet, muss der Antikörper, der mit dem Enzym markiert werden soll, das Epitop des Antigens erkennen und damit reagieren können, welches das gleiche sein sollte, wie das Epitop, das durch den Analyt- Antikörper erkannt wird.
In dem Reaktionssystem, in dem die Konkurrenzreaktion zwischen dem Analyt-Antigen, dem polymerisierten Antigen und dem enzymmarkierten Antikörper ablaufen soll, muss der Antikörper, der mit dem Enzym markiert werden soll, mit einem Epitop reagieren können, das dem Antigen und dem polymerisierten Antigen gemeinsam ist.
Der Antikörper und das Enzym können gemäß dem gleichen Verfahren, wie es zur Bindung zwischen dem Antikörper (Ligand) und der makromolekularen Substanz, wie oben erwähnt, verwendet wurde, konjugiert werden.

Markierungsenzym, nichtdiffundierbares Substrat und Fragmentierungsenzym

Das Enzym, das an das Antigen oder den Antikörper als Markierung gebunden ist, zersetzt das nichtdiffundierbare hochpolymere Substrat unter Bildung eines diffundierbaren Produktes, welches zu einem Produkt mit noch niedrigerem Molekulargewicht (beispielsweise Glucose) durch die Einwirkung des Fragmentierungsenzyms fragmentiert werden kann.
Das nichtdiffundierbare Substrat ist nicht die wässrige Probenflüssigkeit dispergierbar und diffundiert oder migriert nicht in die Reagensschicht 12.
Das Fragmentierungsenzym ist in der Reaktionsschicht 12 enthalten und wandelt das diffundierbare Produkt, gebildet aus dem nichtdiffundierbaren Substrat, durch den Einfluss des Markierungsenzyms, das an das Antigen oder den Antikörper gebunden ist, um, unter Bildung eines Produkts mit niedrigem Molekulargewicht, das nachgewiesen werden kann.
Eine geeignete Kombination aus Enzym und Substrat kann so ausgewählt werden, dass das Enzym auf das nichtdiffundierbare Substrat unter Bildung einer diffundierbaren Substanz wirkt, die weiter durch das Fragmentierungsenzym zersetzt wird, wobei ein Produkt mit niedrigem Molekulargewicht gebildet wird, das leicht nachgewiesen werden kann.

Markierungsenzym

Das Markierungsenzym ist α-Amylase.

Es ist bevorzugt, dass das Enzym nicht durch irgendeinen. Behinderungsfaktor, der in der Probe vorhanden ist, beeinflusst wird, und dass kein Konkurrenzenzym der gleichen Art in der Probe vorhanden ist. Wenn jedoch ein Enzym, das gleich ist wie das Markierungsenzym, in der Probe vorhanden ist, kann ein Enzyminhibitor verwendet werden. Der Enzyminhibitor kann einer sein, der das Enzym in der Probe in größerem Ausmaß inhibiert als er die Aktivität gegenüber dem Markierungsenzym inhibiert. Es ist am meisten bevorzugt, dass der Enzyminhibitor das Enzym in der Probe vollständig inaktiviert und das Markierungsenzym nicht desaktiviert. Bei der praktischen Verwendung reicht es jedoch aus, dass der Blindwert bei der Bestimmungsstufe nicht erhöht wird, und dass der Enzyminhibitor inaktiviert wird und die Aktivität des Enzyms in der Probe nach Beendigung der Bestimmung wieder hergestellt wird. Es reicht ebenfalls aus, wenn der Enzyminhibitor das Enzym in dem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper nicht inhibiert, sondern die Aktivität des freien Enzyms inhibieren kann. Der Enzyminhibitor kann aus bekannten Enzyminhibitoren ausgewählt werden, so dass das ausgewählte Enzym die spezifischen Eigenschaften, wie zuvor erwähnt, besitzt. Andererseits kann ein Antikörper gegen das Enzym, das in der Probe vorhanden ist und ein Problem verursacht, hergestellt werden und als Enzyminhibitor verwendet werden.

Nichtdiffundierbares Substrat

Das Substrat für die α-Amylase ist carboxymethylierte Stärke (im Folgenden auch als "CM-Stärke" bezeichnet).

Es ist vorgesehen, dass bei der vorliegenden Erfindung als nichtdiffundierbares Substrat ein Substrat verwendet wird, das nur mit dem Markierungsenzym des Antigens (oder Antikörpers) reagiert, und das eine Reaktion mit dem Fragmentierungsenzym, das in der Reagensschicht enthalten ist, vermeidet. Als Ergebnis ist die Zersetzung des nichtdiffundierbaren Substrats durch das Fragmentierungsenzym null, und das Geräusch ist folglich gedämpft, selbst wenn das Fragmentierungsenzym von der unteren Reagensschicht in die obere Substratschicht diffundiert, nachdem die Probenlösung aufgetüpfelt wurde. Selbst wenn das nichtdiffundierbare Substrat extern ein solches unlösliches makromoleulares Substrat enthält, das nicht in der Substratschicht zurückgehalten wird, sondern in die Reagensschicht migriert, bedingt durch einen unerwartet niedrigen Polymerisationsgrad oder einen unerwarteten kleinen Teilchendurchmesser, wird dieses unlösliche makromolekulare Substrat nicht mit dem Fragmentierungsenzym in der Reagensschicht reagieren.
Wenn eine α-Amylase als Enzym des enzymmarkierten Antikörpers (oder Antigens) verwendet wird und eine Glucoamylase oder α-Glucosidase, die im Folgenden spezifisch beschrieben wird, als Fragmentierungsenzym verwendet wird, wird ein solches unlösliches Polysaccharid, wie Stärke, die die nichtreduzierende terminale Glucose daran, modifiziert mit einer Carboxylgruppe, enthält, verwendet. Obgleich dieses modifizierte Substrat ein Substrat für α-Amylase sein kann, ist es kein Substrat für Glucoamylase oder α- Glucosidase.
Die Modifizierungsgruppe der nichtreduzierenden terminalen Glucose ist eine nichtreaktive funktionelle Gruppe, die die Aktivität des Markierungsenzyms oder Fragmentierungsenzyms nicht beeinflussen kann. Sie ist eine hydrophile Modifizierungsgruppe, um die Reaktivität des Enzyms in dem trockenen Assayelement zu verbessern.
Wenn die nichtreduzierende terminale Glucose mit einer benachbarten Glucoseeinheit in einer Bindungsart, ausgenommen der α-1,4-Glucosidbindung (wie beispielsweise einer α- 1,6-Bindung oder einer α-1,3-Bindung), gebunden ist und an einer Stelle an der Verzweigung der Glucosekette vorhanden ist, kann das Polysaccharid, das eine solche nichtreduzierende terminale Glucose enthält, als nichtdiffundierbares Substrat bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Da eine solche exo-aktive Glucosidase, wie Glucoamylase, im Allgemeinen ein Enzym ist, das die α-1,4-Bindung oder α-1,6-Bindung des linearen Teils der Zuckerkette vom nichtreduzierenden Ende aus in eine Glucoseeinheit spaltet, ist sie nicht in der Lage, die Glucosidbindung an der Stelle der Verzweigung (nämlich die α-1,6-Bindung oder α- 1,3-Bindung) zu zersetzen. Sie ist daher unfähig, hydrolysiert zu werden, selbst wenn die nichtreduzierende terminale Glucose an der Stellung vorhanden ist, an der die nichtreduzierende terminale Glucose von der Zuckerkette verzweigt ist.
Die α-Amylase ist eine endo-aktive Glucosidase, die die α- 1,4-Glucosidbindung einer Zuckerkette mit nicht weniger als vier Glucoseeinheiten hydrolysiert, und kann daher innerhalb des Moleküls eines Substrats, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Modifizierung für die terminale Glucose oder der Anwesenheit oder Abwesenheit einer verzweigten Zuckerkette, hydrolysiert werden.
Durch beschränkte Zersetzung der carboxylmethylierten Stärke, die eine Carboxylmethylgruppe in die Glucoseeinheit eingearbeitet enthält, halbwegs längs der Zuckerkette von der nichtreduzierenden terminalen Glucosestelle bis zur Stelle der carboxylmethylmodifizierten Glucoseeinheit durch eine exo-aktive Glucosidase, ist es möglich, die Stärke in ein Substrat, das die nichtreduzierende terminale Glucose mit der Carboxylmethylgruppe modifiziert enthält, überzuführen. Als konkretes Beispiel für die exoaktive Glucosidase, die hier verwendet wird, können Glucoamylase und α-Glucosidase erwähnt werden.
Die carboxylmethylierte Stärke, die einen erhöhten Carboxylmethylierungsgrad durch beschränkten Abbau der terminalen Glucose, wie oben beschrieben, hat, besitzt, wenn sie in einem Trockenassayelement verwendet wird, und erhöhte Reaktivität mit einem solchen endo-aktiven Enzym, wie α- Amylase. Diese Tatsache ist eine neue Erkenntnis, die von den genannten Erfindern gewonnen wurde, wie es in den folgenden Arbeitsbeispielen erläutert wird. Der Grund, weshalb die enzymatische Aktivität des Markierungsenzyms gegenüber unlöslichem Polysaccharid, wie Stärke, durch Erhöhung des Carboxylmethylierungsgrades (der Anteil der Einarbeitung) erhöht wird, wurde nicht geklärt. Es wird jedoch angenommen, dass die Reaktivität des Substrats gegenüber dem Enzym aus dem folgenden Grund verbessert wird.
Die Carboxylmethylgruppe ist eine hydrophile Gruppe. Das Ansteigen des Verhältnisses der Einarbeitung dieser funktionellen Gruppe ermöglicht daher, dass das unlösliche Polysaccharid eine erhöhte Fähigkeit erlangt, zu hydratisieren und leicht in wässrigem Lösungsmittel benetzbar wird. Die Reaktion in einem Trockenassayelement wird bewirkt, indem eine Probenlösung in geringer Menge (im Allgemeinen nicht mehr als 100 ul) durch Tüpfeln aufgebracht wird; die Menge an Wasser, die zugeführt wird, ist extrem gering. Da das Wasser (Probenlösung), das zugeführt wird, in einer passenden Schicht ausgebreitet wird und auch unmittelbar in die benachbarten Schichten migriert (bzw. wandert), ist das Innere der passenden Schicht, welches das Gebiet der enzymatischen Reaktion bildet, eine Umgebung mit extrem beschränkter Wasserzufuhr. In der Schicht, die eine beschränkte Wasserzufuhr, wie oben erwähnt, besitzt, kann das Substrat nicht ausreichend quellen und mit dem Enzym ausreichend reagieren. Wenn der Quellgrad des Substrats erhöht wird, wenn auch nur geringfügig, ergibt die Umgebung bei solch starker Beschränkung nur eine mikroskopische Strukturänderung und legt die Reaktionsstelle des Substrats für das Enzym frei. Es wird angenommen, dass dies eine Verstärkung der Reaktivität des unlöslichen Polysaccharids mit dem Enzym-Trockenassayelement ergibt und seine Empfindlichkeit erhöht wird.
Wenn dagegen das Substrat mit einem Enzym in wässriger Lösung reagieren kann, kann das Substrat schon gut quellen, und dadurch wird die Reaktivität mit dem Enzym sichergestellt. Diese Situation kann logischerweise unter der Annahme erklärt werden, dass in einer Umgebung mit ausreichender Wasserzufuhr das Substrat ausreichend für die Reaktion quellen kann und dass die Reaktivität davon mit einem Enzym nicht weiter verstärkt wird, selbst wenn der Quellgrad mehr oder weniger durch die Erhöhung des Carboxylmethylierungsgrades des Substrats erhöht wird, und somit die Hydrophilizität davon verstärkt wird.

