DE69736813T2

DE69736813T2 - Serum-freie zellkulturmedien

Info

Publication number: DE69736813T2
Application number: DE1997636813
Authority: DE
Inventors: Kjell Bertheussen
Original assignee: Medi-Cult AS
Current assignee: Medi-Cult AS
Priority date: 1996-12-04
Filing date: 1997-12-01
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2017-12-02
Also published as: EP0950090A1; US20050227355A1; DE69736813D1; EP0950090B1; IL130281A0; NO992704D0; WO1998024883A3; WO1998024883A2; NO992704L; CA2273082A1; IL130281A; GB9625175D0; JP2001505058A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zellkulturmedien und Zusammensetzungen für die Verwendung beim Herstellen solcher Medien.
Zellkulturmedien werden für die Kultur einer großen Auswahl an Zelltypen unter variierenden Umständen und für variierende Zwecke verwendet, welche die Teilung und Vermehrung der Zellen einschließen kann oder nicht. Der Begriff „Zellkulturmedium" wird hierin verwendet, um sich auf jedes Medium zu beziehen, in welchem Zellen in vitro in einem aktiven und lebensfähigen Zustand gehalten werden.
Wie es in dieser Technik gut verstanden ist, erfordert die Kultur von Zellen die Versorgung der Zellen mit Materialien, welche sie für die Aufrechterhaltung von Lebensfähigkeit und, falls gewünscht, für die Produktion von Zellprodukten und/oder die Vermehrung der Zellen brauchen. Während viele dieser Materialien in gereinigter oder synthetischer Form geliefert werden können, war Serum traditionell für die Bereitstellung von Anderen erforderlich. Die für Zellen in Kultur erforderlichen einfacheren Materialien können in einem Grundzellkulturmedium formuliert sein, das typischerweise anorganische Salze, Aminosäuren, Vitamine und zahlreiche andere Additive enthält. Eine Anzahl von Formulierungen solcher Grundmedien wurde vorgeschlagen. In solchen Grundmedien ohne Serumergänzung sterben Zellen jedoch schnell ab. Serum enthält eine Anzahl von biochemischen Einheiten, welche die Zellen für das Überleben in solchen Grundmedien brauchen. Einige dieser Einheiten schützen die Zellen vor toxischen Verunreinigungen in den Grundmedien, wovon manche die Produkte der Zellen selber sein können, und andere dienen dazu, den Zellen Eisen und Spurenmetalle in einer Weise zu präsentieren, welche die Zellen verwenden können. Die Zugabe von Serum kann ein gut funktionierendes Medium für viele unterschiedliche Zelltypen produzieren, Serum bringt aber schwere Nachteile mit sich.
Diese Nachteile veranlassten Versuche, sich erfolgreiche Zellkulturmedien, die serumfrei sind, auszudenken. Diese Nachteile schließen die folgenden ein:

– Serum ist für Zellen ein unphysiologisches Fluid aufgrund vieler Unterschiede in der Zusammensetzung im Vergleich mit dem interstitiellen Gewebefluid und auch, wenn es mit Plasma verglichen wird;
– Serum hat eine entzündliche und transformierende Wirkung auf Zellen, wodurch Überstimulierung und andere Phänomene aufgrund seines Gehaltes an Produkten, die aus Blutplättchen und Leukozyten freigesetzt werden, induzieren;
– Antikörper und Plasmafaktoren erzeugen eine starke oder destruktive Wechselwirkung in wissenschaftlichen Experimenten und bei der biotechnologischen Produktion. Zum Beispiel wird die Produktion von gereinigten monoklonalen Antikörpern viel schwieriger gemacht;
– Da der Blutstrom ein Transportsystem für Nährstoffe und auch für Abfallprodukte darstellt, werden sämtliche Arten an Abfallprodukten aus der Nahrungsaufnahme des Körpers und aus dem Metabolismus den kultivierten Zellen präsentiert werden, möglicherweise mit Schlachthofverunreinigungen;
– Serum wird einer Hitzebehandlung ausgesetzt, um lytische Bestandteile zu inaktivieren, was auch eine denaturierende Wirkung auf etliche Serumproteine hat;
– Serum ist kein reproduzierbares und festgelegtes Material. Signifikante Variationen in den Chargen beeinträchtigen die Reproduzierbarkeit von Kulturvorgängen;
– Serum kann bekannte und unbekannte unerwünschte Materialien, einschließlich viralen Pathogenen oder solche vom Priontyp, enthalten; und
– Serum kann teuer sein und schwierig zu erwerben sein.

