DE69803443T2

DE69803443T2 - Verfahren zur isolierung, detektion oder quantifizierung eines analyten in einem medium

Info

Publication number: DE69803443T2
Application number: DE69803443T
Authority: DE
Inventors: Bernard Mandrand; Agnes Perrin; Alain Theretz
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1997-01-30
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2002-09-05
Anticipated expiration: 2018-01-31
Also published as: FR2758884B1; EP0965045A1; WO1998034116A1; ATE211824T1; JP4053092B2; JP2001510565A; AU6104598A; EP0965045B1; DE69803443D1; FR2758884A1; CA2280187A1; US6342396B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von zumindest einem Analyten in einem flüssigen Medium, in welchem letzterer verteilt ist.
Unter "isolieren" oder "Isolierung" wird allgemein jede Technik verstanden, die es ermöglicht, den Analyten abzutrennen, oder auch eine solche, die es ermöglicht, jedes flüssige Gemenge, das den Analyten enthält, bezüglich dieses Analyten anzureichern oder zu konzentrieren. Es wird darunter jedoch auch, eventuell zusammen mit der vorstehenden Definition, jede Technik verstanden, die es ermöglicht, den Analyten ausgehend von dem flüssigen Medium, das diesen enthält, im Sinne einer Detektion und/oder Quantifizierung desselben zu bestimmen.
Unter "Analyt" wird jedes zu isolierende Gebilde, insbesondere biologische Gebilde, verstanden. Aus der Reihe der nachstehend durch die vorliegende Erfindung in Erwägung gezogenen Analyten sind Zellen zu nennen, Organellen, Viren und Bakterien, Antikörper, Antikörperfragmente, Antigene, Haptene, Lektine, Zucker, Ribo-, Deoxyribonukleinsäuren, Proteine, insbesondere Protein A oder Protein G, Hormone, Hormonrezeptoren, Biotin, Avidin, Streptavidin, und im allgemeinen alle zu bestimmenden, d. h. zu detektierende und/oder zu quantifizierende natürlichen oder synthetischen Moleküle oder Makromoleküle, oder Analoge.
Gemäß Dokument FR-A-2 679 660 ist ein Verfahren zum Isolieren von zumindest einem Analyten bekannt, nämlich eines entweder freien oder an die Oberfläche einer Zelle gebundenen Antigens, oder eines Antikörpers, der gegen ein zelluläres oder Gewebeantigen gerichtet ist, beispielsweise einen antierythrocytären Antikörper.
Nach dem Verfahren der FR-A-2 679 660 wird zumindest ein Reagenz bereitgestellt, das einerseits einen freien Träger von diskreter Form aufweist, in diesem Fall relativ große Magnetpartikel, die durch ein Polymer gebildet werden, das Ferritkörner verkapselt, und das andererseits einen Rezeptor des Analyten aufweist, nämlich einen Antikörper oder ein Antigen oder eine Erkennungssubstanz, beispielsweise einen humanen Anti- Immunoglobulin-Antikörper.
Es wird auch ein weiterer Träger bereitgestellt, nämlich zum Einfangen, der durch die Wand eines Behälters oder Bechers gebildet wird, und dessen zugängliche Oberfläche zumindest einen geeigneten oder aktiven Bereich von begrenzter Oberfläche aufweist, wobei dieser zumindest einen weiteren Rezeptor für ein einzufangendes Gebilde, nämlich den Analyten oder den Rezeptor, aufweist. Dieser weitere Rezeptor ist entweder ein Antikörper oder ein beispielsweise erythrocytäres Antigen.
In jedem Fall wird nach dem Verfahren die zugängliche Oberfläche des weiteren Trägers mit dem Analyten in Kontakt gebracht, der in einer flüssigen Probe enthalten ist, um den Analyten an die zugängliche Oberfläche zu binden und um diesen in Form einer Ablagerung auf dieser Oberfläche zusammen zu bringen, wobei der Analyt auf dem weiteren Träger über den weiteren Rezeptor immobilisiert ist.
Anschließend wird zum Zwecke des Nachweisens das Reagenz mit dem immobilisierten Analyt in Kontakt gebracht, um mit dem letzteren eine ebenfalls auf dem weiteren Träger immobilisierte Verbindung zu erhalten, was die Isolierung und Bestimmung des Analyten ermöglicht.
Ein wie zuvor definiertes Verfahren wird also mit einem Reagenz durchgeführt, das durch einen Träger von diskreter Form gebildet ist, an den zumindest ein Ligand gebunden ist, der einen Rezeptor des Analyten bildet.
Diese Partikel sind vorzugsweise magnetisch. Sie können in zwei Kategorien eingeordnet werden, und zwar in Partikel von relativ großem Durchmesser, beispielsweise im Bereich von einem oder mehreren Mikrometern, und in solche mit einem relativ kleinen Durchmesser, beispielsweise im Bereich von einigen Dutzenden Nanometern und von kolloidalem Zustand.
Wenn die magnetischen Partikel von relativ großem Durchmesser in ein Magnetfeld gebracht werden, bewegen sich diese in die Richtung der Stelle, an der das Feld am stärksten ist, und dies erfolgt mit einer Geschwindigkeit, die ausreichend ist, um aus deren Medium durch dieses Mittel abgetrennt zu werden.
Es können beispielsweise Partikel zitiert werden, die in Dokument EP-A-0 125 995 beschrieben sind. Sie werden durch Ausfällung von eisenhaltigen Salzen und Eisensalzen in basischem Medium, gefolgt von einer Silanisierungsreaktion in Methanol, erhalten. Ihr Enddurchmesser liegt bei 0,1 bis 1,5 um und ihre Dichte bei 2,5 g/cm³. Gleichermaßen werden die Partikel, die in den Dokumenten EP-A-0 106 873, EP-A-0 585 868 und US-C- 5,356,713 beschrieben werden, über verschiedene Polymerisationsverfahren erhalten, oder auch jene, die in dem Dokument US- C-4,297,337 beschrieben werden, bei denen eine poröse Glasmatrize verwendet wird, in der magnetische Pigmente dispergiert sind. Auch andere Patente beschreiben die Verwendung von Partikeln geringerer Größen, die jedoch bewußt aggregiert sind, um die magnetische Masse zu verstärken, wie dies in dem Dokument US-C-5,169,754 beschrieben ist. Der Artikel von P. A. Ris en et al., Protein Expression and Purification, 6 (1995), 272-277, beschreibt außerdem magnetische Gele.
Werden diese relativ großen Partikel in ein Magnetfeld gebracht, so bewegen sich sämtliche in Richtung der Stelle, an der das Feld am stärksten ist. Es kann ein einfacher Permanentmagnet oder entsprechende Aufbauten verwendet werden, wie diese beispielsweise in dem Dokument EP-A-0 317 286 oder US-C-565 665 beschrieben sind. Solche Partikel werden für gewöhnlich für die Abtrennung von Zellen oder von Molekülen sowie in solchen Immunoassays benutzt, die in dem Dokument EP-A-0 528 708 beschrieben sind, sie werden jedoch nicht als Detektions- und Quantifizierungssystem verwendet.
Darüber hinaus bewirkt deren Durchmesser und deren Dichte, daß sie unter dem Einfluß der Schwerkraft sehr schnell sedimentieren, was es schwierig macht, sie in Anbetracht der erforderlichen Bewegung oder aufgrund der Inhomogenität der Lösungen, die auf die Ausbildung eines Konzentrationsgradienten zurückzuführen ist, zu verwenden.
Zusammenfassend ist zu sagen, daß die relativ großen Partikel heikel in ihrer Anwendung, und für die Bestimmung eines Analyten wenig angepaßt sind.
Die magnetischen Partikel von relativ geringem Durchmesser werden durch einen einfachen Permanentmagneten innerhalb einer vernünftigen Zeit praktisch nicht angezogen: Diese Partikel werden insbesondere häufig für die magnetische Abtrennung von Zellen verwendet. Diese Partikel sind dem Fachmann unter der Bezeichnung "superparamagnetische" Partikel bekannt. Unter "superparamagnetischen" Partikeln versteht man Partikel, deren Durchmesser zu gering ist, um aus mehreren magnetischen Domänen zu bestehen. Sie sind durch eine starke Magnetempfindlichkeit und eine Magnetisierung mit großer Sättigung, jedoch durch keine oder sehr schwache magnetische Remanenz charakterisiert. Diese Partikel werden insbesondere häufig für die magnetische Zelltrennung verwendet. Beispielsweise werden jene, die in dem Dokument US-C-4,230,685 beschrieben sind, durch Emulsion eines Gemenges aus Albumin, Protein A und Fe&sub3;O&sub4;-Partikeln mit einem Durchmessers von 15-20 nm erhalten, und können über den Vermittler des Proteins A Antikörper immobilisieren. Das Dokument US-C-4,452,773 beschreibt einen weiteren Typ von Partikeln, die durch Ausfällen von eisenhaltigen Salzen und Eisensalzen in basischem Milieu und in Gegenwart eines Polysaccharids erhalten werden. Diese Partikel können Antikörper, Oligonukleotide, Lektine oder andere Biomoleküle über Kopplung auf das Polysaccharid mittels bekannter Pfropfverfahren immobilisieren. Ihre Verwendung ist häufig übernommen worden, wie auch in den Dokumenten US-C-5,543,289 oder WO-A-88/00060, oder sie sind in besonderen Anwendungen eingesetzt worden, wie in denen, die in den Dokumenten FR-A-2 710 410 und FR-A-2 732 116 beschrieben sind.
Das Dokument US-C-4,795,698 beschreibt eine Modifizierung des Verfahrens von Molday, in dem beispielsweise das Polysaccharid durch ein anderes Proteinnaturpolymer ersetzt ist. Die an der Oberfläche der Partikel vorhandenen Proteine können so der späteren Immobilisierung von Antikörpern über dem Fachmann bekannte Kopplungsverfahren dienen.
Diese Partikel erfordern die Verwendung von besonderen Vorrichtungen, die es ermöglichen, den Gradienten des Magnetfeldes lokal zu erhöhen. Diese Technik ist dem Fachmann unter der Bezeichnung HGMS (für High Gradient Magnetic Separation) bekannt und sie ist z. B. durch die WO 96/09409 beschrieben. Sie verwendet eine Vorrichtung, die beispielsweise aus einem Behälter besteht, der eine Matrize von Fasern oder Metallkörnern enthält. In ein externes Magnetfeld gebracht ermöglicht es diese Vorrichtung, gerade an der Oberfläche der Fasern einen sehr großen Feldgradienten zu erhalten. Sogar superparamagnetische Partikel von geringer Größe können auf einer solchen Vorrichtung zurückgehalten werden, sofern das Fasernetz ausreichend eng gestaltet ist und sofern die Strecke eines Partikels in der Nähe der Matrize liegt. Solche Vorrichtungen werden beispielsweise in den Dokumenten US-C-4,375,407, US-C-5,543,289, WO-A- 96/26782, WO-A-96/26011 oder US-C-5,186,827 und in Publikationen wie jener von B. L. Hirschbein et al. (CHEMTECH, März 1982, S. 172-179) beschrieben. Solche Vorrichtungen lassen sich ebenfalls im Handel finden, beispielsweise bei Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Deutschland) unter der Bezeichnung MACS- Säule.
Diese Verfahren sind für die Abtrennung und Konzentrierung von biologischen Zellen von ihrem wäßrigen Milieu üblich und sogar vertrieben worden. In solchen Anwendungen können in der Tat mehrere tausend Partikel über spezifische molekulare Erkennungsreaktionen mit nur einer Zelle reagieren, wodurch es ermöglicht wird, dieses Element abzutrennen, indem dessen magnetische Masse erhöht wird. Andererseits können die Partikel in Anbetracht ihrer geringen Ausmaße nur mit einer sehr begrenzten Anzahl von in Lösung dispergierten Molekülen spezifisch reagieren. Sie verbleiben folglich in diskreter Form und werden aus diesem Grund für die Abtrennung, Konzentrierung oder Anreicherung eines Analyten nicht verwendet.