Fragmentierungsenzym

Das Fragmentierungsenzym kann ein Enzym der gleichen Art wie das Markierungsenzym sein. In einem solchen Fall ist es bevorzugt, dass das Markierungsenzym ein endo-aktives Enzym ist, welches das Molekül intramolekular unter Bildung eines Oligomeren fragmentiert, und dass das Fragmentierungsenzym exo-aktiv ist und am Ende des Moleküls unter Bildung eines Monomeren wirkt.
So wird, wenn das nichtdiffundierbare Substrat ein Polymer ist, ein Fragmentierungsenzym für die Zersetzung des diffundierbaren Oligomeren, gebildet durch Einwirkung des Markierungsenzyms auf das Monomere, verwendet. Das Fragmentierungsenzym ist Glucoamylase oder α-Glucosidase.

Nachweissystem für ein Produkt mit niedrigem Molekulargewicht

Das Produkt mit niedrigem Molekulargewicht, gebildet durch Fragmentierung in der Reagensschicht durch den Einfluss des Fragmentierungsenzyms, kann optisch unter Verwendung eines bekannten Nachweisreagens nachgewiesen werden.
Irgendwelche bekannten Verfahren können für den Nachweis der Endglucose verwendet werden, die durch Einwirkung des zuvor erwähnten Fragmentierungsenzyms gebildet wird. Beispiele umfassen:
(1) ein Verfahren, bei dem Wasserstoffperoxid, gebildet durch Oxidation von Glucose in Anwesenheit von Glucoseoxidase, nachgewiesen wird, beispielsweise
(1-1) das Verfahren, bei dem ein Trinder-Reagens verwendet wird, wie in Ann. Clin. Biochem., 6, 24 (1964) und J. Clin Pathol., 22, 246 (1969) beschrieben;
(1-2) das Verfahren, bei dem ein Trinder-Reagens beschrieben wird, wie in der nichtgeprüften japanischen Patentpublikation Nr. 50991/1974 (entsprechend USP 3 886 045), USP 3 992 158 und der nichtgeprüften japanischen Patentpublikation Nr. 164356/1980 (entsprechend USP 4 292 272) beschrieben;
(1-3) das Verfahren, bei dem ein Reagens verwendet wird, das einen triarylsubstituierten Imidazol-Leuko-Farbstoff enthält, wie in der nichtgeprüften japanischen Patentpublikation Nr. 26188/1978 (entsprechend USP 4 089 747) und der nichtgeprüften japanischen Patentpublikation Nr. 45557/1983 (Chemical Abstracts, 99, (1983): 209284j) beschrieben;
(1-4) das Verfahren, bei dem ein Reagens, das einen Imidazol-Leuko-Farbstoff, substituiert mit Diarylmonoalkyl, enthält, wie in den nichtgeprüften japanischen Patentpublikationen Nr. 193352/1984 (entsprechend EP 012264A) und
224677/1985 (entsprechend USP 4 665 023)) beschrieben; und (2) ein Verfahren, bei dem NADH in Anwesenheit von Glucosedehydrogenase gebildet wird und NAD nachgewiesen wird; und
(3) ein Verfahren, bei dem Glucose-6-phosphat, das in Anwesenheit von Hexokinase gebildet wird, nachgewiesen wird.
Unter diesen Nachweisverfahren ist das wegen seiner hohen Nachweisempfindlichkeit am meisten bevorzugte Verfahren das, bei dem Glucose in Anwesenheit von Glucoseoxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert wird, welches unter Verwendung von Peroxidase und einem Leuko-Farbstoff nachgewiesen wird.
Diese Nachweisreagentien können in der Reagensschicht 12 zusammen mit dem Fragmentierungsenzym vorhanden sein, oder sie können in einer anderen Schicht, die unterhalb der Reagensschicht 12 vorhanden ist (beispielsweise in einer zweiten Reagensschicht oder einer Nachweisschicht), vorhanden sein, um das gebildete Produkt mit niedrigem Molekulargewicht nachzuweisen. Wenn ein Leuko-Farbstoff verwendet wird, ist es im Hinblick auf die Stabilität des gebildeten Farbstoffs bevorzugt, dass der Farbstoff in dem hydrophilen Bindemittel in der Lösung in einem mit Wasser unmischbaren Lösungsmittel dispergiert ist.

Schichtstruktur des Analysenelements

Das erfindungsgemäße trockene Immunoassay-Element kann eine Schichtstruktur, ähnlich wie die der verschiedenen trockenen Analysenelemente, enthalten. Das Element kann eine mehrschichtige Konstruktion besitzen, die zusätzlich zu der Substratschicht und der Reagensschicht einen Träger, eine Ausbreitungsschicht, eine Nachweisschicht, eine Lichtabschirmschicht, eine Klebstoffschicht, eine Wasserabsorptionsschicht, eine Grundierungsschicht, usw., umfasst. Beispiele solcher Analysenelemente sind in den Beschreibungen der nichtgeprüften japanischen Patentpublikationen Nr. 53888/1974 (entsprechend USP Nr. 3 992 158), 40191/1976 (entsprechend USP Nr. 4 042 353), 164356/1980 (entsprechend USP Nr. 4 292 272) und 4959/1986 (entsprechend EP Nr. 0166365A) offenbart.
Wenn ein lichtdurchlässiger und wasserundurchlässiger Träger verwendet wird, kann ein trockenes Immunoassay-Element mit der folgenden Konstruktion verwendet werden, obgleich die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Konstruktionen beschränkt ist.
(1) Eine Reagensschicht, angeordnet auf einem Träger, und eine Substratschicht, die auf der Reagensschicht liegt;
(2) Eine Reagensschicht, angeordnet auf einem Träger, eine Klebstoffschicht auf der Reagensschicht und eine Substratschicht auf der Klebstoffschicht, in dieser Reihenfolge;
(3) Ein Träger und eine Nachweisschicht, eine Reagensschicht und eine Substratschicht, übereinanderliegend in dieser Reihenfolge.
(4) Ein Träger und eine Reagensschicht, eine Lichtabschirmschicht und eine Substratschicht, übereinander liegend in dieser Reihenfolge;
(5) Ein Träger und eine Nachweisschicht, eine Reagensschicht, eine Lichtabschirmschicht und eine Substratschicht, übereinanderliegend in dieser Reihenfolge;
(6) Ein Träger und eine Nachweisschicht, eine Lichtreflexionsschicht, eine Reagensschicht und eine Substratschicht, übereinanderliegend in dieser Reihenfolge;
(7) Ein Träger und eine zweite Reagensschicht, eine Lichtreflexionsschicht, eine erste Reagensschicht und eine Substratschicht, übereinanderliegend in dieser Reihenfolge; und
(8) Ein Träger und eine Nachweisschicht, eine zweite Reagensschicht, eine Lichreflexionsschicht, eine erste Reagensschicht und eine Substratschicht, übereinanderliegend in dieser Reihenfolge.
Bei den Konstruktionen (1) bis (6) kann die Reagensschicht aus einer Vielzahl von Schichten zusammengesetzt sein. Die Reagensschicht kann eine immunologische Reaktionsschicht sein, die eine Komponente enthält, die an der immunologischen Reaktion teilnimmt, wie im Folgenden näher erläutert wird.
Eine Wasserabsorptionsschicht kann zwischen dem Träger und der Reagens- oder Nachweisschicht angebracht sein. Filterschichten können zwischen benachbarten Schichten angebracht sein. Eine Ausbreitungsschicht kann auf der Substratschicht vorhanden sein, oder die Substratschicht kann als Ausspreitungsschicht dienen.