Schließlich, während serumenthaltende Medien besonders erfolgreich für Zellen mesodermalen Ursprungs waren, erwiesen sich Zellen, die aus embryonalem Ektoderm oder Endoderm stammen, als am schwierigsten in einem guten Zustand in serumergänzten Grundmedien zu halten. Dies gilt auch für Gameten, sowohl Eizellen als auch Spermienzellen.
Ein Hauptfortschritt bei der Formulierung von Zellkulturmedien, wodurch die Anwesenheit von Serum eliminiert wird, wurde von uns in US-A-5,095,454 beschrieben. Dort wurde ein Additiv zu Grundmedien, umfassend EDTA in Kombination mit Citratpuffer, um Eisen zu komplexieren und seine Fällung zu verhindern, und Aurintricarboxylsäure, um das Eisen an Zellen wirksam zu präsentieren, beschrieben. Die vorliegende Erfindung stellt eine Anzahl von verschiedenen und gesondert nützlichen Verbesserungen an den zuvor erhältlichen Medien bereit, wovon jede selbst beim Verbessern der Medien, beschrieben in US-A-5,045,454, besonders nützlich ist, oder in Kombination mit einem oder mehreren der anderen.
Der Einschluss von Lipiden in Zellkulturmedien ist ein lange bestehendes Problem. Lipide, von welchen gewünscht ist sie einzuschließen, haben eine Reihe von unterschiedlichen Funktionen. Sie schließen langkettige Fettsäuren, fettlösliche Vitamine und Sterole wie Cholesterol ein. Die direkte Zugabe von Lipiden ist nicht praktisch, aufgrund ihrer geringen Löslichkeit. Üblicherweise werden in serumenthaltenden Medien die Lipide dem Medium in dem Serum zugesetzt, worin die Lipide als lösliche Lipoproteine aufgenommen werden. In serumfreien Medien können Lipide durch Albumin aufgenommen werden, aber es ist natürlich wünschenswert, die Verwendung von Albumin ebenfalls zu vermeiden. Eine Anzahl von Publikationen, einschließlich „Nutritional and Hormonal Requirements of Mammalian Cells in Culture", D. Barnes, Wld. Rev. Nutr. Diet., Band 45, Seiten 167-197, beschreiben die Bereitstellung von Lipiden in Zellkultur über den Einschluss von Liposomen, welche unter Verwendung von Phospholipiden gebildet werden, wie zum Beispiel jene, die in solchen Quellen wie Dorschleberöl gefunden werden (WO-A-89/01027 und andere, zum Beispiel WO 90/03429). Aus praktischen Gründen kann das in das Medium einzuschließende Cholesterol mit den Lipiden in solchen Liposomen hinzugefügt werden.
Solche Verfahren involvieren die Verwendung von schlecht charakterisierten Materialien wie Dorschleberöl, die als die Quelle der Phospholipide dienen, welche für die Produktion der benötigten Liposomen oder Mikroemulsionen gebraucht werden. Dies ist wiederum eine unerwünschte Eigenschaft solcher Medien. Es verbleibt ein Bedarf für ein akzeptableres Verfahren des Einschließens von Cholesterol in die Medien.
US-A-4,533,637 beschreibt die Bildung von Einschlusskomplexen zwischen Lipiden und Cyclodextrinen. Wir fanden heraus, dass Lipidfettsäuren und andere mit Cyclodextrinen komplexierte Lipide in Zellkultur nicht gut funktionieren – zum Teil aufgrund der geringen Stabilität in Lösung.
„Biochemistry – The Molecular Basis of Cell Structure and Function", Albert L. Lehninger, Worth Publishers Inc. 1970, Seiten 513-514, offenbart, dass Essigsäure ein metabolischer Vorläufer von längerkettigen Fettsäuren in einer isolierten Überstandfraktion der Leber nach Entfernung von Mitochondrien durch Zentrifugation, aber nur in der Anwesenheit von Kohlendioxid oder Bicarbonat, sein kann. Es wird ein Stoffwechselweg durch Malonyl-CoA, gebildet aus Acetyl-CoA, beschrieben.
US-A-5,378,612 beschreibt Medien mit niedrigem Proteingehalt, in welchen das oberflächenaktive Mittel Pluronic F-68 in Kombination mit Cyclodextrin verwendet wird. Buttersäure wird hinzugefügt, um die Proteinexpression zu erhöhen, und Lithiumsalze, einschließlich Lithiumacetat, werden ebenfalls zu diesem Zweck hinzugefügt. Es wird jedoch keine wachstumsfördernde Wirkung aufgrund des Zusatzes von Carboxylsäuren und ihren Salzen bemerkt oder beabsichtigt. Die beschriebenen Medien sind für das Erzeugen von Zellwachstum ungeeignet. Sie erlauben einen kurzen Zeitraum der Proteinproduktion vor dem letztlichen Zelltod. Diese Vorgehensweise wird durch das Fehlen eines geeigneten proteinfreien Wachstumsmediums erforderlich gemacht. Etliche andere Offenbarungen bemerkten auch die Proteinexpression steigernde Wirkung von Buttersäure, ohne dass irgendein zellwachstumsfördernder Effekt beschrieben worden wäre.
Ethanol wurde beim Zubereiten von Kulturmedien für den Zweck des Lösens von fetten Materialien, einschließlich Cholesterol, und anderen hydrophoben Verbindungen verwendet, wenn ein Konzentrat gemacht wird, das in wässrigen Medien zu einem späteren Zeitpunkt verdünnt werden soll, z. B. in WO-A-52/04988. Demgemäß war Ethanol in etlichen Zellkulturmedien in der Vergangenheit in. kleinen Mengen anwesend, das aus seiner Verwendung als Lösungsmittel für Lipide wie Cholesterol herübergetragen worden ist. Zum Beispiel enthält CMRL 1066 (eine Standardgrundmedienformulierung – siehe „Culture of animal cells" R.I. Freshney, 3. Auflage, Willey-Liss) aus diesem Grund 16 mg/l Ethanol. WO 92/22637 beschreibt die Löslichmachung von Cholesterol in Ethanol, gefolgt von der Produktion von Liposomen für die Zugabe zu Kulturmedien. Die durch diesen Weg in den Zellkulturmedien vorhandenen Ethanolmengen werden jedoch nicht adäquat gewesen sein, um eine signifikante wachstumsfördernde Wirkung bereitzustellen, wie sie hiernach gemäß der Erfindung beschrieben wird. Auch wird, wenn Ethanol in einem serumergänzten Medium inkludiert wird, keine wachstumsfördernde Wirkung beobachtet.
Wir machten nun eine Anzahl von Entdeckungen, was in verbesserten Zellkulturmedien resultiert, die gesondert oder in Kombinationen mit etlichen oder sämtlichen solcher Verbesserungen genutzt werden können.
Erstens fanden wir nun überraschenderweise, dass ein oberflächenaktives Mittel, z. B. ein oberflächenaktives Mittel des Typs, der als PLURONIC F68 (PF68) bekannt ist, zu dem Ausschluss von Proteinmitteln verwendet werden kann, um ansonsten wasserunlösliche Lipide wie Cholesterol und/oder andere Sterole in serumfreien Medien einzubrigen. PLURONIC P68 ist auch unter dem Namen POLOXAMER 188, POLOXALKOL und EXOCORPOL bekannt.
Dies erlaubt es, dass das Lipiderfordernis durch ein stabiles, synthetisch produziertes, chemisch reines Material befriedigt wird, wohingegen in Medien wie CMRL 1066 das Cholesterol ausfallen würde, und in jüngeren Medien ist das Cholesterol nicht in reiner Form vorhanden, sondern durch Proteine stabilisiert, welche aus natürlichen Quellen aufgereinigt sind und Probleme des Fehlens der Reproduzierbarkeit und der möglichen Kontamination einführen.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Zellkulturmedium bereit, das eines oder mehrere Lipide enthält, z. B. ein Sterol oder ein Ester davon als ein metabolisch annehmbares Derivat, die in Lösung durch eines oder mehrere oberflächenaktive Mittel stabilisiert sind und im Wesentlichen unter Abwesenheit von Protein oder von Phospholipid.
Die Zellkulturmedien der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise Wachstumsmedien.
Das Sterol oder Esterderivat davon kann eines oder mehrere der folgenden sein: Cholesterol, Campersterol, Desmosterol, Ergosterol (hergestellt durch Hefe), Fucosterol, β-Sitosterol (hergestellt aus Sojabohnen), Stigmasterol oder ein metabolisch annehmbares Esterderivat davon. Geeigneterweise ist der Ester ein Acetat. Als weitere Alternativen zu Cholesterol können andere Sterole, einschließlich andere Methylcholesterole, verschiedene Hydroxycholesterole, Epicholesterol, Cholestanol und β-Östradiol verwendet werden.
Im Hinblick auf die unten beschriebenen überragenden Ergebnisse schließt die Erfindung ein Zellkulturmedium ein, das eine Mischung aus Campesterol und β-Sitosterol enthält.
Das Lipid kann durch ein oberflächenaktives α-Hydro-w-hydroxypolyoxyethylen)poly(oxypropylen)poly(oxyethylen)-Block-Copolymer der Struktur HO(CH₂CH₂O)_a(CH(CH₃)-CH₂O)_b(CH₂CH₂O)_cH, wo a von 50 bis 100 ist, b von 20 bis 40 ist und c von 50 bis 100 ist, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 7.500 bis 10.000, solubilisiert sein.
Vorzugsweise sind a = 75, b = 30 und c = 75 und dieses Durchschnittsmolekulargewicht beträgt ungefähr 8350.
Bevorzugter ist dieses oberflächenaktive Mittel PLURONIC F68. Andere oberflächenaktive Mittel, besonders nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, welche nicht mit der Wirkung des Zellkulturmediums in Wechselwirkung treten, können eingeschlossen werden, sind jedoch bevorzugt abwesend, z. B. polyoxyethylensorbitanmonooleatartige oberflächenaktive Mittel wie Tween 80.
Es wurde jedoch herausgefunden, dass das natürliche oberflächenaktive Mittel Cholinsäure in gewissen Arten an Zellkulturen eine wachstumsstimulierende Wirkung bereitstellen.
Vorzugsweise enthält das Kulturmedium von 0,05 bis 20 mg/l Cholesterol, bevorzugter von 0,5 bis 10 mg/l, zum Beispiel von 1 bis 4 mg/l.
Vorzugsweise umfasst das Kulturmedium von 20 bis 300 mg/l dieses oberflächenaktiven Mittels, bevorzugter von 50 bis 200 mg/l, bevorzugter ungefähr 100 mg/l.
