DE69734601T2

DE69734601T2 - Zusammensetzung von kollagenbindungsprotein und verfahren zu deren verwendungen

Info

Publication number: DE69734601T2
Application number: DE69734601T
Authority: DE
Inventors: Magnus Höök; M. Joseph PATTI; Karen House-Pompeo; Narayana Sthanam; Jindrich Symersky
Original assignee: Texas A&M University System; UAB Research Foundation; Texas A&M University
Current assignee: Texas A&M University System; UAB Research Foundation; Texas A&M University
Priority date: 1996-05-16
Filing date: 1997-05-14
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2017-05-15
Also published as: AU3126097A; ES2252785T3; DE69734601D1; WO1997043314A3; US6288214B1; DK0950068T3; ATE309271T1; US20020102262A1; WO1997043314A2; CA2255669A1; EP0950068B1; EP0950068A2

Description

1.1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf das Gebiet der Molekularbiologie. Noch bevorzugter betreffen bestimmte Ausführungsformen Methoden und Zusammensetzungen, welche DNA-Abschnitte umfassen, und Proteine, die von Bakterienarten abgeleitet wurden. Noch genauer stellt die Erfindung cna und cna-abgeleitete Nukleinsäurezusammensetzungen bereit, welche ein Kollagen (Col) -Bindungsprotein (CBT) aus Staphylococcus aureus und die korrespondierenden Peptid Epitope und Proteinsequenzen umfassen, welche native und synthetisch modifizierte Col-Bindungsstellendomänen umfassen. Es sind verschiedene Verfahren ihrer Herstellung und Verwendung dieser DNA-Segmente, DNA-Segmente, welche synthetisch modifizierte Liganden-Bindungsstellendomänen kodieren, und native und synthetische Proteine offenbart, wie zum Beispiel, beispielsweise die Verwendung von DNA-Segmenten als diagnostische Sonden und Matrizen für die Proteinherstellung, und die Verwendung von Proteinen, Fusionsproteinträgern und Peptiden in verschiedenen pharmakologischen und immunologischen Anwendungen.
1.2. Beschreibung des nächsten Standes der Technik
1.2.1. Kolonisation durch Staphylococcus Aureus
S. Aureus Zellen können viele verschiedene Wirtsgewebe kolonisieren und verschiedene Arten von Infektionen hervorrufen, wie zum Beispiel Endocarditis, Pneumonie, Wundinfektionen, Osteomyelitis und septische Arthritis. Die Anhaftung von Staphylokokken an Wirtsgewebe schließt eine Familie von Adhesinen ein, die Komponenten der extrazellulären Matrix erkennen und welche MSCRAMMs (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) genannt werden (Patti et al., 1994a).
Die Expression spezifischer MSCRAMMs scheint für die Kolonisation verschiedener Gewebetypen erforderlich zu sein. Zum Beispiel exprimieren Staphylokokkenstämme, welche aus den Gelenken von Patienten mit der Diagnose einer septischen Arthritis oder Osteomyelitis erhalten wurden, fast immer ein CBP, während signifikant weniger Isolate, welche aus Wundinfektionen erlangt wurden, dieses Adhesin exprimieren (Switalski et al., 1993a). In ähnlicher Weise haben S. Aureus Stämme, welche aus den Knochen von Patienten mit Osteomyelitis isoliert wurden, oft ein MSCRAMM, welches das knochenspezifische Protein, Knochen-Sialoprotein (BSP), erkennt (Rydén et al., 1998).
Die Klonierung, Sequenzierung und Expression von einem cna Gen, welches ein S. Aureus CBP kodiert, wurde kürzlich berichtet (Patti et al., 1992). Das cna Gen kodiert ein 133-kDa-Adhesin, das strukturelle Merkmale enthält, welche für Oberflächenproteine charakteristisch sind, die aus Gram-positiven Bakterien isoliert wurden. Es ist gezeigt worden, dass das CBP für die Anhaftung von S. Aureus an Col-beschichtete künstliche Substrate notwendig und ausreichend ist, ebenso wie an Knorpel, einem Gewebe, das reich an Typ II Col ist (Switalski et al., 1993). Alle Stämme, welche das CBP exprimieren, sind in der Lage an Knorpel anzuhaften, wohingegen solche Stämme, welchen die MSCRAMMs fehlen, nicht anhaften. Die Vorinkubation von S. Aureus mit polyklonalen Antikörpern, welche gegen das gereinigte Adhesin gerichtet sind, oder die Sättigung von Knorpelsubstrat mit löslichen rekombinanten CBP hat eine vollständige Inhibition bakterieller Anhaftung zur Folge (Switalski et al., 1993a).
Die S. Aureus Kolonisation von Gelenkknorpel innerhalb von Gelenkspalten scheint ein wichtiger Faktor zu sein, welcher zu der Entwicklung einer septischen Arthritis beiträgt. Die Bedeutung von dem CBP in der Pathogenese der septischen Arthritis wurde durch den Vergleich der Virulenz zweier Gruppen isogener Mutanten von S. Aureus in einem Tiermodel bestimmt (Patti et al., 1994b). Mehr als 70 % der Mäuse, welchen die CNA⁺-Stämme (d. h. einem klinisichen Isolat, welches das CBP exprimiert oder einen negativen Stamm, in welchem das cna Gen eingeführt worden ist) injiziert worden sind, entwickeln klinische Symptome von Arthritis, wohingegen weniger als 27 % von den Tieren Symptome der Krankheit zeigten, wenn ihnen CNA^– Stämme injiziert worden sind (d. h. ein Stamm, welchem das cna Gen fehlt oder einem Stamm, in welchem das cna Gen oder einem Stamm, in welchem das cna Gen durch homologe Rekombination inaktiviert worden ist).
Zusammengefaßt zeigen diese Ergebnisse, dass das CBP eine wichtige Rolle in der Pathogenese der durch S. Aureus induzierten septischen Arthritis spielt.
Kürzlich wurde die Ligandenbindungsstelle innerhalb der N-terminalen Hälfte des CBP lokalisiert (Patti et al., 1993). Durch die Analyse der Col-Bindungsaktivität rekombinanter Proteine, welche verschiedenen Segmente des MSCRAMM entsprechen, wurde ein 168-Aminosäuren langes Proteinfragment (korrespondierend zu den Aminosäurenresten 151–318), das eine nennenswerte Col-Bindungsaktivität hat, identifiziert. Kleine Verkürzungen von diesem Protein im N- oder C-Terminus haben einen Verlust der Ligandenbindungsaktivität zur Folge, aber haben auch konformative Änderungen des Proteins zur Folge, wie durch Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie gezeigt wurde. Diese Ergebnisse haben die Möglichkeit aufgeworfen, dass die Ligandenbindungsaktivität auch konformative Änderungen des Proteins zur Folge haben, wie durch Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie gezeigt wurde. Diese Ergebnisse haben die Möglichkeit aufgeworfen, dass die Ligandenbindungsstelle des MSCRAMM innerhalb eines kurzen Segments von Aminosäuren enthalten ist und dass flankierende Sequenzen für eine korrekte Faltung dieser Reste in der Ligandenbindungsstelle erforderlich sind.
Die WO A1 85/05553 offenbart bakterielle Zelloberflächenproteine, welche eine Fibronectin, Fibrinogen-, Collagen- und/oder Laminin-Bindungsfähigkeit haben. Dadurch ist gezeigt worden, dass verschiedene Bakterien die Fähigkeit haben, an Fibronectin, Fibrinogen, Collagen und/oder Laminin zu binden.
In Bezug auf die Bindung von Collagen an S. Aureus sind einige Studien berichtet worden (Carret et al., 1985; Holderbaum et al., 1985; Holderbaum, D., Hall, G.S., und Erhart, L.A., 1986; Infect. Immun. 54: 359–364; Vercellotti, G.M., McCarthy, J.B., Lindholm, P., Peterson, P.K., Jacob, H.S., und Furcht, L.T.; 1985; Am. J. Pathol. 120: 13–21; Speziale, P.G., Ruacci, L., Switalski, L.M., Timpl, R. und Höök, M. 1986, J. Bact, 167: 77–81, Switalski, L.M., Seziale, P. und Höök, M. 1989, J. Biol. Chem. 264: 21080–21086).
Switalski et al., 1989 haben von der Isolierung und der Charakterisierung eines S. Aureus-Oberflächenproteins berichtet, welches sie als Kollagenrezeptor identifizierten. Indem Lysostaphin verwendet wurde, um das Protein aus der Zellwand zu lösen, gefolgt durch eine Ionen-Austausch-Chromatographie, eine Ammoniumsulfatprezipitation und eine Gelfiltration war es möglich, ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 135 kDa zu reinigen. Es wurde auch gezeigt, dass Antikörper, welche gegen das 135 kDa Protein gerichtet sind, die Bindung von Kollagen an S. Aureus Cowan 1 Zellen inhibieren.
Die WO 92/07002 bezieht sich auf ein neues rekombinantes Hybrid-DNA-Molekül, welches eine Nukleotidsequenz aus S. Aureus umfasst, welche für ein Protein oder Polypeptid kodiert, dass Kollagen Bindungseigenschaften hat.
1.2.2. Die Rolle von S. Aureus CBP in humanen Erkrankungen
Die hematogen erworbene bakterielle Arthritis bleibt ein ernstes medizinisches Problem. Diese rasant fortschreitende und stark zerstörende Gelenkserkrankung ist schwer gänzlich auszurotten, mit weniger als 50 % der infizierten Patienten erholen sich nicht ohne schwere Gelenkschäden. S. Aureus ist das vorherrschende Pathogen, welches aus adulten Patienten mit hematogener (primärer) und sekundärer Osteomyelitis isoliert wurde (Waldvogel und Vasey 1980), obwohl auch bis zu 90 % der Fälle von akuter hematogener Osteomyelitis in ansonsten gesunden Kindern verursacht wird (Cole 1982). Rasterelektronen Mikroskopiestudien haben gezeigt, dass S. Aureus eng mit Knorpel- und Knochengewebe verknüpft ist, welches aus der Stelle der Infektion erlangt wurde. Zusätzliche Mikroskopiehinweise deuten auf eine vorherrschende Anhaftung und nachfolgende Kolonisation knorpeliger, eher als an synovialen Oberflächen hin (Voytek et al. 1988). Eine Analyse von S. Aureus-Stämmen, die aus Patienten mit einer diagnostizierten Osteomyelits und septischen Arthritis isoliert worden sind, zeigte, dass fast alle von den Isolaten ein Col-Adhesin enthielten. Demgegenüber exprimierten nur ein Drittel von den S. Aureus-Stämmen, welche aus Patienten mit einer Weichteilgewebeinfektion isoliert worden sind, das Col-Adhesin (Switalski, Patti et al. 1993). Diese Beobachtungen legen nahe, dass die eine Zelloberflächenexpression von dem Col-Adhesin ein wichtiger Virulenzfaktor in der Staphylokokken-mediierten Osteomyelitis und der septischen Arthritis ist. Darüber hinaus ist beobachtet worden, dass Knorpelabbau nach einer Staphylokokken-Gelenksinfektion auf eine direkte Interaktion zwischen Bakterien und Knorpel zurückgeführt werden kann (Smith et al. 1982), zusätzlich zu der entzündlichen Antwort des Wirtes (Smith et al. 1987). Personen, welche mehr als 6 Tage brauchen, um die Synovialflüssigkeit von dem Mikroorganismus freizubekommen, haben üblicherweise einen schlechten klinischen Befund (Ho und Su 1982). Schlechte Ergebnisse umfassen permanente Körperbehinderung mit eingeschränkter Bewegung oder ständigem Schmerz in dem betroffenen Gelenk. Daher kann, durch Inhibition der anfänglichen Anhaftung der Bakterien an Knorpel die Wahrscheinlichkeit von anschließender Gelenkzerstörung vermindert werden.
1.3. Unzulänglichkeiten im Stand der Technik
Es ist ohne Zweifel, dass, obwohl verschiedene Ansätze der Behandlung von bakteriellen Erkrankungen einigen Erfolg gezeigt haben, viele Probleme bleiben, einschließlich der Antibiotikaresistenz, der Variabilität von Antigenen zwischen Arten und Artenvariationen durch Mutation von Antigenen, ebenso wie das Bedürfnis, anfällige Gruppen zu schützen, wie zum Beispiel junge Kinder, ältere Menschen und andere Immun-suprimierte Patienten. Folglich besteht ein unmittelbares Bedürfnis nach einer effektiven Behandlung einer S. Aureus-Infektion und Impfstoffen gegen diesen Erreger.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein CBP-Peptid, wobei das besagte Peptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 aufweist und die antibakterielle Anhaftung an Collagen inhibiert zur Verwendung in der Therapie.
Es wird weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, umfassend ein CBP-Peptid, wobei das Peptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 6 aufweist und die bakterielle Anhaftung an Collagen inhibiert.
In einem weiteren Aspekt wird die Verwendung einer Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein CBP-Peptid, wobei das Peptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 aufweist und die bakterielle Anhaftung Collagen inhibiert, zur Herstellung eines prophylaktischen Medikaments zur Inhibierung oder der Vorbeugung einer bakteriellen Kolonisation, einer bakteriellen Infektion, einer bakteriellen Sepsis, einer Staphylokokken-Infektion oder einer Sepsis in einem Lebewesen.
In einem weiteren Aspekt wird außerdem eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein isoliertes Nukleinsäuresegment, das für ein CBP-Peptid kodiert, wobei das CBP-Peptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 aufweist und die bakterielle Anhaftung an Collagen inhibiert, zur Verwendung in der Therapie.
In einem weiteren Aspekt wird ferner die Verwendung einer Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, umfassend ein isoliertes Nukleinsäuresegment, das für ein CBP-Peptid kodiert, wobei das CBP-Peptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 aufweist und die bakterielle Anhaftung an Collagen inhibiert, für ein prophylaktisches Medikament zur Inhibierung oder der Vorbeugung einer bakteriellen Kolonisation, einer bakteriellen Infektion, einer bakteriellen Sepsis, einer Staphylokokken-Infektion oder einer Sepsis in einem Lebewesen.
In einem noch weiteren Aspekt wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, umfassend einen Antikörper, der an ein CBP-Peptid bindet, das CBP-Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 angegeben ist, wobei der Antikörper die bakterielle Anhaftung an Collagen inhibiert, zur Verwendung in der Therapie.
Es wird außerdem die Verwendung einer Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, umfassend einen Antikörper, der an ein CBP-Peptid bindet, das CBP-Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 angegeben ist, wobei der Antikörper die bakterielle Anhaftung an Collagen inhibiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung für die Inhibition oder Vorbeugung einer bakteriellen Kolonisation, einer bakteriellen Infektion, einer bakteriellen Sepsis, einer Staphylokokken-Infektion oder einer Sepsis in einem Lebewesen.
In einem weiteren Aspekt wird ein Kit zur Verfügung gestellt, umfassend eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung.
Auch wird die Verwendung einer Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, umfassend einen Antikörper, der an ein CBP-Peptid bindet, das CBP-Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr: 2 angegeben ist, für die Herstellung eines prophylaktischen Medikaments zur Inhibition der Vorbeugung einer bakteriellen Kolonisation, einer bakteriellen Infektion oder einer bakteriellen Sepsis in einem Lebewesen.
In einem noch weiteren Aspekt wird die Verwendung einer Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend einen Antikörper, der an ein CBP-Peptid bindet, das CBP-Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr: 2 angegeben ist, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Staphylokokken-Infektion oder einer Sepsis in einem Lebewesen.
In einem weiteren Aspekt wird ein Kit zur Verfügung gestellt, umfassend eine Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper, welcher an ein CBP-Peptid bindet, das CBP-Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr: 2 angegeben ist, zur Verwendung in der Therapie.