Substratschicht

Die Substratschicht 14 ist aus einer wasserpermeablen Schicht zusammengesetzt und enthält ein nichtdiffundierbares Substrat, welches ein Substrat für die Enzymmarkierung des Antikörpers ist.
Damit die Wasserpermeabilität der Substratschicht sichergestellt ist, ist es bevorzugt, dass die Substratschicht aus einem porösen Medium oder einer Schicht, zusammengesetzt aus einem hydrophilen Polymerbindemittel, besteht.
Die poröse Schicht kann fasrig oder nichtfasrig sein. Als fasriges Material kann Filterpapier, nichtgewebtes Tuch, gewebtes Tuch (beispielsweise einfach gewebtes Tuch), gestricktes beziehungsweise gewirktes Tuch (beispielsweise trikotgestricktes Tuch) oder Filterpapier, hergestellt aus Glasfasern, verwendet werden. Beispiele von nichtfaserförmigen Materialien umfassen Membranfilter, zusammengesetzt aus Celluloseacetat, wie in der nichtgeprüften japanischen. Patentpublikation Nr. 53888/1974 (entsprechend USP Nr. 3 992 258) beschrieben, und eine teilchenförmige Strukturschicht, enthaltend miteinander verbundene Poren, und zusammengesetzt aus anorganischen oder organischen feinen Teilchen, wie in den nichtgeprüften japanischen Patentpublikationen Nr. 53888/1974 (entsprechend USP 3 992 258) 90859/1980 (entsprechend USP Nr. 4 486 537) beschrieben. Eine laminierte Struktur, hergestellt aus teilweise gebundenen mehrfachen porösen Schichten, kann ebenfalls bevorzugt verwendet werden, Beispiele solcher Strukturen sind in den nichtgeprüften japanischen Patentpublikationen Nr. 4549/1986 (entsprechend EP 0166265A), 116258/1987 (Chemical Abstracts, 108, (1988): 3041y), 138756/1987 (EP 0226465A), 138757/1987 (EP 0226465A) und 138758/1987 (EP 0226465A) beschrieben.
Die poröse Schicht kann eine Ausbreitungsschicht mit einer sogenannten Dosierfunktion sein, wobei eine Flüssigkeit über einer Fläche im Wesentlichen proportional zu dem Volumen der Flüssigkeit, die zugefügt wird, ausgebreitet wird. Bevorzugte Materialien für die Ausbreitungsschicht sind gewebte und gestrickte beziehungsweise gewirkte Flächengebilde. Die gewebten Flächengebilde oder ähnliche können einer Glühentladungsbehandlung unterworfen werden, wie in der nichtgeprüften japanischen Patentpublikation Nr. 66359/1982 (entsprechend GB 2 087 974A und USP 4 783 315) beschrieben. Zur Einstellung der Fläche oder der Rate zum Ausbreiten kann die Ausbreitungsschicht ein hydrophiles Polymeres oder ein grenzflächenaktives Mittel, wie in den nichtgeprüften japanischen Patentpublikationen Nr. 222770/1985 (entsprechend EP 0162301A), 219397/1988 (entsprechend DE 37 17 913 A), 112999/1988 (entsprechend DE 37 17 913A) und 182652/1987 (entsprechend DE 37 17 913A) beschrieben, enthalten.
Ein zweckdienliches Verfahren ist ein Verfahren, bei dem das Substrat in eine poröse Membran imprägniert oder auf eine aufgetragen wird, wobei die Membran beispielsweise aus Papiergewebe oder einem Hochpolymeren besteht, und das Verbundmaterial auf eine andere wasserpermeable Schicht, beispielsweise eine Reagensschicht, die auf dem Träger liegt, aufgebracht wird, gemäß dem Verfahren, wie es in der nichtgeprüften japanischen Patentpublikation Nr. 164356/1980 (entsprechend USP 4 292 272) beschrieben wird. Ein weiteres Verfahren umfasst die Stufen der Bindung einer porösen Schicht auf eine andere wasserpermeable Schicht (beispielsweise eine Reagensschicht) gemäß einem Verfahren, wie oben beschrieben, und Beschichtung der porösen Schicht mit einer Zusammensetzung, die das Substrat enthält. Irgendwelche bekannten Verfahren können zur Imprägnierung oder Beschichtung der porösen Schicht verwendet werden. Die Beschichtung kann durchgeführt werden, indem ein geeignetes Verfahren ausgewählt wird, beispielsWeise eine Eintauchbeschichtung, eine Beschichtung mit einem Rakelmesser, eine Beschichtung mit einem Speisetrichter und eine Vorhangsbeschichtung.
Obgleich die Dicke der Substratschicht, hergestellt nach irgendeinem der zuvor erwähnten Verfahren, nicht beschränkt ist, kann die Dicke im Bereich innerhalb von 1 um bis 50 um liegen, und bevorzugt von 2 um bis 30 um, wenn die Schicht als Überzugsschicht vorgesehen ist. Wenn sie nach einem anderen Verfahren angeordnet wird, beispielsweise durch Aufschichten des Laminats, kann die Dicke davon innerhalb eines großen Bereichs von mehreren Zehnteln um bis mehreren Hundertsteln um variiert werden.
Die Substratschicht kann eine wasserpermeable Schicht sein, zusammengesetzt aus einem hydrophilen polymeren Bindemittel, wie Gelatine und ihren Derivaten (beispielsweise mit Phthalsäure umgesetzte Gelatine), Derivaten der Cellulose (beispielsweise Hydroxyethylcellulose), Agarose, Natriumalginat, Acrylamidcopolymere, Methacrylamidcopolymere, Copolymere von Acrylamiden oder Methacrylamiden mit verschiedenen Vinylmonomeren, Polyhydroxyethylmethacrylat, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Natriumpolyacrylat und Copolymeren von Acrylsäure mit verschiedenen Vinylmonomeren.
Die Substratschicht, zusammengesetzt aus einem hydrophilen polymeren Bindemittel, kann durch Auftragen einer wässrigen Lösung oder Dispersion des Substrats, einer zusätzlichen anderen Reagenszusammensetzung und eines hydrophilen polymeren Bindemittels auf eine andere Schicht, wie einen Träger oder eine Nachweisschicht, und dann Trocknen der aufgetragenen Lösung oder Dispersion, hergestellt werden, wie es in den Beschreibungen der japanischen Patentpublikation Nr. 21677/1988 (entsprechend USP 3 992 158), den nichtgeprüften japanischen Patentpublikationen Nr. 164356/1980 (entsprechend USP 4 292 272), 101398/1979 (entsprechend USP 4 132 528) und 292063/1986 (Chemical Abstracts, 106, (1987): 210567y) beschrieben wird. Die Dicke der getrockneten Substratschicht, die ein hydrophiles polymeres Bindemittel enthält, kann im Bereich von etwa 2 um bis etwa 50 um, und bevorzugt von etwa 4 um bis etwa 30 um, liegen, und die Bedeckung davon kann im Bereich von etwa 2 g/m² bis etwa 50 g/m², bevorzugt von etwa 4 g/m² bis etwa 30 g/m², liegen.
Zur Verbesserung der Eigenschaften, wie der Beschichtungseigenschaften, der Diffusionsfähigkeit des diffundierbaren Materials, der Reaktivität und der Lagerungsstabilität, kann die Substratschicht zusätzlich zu dem nichtdiffundierbaren Substrat verschiedene organische oder anorganische Additive, beispielsweise Enzymaktivatoren, Coenzyme, grenzflächenaktive Mittel, pH-Pufferreagentien, feine Teilchen, Antioxidantien, usw., enthalten. Beispiele für ein Puffersystem, das in der Substratschicht vorhanden sein kann, umfassen pE-Pufferreagentien, wie in "KAGAKU BINRAN, KISOHEN", herausgegeben von Japanese Chemical Society (MARUZEN, Tokyo, 1966), S. 1312-1320; R. M. C. Dawson et al., "Data for Biological Research", 2. Herausgabe (Oxford at the Clarendon Press, 1969), S. 476-508; "Biochemistry", 5, S. 467-477 (1966); und "Analytical Biochemistry", 104, S. 300-310 (1980), beschrieben. Spezifische Beispiele verwendbarer Puffer sind Pufferreagentien, die Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) enthalten, Pufferreagentien, die Phosphate enthalten, Pufferlösungen, die Borate enthalten, Pufferreagentien, die Citronensäure oder Citrate enthalten, Pufferlösungen, die Glycin enthalten, Pufferlösungen, die Bicin enthalten, und Pufferreagentien, die HEPES enthalten.

Reagensschicht

Die Reagensschicht 12 enthält eine Reagenszusammensetzung zum Nachweis des diffundierbaren Materials, das von der Substratschicht 14 diffundiert und migriert ist. Gewünschtenfalls kann ein Fragmentierungsenzym in der Nachweisreagenszusammensetzung enthalten sein und eine Nachweisreagenszusammensetzung zum Nachweis des Produkts mit niedrigem Molekulargewicht, gebildet durch Einwirkung des Fragmentierungsenzyms, kann ebenfalls verwendet werden.
Die Reagensschicht 12 ist aus einer wasserpermeablen Schicht, die bevorzugt eine kontinuierliche Schicht, hergestellt aus einem hydrophilen polymeren Bindemittel, ähnlich wie die wasserpermeablen Schichten, die bei der Beschreibung der Substratschicht erwähnt wurden, zusammengesetzt. Das verwendete hydrophile polymere Bindemittel kann im Hinblick auf das diffundierbare Produkt, das in der Substratschicht gebildet wird, und des Farbreagens, das in der Reagensschicht vorhanden ist, ausgewählt werden.

Träger

Der Träger 10 kann ein nichtlichtdurchlässiger (opaker), semilichtdurchlässiger (transluzenter) oder lichtdurchlässiger (transparenter) Träger sein, und es ist im Allgemeinen bevorzugt, dass der Träger lichtdurchlässig und wasserundurchlässig ist. Bevorzugte Materialien für den lichtdurchlässigen und wasserundurchlässigen Träger sind Polyethylenterephthalat und Polystyrol. Im Allgemeinen wird eine Grundierungsschicht angeordnet oder der Träger wird einer Hydrophilisierungsbehandlung unterworfen, damit die hydrophile Schicht fest haftet.