Das Cholesterol oder anderes Sterol und das oberflächenaktive Mittel können in einer konzentrierten Lösung für die Zugabe zu einem Grundmedium zubereitet werden, um ein Kulturmedium zu bilden, das diese Materialien in den erforderlichen Mengen enthält. Solch eine Konzentration wird üblicherweise durch ihre Auflösung in Alkohol, vorzugsweise Ethanol, zubereitet und die Addition solch eines Konzentrates zu einem Grundmedium, wie im Detail hiernach beschrieben, kann dem Grundmedium eine Alkoholmenge bereitstellen, die ausreichend ist, eine zellwachstumsfördernde Wirkung gemäß einem alternativen Aspekt der Erfindung bereitzustellen.
Das Zellkulturmedium kann weiter eine lösliche Carboxylsäure oder ein metabolisch annehmbares Derivat davon, wie zum Beispiel ein metabolischer Vorläufer von Lipidfettsäuren, enthalten. Diese Carboxylsäure ist vorzugsweise eine C₂- bis C₇-Carboxylsäure, welche bevorzugt gesättigt ist und vorzugsweise eine Carboxylsäuregruppe enthält. Die Carboxylsäure kann zu der Säure als solche oder in der Form eines metabolisch annehmbaren Salzes oder anderen Derivates wie ein Ester hinzugefügt werden. Vorzugsweise liegen diese Carboxylsäure oder das Derivat in einer Konzentration von 10 μM bis 10 mM, bevorzugter von 50 μM bis 1 mM, z. B. von 100 bis 300 μM, am bevorzugtesten bei ungefähr 100 μM, vor.
Das Zellkulturmedium kann einen Alkohol enthalten, der in der Lage ist Zellwachstum zu fördern, in einer effektiven wachstumsfördernden Konzentration von wenigstens 0,01 % Vol/Vol, wodurch er als ein zellwachstumsförderndes Mittel wirkt.
Vorzugsweise ist diese Alkoholkonzentration von 0,01 % bis 1,0 % Vol/Vol, bevorzugter von 0,075 % bis 0,5 % Vol/Vol, zum Beispiel von 0,1 % bis 0,3 % Vol/Vol.
Dieser Alkohol kann ein C₁- bis C₄-Monoalkohol oder Diol sein. Geeignete Alkohole schließen Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Ethylenglykol, Propylenglykol oder Glycerol ein, aber Ethanol wird am meisten bevorzugt. Vorzugsweise beträgt die Alkoholkonzentration wenigstens 0,01 % bis 0,25 % Vol/Vol, zum Beispiel von 0,075 % bis 0,2 % Vol/Vol, bevorzugter von 0,1 % bis 0,15 % Vol/Vol (1 % Ethanol Vol/Vol = 7,9 g/l).
Wie oben erwähnt wird Cholesterol in gewissen Zellkulturmedien eingeschlossen, um Lipid bereitzustellen, oftmals in Kombination mit anderen Lipiden wie Lecithin, Sphingomyelin, fettlösliche Vitamine (A, D, E und K), Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Dipalmitoylphosphatidinsäure und Fettsäuren. Der Einschluss dieser hydrophoben Materialien stellt Probleme. Dies wurde in der Vergangenheit durch die Verwendung von Komplexlipoproteinen, Cyclodextrin oder Lipidmizellen, die in Albumin aufrechterhalten wurden, um das Cholesterol zu stabilisieren, angegangen.
Eine weitere Schwierigkeit beim Zubereiten zufriedenstellender serumfreier Medien in der Vergangenheit stand im Zusammenhang mit dem Einschluss von Fettsäuren. Diese stellen ein Stabilitätsproblem dar und sind zusätzlich chemisch instabil, wodurch sie Gegenstand von Oxidation sind. Wir fanden überraschenderweise heraus, dass lösliche Carboxylsäuren und ihre Derivate wie Salze und Ester in Zellkultur für die Synthese von Fettsäuren durch Zellen genutzt werden können, wodurch der Bedarf, Fettsäuren in den Zellkulturmedien selber einzuschließen, beseitigt wird. Gewisse Grundmedienformulierungen inkludieren eine oder mehrere Fettsäuren wie Linolensäure. In diesen Formulierungen ist die Linolensäure jedoch nicht in einer nützlichen Form vorhanden. Sie wird auf einmal ausfallsen, wenn das Medium für die Verwendung fertiggemacht wird. Es ist deshalb in der Praxis notwendig, lipidlösliche Materialien wie Serum, Albumin oder Liposomen hinzuzufügen, um die Medien für Zellen akzeptabel zu machen. Demgemäß mag ein Wachstumsmedium für Zellkultur gemäß der Erfindung eine lösliche Carboxylsäure oder ein metabolisch annehmbares Derivat davon enthalten, um einen metabolischen Vorläufer von Lipidfettsäuren bereitzustellen und/oder um die Zellwachstumsrate zu steigern. Geeignete Carboxylsäuren und ihre Derivate sind oben beschrieben.
Vorzugsweise ist die Konzentration der löslichen Carboxylsäure oder des Salzes in dem Kulturmedium oben gegeben.
Das Medium kann Polyvinylpyrrolidon wie PVP-10, Molekulargewicht 10.000, umfassen. Geeigneterweise ist dieses bei einer Konzentration von 25 bis 10.000 mg/l, bevorzugter von 100 bis 500 mg/l, z. B. ungefähr 250 mg/l, vorhanden.
Das Kulturmedium kann zusätzlich sämtliche oder irgendwelche der Bestandteile in den Verhältnissen oder Mengen, die in US-A-5,045,454 für die Verwendung in jener Erfindung offenbart sind, enthalten.
Wie dort offenbart umfasst das Medium vorzugsweise einen oder mehrere Komplexbildner, wodurch die Fällung von Eisen bei Kulturtemperaturen, typischerweise 37 °C, verhindert wird. Die bevorzugtesten Komplexbildner sind EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und Citratpuffer. Vorzugsweise ist das molare Verhältnis von Citratpuffer zu EDTA wenigstens 3:1 Citratpuffer:SDTA durch die molare Konzentration, bevorzugter ungefähr 10:1 Citratpuffer:SDTA, wobei Citratpuffer die Summe von Zitronensäure und Citrat darstellt.
Eisen wird vorzugsweise dem Medium als der Metallchelatkomplex, definiert als Fe-EDTA, gemeinsam mit Citratpuffer geliefert. Genauer können ungefähr 2,4 bis 3,6 μM Fe-EDTA und ungefähr 0,8 bis 1,2 μM Na₂- (oder K₂-) EDTA mit ungefähr 12 bis 18 μM Zitronensäure und ungefähr 20 bis 30 μM Na₃-Citrat bereitgestellt werden. Andere biokompatible Komplexbildungsmittel können verwendet werden.
Ein Mittel, um Eisen den Zellen zu präsentieren, wird vorzugsweise bereitgestellt, welches bevorzugt Aurintricarboxylsäure ist. Dieses ist vorzugsweise bei einer Konzentration von 0,1 bis 10 μM, bevorzugter von 2,4 bis 3,6 μM, z. B. 3 μM, vorhanden.
Der pH-Wert des Mediums kann zwischen 7,0 und 7,8 betragen, am bevorzugtesten ist er ungefähr 7,4, aber das Optimum kann aufgrund der Art der Zellen in Kultur variieren.
Das Kulturmedium ist vorzugsweise serumfrei und auch proteinfrei, mit der Ausnahme, dass es vorteilhaft sein kann, eine kleine Menge Insulin hinzuzufügen, wie beschrieben in US-A-5,045,454.
Medien, die Insulin in der geeigneten Konzentration für seine Verwendung enthalten, können immer noch als im Wesentlichen proteinfrei angesehen werden.
Analog zu den dort beschriebenen Verfahren können die Kulturmedien gemäß den verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung zubereitet werden, indem eines einer Anzahl von Standard- oder modifizierten Grundmedien hergerichtet wird und zu ihnen die in US-A-045,454 offenbarten Additive aus einer oder mehreren Konzentratlösungen und die weiteren Additive, die durch die vorliegende Erfindung erforderlich sind, aus einem oder mehreren weiteren Konzentraten hinzugefügt werden.
Die Grundmedien können alle Fachleuten bekannten sein, einschließlich Eagle's MEM, Dulbeccos modifiziertes Eagle's MEM, Ham's F10/F12, CMRL, RPMI 1640, 199, L15, Fischer's oder Waymouth's MB 752/1 (siehe Referenz 1). Vorzugsweise ist das Grundmedium jedoch RPMI 1640. RPMI-X (ein modifiziertes RPMI 1640, enthaltend 20 mM HEPES und Pyruvat) wird für die Kultur von Zellen der Leukozyten- und retikuloendothelialen Linien, einschließlich Lymphozytenhybridomen, bevorzugt, während DME/F12 für die Verwendung von anderen Zelltypen bevorzugt wird.
Die empfohlene Konzentration an Bicarbonat ist 2,2 g/l und Antibiotika wie Penicillin oder Streptomycin sollten bevorzugt 50 U/ml bzw. 50 μg/ml nicht überschreiten.
Zu solchen Grundmedien können eine geeignete Menge eines „SSR2" hinzugefügt werden, wie beschrieben in US-A-5,045,454, d. h. eine Lösung, die EDTA, Citrat, Eisen und Aurintricarboxylsäure enthält, ebenso wie optional PLURONIC F68, z. B. eine „Lösung A" („Solution A", US 5,045,454 , Spalte 5), enthaltend 20 mg/ml PLURONIC F68, ungefähr 4 mM EDTA, ungefähr 3 mM Fe, ungefähr 40 mM Natriumcitrat/Zitronensäure, ungefähr 3 mM Aurintricarboxylsäure und optional ungefähr 1 % Spurenelemente. Diese Mengen sind geeignet für eine tausendfache Formulierung, d. h. eine Lösung, die tausendmal die Konzentration jener Bestandteile enthält, die in der Endlösung gewünscht sind, und von welcher deshalb beabsichtigt wird, dass sie mit 1000 Teilen des Grundkulturmediums verdünnt wird. Die Spurenelemente können Mn (ungefähr 1 μM), Cr (ungefähr 1 μM), Zn (ungefähr 0,1 mM), Ni (ungefähr 0,2 μM), Co (ungefähr 0,2 μM), Cu (ungefähr 20 μM), Al (ungefähr 2 μM) und Se (ungefähr 10 μM) umfassen.
Das Grundkulturmedium kann weiter mit einer geeigneten Menge einer weiteren Konzentratlösung der Art, auf die in US-A-5,045,454 als „Solution B" (Lösung B) Bezug genommen wird, umfassend ungefähr 0,5 mg/ml Insluin (1000x), ergänzt werden.
In Anbetracht des Obigen schließt die Erfindung ein Additiv für die Zugabe zu einem Grundzellkulturmedium ein, um ein serumfreies Zellkulturmedium zu bilden, umfassend:
Ethanol als Lösungsmittel
ein Sterol oder metabolisch annehmbaren Ester davon und
eine lösliche Carboxylsäure, welche bei der Verwendung als ein metabolischer Vorläufer von Lipidfettsäuren wirkt, wobei dieses Sterol oder der Ester davon in der Additivlösung in der Abwesenheit von Protein oder Phospholipiden gelöst ist.
Um die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung zu verwirklichen, kann ein ergänztes Grundmedium, wie oben beschrieben, weiter durch die Zugabe einer geeigneten Menge eines weiteren Konzentrates, umfassend Cholesterol in Ethanollösung, ebenfalls Essigsäure enthaltend, weiter modifiziert werden. Andere Bestandteile, welche hierin inkludiert sein können, sind PVP 10 und Ethanolamin.
Eine geeignete Zusammensetzung für solch eine 1000x „Solution Cx" (Lösung Cx) wird sein:

– Ethanol 96 %, 1 Liter
– Cholesterol (zellkulturüberprüft), 2 g (z. B.: Sigma C-7402 C-3405)
– PVP-10, 250 g (pflanzenzellgetestet), z. B. Sigma P-2307
– konzentrierte Essigsäure, 6 ml (auf 100 mM)
– 1,2 ml konzentrierte Lösung aus Ethanolamin (auf 20 mM)
– pH-Wert des Konzentrates 6,5.

In Abhängigkeit von seiner beabsichtigten Verwendung kann das Zellkulturmedium weiter unter Verwendung eines Konzentrates „Solution Dx" (Lösung Dx), enthaltend Ethanol und PVP-10, ergänzt werden, z. B. eine 1000x-Lösung, enthaltend:

– Ethanol 96 %, 500 ml
– Wasser, 500 ml
– PLURONIC F68, 100 g (Serva 35724 oder Sigma P-1300).

Wir fanden heraus, dass gewisse im Handel erhältliche Grundkulturmedien in der Lage sind, durch einen Eisenkonditionierungsprozess verbessert zu werden, was in einer wachstumsstimulierenden Wirkung resultiert, welche an der chemischen Reduktion von organischen Molekülen und der Absorption von toxischen Bestandteilen in ein durch den Vorgang produziertes frisches Präzipitat von Eisenhydroxid liegen kann.
Demgemäß kann man das Grundkulturmedium für gesteigertes Zellwachstum durch das Einschließen von angesäuertem Eisensulfat in Wasser konditionieren, verwendet, um ein Grundzellkulturmedium in Pulverform aufzufüllen und um Eisenhydroxid aus dem aufgefüllten Pulver durch die Zugabe von Bicarbonat auszufällen.
Das so erzeugte konditionierte Grundmedium sollte sterilfiltriert werden, um das Präzipitat vor der Zugabe der Lösungen A, B, Cx und, falls erforderlich, Dx, oben beschrieben, zu entfernen, falls die anderen Aspekte der Erfindung auch verwendet werden sollen.
Eine 1000x-Lösung für die Verwendung bei diesem Konditionierungsschritt kann durch Auflösen von FeSO₄ auf 50 mM in 100 ml Wasser plus 0,2 ml 2,5 M H₂SO₄ und zehnfacher Verdünnung in Wasser zubereitet werden.
Im Handel erhältliche, von Sigma und Imperial produzierte Medienpulver ziehen aus diesem Konditionierungsvorgang einen Nutzen. Allgemein gesprochen wird der Konditionierungsprozess nicht geeignet sein für konventionelle IVF-Medien und Hams Medien, HF 10/12, MCDB-Medien und DME/F 12; sie enthalten vergleichsweise hohe Mengen an instabilem Eisensulfat und sollten nicht auf diesem Wege behandelt werden.
Der Konditionierungsvorgang sollte deshalb allgemein auf Grundmedien angewendet werden, die als ein Ergebnis ein besseres Zellwachstum produzieren werden.
Die Erfindung wird weiter erläutert werden durch die folgende Beschreibung von bevorzugten Eigenschaften und erläuternden Beispielen davon mit Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen, in welchen:
1 die wachstumsfördernden Wirkungen von Ethanol in Zellkultur zeigt, wie in Beispiel 1a gefunden;
2 die wachstumsfördernden Wirkungen von Methanol wie in Beispiel 1b gefunden zeigt;
die 3 bis 7 Zellwachstumsmessungen zeigen, berichtet jeweils in den Beispielen 2 bis 6;
die 8 bis 13 Ergebnisse zeigen, die in Beispiel 8 gewonnen worden sind;
die 14 bis 16 in Beispiel 9 gewonnene Ergebnisse zeigen;
die 17 und 18 in Beispiel 10 gewonnene Ergebnisse zeigen; und
19 in Beispiel 11 gemessene Proteinexpression zeigt.
Die Kultivierung anhaftender Zellen oder von Lymphozyten, welche in Kultur von durch anhaftende Zellen produzierten Cytokinen abhängen, wird vorzugsweise auf mit Gelatine und Fibronektin überzogenen TC-Plastikartikeln durchgeführt. Wenn mit Gelatine vorüberzogene TC-Plastikartikel mit aktivem Serum behandelt werden, z. B. fötales Rinderserum, bindet Fibronektin selektiv an die Gelatineoberfläche und macht dies nach Waschen zum optimalen Substrat für Kultur unter Verwendung von serumfreien Medien.
Etliche transformierte anhaftende Zelllinien können in Suspension zum Beispiel in DME/F12, ergänzt durch die Lösungen A, B, Cx und Dx, kultiviert werden, zum Beispiel die Linien CHO-K1, MDBK, HELA S3 und gewisse WEHI-Linien. Die Zellen neigen dazu, als Mikroaggregate zu wachsen, und man sollte eine Art an TC-Plastikartikeln mit minimalen anhaftenden Eigenschaften auswählen, da eine schwache Anhaftung wachstumsinhibierend ist im Vergleich mit entweder gar keiner Anhaftung oder starker Anhaftung. Ähnliche Plastikartikel mit niedriger Anhaftung sollten verwendet werden, um Lymphozytenhybridome in RPMI-X zu kultivieren, ergänzt mit den Lösungen A, B, Cx und Dx. Die in den Figuren gezeigten Wachstumskurven wurden unter Verwendung von Nunc-TC-Flaschen erzielt.
Vorteile der bevorzugten Zellkulturmedien der Erfindung in ihren zahlreichen Aspekten schließen die Folgenden ein. Die Anwesenheit von PVP-10 ist vorteilhaft dahingehend, dass es organische Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht bindet, zum Beispiel phenolische Bestandteile, d. h. es zeigt albuminähnliche Eigenschaften. Es entgiftet deshalb Abfallprodukte in Zellkulturen mit hoher Dichte und steigert dadurch die Produktivität der Zellkultur, indem eine hohe Zelldichte erleichtert wird.
Cholesterol wird in dem Endmedium bei Lagerungstemperatur (4 °C) durch das oberflächenaktive Mittel PLURONIC F68 in Lösung gehalten, welches aus den Lösungen A und Dx und durch den Beitrag von Ethanol aus der Lösung Cx stammt. Cholesterol wird bei Kultivierungstemperaturen (37 °C) weniger löslich und wird schrittweise in Zellkulturen ausfallen, sofern die Zelldichte nicht wenigstens 10⁵ Zellen/ml ist, was in der Praxis immer in Zellkultur für biotechnologische Produktionszwecke der Fall ist. Folglich wird der Bedarf, Cholesterol in einem löslichen Zustand zu präsentieren, ohne den Einschluss von Lipoproteinen und anderen unerwünschten komplexbildenden Materialien erfüllt.
Die Balance der Menge an Cholesterol und PLURONIC F68 kann eingestellt werden, um für die kultivierten Zellen geeignet zu sein. Die Verwendung der Lösungen A, B und Cx führt zu einer hohen Oberflächenspannung, welche die Anhaftung von anhaftenden Zellen an eine feste Oberfläche fördert. Die hohe Oberflächenspannung wird ermöglicht durch eine hohe Konzentration an Cholesterol im Verhältnis zu dem oberflächenaktiven Mittel. Als ein Ergebnis davon ist das Cholesterol weniger stabil als wenn Lösung Dx ebenfalls hinzugefügt wird, aber zur selben Zeit wird die hohe Oberflächenspannung während des gesamten Kultivierungszeitraums sichergestellt. Ein kleines Präzipitat aus Cholesterol kann möglicherweise zuerst die Zellmonoschicht überdecken, aber diese wird schnell während der ersten 24 Stunden der Kultivierung absorbiert werden.
Indem auch die Lösung Dx eingeschlossen wird, wird eine niedrigere Oberflächenspannung erzeugt, indem das Verhältnis zwischen Cholesterol und PLURONIC F68 geändert wird. Die resultierende Oberflächenspannung begünstigt die Kultivierung von Zellen in Suspension.
Sowohl PVP als auch PLURONIC F68 steigern die Viskosität des Mediums und stellen einen mechanischen Schutz für die Zellen bereit.
Sämtliche Bestandteile des Systems haben ein Molekulargewicht von nicht mehr als 10.000, wodurch die Abtrennung des Mediums von zellulären Produkten erleichtert wird.
Es werden keine Proteine oder Peptide eingeschlossen, mit der Ausnahme einer niedrigen Konzentration an Insulin, und es sind keine anderen Produkte tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sind vorhanden, so dass es einen hohen Grad an Reproduzierbarkeit und Stabilität gibt.
Beispiel 1: Die wachstumsfördernde Wirkung von Alkoholen