Die vorliegende Erfindung überwindet einen oder mehrere dieser und anderer Nachteile, welche dem Stand der Technik inhärent sind, durch die Bereitstellung neuer Zusammensetzungen und ihrer Verwendung in der Behandlung von S. Aureus-Infektionen, durch Verwendung nicht-antibiotischer Strategien. Offenbart sind Methoden für die Verwendung von neuen Peptiden und Antikörperzusammensetzungen in der Behandlung einer S. Aureus-Infektion, mediiert durch die Inhibition der bakteriellen Anhaftung an die ECM-Komponente der Wirtszellen, Col. Ferner sind Verfahren für die aktive und passive Immunisierung gegen S. Aureus und verwandte Arten offenbart, die neue native und ortsspezifisch veränderte CBP-Zusammensetzungen und CBP-abgeleitete Epitop-Peptide aus bakteriellen Arten verwenden. Bestimmte Aspekte der Erfindung beziehen sich auf neue Nukleinsäuresegmente, welche diese Peptide und Epitope kodieren, und auf die Verwendung solcher Nukleinsäuresegmente in einer Auswahl von diagnostischen und therapeutischen Regime. Ebenso sind Peptidzusammensetzungen zur Verfügung gestellt, welche von CBP abgeleitet sind, welches die Col-Bindungsdomäne umfasst. Durch die Verwendung von Kristallstrukturanalysen haben die Erfinder ortsspezifische Mutationen in CBP-kodierenden DNA-Segmenten entwickelt, welche veränderte Col-Bindungsdomänen zur Folge haben. In wichtigen Ausführungsformen werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, zur Inhibition der Bindung von S. Aureus an Col. Diese Zusammensetzungen sind in der Prävention der bakteriellen Adhesion an extrazellulären Matrixkomponenten verwendbar, wie zum Beispiel Col, und in der Inhibition der bakteriellen Kolonisation an collagene Substrate. Des weiteren umfasst die Erfindung die Verwendung von CBP oder cna Gensequenzen, um Antikörper herzustellen, welche gegen Staphylokokken-Infektionen schützen.
In einer weiteren Ausführungsform offenbart die Erfindung ein Verfahren zur Prävention einer S. Aureus mediierten Erkrankung in einem Lebewesen. Das Verfahren umfasst im allgemeinen die Identifikation eines Lebewesens, bei welchem eine S. Aureus-Infektion vermutet wird, und die Verabreichung eines Collagen-Bindungsproteins oder einer Antikörperzusammensetzung an das Lebewesen, welche wirksam ist, die Erkrankung in dem Lebewesen vorzubeugen.
In einer weiteren Ausführungsform offenbart die Erfindung ein Verfahren der Zunahme der Phagocytose von S. Aureus-Zellen durch eine Makrophagenzelle. Das Verfahren umfasst im allgemeinen die Bereitstellung einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung eines Collagen-Bindungsproteins oder Antikörpers für die Makrophagenzelle, in einer Menge, die wirksam ist, die Phagocytose von den Bakterien durch die Makrophagen zu erhöhen.
Bevorzugt umfasst die Zusammensetzung des Collagen-Bindungsproteins die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6, oder der Antikörper bindet spezifisch an die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6.
In einer ähnlichen Ausführungsform offenbart die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der intrazellulären Zerstörung einer S. Aureus Zelle in einer Makrophagenzelle. Dieses Verfahren umfasst die Bereitstellung einer pharmazeutisch-verträglichen Zusammensetzung eines Collagen-Bindungsproteins oder eines Antikörpers für die Makrophagenzelle, in einer Menge, die wirksam ist, die intrazelluläre Zerstörung von der S. Aureus-Zelle in der Makrophage zu erhöhen.
2.1. CNA Nukleinsäure-Zusammensetzungen
Die Erfindung stellt Nukleinsäuresequenzen zur Verfügung, welche CBP kodieren. Wie hierin verwendet, bedeutet ein Gen, welches für CBP kodiert, eine Nukleinsäuresequenz, welche für das Col-Bindungsprotein kodiert. Eine Nukleinsäuresequenz, die für ein CBP-Gen kodiert, ist die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID Nr: 1, oder einer Stammvariante oder ein aktives Fragment davon. Es wird davon ausgegangen, dass das Gen, welches für CBP kodiert, in der Nukleinsäuresequenz von Stamm zu Stamm variiert, aber dass die Variation in der Nukleinsäuresequenz nicht die Hybridisierung zwischen Sequenzen, welche für CBP eines jeden Stammes kodieren, unter strengen Hybridisierungsbedingungen verhindern.
Wie hierin verwendet, bedeutet eine Stammvariante von CBP jedes Polypeptid, welches im Ganzen oder teilweise durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche unter strengen Hybridisierungsbedingungen an eine Nukleinsäuresequenz in irgendeiner der SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 und SEQ ID Nr: 5 hybridisiert, welche jeweils für die M55-, M31- und M17-Epitope von S. Aureus kodieren. Die Aminosäuresequenz der M55-, M31- und M17-Peptide ist jeweils in SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 und SEQ ID Nr: 6 gegeben. Der Fachmann wird verstehen, dass Stammvarianten von CBP solche Proteine umfassen, welche durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, welche durch die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz jeder der SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 und SEQ ID Nr: 5 amplifiziert werden kann.
In ähnlichen Ausführungsformen umfasst die Offenbarung auch Stammvarianten von CBP und dem/den cna Gen(en), welche für CBPs kodieren. Stammvarianten sind jene Nukleinsäurezusammensetzungen und Polypeptidzusammensetzungen, welche von Stämmen von S. Aureus und ähnlichen Gram-positiven Bakterien isoliert werden, welche CBPs exprimieren und welche an Col-Substrate binden.
Aspekte der Offenbarung betreffen die Identifikation von solchen Stammvarianten, indem die hierin beschrieben diagnostischen Methoden und Kits verwendet werden. Insbesondere sind Methoden, welche cna Gensequenzen als Nukleinsäure-Hybridisierungsproben und/oder Anti-CBP-Antikörper in Western-Blots oder ähnlichen Analysen verwenden, nützlich für die Identifikation von solchen Stammvarianten. Die Identität von möglichen Stammvarianten von CBP kann durch Col-Bindungsassays bestätigt werden, wie zum Beispiel durch Blot-Analysen mit markiertem Col, oder wahlweise durch die Demonstration der Eignung der Stammvariante CBP die Bindung von S. Aureus und ähnlichen Bakterien abzuschwächen oder zu verhindern.
Wie hierin verwendet, ist CBP ein Protein, welches Schutz gegen eine Staphylokokken- oder eine Streptokokken-Infektion verleiht. Ein CBP, oder Fragmente davon, kann die Bindung von S. Aureus an Col verhindern oder vermindern, oder die schwere irgendeiner der Erkrankungen verhindern oder vermindern, welche mit einer S. Aureus Infektion verbunden sind, einschließlich Sepsis, Hautlesionen, septische Arthritis, Endokarditis, Mastitis, Pneumonia, neurologische Störungen und andere Erkrankungen, welche aus der Kolonisation von S. Aureus oder ähnlichen Organismen an Col enthaltende Substrate resultieren.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, welche CBP kodieren, und die Herstellung und die Verwendung rekombinanter Wirtszellen durch die Anwendung von DNA-Methoden, die CBP-Gene und CBP-abgeleitete Genprodukte exprimieren. Als solche betrifft die Erfindung DNA-Segmente, umfassend ein isoliertes Gen, das für ein Protein oder ein Peptid kodiert, das Aminosäuresequenzen umfasst, die im wesentlichen dargelegt sind durch eine zusammenhängende Sequenz von SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6. Diese DNA-Segmente sind jeweils beispielhaft in SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 und SEQ ID Nr: 5 dargelegt. Zusammensetzungen, die ein gereinigtes Protein beinhalten, das eine Aminosäuresequenz hat, die im Wesentlichen durch die Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 dargelegt ist, sind auch durch die Erfindung umfasst.
In Bezug auf neue Protein-CBP-Epitope betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Segmente, welche aus so gut wie jeder bakteriellen Quelle isoliert werden kann, die frei von gesamter genomischer DNA sind und die für Proteine oder Peptide kodieren, welche CBP-ähnliche Aktivität aufweisen. DNA-Segmente, welche für CBP-ähnliche Arten kodieren, können darauf hin untersucht werden, für Proteine, Polypeptide, Untereinheiten, funktionelle Domänen und ähnliches zu kodieren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „DNA-Segment" auf ein DNA-Molekül, das aus gesamtgenomischer DNA einer einzelnen Art frei isoliert wurde. Daher bezieht sich ein DNA-Segment, welches für CBP kodiert, auf ein DNA-Segment, das CBP-kodierende Sequenzen enthält, dennoch frei isoliert wurde von, oder frei gereinigt wurde, aus der gesamtgenomischer DNA der Art, von welcher das DNA-Segment erhalten wurde. Inbegriffen in dem Begriff „DNA-Segment" sind DNA-Segmente und kleinere Fragmente solcher Segmente, und auch rekombinante Vektoren, einschließlich, zum Beispiel, Plasmide, Kosmide, Phagemide, Phagen, Viren und ähnlichem.
In ähnlicher Weise bezieht sich ein DNA-Segment, umfassend ein isoliertes oder gereinigtes CBP-Gen, auf ein DNA-Segment, einschließlich CBP-kodierende Sequenzen und, in bestimmten Aspekten, regulatorische Sequenzen, im wesentlichen aus anderen natürlich vorkommenden Genen oder Protein-kodierenden Sequenzen frei isoliert. In dieser Hinsicht wird der Begriff „Gen" der Einfachheit halber verwendet, um auf ein funktionales Protein, Polypeptid oder Peptid-kodierende Einheit zu verweisen. Wie von jenen auf dem Fachgebiet verstanden werden wird, umfasst dieser funktionale Begriff sowohl genomische Sequenzen, extragenomische und Plasmid-kodierende Sequenzen, als auch kleinere manipulierte Gensegmente, welche Proteine, Polypeptide oder Peptide exprimieren oder adaptiert werden können, diese zu exprimieren. Solche Segmente können natürlich isoliert werden, oder synthetisch durch die Hand des Fachmanns modifiziert werden.
„Im wesentlichen frei isoliert von anderen kodierenden Sequenzen" bedeutet, dass das Gen von Interesse, in diesem Fall ein Gen, welches für CBP kodiert, den signifikanten Teil der kodierenden Region des DNA-Segments bildet, und dass das DNA-Segment keine großen Teile von natürlich vorkommender kodierender DNA enthält, wie zum Beispiel große chromosomale Fragmente oder andere funktionale Gene oder Polypeptid-kodierende Regionen. Natürlich bezieht sich dies auf DNA-Segmente wie ursprünglich isoliert, und grenzt nicht Gene oder kodierende Regionen aus, welche später durch Menschenhand an das Segment künstlich hinzugefügt wurden.
In besonderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, welche DNA-Sequenzen enthalten, die für eine CBP-Art kodieren, die innerhalb ihrer Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz enthält, die im wesentlichen in SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 dargestellt ist. In anderen spezifischen Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, welche DNA-Sequenzen enthalten, die in ihrer Sequenz eine Nukleotidsequenz enthalten, die im wesentlichen der entspricht, wie in SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 5 dargestellt.
Der Ausdruck „eine Sequenz im wesentlichen wie die dargestellt in SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6" bedeutet, dass die Sequenz im wesentlichen einem Teil der SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 entspricht und relativ wenig Aminosäuren hat, die nicht identisch zu, oder biologisch funktional äquivalent davon, der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 sind. Der Ausdruck „biologisch funktional äquivalent" ist auf dem Fachgebiet selbstverständlich und wird hierin im Detail weiter definiert (zum Beispiel, siehe die veranschaulichenden Ausführungsformen). Folglich sind Sequenzen, die zwischen ungefähr 70 % und ungefähr 80 %; oder bevorzugter zwischen ungefähr 81 % und ungefähr 90 %; oder noch bevorzugter zwischen ungefähr 91 % und ungefähr 99 %; Aminosäuren haben, die identisch oder funktional äquivalent zu den Aminosäuren von SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 sind, Sequenzen, die „im wesentlichen die sind, wie dargestellt in SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6".
In einigen anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, die innerhalb ihrer Sequenzen eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die im Wesentlichen der in SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 5 dargestellten entspricht. Der Begriff „im wesentlichen wie dargestellt in SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 5" wird mit der gleichen Bedeutung wie oben beschrieben verwendet und bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einem Teil von SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 5 entspricht und relativ wenige Codons hat, die nicht identisch sind, oder funktional äquivalent, zu den Codons von SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 5. Ferner, DNA-Segmente, die Proteine kodieren, welche eine CBP-ähnliche Aktivität aufweisen, sind am meisten bevorzugt.
Es versteht sich auch, dass Aminosäuren und Nukleinsäuresequenzen zusätzliche Reste enthalten können, wie zum Beispiel zusätzliche N- oder C-terminale Aminosäuren, oder 5'- oder 3'-Sequenzen, und dennoch nach wie vor im wesentlichen wie in einer von den hierin offenbarten Sequenzen dargelegt sind, so lange die Sequenzen die oben dargelegten Kriterien erfüllen, einschließlich der Erhaltung der biologischen Proteinaktivität, wo die Proteinexpression betroffen ist. Die Hinzufügung von terminalen Sequenzen gilt insbesondere für Nukleinsäuresequenzen, die zum Beispiel verschiedene, nicht-kodierende Sequenzen enthalten können, die entweder 5'- oder 3'-Teile der kodierenden Region flankieren oder können verschiedene Upstream- oder Downstream- regulatorische oder strukturelle Gene enthalten.
Selbstverständlich umfasst die vorliegende Erfindung auch DNA-Segmente, die komplementär oder im Wesentlichen komplementär zu der Sequenz ist, in SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 5 dargestellt ist. Nukleinsäuresequenzen, die „komplementär" sind, sind jene, die zur Basenpaarung gemäß der Standard Watson-Crick-Komplemetaritäts-Regeln in der Lage sind. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „komplementäre Sequenzen" Nukleinsäuresequenzen, die im wesentlichen komplementär sind, wie durch denselben Nukleotidvergleich, wie oben dargestellt, beurteilt werden kann, oder definiert als zur Hybridisierung an Nukleinsäuresegmente von SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3, oder SEQ ID Nr: 5 unter relativ stringenten Bedingungen befähigte, wie zum Beispiel jenen hierin beschrieben, definiert.
Die Nukleinsäuresegmente der vorliegenden Erfindung können, ungeachtet der Länge der kodierenden Sequenz, ihrerseits mit anderen DNA-Sequenzen kombiniert werden, wie zum Beispiel Promotoren, Polyadenylierungssignale, zusätzliche Stellen für Restriktionsenzyme, multiple Klonierungsstellen, andere kodierende Segmente und Ähnlichem, so dass ihre Gesamtlänge um einiges variieren kann. Es ist daher vorgesehen, dass ein Nukleinsäurefragment von nahezu jeder Länge verwendet werden kann, mit einer Gesamtlänge bevorzugt eingeschränkt durch die Leichtigkeit der Präparation und Verwendung in dem beabsichtigten rekombinanten DNA-Protokoll. Zum Beispiel können Nukleinsäurefragmente hergestellt werden, die eine kurze zusammenhängende Strecke identisch zu oder komplementär zu SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 5 einschließen, wie zum Beispiel 14 Nukleotide, und die bis zu ungefähr 10000 oder ungefähr 5000 Basenpaare lang sind, mit Segmenten von ungefähr 3000, bevorzugt in verschiedenen Fällen. DNA-Segmente mit einer Gesamtlänge von ungefähr 2000, ungefähr 1000, ungefähr 500, ungefähr 200, ungefähr 100 und ungefähr 50 Basenpaare in der Länge (einschließlich aller dazwischen liegenden Längen) sind auch als nützlich zu betrachten.
Es ist leicht zu verstehen, dass „dazwischen liegende Längen" in diesen Zusammenhängen jede Länge zwischen den genannten Bereichen bedeutet, wie zum Beispiel 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; einschließlich aller ganzen Zahlen bis durch die Bereiche 200–500; 500–1000; 1000–2000; 2000–3000; 3000–5000; 5000–10000, bis zu und einschließlich Sequenzen von ungefähr 12001, 12002, 13001, 13002 und ähnlichen.
Es ist auch selbstverständlich, dass diese Offenbarung nicht auf die spezifischen Nukleinsäuresequenzen limitiert ist, die in SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 5 offenbart sind, oder auf die Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 offenbart sind. Rekombinante Vektoren und isolierte DNA-Segmente können daher verschiedenartig die CBP Epitop-kodierenden Regionen an sich umfassen, kodierende Regionen, welche ausgewählte Änderungen oder Modifikationen in der Hauptkodierungsregion tragen, oder sie können größere Polypeptide kodieren, die nichtsdestotrotz CBP-abgeleitete Kodierungsregionen umfassen oder können biologisch funktionale Äquivalentproteine kodieren oder Peptide, welche abweichende Aminosäuresequenzen haben.