Immunologische Reaktionsschicht

Die Substratschicht 14, die in der Fig. 1 gezeigt wird, kann einen enzymmarkierten oder unmarkierten immunologischen Bindungspartner (Antigen oder Antikörper) zusätzlich zu dem diffundierbaren Substrat unter Bildung einer immunologischen Reaktionsschicht, in der die immunologische Reaktion stattfindet, enthalten.
Beispielsweise kann die Substratschicht so ausgebildet sein, das sie enthält:
(1) einen enzymmarkierten Antikörper, wenn die Menge eines Antigens, die dem Assay unterworfen wird, bestimmt wird, indem das Antigen mit dem enzymmarkierten Antikörper reagieren soll;
(2) einen Antikörper und ein enzymmarkiertes Antigen, wenn die Menge an Antigen, die dem Assay unterworfen wird, bestimmt wird, indem das Antigen mit dem Antikörper und dem enzymmarkierten Antigen reagiert;
(3) ein polymerisiertes Antigen und einen enzymmarkierten Antikörper, wenn die Menge an Antigen, die dem Assay unterworfen wird, indem das Antigen mit dem polymerisierten Antigen und dem enzymmarkierten Antikörper reagiert;
(4) ein enzymmarkiertes Antigen, wenn die Menge eines Antikörpers, die dem Assay unterworfen wird, bestimmt wird, indem der Antikörper mit dem enzymmarkierten Antigen reagiert; oder
(5) ein Antigen und ein enzymmarkiertern Antikörper, wenn die Menge an Antikörper, die dem Assay unterworfen wird, bestimmt wird, indem der Antikörper mit dem Antigen und dem Enzymmarker-Antikörper reagiert.
Bei solchen Konstruktionen wirkt die Substratschicht als immunologische Reaktionsschicht, in der zusätzlich eine immunologische Reaktion darin ablaufen kann. In diesem Fall findet die homogene immunologische Enzymreaktion in dem Element nur statt, wenn eine Probenlösung auf das Element aufgetüpfelt wird.
Alternativ kann entweder ein gegebenes Paar an Reaktionsteilnehmern in der Substratschicht und der Rest in der wasserdurchlässigen Schicht, die auf der Substratschicht aufliegt, enthalten sein. Sonst kann eine Wasserpermeationsschicht, die aus einer Schicht oder einer Vielzahl von Schichten gebildet wird, auf der Substratschicht ausgebildet werden, und diese Schichten können immunologische Bindungspartner enthalten, die für die immunologische Reaktion erforderlich sind. Die Schichtenkonstruktion dieser immunologischen Reaktionsschichten kann auf beliebige Weise ausgewählt werden, abhängig von der Art der immunologischen Reaktion, die durchgeführt werden soll.
Beispielsweise können im Falle der oben erwähnten Reaktion (2) der Antikörper und das enzymmarkierte Antigen in eine Vielzahl von Schichten, ausgenommen der Substratschicht, enthalten sein. Beispielsweise kann das Immunoassay- Element eine wasserpermeable (bzw. wasserundurchlässige) Schicht 16, die ein Antigen enthält und auf der Substratschicht 14 liegt, und weitere darauf eine wasserpermeable Schicht 18, die das enzymmarkierte Antigen enthält, wie in Fig. 2 erläutert, enthalten. In diesem Fall diffundiert und permeatiert das Antigen (Ligand) in der Probe zusammen mit dem enzymmarkierten Antigen der Schicht 18 durch die Schicht 16. In der Schicht 16 sind das Antigen beziehungsweise das enzymmarkierte Antigen mit dem Antikörper gebunden und können weiter in die Substratschicht 14 migrieren.
Umgekehrt kann das Immunoassay-Element die wasserpermeable Schicht 16, die das enzymmarkierte Antigen enthält, enthalten, und die wasserpermeable Schicht 18 kann darauf liegen und den Antikörper enthalten. In diesem Fall bindet das Antigen (Ligand) in der Probe an den Antikörper, der in der Schicht 18 enthalten ist, und migriert dann in die Schicht 16. In der Schicht 16 bindet der Antikörper, der mit dem Antigen nicht gebunden hat, mit dem enzymmarkierten Antigen und migriert weiter in die Substratschicht 14.
Gegebenenfalls kann eine Schicht, außer der Substratschicht, den Antikörper und das enzymmarkierte Antigen zusammen in einem im Wesentlichen trockenen Zustand oder in wesentlicher Abwesenheit von Wasser enthalten. Beispielsweise kann ein Immunoassay-Element so konstruiert sein, dass auf der Substratschicht 14 eine wasserpermeable Schicht 20 gebildet wird, die den Antikörper und das enzymmarkierte Antigen zusammen in im Wesentlichen trockenen Zustand oder in wesentlicher Abwesenheit von Wasser, wie in Fig. 3 erläutert, enthält. In diesem Fall werden, wenn die Probe Wasser als Lösungsmittel enthält und der Schicht 20 zugefügt wird, der Ligand (Antigen) in der Probe und das enzymmarkierte Antigen an den Antikörper in dem Wasser, das von der Probe in der Schicht 20 stammt, gebunden und migrieren in die Substratschicht 14. Damit ein Antikörper und ein enzymmarkierter Ligand zusammen in einer getrennten Schicht in im Wesentlichen trockenen Zustand oder im wesentlichen in Abwesenheit von Wasser vorhanden sind, müssen entweder einer oder beide, der Antikörper und der enzymmarkierte Antikörper in einem nichtwässrigen Lösungsmittel, wie Alkohol (beispielsweise Ethanol), gelöst oder dispergiert sein, und dann wird die entstehende Lösung oder Dispersion zum Imprägnieren der wasserpermeablen Schicht verwendet.
Wenn die Immunoreaktionsschicht weggelassen wird, kann das erfindungsgemäße Assayelement ebenfalls für den Nachweis eines Enzyms verwendet werden, das das nichtdiffundierbare Substrat, das in der Substratschicht 14 enthalten ist, zersetzt.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Assayelement für den Nachweis einer endo-aktiven Glucosidase, wie α-Amylase oder β-Amylase, verwendet werden.

Verfahren zur Herstellung des Immunoassay-Elements

Das erfindungsgemäße trockene Immunoassay-Element kann nach irgendeinem der bekannten Verfahren, die in den Beschreibungen der zuvor erwähnten Patentschriften beschrieben werden, hergestellt werden.
Das erfindungsgemäße Analysenelement kann in quadratische Stücke mit Seiten je im Bereich von 15 mm bis etwa 30 mm oder Scheiben mit im Wesentlichen der gleichen Fläche geschnitten werden. Im Hinblick auf die Herstellung, die Verpackung, den Transport, die Lagerung und die Messvorgänge ist das Element in einem Objektträgerrahmen enthalten, wie es beispielsweise in der japanischen Patentpublikation Nr. 28331/1982 (entsprechend USP Nr. 4 169 751), der nichtgeprüften Patentpublikation Nr. 142454/1981 (entsprechend USP Nr. 4 387 990), der nichtgeprüften japanischen Patentpublikation Nr. 63452/1982, der nichtgeprüften Patentpublikation Nr. 32350/1983 und der nichtgeprüften japanischen Patentpublikation Nr. 501144/1983 (entsprechend der internationalen Patentpublikation WO 83/00391) offenbart ist, wo die Verwendung in Form eines Objektträgers für chemische Analysen beschrieben wird. In einigen Fällen kann es zweckdienlich sein, dass das Analysenelement die Form eines Bandes hat, das in einer Kassette oder einem Magazin enthalten ist; es kann auch ein kleines Stück davon auf einer ina-Karte aufgebracht sein oder in einer ina-Karte, die eine Öffnung hat, enthalten sein.

Analyseverfahren unter Verwendung des Immunoassay-Elements

Das erfindungsgemäße Analysenelement kann zur quantitativen Analyse eines Analytliganden (oder eines Analyt-Antikörpers) in einer Probenflüssigkeit verwendet werden, indem es bei den in den Beschreibungen der zuvor erwähnten Patentschriften beschriebenen Vorgängen eingesetzt wird.
Beispielsweise können etwa 5 ul bis etwa 30 ul, bevorzugt etwa 8 ul bis 15 ul, einer wässrigen Probenflüssigkeit, wie Serum, Plasma oder Urin, auf die Substratschicht 14 aufgetüpfelt oder sonst zugeführt werden. Das Analysenelement, das die Probenflüssigkeit aufgetüpfelt enthält, wird dann bei einer konstanten Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 45ºC, bevorzugt bei einer konstanten Temperatur von etwa 30ºC bis etwa 40ºC, während 1 bis 10 Minuten inkubiert. Die optische Reflexionsdichte der Farbe oder die Farbänderung in dem Element kann von der lichtdurchlässigen Trägerseite aus gemessen werden, und die Menge an Ligand (oder Antikörper), die in der Probe enthalten ist, kann unter Verwendung einer vorab hergestellten Eichkurve, beruhend auf dem Prinzip der Colorimetrie, bestimmt werden. Das Volumen der aufgetüpfelten Flüssigkeitsprobe und die Zeit und die Temperatur für die Inkubation werden konstant gehalten, um die Genauigkeit bei der quantiativen Analyse zu verbessern.
Der Messvorgang kann durchgeführt werden, während die Chemikalien-Analysevorrichtung, die in der nichtgeprüften japanischen Patentpublikation Nr. 161867/1983 (entsprechend USP Nr. 4 424 191) beschrieben wird, verwendet wird, wobei eine quantitative Analyse mit hoher Genauigkeit durch extrem leichte Vorgänge durchgeführt wird. In der Zwischenzeit kann eine semiquantitative Analyse durchgeführt werden, indem der Grad der Verfärbung mit dem bloßen Auge geprüft wird, wenn eine solche visuelle Beurteilung für das Ziel oder die erforderliche Genauigkeit geeignet ist.
Wenn das Analysenelement keine immunologische Reaktionsschicht enthält, nämlich wenn das Analysenelement keinen immunologischen Bindungspartner enthält, der für die immunologische Reaktion mit dem Antigen oder Antikörper, das bzw. der analysiert werden soll, erforderlich ist, kann eine notwendige immunologische Reaktion in einem geeigneten Reaktionsgemisch, außer dem Assayelement, durchgeführt werden, und dann wird das entstehende Reaktionsgemisch auf das Element aufgetüpfelt. Der Analyt kann so als Änderung der enzymatischen Aktivität des Markierungsenzyms analysiert werden. Für die Analyse eines Antigens kann beispielsweise eine wässrige Probenlösung mit einer Lösung vermischt werden, die einen Antikörper und einen enzymmarkierten Liganden für die Vervollständigung der Bindungsreaktion enthält, und dann auf die Substratschicht aufgetüpfelt werden.

Beispiel 1:

Herstellung eines spezifischen reaktiven Substrats des Endo-Typs

10 Gramm carboxylmethylierte Stärke, hergestellt von der Edward Mendel Company Inc. und verkauft unter der Warenzeichenbestimmung "Exprotab", wurden in 1 Liter 0,1 M Boratpufferlösung (pH 10) dispergiert und dann eine Stunde gerührt. Mit Chlorwasserstoffsäure und Phosphorsäure wurde der pH der entstehenden Dispersion auf 5, 5 eingestellt, und dann werden 1.000 E Glucoamylase (hergestellt von Toyobo K. K.) zugegeben, um mit der carboxylmethylierten Stärke bei 37ºC während 16 Stunden zu reagieren. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch dem Hochgeschwindigkeitszentrifugieren bei etwa 10,000 G unterworfen. Die Reinigung durch Zentrifugieren wurde wiederholt, bis die elektrische Leitfähigkeit des abgetrennten Überstands unter 20 us/cm fiel, um die löslichen Komponenten zu entfernen. Dann wurden zu der entstehenden Dispersion 10 Liter Ethanol gegeben, während die Letztere ausreichend gerührt wurde. Der farblose Niederschlag, der darauf folgend auftrat, wurde unter Absaugen abfiltriert. Er wurde bei 30ºC 10 Stunden getrocknet, wobei 5,2 g (Ausbeute: 52%) carboxylmethylierte Stärke, die für eine enzymatische Reaktion des Endo-Typs spezifisch ist, erhalten wurden.