Des weiteren werden die Partikel nach der Abtrennung in den späteren Schritten sämtlicher Verfahren eher als Störfaktor angesehen. In dem Dokument US-C-4,018,886 werden sie sogar entfernt. Das Dokument FR-A-2 710 410 nutzt die Anwesenheit von superparamagnetischen Partikeln von geringer Größe als Nachweiselemente, die es ermöglichen, eine molekulare Erkennungsreaktion zu quantifizieren. In diesem Fall ist das verwendete Prinzip eine Agglutinationsreaktion, die zu der Ausbildung eines Aggregates führt. Des weiteren werden die Partikel nicht als Konzentrierungs- oder Abtrennungsmittel für das abzutrennende Element verwendet, sondern nur als Detektionsmittel.
Zusammenfassend ist zu sagen, daß die relativ kleinen Magnetpartikel wenig an Verfahren zur Abtrennung, Anreicherung oder Konzentrierung in traditionellen Verfahren, insbesondere Immunoassays, angepaßt sind.
Das Dokument WO-A-9609409 beschreibt die Verwendung des sogenannten MACS-Verfahrens (Magnetic Cell Sorting), welches die Ausbildung eines Komplexes zwischen einem Analyten und einem Reagens einschließt, welches magnetische Partikel aufweist, um den Analyten, im vorliegenden Fall fötale Erythrozyten, anzureichern/zu konzentrieren. Diese Zellen werden anschließend mittels Durchflußzytometrie analysiert oder als Quelle genetischen Materials verwendet, jedoch ohne daß diese durch eine Verbindung zwischen dem Analyten und beispielsweise einem Rezeptor auf einem Träger immobilisiert sind.
Das Dokument DE-A-40 36 288 beschreibt ein Verfahren, das es ermöglicht, einen oder mehrere Analyten zu detektieren und zu quantifizieren, die spezifisch an Partikel gebunden sind, die erkannt werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, das es ermöglicht, ausgehend von einem flüssigen Medium einen Analyten zu isolieren, der in diesem Medium äußerst stark verdünnt oder wenig konzentriert vorliegt. Insbesondere handelt es sich um die Bestimmung des Analyten, wobei die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Gegenstand hat, das eine hohe Detektions- und/oder Quantifizierungsempfindlichkeit ermöglicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ganz allgemein:
- das Reagenz mit einer flüssigen Probe, welche aus dem den Analyten enthaltenden Medium gewonnen wird, zur Bildung eines Zwischenmediums in Kontakt gebracht, das, nach wie vor in diskreter Form und in dem Medium verteilt, einen Komplex zwischen dem Träger, dem Rezeptor und dem Analyten enthält,
- die zugängliche Oberfläche des weiteren Trägers mit zumindest einem zu fangenden Partner, nämlich dem Reagenz, in Kontakt gebracht wird, das beim vorherigen Schritt nicht reagiert hat, oder dem Komplex, um den zu fangenden Partner an die zugängliche Oberfläche zu binden, und um eine konzentrierte Ablagerung in dem geeigneten Bereich zu erzielen, wobei diese auf dem weiteren Träger durch die Bindung zwischen dem weiteren Rezeptor mit dem Rezeptor oder dem Analyten immobilisiert ist,
- die Ablagerung des zu fangenden Partners in dem geeigneten Bereich konzentriert wird, um die Menge des genannten Partners pro Flächeneinheit in dem geeigneten Bereich zu erhöhen.
Es können mehrere Arten der Konzentrierung der Ablagerung, und zwar vor oder beim Einfangen, um diese mit der zugänglichen Oberfläche des weiteren Trägers in Kontakt zu bringen, in Frage kommen.
Die Ablagerung des zu fangenden Partners wird konzentriert, indem aus dem Zwischenmedium eine weitere Probe gewonnen wird, die bezüglich des zu fangenden Partners angereichert ist; und diese weitere Probe wird mit der zugänglichen Oberfläche in Kontakt gebracht.
Es wird ein den zu fangenden Partner enthaltender flüssiger Strom von begrenztem und an die zugängliche Oberfläche angepaßtem Querschnitt errichtet, und der Strom wird mit der zugänglichen Oberfläche in Kontakt gebracht.
Es wird ein den zu fangenden Partner enthaltender flüssiger Strom errichtet, und der Strom wird mit der zugänglichen Oberfläche in Kontakt gebracht, anschließend in Kontakt stehend mit der Oberfläche zu dieser zurückgeführt.
Vor der Beschreibung der Erfindung sollen die verwendeten Begriffe definiert werden.
Unter "Ligand" wird ein Element verstanden, das in der Lage ist, über eine chemische oder physikalische Bindung einen Komplex mit einem Analyten auszubilden.
Als Beispiel für einen Liganden können Antikörper, Antikörperfragmente, Antigene, Haptene, Lektine, Zucker, Ribo- und Desoxyribonukleinsäuren, Proteine, insbesondere Protein A oder Protein G, Hormone, Hormonrezeptoren, Biotin, Avidin oder Streptavidin und im allgemeinen natürliche oder synthetische Liganden und Analoge modifizierter Liganden, die mit den Liganden kompetitieren können, genannt werden.
Unter "Rezeptor" wird jeder wie zuvor definierte Ligand verstanden, der auf einem Träger durch irgendein Mittel, wie Adsorption, Kovalenz, Chelierung, oder molekulare Erkennung immobilisiert ist, und der in der Lage ist, allein oder an einem weiteren Liganden konjugiert, einen Analyten zurückzuhalten.
Unter "Träger" wird jeder polymere, anorganische oder metallische Träger verstanden. Als Beispiel für polymere Träger können Kunststoffträger auf der Basis von Polystyrol, Poly(meth)acrylaten, Polybutadien, Polypropylen oder anderem genannt werden, und zwar allein oder in Form von Copolymeren. Als Beispiel für anorganische Träger können Kieselerdeoxide, Silizium, Glimmer, Glas, Quarz, genannt werden. Als Beispiel für metallische Träger können Gold, Silber, Titanoxid, Vanadiumoxid genannt werden.
Die Immobilisierung der Liganden auf dem Träger kann entweder durch einfache Adsorption auf den nativen oder modifizierten Träger erfolgen, oder über eine chemische oder physikalische Reaktion, die es ermöglicht, die Oberfläche des Trägers zu modifizieren, und so die Fixierung des Rezeptors durch kovalente Bindungen zu ermöglichen, oder durch andere traditionelle Mittel, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Unter "begrenzter Oberfläche" wird jede Oberfläche verstanden, die über chemische oder physikalische Mittel erhalten wird, die darauf abzielen, eine Oberfläche von bestimmter Größe zu verkleinern, beispielsweise durch ein Zerschneiden in kleinere Elemente, oder mittels einer Abdeckung durch eine "Maske", die die anfängliche Oberfläche durch die inneren Umrisse der Maske begrenzt, oder durch chemische Mittel zur Aufteilung entsprechend einer kleineren Oberfläche, wie in Kumar A. et al. (Langmuir (1994), 10, 1498-1511) beschrieben. Die Verkleinerung der Oberfläche des geeigneten oder aktiven Bereichs ist hinsichtlich der Größe nicht begrenzt. Verfahren, die aus den Mikrotechnologien stammen, ermöglichen es, beispielsweise Oberflächen zu erhalten, die auf mikro- oder nanoskopischen Größen begrenzt sind, sowie Mikro- oder Nanovolumina von Flüssigkeiten in den geeigneten Bereich der begrenzten Oberfläche zu geben und/oder zu befördern.
In der nachfolgenden Beschreibung ist der Begriff "Konjugat" für das Gebilde vorgesehen, das durch Immobilisierung zwischen dem Liganden und dem Träger des Reagenz ausgebildet wird. Der Begriff "Komplex" ist für das Gebilde vorgesehen, das sich zwischen dem prinzipiell konjugierten Reagenz und dem Analyten ausbildet. Selbst wenn es sich um einen Träger handelt, der zu einem Teil zu dem Reagenz oder zu dem eigentlichen Reagenz und dem Komplex gehört, sind jene von diskreter Form und in einem flüssigen Medium verteilt oder dispergiert, und haben folglich die Gestalt von Partikeln.
Die Begriffe "Träger" und "weiterer Träger' geben an, daß es sich um Elemente der im wesentlichen selben Beschaffenheit oder selben Funktion handelt. Der Begriff "Träger" ist für den Träger vorgesehen, der zu dem Reagenz gehört, und der Begriff "weiterer Träger" für den Träger, bei dem zumindest ein Teil der zugänglichen Oberfläche oder ein Fenster einen oder mehrere geeignete Bereiche von begrenzter Oberfläche aufweist.
Die Begriffe "Rezeptor" bzw. "weiterer Rezeptor" sind für die auf dem Träger bzw. dem weiteren Träger immobilisierten Liganden vorgesehen.
Unter "Partikel" wird jeder anorganische oder metallische Partikel eines Polymerträgers verstanden, auf den ein Ligand aufgebracht werden kann. Als unter die vorliegende Erfindung fallend werden insbesondere Partikel in Betracht gezogen, die durch das Einwirken eines äußeren physikalischen Mittels, beispielsweise auf magnetischem oder elektrischem Weg oder über die Wirkung der Schwerkraft oder über Zentrifugation abgetrennt werden können. Aus der vorstehenden Definition geht hervor, daß die Sedimentationsgeschwindigkeit der Partikel von geringer Größe, insbesondere die der superparamagnetischen Partikel, unter Einwirkung der Schwerkraft kleiner ist als die Wärmebewegung, diese Partikel jedoch durch jegliches Verfahren Aggregate bilden können, das es ermöglicht, die Partikel miteinander zu vereinen, oder die Partikel auf größeren Partikeln zu sammeln, die durch irgendein physikalisches Mittel abtrennbar sind.
Als Beispiel von Polymerpartikeln können Partikel genannt werden, die über Polymerisation in einer Emulsion, wie z. B. Latex, erhalten werden oder magnetische oder nicht magnetische Partikel von größerer Größe.
Als Beispiel für metallische Partikel können kolloidales Gold, ferro-, ferri-, para- oder superparamagnetische Partikel genannt werden, die mit natürlichen oder synthetischen Polymeren bedeckt oder nicht bedeckt sind, deren Zusammensetzung Eisen oder andere magnetische oder nicht magnetische Metalle wie Kobalt, Nickel, allein oder in Form von Legierungen, aufweist.
Als Beispiel für anorganische Partikel können magnetische oder nicht magnetische Partikel auf der Basis von Kieselsäureanhydrid oder Silizium, genannt werden.
Als Beispiel für Verfahren zur Abtrennung durch ein äußeres physikalisches Mittel können die Sedimentation durch die Schwerkraft oder durch Zentrifugation, die magnetische Anziehung durch die Einwirkung von Permanentmagneten, Elektromagneten oder durch die Verwendung von Vorrichtungen erwähnt werden, die es ermöglichen, den Gradienten des magnetischen Feldes, die elektrische Anziehung zu erhöhen, und jede weitere äquivalente Technik.
Unter "Bestimmung" wird jedes Verfahren verstanden, das es ermöglicht, das Vorhandensein der in dem geeigneten Bereich der zugänglichen Oberfläche des weiteren Trägers konzentrierten Ablagerung nachzuweisen und/oder zu quantifizieren, nämlich die Partikel des interessierenden spezifischen Produktes, d. h. des Komplexes oder nicht reagierten Reagenzes.
Als Beispiel für ein Bestimmungsverfahren können genannt werden:
- topographische Verfahren, wie die Atomkraftmikroskopie, Profilometrie, ...
- magnetische Verfahren, wie beispielsweise in dem Dokument FR-A-2 710 410 beschrieben, die Magnetkraftmikroskopie und sämtliche Bestimmungsverfahren, die für das Vorliegen von ferro-, ferri-, para- und superparamagnetischen metallischen Elementen empfindlich sind.
- elektrische Verfahren, wie die Messung einer Kapazitätsänderung, beispielsweise beschrieben in dem Dokument EP-A- 90 402 611, die Tunneleffekt-Mikroskopie, Impedanzmessungen, ...