Die DNA-Segmente der vorliegenden Erfindung umfassen biologisch funktionale CBP-abgeleitete Proteine und Peptide, insbesondere jene CBP und ähnliche Proteine, aus prokaryotischen Quellen, und insbesondere Bakterien isoliert worden sind. DNA-Segmente, welche aus den Arten Staphylokokki und Streptokokki und ähnlichen Bakterien isoliert worden sind, für welche gezeigt wurde, an Col zu binden, sind besonders bevorzugt für die Verwendung in den hierin offenbarten Methoden. Solche Sequenzen können als Folge einer Codon-Redundanz und funktionaler Äquivalenz hervorgehen, für die bekannt ist natürlicherweise innerhalb von Nukleinsäuresequenzen und den dadurch kodierten Proteinen vorzukommen. Wahlweise können funktional-äquivalente Proteine oder Peptide via der Anwendung von rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden, in welcher Änderungen in der Proteinstruktur eingefügt werden können, basierend auf der Beachtung von Eigenschaften der Aminosäuren, welche ausgetauscht werden. Die durch den Menschen konstruierten Änderungen können durch die Anwendung von zielgerichteter Mutagenesetechniken eingefügt werden, wie zum Beispiel um Verbesserungen der Antigenität des Proteins einzufügen oder Mutanten zu testen, um die Aktivität auf molekularer Ebene zu bestimmen.
Wenn gewünscht, können auch Fusionsproteine und Peptide hergestellt werden, zum Beispiel wo die CBP oder CBP-abgeleiteten Kodierungsregionen in der gleichen Expressionseinheit mit anderen Proteinen oder Peptiden verbunden sind, welche gewünschte Funktionen, haben wie zum Beispiel zur Reinigung oder Immunodetektionzwecke (zum Beispiel Proteine, die jeweils durch Affinitätschromatographie und Enzym-markierungs-Kodierungsregionen gereinigt werden können).
2.2. Rekombinante Expression von CBP und CBP-abgeleiteten Epitopen
Die vorliegende Offenbarung betrifft auch rekombinante Wirtszellen für die Expression eines isolierten cna Gens, oder für eine DNA-Sequenz, welche eine oder mehrere epitopische Peptide kodiert, aus einem cna-kodierenden Protein abgeleitet sind. Es ist vorgesehen, dass so gut wie jede Wirtszelle für diesen Zweck verwendet werden kann, aber verschiedene Vorteile bei Verwendung einer bakteriellen Zelle, wie zum Beispiel E. Coli, S. Typhimorium, B. Subtilis, oder S. Aureus, S. Dysgalactiae, S. Pyogenes oder anderen Gram-positiven Arten gefunden werden können. Auch die Expression in einer eukaryotischen Zellen ist vorgesehen, wie zum Beispiel jenen abgeleitet von Hefe-, Insekten-, oder Säugetier- Zelllinien. Diese rekombinanten Wirtszellen können in Verbindung mit der „Überexpression" des CBP-Proteins verwendet werden, d.h. Erhöhung der Menge der Expression über diejenige, die natürlicherweise in S. Aureus vorkommt.
Es wird für die Proteine, die abgeleitet sind von, oder ähnlich zu, Aminosäuresequenzen von CBP erwartet, eine Affinität für Col zu haben und können von anderen Bestandteilen von S. Aureus oder rekombinanten Wirtszellen durch Chromatographie auf Substanzen, welche Col enthalten, gereinigt werden, eine sogenannte „Affinitäts-Chromatographie". CBPs können auch durch Verfahren gereinigt werden, welche nicht auf einer Affinität zu Col basieren, wie zum Beispiel Ionenaustausch-Chromatographie, der Größen-Ausschluß-Chromatographie, der Metall-Chelat-Chromatographie, oder ähnlichem. Puffer, Detergentien und andere Konditionen können verschieden sein von jenen, die optimal sind für die „Affinitäts-Chromatographie". In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Affinitäts-Grundsubstanz, umfassend Typ II Col oder ähnliche Col-Arten (zum Beispiel, Typ I, Typ III, Typ V, Typ IX, etc.), für die Isolierung von CBPs aus Lösung verwendet werden, oder wahlweise der Isolation von intakten Bakterien, welche CBPs exprimieren, oder sogar Membranfragmente von Bakterien, welche CBPs exprimieren.
Ein besonderer Aspekt der Erfindung stellt neue Arten und Weisen zur Verfügung, in welchen rekombinante CBPs oder CBP-abgeleitete Peptide, Nukleinsäuresegmente, welche diese Peptide kodieren, rekombinante Vektoren und transformierte Wirtszellen, umfassend cna oder cna-abgeleitete DNA-Segmente, rekombinante Vektoren und transformierte Wirtszellen, welche cna oder cna-abgeleitete DNA-Segmente umfassen, und rekombinante Vektoren und transformierte Wirtszellen, welche S. Aureus cna-abgeleitete DNA-Segmente umfassen, verwendet werden können. In besonderen Ausführungsformen werden gentechnisch manipulierte Nukleinsäuresegmente und CBP-Proteine erhalten, welche veränderte Col-Bindungsstellendomänen haben. Durch die Verwendung der hierin offenbarten Verfahren haben die Erfinder ortsspezifisch veränderte CBPs entwickelt, welche eine reduzierte Affinität für Col haben. Wie jenen auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt ist, sind viele solcher Vektoren und Wirtszellen leicht erhältlich, ein besonders detailliertes Beispiel von einem geeigneten Vektor für die Expression in Säugetierzellen ist das beschrieben in US-Patent 5,168,050. Dennoch besteht kein Erfordernis, dass ein stark gereinigter Vektor verwendet wird, solange wie die verwendeten kodierenden Segmente ein Protein oder Peptid von Interesse kodieren (zum Beispiel ein CBP, und insbesondere ein CBP aus S. Aureus, oder ähnlichen Bakterien, und umfasst nicht jede kodierende- oder regulatorische Sequenz, die einen nachteiligen Effekt auf die Zellen haben würde). Daher ist es auch selbstverständlich, dass geeignete Nukleinsäuresequenzen zusätzliche Reste umfassen können, wie zum Beispiel zusätzliche nicht-kodierende Sequenzen, welche entweder die 5'- oder 3'-Teile der kodierenden Region flankieren, oder verschiedene regulatorische Sequenzen umfassen können.
Nach der Identifikation eines geeigneten Epitop-kodierenden Nukleinsäuremoleküls kann dieses in einem beliebigen der vielen zur Zeit auf dem Fachgebiet bekannten Vektoren eingefügt werden, so dass er die Expression und Produktion von dem Protein- oder Peptid- Epitop von Interesse regelt (zum Beispiel von CBP aus S. Aureus), wenn er in eine Wirtszelle inkorporiert ist. In einem rekombinaten Expressionsvektor wird der kodierende Anteil von dem DNA-Segment unter der Kontrolle eines Promotors positioniert. Der Promotor kann in der Art von dem Promotor sein, welcher natürlicherweise mit einem CPB-kodierenden Nukleinsäuresegment verbunden ist, wie durch die Isolation der 5'-nichtkodierenden Sequenzen, welche upstream der kodierenden Segmente lokalisiert sind, erhalten werden kann, zum Beispiel, indem rekombinante Klonierungs- und/oder PCR^TM-Technologien verwendet werden, in Verbindung mit den hierin offenbarten Zusammensetzungen. Direkte Amplifikation der Nukleinsäuren durch Verwendung der PCR^TM-Technologie der US-Patente 4,683,195 und 4,683,202 sind insbesondere vorgesehen, nützlich in solchen Methodologien zu sein.
In einigen Ausführungsformen ist vorgesehen, dass besondere Vorteile durch die Positionierung des CBP-kodierenden DNA-Segments unter die Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotor erhalten werden. Wie hierin verwendet, ist ein rekombinanter oder heterologer Promotor dafür vorgesehen, sich auf einen Promotor zu beziehen, der üblicherweise nicht mit einem cna oder cna-ähnlichem Gensegment in seiner natürlichen Umgebung verbunden ist. Solche Promotoren können solche umfassen, die normalerweise mit anderen MSCRAMM-kodierenden Genen verbunden ist, und/oder Promotoren isoliert aus jeder anderen bakteriellen, viralen, eukaryotischen oder Säugetierzelle. Selbstverständlich ist es wichtig, einen Promotor zu verwenden, der wirksam die Expression des DNA-Segments in der spezifischen Zelle regelt, welche den Vektor umfasst, welcher das CBP-kodierende Nukleinsäuresegment umfasst.
Die Verwendung von Promotor und Zelltypkombinationen für die Proteinexpression ist dem Fachmann der Molekularbiologie üblicherweise bekannt, zum Beispiel, siehe Sambrook et al., 1989. Die verwendeten Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein, und können unter den geeigneten Bedingungen verwendet werden, um hohe Expressionsmengen der eingeführten DNA-Segmente zu regeln, wie es zum Beispiel in der großtechnischen Herstellung von rekombinanten Proteinen oder Peptiden vorteilhaft ist.
Die prokaryotische Expression von Nukleinsäuresegmenten der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden, indem Methoden verwendet werden, die jenen auf dem Fachgebiet bekannt sind, und wird wahrscheinlich Expressionsvektoren und Promotorsequenzen umfassen, wie zum Beispiel jene erhalten durch tac, trp, lac, lacUV5 oder T7. Wenn die Expression von rekombinanten CBP-Proteinen in eurkaryotischen Zellen erwünscht ist, stehen eine Anzahl von Expressionssystemen zur Verfügung und sind jenen auf dem Fachgebiet bekannt. Ein exemplarisches eukaryotisches Promotorsystem, welches für die Verwendung in der Expression hoher Mengen vorgesehen ist, ist das Pichia-Expressions-Vektorsystem (Pharmacia LKB Biotechnology).
In Verbindung mit Ausführungsformen der Expression, um rekombinantes CBP und Peptide herzustellen, ist es vorgesehen, dass oftmals längere DNA-Segmente verwendet werden, mit DNA-Segmenten, welche das gesamte CBP oder funktionale Domänen, Epitope, Liganden-Bindungsdomänen, Untereinheiten, etc. kodieren, welche am meisten bevorzugt sind. Dennoch wird verstanden werden, dass die Verwendung von kürzeren DNA-Segmenten, um die Expression von CBP-Peptiden oder Epitop-Kernregionen zu regeln, verwendet werden können, um Anti-CBP-Antikörper herzustellen, auch in den Schutzumfang der Erfindung fallen. DNA-Segmente, die Peptid-Antigene von ungefähr 15 bis ungefähr 100 Aminosäuren in der Länge kodieren, oder noch bevorzugter, von ungefähr 15 bis ungefähr 50 Aminosäuren in der Länge, sind als besonders nützlich vorgesehen. Beispielhafte DNA-Segmente, welche Peptid-Epitope von dem Col-Bindungsprotein kodieren, für welche die Erfinder die Nützlichkeit in der Vorbeugung der Bindung an Col gezeigt haben, umfassen die Polynukleotide offenbart in SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 und SEQ ID Nr: 5.
Die cna Gene und cna-abgeleiteten DNA-Segmente können auch in Zusammenhang mit der somatischen Expression in einem Lebewesen verwendet werden oder in der Erschaffung eines transgenen Tieres. Noch einmal, in solchen Ausführungsformen ist die Verwendung von einem rekombinanten Vektor, der Expression von der gesamten Länge oder einer oder mehrerer aktiver CBP-Epitope regelt, vorzugsweise vorgesehen. Die Expression von cna-Transgen in Lebewesen ist vorzugsweise als nützlich in der Herstellung von Anti-CBP-Antikörpern für die Verwendung in der Methode der passiven Immunisierung für die Prävention von Staphylokokken- und Streptokokken-Adhesion an Col vorgesehen.
Die Verwendung von rekombinanten Promotoren, um eine Proteinexpression zu erhalten, ist im allgemeinen den Fachmännern auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt, zum Beispiel siehe Sambrook et al. (1989). Die verwendeten Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein, und können unter geeigneten Bedingungen verwendet werden, um hohe Mengen oder eine regulierte Expression der eingeführten DNA-Segmente zu regeln. Für die eurkaryotische Expression sind die derzeit bevorzugten Promotoren solche, wie zum Beispiel CMV, RSV LTR, der SV40-Promotor alleine, und der SV40-Promotor in Verbindung mit dem SV40-Enhancer. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Expression von rekombinanten CBPs ausgeführt, indem prokaryotische Expressionssysteme verwendet werden, und insbesondere bakterielle Systeme, wie zum Beispiel E. Coli. Solch eine prokaryotische Expression von Nukleinsäuresegmenten der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden, indem dem Fachmann bekannte Methoden verwendet werden, und wird wahrscheinlich Expressionsvektoren und Promotorsequenzen umfassen, wie zum Beispiel jene erhalten durch tac, trp, lac, lacUV5 oder T7-Promotoren.
Für die Expression von CBP oder CBP-abgeleiteten Epitopen kann, sobald ein geeigneter Klon oder Klone erhalten wurden, ob native Sequenzen oder genetisch modifizierte, fortgefahren werden, ein Expressionssystem für die rekombinante Herstellung von CBP oder CBP-abgeleiteten Peptiden zu entwerfen. Die Herstellung von einem DNA-Segment(en) für die Expression in einem prokaryotischen oder eukaryotischen System kann durch Techniken durchgeführt werden, die im Allgemeinen jenen auf dem Gebiet der rekombinanten Expression bekannt sind. Es wird geglaubt, dass so gut wie jedes Expressionssystem in der Expression von CBP oder CBP-abgeleiteten Epitopen verwendet werden kann.
Alternativ kann es in einigen Ausführungsformen wünschenswert sein, CBP oder CBP-abgeleitete Epitope in eukaryotischen Expressionssystemen zu exprimieren. Die DNA-Sequenzen, welche die gewünschten CBP oder CBP-abgeleiteten Epitope (entweder nativ oder mutagenisiert) kodieren, können separat in bakteriellen Systemen exprimiert werden, mit den kodierten Proteinen als Fusionen exprimiert werden, als Fusionen mit b-Galactosidase, Ubiquitin, Schistosoma Japonicum Glutathion S-transferase, S. Aureus-Protein A, Maltose-Bindungsprotein und Ähnlichem. Es wird geglaubt, dass die bakterielle Expression letztendlich Vorteile gegenüber der eukaryotischen Expression in Hinblick auf die Einfachheit der Verwendung und Quantität des dadurch erhaltenen Materials hat.
Es ist beabsichtigt, dass für Transformationen von Wirtszellen mit DNA-Segmenten, welche solche Epitope kodieren, ein zweckmäßiges Mittel für die Erlangung von CBP oder CBP-abgeleiteten Peptiden bildet. Genomische Sequenzen sind für die eukaryotische Expression geeignet, da die Wirtszelle sicherlich das genomische Transkript prozessiert, um funktionale mRNA für die Translation in Protein hervorzubringen.
In gleicher Weise wird davon ausgegangen, dass nahezu jedes eurkaryotisches Expressionssystem für die Expression von CBP und CBP-abgeleiteten Epitopen verwendet werden kann, zum Beispiel können auf Baculovirus basierende, auf Glutaminsynthase basierende oder auf Dihydrofolatreduktase basierende Systeme verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist es vorgesehen, dass Plasmidvektoren, welche eine "Origin of replication" umfassen und einen effizienten eukaryotischen Promotor, wie beispielhaft durch die eukaryotischen Vektoren der pCMV-Serie veranschaulicht, wie zum Beispiel ein pCMV5, am meisten gebraucht werden.
Für die Expression in dieser Art und Weise würde man die kodierenden Sequenzen angrenzend an und unter der Kontrolle von dem Promotor positionieren. Es ist auf dem Fachgebiet selbstverständlich, dass eine kodierende Sequenz unter die Kontrolle eines solchen Promotors gebracht wird, man positioniert das 5'-Ende von der Transkriptions-Initiierungsstelle des Transkriptions-Leserahmens von dem Protein zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 Nukleotiden „downstream" von (d.h. 3' von) dem gewählten Promotor.
Wo eine eukaryotische Expression vorgesehen ist wird man auch üblicherweise wünschen, eine Transkriptionseinheit, welche die Nukleotidsäuresequenzen umfasst, welche für CBP oder CBP-abgeleitete Peptide kodieren, eine geeignete Polyadenylierungsstelle (zum Beispiel 5'-AATAAA-3') einzufügen, wenn nicht eine innerhalb des originalen klonierten Segments enthalten war. Üblicherweise wird die Poly-A Additionsstelle ungefähr 30 bis 2000 Nukleotide „downstream" von der Terminationsstelle von dem Protein in einer Position vor dem Transkriptionsende plaziert.