Beispiel 2:

Eine Reagenslösung, enthaltend ein Vernetzungsreagens, wurde auf eine farblose und transparente Polyethylenterephthalat(PET)-Folie (Träger), beschichtet mit einer Gelatinegrundierung und mit einer Dicke von 180 um, aufgetragen. Die Folie wurde dann getrocknet, wobei darauf eine Reagensschicht gebildet wurde, wobei die entsprechenden Komponenten die Bedeckungen, wie im Folgenden angegeben, ergaben.
Alkalibehandelte Gelatine 14,5 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (Enthaltend (durchschnittlich) 9 bis 10 Oxyethylen-Einheiten) 0,2 g/m²
Glucoseoxidase 5.000 E/m²
Peroxidase 15.000 E/m²
Glucoamylase 5.000 E/m²
2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4-[4-(dimethylamino)phenyl]-5-phenethylimidazol (Leuko-Farbstoff)-Acetat 0,38 E/m²
Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]methan 0,1 g/m²
Die Klebstoffschicht wurde auf die Reagensschicht aufgetragen, die die folgende Bedeckung zeigte, und dann getrocknet.
Alkalibehandelte Gelatine 14,5 g/m²
Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]methan 0,1 g/m²
Dann wurde eine wässrige Lösung, die das folgende Reagens enthielt, auf die Oberfläche der Klebstoffschicht aufgetragen, so dass die folgenden Bedeckungen erhalten wurden und die Gelatineschicht quellen konnte. Ein gestricktes Trikottuch, hergestellt durch Stricken von gesponnenem PET-Garn mit 36 Gauge, entsprechend 50 Denier, und mit einer Dicke von etwa 250 um, wurde dann darauf laminiert, indem mit einheitlichem leichtem Druck gepresst wurde und wobei eine poröse Ausbreitungsschicht gebildet wurde.
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (Enthaltend (durchschnittlich) 9 bis 10 Oxyethylen-Einheiten) 0,15 g/m²
Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]methan 0,4 g/m²
Danach wurde eine Substratschicht gebildet, indem carboxylmethylierte Stärke spezifisch für die enzymatische Reaktion des Endo-Typs, hergestellt gemäß Beispiel 1, als Schicht aufgetragen und anschließend getrocknet wurde, wobei die folgenden Bedeckungen erhalten wurden, und es wurde ein mehrschichtiges Analysenelement für die quantitative Analyse von CRP hergestellt.
Carboxylmethylierte Stärke 3,5 g/m²
Mannit 3,0 g/m²
MES(2-Morpholinoethansulfonsäure) 2,0 g/m²
Das so vorab hergestellte Element wurde in rechteckige Chips, 14 mm · 13 mm, geschnitten. Die Chips wurden mehrmals mit Objektträgerrahmen, wie in JP-A-57-63 452 beschrieben, versehen, wobei mehrschichtige trockene Objektträger 1 für die Analyse von CRP, gemäß diesem Beispiel, erhalten wurden.
Als Vergleichsbeispiel wurde ein Kontroll-Objektträger mit der gleichen Konstruktion wie die Objektträger 1 der Beispiele hergestellt, ausgenommen, dass eine nichtbehandelte carboxylmethylierte Stärke (Exprotab) als Substrat anstelle der carboxylmethylierten Stärke spezifisch für die enzymatische Reaktion des Endo-Typs verwendet wurde.

Beispiel 3:

50 mM Glycerophosphatpufferlösung (pH 7) wurden in einer Einheitsmenge von 10 ul mehrmals auf die trockenen Objektträger 1 von Beispiel 2 und die trockenen Objektträger 2 des Vergleichsbeispiels aufgetüpfelt. Danach wurden die Objektträger bei 37ºC gehalten, und von der PET- Trägerelementseite wurde die reflektierte optische Dichte bei einer zentralen Wellenlänge von 650 nm im Lauf der Zeit gemessen. Die Änderungen der reflektierten optischen Dichte mit der Zeit nach dem Auftüpfeln von Puffer sind in Fig. 4 dargestellt.
Bei Kontroll-Objektträgern von Beispiel 2, bei denen nichtbehandelte carboxylmethylierte Stärke als nichtdiffundierbares Substrat verwendet wurde, wurde gefunden, dass die reflektierten optischen Dichten im Verlauf der Zeit zunahmen (angezeigt durch das Zeichen -O- in der graphischen Darstellung) nach dem Auftüpfeln der Pufferlösung.
Diese Tatsache zeigt an, dass sich die nichtbehandelte carboxylmethylierte Stärke in Glucose durch Glucoamylase (Fragmentierungsenzym), ein exo-aktives Enzym, das von der Reagensschicht aus migrierte, zersetzte.
Im Gegensatz dazu war bei den Objektträgern 1 von Beispiel 2, bei denen carboxylmethylierte Stärke, die vorab durch Behandlung mit Glucoamylase für eine enzymatische Reaktion des Endo-Typs spezifisch gemacht wurden, die reflektierte optische Dichte konstant war; es trat keine Erhöhung (angezeigt durch die Markierung - - im Diagramm) auf.

Beispiel 4:

10 ul von je 50 mM Glycerophosphatpufferlösung (pH 7), enthaltend ein amylasemarkiertes Anti-CRP-TgG (0,1 mg/ml) und ein bekannte Menge von CRP, wurden auf die trockenen Objektträger 1 von Beispiel 2 und die trockenen Objektträger 2 des Vergleichsbeispiels aufgetragen. Die Objektträger 1 und 2 wurden bei 37ºC gehalten, und von der PET- Trägerseite aus wurde die reflektierte optische Dichte mit sichtbarem Licht mit einer zentralen Wellenlänge von 650 nm gemessen. Die Unterschiede in der reflektierten optischen Dichte (ΔOD&sub6;&submin;&sub4;) zwischen 4 Minuten und 6 Minuten nach dem Auftüpfeln sind in Fig. 5 dargestellt. Aus der Eichkurve von Fig. 5 ist klar ersichtlich, dass das erfindungsgemäße trockene Immunoassay-Element, bei dem eine carboxymethylierte Stärke, die vorab für die enzymatische Reaktion des Endo-Typs spezifisch gemacht wurde, die Menge an CRP mit hoher Genauigkeit bestimmen konnte (angegeben durch das Zeichen - - in der graphischen Darstellung). Die Änderungen ΔOD&sub6;&submin;&sub4; relativ zu Veränderungen der CRP- Konzentration waren, verglichen mit dem Vergleichsbeispiel (angegeben durch das Zeichen -O- in der graphischen Darstellung), groß, was eine Verbesserung der Empfindlichkeit anzeigte.

Beispiel 5:

Ein mehrschichtiges Analysenelement mit der gleichen Konstruktion wie das Element von Beispiel 2 wurde hergestellt, indem das Verfahren von Beispiel 2 getreu wiederholt wurde. Auf der gestrickten Trikottuchschicht, die sowohl als Substratschicht als auch als Ausbreitungsschicht diente, wurde eine Ethanollösung von amylasemarkiertem CRP-IgG als Schicht aufgetragen und imprägniert, wobei eine Bedeckung von 3 mg/m² erhalten wurde. Anschließend wurde getrocknet, wobei ein mehrschichtiger Immunoassay- Objektträger 3 für die Analyse von CRP erhalten wurde. Als Vergleichsbeispiel wurde die gestrickte Trikottuchschicht des mehrschichtigen Assayelements von dem Vergleichsobjektträger 2, wie in Beispiel 2 hergestellt, ähnlich mit einer Ethanollösung von amylasemarkierter CRP-IgG mit einer Bedeckung von 3 mg/m² beschichtet und imprägniert, wobei ein mehrschichtiger Vergleichs-Immunoassay- Objektträger 4 hergestellt wurde.

Beispiel 6:

Auf die Objektträger 3 und Objektträger 4 wurden je 10 ul 50 mM Glycerophosphatpufferlösung (pH 7), enthaltend CRP in unterschiedlicher Konzentration, aufgetüpfelt. Die Objektträger wurden bei 37ºC gehalten, und von der Trägerseite aus wurde die reflektierte optische Dichte bei einer Wellenlänge von 650 nm gemessen, wobei Unterschiede in der reflektierten optischen Dichte (ΔOD&sub6;&submin;&sub4;) zwischen 4 Minuten und 6 Minuten nach dem Auftüpfeln der Lösung gefunden wurden. Aus der Eichkurve von Fig. 6 ist klar ersichtlich, dass das erfindungsgemäße trockene Immunoassay-Element, bei dem carboxylmethylierte Stärke verwendet wurde, die für die Reaktion des Endo-Typs spezifisch ist (wie durch das Zeichen - - in Fig. 6 angegeben), fähig war, den quantitativen CRP-Assay mit hoher Empfindlichkeit durchzuführen, verglichen mit dem Vergleichsbeispiel (was durch dass Zeichen -O- angezeigt wird).