- optische Verfahren, die den Nachweis beispielsweise einer Modifikation der Dicke und/oder des Refraktionsindexes (optisch dünne Schichten, Ellipsometrie, Oberflächenplasmonresonanz, akustische Oberflächenwellen, ...) ermöglichen, oder die die Messung der Lichtstärke ermöglichen (Evaneszente Wellen, Dunkelfeldmikroskopie, Optische Nahfeld-Mikroskopie, ...)
- Verfahren, die die Messung von Massenänderungen ermöglichen (Quarzkristall-Mikrobalance, ...)
- und allgemein sämtlich hier nicht erwähnten, aber äquivalenten Techniken.
Die vorliegende Erfindung kann gemäß der nachstehend definierten Funktionswahl verschiedene Ausführungsformen annehmen.
Im Konzentrierungsschritt wird der Grad der Konzentrierung an zu fangendem Partner bestimmt, damit die Menge des immobilisierten zu fangenden Partners gegenüber der Menge des weiteren Rezeptors auf dem weiteren Träger höchstens gleich bleibt. Zu diesem Zweck weist beispielsweise das Reagenz Trägerpartikel auf, die mit dem Rezeptor konjugiert sind, wobei diese die Eigenschaft haben, daß sie von jeglichem flüssigen Medium, in dem diese dispergiert sind, unter der Wirkung eines physikalischen Mittels, das auf das flüssige Medium einwirkt, abgetrennt zu werden, wobei man das physikalische Mittel auf zumindest einen Teil des Zwischenmediums einwirken läßt, um die Partikelkomplexe abzutrennen, die so abgetrennten Partikelkomplexe ggf. gewaschen werden, und die Partikelkomplexe zurückgewonnen werden, indem die Einwirkung des physikalischen Mittels so eingestellt wird, daß letztlich in dem geeigneten Bereich eine konzentrierte Ablagerung an einzufangendem Partner erhalten wird. Die Trägerpartikel sind beispielsweise magnetisch, insbesondere superparamagnetisch, und das physikalische Mittel besteht aus einem Magnetfeld, das auf das Zwischenmedium einwirkt, beispielsweise gemäß der sogenannten HGMS-Technik (High Gradiant Magnetic Separation).
Der Rezeptor, d. h. jener, der zu dem Reagenz gehört, und der weitere Rezeptor, d. h. jener der zugänglichen Fängeroberfläche, weisen denselben auf dem Träger bzw. dem weiteren Träger immobilisierten Liganden auf.
Wenn das Reagenz mit dem Rezeptor konjugierte Partikel des Trägers aufweist, die die Eigenschaft haben, von jeglichem flüssigen Medium, in dem diese dispergiert sind, unter der Wirkung eines physikalischen Mittels, das auf das flüssige Medium einwirkt, abgetrennt zu werden, dann wird man das physikalische Mittel vorzugsweise in bezug auf den weiteren Träger, d. h. den Fängerträger, einwirken lassen, um die Ablagerung in dem gesamten geeigneten Bereich zu konzentrieren.
In bestimmten Fällen wird das Reagenz markiert und die Behandlung des Analyten weist einen Schritt zur Bestimmung des Markers der in dem geeigneten Bereich des weiteren Trägers, d. h. des Fängerträgers, immobilisierten konzentrierten Ablagerung auf. Klassischerweise wird diese Markierung nach einer der folgenden Methoden erhalten, nämlich:
- der Träger bildet selbst einen Marker; es handelt sich beispielsweise um kolloidales Gold
- der Marker ist an den Träger gebunden
- der Marker ist an den Rezeptor gebunden.
Der Analyt wird ausgehend von der konzentrierten Ablagerung in dem geeigneten Bereich durch jedes Verfahren bestimmt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die topographische Verfahren einschließt, beispielsweise durch Atomkraftmikroskopie (AFM), magnetische Verfahren, beispielsweise durch Magnetkraftmikroskopie, elektrische Verfahren, z. B. durch Messung einer Kapazitätsänderung, optische Verfahren, z. B. durch Messen des Refraktionsindexes, und schließlich Verfahren zur Messung von Massenänderungen, beispielsweise Quarzkristall-Mikrobalance.
Insbesondere ist der geeignete Bereich so dimensioniert, daß die Menge der auf dem weiteren Träger immobilisierten Ablagerung zumindest gleich der Sensibilisierungsschwelle des Bestimmungsverfahrens ist, ausgedrückt als Anzahl von Partikeln pro Oberflächeneinheit.
Die Art des verwendeten Assays ist direkt, in welchem Fall der zu fangende Partner der Komplex aus dem Träger, dem Rezeptor und dem Analyten ist, oder kompetitiv, in welchem Fall der zu fangende Partner das Reagenz ist.
Vorzugsweise wird eine weitere Probe gewonnen, indem das Zwischenmedium bezüglich des Komplexes angereichert wird, und die weitere Probe wird mit der zugänglichen Oberfläche des weiteren Trägers in Kontakt gebracht.
Es kommen verschiedene Methoden des In-Kontakt-Bringens der weiteren Probe mit der zugänglichen Fängeroberfläche in Betracht:
- Aufbringen einer dosierten Menge der weiteren Probe auf die zugängliche Oberfläche des letzteren
- Vorbeiführen eines Stroms der weiteren Probe mit einer relativ geringen Dicke, ggf. wiederholt, in Kontakt zu dieser zugänglichen Oberfläche.
Schließlich kann das flüssige Medium eine Vielzahl von unterschiedlichen Analyten enthalten, wobei dann die zugängliche Fängeroberfläche des weiteren Trägers eine Vielzahl von geeigneten Bereichen aufweist, die eine Vielzahl von jeweils unterschiedlichen weiteren Rezeptoren für entsprechend unterschiedliche zu fangende Partner aufweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf Nukleinmaterial, insbesondere von jedem Bakterium, angewendet werden, im vorliegenden Fall auf ribosomale RNA, in welchem Fall es der erreichte Empfindlichkeitsbereich ermöglicht, jedes enzymatische Amplifizierungsverfahren, wie eine PCR (Polymerase Chain Reaction) zu vermeiden, die auf das genomische Material dieses Bakteriums angewendet wird, um letzteres zu detektieren. In der Tat ist der erzielte Empfindlichkeitsbereich mit der Menge von in einem Bakterium vorliegender ribosomaler RNA von 10&sup4; bis 10&sup5; Molekülen kompatibel, was es ermöglicht, das Vorhandensein dieses Bakteriums zu bestimmen, ohne auf eine Amplifikation des gesamten oder Teilen seines Genoms zurückzugreifen.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 stellt ein allgemeines Schema der Bildung des Komplexes in Lösung dar.
Fig. 2 zeigt ein Beispiel einer Vorrichtung zur Abtrennung des Komplexes.
Fig. 3 stellt eine zugängliche biospezifische Oberfläche des Fängerträgers dar. Fig. 4 stellt die Ablagerung der den Komplex enthaltenden Lösung auf der biospezifischen Oberfläche dar. Fig. 5 stellt die Reaktion zwischen dem Komplex und den weiteren Rezeptoren der biospezifischen Oberfläche dar.
Die Fig. 6 und 6a zeigen schematisch zwei Verfahren, die es ermöglichen, die Partikel des Komplexes auf der biospezifischen Oberfläche zu sammeln und zu immunobilisieren, einmal ohne Konzentrierung des Komplexes (Fig. 6) und ein anderes Mal mit Konzentrierung des Komplexes (Fig. 6a).
Fig. 7 stellt zwei Kurven dar, die durch die Verfahren erhalten wurden, die in den Fig. 6 bzw. 6a gezeigt sind. Auf den Ordinaten ist die Anzahl detektierter Partikel pro Oberflächeneinheit, und auf der Abszisse die Konzentration an Analyten des ursprünglichen flüssigen Mediums aufgetragen. Der punktierte Strich legt die Empfindlichkeitsschwelle fest.
Fig. 8 zeigt eine dem Komplex zugängliche Oberfläche, die zu dem weiteren Träger, dem sogenannten Fängerträger, gehört, und die durch die Verwendung einer Maske begrenzt ist.
Die Fig. 9 und 9a zeigen die Ablagerung der Partikel des Komplexes auf der begrenzten Oberfläche, die in Fig. 8 dargestellt ist, ohne bzw. mit einem Konzentrierungsmittel, das durch einen Magneten oder Elektromagneten gebildet wird.
Fig. 10 stellt ein System dar, das mit jenem identisch ist, das in Fig. 4 dargestellt ist, mit der begrenzten Oberfläche, die in Fig. 8 dargestellt ist, und einem angebrachten Magneten.
Fig. 11 stellt die Auswirkung der Anreicherung des Komplexes durch einen Magnetfeldgradienten auf die Veränderung der Anzahl von Partikeln pro Oberflächeneinheit (um²) auf der Ordinate, in Abhängigkeit von der Konzentration von TSH (Analyt) auf der Abszisse [Log10 ng/ml] dar. Die schwarzen Kreise beziehen sich auf fehlende Anreicherung bei einem konstanten Volumen von 0,07 ml, die schwarzen Quadrate auf ein variables Volumen, das mittels HGMS konzentriert wurde.
Fig. 12 zeigt vier Atomkraftmikroskopie-Bilder, die die Auswirkung der zugefügten Magneten während der Reaktion der Ausbildung der Konjugate aus Komplexen und Rezeptoren der biospezifischen oder zugänglichen Oberfläche des Fängerträgers darstellen. Die linken Figuren wurden mit Konzentrierung mittels eines Magneten erhalten, und die rechten Figuren ohne Konzentrierung.
Fig. 13 zeigt die Änderung der Anzahl von immobilisierten Partikeln des Komplexes pro Oberflächeneinheit (um²) in Abhängigkeit der Größe der biospezifischen Oberfläche, in mm² (auf der Abszisse).
Fig. 14 zeigt für eine biospezifische Oberfläche mit geringer Größe die Änderung der Anzahl von immobilisierten Partikeln des Komplexes pro Oberflächeneinheit (um²) in Abhängigkeit der ursprünglichen Konzentration an TSH in Lösung in pg/ml auf der Abszisse; die rechte Figur (Fig. 14a) zeigt die Steigung am Anfang.
Fig. 15 vergleicht die Änderung der Anzahl von immobilisierten Partikeln des Komplexes pro Oberflächeneinheit (um²) in Abhängigkeit der ursprünglichen Konzentration an TSH in Lösung, angegeben in ng/ml auf der Abszisse, entsprechend der Größe der biospezifischen Oberfläche. Die schwarzen Kreise beziehen sich auf einen Komplex, der zuerst mittels eines HGMS-Magnetfeldgradienten angereichert wurde, und ohne Konzentrierung auf einer biospezifischen Oberfläche von 64 mm² immobilisiert wurde. Die schwarzen Kreuze beziehen sich auf einen angereicherten und mit einer Konzentrierung auf einer biospezifischen Oberfläche von 0,5 mm² immobilisierten Komplex. Die Konzentration ist auf der Abszisse in log 10 (ng/ml) angegeben.
Fig. 16 stellt einen Vergleich von verschiedenen Konzentrierungsmethoden dar, wobei als Ausgangsreagenz magnetische Partikel verwendet wurden. Die Ordinate und Abszisse sind die gleichen und mit den gleichen Maßstäben wie jene, die auf Fig. 15 dargestellt sind. Die schwarzen Vierecke beziehen sich auf einen auf der biospezifischen Oberfläche immobilisierten Komplex, der zuvor nicht angereichert wurde und im Moment des Einfangens auf der biospezifischen Oberfläche nicht konzentriert wurde, die schwarzen Rauten beziehen sich auf einen immobilisierten Komplex nach Anreicherung auf einer HGMS-Säule, und die schwarzen Kreuze beziehen sich auf einen immobilisierten Komplex nach Anreicherung und Konzentrierung.
Fig. 17 zeigt einen Vergleich von verschiedenen Anreicherungsmethoden, wobei als zum Reagenz gehörender Träger Partikel von kolloidalem Gold verwendet werden. Auf der Ordinate ist die Anzahl der Partikel pro um², auf der Abszisse die Konzentration von TSH (log 10 ng/ml) aufgetragen. Die schwarzen Rauten beziehen sich auf eine Bestimmung nach Anreicherung mittels Zentrifugation, und die schwarzen Kreise auf eine Bestimmung ohne Anreicherung mittels Zentrifugation.