Es ist vorgesehen, dass so gut wie jede allgemein verwendeten Wirtszellen in Verbindung mit der Expression von dem CBP und dem CBP-abgeleiteten Epitopen in Übereinstimmung hiermit verwendet werden kann. Beispiele umfassen Zelllinien, die üblicherweise für die eukaryotische Expression verwendet werden, wie zum Beispiel 239, AtT-20, HepG2, VERO, HeLa, CHO, WI 38, BHK, COS-7, RIN und MDCK-Zelllinien.
Es ist weiterhin vorgesehen, dass das CBP oder Epitop-Peptide, welche von nativen oder rekombinanten CBPs abgeleitet sind, „überexprimiert" werden können, d.h. in hohen Mengen relativ zu seiner natürlichen Expression in humanen Zellen exprimiert wird, oder sogar relativ zu der Expression von anderen Proteinen in einer rekombinanten Wirtszelle, welche CBP-kodierende DNA-Segmente enthält. Solch eine Überexpression kann durch eine Vielfalt an Methoden beurteilt werden, einschließlich durch radioaktive Markierung und/oder Proteinreinigung. Dennoch sind einfache und direkte Methoden bevorzugt, zum Beispiel jene, die SDS/PAGE und Proteinmarkierung oder Western-Blot involvieren, gefolgt durch quantitative Analysen, wie zum Beispiel eine densitometrische Abtastung des resultierenden Gels oder Blots. Eine spezifische Erhöhung in der Menge von dem rekombinanten Protein oder Peptid im Vergleich zu der Menge in den ursprünglich CBP-herstellenden Zellen ist ein Hinweis für eine Überexpression, da es die relative Menge von dem spezifischen Protein in Relation zu den anderen Proteinen ist, welche durch die Wirtszelle hergestellt werden und zum Beispiel sichtbar auf einem Gel ist.
Wie hierin verwendet, ist es beabsichtigt, dass der Begriff „manipulierte" oder „rekombinante" Zelle sich auf eine Zelle bezieht, in welcher ein rekombinantes Gen, zum Beispiel ein Gen, welches ein CBP oder ein CBP-abgeleitetes Epitop kodiert, eingefügt wurde. Auf diese Weise sind manipulierte Zellen unterscheidbar von ursprünglich vorkommenden Zellen, welche kein rekombinant eingefügtes Gen enthalten. Manipulierte Zellen sind solche Zellen, welche ein Gen oder Gene haben, welche durch Menschenhand eingefügt worden sind. Rekombinant eingefügte Gene sind entweder in der Form von einzelnen strukturellen Genen, einem gesamten genomischen Klon, umfassend ein strukturelles Gen und flankierende DNA, oder ein Operon oder anderen funktionalen Nukleinsäuresegementen, welche auch Gene umfassen, die entweder upstream und/oder downstream von dem Promotor, regulatorischen Elementen oder strukturellen Genen an sich, positioniert sind, oder sogar Genen, die nicht natürlicherweise mit dem spezifischen strukturellen Gen von Interesse verbunden sind.
Wo die Einführung einer rekombinanten Version von einem oder mehreren vorangehenden Gene benötigt wird, wird es wichtig sein, das Gen so einzufügen, so dass es unter der Kontrolle von einem Promotor ist, der effektiv die Expression von dem Gen in dem für die Manipulation gewählten Zelltyp regelt. Im Allgemeinen wünscht man ein Promotor zu verwenden, der eine konstitutive (konstante) Expression von dem Gen von Interesse ermöglicht. Üblich verwendete konstitutive eukaryotische Promotoren umfassen virale Promotoren, wie zum Beispiel der Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, die Rous Sarcoma Long Terminal Repeat (LTR)-Sequenz, oder der SV40 Early Gene Promotor. Die Verwendung von diesen konstitutiven Promotoren wird einen hohen konstanten Grad der Expression von den eingefügten Genen gewährleisten. Die Erfinder haben bemerkt, dass der Grad der Expression von den eingefügten Genen von Interesse in verschiedenen Klonen variieren kann, oder Genen, isoliert von verschiedenen Stämmen oder Bakterien. Somit kann der Grad der Expression von einem bestimmten rekombinanten Gen durch Auswertung verschiedener Klone, die von jeder Transfektionsstudie erhalten wurden, bestimmt werden; sobald die Linie ausgewählt ist, gewährleistet der konstitutive Promotor, dass der gewünschte Grad der Expression permanent aufrechterhalten wird. Es kann auch in Betracht kommen, Promotoren zu verwenden, die spezifisch für den für die Manipulation verwendeten Zelltyp sind, wie zum Beispiel der Insulinpromotor in Insulinoma-Zelllinien, oder der Prolactin- oder Wachstumshormon-Promotor in älteren hypophysen Zelllinien.
2.3. Immunologische Detektion von CBP und Bakterien, welche CBPs exprimieren
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Herstellung von immunologischen Zusammensetzungen, und insbesondere Anti-CBP-Antikörpern für diagnostische und therapeutische Verfahren mit Bezug auf die Detektion und Behandlung von Infektionen, welche durch S. Aureus und ähnlichen Gram-positiven Arten verursacht worden sind. In bevorzugten Ausführungsformen sind Antikörperzusammensetzungen offenbart, welche an die ortspezifisch veränderten rekombinanten CBPs, welche in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, binden. Auch sind Antikörper offenbart, welche spezifisch native und synthetisch-mutierte Col-Bindungsdomänen-Epitope innerhalb der CBPs erkennen. Die Erfinder betrachten solche Antikörper als nützlich sowohl in diagnostischen Screening-Assays, Verfahren für die Reinigung von Col, der Detektion von Anti-CBP-Antikörpern, als auch ihrer Verwendung für die passive Immunisierung von Lebewesen, um eine bakterielle Sepsis, die Kolonisation, oder die Bindung an die ECM-Komponente Col zu verhindern.
2.4 Methoden für die Auslösung einer Immunantwort
Offenbart ist auch ein Verfahren zur Generierung einer Immunantwort in einem Lebewesen. Das Verfahren umfasst im Allgemeinen die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, umfassend eine immunologisch wirksame Menge einer hierin offenbarten Peptidzusammensetzung. Die Peptidzusammensetzungen umfassen das Peptid, das in einer der Sequenzen von SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 oder SEQ ID Nr: 6 offenbart ist.
Die Erfindung umfasst auch CBP und CBP-abgeleitete Peptid-Antigenzusammensetzungen zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, Trägern, Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und anderen Komponenten, wie zum Beispiel zusätzliche Peptide, Antigene oder Präparationen von Außenmembran, wie es in der Formulierung bestimmter Impfstoffe verwendet werden kann.
Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung kodieren CBP und sind nützlich, um reines rekombinantes CBP für die Verabreichung an einen Wirt herzustellen. Solche Verabreichungen sind als Impfstoffe nützlich, um therapeutische Antikörper zu induzieren, die die Bindung von S. Aureus an das Wirtsgewebe verhindern.
Es ist hierin gezeigt, dass Antiseren, welche gegen CBP erzeugt wurden und reaktiv sind mit CBP, die Bindung inhibieren, die Phagocytose fördern und die intrazelluläre Zerstörung durch Makrophagen erhöhen. Somit ist es vorgesehen, dass die Verabreichung von Antikörpern, welche reaktiv sind mit CBP, an gefährdeten Personen in der Prophylaxe wirksam sind von, und im Fall von infizierten Personen für die Therapie von, bakteriellen Infektionen.
Die Antikörper können von verschiedener Art sein, einschließlich jenen, die in heterologen Spenderlebewesen oder humanen Freiwilligen, welche mit CBPs immunisiert sind, erzeugt worden sind, monoklonale Antikörpern (mAbs), die aus Hybridomen resultieren, welche aus der Fusion von B-Zellen aus CBP-immunisierten Tieren oder Menschen mit kompatiblen Myelom Zelllinien stammen, sogenannte „humanisierte" mAbs, die aus der Expression von Genfusionen von Komplementaritäts-determinierenden Regionen von mAb-kodierenden Genen aus heterologen Arten mit Genen, welche humane Antikörper kodieren, resultieren oder CBP-reaktive Antikörper enthaltende Fraktionen aus Plasma von humanen Spendern. Es ist vorgesehen, dass jede der Techniken, die oben beschrieben sind, für die Impfung von Personen zum Zwecke der Antikörperherstellung angewendet werden kann. Die optimale Dosierung solcher Antikörper ist in hohem Maße von der Pharmakinetik der spezifischen Antikörperpopulation in der jeweiligen zu behandelnden Art abhängig. Es ist vorgesehen, dass die Dauer der Dosierung, welche Anti-CBP-Mengen bei diesen inhibitorischen Antikörperkonzentrationen aufrecht erhält, mindestens vier bis acht Wochen im Anschluß an einer mutmaßlichen S. Aureus-Aussetzung beträgt, oder während der ganzen Dauer von Symptomen der Erkrankung und für mindestens vier bis acht Wochen nach Beendigung dieser Symptome.
Durch die Verwendung des hierin beschriebenen Peptidantigene stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Generierung einer Immunantwort bereit, wobei die Verfahren im Allgemeinen die Verabreichung einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung, umfassend eine immunologisch wirksame Menge einer CBP-Peptidzusammensetzung, an ein Lebewesen umfassen. Bevorzugte Lebewesen umfassen Säugetiere und insbesondere Menschen. Andere bevorzugte Lebewesen umfassen Mäuse, Rinder, Pferde, Schweine, Hunde und Katzen. Die Zusammensetzungen können teilweise oder signifikant gereinigte CBP-Peptid-Epitope umfassen, die aus natürlichen oder rekombinanten Quellen erhalten wurden, die Proteine oder Peptide können natürlich erhältlich sein oder entweder chemisch synthetisiert, oder alternativ in vitro von rekombinanten Wirtszellen, welche DNA-Segmente exprimieren, die solche Epitope kodieren, hergestellt. Kleiner Peptide, die solche reaktiven Epitope umfassen, wie zum Beispiel solche zwischen ungefähr 10 und ungefähr 50, oder aber zwischen ungefähr 50 und ungefähr 100 Aminosäuren lang werden meistens bevorzugt sein. Die antigenen Proteine oder Peptide können auch mit anderen Wirkstoffen kombiniert werden, wie zum Beispiel andere Peptide oder Nukleinsäurezusammensetzungen, wenn erwünscht.
Mit „immunologisch wirksamer Menge" ist eine Menge einer Peptidzusammensetzung gemeint, die in der Lage ist, eine Immunantwort in einem Empfängerlebewesen zu generieren. Dies umfasst sowohl die Generierung einer Antikörperantwort (B-Zell-Antwort) und/oder die Stimulation einer cytotoxischen Immunantwort (T-Zell-Antwort). Die Generierung einer solchen Immunantwort ist sowohl für die Herstellung von nützlichen Bioreagenzien von Nutzen, zum Beispiel CTLs und, noch spezieller, reaktiver Antikörper zur Verwendung in diagnostischen Ausführungsformen, und wird auch nützlich in verschiedenen prophylaktischen oder therapeutischen Ausführungsformen von Nutzen sein. Daher ist es selbstverständlich, dass, obwohl diese Methoden für die Stimulation einer Immunantwort Impfungsregime umfassen, welche für die Vorbeugung oder Verminderung signifikanter Infektionen vorgesehen sind, die durch Bakterien, welche CBP exprimieren, verursacht werden und die Behandlungsregime, welche den Grad oder die Dauer einer Infektion mindern, das Erreichen einer von diesen Endergebnissen nicht für die Ausübung dieser Aspekte der Erfindung notwendig ist. Solche Behandlungsmethoden können insbesondere für die Behandlung von Infektionen verwendet werden, welche durch Pathogene, wie zum Beispiel S. Aureus, ähnliche Arten und anderen Bakterien, welche CBPs exprimieren und an Col binden, verursacht werden.
Weitere Mittel, welche von den Erfindern für die Generierung einer Immunantwort in einem Lebewesen vorgesehen sind, umfassen die Verabreichung einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung an ein Tier oder einer humanen Person, umfassend eine immunologisch wirksame Menge einer Nukleinsäurezusammensetzung, welche für ein CBP-Epitop kodiert, oder einer immunologisch wirksamen Menge eines abgeschwächten lebenden Organismus, der solche Nukleinsäurezusammensetzungen umfasst und exprimiert. Die „immunologisch wirksamen Mengen" sind solche Mengen, welche im Stande sind, eine B-Zell- und/oder T-Zell-Antwort zu stimulieren.
Die Immunformulierungen dieser Erfindung, ob für die Impfung, die Behandlung, oder für die Generierung von Antikörpern, welche nützlich sind in der Detektion von S. Aureus und ähnlichen Bakterien, der Vorbeugung bakterieller Adhesion, oder im Fall der bakteriellen Kolonisation, Förderung der bakteriellen Adhesion an ECM-Komponenten, wie zum Beispiel Col vorgesehen, können native oder synthetisch abgeleitete antigene Peptidfragmente von diesen Proteinen umfassen. Als solche fallen auch antigene funktionale Äquivalente von den hierin beschriebenen Proteinen und Peptiden in den Umfang der vorliegenden Erfindung. Ein „antigenes funktionelles äquivalentes" Protein oder Peptid ist eines, das ein Epitop umfasst, das immunologisch mit einem oder mehreren Epitopen kreuzreaktiv ist, abgeleitet aus einer der jeweiligen offenbarten MSCRAMM-Proteine (zum Beispiel CBPs), und insbesondere das CBP von S. Aureus. Antigene funktionelle Äquivalente, oder epitopische Sequenzen, können zunächst entworfen oder vorhergesagt und dann getestet werden, oder können einfach direkt auf Kreuzreaktivität hin getestet werden.
In noch weiteren Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Immunodetektionsverfahren und damit im Zusammenhang stehende Kits. Es ist vorgesehen, dass die Proteine und Peptide der Erfindung verwendet werden können, um Antikörper zu detektieren, welche damit Reaktivität aufweisen, oder, wahlweise, können Antikörper, welche in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt worden sind, verwendet werden, um CBP oder Peptide zu detektieren. Jede Art von Kit kann in der Immunodetektion von Verbindungen verwendet werden, die innerhalb klinischer Proben vorhanden sind, die für Infektionen indikativ sind, welche durch Gram-positive Bakterien verursacht werden, die ein CBP exprimieren, und insbesondere S. Aureus. Die Kits können auch für die Antigen- oder Antikörperreinigung verwendet werden, soweit erforderlich.
Im Allgemeinen umfassen die bevorzugten Immunodetektionsmethoden zuerst das Erhalten einer Probe, welche verdächtigt wird, einen CBP-reaktiven Antikörper zu enthalten, wie zum Beispiel eine biologische Probe aus einem Patienten, und das Kontaktieren der Probe mit einem ersten CBP oder Peptid unter effektiven Bedingungen die Bildung eines Immunokomplexes zu ermöglichen (primärer Immunkomplex). Dann kann man das Vorhandensein eines primären Immunkomplexes, der gebildet wurde, detektieren.
Das Kontaktieren der ausgewählten Probe mit dem CBP oder Peptid unter effektiven Bedingungen, um die Bildung eines (primären) Immunkomplexes zu ermöglichen, ist im allgemeinen eine Sache von einfacher Hinzufügung der Protein- oder Peptidzusammensetzung zu der Probe. Dann inkubiert man das Gemisch für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, dem hinzugefügten Antigen zu ermöglichen, einen Immunkomplex zu bilden mit, d. h. zu binden an, jeden Antikörper, der innerhalb der Probe ist. Nach dieser Zeit wird die Probenzusammensetzung, wie zum Beispiel eine Gewebeprobe, eine ELISA-Platte, ein Dot-Blot oder ein Western-Blot, im Allgemeinen gewaschen, um nicht spezifisch gebundene Antigen-Arten zu entfernen, somit wird ermöglicht, dass nur jene spezifisch gebundenen Arten innerhalb des Immunkomplexes detektiert werden.
Die Detektion von Immunkomplexbildungen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und kann durch die Anwendung einer Anzahl von Ansätzen erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind und in verschiedenen Publikationen beschrieben worden sind, wie zum Beispiel, beispielsweise Nakamura et al. (1987), durch Bezugnahme hierin aufgenommen. Die Detektion von Primärkomplexen basiert im allgemeinen auf der Detektion eines Labels oder eines Markers, wie zum Beispiel eines radioaktiven, fluoreszierenden, biologischen oder enzymatischen Labels, mit Enzymtags, wie zum Beispiel alkaline Phosphatase, Urease, Horseradish Peroxidase, Glukoseoxidase sind geeignet. Das jeweilig verwendete Antigen kann seinerseits an ein detektierbares Label geknüpft sein, wobei man dann einfach dieses Label detektieren würde, dadurch ermöglichen, dass die Menge von gebundenem Antigen, welche in der Zusammensetzung vorhanden ist, bestimmt wird.