a) Hybridomzellen wurden in RPMI 1640, ergänzt mit den oben beschriebenen Lösungen A und B, plus 20 mM Ethanolamin, (auf das Bezug genommen wird als RPMI-SR3) kultiviert, und zum Vergleich in demselben Medium, das zusätzlich ergänzt worden ist mit 10 mg/ml Albumin (5 Vol.-%), oder in RPMI 1640, ergänzt mit 10 % v/v Pferdeserum. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Man kann sehen, dass in RPMI-SR3 Konzentrationen an Ethanol von bis zu 1,0 Vol.-% in negativer Inhibition (d. h. Förderung) von Zellwachstum resultieren, aber dass diese Wirkung nicht zu sehen ist, wenn die mit Protein oder Serum ergänzten Medien verwendet werden.
b) Das Obige wurde wiederholt unter Verwendung von Methanol anstelle von Ethanol mit ähnlichen Ergebnissen, dargestellt in 2.

In den folgenden weiteren Beispielen werden Wachstumskurven für Zellen, die in Medien gemäß der Erfindung kultiviert worden sind, und für Zellen, die in Medien gemäß des Standes der Technik kultiviert worden sind, verglichen. Es werden sowohl Zellkultur in Suspension als auch die Kultur von anhaftenden Zellen dargestellt. Eine Reihe von transformierten Zellen wurde in den Medien der Erfindung kultiviert. Transformierte Zellen sind Zellen, die genetisch modifiziert sind, in einer ähnlichen Art wie Krebszellen, dahingehend, dass ihr Wachstum kontinuierlich und nicht reguliert ist, d. h. das Wachstum ist unabhängig von der Anwesenheit von sogenannten Cytokinen (Peptide, die als spezifische und regulatorische Wachstumsfaktoren wirken). Allgemein werden transformierte Zelllinien in proteinfreien Medien der Erfindung annähernd so effizient wachsen wie in Medien, die 10 % Serum enthalten. EBV-transformierte B-Lymphozyten können jedoch gewisse Cytokine in dem Medium erfordern. Wie die folgenden Beispiele zeigen, werden die meisten Hybridome bei einer etwas reduzierten Rate in diesen Medien im Vergleich mit jenen, die Serum enthalten, wachsen, aber die Produktion von Antikörper ist nichtsdestotrotz so gut wie mit Serum, falls nicht besser. Falls die Qualität der Charge des Serums nicht optimal ist, kann das Wachstum niedriger sein als mit Medien gemäß der Erfindung erzieltes Wachstum.
Bei diesen Beispielen wird auf eine Kombination der Lösungen A, B und Cx, wie oben beschrieben, als SSR3X Bezug genommen und, wenn sie zusätzlich mit der oben beschriebenen Lösung Dx ergänzt werden, als SSR4X.
Beispiel 2: Wachstum von BHK-21-Zellen in serumfreiem Medium
BHK-21-Hamsternierenfibroblastenzellen (ATCC CCL 10) wurden an die Kultur angepasst durch zweimonatiges Kultivieren in DME/F12 + SSR3X-Medium der Erfindung. Die Zellen wurden als eine anhaftende Monoschicht in Falcon-T-Flaschen mit 25 cm² kultiviert, enthaltend 7 ml Medium ohne Änderung des Mediums bei einer Aussaatdichte von 40 × 10³ Zellen/ml. Zellzahlen nach bis zu zehn Tagen (wobei nur lebensfähige anhaftende Zellen gezählt werden) sind in 3 gezeigt. Vergleichskulturen unter vergleichbaren Bedingungen wurden unter Verwendung desselben Mediums und entweder mit Gelatine oder mit Fibronectin überzogenen Flaschen oder unüberzogenen Flaschen und auch unter Verwendung des Grundmediums, modifiziert nur mit den Lösungen A und B (SSR 2), wie in US-A-5,045,454, mit unüberzogenen Flaschen durchgeführt. Alle diese werden mit der Verwendung von Grundmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, verglichen.
Es wurde herausgefunden, dass die Morphologie der Zellen in dem SSR 3X enthaltenden Medium im Vergleich mit dem serumenthaltenden Medium überlegen war. Wenn die Kultur Konfluenz erreicht, beginnen die Zellen sich von der Oberfläche abzulösen und werden in dem Medium als große Aggregate oder Platten treiben. In dem serumfreien Medium bleiben die Zellen für einen langen Zeitraum in diesem Stadium am Leben, aber in serumergänztem Medium beginnen die Zellen beim Erreichen von Konfluenz zu sterben.
Aus der Figur kann gesehen werden, dass SSR 3X die Adhäsion im Vergleich mit SSR 2 fördert.
Beispiel 3: Kultur von Vero-Zellen
Vero-Zellen (Affennierenfibroblasten) ATCC CCL 81, wie sie typischerweise bei der viralen Vakzinproduktion verwendet werden. Vergleichskulturen wurden wie in Beispiel 2 durchgeführt. Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Wachstum in dem serumfreien Medium der Erfindung war jenem in serumenthaltendem Medium überlegen und Wachstum konnte sogar in unüberzogenen Platten beobachtet werden, auf welchen kein Wachstum unter Verwendung von SSR 2 erzeugt wurde.
Beispiel 4: Wachstum von WEHI-Zellen
WEHI-164-Mausfibrosarkomzellen ATCC CRL 1751 wurden als eine anhaftende Monoschicht in Falcon-T-Flaschen mit 25 cm², enthaltend 7 ml Medium, ohne Änderungen des Mediums bei einer Aussaatdichte von 40 × 10³ Zellen/ml kultiviert. Zellzahlen nach bis zu zehn Tagen (wobei nur lebensfähige anhaftende Zellen gezählt worden sind) sind in 5 gezeigt. Es wurde herausgefunden, dass die Morphologie der Zellen in dem SSR 3X enthaltenden Medium im Vergleich zu dem serumenthaltenden Medium überlegen war.
Wenn die Kultur Konfluenz erreicht, beginnen die Zellen sich von der Oberfläche abzulösen und werden in dem Medium als große Aggregate oder Platten treiben. In dem serumfreien Medium bleiben die Zellen für einen langen Zeitraum in diesem Zustand am Leben, aber in serumergänztem Medium beginnen die Zellen beim Erreichen von Konfluenz abzusterben.
Aus der Figur kann gesehen werden, dass SSR 3X im Vergleich mit SSR 2 die Adhäsion fördert.
Beispiel 5: Wachstum von ECV-304-Zellen
ECV 304, humane Endothelnabelschnurzellen, ATCC CCL 1998, wurden auf die Kultur angepasst durch zweiwöchiges Kultivieren in DME/F12 + SSR 3X-Medium der Erfindung. Die Zellen wurden als eine anhaftende Monoschicht in Falcon-T-Flaschen mit 25 cm², enthaltend 7 ml Medium, ohne Medienwechsel bei einer Aussaatdichte von 40 × 10³ Zellen/ml kultiviert. Zellzahlen nach bis zu zehn Tagen (wobei nur lebensfähige anhaftende Zellen gezählt worden sind) sind in 6 gezeigt.
Beispiel 6: Wachstum von Hybridomzellen in Suspension
Adaptierte Maushybridoma H3 (IgM-Id³) wurden durch Kultur für vier Wochen in mit SSR 4X ergänztem RPMI-X adaptiert. Das Wachstum der Zellen in Suspensionskultur wurde dann über einen 9-Tageszeitraum in Corning-T- Flaschen mit 25 cm², enthaltend 7 ml Medium, ohne Medienwechsel studiert. Die Aussaatdichte war 10 × 10³ Zellen/ml. Zellzahlen nach bis zu neun Tagen (wobei nur lebensfähige Zellen gezählt worden sind) waren wie in 7 gezeigt.
Eine verbesserte Morphologie und Lebensfähigkeit wurden unter Verwendung von mit SSR 4X ergänztem Medium im Vergleich mit SSR 3 beobachtet. In Kultur mit hoher Dichte war die Zelllebensfähigkeit 90 % unter Verwendung von SSR 4X, aber nur 50 % unter Verwendung von SSR 3. Hybridomzellen werden im Allgemeinen nicht in Grundmedium ohne Ergänzung wachsen.
Beispiel 7: Antikörpererzeugung
Eine Anzahl von unterschiedlichen Hybridomzelllinien wurde in mit SSR 4X ergänztem RPMI-X oder mit Serum als Kontrolle kultiviert.
Es waren alles reine Maushybride unter Verwendung von zwei Myelomzelllinien 2/0, P3X63.Ag9 als Fusionspartner. Die Zelllinien wurden so gewählt, dass die Eigenschaften der Medien auf unterschiedlichen Wegen herausgefordert worden sind, wobei etliche gute Antikörpererzeuger und etliche schlechte inkludiert waren. Ähnlich hatten manche Zellen gute Wachstumseigenschaften und manche schlechte. Sämtliche Hybridome wurden mit 10⁴ Zellen/ml in drei verschiedenen Medien, nämlich mit SSR 4X ergänztes RPMI-X, RPMI-I (ein eigenes serumfreies Medium) und in serumergänztem Medium, ausgesät.
Die Wachstumsrate in dem serumenthaltenden Medium war allgemein ungefähr 25 % höher als in dem serumfreien Medium, aber die Antikörperproduktion in dem mit SSR 4X ergänztem Medium war für acht der neun Hybridome von 1 bis 2,7 mal höher als in dem serumergänzten Medium.
Überstände aus mit SSR 4X ergänzten Kulturen und aus mit serumergänzten Kulturen wurden auf einer Protein-A-Säule gereinigt. Gelelektrophorese des gereinigten Produktes zeigte etliche Extrabanden in dem Falle der serumergänzten Kultur aufgrund der Anwesenheit von Serumprotein, das mit dem Immunglobulin von Interesse gleichzeitig gebunden hat und aus der Säule gleichzeitig eluiert worden ist.
Beispiel 8: Testen von anderen Sterolen als Cholesterol
Um zu zeigen, dass die Erfindung unter Verwendung von anderen Sterolen als Cholesterol anwendbar ist, wurden Zellwachstum und Zellmorphologie in Medien untersucht, die alternative Sterole enthalten.
Es wurden die folgenden Zelltypen verwendet: transformierte anhaftende Zellen:

– Vero: ATCC CCL 81, Affennierenfibroblast
– CHO-K1: ATCC CCL 61, Epithelium von chinesischem Hamsterovar transformierte Zellen, die in Suspension wachsen:
– 1E6: ECACC 86112001, Maushybridom – Fusion von Balb/c mit P₃U₁-Myelom

Die verwendeten Grundmedien waren DME/F12 für anhaftende Zellen und RPMI-X für Suspensionszellen. Die Grundmedien wurden mit SSR2, oben beschrieben, ergänzt, d. h. mit einer Lösung, enthaltend 20 mg/ml PLURONIC F68, ungefähr 4 mM EDTA, ungefähr 3 mM Fe, ungefähr 40 mM Natriumcitrat/Zitronensäure, ungefähr 3 mM Aurintricarboxylsäure und ungefähr 1 % Spurenelemente. Diese wurden weiter ergänzt mit PEG (Polyethylenglycol, MW 8000) in allen Testmedien, mit der Ausnahme von jenen von Beispiel 10, um die Grundlebensfähigkeit der kultivierten Zellen zu verbessern. Für Hybridomzellen wurde dies noch zusätzlich ergänzt durch Ethanolamin mit 20 μM. Jede Kultur wurde doppelt laufen gelassen. Als eine Kontrolle wurde auch Cholesterol verwendet, aber in diesem Fall wurde das Grundmedium durch „Solution Cx" oder „Solution Dx", oben beschrieben, wie für den Zelltyp geeignet ergänzt. Die Negativkontrollen, auf die unten Bezug genommen wird, waren in jedem Fall eine Zellkultur, die keine Testsubstanz (Sterol) enthielt.
Zellen wurden durch zwei Passagen für anhaftende Zellen und durch drei Passagen für die Hybridomlinie im Hinblick auf eine größere Schwierigkeit der morphologischen Bewertung von Suspensionskulturen, was durch die längere Kulturzeitdauer kompensiert wird, kultiviert. Sämtliche Kulturen desselben Experimentes wurden unter Verwendung eines identischen Aufteilungsverhältnisses subkultiviert, zum Beispiel 1:10; dieses Verhältnis wurde in den einzelnen Experimenten angepasst, um zu der Wachstumsrate der Positivkontrolle zu passen (siehe oben).
Im Prinzip wurden dann langsamer wachsende Kulturen bei jeder Passage stärker verdünnt und das Endergebnis (Gesamtergebnis) stellt eine bessere Differenzierung der Kulturen und ein sicheres endgültiges Ablesen von Zellzahl und Morphologie bereit.
40.000 Zellen pro ml Medium wurden anfänglich in T-Flaschen ausgesät (insgesamt 5 ml Medium) und nach einer Kulturzeitdauer von vier bis sechs Tagen erreichten die Positivkontrollen einen Zustand der Konfluenz. Dann wurden anhaftende Zellen trypsiniert und weiter für die Zweitpassage subkultiviert – gefolgt von Zählen der Anzahl von Zellen, wenn sie zum zweiten Mal konfluent waren.
Hybridomzellen, die in Suspensionen wachsen, wurden einfach im Medium für jede neue Passage verdünnt.
Das Zählen aller Zellarten wurde allgemein durchgeführt unter Verwendung einer Standard-Bürker-Kammer und Lebensfähigkeit wurde durch Trypanblauausschluss bestimmt (nur lebensfähige Zellen wurden gezählt). In gewissen Experimenten, wo es machbar war, wurden Zellen direkt in einem unter dem Mikroskop zu sehenden Feld unter Verwendung eines kalibrierten Gitters ausgezählt. Zusätzlich wurde die Qualität der kultivierten Zellen (hauptsächlich bei anhaftenden Zellen) durch Phasenkontrastmikroskopie von lebenden Zellen beurteilt und ein gewisser morphologischer Index wurde dann jeder Kultur zugeordnet – sich erstreckend von 0 (keine lebensfähigen Zellen, die in der Kultur gesehen werden) bis zu einem Maximum von 100 (die maximale mögliche Qualität, normalerweise wie sie in anhaftenden Zellkulturen gesehen werden, die DME/F12 mit „Solution Cx" enthalten). Der morphologische Index wird hauptsächlich auf drei Eigenschaften basiert: Einzelzellmorphologie, Anzahl der Zellen und der Grad an einheitlicher Verteilung der Zellen um die Kulturoberfläche herum („zelluläres Verhalten").
Tests wurden unter Verwendung der folgenden Cholesterolanaloga durchgeführt, von welchen gedacht wurde, dass sie funktionelle Analoga von Cholesterol für Zellkultur sind, dahingehend, das sie Vorläufer von Lipiden sind, welche durch kultivierte Zellen synthetisiert werden, was in dem Fall von anhaftenden Zellen eine hohe Oberflächenspannung aufrechterhält, was die hydrophobe Anhaftung von Zellen an Plastikoberflächen erleichtert. Von diesen Verbindungen wird gedacht, dass sie eine ähnliche physiologische Rolle wie Cholesterol in Pflanzen oder Tieren spielen.
Die getesteten Verbindungen können in verschiedene Gruppen wie folgt eingeteilt werden:

– jene, die in Wasser unlöslich sind und eine hohe Oberflächenspannung in dem Medium bewirken, d. h.: C 5157 Campesterol C 3045 Cholesterol D 6513 Desmosterol E 6510 Ergosterol F 5379 Fucosterol S 1270 β-Sitosterol 95 % synth. S 5753 β-Sitosterol 60 % S 6126 Stigmasterol
– die Acetatester dieser Verbindungen, die sehr leicht in Wasser löslich sind, die jedoch auch zum Erzeugen einer hohen Oberflächenspannung beitragen, d. h. C 9329 Cholesterylacetat S 2265 β-Sitosterylacetat S 6251 Stigmasterolacetat
– verschiedene Produkte des Cholesterolmetabolismus, die ebenfalls i Wasser unlöslich sind und die eine hohe Oberflächenspannung in dem Medium bewirken, d. h. D 4429 7-Dehydrocholesterol D 6128 Dihydrocholesterol (Cholestanol) L 5768 Lanosterol 97 % L 1504 Lanosterol 50-60 %
– biologisch aktive Verbindungen (Hormone, Vitamine), die etwas in Wasser löslich oder unlöslich sind, die aber die Oberflächenspannung des Mediums nicht beeinflussen, d. h. E 9007 Ergocalciferol E 2758 β-Östradiol
– und ein Beispiel eines Detergenz (Gallensalz), welches ein Produkt des Cholesterolmetabolismus ist, das in Wasser sehr löslich ist und eine niedrige Oberflächenspannung erzeugt, d. h. C 9282 Cholinsäure

Die oben zitierten Referenznummern sind aus dem Sigma Katalog. Wenn die Reinheit geringer als 95 % ist, wird der Rest als eine Mischung aus eng verwandten Verbindungen durch den Hersteller angegeben. Zum Beispiel enthält β-Sitosterol 60 % zu 40 % einer Mischung aus hauptsächlich Campesterol und Dihydrobrassicasterol. Lanosterol 50-60 % enthält 40-50 % hauptsächlich Dihydrolanosterol.
Die Ergebnisse sind in den 8 bis 13 gezeigt. In den 8 bis 10 ist die Legende zu der Art an Cholesterolanalogon wie folgt:
Testkonzentration: 2 μg/ml, mit der Ausnahme von Desmosterol: 1 μg/ml. n. d. = nicht durchgeführt.
In den 11 bis 13 ist die Legende zu der Art an Cholesterolanalogon wie folgt:
Die Testkonzentration war 2 μg/ml.
Es kann gesehen werden, dass sämtliche der in der Gruppe getesteten Substanzen, für welche die Ergebnisse in den 8 bis 10 gezeigt sind, in der Lage sind, Cholesterol in der Kultur von wenigstens einer Zellart zu ersetzen. Die Kombination aus Campesterol und β-Sitosterol gab besonders gute Ergebnisse, die überlegen zu jenen waren, die mit Cholesterol selber erzielt worden sind.
Die Substanzen, für welche die Ergebnisse in den 11 bis 13 gezeigt sind, waren im Allgemeinen weniger geeignet, obwohl gute Ergebnisse mit Cholesterylacetat und anderen Sterolacetaten erzielt worden sind, und wenigstens in Verbindung mit suspendierter Zellkultur scheint es möglich, Cholesterol durch Cholinsäure zu ersetzen oder Sterol enthaltende Kulturen durch den Einschluss von Cholinsäure zu fördern. Cholinsäure ist ein ionisches oberflächenaktives Mittel und kann Suspensionskulturen durch die Erniedrigung der Oberflächenspannung, die sie erzeugt, fördern.
Das optimale Sterol für Zellkultur sollte den folgenden Spezifikationen entsprechen: a) stabil gegen Fällung in Medium bei 37 °C sein, b) Zellwachstum und Lebensfähigkeit so zu fördern, wie es Cholesterol macht, oder besser und c) für anhaftende Zellen: eine hohe Oberflächenspannung in dem Medium für eine optimale Anhaftung der Zellen an die Oberfläche durch hydrophobe Kräfte zu erzeugen.
Die Sterole, welche dieser Spezifikationen am besten entsprachen, sind:

– eine Mischung aus 60 % β-Sitosterol und 40 % Campesterol (pflanzlichen Ursprungs/Sojabohne)
– Cholesterylacetat (aus Tier gewonnen)
– Campesterol (pflanzlichen Ursprungs/Sojabohne)
– Stigmasterol (pflanzlichen Ursprungs/Sojabohne).

Die Mischung aus β-Sitosterol und Campesterol (60/40) wäre wahrscheinlich die beste Option für allgemeine Zellkultur. Reines β-Sitosterol funktioniert gut als ein stimulierendes Mittel des Zellwachstums und der Lebensfähigkeit, seine Stabilität in Medium ist jedoch weniger als zufriedenstellend – eine Eigenschaft, welche nach seinem Mischen mit Campesterol stark verbessert wird.
Andere Sterole können verwendet werden, obgleich weniger stimulierende Wirkungen erzielt werden würden. Cholinsäure alleine ergibt eine niedrige Oberflächenspannung des Mediums; folglich könnte es in Suspensionszellkultur von Wert sein. Ein Hormon wie β-Östradiol kann gewisse Zellen stimulieren. Cholesterol selbst ist etwas instabil in Medien; es kann jedoch in Lösung stabil gemacht werden durch Modifizieren des Moleküls durch das Einführen eines Acetatesters. Seine wachstumsfördernde Wirkung wird durch diese Modifikation kaum beeinflusst. Andere Sterole können ebenfalls auf diesem Wege für die Verwendung in Zellkulturen modifiziert werden. Cholesterylacetat würde das Sterol der Wahl sein, wenn eine physiologisch korrekte Umgebung für humane oder Tierzellen von entscheidender Bedeutung ist; möglicherweise könnte dies der Fall sein, zum Beispiel bei humaner In-Vitro-Fertilisation, bei der Kultur von Hauttransplantaten (Keratinozyten) und bei der Kultur von Knochenmarkzellen.
Die „natürliche Mischung" 60 % β-Sitosterol (Sigma S 5753) enthält zu 40 % zwei isomere Formen von Ergost-5-en-3-ol (24-Methyl-cholesterol): 1) Campesterol (3β, 24R) und 2) Dihydro-brassicasterol (3β, 24S). Diese beide können als Cholesterolanaloga verwendet werden. Alternative Namen für etliche der oben diskutierten Sterole sind:

1) Campesterol = 24α-Methylcholesterol
2) Dihydro-brassicasterol = 24β-Methylcholesterol.

Beispiel 9: Die Annehmbarkeit von löslichen organischen Säuren als Lipidvorläufer
Wie im Zusammenhang mit Essigsäure gezeigt, können lösliche organische Säuren als Vorläufer von Fettsäuren, die für das Zellwachstum notwendig sind, wirken. In Zellkultur können sie deshalb wasserunlösliche Fettsäuren ersetzen, die normalerweise in Komplexen mit Serumalbumin geliefert werden.
Die folgenden Substanzen wurden getestet:
Zellen wurden wie in Beispiel 8 beschrieben kultiviert, mit der Ausnahme, dass als Grundmedium DME/MCDB 110 verwendet worden ist, da DME/F12 eine Fettsäure enthält, nämlich Linolensäure. Anstelle von Sterolen wurden zahlreiche Fettsäuren als Testsubstanzen hinzugefügt.
Die Ergebnisse sind in den 14 bis 16 gezeigt. Die Legende für die Art von getesteter organischer Säure in diesen Figuren ist:
Testkonzentration: 1x = 0,1 mM oder 10x = 1 mM. Für Capronsäure: 0,075 oder 0,75 mM.
Sämtliche getesteten organischen Säuren konnten Zellwachstum und/oder Lebensfähigkeit stimulieren. Eine allgemeine Schlussfolgerung dann ist, dass jede wasserlösliche Carboxylsäure für Zellkultur verwendet werden kann. Die wichtigsten organischen Säuren waren (neben Essigsäure): Propionsäure (0,1 mM), Buttersäure (0,1-1 mM) und Capronsäure (das Optimum liegt wahrscheinlich um 0,2 mM herum).
Für CHO-Zellen ergibt Buttersäure eine hohe Zellzahl und gute Anhaftung. Propionsäure kombiniert sogar ein schnelleres Wachstum mit der Entwicklung von Mikroaggregaten (spezielle symmetrische Zellaggregate), wenn die Kulturen Konfluenz erreichen – eine Eigenschaft von möglicher Wichtigkeit für zukünftige Entwicklungen bei CHO-Suspensionskulturen. Für Verozellen ergibt Propionsäure die besten Ergebnisse, dann Capronsäure. Für Hybridom 1E6 wurden die besten Ergebnisse mit Essigsäure und Capronsäure, dann Propionsäure, erzielt. Buttersäure inhibiert das Wachstum. Die Lebensfähigkeit der kultivierten Zellen ist jedoch gut und die Möglichkeit besteht, dass Buttersäure zelluläre Produktionsprozesse durch Reduzieren der Wachstumsrate stimulieren könnte.
Beispiel 10: Die wachstumsstimulierende Wirkung von Alkoholen
Zellkultur wurde wiederum wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt, jedoch mit der Zugabe einer Anzahl an Alkoholen anstelle von Sterolen. Wir vermuten, dass eine gesteigerte Löslichkeit von wasserunlöslichem Material, erhalten durch die Zugabe von Alkoholen, zellulären Transportvorgängen und dem Inhalt und der Verteilung von membranassoziierten Molekülen in kultivierten Zellen (einschließlich lateraler Mobilität: „Membranfluidität") hilft.
Es wurden die folgenden Substanzen getestet:

Ethanol

E 9129 Ethylenglycol

G 2025 Glycerol

27,067-9 1-Butanol

29,328-8 1-Propanol
Ethanol und Methanol wurden getestet in Beispiel 1 verglichen, wo beide ähnlich positive Wirkungen auf Zellwachstum für Hybridomzellen in proteinfreiem Medium zeigten. Die in dem gegenwärtigen Beispiel in anhaftender Zellkultur erhaltenen Ergebnisse sind in den 17 und 18 gezeigt. Die Legende für die Identifikation der getesteten Alkohole in diesen Figuren lautet wie folgt:
Liste der Alkohole:
Testkonzentration: 1x = 0,1 % oder 5x = 0,5 %
Die Ergebnisse zeigen, dass für anhaftende Zellen Ethanol, Ethylenglycol und Propylenglycol positive Wirkungen auf Zellwachstum und Lebensfähigkeit bei Konzentrationen um 0,1 % herum zeigen, wie früher für Ethanol und Methanol unter Verwendung von 1E6-Zellen im Hybridtest gefunden. Butanol ist bei höheren Konzentrationen toxisch. Allgemein waren bei einer geeigneten Konzentration sämtliche der untersuchten Alkohole in der Lage, das Wachstum zu fördern, im Vergleich mit der Negativkontrolle, aber keiner zeigte so gute Ergebnisse wie Ethanol bei höheren Konzentrationen, mit der Ausnahme von Propylenglycol.
Beispiel 11: In-Vitro-Fertilisation
Ein universales IVF-Medium ist in weit verbreiteter Verwendung für erfolgreiche IVF-Behandlung. Es besteht aus 10 mg/ml HSA und der oben beschriebenen Lösung SSR2 plus Grundmedium. Es wurde bis vor kurzem nicht belegt, dass es möglich ist, HSA zu ersetzen, obwohl dies höchst wünschenswert ist. Wir verglichen nun die Verwendung dieses Universal-IVF-Mediums mit einem Medium gemäß dieser Erfindung, nämlich einem, das anstelle von HSA und SSR2 das Medium SSR4x wie oben beschrieben enthält. In Versuchen, in welchen 133 Embryonen kultiviert worden sind, war der Prozentsatz, der das Blastozystenstadium erreichte, 75 % für das Universal-IVF-Medium und 77 % für das Medium gemäß der Erfindung (es sollte festgestellt werden, dass die Verwendung des Kulturmediums der Erfindung für das Kultivieren von humanen Embryonen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht inkludiert ist). Folglich hat sich die Erfindung als eine gangbare Alternative für die Verwendung von serumenthaltendem Medium bei der Verwendung bei IVF gezeigt.
Beispiel 12: Proteinexpression
Eine transfizierte BHK-Zelllinie, die hIL-2 exprimiert, wurde in einem FCS enthaltenden Medium und in SSR4x kultiviert. In gesonderten Studien wurde ein Differenzierungskultivierungsapparat genutzt, d. h. T-Flaschen, Rollerflaschen, miniPERM und ein kontinuierlich perfundierendes Kultursystem. Ähnliche Studien wurden unter Verwendung von CHO-Zellen unternommen, die für die Expression von t-PA und für die Expression von Rubella-Capsidprotein unter Verwendung von T-Flaschen, Spinnerkolben, miniPERM und Hollow-Fiber-System-Kultivierung, transfiziert worden sind. Weiterhin wurde die Lebensfähigkeit von in SSR4x eingefrorenen Zellen verglichen mit jener, die unter Verwendung eines FCS enthaltenden Mediums gewonnen worden ist.
Es wurde für die BHK-Zellen herausgefunden, dass die Wachstumskurven für die beiden Medien ähnlich waren, während gleiche oder höhere Produktionsausbeuten erzielt worden sind. In gewissen Fällen waren die Ausbeuten spektakulär höher. 19 zeigt Produktionsdaten für BHK-Zellen, die humanes IL-2 exprimieren, in mit FCS ergänztem Medium im Vergleich mit der Lösung SSR4x, oben beschrieben, in einem miniPERM-Bioreaktorsystem (Hereus) mit und ohne einem Adaptionsvorgehen von FCS auf SSR4x-Kultivierung.
Für die CHO-Zellen wurden ein gutes Wachstum und Produktion erzielt.
Für die Gefriertests wurde herausgefunden, dass die Lebensfähigkeit der in dem Medium SSR3x der Erfindung eingefrorenen Zellen gut war und dass nach sieben bis acht Tagen die Zellzahlen ähnlich waren wie jene, die in dem üblichen Medium wachsen gelassen und eingefroren worden sind. Weiterhin ist die Zeit für die erneuten Etablierung der Zellteilung nach dem Auftauen weniger als 48 Stunden, wie gefordert durch industrielle Anwender.

Claims

Additivlösung zum Hinzufügen zu einem Basiszellkulturmedium, um ein serumfreies Zellkulturmedium zu bilden, wobei dieses Additiv umfasst: Ethanol als Lösungsmittel, ein Sterol oder metabolisch annehmbaren Ester davon, und eine lösliche Carboxylsäure, welche bei der Verwendung als ein metabolischer Vorläufer von Lipidfettsäuren wirkt, wobei dieses Sterol oder der Ester davon in der Additivlösung in der Abwesenheit von Protein oder Phospholipiden gelöst ist.
Additiv zum Hinzufügen zu einem Basiszellkulturmedium, um ein serumfreies Zellkulturmedium zu bilden, wie in Anspruch 1 beansprucht, worin diese lösliche Carboxylsäure eine C₂-C₇-Carboxylsäure ist.
Additiv für ein Zellkulturmedium, wie in Anspruch 2 beansprucht; worin diese Carboxylsäure Essigsäure ist.
Additiv für ein Zellkulturmedium, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-3 beansprucht, weiter umfassend: Ethanolamin und PVP-10.
Additiv wie in Anspruch 4 beansprucht, worin dieses Additiv dieses Ethanolamin und PVP-10 in den Verhältnissen 250 g PVP-10: 1,2 ml reines, konzentriertes Ethanolamin enthält.
Additiv, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-5 beansprucht, enthaltend Ethanol, Cholesterol und Essigsäure im Wesentlichen in den Verhältnissen 1 196 % Ethanol: 2 g Cholesterol: 100 mmol Essigsäure.
Additiv für ein Zellkulturmedium, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-6 beansprucht, worin dieses Sterol Stigmasterol oder ein metabolisch annehmbares Derivat davon umfasst.
Zellkulturmedium, enthaltend Lipid in Lösung, stabilisiert durch eines oder mehrere oberflächenaktive Mittel, und unter wesentlicher Abwesenheit von Protein und von Phospholipid.
Zellkulturmedium, wie in Anspruch 8 beansprucht, worin dieses Lipid ein Sterol oder ein metabolisch annehmbares Derivat davon ist.
Zellkulturmedium, wie in Anspruch 9 beansprucht, in welchem das Sterol oder Derivat davon eines oder mehrere ist von Cholesterol, Campesterol, Desmosterol, Ergosterol, Fucosterol, β-Sistosterol, Stigmasterol, Methylcholesterole oder ein metabolisch annehmbares Derivat davon.
Zellkulturmedium, wie in Anspruch 10 beansprucht, worin das Sterol als ein Derivat, welches ein Ester ist, vorhanden ist.
Zellkulturmedium, wie in irgendeinem der Ansprüche 8-11 beansprucht, worin das Lipid solubilisiert ist durch ein oberflächenaktives α-Hydro-ω-hydroxypoly(oxyethylen)-poly(oxypropylen)-poly(oxyethylen)-Blockcopolymer-Mittel mit der Struktur HO(CH₂CH₂O)_a(CH(CH₃)CH₂O)_b-(CH₂CH₂O)_cH, wo a von 50 bis 100 ist, b von 20 bis 40 ist und c von 50 bis 100 ist, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 7.500 bis 10.000.
Zellkulturmedium wie in Anspruch 12 beansprucht, worin a = 75, b = 30 und c = 75 und dieses Durchschnittsmolekulargewicht ungefähr 8.350 ist.
Zellkulturmedium wie in Anspruch 13 beansprucht, worin dieses oberflächenaktive Mittel PLURONIC F68 ist.