Fig. 18 stellt eine Ausführungsform der Erfindung für die Bestimmung von Haptenen durch Kompetition dar, und Fig. 19 stellt die theoretisch erwartete Kurve dar, wobei die Ordinate die Anzahl von detektierten Partikeln pro Einheit der biospezifischen Oberfläche, und die Abszisse die ursprüngliche Konzentration von Hapten angibt.
Fig. 20 stellt eine zugängliche biospezifische Oberfläche des Fängerträgers dar, die mehrere geeignete Bereiche mit Rezeptoren von jeweils verschiedenen Affinitäten aufweist.
Fig. 21 stellt eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar.
Fig. 22 stellt eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar.
Die Fig. 23 und 24 stellen die Ausführungsform dar, die in Fig. 22 beschrieben ist, bei der zwei Konzentrierungsmittel angebracht wurden, und eine biospezifische Oberfläche verschiedene wie beispielsweise in Fig. 20 beschriebenen geeigneten Bereiche aufweist.
Die Fig. 25 und 26 stellen eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar. Sie zeigen insbesondere die an der Oberfläche erfolgte Anbringung des Magneten 12, eines spitzen Teils 21 aus sogenanntem "schwachem" magnetischem Material mit der Eigenschaft, die Magnetfeldlinien am Ende dieser Spitze zusammenzuführen. Dieses Teil oder ein Äquivalent kann gleichermaßen an die Beispiele angebracht werden, die auf den Fig. 9a, 10, 18, 21, 23 und 24 beschrieben sind, oder an jede weitere äquivalente Vorrichtung.
Wie zuvor erwähnt, betrifft die Erfindung als einen besonderen Aspekt ein Verfahren, das es ermöglicht, sehr stark verdünnte Analyten aus flüssigen Medien zu isolieren. Die Isolierungsmethode kann verschieden sein, wobei zum besseren Verständnis ein informatorisches Beispiel gegeben wird. Diese Methode zeigt den Vorteil der Verwendung von magnetischen Partikeln von geringer Größe. Fig. 1 gibt ein Beispiel.
In einer besonderen Ausführungsform weisen die verwendeten Partikel 1 einen Durchmesser von 10 bis 1000 nm, vorzugsweise von 10 bis 200 nm auf. Sie weisen zumindest einen Kern aus mikrokristallinem Eisenoxid mit einem Durchmesser von 7 bis 15 nm auf, welcher selbst von einer Schicht eines hydrophilen Polymers (Träger) umgeben ist, um das Berühren des Metallkerns und des Liganden, der den Rezeptor bildet, zu vermeiden. Der Metallkern hat aufgrund seiner Größe einen superparamagnetischen Charakter. Solche Suspensionen sind mehrere Monate ohne wesentliche Sedimentation stabil. Das Polymer kann vorzugsweise gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren zum Immobilisieren oder Einfangen von Liganden verwendet werden. Das hier verwendete Polymer ist ein Dextran® genanntes Polysaccharid mit einer molekularen Masse von 10.000 bis 2.000.000, vorzugsweise von 40.000 bis 70.000. Es kann zweckmäßigerweise durch verschiedene Verfahren aktiviert oder funktionalisiert werden, wie z. B. durch Oxidation mittels Periodat, Bereitstellung von Aldehydfunktionen durch Spaltung von vicinalen Alkoholfunktionen, oder mittels Bromcyan, und allgemein mittels jedes äquivalenten Verfahrens.
Die Liganden 2 sind gleichermaßen Antikörper, Antigene, Oligonukleotide oder jegliches andere biologische Gebilde, das die Eigenschaft aufweist, sich an einen wie oben definierten Analyten zu binden. Die Liganden können beispielsweise auf die Oberfläche der Partikel auf zuvor aktivierte Polymerfunktionen über Primäraminfunktionen gekoppelt werden, die im nativen Molekül vorliegen oder bewußt an den Liganden angebracht wurden. Das Partikel/Ligand-Konjugat 3 ist in Fig. 1 dargestellt.
Fig. 1 stellt ein allgemeines Schema der Ausbildung von Komplexen in Lösung dar. Das Konjugat 3 (Reagenz) wird in das den abzutrennenden Analyten 4 enthaltende Medium eingebracht. Nach einer Inkubationsdauer, die für die Ausbildung des Komplexes 5 aus dem Konjugat und dem Analyten erforderlich ist, gibt man die Lösung (Zwischenmedium) über die in Fig. 2 dargestellte Vorrichtung. Dabei handelt es sich um ein Beispiel einer Anreicherungsvorrichtung, die auf dem Prinzip einer Trennung von Elementen basiert, die auf den Impuls eines Magnetfeldes reagieren. Sie enthält eine Abtrennkammer 6, die eine Matrix von Filamenten aus ferromagnetischem Material, wie z. B. Stahlfäden 7, birgt. Diese Matrix kann zweckmäßigerweise mit einem Polymer bedeckt sein, z. B. wie dies in den Dokumenten US-C- 4,375,407 oder WO-A-90/07380 beschrieben ist. Die Lösung, die die Analyt/Reagenz-Komplexe 5 enthält, wird bei einstellbarer Durchflußmenge über die filamentöse Matrix gegeben, die in dem Magnetfeld des oder der Magneten 8 angeordnet ist, wodurch es möglich wird, die Komplexe mittels der Matrix zurückzuhalten. Eine solche Vorrichtung ermöglicht es, den in ursprünglich sehr großen Volumina verdünnten Komplex anzureichern.
Nach der Entfernung der Fremdkörper und der Trägerflüssigkeit wird das Magnetfeld zurückgezogen und der konzentrierte Komplex wird durch ein geringes Flüssigkeitsvolumen eluiert. Dieses Volumen wird auf eine biospezifische zugängliche Oberfläche, die in Fig. 3 dargestellt ist, gegeben. Diese wird durch einen ebenen Träger 9 gebildet, auf dem weitere Rezeptoren 10 immobilisiert sind, die für den Analyten 4 spezifisch sind.
Ein ebener Träger wie z. B. Siliziumoxid weist bekannte Vorteile auf. Es können beispielsweise eine geringe Unebenheit, anpaßbare Größe oder vielfältige Funktionalisierungsmöglichkeiten genannt werden. Beispielsweise ermöglicht die Alkoxy- oder Chlorsilanfixierung das Einbringen von Funktionen in die Oberfläche, mit dem Ziel, Rezeptoren auf verschiedene Art und Weise zu immobilisieren (Adsorption, kovalente Bindungen, ...), ... Es sind jedoch weitere wie zuvor beschriebene Träger verwendbar.
Fig. 4 stellt ein Beispiel der Ablagerung von der Lösung dar, die die Komplexe 5 enthält. Diese wird eluiert, indem das Magnetfeld zurückgezogen wird, und in einem geringen Volumen auf die biospezifische Oberfläche gegeben wird.
Fig. 5 stellt ein Beispiel der Reaktion zwischen dem Komplex 5 und dem Rezeptor 10 auf dem Träger 9 dar.
Die Fig. 6 und 6a zeigen einen der Vorteile der Erfindung. In Fig. 6 wird eine bestimmte Anzahl von Partikeln auf einer großen sogenannten biospezifischen Oberfläche konzentriert. Fig. 6a zeigt eine Weiterentwicklung, bei der die gleiche Anzahl von Partikeln auf einer biospezifischen Oberfläche mit geringerer Größe als in der Vorrichtung der Fig. 6 konzentriert wird.
Fig. 7 stellt eine theoretische Kurve dar, die die Zunahme der Anzahl von Partikeln pro Oberflächeneinheit gemäß den auf den Fig. 6 und 6a dargestellten Vorrichtungen zeigt. Wenn sich eine Empfindlichkeitsgrenze (gestrichelte Linie) herausstellt, ist es bevorzugt, eine verkleinerte Oberfläche zu verwenden, wodurch die Empfindlichkeitsschwelle und folglich die Detektion von sehr geringen Konzentrationen von Partikeln in einer Lösung verbessert wird.
Fig. 8 zeigt ein Ausführungsbeispiel, das darauf abzielt, die biospezifische Oberfläche zu begrenzen, die durch einen einzigen geeigneten Fängerbereich gebildet wird. Diese ist identisch mit der in Fig. 4 dargestellten biospezifischen Oberfläche, wobei ihre Größe jedoch durch die Verwendung einer Maske 11 von kontrollierter Größe begrenzt ist.
Gemäß der vorstehenden Beschreibung zeigen die Fig. 9 und 9a eine besondere Ausführung der Partikelablagerung auf der verkleinerten in der Fig. 8 dargestellten Oberfläche. Fig. 9a zeigt einen weiteren Vorteil der Erfindung. Es handelt sich um eine Verbesserung der in Fig. 9 dargestellten Form durch das Anbringen eines Magneten 12, der unter dem Träger angebracht ist, und darauf abzielt, die Komplexe 5 auf dem geeigneten Bereich 10 zu konzentrieren.
Fig. 10 stellt ein System dar, das mit jenem identisch ist, das in Fig. 4 dargestellt ist, mit den zwei oben beschriebenen Weiterentwicklungen der Erfindung: die Reduzierung der zugänglichen Oberfläche durch Anbringung einer Maske 11, und die Konzentrierung oder Zusammenschließung der Partikel auf einer Oberfläche mit reduzierter Größe durch das Anbringen eines Magneten 12.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden die Partikel mittels Atomkraftmikroskopie detektiert und quantifiziert. Diese Technik ermöglicht es, nicht nur die Partikel unzweideutig zu detektieren und zu identifizieren, sondern auch Bildbearbeitungssoftware zur Quantifizierung der Anzahl von Partikeln, die auf einer definierten Oberfläche vorhanden sind, zu verwenden.
Nach diesem Konzentrierungsschritt wird die Reaktion mittels Atomkraftmikroskopie detektiert oder quantifiziert, wobei weitere dem Fachmann bekannte Mittel eingesetzt werden können und in den Bereich der Erfindung fallen.
Fig. 20 zeigt ein Ausführungsbeispiel, das darauf abzielt, mehrere biospezifischen Oberflächen oder geeignete Fängerbereiche (A, B, C...) zu begrenzen, wobei jede von unterschiedlicher Spezifität ist. Die Größe jeder Oberfläche wird durch die Verwendung einer Maske 11 von kontrollierter Größe begrenzt.
Als besondere Ausführungsform der Erfindung stellt Fig. 22 ein Mittel zur Abtrennung von Analyten 4 oder von Komplexen 5 aus der Lösung dar. Eine Zelle, die eine begrenzte Höhe und einen Zugang und einen Ausgang aufweist, ermöglicht ein In- Kontakt-Bringen der die Analyten 4 oder Komplexe 5 enthaltenden Probe mit den Rezeptoren 10 der Fängeroberfläche. Die Durchflußmenge ist durch jedes dem Fachmann bekannte Mittel einstellbar, und die Geometrie der Zelle kann an eine laminare oder turbulente Strömung angepaßt werden.
Die Fig. 23 bzw. 24 stellen einen Profilschnitt und eine Sicht auf die in Fig. 22 beschriebene Ausführungsform dar, an die zwei Konzentrierungsmittel und eine solche biospezifische Oberfläche angebracht sind, die Rezeptoren mit jeweils verschiedenen Affinitäten aufweist, wie in Fig. 20 beschrieben. Das erste Mittel zur Eingrenzung besteht beispielsweise aus der Verwendung von "Paßstücken" 17, die darauf abzielen, den Fluß der Lösung zu einer Bahn mit der Breite 18 einzugrenzen, die an den aktiven Bereichen 13 A, B und C der Fängeroberfläche und in Kontakt stehend mit diesen vorbeitritt. Das zweite Mittel zur Eingrenzung betrifft die Anbringung eines beweglichen Magneten 12 oder mehrerer sich auf jeden geeigneten Bereich beziehenden Magneten.
Die Fig. 25 und 26 stellen eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar, Sie zeigen insbesondere im unteren Teil 20 die an der Oberfläche erfolgte Anbringung des Magneten 12, eines spitzen Teils 21 aus einem sogenannten "schwachen" magnetischem Material mit der Eigenschaft, die Magnetfeldlinien am Ende dieser Spitze zusammenzuführen und einzugrenzen. Dieses Teil oder ein Äquivalent kann auch an die Gestaltungen gemäß der auf den Fig. 9a, 10, 18, 21, 23 und 24 beschriebenen Beispiele oder an jede andere äquivalente Vorrichtung angebracht werden. Der obere Teil 19 ist mit einem Zugang und einem Ausgang versehen, was es ermöglicht, die Analyten 4 oder Komplexe 5 der Probe mit den Rezeptoren 10 der Fängeroberfläche 13 in Kontakt zu bringen.
Weitere Details, die die Ausführung der Erfindung betreffen, werden in den folgenden Beispielen angegeben.