Wahlweise kann der primäre Immunkomplex durch das Mittel eines zweiten Bindungsliganden detektiert werden, welcher an ein detektierbares Label gebunden ist und Bindungsaffinität für das erste Protein oder Peptid hat. Der zweite Bindungsligand ist seinerseits oft ein Antikörper, welcher somit als „zweiter" Antikörper bezeichnet wird. Die primären Immunkomplexe werden mit dem markierten zweiten Bindungsliganden oder Antikörper unter Bedingungen kontaktiert und für eine Zeitdauer, welche ausreichend ist, die Bildung eines zweiten Immunkomplexes zu ermöglichen. Die zweiten Immunkomplexe werden dann im Allgemeinen gewaschen, um nicht spezifisch gebundene markierte sekundäre Antikörper zu entfernen und die verbleibenden gebundenen Label dann zu detektieren.
Für diagnostische Zwecke wird vorgeschlagen, dass so gut wie jede Probe, die verdächtigt wird, Antikörper von Interesse zu enthalten, verwendet wird. Beispielhafte Proben umfassen klinische Proben, erhalten aus einem Patienten, wie zum Beispiel Blut- oder Serumproben, Bronchoalveolarfluid, Ohrabstriche, Sputumproben, Mittelohrflüssigkeit oder sogar auch vielleicht Urinproben können verwendet werden. Dieses ermöglicht die Diagnose von Infektionen, welche durch Gram-positive Bakterien, und insbesondere S. Aureus, verursacht werden. Weiterhin ist es vorgesehen, dass solche Ausführungsformen in nicht-klinischen Proben Anwendung finden, wie zum Beispiel zur Bestimmung des Tites von Antikörperproben, in der Auswahl von Hybridomen, der Detektion von Anti-CBP-Antikörpern in Proben, der Reinigung von CBPs, und der Prävention von bakterieller Adhesion an Col, und Ähnlichem. Wahlweise können die klinischen Proben aus Veterinärquellen sein und können solche einheimischen Tiere umfassen, wie Rinder, Schafe und Ziegen. Proben von Katzen, Hunden und Pferdequellen können auch in Übereinstimmung mit den hierin beschriebenen Methoden verwendet werden.
In ähnlichen Ausführungsformen sieht die vorliegende Erfindung die Herstellung von Kits vor, die verwendet werden können, um das Vorhandensein von CBP-spezifischen Antikörpern in einer Probe zu detektieren. Im Allgemeinen gesprochen, umfassen die Kits in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein geeignetes Protein oder Peptid, zusammen mit einem Immunodetektionsreagenz, und einem Mittel für das Beinhalten des Proteins oder Peptids und des Reagenz.
Das Immunodetektionsreagenz wird üblicherweise ein Label umfassen, welches mit einem CBP oder Peptid verbunden ist, oder mit einem zweiten Bindungsliganden verbunden ist. Beispielhafte Liganden können einen sekundären Antikörper umfassen, welcher gegen das erste CBP oder Peptid oder Antikörper gerichtet ist, oder einer Biotin- oder Avidin- (oder Streptavidin)-Liganden, welche mit einem Label verbunden sein können. Detektierbare Labels, welche an Antikörper gebunden sind, welche Bindungsaffinität für einen humanen Antikörper haben, sind auch vorgesehen, zum Beispiel für Protokolle, wo das erste Reagenz ein CBP-Peptid ist, das verwendet wurde, um an einen reaktiven Antikörper aus einer humanen Probe zu binden. Sicherlich sind, wie oben erwähnt, eine Anzahl von exemplarischen Labels auf dem Fachgebiet bekannt und all diese Labels können in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Kits können ein Antigen oder ein Antikörper-Label-Konjugat enthalten, entweder in voller konjugierter Form, in der Form von Intermediaten, oder als separate, durch den Anwender des Kits zu konjugierende Teile zu.
Das Behältnismittel wird im allgemeinen zumindest ein Fläschchen, ein Reagenzglas, einen Kolben, eine Flasche, eine Spritze oder andere Behältnismittel umfassen, in welche das Antigen plaziert werden kann, und bevorzugt und entsprechend gesammelt werden kann. Wo ein zweiter Bindungsligand erhalten wird, wird das Kit auch üblicherweise ein zweites Fläschchen oder andere Behältnisse, in welchen dieser Ligand oder Antikörper plaziert werden kann, enthalten. Die Kits der vorliegenden Erfindung umfassen auch üblicherweise ein Mittel für das Fassen der Fläschchen in dichtem Verschluss für den kommerziellen Verkauf, wie beispielsweise Injektion oder geblasene Plastikbehältnisse, in welcher die gewünschten Fläschchen aufbewahrt werden.
2.5 Verfahren für die Inhibition der bakteriellen Adhesion an Col
Des Weiteren ist das CBP als ein Mittel nützlich, um die Bindung oder Anhaftung von S. Aureus an Col zu blockieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine therapeutisch effektive Menge von einem CBP-abgeleiteten Epitop an eine Person durch herkömmliche Methoden verabreicht, um der Adhesion von S. Aureus an das Wirtsgewebe vorzubeugen oder zu blockieren. Die CBP-Zusammensetzung wird bevorzugt systemisch verabreicht (d.h. auf oralem, intravenösem, und/oder parenteralen Weg), kann aber auch topisch verabreicht werden, zum Beispiel auf eine örtlich begrenzte Gewebestelle, Wunde, Lesion oder jede andere Stelle, wo eine Prävention einer S. Aureus-Adhesion erwünscht ist. Der Begriff therapeutisch effektive Menge bedeutet die Menge einer CBP-Zusammensetzung, welche ausreichend ist, um die Adhärenz von S. Aureus an eine Person zu vermindern oder vorzubeugen oder die bekannten tödlichen Effekte einer S. Aureus-Infektion zu neutralisieren. Solch eine Dosis kann einfach durch bekannte klinische, diagnostische und pharmakologische Methoden bestimmt werden. Eine fehlende Adhesion von den Bakterien an das Gewebe, die erkrankungsinduzierenden Effekte der Mikroorganismen sind unterbrochen, somit ist das CBP der vorliegenden Erfindung nützlich als ein therapeutisches Agenz, um der Adhesion von S. Aureus vorzubeugen und dadurch die Erkrankung, welche durch diese Mikroorganismen induziert wird, zu vermindern oder vorzubeugen.
2.6 Verfahren für die Identifikation von Inhibitoren der Col-Bindung durch CBPs
In einer bevorzugten Ausführungsform werden neue rekombinante Polypeptide der vorliegenden Offenbarung in Verfahren verwendet, um Zusammensetzungen zu isolieren, identifizieren und charakterisieren, welche die Bindung von Col an CBPs inhibieren. Solche Inhibitoren sind in der Prävention der bakteriellen Adhesion an Col enthaltende extrazelluläre Grundsubstanzen nützlich. Diese Inhibitoren bieten eine nicht antibiotische Strategie für die Prävention einer bakteriellen Infektion in einem Lebewesen, vor allem durch die Inhibition der Col-Bindung an Proteine, welche auf der bakteriellen Zelloberfläche lokalisiert sind. Insbesondere sehen die Erfinder die Verwendung von CBP und CBP-abgeleiteten Peptide vor, um kleine Molekülinhibitoren zu bestimmen und zu screenen. Ein besonderer Nutzen dieser Inhibitoren ist die Prävention der bakteriellen Adhesion an exponiertes collagenes Gewebe, oder an eine Col-Ansammlung auf künstlichen Gelenken, medizinischen Implantaten und anderen chirurgischen Hilfsmitteln, welche der Col-Beschichtung zugänglich sind und einer anschließenden bakteriellen Adhesion an die Col-beschichteten Oberflächen. Gleichermaßen ermöglicht nun die Verfügbarkeit der Kristallstruktur des CBPs zum ersten Mal die Gestaltung von Peptidomimetikern, welche auch dazu dienen können, die Bindung von CBP an Col zu inhibieren.
2.7 Hybridisierungsausführungsformen
Zusätzlich zu ihrer Verwendung in der Regelung der Expression von CBP und CBP-abgeleiteten Epitop-Peptiden haben die hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen eine Vielzahl von anderen Verwendungen. Zum Beispiel finden sie Verwendung als Proben oder Primer in Ausführungsformen der Nukleinsäurehybridisierungs. Als solche ist es vorgesehen, dass Nukleinsäuresegmente, welche eine Sequenzregion umfassen, die aus zumindest einer 14 Nukleotid langen zusammenhängenden Sequenz besteht, welche die gleiche Sequenz wie, oder komplementär ist zu, einer 14 Nukleotid langen zusammenhängenden Sequenz einer der Sequenzen von SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 5 von besonderen Nutzen sein werden. Längere zusammenhängende identische oder komplementäre Sequenzen, wie zum Beispiel von ungefähr 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 (einschließlich aller intermediaren Längen) und bis zu Sequenzen mit voller Länge sind auch von Nutzen in einigen Ausführungsformen.
Die Fähigkeit solcher Nukleinsäureproben spezifisch an CBP-kodierende Sequenzen zu hybridisieren, wird sie in die Lage versetzen, von Nutzen der bei Detektion des Vorhandenseins von komplementären Sequenzen in einer gegebenen Probe zu sein. Dennoch sind andere Anwendungen vorgesehen, einschließlich die Verwendung der Sequenzinformation für die Herstellung von Primern mutanter Art, oder Primern für die Verwendung in der Herstellung anderer genetischer Konstrukte.
Nukleinsäuremoleküle, welche Sequenzregionen haben, bestehend aus zusammenhängenden Nukleotidstrecken von 10–14, 15–20, 30, 50 oder sogar bis zu 100–200 Nukleotide oder so, identisch oder komplementär sind zu SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3, oder SEQ ID Nr: 5, sind insbesondere als Hybridisierungsproben für die Verwendung in zum Beispiel Southern und Northern Blotting vorgesehen. Dieses würde die Analyse der CBP strukturellen oder regulatorischen Gene ermöglichen, sowohl in verschiedenen Zelltypen als auch in verschiedenen bakteriellen Zellen. Die Gesamtgröße von Fragmenten, als auch die Größe von komplementären Stück(en), wird letztendlich von der beabsichtigten Verwendung oder Anwendung von dem jeweiligen Nukleinsäuresegment abhängen. Kleinere Fragmente werden im allgemeinen Anwendung in Hybridisierungsausführungsformen finden, wobei die Länge von der zusammenhängenden komplementären Region variiert werden kann, zum Beispiel zwischen ungefähr 14 und ungefähr 100 Nukleotiden, aber größere zusammenhängende komplementäre Teile können verwendet werden, entsprechend mit der Länge der komplementären Sequenzen, die man zu detektieren wünscht.
Die Verwendung einer Hybridisierungsprobe von ungefähr 14–25 Nukleotiden in der Länge ermöglicht die Bildung eines Duplexmoleküls, das sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle, welche zusammenhängende komplementäre Sequenzen über Strecken größer als 14 Basen in der Länge haben, sind dennoch üblicherweise bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität der Hybride zu erhöhen, und dadurch die Qualität und den Grad der erhaltenen spezifischen Hybridmoleküle zu verbessern. Man wird es üblicherweise bevorzugen, Nukleinsäuremoleküle zu entwerfen, welche Gen-komplementäre Teile von 15–25 zusammenhängenden Nukleotiden haben, oder eben länger, wenn erwünscht.
Hybridisierungsproben können aus jedem Teil irgendeiner der hierin offenbarten Sequenzen ausgewählt werden. Alles was dafür erforderlich ist, ist die Sequenzen, dargestellt in SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 und SEQ ID Nr: 5, durchzusehen und einen zusammenhängenden Teil der Sequenz von ungefähr 14–25 Nukleotiden in der Länge bis zu und einschließlich der vollständigen Sequenz auszuwählen, welche man als Probe oder Primer zu verwenden wünscht. Die Wahl der Probe oder der Primersequenzen kann durch verschiedene Faktoren bestimmt werden, wie zum Beispiel, lediglich als Beispiel, kann man wünschen, Primer in Richtung der Enden der Gesamtsequenz zu verwenden.
Das Verfahren der Auswahl und der Herstellung eines Nukleinsäuresegments, das eine zusammenhängende Sequenz innerhalb von SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 5 umfasst, kann alternativ als Herstellung eines Nukleinsäuresegments beschrieben werden. Sicherlich können Fragmente auch durch andere Techniken erhalten werden, wie zum Beispiel, beispielsweise durch mechanisches Scheren oder durch Restriktionsenzymverdauung. Kleine Nukleinsäuresegmente oder -fragmente können einfach durch, zum Beispiel, direktes Synthetisieren des Fragments durch chemische Mittel hergestellt werden, wie es üblicherweise praktiziert wird, durch die Verwendung eines automatisierten Oligonukleotidsynthesizers. Auch können Fragmente durch die Anwendung von Nukleinsäurereproduktionstechnologien erhalten werden, wie zum Beispiel der PCR^TM-Technologie des US-Patents 4,683,202 (durch Referenz hiermit aufgenommen), durch die Einfügung ausgewählter Sequenzen in rekombinante Vektoren für die rekombinante Herstellung und durch andere rekombinante DNA-Techniken, die im Allgemeinen auf dem Fachgebiet der Molekularbiologie bekannt sind.
Entsprechend können die Nukleotidsequenzen der Offenbarung entsprechend ihrer Fähigkeit verwendet werden, Selektiv-Duplexmoleküle mit komplementären Teilen des gesamten cna Gens oder Genfragmente zu bilden. In Abhängigkeit von der vorgesehenen Anwendung wird man wünschen, verschiedene Hybridisierungsbedingungen zu verwenden, um verschiedene Grade der Selektivität der Probe gegen die Zielsequenz zu erreichen. Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, wird man üblicherweise wünschen, relativ stringente Bedingungen zu verwenden, um die Hybride zu bilden, zum Beispiel wird man relativ geringe Salz- und/oder hohe Temperaturbedingungen auswählen, wie zum Beispiel erzielt durch ungefähr 0,02 M bis ungefähr 0,15 M NaCl bei Temperaturen von 50°C bis 70°C. Solche selektiven Bedingungen tolerieren kaum, wenn überhaupt, Mismatches zwischen der Probe und dem Template oder dem Target-Strang, und würden für die Isolierung von CBP-Genen besonders nützlich sein.
Sicherlich sind für einige Anwendungen, zum Beispiel, dort wo man die Herstellung von Mutanten wünscht, durch Verwendung eines mutanten Primerstranges, welcher an ein zugrundeliegendes Template hybridisiert ist, oder wo man die Isolierung CBP-kodierender Sequenzen aus ähnlichen Arten, funktionalen Aquivalenten oder ähnlichem erstrebt, üblicherweise weniger stringente Hybridisierungsbedingungen notwendig, um die Bildung eines Heteroduplex zu ermöglichen. Unter diesen Umständen kann man wünschen, Bedingungen anzuwenden, wie zum Beispiel 0,15 M bis ungefähr 0,9 M Salz, bei Temperaturen sich erstreckend von 20°C bis 55°C. Cross-Hybridisierungsarten können mit Bezug auf Kontroll-Hybridisierungen dadurch leicht als positive Hybridisierungsignale identifiziert werden. Auf jeden Fall wird es allgemein anerkannt, dass die Bedingungen durch die Hinzufügung von ansteigenden Mengen von Formamid noch stringenter gemacht werden können, welches dazu dient, den Hybridduplex in der gleichen Art und Weise wie ansteigende Temperaturen zu destabilisieren. Auf diese Weise können Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden und werden folglich üblicherweise, in Abhängigkeit von dem gewünschten Ergebnis, eine Methode der Wahl sein.
In bestimmten Ausführungsformen wird es zur Ermittlung der Hybridisierung vorteilhaft sein, Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Offenbarung in Kombination mit geeigneten Mitteln zu verwenden, wie zum Beispiel einem Label. Eine große Anzahl von geeigneten Indikatormitteln sind auf dem Fachgebiet bekannt, einschließlich fluoreszierender, radioaktiver, enzymatischer oder anderer Liganden, wie zum Beispiel Avidin/Biotin, welche in der Lage sind, ein detektierbares Signal zu geben. In bevorzugten Ausführungsformen wird man voraussichtlich wünschen, ein fluoreszierendes Label zu verwenden oder ein Enzymtag, wie zum Beispiel Urease, alkaline Phosphatase oder Peroxidase, anstatt von radioaktiven oder anderen die Umwelt betreffend unerwünschte Reagenzien. Im Fall von Enzymtags, sind colorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, welche verwendet werden können, um ein Mittel bereitzustellen, welches für das humane Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um die spezifische Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäure enthaltenden Proben zu identifizieren.