Beispiel 7:

Die Objektträger 2 von Beispiel 5 und die Objektträger 4 des Vergleichsbeispiels wurden vergleichend auf ihre Reproduzierbarkeit (CV) untersucht. Auf die Objektträger 3 und die Objektträger 4 wurden vier Proben (L-1, L-2, M und H) CRP-enthaltendes humanes Standardblutserum in einer Einheitsmenge von 10 ul aufgetüpfelt. Die Objektträger wurden bei 37ºC gehalten, und von der Trägerelementseite wurde die reflektierte optische Dichte bei einer Wellenlänge von 650 nm bestimmt, wobei Unterschiede in der reflektierten optischen Dichte (ΔOD&sub6;&submin;&sub4;) 4 Minuten und 6 Minuten nach dem Auftüpfeln der Lösung gefunden wurden. Eine Eichkurve für die Objektträger 3 von Beispiel 5 und eine Eichkurve für die Objektträger 4 des Vergleichsbeispiels wurden vorab getrennt hergestellt. Aus den OD&sub6;&submin;&sub4;-Werten für die Proben, die darauf gefunden wurden, wurde die relevante CRP-Konzentration (gemessene Werte) berechnet. Diese Messung erfolgte mit jeder der Proben in bis zu 10 Wiederholungen. Die durchschnittlichen Standardabweichungen (S. D.) und der Variationskoeffizient (CV= (S.D./Durchschnitt) · 100) der entstehenden Messungen wurden darauffolgend erhalten. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. Tabelle I Reproduzierbarkeit bei Objektträger 3 (Beispiel 5) Tabelle 2 Reproduzierbarkeit bei Objektträger 4 (Vergleichsbeispiel)
Aus den Tabellen 1 und 2 folgt, dass die Objektträger 3 des erfindungsgemäßen Beispiels 5, bei denen Substrate verwendet wurden, die spezifisch für die Reaktion des Endo-Typs waren, nur eine geringe Variation zeigten und eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit besaßen, wohingegen die bekannten Objektträger 4 für den Vergleich große Änderungen des gemessenen Wertes (Konzentration) zeigten. Insbesondere waren im niedrigen Konzentrationsbereich (Proben L-1 und L-2) und im hohen Konzentrationsbereich (Probe H) die CV-Werte der Objektträger 3 der Arbeitsbeispiele umgefähr 1/3 niedriger als die der Vergleichs-Objektträger 4, was anzeigt, dass die erfindungsgemäßen Immunoassay- Elemente eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit und Genauigkeit zeigten.

Beispiel 8:

Die Objektträger 3 von Beispiel 5 und die Vergleichs- Objektträger 4 wurden vergleichsweise auf ihre Stabilität bei der Konservierung untersucht. Trockene Assayelemente sind im Allgemeinen während einer Dauer von etwa einem Monat stabil. In diesem Beispiel wurden die Objektträger daher bei 25ºC einem Beschleunigungstest unterworfen, und die Werte der Messung, die an Tag eins, drei Tage und sieben Tage nach der Herstellung der Objektträger erhalten wurden, wurden mit den Werten der Messungen, die unmittelbar (0 Tage) nach der Herstellung der Objektträger erhalten wurden, verglichen. Bei den Objektträgern 3 (Beispiel 5) und den Objektträgern 4 (Vergleichsbeispiel) wurden nach der angegebenen Zahl von Tagen ab der Herstellung der Objektträger CRP-enthaltende Standardproben CP1 (1,4 mg/dl), CP2 (4,2 mg/dl) und CP3 (10,0 mg/dl) mehrere Male in einer Einheitsmenge von 10 ul aufgetüpfelt. Diese Objektträger wurden bei 37ºC gehalten, und dann wurde die reflektierte optische Dichte von der Trägerelementseite: aus bei einer Wellenlänge von 650 nm bestimmt, um Unterschiede in der reflektierten optischen Dichte (ΔOD&sub6;&submin;&sub4;) zwischen 4 und 6 Minuten nach der Abscheidung der Lösung in Form von Tüpfelproben festzustellen. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 3 und 4 aufgeführt. Tabelle 3 Lagerungsstabilität der Objektträger (Beispiel 5)
Bei den Objektträgern 4 (für den Vergleich), wobei bekannte nichtbehandelte carboxylmethylierte Stärke als Substrat verwendet wurden, nahmen die ΔOD&sub6;&submin;&sub4;-Werte im Verlauf von Tagen der Konservierung bei 25ºC ab, wobei Abnahmen von 5 bis 10% am dritten Tag und große Abnahmen im ungefähren Bereich von 15 bis 20% am siebten Tag gefunden wurden. Im Gegensatz dazu zeigten die Objektträger 3 (Beispiel 5), in denen die erfindungsgemäßen carboxylmethylierte Stärke, hergestellt als Substrat, spezifisch für die Reaktion des Endo-Typs, verwendet wurde, eine Abnahme der ΔOD&sub6;&submin;&sub4;-Werte von nur 2 bis 4% am dritten Tag und etwa 3 bis 5% am siebten Tag nach der Konservierung. Die Ergebnisse zeigen an, dass die erfindungsgemäßen Immunoassay-Elemente eine ausgezeichnete Lagerungsstabilität besitzen.

Beispiel 9:

Herstellung von selektiv reaktivem Substrat des Endo-Typs:

In 8,960 g reinem Wasser wurden 453 g carboxylmethylierte Stärke (hergestellt von Edward Mendel Company Inc., die mit der Warenzeichenbezeichnung "Exprotab" verkauft wurde) während etwa 4 Stunden gerührt und gequollen. Die gequollene Stärke wurde durch Zugabe von 1139 g 0, 5 N NaOH alkalisch gemacht und ungefähr eine Stunde gerührt. Danach wurde der pH durch Zugabe von 32 g Essigsäure auf 7 eingestellt. Er wurde dann auf pH 5,7 mit MES (2- Morpholinoethansulfonat)-Pufferlösung eingestellt und konnte dann mit 80 g Glucoamylase-Enzymlösung (320 k Einheit/l, 5 mM MES, pH 6,0, hergestellt von Toyobo K. K.) bei 37ºC während 12 bis 20 Stunden reagieren. Die darauffolgend erhaltene Reaktionslösung wurde mit reinem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 140 l verdünnt. Die entstehende Suspension wurde durch einen Keramikmembranfilter (monolithi-scher Typ, 2 um Porengröße und 0,24 m² Membranfläche" hergestellt von Nippon Gaishi K. K. und verkauft unter dem eingetragenen Warenzeichen "CEFILT-MF") durchgeleitet. Das Keramikmembranfilter wurde von den löslichen Komponenten befreit, indem reines Wasser durch das Filter geleitet wurde, bis die elektrische Leitfähigkeit des gefilterten Wassers unter 20 uS/cm fiel. Der Rückstand der carboxymethylierten Stärke wurde von dem Filter gesammelt und mit gereinigtem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 100 l verdünnt. Etwa 3,6 l verdünnter Rückstand wurden bei 7.500 UpM für 10 Minuten zentrifugiert, und der Zentrifugierrückstand wurde gesammelt. Etwa 18 l Isopropylalkohol wurden zu dem Rückstand zugegeben, und die farblose Substanz, die darauffolgend ausfiel, wurde bei verringertem Druck abfiltriert. Das Verfahren von dem Zentrifugieren bis zur Präzipitation mit Isopropylalkohol wurde bis zu etwa 26 Mal wiederholt, und die Rückstände aufeinanderfolgender Verfahrensstufen wurden gesammelt und bei 35ºC während 24 Stunden getrocknet. Der Vorgang ergab 220 g glucoamylasebehandelte Carboxylmethylstärke, spezifisch für die enzymatische Reaktion des Endo-Typs (im Folgenden als "GAbehandelte CMS" bezeichnet).
Als Vergleichsbeispiel (Vergleich) wurde eine carboxylmethylierte Stärke hergestellt, indem der Betrieb wie oben erwähnt genau wiederholt wurde, wobei die Behandlung mit. Glucoamylase ausgelassen wurde (nichtbehandelte carboxymethylierte Stärke; im Folgenden als "unbehandelte CMS") bezeichnet.

Beispiel 10:

Die GA-behandelte CMS und die nichtbehandelte CMS, erhalten gemäß Beispiel 9, wurden auf ihren Carboxylmethylierungsgrad geprüft, und die Dispersionen davon in Wasser wurden auf ihren Quellgrad geprüft. Der Carboxylmethylierungsgrad wurde bestimmt, indem das Verhältnis von Glucoseeinheiten, modifiziert mit einer Carboxylmethylgruppe, zu der gesamten Glucoseeinheit mittels ¹³C-NMR bestimmt wurde. Der Quellgrad wurde bestimmt, indem 10 ml einer wässrigen 0,7%igen Lösung mit gegebenem CMS hergestellt wurden, die wässrige Lösung in ein Reagensglas gegeben wurde, sie bei 25ºC 30 Minuten stehen gelassen wurde, wobei dann das Volumen (ml) von CMS, das sich als Folge am Boden des Reagensglases abgesetzt hatte, bestimmt wurde. Das Volumen wurde als Quellgrad aufgezeichnet.
Aus den Ergebnissen in der folgenden Tabelle 5 ist erkennbar, dass die carboxylmethylierte Stärke, die mit Glucoamylase behandelt wurde, einen Carboxymethylierungsgrad erreichte, und dass 28% der gesamten Glucoseeinheiten, die darin gebildet wurden, eine Carboxylmethylgruppe enthielten. Diese Tatsache zeigt an, dass die Behandlung mit Glucoamylase eine Abnahme in der Menge von nicht-CM- modifizierten Glucoseeinheiten in der CM-modifizierten Stärke ergab und dass als Folge der Anteil von CM- modifizierten Glucoseeinheiten erhöht wurde, da die Behandlung die Glucosebindungen vom nichtreduzierenden Ende bis zu einer Stelle unmittelbar vorhergehend der Stelle der Carboxylmethylierung hydrolysierte. Es ist ebenfalls erkennbar, dass die Erhöhung des Anteils der Einarbeitung der Carboxylmethylgruppe, einer hydrophilen Gruppe, die Leichtigkeit der Hydratisierung erleichterte und den Quellgrad verstärkte. Tabelle 5

Beispiel 11:

Reaktivität der GM-behandelten CMS mit Glucoamylase:

Die mit Glucoamylase behandelte carboxylmethylierte Stärke, erhalten gemäß Beispiel 9, und die nicht mit Glucoamylase behandelte carboxylmethylierte Stärke vom Vergleichsbeispiel wurden getrennt in 5 mM MES-Pufferlösung (pH 6,0, enthaltend 0,5% Block Ace (hergestellt von Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) und 68 um CaCl&sub2;) dispergiert, wobei 0,2%ige (Gew./Vol.) Dispersionen erhalten wurden. Zu 7 ml der 0,2%igen CMS-Dispersionen wurden 70 ul Glucoamylaselö,sung (hergestellt von Toyobo K. K., 320 k Einheit/l, 6 mM MES, pH 6,0) gegeben und zusammen bei 37ºC während 6 0 Minuten bei 120 UpM zur Induzierung der Reaktion geschüttelt. Die Reaktionslösung, die anschließend erhalten wurde, wurde mit 70 ul 10%iger Phosphorsäure kombiniert und zur Beendigung der Reaktion mit Eis gekühlt. Die entstehenden Reaktionslösungen wurden bei 12.000 UpM 4 Minuten zentrifugiert, um nichtgeänderte CMS abzutrennen. Einhundert (100) ul des Überstands des Zentrifugierens, enthaltend die gebildete Glucose, wurden zu 3 ml Reaktionslösung A in der folgenden Zusammensetzung gegeben, und sie wurden zusammen bei 37ºC während 30 Minuten bei 120 UpM geschüttelt, um eine Farbreaktion zu induzieren. Die entstehende Reaktionslösung wurde zur Absorption bei einer Wellenlänge von 727 nm getestet. Die relevanten Eichkurven wurden hergestellt, indem 100 ul Glucoselösung bekannter Konzentration zu 3 ml Reaktionslösung A gegeben wurden und das entstehende Gemisch der gleichen Farbreaktion unterworfen wurde.