BEISPIELE:

Beispiel 1- Herstellung von biospezifischen begrenzten Oberflächen durch Ankoppeln von Anti-TSH-Antikörpern (Thyroid Stimulating Hormon, oder Analyt)

Der verwendete Träger ist aus Siliziumplatten von 8 · 8 mm zusammengesetzt, die mit thermischem Kieselsäureanhydrid beschichtet sind. Mögliche organische Kontaminationen werden zuvor durch Reinigen in Chromschwefelsäure entfernt. Die Platten werden anschließend in 1 ml einer 2%igen (v/v) Lösung von Aminopropyldimethylethoxysilan in Toluol eingetaucht. Die so auf der Oberfläche erzeugten Aminfunktionen werden durch 1 ml einer Lösung von Disuccinimidylsuberat (10 mM in DMF) aktiviert.
Die Anti-TSH-Fängerantikörper werden auf 40 ug/ml in 50 mM Phosphatpuffer, 0,15 M NaCl, pH 7,4 (PBS) verdünnt. 70 ul werden auf die aktivierten Platten gegeben. Die Kopplung erfolgt für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Platten werden anschließend für 2 Stunden bei 37ºC mit 70 ul einer Albuminlösung von 0,1 mg/ml in PBS-Puffer mit 0,5% Tween 20® (PBS/Tween) inkubiert, um die Adsorption von ungewünschten Molekülen zu verhindern.

Beispiel 2- Synthese von magnetischen Partikeln (freier Träger)

Diese Synthese ist in dem Dokument US-C-4,452,773 (Molday), abgesehen von einigen Änderungen, beschrieben.
14 Gramm Dextran®-Polysaccharid T40 (MW = 40.000, Pharmacia) werden zu 14 ml Wasser zugegeben, und man wartet, bis sich das Dextran bei Raumtemperatur gelöst hat (Lösung 1). Es wird eine Lösung 2 mit 3 Gramm FeCl&sub3;, 6H&sub2;O (MW = 270,3) und 1,3 Gramm FeCl&sub2;, 4H&sub2;O (MW = 198,81) in 20 ml Wasser hergestellt. Die beiden Lösungen werden in ein doppelt ummanteltes Reaktionsgefäß von 250 ml eingebracht, das mit einem auf 200-250 Umdrehungen/min eingestellten Rührmotor, einem Glasrührer und einem Tropftrichter ausgestattet ist, der eine 7,5%ige (v/v) Lösung von NH&sub4;OH enthält. Bei Raumtemperatur wird die NE&sub4;OH- Lösung unter Rühren tropfenweise bis zu einem End-pH von 10 bis 11 zugegeben. Die Temperatur wird für ungefähr 60 Minuten auf 70ºC gebracht, anschließend wird die Endlösung gründlich gegen 5 Liter destilliertes Wasser dialysiert, wobei die Dialysebäder bis zum Erreichen eines neutralen pH erneuert werden. Die Lösung wird anschließend über Quarzwolle filtriert, um die größten Aggregate zu entfernen, anschließend dreimal bei 600 Umdrehungen/min für 5 Minuten zentrifugiert. Um überschüssiges Dextran zu entfernen, werden die Partikel auf eine Säule von (33 · 2,5) cm Sephacryl 5300 HR Gel (Pharmacia) gegeben, die zuvor in 0,1 M Acetatpuffer, 0,15 M NaCl, 0,05% NaH&sub3; pH = 6,5, äquilibriert wurde. Die erhaltenen mit Dextran beschichteten superparamagnetischen Partikel haben einen Außendurchmesser von 20 bis 900 nm, und vorzugsweise von 30 bis 100 nm. Sie werden bei +4ºC aufbewahrt.
Die Analyse der Partikel erfolgt mittels Messen der optischen Dichte bei 483 nm. Zuerst wird eine Eichgerade erstellt, die die optische Dichte mit der volumenbezogenen Masse der Lösung, die über den Trockenextrakt bestimmt wird, korreliert. Die Partikeldichte ist bekannt, deren Anzahl pro Volumeneinheit kann daraufhin hergeleitet werden. Sie beträgt typischerweise 15 mg/ml.
Die Analyse des Eisens wird mittels des Verfahrens von Avol, E. et al. durchgeführt (Prep. Bioch. 3/3: 279, 1973), wobei Bathophenanthrolin verwendet wird. Die optische Dichte des Bathophenanthrolin/Eisen-Komplexes wird bei 535 nm gemessen. Die Eichkurve wird mit einer Lösung von Eisen-II-Salz bekannter Molarität erstellt. Der Massenanteil des Eisens in den Partikeln beträgt etwa 50 (±10) %.
Die Analyse des Dextrans erfolgt mittels der von Molday, R. S. et al. beschriebenen Technik (FEBS Lett., 170/2: 232, 1973). Die optische Dichte der zwischen dem Polysaccharid und der Schwefelsäure-Phenolmischung wird bei 487 nm gemessen. Die Eichkurve wird gegen freies Dextran erstellt. Der Massenanteil des Dextrans in den Partikeln beträgt etwa 50 (±10) %.

Beispiel 3- Herstellung der Anti-TSH-Antikörper/Partikel- Konjugate zum Erhalt des Reagenz

3.1) Direkte Kopplung von Anti-TSH-Antikörpern auf die Partikel von Beispiel 2

Die Partikel werden in Acetatpuffer (0,1 M CH&sub3;COONa, 0,15 M NaCl, pH = 6,5) dialysiert. 5 ul/mg Partikel einer 0,1 M Natriumperiodatlösung in Acetatpuffer werden zugegeben, und die Dauer der vor Licht zu schützenden Reaktion beträgt 45 Minuten. Die so oxidierten Partikel werden in Kopplungspuffer (0,25 M Phosphat, 0,75 M NaCl) dialysiert und die Anti-TSH-Antikörper werden hinzugegeben (10 bis 100 ug/mg Partikel). Die Kopplung erfolgt unter Rühren über Nacht bei 37ºC.
Die Iminbindung wird anschließend durch Zugabe von Natriumborhydrid (0,1 M, 1 umol/mg Partikel) für 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren reduziert. Die Mischung wird schließlich gegen einen 0, 1 M Phosphatpuffer, 0, 15 M NaCl bei pH 7,4 dialysiert.

3.2) Verwendung von an Streptavidin gekoppelten kommerziellen Partikeln

3.2.1) Biotinylierung von Anti-TSH-Antikörpern:

2 mg Anti-TSH-Antikörper werden in PBS-Puffer dialysiert, anschließend unter Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit NHS-Biotin (Pierce) in Kontakt gebracht (20 mol Biotin/mol Antikörper). Die biotinylierten Antikörper werden erneut dialysiert, um den Biotinüberschuß zu entfernen.

3.2.2) Kopplung von biotinylierten Antikörpern auf die Streptavidin-Partikel:

2 ug wie zuvor erhaltene biotinylierte Antikörper werden zu 100 ul Lösung zugegeben, die 1011 an Streptavidin gekoppelte Partikel enthält. Die Mischung wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die freien Antikörper werden entfernt, indem die Lösung über eine Säule gegeben wird, die eine Metallmatrix enthält, die die Abtrennung der ausgebildeten Konjugate mittels eines Magnetfeldgradienten (HGMS) ermöglicht. Solche Säulen können beispielsweise von Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Deutschland) bezogen werden. Und die entsprechenden Anreicherungstechniken sind in den Dokumenten US-C-4,375,407, US- C-5,543,289, WO-A-96/26782, WO-A-96/26011, US-C-5,186,827 und der Publikation von B. L. Hirschbein et al. (Chemtech, März 1982, Seiten 172-179) beschrieben. Die Säule wird mit 2 ml PBS gespült, anschließend werden die konjugierten Partikel in 100 ul PBS/Tween eluiert. So werden ca. 70% (7 · 101º Partikel) der ursprünglichen Partikel in konjugierter Form zurückgewonnen. Eine Titrationskurve zeigt, daß ein bis zwei Antikörper pro Partikel immobilisiert wurden.

Beispiel 4- In-Kontakt-Bringen des Reagenz mit dem Analyten und Anreicherung des erhaltenen Zwischenmediums

1,6 · 10¹&sup0; konjugierte Partikel, die wie in Beispiel 3 erhalten wurden, werden in PBS/Tween® in unterschiedlichen Volumina (von 0,1 bis 100 ml) verdünnt. 6 ng TSH werden zu jeder Lösung hinzugegeben und die Assays werden für 2 Stunden bei 37ºC unter Rühren inkubiert. Jede Lösung wird dann über eine in Beispiel 3 beschriebene Säule gegeben und angereichert, anschließend mit 1 ml PBS/Tween gewaschen, um freie Antigene zu entfernen. Um die Partikel zurückzugewinnen, wird die Säule vom Magneten entfernt. Es werden 30 ul PBS/Tween darüber gegeben und verworfen, denn ihre Partikelkonzentration ist zu gering. Anschließend werden 70 ul darüber gegeben und gesammelt.
Jede Probe von 70 ul wird anschließend auf eine wie in Beispiel 1 erhaltene Platte gegeben. Die Lösung wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden anschließend gründlich mit PBS/Tween, anschließend mit Wasser gewaschen.
Zum Vergleich werden Assays mit Lösungen von konstantem Volumen (70 ul) durchgeführt, in denen wie zuvor 1,6 · 10¹&sup0; konjugierte Partikel (Reagenz) und unterschiedliche TSH-Mengen vermischt werden, um einen Bereich von Konzentrationen zu erhalten, die mit jenem vergleichbar sind, die oben beschrieben wurden (von 0,06 bis 86 ng/ml). Die Lösungen werden nicht über eine Säule gemäß der HGMS-Technik angereichert, sondern direkt auf die wie in Beispiel 1 erhaltenen Platten gegeben und unter denselben Bedingungen, wie den oben beschriebenen, inkubiert.
Die Detektion der konzentrierten Ablagerung der superparamagnetischen komplexen Partikeln erfolgt nach der spezifischen Reaktion auf dem Träger mittels Atomkraftmikroskopie oder AFM (Autoprobe, Park Scientific Instrument). Die Proben werden stickstoffgetrocknet und im Luftkontaktmodus analysiert (Si&sub3;N&sub4;- Spitzen, Dicke = 6 um, Steifigkeitskonstante von 0,01 bis 0,5 N/m). Es wird ein Scanner von 100 um verwendet und Abtastungen von 5 · 5 um² werden durchgeführt. Die Anzahl der in jedem analysierten Bereich detektierten Partikel wird mittels einer Bildbearbeitungssoftware berechnet und der aufgefundene Wert wird auf eine Anzahl von Partikeln pro um² zurück gerechnet.
Die Ergebnisse werden durch Fig. 11 beschrieben. Für gleiche TSH-Konzentrationen wird im Falle der Konzentrierung nach der HGMS-Technik eine deutliche Erhöhung der Anzahl von Partikeln pro Oberflächeneinheit beobachtet. Die Detektionsgrenzen (die wie in Beispiel 7 angegeben berechnet werden) für beide Verfahren sind in Tabelle 2 angegeben.