Im Allgemeinen ist es vorgesehen, dass die hierin beschriebenen Hybridisierungsproben sowohl als Reagenzien in Lösungs-Hybridisierungs nützlich sind, als auch in Ausführungsformen, die eine feste Phase verwenden. In Ausführungsformen, die eine feste Phase involvieren, ist die Test-DNA (oder RNA) adsorbiert oder anderweitig auf der ausgewählten Substanz oder Oberfläche fixiert. Diese fixierte, einzelsträngige Nukleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Proben unter gewünschten Bedingungen unterworfen. Die ausgewählten Bedingungen hängen von den jeweiligen Umständen ab, bezogen auf die jeweiligen erforderlichen Kriterien (beruhend auf, zum Beispiel, dem G+C Gehalt, der Art von der Target Nukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungsprobe, etc.). Nach dem Waschen der hybridisierten Oberfläche, um die nicht spezifisch gebundene Probenmoleküle entfernen, wird die spezifische Hybridisierung mit Hilfe von dem Label detektiert, oder auch quantifiziert,.
2.8 Antikörper-Zusammensetzungen
In einer bevorzugten Ausführungsform induziert die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von CBP an ein Lebewesen Antikörper in dem Lebewesen, welche eine vorhandene S. Aureus binden und neutralisieren, dadurch den schädlichen Effekt dieser Mikroorganismen verhindern. Wahlweise bieten Anti-CBP-Epitop-Antikörper, welche in einem ersten Wirts-Lebewesen generiert wurden, welche einem zweiten Lebewesen zur passiven Immunisierung oder Behandlung gegen eine S. Aureus-Infektion verabreicht werden können. Solche Antiköper sind auch nützlich als ein diagnostischer Screen für das Vorhandensein von S. Aureus in einer Testprobe, indem konventionelle Immunoassaytechniken verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung werden neue Nukleinsäuresequenzen offenbart, welche ortsspezifisch modifizierte CBPs von S. Aureus kodieren. Diese synthetischen Varianten werden durch die hierin offenbarten Methoden hergestellt und kodieren CBPs, welche modifizierte Col-Bindungsdomänen haben.
In einigen Aspekten betrifft die vorliegende Erfindung neue Antikörperzusammensetzungen, welche die Col-Bindung an Bakterien inhibieren. Insbesondere wurden Antikörper gegen native und synthetisch modifizierte Epitope von CBPs entwickelt, welche die Col-Bindung an CBPs sowohl in vitro als auch in vivo inhibieren. Insbesondere wurden Proteine, Peptide und Peptid-Epitope hergestellt, um Impfstoffzusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die nützlich sind in der Prävention bakterieller Infektionen und Antikörperzusammensetzungen, die nützlich sind in der Prävention der Col-Bindung an solche Organismen.
In anderen Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Antikörperzusammensetzungen, welche die Col-Bindung an bakterielle Zellen erhöhen. Diese Aspekte stellen Methoden und Zusammensetzungen für die bakterielle Kolonisation eines Wirtslebewesens mit verminderter, oder avirulenten bakteriellen Stämmen, welche Zelloberflächen-CBP-Epitope exprimieren, bereit.
In einem Aspekt offenbart die Erfindung einen Antikörper, der mit einer CBP-Domäne von einem bakteriellen cna-Genprodukt interagiert, und insbesondere einer CBP-Domäne von einem S. Aureus cna-Genprodukt. Solche Antikörper können monoklonal sein, oder bevorzugt polyklonal. In anderen Aspekten offenbart die Erfindung einen Antikörper, welcher die bakterielle Adhesion inhibiert und die Bindung von dem Genprodukt an Col.
Auch ist ein Verfahren für die Detektion eines Bakteriums in einer Probe offenbart, welches ein CBP exprimiert. Das Verfahren umfasst im Allgemeinen die Beschaffung einer Probe, welche verdächtigt wird, ein Bakterium zu enthalten, welches solch ein Protein exprimiert, dann das Kontaktieren der Probe mit einer hierin offenbarten Antikörperzusammensetzung, und der Detektion der Bildung von Immunkomplexen. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Bakterium S. Aureus, S. Dysgalactiae, S. Pyogenes, oder ähnliche Gram-positive Bakterien.
Andere Aspekte der Offenbarung umfassen Verfahren der Inhibition bakterieller Kolonisation, und insbesondere der Kolonisation durch S. Aureus, S. Dysgalactiae, S. Pyogenes, oder einer ähnlichen Art von Gram-positiven Bakterien, in einem Lebewesen, durch Verabreichung eines Antikörpers der vorliegenden Erfindung an das Lebewesen, welcher die Bindung von Col an das CBP, welches durch die Bakterien exprimiert wird, verhindert oder signifikant reduziert. Die Verabreichung der Antikörperzusammensetzung kann prophylaktisch vor und/oder nach der Diagnose einer Infektion oder anderer multisystemischer Erkrankungen erfolgen, welche durch bakterielle Infektion verursacht werden, welche die Haut, Gelenke, Herz und das zentrale Nervensystem einbeziehen. Die Verabreichung kann auch gemäß passiver Immunisierungsprotokolle erfolgen, welche entwickelt worden sind, um die systemische Infektion durch anfällige Pathogene zu verhindern und/oder verbessern, und insbesondere, die Auswirkungen einer Infektion durch pathogene Streptokokken, Staphylokokken und ähnlichen Gram-positiven Bakterien zu verbessern.
2.9 Nukleinsäuresegmente und Vektoren
Die vorliegende Offenbarung umfasst Proteine, welche von Genen exprimiert wurden, die ein CBP kodieren, wie zum Beispiel das Protein, welches von einem DNA Insert eines rekombinanten Klons, umfassend ortsspezifisch modifizierte CBPs von S. Aureus, exprimiert wurde. Auch umfasst sind Stammvarianten von dem cna Gen, welches von S. Aureus abgeleitet ist, welches auch Proteine kodiert, die in der Lage sind, Col zu binden, welches an cna DNAs unter moderaten oder hochstringenden Bedingungen hybridisieren kann, oder welches als Template für die Genamplifikation durch PCR^TM dienen kann, indem Oligonukleotidprimer verwendet werden, die von cna oder cna-abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen abgeleitet sind. Es ist selbstverständlich, dass diese Varianten Gene umfassen, die Codons enthalten, die nicht identisch in der Nukleotidsequenz zu jenen von dem cna-Gen von S. Aureus sind, aber das gleiche kodieren, oder funktionell äquivalente Aminosäuren, wie durch den Fachmann erwartet wird, der die Degeneration des genetischen Codes kennt. Diese Varianten können auch solche Gene umfassen, die dem cna Gen von S. Aureus ähnlich sind, aber Codons haben, die relativ wenige Aminosäuren spezifizieren, die von jenen von dem/den Protein(en) verschieden sind, welche durch S. Aureus kodiert sind, oder ein wenig geringere oder größere Anzahl von diesen Codons. Folglich umfassen solche Sequenzen solche, die zwischen ungefähr 60% und ungefähr 80%; oder noch bevorzugter zwischen ungefähr 81% und ungefähr 90%; oder noch stärker bevorzugt zwischen ungefähr 91% und ungefähr 99%; an Aminosäuren haben, die identisch oder funktional äquivalent sind zu jenen Protein(en), die durch S. Aureus cna kodiert werden.
Es ist auch selbstverständlich, dass Aminosäuresequenzen und Nukleinsäuresequenzen zusätzliche Reste umfassen können, wie zum Beispiel zusätzliche N- oder C-terminale Aminosäuren, oder 5'- oder 3'-Nukleinsäuresequenzen und immer noch sind, wie hierin dargestellt, solange die Sequenzen die oben dargelegten Kriterien erfüllen, einschließlich der Expression eines CBP-Proteins. Diese zusätzlichen Sequenzen können, zum Beispiel, verschiedene transkriptionale Promotoren, Enchancer oder Terminatoren, verschiedene Sekretions-regelnde Leader-Peptide, verschiedene Aminosäuresequenzen, die die posttranslationale Modifikationen regeln, Aminosäuren und Peptide, welche die Isolierung und Reinigung von CBP(s) erleichtern, und ähnlichem umfassen. Selbstverständlich werden Änderungen und Anhänge an diese Sequenz mit Rücksicht auf die Zellart, dem Organismus, oder dem Lebewesen, das für die Expression von CBP(s) gewählt werden wird, gemacht.
2.10 Impfstofformulierung
Es wird erwartet, dass, um eine „immunologisch wirksame Formulierung" zu erhalten, es wünschenswert ist, CBPs einem humanen oder tierischen Lebewesen zu verabreichen, in einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung, umfassend eine immunologisch wirksame Menge von CBPs, gemischt mit anderen Hilfsstoffen, Trägern oder Verdünnungsmitteln, welche die Stimulation der B-Zell- oder T-Zellantworten verbessern oder anderweitig verändern können, oder immunologische inerte Salze, organische Säuren und Basen, Kohlenhydrate und ähnliche, welche einem solchen Gemisch Stabilität verleihen. Immunostimulatorische Hilfsstoffe, oftmals auch als Adjuvantien bezeichnet, können Salze von Aluminium umfassen (oftmals als Alaun bezeichnet), einfache oder komplexe Fettsäuren und Sterolverbindungen, physiologisch verträgliche Öle, polymere Kohlenhydrate, chemisch oder genetisch modifizierte Proteintoxine, und verschiedene korpuskuläre oder emulgierte Kombinationen davon. Für die CBPs oder Peptide in diesen Gemischen oder jeder Variante, wenn mehr als eine vorhanden ist, wird erwartet, ungefähr 0,0001 bis 1,0 Milligramm, oder noch bevorzugter ungefähr 0,001 bis 0,1 Milligramm, oder aber noch bevorzugter weniger als 0,1 Milligramm pro Dosis zu umfassen.
Es ist auch vorgesehen, dass abgeschwächte Organismen konstruiert werden können, um rekombinante CBP-Genprodukte zu exprimieren und ihrerseits Zuführungsmittel für die Erfindung sind. Besonders bevorzugt sind abgeschwächte Bakterienarten, wie zum Beispiel Mycobakterium, und insbesondere M. Bovis, M. Smegmatis, oder BCG. Wahlweise können auch Pox-, Polio-, Adeno-, oder andere Viren, und Bakterien, wie zum Beispiel Salmonella, Shigella, Listeria, Streptokokkus-Arten in Verbindung mit den hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden.
Für die nackte DNA-Technologie, oftmals als genetische Immunisierung bezeichnet, wurde gezeigt, dass sie für den Schutz gegen infektiöse Organismen geeignet ist. Solche DNA-Segmente können in einer Vielfalt von Formen verwendet werden, einschließlich nackter DNA und Plasmid-DNA, und können der Person in einer Vielzahl von Wegen, einschließlich der parenteralen, der mukosalen, und die sogenannten Mikroprojektil-basierenden „Genkanonen" Impfungen verabreicht werden. Die Verwendung von cna-Nukleinsäurezusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in solchen Immunisierungstechniken wird somit als nützliche Impfstrategie gegen Streptokokken und Staphylokokken Infektionen vorgeschlagen.
Es ist durch den Fachmann anerkannt, dass ein optimaler Dosierungsplan einer Impfregimens so viele wie fünf bis sechs, aber bevorzugt drei bis fünf, oder noch bevorzugter ein bis drei Verabreichungen einer Immunisierungseinheit umfassen kann, bei Intervallen von weniger als zwei bis vier Wochen, bis fünf bis zehn Jahre, oder gelegentlich auch längeren Intervallen.
2.11 Rekombinante Wirtszellen und Vektoren
Besondere Aspekte der Offenbarung betreffen die Verwendung von Plasmidvektoren für die Klonierung und Expression der rekombinanten Peptide, und spezieller Peptid-Epitope, umfassend entweder native oder ortsspezifisch mutierte CBP Col-Bindungsstellen-Epitope. Die Generierung von rekombinanten Vektoren, die Transformation von Wirtszellen, und die Expression von rekombinanten Proteinen ist jenen auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt. Prokaryotische Wirte sind für die Expression der Peptidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Ein Beispiel eines bevorzugten prokaryotischen Wirtes ist E. Coli, und insbesondere die E. Coli-Stämme ATCC 69791, BL21(DE3), JM101, XL1-Blue^TM, RR1, LE392, B, χ¹⁷⁷⁶ (ATCC 31537) und W3110 (F^–, λ^–, prototrophisch, ATCC 273325). Wahlweise können andere Enterobakterien, Arten wie zum Beispiel Salmonella Typhimurium und Serratia Marcescens, oder auch andere Gram-negative Wirte, einschließlich verschiedener Pseudomonas-Arten in der rekombinanten Expression der hierin offenbarten genetischen Konstrukte verwendet werden. Wahlweise können Streptokokken und Staphylokokken Arten verwendet werden, um diese Konstrukte zu exprimieren, und insbesondere S. Aureus, S. Pyogenes, und S. Dysgalactiae.
Üblicherweise werden in Verbindung mit diesen Wirten Plasmidvektoren verwendet, welche Replikon und Kontrollsequenzen enthalten, welche abgeleitet sind aus Arten, die mit der Wirts-Zelle kompatibel sind. Gewöhnlich tragen die Vektoren einer Replikationsstelle, als auch Markierungssequenzen, welche in der Lage sind, eine phänotypische Auswahl der transformierten Zellen bereitzustellen. Zum Beispiel kann E. coli üblicherweise durch Verwendung der Vektoren, wie zum Beispiel pBR322 oder irgendeins seiner Derivate (Boliva et al., 1977) transformiert sein. pBR322 enthält Gene für die Ampicillin- und Tetrazyclin-Resistenz und bietet somit ein einfaches Mittel für die Identifikation der transformierten Zellen. pBR322, seine Derivate oder andere mikrobielle Plasmide oder Bakteriophagen können auch Promotoren enthalten, oder so modifiziert sein, Promotoren zu enthalten, welche durch den bakteriellen Organismus für die Expression endogener Proteine verwendet werden kann.
Des Weiteren können Phagenvektoren, solche, die Replicon und Kontrollsequenzen enthalten, die mit dem Wirtsmikroorganismus kompatibel sind, als Transformationsvektoren in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Zum Beispiel, Bakteriophagen, wie zum Beispiel λGEM^TM-11 können in der Herstellung eines rekombinanten Vektors verwendet werden, welcher verwendet werden kann, um empfängliche Wirtszellen zu transformieren, wie zum Beispiel E. coli LE392.
Jene Promotoren, die meist üblich in der rekombinanten DNA-Konstruktion verwendet werden, umfassen die β-Lactamase (Penicillinase) und Laktose Promotorsysteme (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) oder das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al. 1980). Die Verwendung von rekombinanten und nativen mikrobiellen Promotoren ist jenen auf dem Fachgebiert sehr gut bekannt und Details, betreffend ihrer Nukleotidsequenzen und spezifischen Verfahren, sind jedermann zugänglich, die den Fachmann befähigt, einen bestimmten rekombinanten Vektor und Expressionssysteme für den Zweck der Herstellung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zu konstruieren.
Zusätzlich zu der Expression in Prokaryoten können eukaryotische Mikroben, wie zum Beispiel Hefekulturen in Zusammenhang mit den hierin offenbarten Methoden verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae oder bekannt als Bäckerhefe, ist der meist üblich verwendete unter den eukaryotischen Mikroorganismen, obwohl eine Vielzahl von anderen Arten auch für solche eukaryotische Expressionssysteme verwendet werden kann. Für die Expression in Saccharomyces wird zum Beispiel das Plasmid YRp7 üblicherweise verwendet (Stinchcomb et al. 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Dieses Plasmid enthält bereits das trpL-Gene, welches einen Selektionsmarker für einen mutanten Stamm der Hefe bereitstellt, welchem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, zum Beispiel ATCC 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977). Das Vorhandensein einer trpL-Läsion als charakteristisches Merkmal des Genoms der Hefewirtszelle stellt dann wirksame Bedingungen für die Detektion der Transformation durch das Wachsen in der Abwesenheit von Tryptophan her.