Reaktionslösung A

Leuko-Farbstoff (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4' bis(dimethylamino)diphenylaminnatriumsalz)(Wako Junyaku K. K. Produktcode: "DA-64") 3,9 mg
Glucoseoxidase (Toyobo K. K: Produktcode: "GLO-501") 139 Einheiten
Peroxidase (Toyobo K. K: Produktcode: "PEO-301") 115 Einheiten
100 mM MES-Pufferlösung (pH 6,0) 100 ml
Die Messung wurde an GA-behandelter CMS mit bis zu fünf Wiederholungen und mit nichtbehandelter CMS mit bis zu zwei Wiederholungen durchgeführt. Aus den in Tabelle 6 angeführten Ergebnissen ist erkennbar, dass die CM-Stärke, die nicht mit Glucoamylase behandelt wurde, etwa 33 ug Glucose pro Gramm ergab, wohingegen die CM-Stärke, die vorab mit Glucoamylase behandelt wurde, durchschnittlich nicht mehr als 0,2 gg Glucose bildete. Diese Tatsache zeigt an, dass die gesamte nichtreduzierende terminale Glucose der erfindungsgemäßen GA-behandelten CMS entweder modifiziert war oder an der Stelle der Kettenverzweigung vorhanden war und kein Substrat für Glucoamylase, ein Enzym des exo-reaktiven Typs, bildete. Tabelle 6

Beispiel 12:

Reaktivität von GA-behandelter CMS mit α-Amylase (Nasses System)

Die mit Glucoamylase behandelte carboxylmethylierte Stärke, erhalten gemäß Beispiel 9, und die nicht mit Glucoamylase behandelte carboaylmethylierte Stärke des Vergleichsbeispiels wurden getrennt in 5 mM MES-Pufferlösung (pH 6,0, enthaltend 0,5% Block Ace (hergestellt von Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) und 68 um CaCl&sub2;) unter Bildung von 0,2%igen (Gew./Vol.) Dispersionen dispergiert. Die 0,2%igen CMS-Dispersionen, 7 ml im Volumen, und 70 ul einer α-Amylaselösung mit unterschiedlicher Konzentration wurden mehrmals dazu gegeben und zusammen bei 37ºC während 60 Minuten bei 120 UpM zur Induzierung einer Reaktion geschüttelt. Die darauffolgend erhaltenen Reaktionslösungen wurden mit 70 ul 10%iger Phosphorsäure vereinigt und zur Beendigung der Reaktion in Eis gekühlt. Die entstehenden Reaktionslösungen wurden bei 12.000 UpM zur Bewirkung der Abtrennung der unveränderten CMS zentrifugiert. Einhundert (100) ul des Überstands des Zentrifugierens, enthaltend die gebildete Glucose, wurden zu 3 ml einer Reaktionslösung B der folgenden Zusammensetzung gegeben, und sie wurden zusammen bei 37ºC während 30 Minuten bei 120 UpM geschüttelt, um eine Farbreaktion zu induzieren. Die entstehenden Reaktionslösungen wurden auf ihre Absorption bei einer Wellenlänge von 727 nm untersucht. Die relevanten Eichkurven wurden hergestellt, indem 100 ul einer Glucoselösung bekannter Konzentration zu 3 ml Reaktionslösung B gegeben wurden und die entstehenden Gemische der gleichen Farbreaktion unterworfen wurden. Eine graphische Darstellung wurde erhalten, wenn die Gehalte der Oligosaccharide, die gebildet wurden, auf der Grundlage der Eichkurven dargestellt wurden (Fig. 7).

Reaktionslösung B

Leuko-Farbstoff (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)diphenylaminnatriumsalz)(Wako Junyaku K. K. Produktcode: "DA-64") 3,9 mg
Glucoamylase 180 Einheiten (Toyobo K. K., Produktcode: "GLA-111") 3,9 mg
Glucoseoxidase (Toyobo K. K: Produktcode: "GLO-501") 139 Einheiten
Peroxidase 1 (Toyobo K. K: Produktcode: "PEO-301") 15 Einheiten
100 mM MES-Pufferlösung (pH 6,0) 100 ml
Wie in Fig. 7 gezeigt, zeigt die CM-Stärke, die vorab mit Glucoamylase behandelt wurde, eine Reaktivität gegenüber α-Amylase (ein Enzym des Endo-Reaktionstyps) (die Neigung der Eichkurve im Diagramm) von ungefähr der Hälfte von der der CM-Stärke, die nicht vorab behandelt wurde. Während der Hintergrundwert der nichtbehandelten CMS etwa 1,3 ppm betrug, betrug der der GA-behandelten CMS ungefähr 0.
Die Tatsache, dass der Gehalt an Oligosaccharid, gebildet aus der nichtbehandelten CMS, nicht null war, während der Gehalt an α-Amylase null war, kann durch die folgende Annahme erläutert werden. Die vertikale Achse der Werte der Fig. 7 ist ein Maßstab für das gebildete Oligosaecharid, jedoch wurde in dem Reaktionssystem dieses Beispiels die Menge an schließlich gebildeter Glucose analysiert. Obgleich die Rückstände von CMS CM-Stärke, die nach der Reaktion mit der α-Amylase verblieben, durch Zentrifugieren entfernt wurden, überlebten geringe Mengen an CMS-Teilchen in den Überständen. Wenn die geringen Mengen an CMS- Teilchen sich mit den Überständen vermischen, welche als Oligosaccharid gesammelt wurden, sind die CMS-Teilchen ebenfalls dem Angriff durch Glucoamylase, die in der Farbreaktionslösung B enthalten ist, ausgesetzt. In der nichtbehandelten CMS wurde, da die terminale Glucose nicht entfernt wurde, die terminale Glucose durch Glucoamylase hydrolysiert und anschließend nachgewiesen. Da die Mengen an terminaler Glucose, die so nachgewiesen wurde, nicht von der Mengen an α-Amylase, die verwendet wurde, abhing, sondern fast konstant war, wurde die gesamte Eichkurve als Hintergrundwert in Fig. 7 erhöht.
Im Gegensatz dazu zeigt die CM-Stärke, die vorab mit der Glucoamylase behandelt wurde, kein nichtmodifiziertes Glucoseende, das mit Glucoamylase reagieren könnte, welches ein Enzym des exo-aktiven Typs ist. Selbst wenn die CMS- Teilchen sich mit dem Farbreaktionssystem vermischten, verursachten sie keinen Hintergrundwert.
Die Tatsache, dass die Reaktivität der CM-Stärke mit α- Amylase durch Behandlung mit Glucoamylase erniedrigt wird, kann logischerweise durch die folgende Annahme erläutert werden. Die α-Amylase zeigt eine Reaktivität gegenüber Polysacchariden mit nicht weniger als vier Molekülen Glucosekettenlänge. Diese Reaktivität erhöht sich entsprechend, wie sich der Grad der Polymerisation erhöht (die Kettenlänge wird größer).
Wenn die Glucoseeinheit in der Zuckerkette beliebig carboxylmethyliert ist, sinkt der Teil, der durch kontinuierliche Glucosemoleküle gebildet wird, in denen die α-Amylase eine hohe Reaktivität zeigt, unvermeidlich ab. Als Ergebnis erniedrigt sich inhärent die Reaktivität davon gegenüber α-Amylase, wenn sie carboxylmethyliert ist. Wenn die CM-Stärke weiter mit Glucoamylase behandelt wird, werden die verzweigten Ketten der CM-Stärke stark durch Zersetzung von dem nichtreduzierenden Ende entfernt. Wenn CM- Stellen halbwegs längs der Längen der verzweigten Ketten vorhanden sind, werden sie hydrolysiert und durch Glucoseeinheiten vom nichtreduzierenden Ende bis zu den Stellen entfernt. Als Ergebnis wird die CM-Stärke, die mit Glucoamylase behandelt wird, in eine Art von beschränkten Dextrinen überführt, und der Teil, der durch aneinander gereihte Glucosemoleküle, gegenüber denen die α-Amylase eine hohe Reaktivität zeigt, gebildet wird, wird offensichtlich weiter verringert. Fig. 7 zeigt diese Tatsache.
Obgleich die vorab mit Glucoamylase behandelte CM-Stärke eine zu α-Amylase verringerte Reaktivität hat, zeigt sie in dem trockenen Analysenelement eine erhöhte Rektivität zu α-Amylase, was in den Beispielen 13 und 14, die folgen, erläutert wird.

Beispiel 13:

Reaktivität der GA-behandelten CMS mit α-Amylase (trockenes System)

Ein mehrschichtiges Analysenelement, identisch mit der Konstruktion von dem von Beispiel 5, wurde hergestellt, indem das Verfahren von Beispiel 5 getreu wiederholt wurde, wobei jedoch die glucoamylasebehandelte CM-Stärke, erhalten gemäß Beispiel 9, verwendet wurde.
Spezifisch wurden Objektträger, identisch in ihrer Konstruktion zu solchen von Beispiel 2, hergestellt, indem das Verfahren von Beispiel 2 wiederholt wurde, wobei die in Beispiel 9 erhaltene glucoamylasebehandelte CM-Stärke als Substratschicht anstelle der carboxylmethylierten Stärke, die in Beispiel 2 eingesetzt wurde, verwendet wurde. Danach wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 5 auf die gestrickten Trikottuchschicht, die sowohl als Substratschicht als auch als Ausbreitungsschicht diente, eine Ethanollösung des amylasemarkierten CRP-IgG als Schicht aufgetragen und in einer Bedeckung von 3 mg/m² imprägniert und dann getrocknet, wobei ein mehrschichtiger Immunoassay-Objektträger 5 für die Analyse von CRP erhalten wurde (Beispiel 13).
Als Vergleichsbeispiel wurde ein Objektträger 6, identisch mit der Konstruktion von dem von Beispiel 13, hergestellt, wobei das Verfahren von Beispiel 13 wiederholt wurde, während eine nichtbehandelte carboxylmethylierte Stärke als Substrat anstelle der glucoamylasebehandelten carboxylmethylierten Stärke verwendet wurde.