Beispiel 5- Anlegen eines Magneten mit Bezug auf die biospezifischen begrenzten Oberflächen, während ihres In-Kontakt- Stehens mit den komplexen Partikeln

4 Siliziumdioxidplatten von 8 · 8 mm² werden auf ihrer gesamten Oberfläche mittels Anti-TSH-Fänger-Antikörper, wie in Beispiel 1 beschrieben, funktionalisiert und konjugiert. Zwei von vier Platten werden auf einen aus seltenen Erden gebildeten Magneten plaziert (6 mm Durchmesser, 25 mm Dicke, B = 0,32 Tesla), die beiden anderen befinden sich außerhalb der Wirkung von jeglichem Magnetfeld. 70 ul der Lösungen, die eine Konzentration an TSH von 1 oder von 100 ng/ml und eine identische Konzentration an konjugierten Partikeln (2 · 10&sup9;) enthalten, werden auf diese Platten gegeben. Die Lösungen werden für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert, um nicht-spezifische Adsorption von konjugierten Partikeln zu begrenzen. Die Platten werden danach mittels AFM gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Prinzip analysiert, und die Ergebnisse werden durch die Aufnahmen der Fig. 12 illustriert. Obwohl in dieser besonderen Ausführung magnetische Partikel von geringer Größe verwendet werden, ermöglichen die verwendeten geringen Volumina trotz allem deren Abtrennung mittels eines Permanentmagneten, denn die Abtrennungsstrecken sind gering.
Die beiden auf die Magneten plazierten Platten zeigen eine deutlich höhere Partikeldichte als jene Platten, die dem Einfluß des Magnetfeldes nicht unterzogen wurden. Es konnte demonstriert werden, daß das Hintergrundrauschen (ohne TSH in Lösung) in beiden Fällen vergleichbar ist, und demnach die Verbesserung der Antikörper/Antigen-Reaktion auf der biospezifischen Oberfläche auf das Vorhandensein des Magneten zurückzuführen ist. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1

Beispiel 6- Anreicherung des Zwischenmediums auf der BGMS- Säule, anschließend Anlegen eines Magneten mit Bezug auf die biospezifische begrenzte Oberfläche: Einfluß der Größe der biospezifischen Oberfläche

Die Fänger-Antikörper oder Liganden werden auf aktiviertes Siliziumdioxid auf Oberflächen von zunehmender Größe gekoppelt. Zu diesem Zweck werden unterschiedliche Volumina von 1,10 und 70 ul Antikörperlösung in das Zentrum der Platten gegeben bzw. bedecken Oberflächen von 1, 8, 13 und 56 mm². Die kleinste Oberfläche (0,5 mm²) wird mittels einer durchlöcherten Maske, die in das Zentrum der Platte plaziert wird, hergestellt. Die Lösungen von konjugierten Partikeln (7,6 · 10&sup9;) und von TSH (60 pg/ml) werden in 1 ml inkubiert, anschließend über eine HGMS-Säule gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Protokoll gereinigt. Die wie in Beispiel 1 erhaltenen Platten werden anschließend auf die Magneten plaziert, und die gereinigten Lösungen werden darauf gegeben und inkubiert. Die Analyse mittels AFM ermöglicht die Quantifizierung der Anzahl von Partikeln pro um².
Die Ergebnisse werden durch Fig. 13 beschrieben. Die Anzahl von pro Oberflächeneinheit immobilisierten komplexen Partikeln nimmt zu, wenn sich die biospezifische Oberfläche verkleinert, also wenn die komplexen Partikel im Zentrum der Oberfläche unter Einwirkung des Magneten konzentriert werden. Der Konzentrierungseffekt ist um so wichtiger, wenn sich die Oberfläche, auf der die komplexen Partikel reagieren können, verkleinert.

Beispiel 7- Anreicherung des Zwischenmediums auf einer HGMS-Säule, anschließend Anlegen eines Magneten mit Bezug auf die biospezifische, begrenzte, geeignete Oberfläche: Auswirkung der Menge von Antigen (Analyt) in Lösung und Ermittlung der Empfindlichkeitsgrenze des Verfahrens

Die Fänger-Antikörper oder Liganden werden auf das aktivierte Siliziumdioxid auf eine Oberfläche von 64 oder 0,5 mm² gekoppelt. Die konjugierten Partikel (8 · 10&sup9; pro Assay) und die Antigene (Analyt) werden bei unterschiedlicher Konzentration (von 0 bis 500 ng/ml) in 1 ml inkubiert, anschließend werden die komplexen Partikel auf einer HGMS-Säule angereichert. Die funktionalisierten, d. h. an ihre eigenen Rezeptoren gekoppelten Platten werden anschließend auf die Magneten plaziert, wie in den Fig. 9a und 10 gezeigt, und die gereinigten Lösungen werden inkubiert und anschließend mittels AFM analysiert.
Fig. 15 ermöglicht es erneut eindeutig die Auswirkung der Größe der biospezifischen geeigneten Oberfläche auf den Konzentrierungs- oder Zusammenschließungseffekt durch Magnetisierung aufzuzeigen. Tatsächlich wird bei gleicher TSH-Konzentration auf der kleinen Oberfläche (0,5 mm²) eine viel größere Dichte von komplexen Partikeln beobachtet, dargestellt durch die Kreuze, als im Vergleich auf der großen Oberfläche (64 mm²), bei der die Dichte durch Kreise dargestellt ist.
Für die Konzentrierung auf einer geeigneten Oberfläche von 0,5 mm² sind die Ergebnisse durch Fig. 14 beschrieben. Die Berechnung demonstriert, daß der Wert des erhaltenen Plateaus der erwarteten theoretischen Kurve (Fig. 7, Kurve 6a) entspricht. Die Detektionsgrenze wird wie zuvor (Beispiel 6) nach dem allgemein anerkannten statistischen Verfahren berechnet: Es werden 10 Kontrollen (ohne Antigen) hergestellt, von denen der Mittenrauhwert (Ra) und die Standardabweichung (Rs) berechnet wird. Die Detektionsgrenze (DG) wird definiert als: DG = Ra + 3 · Rs. Dieser Wert wird auf die Steigung am Beginn der Eichkurve übertragen. Es wurde eine Detektionsgrenze von 5 · 10&supmin;³ pg/ml, d. h. von 1,2 · 10&sup5; Molekülen von TSH berechnet (Tabelle 2).

Vergleich der Ergebnisse:

Fig. 16 stellt noch einmal in derselben Graphik die in den Beispielen 4 und 7 beschriebenen Ergebnisse dar, wodurch die Verbesserung der Empfindlichkeit hervorgehoben wird, die durch die in Fig. 10 dargestellte Vorrichtung erzielt wurde. Die Tabelle 2 unten ermöglicht es gleichermaßen, die Verbesserung der Empfindlichkeitsgrenze für die Detektion von TSH zu zeigen, die einerseits durch die magnetische Anreicherung auf der Säule mittels Feldgradienten, und andererseits durch den gemeinsamen Effekt der magnetischen Anreicherung des Zwischenmediums auf der Säule mittels Feldgradienten und der magnetischen Konzentrierung der komplexen Partikel auf einer biospezifischen Oberfläche von geringer Größe, erzielt wird. Tabelle 2
Als Vergleich beträgt die Detektionsgrenze, die auf den Immunanalyse-Automaten erhalten wird, je nach Fall, einige pg/ml. Durch die Durchführung des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens wird also eine Zunahme der Empfindlichkeit um den Faktor von ungefähr 100 bis 1000 erreicht.

Beispiel 8- Synthese von konjugierten Anti-TSH-Antikörper- Goldpartikeln

Das nachstehende Beispiel zeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren auf nicht magnetische Trägerpartikel verschiedenster Natur ausgedehnt und mit diesen durchgeführt werden kann.
- Lösung von kolloidalem Gold. Der pH der Lösung von kolloidalem Gold (Partikeldurchmesser: 15 nm, Polyscience, OD&sub5;&sub2;&sub0; = 0,524) wird durch eine 0,2 M K&sub2;CO&sub3;-Lösung eingestellt. Das kolloidale Gold wird anschließend über eine Membran von 0,1 um filtriert.
- Ligandenlösung. Die Anti-TSH-Antikörper werden in einem 2 mM Boratpuffer, pH 9,00, dialysiert, anschließend direkt vor der Verwendung über eine Membran von 0,1 um filtriert, um eventuelle Aggregate zu entfernen, und bei 280 nm analysiert.
- Synthese von konjugierten Protein/Gold-Partikeln. Die Antikörperlösung wird unter Rühren zu der Goldlösung bei einer Konzentration von 8 ug Antikörper/ml von kolloidalem Gold zugegeben. Nach 10minütiger Inkubation wird die kolloidale Stabilisierung durch die Zugabe einer Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) von 10 mg/ml PBS sichergestellt, um eine Endkonzentration an konjugierten Partikeln von 100 ug/ml zu erhalten. Die Lösung wird filtriert (0,1 um), anschließend über eine Membran mit der Durchlaßgrenze von MWDL = 300.000 gereinigt, um den Antikörperüberschuß zu entfernen. Die konjugierten Partikel werden in PBS/BSA/0,5% Tween 20-Medium aufgenommen und filtriert. Sie werden bei 4ºC in Gegenwart von Natriumazit (0,05%) gelagert und können für mehrere Monate aufbewahrt werden. Das Natriumazit kann ggf. durch eine Sterilfiltration zum Zeitpunkt der Verwendung ersetzt werden.

Beispiel 9- Sandwichbestimmung von TSH mittels markierter konjugierter Partikel aus kolloidalem Gold: Vergleich der Verfahren mit und ohne Anreicherung durch Zentrifugation des Zwischenmediums

* Ohne Anreicherung

Auf die wie in Beispiel 1 erhaltenen Platten werden 70 ul PBS/0,5% Tween-Lösung mit zunehmenden TSH-Konzentrationen von 0 bis 50 ng/ml gegeben und eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach dem Spülen mit PBS/Tween werden 70 ul der Lösung von konjugierten Partikeln (OD 520 nm = 1,4) für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Platten werden danach gewaschen, getrocknet und mittels AFM analysiert. Es wird die Anzahl komplexer Partikel pro Oberflächeneinheit gezählt.

* Mit Anreicherung durch Zentrifugation

Nach der Synthese der zuvor beschriebenen konjugierten Partikel (Reagenz) werden in unterschiedlichen Volumina von 0,1 bis 10 ml PBS/0,5% Tween mit 0,1 mg/ml BSA, 100 ul konjugierte Partikel (OD 520 nm = 1,4) und 6 ng TSH inkubiert. Die erhaltenen Lösungen werden eine Nacht unter Rühren bei 37ºC inkubiert. Es werden Kontrollen ohne Antigen (Analyt) hergestellt. Am Ende der Inkubation werden die Lösungen durch Waschen und Filtrieren über eine Membran (MWCO = 100.000) konzentriert, um ein Endvolumen von einigen 10 ul zu erhalten. Diese werden anschließend auf die wie in Beispiel 1 erhaltenen Platten gegeben. Die Inkubation erfolgt für 1 Stunde bei 37ºC. Das Spülen und die Analyse erfolgen wie zuvor.
Die Ergebnisse sind in Fig. 17 dargestellt. Bei gleicher Konzentration von TSH wird eine deutliche Verbesserung der Empfindlichkeit festgestellt, wenn die komplexen Partikel konzentriert werden.

Beispiel 10- Herstellung von biospezifischen Trägern (weitere Träger und Rezeptoren) durch Kopplung von Oligonukleotiden (ODN)

Die Siliziumdioxidoberflächen werden mittels Chromschwefelsäure gereinigt (2 Stunden, 120ºC), anschließend für 2 Stunden bei Raumtemperatur mittels Aminopropyldimethylethoxysilan (2% in wasserfreiem Toluol) silanisiert. Ein Copolymer, das Malein-Co-Methyl-Vinyl-Ether-Anhydrid (MVEA, Mn = 20.000), das in der Lage ist, kovalente Bindungen mit Aminfunktionen herzustellen, wird anschließend auf die Aminooberflächen gepfropft. Eine Lösung von 1 mg MVEA/10 ml wasserfreiem DMSO wird direkt vor der Verwendung hergestellt. Die Aminooberflächen werden in diese Lösung eingetaucht und unter Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur in Gegenwart von Triethylamin (1% v/v) inkubiert. Sie werden anschließend mit DMSO gespült und stickstoffgetrocknet.
Es wird eine Lösung von Fänger-ODN (17 Basen) mit einer Konzentration von 8 uM in einer Mischung von 0,1 M Natriumborat, 0,5 M NaCl (5%)/DMSO (95%) hergestellt. 50 ul der Lösung werden auf die Platte gegeben und für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Träger werden anschließend mit PBS-Tween gespült. Um unspezifische Interaktionen zu vermeiden, werden danach 50 ul einer PEG-Lösung auf die Oberfläche gegeben und für 30 Minuten inkubiert. Die Oberflächen werden mit PBS-Tween gespült. Solche Oberflächen werden im folgenden "biospezifische Oberflächen" genannt.