Geeignete, fördernde Sequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratekinase (Hitzeman et al., 1980) oder anderer glykolytischer Enzyme (Hess et al., 1968; Holland et al. 1978), wie zum Beispiel Enolase, Glyceraldehyd-3- phosphatedehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofruktokinase, Glucose-6-phophatisomerase, 3-Phophoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephophateisomerase, Phophoglukoseisomerase und Glukokinase. Während der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden auch die Terminationssequenzen, welche mit diesen Genen assoziiert sind, 3' von den gewünschten Sequenzen, die exprimiert werden sollen, in den Expressionsvektor legiert, um diese mit einer Polyadenylierung der mRNA und Termination zu versehen. Andere Promotoren, welche die zusätzlichen Vorteile einer kontrollierten Transkription durch Wachstumsbedingungen haben, sind die Promotorregionen für die Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, der sauren Phosphatase, abbauender Enzyme, welche mit dem Stickstoffmetabolismus verbunden sind, und die oben genannte Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, und Enzyme, welche für die Maltose- und Galaktoseverwertung verantwortlich sind. Jeder Plasmidvektor, welcher einen Hefekompatiblen Promotor, eine Origin of Replication, und eine Terminationssequenz enthält, ist geeignet.
Zusätzlich zu den Mikroorganismen können auch Kulturen von Zellen, die aus multizellulären Organismen abgeleitet sind, als Wirte in der regelmäßigen Anwendung der offenbarten Verfahren verwendet werden. Im Grunde ist eine solche Zellkultur praktikabel ob aus vertebraten oder invertebraten Kulturen. Dennoch war das Interesse an vertebraten Zellen am größten und die Vermehrung von vertebraten Zellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren zu einer routinemäßigen Technik geworden. Beispiele solcher nützlicher WirtsZelllinien sind VERO und HeLa-Zellen, Chinese Hamster Ovary (CHO) Zelllinien und W138, BHK, COS-7, 293 und MDCK-Zelllinien. Expressionsvektoren für solche Zellen umfassen gewöhnlich (wenn notwendig) eine Origin of Replication, einen Promotor, welcher vor den zu exprimierenden Gen lokalisiert ist, zusammen mit jeder notwendigen Ribosomenbindungsstelle, RNA-Splicestellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsbeendigungssequenzen.
Für die Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen über die Expressionsvektoren oftmals durch virales Material erhalten. Zum Beispiel sind üblicherweise verwendete Promotoren abgeleitet aus Polyoma, Adenovirus 2, und am häufigsten Simian Virus 40 (SV40). Die frühen und späten Promotoren von SV40-Viren sind besonders nützlich, da beide einfach als ein Fragment aus dem Virus, welches auch die SV40 virale Origin of Replication enthält (Fiers et al., 1978) erhalten werden. Es können auch kleinere und größere SV40-Fragment verwendet werden, vorausgesetzt, dass dort die annähernd 250 bp Sequenz enthalten ist, die sich von der HindIII-Stelle bis zur Bg/I-Stelle erstreckt, welche in der viralen Origin of Replication lokalisiert sind. Ferner ist es auch möglich, und oft wünschenswert, Promotoren oder Kontrollsequenzen zu verwenden, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz verbunden sind, vorausgesetzt solche Kontrollsequenzen sind kompatibel mit dem System der Wirtszelle.
Die Origin of Replication kann entweder durch die Konstruktion des Vektors mit einer exogenen Origin erhalten werden, wie zum Beispiel erhältlich aus SV40 oder anderen viralen Quellen (zum Beispiel Polyoma, Adeno, VSV, BPV) oder kann durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle erhalten werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert wird, ist letzteres oftmals ausreichend.
Es ist weiterhin selbstverständlich, dass einige der Polypeptide in Mengen unterhalb des Selektionslimits der Coomassie-brilliantblau-Anfärbungsverfahren vorhanden sind, welche üblicherweise in der Analyse von SDS/PAGE-Gel verwendet wird, oder das ihr Vorhandensein durch ein inaktives Polypeptid mit ähnlichem M_r verdeckt wird. Obwohl es in der routinemäßigen Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht notwendig ist, ist es vorgesehen, dass andere Detektionstechniken zweckmäßigerweise zur Visualisierung von bestimmten Polypeptiden von Interesse verwendet werden können. Immunologisch-bezogene Techniken, wie zum Beispiel Western Blots, die enzymatisch-, radioaktiv- oder fluoreszenzmarkierte Antikörper verwenden, wie hierin beschrieben, werden als besonders nützlich in dieser Hinsicht betrachtet. Wahlweise können Peptide der vorliegenden Erfindung durch Verwendung von Antikörpern der vorliegenden Erfindung in Kombination mit zweiten Antikörpern, welche eine Affinität für die ersten Antikörper haben, detektiert werden. Dieser zweite Antikörper kann enzymatisch oder radioaktiv markiert sein, oder wahlweise fluoreszenz oder colloidal-gold markiert sein. Mittel für die Kennzeichnung und Detektion solcher Zwei-schritt sekundärer Antikörpertechniken sind jenen auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt.
3. Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die Abbildungen stellen einen Teil der vorliegenden Beschreibung dar und sind eingefügt, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung unterstützend zu zeigen. Die Erfindung kann durch Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Abbildungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung der hierin dargestellten spezifischen Ausführungsformen besser verstanden werden.
1 Ein Faltungsdiagramm von CBD(169–318). Die Pfeile stellen Stränge von β-Faltblättern dar, die Zylinder stellen α-Helices dar. Stränge A, B, H, D und E bilden β-Faltblatt I. Die Stränge F, G, C, I und J formen β-Faltblätter II.
2 Zwei Ansichten der Col-Bindungsdomäne CBD(169–318), dargestellt als Bänderdiagramm der Sekundärstruktur. Die Stränge von β-Faltblättern sind in grün, Helices in blau, Loops und Turns in gold. Stränge A, B, H, D und E bilden β-Faltblatt I, Stränge F, G, C, I und J bilden β-Faltblätter II. N kennzeichnet den Aminoterminus, C kennzeichnet den Carboxyterminus.
3A. Connolly's Molekularoberfläche der Col-Bindungsdomäne zeigend die Furche in dem β-Faltblatt I. Die Reste, welche die Furche abgrenzen und seine „Wände" bilden, sind in Gelb markiert. Andere relevante Reste sind in Magenta markiert. Die Textur hebt den Oberflächenbereich der Reste innerhalb von 6 Å aus Col-Proben hervor.
3B. Ein Modell von gebundenem Col, basierend auf einer Andoc-Suche. Der gleiche Blick wie in 12A mit der Col-Triple-Helix in gold; nur Hauptketten sind gezeigt.
4 Ein Stereoblick der Col-Bindungsstelle in dem β-Faltblatt I. Reste mit einem hohen veränderlichen Effekt auf die Col-Bindung sind in Magenta. Reste mit einem moderaten oder gar keinem Effekt sind in gelb. Einige andere Reste sind nur für die Klarheit in cyan gezeigt.
4. Beschreibung der erläuternden Ausführungsformen
Die hierin beschriebene Technologie wird verwendet, um Verfahren und Zusammensetzungen zu entwickeln, die spezifisch mit der bakteriellen Adhäsion und der anschließenden Kolonisation des Wirtsgewebes interferieren, auf diese Weise zu einer Prävention einer Infektion führen, und der Prävention von Erkrankungen, welche durch Bakterien verursacht werden, welche CBPs auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Die Technologie ist breit anwendbar, hat das Potential, die Effektivität von Antibiotika-Therapien in vielen Situationen zu erhöhen und ersetzt die Antibiotika-Therapie in einer Vielzahl von anderen Anwendungen. Es wird erwartet, dass die Technologie besonders effektiv in Behandlungsprotokollen für Staphylokokken- und Streptokokkeninfektionen ist, und eine kosteneffektive Prophylaxe für die Prävention von ähnlichen Erkrankungen. Die Aufklärung der Kristallstruktur des CBPs durch die Erfinder stellt einen ganz erheblichen Vorteil auf dem medizinischen Fachgebiet dar, und insbesondere auf dem Gebiet der Diagnose und Behandlung infektiöser Erkrankungen durch die Bereitstellung von entscheidenden Informationen, die für die Identifikation von Zusammensetzungen notwendig sind, welche mit der Bindung des Cols an CPBs interferieren, oder diese vollständig blockieren. Solche Inhibitoren sind daher in der Prävention der bakteriellen Adhäsion an Col-enthaltende Substanzen nützlich. Die Erfinder haben die Ligandenbindungsstelle in dem S. aureus CBP identifiziert und ein 25-Aminosäurepeptid wurde charakterisiert, welches direkt die Bindung von S. aureus an ¹²⁵I-markiertes Typ II Col inhibiert. Weiterhin zeigte eine zielgerichtete Mutagenese von dem CBP zwei spezifische Reste, welche für die Ligandenbindungsaktivität entscheidend sind. Die Erfindung hat zum ersten Mal neue Zusammensetzungen für die Verwendung in Methoden bereit gestellt, um Inhibitoren der Interaktion zwischen Col und dem CBP sowohl in vitro als auch in vivo zu identifizieren.
4.1 Die Rolle von CBP als Virulenzfaktor
Um die Bedeutung des Col-Adhesins (Adhäsionen?) als Virulenzfaktor in der Staphylokokken-induzierten septischen Arthritis zu bestimmen, sind zwei Gruppen von Mutanten konstruiert worden. In der ersten Gruppe der Mutanten wurde das isolierte Col-Adhesin-Gen, cna, in einem klinischen Isolat von S. aureus, welches aus einem Patienten mit Osteomyelitis erhalten wurde, inaktiviert. In dem zweiten Typ von Mutante wurde das aktive cna-Gen in einen S. aureus-Stamm eingefügt, dem das Gen fehlte.
Die Virulenz der zwei Gruppen der S. aureus Mutanten wurde mit ihren jeweiligen Vorgängerstämmen verglichen, indem ein neu entwickeltes und charakterisiertes Mäusemodell einer septischen Arthritis verwendet wurde (Bremell et al., 1991). In diesem Modell zeigen die Mäuse histopatholgoische Anzeichen einer Arthritis, welche den Höhepunkt mit Hinblick sowohl auf die Intensität als auch der Ausbreitung der Arthritis nach ungefähr 2–3 Wochen post-Injektion erreichen, danach abnehmend. Die klinisch beurteilten Anzeichen der Arthritis korrelieren eng mit der histopathologischen Beurteilung (Bremell et al., 1992). Schwanzläsionen, mit eindringenden entzündlichen Zellen und der Zerstörung vom Diskus und des Knochengewebes, was innerhalb von 4 Wochen nach der Inokulation in ungefähr 50% der Mäuse stattfindet. Weiterhin zeigen die arthritischen Mäuse oftmals eine gewaltige IL-6-angetriebene polyklonale B-Zellaktivierung (Bremell et al., 1992).
Die Ergebnisse zeigten, dass die Mäuse, welchen intravenös S. aureus-Stämme injiziert wurde, welche des Col-Adhesin exprimieren, mit höherer Wahrscheinlichkeit Arthritis entwickelten, verglichen mit Mäusen, denen die S. aureus-mutanten Stämme injiziiert wurden. Darüber hinaus waren die Serumlevel von IgG1 und IL-6 dramatisch in Mäusen erhöht, denen das CNA⁺ klinische Isolat injiziert worden ist, verglichen mit Mäusen, denen die CNA-Mutante oder Saline injiziert worden war (Patti et al. 1994). Zusammen genommen zeigen diese Daten, dass das Col-Adhesin ein wichtiger Virulenzfaktor in der durch Staphylokokken induzierten septischen Arthritis ist.
4.2 MSCRAMMs
Die bakterielle Anheflung an Wirtsgewebe ist mit spezifischen mikrobiellen Oberflächenadhesinen verknüpft, von denen einer Subfamilie, genannt MSCRAMMs (Patti et al., 1994; Patti und Hook, 1994) spezifisch ECM-Komponenten erkennt. Für viele pathogene Bakterien ist gezeigt worden, spezifisch verschiedene Komponenten der ECM in einer Interaktion zu erkennen und zu binden, welche scheinbar, einen Kolonisationsmechnismus des Wirtsgewebes darstellen.
MSCRAMMs (auf der bakteriellen Zelloberfläche) und Liganden (innerhalb des Wirtsgewebes) sind Moleküle, die in einer Art und Weise von Schlüssel-und-Schloss interagieren, mit der Folge der Anheftung von Bakterien an den Wirt. Vollständige Blockierung der mikrobiellen Adhäsion ist nicht erforderlich, um eine Infektion vorzubeugen. Es ist nur notwendig, dass bakterielle Inokulum unterhalb einer kritischen Masse zu halten. Einige Strategien sind entwickelt worden, welche vor allem in der Bekämpfung bakterieller Infektionen nützlich waren, wie zum Beispiel Infektionen durch Streptokokken und Staphylokokken Arten, durch Verhinderung der bakteriellen Adhäsion an Col-Substrate, einschließlich der ECM von empfänglichen Wirtszellen. Solche Strategien sind als nützlich in der Diagnose, Behandlung und Prophylaxe solcher Infektionen vorgesehen.
4.3 Extrazelluläre Matrix
Die ECM enthält eine Vielzahl von Glykoproteinen und Proteoglykanen, welche durch inter- und intramolekulare Wechselwirkung unlösliche Grundsubstanzen bilden. Die ECM hat in den Geweben eine strukturelle Funktion, aber beeinflusst auch die zelluläre Physiologie des Organismus. Vielleicht stehen die am besten charakterisierten biologischen Funktionen der ECM zu seiner Fähigkeit in Beziehung, als ein Substrat für die Adhäsion von Wirtsgewebezellen zu dienen. Dieser Prozeß involviert die Integrine, eine Familie von heterodimären (α/β) Zelloberflächenrezeptoren, welche spezifische Strukturen in vielen von den ECM-Proteinen erkennen. Es ist eindeutig, dass viele der Bakterien auch den Vorteil der ECM als Substrat für die Adhäsion nutzen. Wie die meisten eukaryotischen Gewebezellen haben auch viele Bakterien etliche parallele Adhäsionsmechanismen entwickelt und diese offensichtliche Redundanz mag die Wichtigkeit der Adhärenz an Wirtsgewebe für den Erfolg der Bakterien widerspiegeln.
Die Adhärenz von Mikroben an verschiedene Zelloberflächen und ECM-Komponenten wurde weithin berichtet (Abraham et al., 1983, Coburn et al., 1993; Fröman et al. 1984; Isaacs, 1994; Maxe et al., 1986; Van Nhieu und Isber, 1993). Die vorliegende Erfindung hat ein neues bakterielles MSCRAMM identifiziert, welches die bakterielle Adhäsion an Col und anderer Proteoglkane fördert, welche zu Col strukturell ähnlich sind, welche im Zusammenhang mit ECM-Komponenten gefunden worden sind, wie zum Beispiel Col.
4.4 Kollagen
Kollagene Proteine sind die Hauptbestandteile der ECM (Bornstein und Sage, 1980). Die meisten Cols werden intrazellulär als Vorläufermoleküle synthetisiert und sind einer beträchtlichen posttranslationalen Bearbeitung vor der Sekretion und Einfügung in die ECM oder anderen Col-reichen Geweben, wie zum Beispiel Knorpel (Ramachandran und Reddi, 1976) ausgesetzt. Bis heute wurden über 18 Arten von Cols bestimmt und sie sind lose in fünf Gruppen kategorisiert (Vanderrest und Garrone, 1991). Diese Gruppen sind:

1) Col-Typen I, II, III, V und XI, welche sich an Quarter-Stagger-Fibrilen beteiligen;
2) Col-Typen XII, XIV und IX, welche Fibrilen-assoziiert sind mit unterbrochenen Dreifach-Helices;
3) Col-Typen IV, VIII und X, welche Blätter formen;
4) Col-Typ VI, welche perlenschnurartige Filamente formen; und
5) Col-Typ VII, welche verankernde Fibrilen formen.

Das Col-Netzwerk in der Haut ist hauptsächlich aus den Col-Typen I und Typ III zusammengesetzt. Col kann die Aktivität des Transforming Growth Factor Beta (TGF-β) inhibieren (Yamaguchi et al., 1990) und die Komplementkomponente Clq inaktivieren (Krumdieck et al., 1992) und es wurde vorgeschlagen, das es als ein anti-inflammatorisches Agens zwischen diesen Interaktionen zu agieren.
4.5 CNA-kodierende Nukleinsäuresegmente
Wie hierin verwendet, wird der Begriff „CBP-Gen" verwendet, um auf ein cna-Gen zu verweisen, oder eine DNA-kodierende Region, die ein Protein, Polypeptid oder Peptid kodiert, welches in der Lage ist, Col zu binden, oder eine ähnliche ECM-Komponente.