Beispiel 14:

Auf den Objektträger 5 und den Objektträger 6 wurden 10 ul von je 50 mM Glycerophosphoratpufferlösung (pH 7), enthaltend CRP in unterschiedlichen Konzentrationen von 1, 1,4, 4,2 und 10 mg/dl aufgetüpfelt. Die Objektträger wurden bei 37ºC gehalten, und dann wurde im Lauf der Zeit von der Trägerseite aus die reflektierte optische Dichte bei einer Wellenlänge von 625 nm gemessen. Die Änderungen im Lauf der Zeit der reflektierten optischen Dichte nach dem Auftüpfeln der CRP-Lösung sind in Fig. 8 dargestellt.
Wenn die CRP-Lösung mit 0 mg/dl aufgetüpfelt wird, wird die hydrolytische Aktivität mit CM-Stärke, einem nichtdiffundierbaren Substrat, maximal, da die α-Amylase in dem markierten Antikörper keiner sterischen Hinderung, bedingt durch die Bindung mit dem Antigen (CRP) unterworfen ist. Die Aktivität, die bei der CRP-Konzentration von 0 mg/dl existiert, bei der die α-Amylase die höchste Aktivität zeigt, war bemerkenswert höher auf dem Objektträger 5 (Beispiel 14, die rechte Seite der Fig. 8), wobei GAbehandelte CMS verwendet wurde, verglichen mit dem Vergleichsbeispiel (Objektträger 6, wobei nichtbehandelte CMS verwendet wurde, auf der linken Seite von Fig. 8). Aufgrund des Index der Neigung, der Änderung im Lauf der Zeit der reflektierten optischen Dichte, zeigte die CM-Stärke, die vorab mit Glucoamylase behandelt wurde, eine doppelt so hohe Reaktivität mit α-Amylase, wie die nichtbehandelte CM-Stärke.
Wenn die sterische Hinderung gegenüber α-Amylase in der Intensität mit dem Gehalt von CRP, einem Antigen, zunahm, war der Abfall der Reaktivität mit α-Amylase auf dem Objektträger 5 auffällig (Beispiel 14, rechte Seite der Fig. 8) bei der Verwendung von GA-behandeltem CMS. Diese Tatsache zeigt an, dass bedingt durch die Reaktitivät der α- Amylase mit der CM-Stärke in dem trockenen Assayelement die Änderung der reflektierten optischen Dichte relativ mit der Änderung der CRP-Konzentration zunimmt, und dass die Empfindlichkeit durch Behandlung der Stärke vorab mit Glucoamylase verstärkt wird, und dass diese somit für die enzymatische Reaktion des endo-aktiven Typs spezifisch gemacht wird.

Claims

1. Immunoassay-Element für die quantitative Analyse eines Antigens durch Bestimmung der Änderung in der enzymatischen Aktivität, verursacht durch irgendeine

1) Reaktion zwischen dem Antigen und einem enzymmarkierten Antikörper;

2) Reaktion zwischen dem Antigen, einem Antikörper und einem enzymmarkierten Antigen; und

3) Reaktion zwischen dem Antigen, einem enzymmarkierten Antikörper und einem Konjugat des Antigens mit einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht, wobei das Konjugat ein Molekulargewicht von weniger als 20.000 Dalton besitzt;

wobei das Element eine Substratschicht, enthaltend ein nichtdiffundierbares Substrat, welches ein diffundierbares Material in Anwesenheit des Markierungsenzyms bildet, und eine Reagensschicht, enthaltend ein Fragmentierungsenzym für die weitere Fragmentierung des diffundierbaren Materials in ein Produkt mit niedrigerem Molekulargewicht, umfasst;

dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsenzym α-Amylase ist, das Fragmentierungsenzym Glucoamylase oder α-Glucosidase ist und das nichtdiffundierbare Substrat carboxylmethylierte Stärke ist, die beschränkt vorab mit einer exo-aktiven Glucosidase von der Stelle der nichtreduzierenden terminalen Glucose bis zur Stelle der carboxylmethylmodifizierten Glucose-Einheit oder der Glucose-Kettenverzweigungsstelle abgebaut wurde, so dass das nichtdiffundierbare Substrat nur mit dem Markierungsenzym reagiert und eine Reaktion mit dem Fragmentierungsenzym vermieden wird.

2. Immunoassay-Element nach Anspruch 1, wobei die Reagensschicht aus einer Schicht gebildet ist, die ein hydrophiles Polymer als Bindemittel enthält.

3. Immunoassay-Element nach Anspruch 1, wobei die Substratschicht eine poröse Schicht ist, die aus einem porösen Medium gebildet ist.

4. Immunoassay-Element nach Anspruch 1, wobei der enzymmarkierte Antikörper in der Substratschicht oder einer Schicht, die auf der Substratschicht liegt, enthalten ist.

5. Immunoassay-Element nach Anspruch 1, wobei der Antikörper in der Substratschicht oder einer Schicht, die auf der Substratschicht liegt, enthalten ist.

6. Immunoassay-Element nach Anspruch 1, wobei das enzymmarkierte Antigen in der Substratschicht oder einer Schicht, die auf der Substratschicht liegt, enthalten ist.

7. Immunoassay-Element nach Anspruch 1, wobei der Antikörper und das enzymmarkierte Antigen in der Substratschicht oder einer Schicht, die auf der Substratschicht liegt, enthalten sind.

8. Immunoassay-Element nach Anspruch 1, wobei das Konjugat aus dem Antigen mit der Verbindung mit hohem Molekulargewicht und der enzymmarkierte Antikörper in der Substratschicht oder einer Schicht, die auf der Substratschicht liegt, enthalten sind.

9. Immunoassay-Element nach Anspruch 1, welches weiter eine Reagenszusammensetzung für die Reaktion mit dem Produkt mit niedrigem Molekulargewicht unter Bildung eines Farbstoffs mit einem Absorptionspeak im sichtbaren Wellenlängenbereich umfasst, und die in der Reagensschicht oder einer anderen wasserpermeablen Schicht enthalten ist.

10. Immunoassay-Element nach Anspruch 9, wobei die Reagenszusammensetzung einen Leuko-Farbstoff enthält, der sich bei der Oxidation färbt.

11. Immunoassay-Element nach Anspruch 10, wobei die Reagensschicht ein hydrophiles Bindemittel enthält, und die Reagenszusammensetzung eine Dispersion einer Lösung eines Leuko-Farbstoffs in einem in Wasser unlöslichen Lösungsmittel in dem hydrophilen Bindemittel enthält.

12. Immunoassay-Element nach Anspruch 11, wobei die Reagenszusammensetzung eine Peroxidase und den Leuko- Farbstoff enthält.

13. Immunoassay-Element für die quantitative Analyse eines Antikörpers durch Bestimmung der Änderung in der enzymatischen Aktivität, verursacht durch eine Reaktion zwischen dem Antikörper und einem enzymmarkierten Antigen, oder eine Reaktion zwischen dem Antikörper, einem Antigen und einem enzymmarkierten Antikörper, wobei das Element eine Substratschicht, enthaltend ein nichtdiffundierbares Substrat, das ein diffusionsfähiges Material in Anwesenheit eines Markierungsenzyms bildet, und eine Reagensschicht, enthaltend ein Fragmentierungsenzym für die weitere Fragmentierung des diffusionsfähigen Materials in ein Produkt mit niedrigem Molekulargewicht umfasst,

dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsenzym α-Amylase ist, das Fragmentierungsenzym Glucoamylase oder α-Glucosidase ist, und das nichtdiffundierbare Substrat carboxylmethylierte Stärke ist, die vorab beschränkt mit einer exo-aktiven Glucosidase von der Stelle der nichtreduzierenden terminalen Glucose bis zur Stelle der carboxylmethylmodifizierten Glucose-Einheit oder der Glucose-Verzweigungskette abgebaut wurde, so dass das nichtdiffundierbare Substrat nur mit dem Markierungsenzym reagiert und eine Reaktion mit dem Fragmentierungsenzym vermieden wird.

14. Immunoassay-Element nach Anspruch 13, wobei die Reagensschicht aus einer Schicht gebildet ist, die ein hydrophiles Polymer als Bindemittel enthält.

15. Immunoassay-Element nach Anspruch 13, wobei die Substratschicht eine poröse Schicht ist, die auf einem porösen Medium gebildet ist.

16. Immunoassay-Element nach Anspruch 13, wobei der enzymmarkierte Antikörper in der Substratschicht oder einer Schicht, die auf der Substratschicht liegt, enthalten ist.

17. Immunoassay-Element nach Anspruch 13, wobei der Antikörper in der Substratschicht oder einer Schicht, die auf der Substratschicht liegt, enthalten ist.

18. Immunoassay-Element nach Anspruch 13, wobei das enzymmarkierte Antigen in der Substratschicht oder einer Schicht, die auf der Substratschicht liegt, enthalten ist.

19. Immunoassay-Element nach Anspruch 13, wobei der Antikörper und das enzymmarkierte Antigen in der Substratschicht oder einer Schicht, die auf der Substratschicht liegt, enthalten sind.

20. Immunoassay-Element nach Anspruch 13, umfassend weiter eine Reagenszusammensetzung, für die Reaktion mit dem Produkt mit niedrigem Molekulargewicht unter Bildung eines Farbstoffs mit einem Absorptionspeak im sichtbaren Wellenlängenbereich und die in der Reagensschicht oder einer anderen wasserpermeablen Schicht enthalten ist.

21. Immunoassay-Element nach Anspruch 20, wobei die Reagenszusammensetzung einen Leuko-Farbstoff enthält, der sich bei der Oxidation färbt.

22. Immunoassay-Element nach Anspruch 21, wobei die Reagensschicht ein hydrophiles Bindemittel enthält und die Reagenszusammensetzung eine Dispersion einer Lösung eines Leuko-Farbstoffs in einem wasserunlöslichen Lösungsmittel in dem hydrophilen Bindemittel enthält.

23. Immunoassay-Element nach Anspruch 22, wobei die Reagenszusammensetzung eine Peroxidase und den Leuko- Farbstoff enthält.