Beispiel 11. Herstellung von Detektionskonjugaten aus magnetischen Partikeln/Biotin-ODN

Beispiel 11a

100 ul mit Streptavidin (Immunicon) beschichtete magnetische Partikel werden zu 100 ul einer Lösung von biotinylierten Detektions-ODN (21 Basen) (8,37 umol/ul) gegeben. Diese Lösung wird für 1 Stunde bei 37ºC unter Rühren inkubiert. Der Überschuß an ODN wird durch 3 aufeinanderfolgende Schritte von Magnetisierung/Verdünnung entfernt und die Konjugate werden schließlich in 100 ul PEG-Puffer aufgenommen.

Beispiel 11b

100 ul mit Streptavidin beschichtete magnetische Partikel (10¹¹ Partikel, also 5 · 10¹² Streptavidinmoleküle, Miltenyi Biotec) werden zu einer Lösung von biotinylierten Detektions- ODN (28 Basen) (4 · 10¹³ Moleküle), Träger eines Spacerfadens von 8 Basen, zugegeben. Diese Lösung wird für 1 Stunde bei 37ºC unter Rühren inkubiert. Der ODN-Überschuß wird durch das Passieren einer HGMS-Abtrennsäule entfernt und anschließend in 100 ul aufgenommen.
Die beiden so erhaltenen Reagenzien werden nachfolgend als "Detektionskonjugate" bezeichnet.

Beispiel 12. Einfangen von DNA-Targets (Analyt) mittels der Detektionskonjugate des Beispiels 11a.

20 ul der Lösung von wie in Beispiel 11a beschriebenen Detektionskonjugate werden in PEG-Puffer verdünnt. Die Targets (37 Basen, 8,23 · 10¹³ Kopien/ul), die die entsprechend komplementären Sequenzen der Fänger- und Detektions-ODN aufweisen, werden in der für ein Gesamtvolumen von 1 ml gewünschten Menge zugegeben. Die Mischung wird für 2 Stunden bei 37ºC unter Rühren inkubiert. Die ausgebildeten Komplexe werden als solche verwendet.

Beispiel 13. Konzentrierung der Targets (Analyt) mittels der Detektionskonjugate des Beispiels 11a. Auswirkung des Vorhandenseins des Magneten.

Es werden 2 biospezifische Träger hergestellt. Gleichermaßen werden 2 Proben, die jeweils 1012 Kopien/ml enthalten, in Gegenwart von wie in Beispiel 11a beschriebenen Detektionskonjugaten inkubiert. Die biospezifischen Träger werden auf den Boden eines Behälters gestellt. Einer der Behälter wird auf einen seltenen-Erden-Magneten gestellt (Durchmesser 6 mm, Höhe 6 mm, B = 0,32 Tesla). Die Lösung, die die auf die magnetischen Partikel hybridisierten Targets enthält, wird in die Behälter gegeben und für 1 Stunde bei Bewegung durch Pipettieren nach jeweils 10 Minuten inkubiert. Am Ende der Inkubation werden die Träger mit PBS-Tween, anschließend mit 0,1 M Ammoniumcarbonatpuffer gespült, bevor sie getrocknet und im Luftkontakt-Modus mittels AFM analysiert werden.
In einem geeigneten Bereich von 4 · 4 um der biospezifischen Oberfläche werden ohne Magneten 0,3 Partikel pro um² und mit einem Magneten 86 Partikel pro um² detektiert.
Ohne Magneten werden die Targets praktisch nicht detektiert, wohingegen in Gegenwart des Magneten eine Einzelschicht von Partikeln, entsprechend der Sättigung des Signals, erhalten wird.

Beispiel 14. Konzentrierung der Targets mittels der Detektionskonjugate des Beispiels 11a. Bestimmung der Detektionsgrenze.

Es werden mehrere biospezifische Träger hergestellt. Es werden zunehmende Targetkonzentrationen (von 0 bis 8 · 10¹² Targets/ml) in 1 ml PEG-Puffer hergestellt. Das Einfangen der DNA-Targets durch die wie in Beispiel 11a beschriebenen Detektionskonjugate wird wie in Beispiel 12 beschrieben durchgeführt. Am Ende der Inkubation werden die biospezifischen Träger bei einer Inkubationstemperatur von 37ºC auf Magneten plaziert, wie in Beispiel 12 beschrieben. 100 ul der Lösungen, die die Targets enthalten, die auf die Detektionskonjugate hybridisiert wurden, werden auf die biospezifischen Träger gegeben. Die Lösung wird für 3 Minuten inkubiert, anschließend wird der Überstand entfernt. Es werden erneut 100 ul hinzugegeben, anschließend wird der Tropfen durch Pipettieren durchmischt, um die Partikel in Lösung zu bringen. Dieses Protokoll wird wiederholt, bis die gesamte Lösung auf dem Träger konzentriert wurde (10 · 100 ul). Am Ende der Inkubation werden die Oberflächen mit PBS-Tween gespült, anschließend mit 0,1 M Ammoniumcarbonatpuffer, bevor diese getrocknet und im Luftkontaktmodus mittels AFM analysiert werden. Die Dichte der Partikel wird im Bereich maximaler Magnetisierung gemessen. Der Bedeckungsgrad der Partikel auf den Bildern wird durch die Verwendung einer Bildbearbeitungssoftware bestimmt.
Die Empfindlichkeitsgrenze wird auf 7 · 10&sup8; Targets/ml geschätzt, d. h. auf eine Zunahme um einen Faktor 100 im Vergleich zum Nachweis von DNA-Targets mittels eines konventionellen enzymatischen Tests, Typ ELOSA (Enzym Linked Oligo Sorbent Assay), ohne Konzentrierung (8 · 10¹&sup0; Ziele/ml), durchgeführt auf dem gleichen Träger.

Beispiel 15. Konzentrierung der Targets (Analyt) mittels der Detektionskonjugate des Beispiels 11b. Bestimmung der Detektionsgrenze.

50 ul der Lösung von wie in Beispiel 11b beschriebenen Detektionskonjugaten werden in PEG-Puffer verdünnt. Die Targets (37 Basen), die die jeweils komplementären Sequenzen der Fänger- und Detektions-ODN aufweisen, werden in einer für ein Endvolumen von 1 ml gewünschten Menge zugegeben. Die Mischung wird über Nacht bei 37ºC unter Rühren inkubiert. Die Komplexe aus Targets und Detektionskonjugaten werden anschließend über eine HGMS-Abtrennsäule, wie in Beispiel 3 beschrieben, aufgereinigt, um ein Endvolumen von 100 ul zu erhalten.
Es werden mehrere biospezifische Träger hergestellt. Sie werden auf Magneten, wie in Beispiel 13 beschrieben, bei einer Inkubationstemperatur von 37ºC plaziert. Die Lösung der Komplexe aus Targets und Detektionskonjugaten wird für 30 Minuten mit einer Durchmischung mittels Pipettieren nach jeweils 10 Minuten inkubiert. Am Ende der Inkubation werden die Oberflächen mit PBS-Tween, anschließend mit 0,1 M Ammoniumcarbonatpuffer gespült, bevor sie getrocknet und im Luftkontaktmodus mittels AFM analysiert werden.
Die Detektionsgrenze wird auf 3 · 10&sup9; Kopien/ml geschätzt, das bedeutet eine Zunahme um einen Faktor 30 im Vergleich zu einem ELOSA-Test, der auf dem gleichen Träger ohne Konzentrierung durchgeführt wurde.

Beispiel 16. Vergleich des Systems der Konzentrierung in Lösung im Vergleich zu einer sequentiellen Inkubation von Reagenzien auf einer Oberfläche.

Assay 1: Die Targets werden in Lösung eingefangen, wie in Beispiel 15 beschrieben.
Assay 2: Nach Herstellung der biospezifischen Träger werden 100 ul einer Targetlösung (von 0 bis 8 · 10¹³ Targets/ml) auf dem Träger (Partikel) inkubiert, der anschließend mit PBS- Tween gespült wird. Anschließend werden 100 ul der Lösung von biotinylierten ODN (0,5 pH in PEG) inkubiert. Schließlich wird der Träger auf einen zylindrischen Magneten plaziert, wie in Beispiel 13 beschrieben, und 100 ul einer handelsüblichen Lösung von mit Streptavidin beschichteten magnetischen Partikeln (Miltenyi Biotec), die zur Hälfte mit dem PEG-Puffer verdünnt wurde, werden für 30 Minuten mit einer Durchmischung nach jeweils 10 Minuten inkubiert.
Die Detektionsgrenze des sequentiellen Systems auf einer Oberfläche wird auf 7,6 · 10¹&sup0; Targets/ml geschätzt, während jene des Assays in Lösung in Beispiel 15 auf 3 · 10&sup9; Kopien/ml geschätzt wurde. Der Verstärkungsfaktor, der mit der Inkubation der Ziele und den Konjugaten in Lösung verbunden ist, beträgt demnach 25.

Beispiel 17. Vorteil der Zirkulationsksmmer, die dazu dient, die magnetischen Konjugate zu konzentrieren

Dieser Assay illustriert ein weiteres in den Fig. 23 und 24 dargestelltes Verfahren zur Durchführung der Erfindung.
Die biospezifischen Träger werden hergestellt, indem biotinylierte (Positivkontrolle) oder nicht-biotinylierte (Negativkontrolle) Antiferritin-Antikörper in einer Konzentration von 0,2 ul/ml auf Siliziumdioxidoberflächen adsorbiert werden.
Assay 1: Diese Träger werden in die Kammer gesetzt, die einen wie zuvor definierten zylindrischen Magneten enthält, der von einem Kegelstumpf überwölbt ist, der an seiner Spitze einen Durchmesser von 0,5 mm aufweist. Eine Lösung, die 30 ul streptavidinbeschichtete magnetische Partikel enthält (Miltenyi Biotec), die in 1 ml PBS/Tween/BSA-Puffer verdünnt wurde (0,1 mg/ml), wird auf jeden Träger mit einer Durchflußmenge von 0,017 ml/min injiziert. Am Ende dieser Inkubation werden die Träger gespült, getrocknet und im AFM analysiert.
Assay 2: Parallel werden Assays auf den gleichen biologischen Trägern außerhalb der Kammer durchgeführt. Jeder Träger wird auf einen wie zuvor definierten zylindrischen Magneten plaziert. Es wird eine Lösung hergestellt, die 30 ul streptavidinbeschichtete magnetische Partikel (Miltenyi Biotec) enthält, in 60 ul PBS-Tween-BSA-Puffer verdünnt und auf die Träger gegeben, anschließend für 30 Minuten inkubiert, wobei alle 10 Minuten geschüttelt wird. Am Ende dieser Inkubation werden die Träger gespült, getrocknet und in dem AFM analysiert und der Beschichtungsgrad der Partikel wird ermittelt.
Es wird festgestellt, daß i) das spezifische Signal (97+/-3 für Assay 1, 63+/-16 für Assay 2) und daß ii) das Verhältnis Signal/Rauschen (139 für Assay 1, 31 für Assay 2) bei Verwendung der Zirkulationskammer deutlich verbessert werden.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die oben beschriebenen Beispiele das allgemeine erfindungsgemäße Verfahren realisieren. Beispiel 7 zeigt, daß es die Erfindung ermöglicht, dermaßen schwache Analytkonzentrationen wie 5 fg/ml TSH zu detektieren, was 1,2 · 10&sup5; Molekülen entspricht. Ein Bakterium entspricht etwa 10&sup4; bis 10&sup5; Molekülen von ribosomaler RNA. Die Beispiele 10 bis 16 zeigen, daß die angewendeten Verfahren identisch oder abweichend für die Detektion von DNA-Targets verwendet werden können. Folglich erscheint es möglich, mit einer Ausführung desselben Typus 1 bis 10 Bakterien pro Volumeneinheit zu detektieren. Verbunden mit einem wie beschriebenen und auf Nukleinmaterial angewendeten Konzentrierungsverfahren liegt also die analytische Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens im Bereich der Empfindlichkeit von Amplifizierungsverfahren wie PCR, NASBA, ...
Die Art und Weisen der Ausführungen der Erfindung können vielfältig sein, und hierfür können, ohne einzuschränken, einige Beispiele gegeben werden:
Die Erfindung kann auf Bestimmungen von Haptenen durch Kompetition gemäß eines Beispielverfahrens angewendet werden, das in Fig. 18 beschrieben ist. Die Haptene werden auf einer begrenzten Oberfläche immobilisiert. Die Lösung, die die zu bestimmenden Haptene (Analyt) enthält, wird für eine Zeit, die ausreicht, um die Ausbildung der komplexen Partikel zu ermöglichen, mit den konjugierten Partikeln in Kontakt gebracht, die nur einen wie in Beispiel 3 beschriebenen Anti-Hapten- Antikörper (Rezeptor) tragen. Die komplexen Partikel werden gemäß eines der beschriebenen Verfahren abgetrennt und auf der geeigneten Oberfläche, die die Rezeptorhaptene trägt, konzentriert. Die konjugierten Partikel, die zuvor in Lösung mit einem Hapten reagiert haben, können nicht binden und werden durch Waschen entfernt. Die konjugierten Partikel, die nicht reagiert haben, Träger von freien Antikörpern, können hingegen mit den Rezeptorhaptenen der biospezifischen Haptenen der biospezifischen geeigneten Oberfläche reagieren und durch eines der zuvor beschriebenen verschiedenen Mitteln detektiert werden. Die Anzahl der detektierten konjugierten Partikel verringert sich, wenn die Konzentration von Haptenen in Lösung ansteigt, wie dies auf der theoretischen Kurve der Fig. 19 gezeigt ist.
Wie in den Dokumenten US-C-5,543,289 oder US-C-5,169,754 beschrieben, können Zellen aus einer Lösung durch magnetisches Sortieren abgetrennt werden. Aufgrund dieser Durchführung ist es möglich, den markierten Analyten (Zellen, Hefen, Bakterien, Viren oder Phagen) auf einer biospezifischen Oberfläche von geringer Größe mittels eines Rezeptors zurückzuhalten oder zu konzentrieren, der verschieden oder identisch mit einem solchen ist, der es ermöglicht, mittels eines beispielsweise in Fig. 10 beschriebenen Verfahrens komplexe Partikel zu erhalten. Die Bestimmung (Detektion und/oder Quantifizierung) kann durch sämtliche geeignete Mittel erfolgen, wie intrinsische oder extrinsische fluoreszierende Marker, Mikroskopieverfahren, ... einschließlich der Detektion durch die Verwendung von Partikeln, die der Abtrennung und Konzentrierung gedient haben.
Besondere Ausführungen, die insbesondere darauf abzielen, mehrere Liganden mit verschiedenen Affinitäten auf dieselbe begrenzte Oberfläche zu binden (Multiaffinität), und/oder die konjugierten Partikel in gewünschten Stellen zu konzentrieren, ermöglichen es, die Erfindung für eine multiple Detektion anzuwenden. Ein Beispiel ist in Fig. 20 beschrieben; in diesem Fall weist die geeignete Oberfläche drei geeignete Bereiche A, B und C auf, die drei jeweils verschiedene Rezeptoren aufweisen, und die an drei identifizierten geographischen Positionen angeordnet sind. Durch ein wie in Fig. 21 beschriebenes besonderes Anwendungsverfahren werden die konjugierten Partikel auf ihren spezifischen Rezeptoren immobilisiert. Das Verfahren weist eine Vorrichtung 14 auf, die ein Kompartiment 15 aufweist, in dem die Ausbildung der komplexen Partikel 5 stattfindet. Dieses Kompartiment kann ein mechanisches Rührsystem aufweisen, oder wenn die verwendeten Partikel magnetisch sind, ein Rührsystem mittels eines Magnetfeldes. Nach einer für die Ausbildung der komplexen Partikel ausreichenden Zeit werden diese über einen Kanal 16 in Kontakt mit der Oberfläche 17 (Mono- oder Multiaffinität) gebracht; der Kanal von geringer Höhe zielt darauf ab, die Höhe der Lösung über der Oberfläche zu begrenzen, so daß die Entfernung begrenzt wird, die ein komplexer Partikel zurücklegen muß, bevor dieser durch seinen spezifischen Rezeptor eingefangen wird. Die Wahrscheinlichkeit der Reaktion von komplexem Partikel und Rezeptor kann vorzugsweise durch das Rezirkulieren-Lassen der Lösung über die begrenzte Oberfläche verbessert werden. Die Vorrichtung beschreibt die Verwendung eines Magneten 12, der sich von einer Position in eine nachfolgende Position verschieben läßt (beispielsweise von Bereich A in Bereich B, anschließend in Bereich C). Gemäß einer weiteren Variante deckt ein einziger Magnet oder mehrere Magneten die gesamte Oberfläche ab, jeder mit Bezug auf einen Bereich A, B oder C, ohne daß sich dadurch das erfindungsgemäße Verfahren ändert. Die beschriebene Vorrichtung kann folglich für die Multidetektion von Analyten, oder für das Trennen von Banken (beispielsweise von Phagen) verwendet werden.
Die zuvor beschriebenen Vorrichtungen können nach Techniken hergestellt werden, die aus den Mikrotechnologien stammen.

Claims

1. Verfahren zum Isolieren von zumindest einem Analyten (4) in einem Medium, in welchem dieser verteilt ist, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist, nämlich:

a) Bereitstellen zumindest eines Reagenz (3), welches einen Träger in einem freien Zustand und von diskreter Form aufweist, und welches zumindest einen Rezeptor für den Analyten enthält,

b) Bereitstellen zumindest eines weiteren Trägers, nämlich zum Einfangen, dessen zugängliche Oberfläche zumindest einen geeigneten oder aktiven Bereich von begrenzter Oberfläche aufweist, wobei dieser zumindest einen weiteren Rezeptor (10) für ein einzufangendes Gebilde, nämlich den Analyten oder den Rezeptor, aufweist, gekennzeichnet durch,

c) in Kontakt bringen des Reagenz (3) mit einer flüssigen Probe, welche aus dem den Analyten enthaltenden Medium gewonnen wird, zur Bildung eines Zwischenmediums, das, nach wie vor in diskreter Form und in dem Medium verteilt, einen Komplex zwischen dem Träger, dem Rezeptor und dem Analyten enthält,

d) in Kontakt bringen der zugänglichen Oberfläche des weiteren Trägers mit zumindest einem zu fangenden Partner, nämlich dem Reagenz, das beim Schritt (c) nicht reagiert hat, oder dem Komplex, um den zu fangenden Partner an die zugängliche Oberfläche zu binden, und um eine konzentrierte Ablagerung in dem geeigneten Bereich zu erzielen, wobei diese auf dem weiteren Träger durch die Bindung zwischen dem weiteren Rezeptor mit dem Rezeptor oder dem Analyten immobilisiert ist,

e) Konzentrieren der Ablagerung des zu fangenden Partners in dem geeigneten Bereich, um die Menge des genannten Partners pro Flächeneinheit in dem geeigneten Bereich zu erhöhen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt e) der Grad der Aufkonzentrierung an zu fangendem Partner so bestimmt wird, daß die Menge des genannten immobilisierten zu fangenden Partners höchstens gleich der Menge des weiteren Rezeptors auf dem weiteren Träger wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Reagenz Trägerpartikel aufweist, die mit dem Rezeptor konjugiert sind, wobei diese die Eigenschaft haben, daß sie von jeglichem flüssigen Medium, in dem diese dispergiert sind, unter der Wirkung eines physikalischen Mittels, das auf das flüssige Medium einwirkt, abgetrennt zu werden, dadurch gekennzeichnet, daß man das physikalische Mittel auf zumindest einen Teil des Zwischenmediums einwirken läßt, um die Partikelkomplexe abzutrennen, wobei ggf. die so abgetrennten Partikelkomplexe gewaschen werden, und daß man die Partikelkomplexe eluiert, wobei die Einwirkung des physikalischen Mittels eingestellt wird, um die Ablagerung in dem geeigneten Bereich an einzufangendem Partner zu konzentrieren.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz magnetische, insbesondere superparamagnetische Trägerpartikel enthält, und daß das physikalische Mittel aus einem Magnetfeld besteht, das auf das Zwischenmedium einwirkt, beispiels mittels einer HGMS (High Gradient Magnetic Separation) genannten Technik.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor und der weitere Rezeptor den gleichen Liganden aufweisen, welcher jeweils auf dem Träger und dem weiteren Träger immobilisiert ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Reagenz Trägerpartikel aufweist, die mit dem Rezeptor konjugiert sind, wobei diese die Eigenschaft aufweisen, daß sie von jeglichem flüssigem Medium in dem diese dispergiert sind unter der Wirkung eines physikalischen Mittels, das auf das flüssige Medium einwirkt getrennt zu werden, dadurch gekennzeichnet, daß man das physikalische Mittel in Zusammenhang mit dem weiteren Träger anwendet, um die Ablagerung in dem geeigneten Bereich zu konzentrieren.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz markiert ist, und daß die Behandlung des Analyten einen Schritt zur Bestimmung der Markierung der konzentrierten Ablagerung aufweist, die im geeigneten Bereich des anderen Trägers immobilisiert ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung des Reagenz auf zumindest einer der folgenden Art und Weisen erhalten wird, nämlich:

- der Träger selbst bildet einen Marker

- ein Marker ist mit dem Träger verbunden

- ein Marker ist mit dem Rezeptor verbunden.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt aus der konzentrierten Ablagerung in dem geeigneten Bereich bestimmt wird, und zwar durch ein Verfahren ausgewählt aus der Gruppe die folgendes einschließt, nämlich topographische Methoden, bspw. durch Atomkraftmikroskopie (abgekürzt AFM), magnetische Verfahren, z. B. durch Magnetkraftmikroskopie, elektrische Methoden, bspw. durch Messung einer Änderung der Kapazität oder des Widerstandes, optische Methoden, bspw. durch Messen des Refraktionindexes, und Verfahren zur Messung von Massenänderungen, bspw. durch Quarzkristall- Mikrobalance.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der geeignete Bereich so dimensioniert ist, daß die Menge der immobilisierten Ablagerung auf dem weiteren Träger zumindest gleich der Empfindlichkeitsschwelle des Bestimmungsverfahrens ist, ausgedrückt als Anzahl von Partikeln pro Oberflächeneinheit.

11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Art des Assays direkt ist, dadurch gekennzeichnet, daß der zu fangende Partner der Komplex zwischen dem Träger, dem Rezeptor und dem Analyten ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Art des Assays kompetitiv ist, dadurch gekennzeichnet, daß der zu fangende Partner das Reagenz ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Zwischenmedium eine weitere Probe gewonnen wird, indem das Zwischenmedium bezüglich des Komplexes angereichert wird, und die weitere Probe wird mit der zugänglichen Oberfläche des weiteren Trägers in Kontakt gebracht.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Probe mit der zugänglichen Oberfläche des weiteren Trägers in Kontakt gebracht wird, indem eine dosierte Menge der weiteren Probe auf die zugängliche Oberfläche des letzteren gebracht wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Probe mit der zugänglichen Oberfläche des weiteren Trägers in Kontakt gebracht wird, indem ein Strom der weiteren Probe mit einer relativ geringen Dicke, ggf. wiederholt, unter Berührung der zugänglichen Oberfläche vorbeigeführt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das flüssige Medium eine Vielzahl von unterschiedlichen Analyten aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die zugängliche Oberfläche des weiteren Trägers eine Vielzahl von geeigneten Bereichen aufweist, die eine Vielzahl von jeweils unterschiedlichen weiteren Rezeptoren für entsprechend unterschiedliche zu fangende Partner aufweisen.