Die Definition von einem „CBP-Gen", wie hierin verwendet, ist ein Gen, das unter relativ stringenten Hybridisierungsbedingungen (siehe auch zum Beispiel Maniatis et al., 1982) an DNA-Sequenzen hybridisiert, derzeit bekannt dafür, CBP-kodierende Gensequenzen zu umfassen.
Es wird sicherlich verstanden, dass eins, oder mehr als eins, für CBP kodierende Gene oder Peptide in den Verfahren und den Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden können. Die hierin offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren können die Verabreichung von ein, zwei, drei, oder mehreren Genen oder Gensegmenten bedingen. Die maximale Anzahl von Genen, die verwendet werden können, ist nur durch praktische Erwägungen begrenzt, wie zum Beispiel der benötigte Aufwand der simultanen Vorbereitung einer großen Anzahl von Genkonstrukten oder auch der Möglichkeit der Hervorrufung einer signifikanten nachteiligen zytotoxischen Wirkung.
Bei der Verwendung mehrerer Gene können diese auf einem einzelnen genetischen Konstrukt unter der Kontrolle von einem oder mehrerer Promotoren kombiniert werden, oder sie können als separate Konstrukte des gleichen oder verschiedener Typen hergestellt werden. Auf diese Weise kann eine nahezu endlose Kombination verschiedener Gene und genetischer Konstrukte verwendet werden. Bestimmte Genkombinationen können entwickelt sein um, oder deren Verwendung kann andererseits resultieren in der Erreichung synergetischer Effekte auf die Bildung einer Immunantwort, oder der Entwicklung von Antikörpern gegen Genprodukte, kodiert durch solche Nukleinsäuresegmente, oder der Herstellung diagnostischer Behandlungsprotokolle für Streptokokken oder Staphylokokken Infektionen, und insbesondere der Infektion mit S. Aureus, S. Dysgalactiae und S. Pyogenes. Jede und alle solcher Kombinationen sind vorgesehen, innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung zu fallen. In der Tat sind in der wissenschaftlichen Literatur viele synergetische Effekte beschrieben worden, so dass ein gewöhnlicher Fachmann leicht in der Lage ist, voraussichtlich synergistische Genkombinationen, oder überhaupt Gen-Proteinkombinationen zu identifizieren.
Es ist auch selbstverständlich, dass, wenn erwünscht, das Nukleinsegment oder Gen in Kombination mit weiteren Wirkstoffen verabreicht werden kann, wie beispielsweise Proteine oder Polypeptide oder verschiedenen pharmazeutischen aktiven Wirkstoffen. Solange genetisches Material einen Teil der Zusammensetzung bildet, gibt es so gut wie keine Beschränkung für andere Komponenten, welche eingefügt werden könne, vorausgesetzt, dass die zusätzlichen Wirkstoffe keine signifikanten nachteiligen Effekte auf den Kontakt mit den Zielzellen oder Geweben hervorrufen.
4.6 Therapeutische und diagnostische Kits, umfassend CBP-Zusammensetzungen
Therapeutische Kits, umfassend, in einem geeigneten Behältermittel, eine CBP-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer pharmazeutisch verträglichen Formulierung, stellen einen anderen Aspekt der Erfindung dar. Die CBP-Zusammensetzung kann aus natives CBP, verkürztes CBP, ortsspezifisch mutiertes CBP, oder CBP-kodierende Peptid-Epitope, oder wahlweise Antikörper, welche natives CBP, verkürztes CBP, ortsspezifisch mutiertes CBP, oder CBP-kodierte Peptid-Epitope binden, bestehen. In anderen Ausführungsformen kann die Zusammensetzung aus Nukleinsäuresegmente bestehen, welche für natives CBP, verkürztes CBP, ortsspezifisch mutiertes CBP, oder CBP-kodierte Peptid-Epitope kodieren. Solche Nukleinsäuresegmente können DNA oder RNA sein, oder können entweder nativ, rekombinant oder mutagenisierte Nukleinsäuresegmente sein.
Die Kits können ein einzelnes Behältermittel umfassen, welches die CBP-Zusammensetzung enthält. Die Behältermittel können, wenn erwünscht, pharmazeutisch verträgliche sterile Hilfsstoffe enthalten, welche hiermit im Zusammenhang stehen, die CBP-Zusammensetzung und, wahlweise, eine detektierbare Kennzeichnung oder ein Imaging Mittel. Die Containermittel ihrerseits können eine Spritze, eine Pipette, oder andere ähnliche Vorrichtungen sein, aus welchen die CBP-Zusammensetzung in die Gewebestelle, der Hautlesion, dem Wundgebiet oder anderen Stellen der bakteriellen Infektion verabreicht werden kann. Wie auch immer, das einzelne Behältermittel kann ein trocknes oder lyophilisiertes Gemisch einer CBP-Zusammensetzung enthalten, welche eine Vorbenetzung vor der Verwendung erfordern kann oder nicht erfordern kann.
Wahlweise können die Kits der Erfindung verschiedene Behältermittel für jede Komponente umfassen. In solchen Fällen würde ein Container die CBP-Zusammensetzung enthalten, entweder als steriles Protein, RNA- oder DNA-Lösung oder in einer lyophilisierten Form, und der andere Container würde den Träger beinhalten, welcher seinerseits fest oder nicht fest sein kann oder in einer sterilen Lösung, oder in einer Gelatinartigen, liquiden oder anderen Form.
Die Kits können auch ein zweites oder drittes Behältermittel für die Aufnahme eines sterilen, pharmazeutisch verträglichen Puffers, Verdünnungsmittel oder Lösemittel umfassen. Solch eine Lösung kann erforderlich sein, um die CBP-Komponente in einer noch geeigneteren Form für die Verabreichung in den Körper zu formulieren, zum Beispiel als eine topische Zubereitung, oder wahlweise in oraler, parentaler oder intravenöser Form. Es sollte dennoch erwähnt werden, dass alle Komponenten von einem Kit in einer trockenen Form (lyophilisiert) bereitgestellt werden können, was ein „Benetzen" bei Kontakt mit Körperflüssigkeit ermöglichen würde. Somit ist das Vorhandensein irgendeines Typs von pharmazeutisch verträglichen Puffern oder Lösemittel keine Voraussetzung für die Kits der Erfindung. Die Kits können auch ein zweites oder drittes Behältermittel für die Aufnahme eines pharmazeutisch verträglichen detektierbaren Imaging Mittels oder Zusammensetzung umfassen.
Das Behältermittel wird üblicherweise ein Container sein, wie zum Beispiel ein Fläschchen, ein Proberöhrchen, ein Behälter, eine Flasche, eine Spritze oder andere Behältermittel, in welche die Komponenten des Kits plaziert werden können. Die Komponenten können auch in kleinere Container aliquotiert werden, sollte dieses erwünscht sein. Die Kits der vorliegenden Erfindung können auch ein Mittel für das Beinhalten der einzelnen Behälter für den gründlichen Verschluß, für den kommerziellen Verkauf umfassen, wie beispielsweise Injektion oder geblasene Plastikcontainer, in welchen die gewünschten Fläschchen und Spritzen aufbewahrt werden können.
Unabhängig von der Anzahl der Behälter können die Kits der Erfindung auch ein Mittel für das Einbringen der CBP-Zusammensetzung in den Körper des Lebewesens umfassen, oder damit verpackt sein. Solch ein Mittel kann einer Spritze, eine Pipette, Zangen, oder jede solcher medizinisch zugelassener Zuführungsvehikel sein.
4.7 Affinitätschromatographie
Die Affinitätschromatographie basiert im Allgemeinen auf der Erkennung eines Proteins durch eine Substanz, wie zum Beispiel einem Liganden oder einem Antikörper. Das Säulenmaterial kann künstlich durch die kovalente Bindung eines Bindungsmoleküls hergestellt werden, wie zum Beispiel ein aktivierter Farbstoff beispielsweise an eine unlösliche Grundsubstanz. Dem Säulenmaterial wird dann ermöglicht, an die gewünschte Substanz aus einer Lösung zu adsorbieren. Als nächstes werden die Bedingungen zu jenen Bedingungen verändert, unter welchen eine Bindung nicht stattfindet und das Substrat eluiert wird. Die Voraussetzungen für eine erfolgreiche Affinitätschromatographie sind:

1) dass die Matrix spezifisch die Moleküle von Interesse adsorbiert;
2) dass andere Konterminanten unadsorbiert bleiben;
3) dass der Ligand gebunden werden muss, ohne seine Bindungsaktivität zu ändern;
4) dass der Ligand ausreichend fest an die Matrix bindet; und
5) dass es möglich ist, die Moleküle von Interesse zu eluieren, ohne sie zu zerstören.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Affinitätschromatographieverfahren für die Reinigung von Antikörpern aus Lösungen, wobei die Matrix CBPs oder Peptid-Epitope, abgeleitet aus CBPs, umfasst, welche kovalent an Sepharose CL6B oder CL4B gebunden sind. Diese Matrix bindet die Antikörper der vorliegenden Erfindung direkt und ermöglicht ihre Trennung durch Eluierung durch einen geeigneten Gradienten, wie zum Beispiel Salz, GuHCl, pH oder Harnstoff. Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Affinitätschromatographieverfahren für die Reinigung von CBPs und Peptid-Epitopen aus einer Lösung. In diesem Fall kann die Matrix ein Antikörper sein, welcher spezifisch für CBP ist, oder wahlweise eine Zusammensetzung, welche Affinität für CBPs hat. Die Aminosäurezusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden somit direkt gebunden, dies ermöglicht ihre anschließende Reinigung durch Eluierung von der Säule mit einem geeigneten Puffer, wie oben beschrieben.
4.8 Verfahren der Nukleinsäurezuführung und DNA-Transfektion
In einigen Ausführungsformen ist es vorgesehen, dass die hierin offenbarten Nukleinsäuresegment verwendet werden, um geeignete Wirtszellen zu transfizieren. Die Methode für die Einführung von DNA in Zellen ist jenen auf dem Fachgebiet wohl bekannt. Vier übliche Verfahren für die Zufuhr eines Nukleinsegmentes in Zellen sind beschrieben worden:

(1) chemische Methoden (Graham und VanDerEb, 1973);
(2) physikalische Methoden, wie zum Beispiel Mikroinjektion (Capecchi, 1980), Elektroporation (Wong und Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) und die Genkanone (Yang et al., 1990);
(3) virale Vektoren (Clapp, 1993; Eglitis und Anderson, 1988); und
(4) Rezeptor-vermittelte Mechanismen (Curiel et al., 1991; Wagner et al., 1992).

4.9 Liposomen und Nanokapseln
Auch ist die Verwendung von Liposomen und/oder Nanokapseln für die Einführung der jeweiligen Peptide oder Nukleinsäuresegmente in die Wirtszellen offenbart. Insbesondere können die Malonyltyrosyl- und Phosphotyrosyl-Peptide der vorliegenden Erfindung für die Zufuhr in einer Lösung mit DMSO oder in Liposomen eingekapselt formuliert werden.
Solche Formulierungen können für die Einführung einer pharmazeutisch verträglichen Formulierung der hierin offenbarten Nukleinsäuren, Peptide und/oder Antikörper bevorzugt sein. Die Zusammensetzung und Verwendung von Liposomen ist im Allgemeinen jenen auf dem Fachgebiet bekannt (siehe zum Beispiel Couvreur et al., 1977; 1988 welcher die Verwendung von Liposomen und Nanokapslen in der gezielten Antibiotikatherapie von intrazellulären bakteriellen Infektionen und Erkrankungen beschreibt). In letzter Zeit wurden Liposomen mit verbesserter Serumstabilität und Zirkulationshalbzeit entwickelt (Gabizon und Papahadjopoulos, 1988; Allen und Choun, 1987).
Liposomen sind bei einer Vielzahl von Zelltypen, die normalerweise gegenüber einer Transfektion durch andere Verfahren resistent sind, verwendet worden, einschließlich T- Zellsuspensionen, primäre Hepatozytenkulturen und PC 12-Zellen (Muller et al., 1990). Darüber hinaus sind Liposomen frei von DNA-Längenbeschränkungen, die typisch sind für auf Viren basierende Zuführungssysteme. Liposomen sind wirksam verwendet worden, um Gene, Arzneistoffe (Heath und Martin, 1986; Heath et al., 1986; Balazsovits et al., 1989), radiotherapeutische Mittel (Pikul et al., 1987), Enzyme (Imaizumi et al., 1990a; 1990b), Viren (Faller und Baltimore, 1984), Transkriptionsfaktoren und allosterische Effektoren (Nicolau und Gersonde, 1979) in eine Vielzahl von kultivierten Zelllinien und Lebewesen einzuführen. Darüber hinaus sind etliche erfolgreiche klinische Studien abgeschlossen worden, die die Wirksamkeit von Liposomen-mediierter Arzneizufuhr untersuchen (Lopez-Berestein et al., 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier et al., 1988). Des Weiteren schlagen etliche Studien vor, dass die Verwendung von Liposomen nicht mit einer Autoimmunantwort, Toxizität oder einer Lokalisation in den Gonaden nach einer systemischen Zufuhr verbunden ist (Mori und Fukatsu, 1992).
Liposomen werden aus Phospholipiden gebildet, die in einem wässrigen Medium dispergiert sind und spontan multilamellare konzentrische Doppelschicht-Vesikel bilden (auch multilamellare Vesikel genannt (MLVs). MLVs haben im Allgemeinen einen Durchmesser von 25 nm bis 4 μm. Die Beschallung von MLVs führt zu einer Bildung von kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs) mit einem Durchmesser in dem Bereich von 200 bis 500 Å, in ihrem Kern eine wässrige Lösung enthaltend.
Liposomen weisen viele Ähnlichkeiten mit zellulären Membranen auf und sind für die Verwendung in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als Träger für die Peptidzusammensetzungen vorgesehen. Sie sind weitgehend geeignet, da sowohl wasser- als auch lipidlösliche Substanzen verpackt werden können, d.h. jeweils in den wässrigen Zwischenräumen und innerhalb der Doppelschicht selbst. Es ist möglich, dass die Arzneimittel enthaltenden Liposomen auch für die ortsspezifische Zufuhr von aktiven Mitteln durch selektive Modifikation der liposomalen Formulierung verwendet werden können.
Zusätzlich zu den Lehren von Couvreur et al. (1977; 1988) können die folgenden Informationen für die Herstellung liposomaler Formulierungen verwendet werden. Phospholipide können eine Vielzahl von anderen Strukturen als Liposomen bilden, wenn sie in Wasser dispergiert sind, in Abhängigkeit von dem molaren Verhältnis von Lipid zu Wasser. Ist das Verhältnis klein, ist das Liposom die bevorzugte Struktur. Die physikalischen Charakteristika von Liposomen hängen vom pH, der Ionenstärke und dem Vorhandensein von zweiwertigen Cationen ab. Liposomen können für ionische und polare Substanzen eine geringe Durchlässigkeit aufweisen, aber unterliegen bei erhöhten Temperaturen einem Phasenübergang, welcher ihre Permeabilität merklich verändert. Der Phasenübergang involviert eine Änderung von einer dicht gepackten, geordneten Struktur, bekannt als Gel-Zustand, zu einer locker gepackten, weniger geordneten Struktur, bekannt als Fluid-Zustand. Dieses ist bei einer charakteristischen Phasenübergangstemperatur zu beobachten und resultiert in einer Erhöhung der Permeabilität für Ionen, Zucker und Arzneimitteln.
Zusätzlich zu der Temperatur kann die Einwirkung von Proteinen die Permeabilität von Liposomen verändern. Bestimmte lösliche Proteine, wie zum Beispiel Cytochrom C, binden, deformieren und penetrieren die Doppelschicht, dadurch werden die Änderungen in der Permeabilität bewirkt. Cholesterin inhibiert diese Penetration der Proteine, scheinbar durch das noch straffere Packen der Phospholipide. Es ist vorgesehen, dass die meisten nützlichen Liposomen Zusammensetzungen für die Zufuhr von Antibiotika und Inhibitoren Cholesterin umfassen.
Die Fähigkeit, gelöste Substanzen einzuschließen variiert zwischen verschiedenen Typen von Liposomen. Zum Beispiel sind MLVs beim Einschluß von gelösten Stoffen moderat wirksam, aber SUVs sind außerordentlich unwirksam. SUVs bieten dennoch den Vorteil von Homogenität und Reproduzierbarkeit in der Größenverteilung, und ein Kompromiß zwischen Größe und Einschlußeffizienz wird durch große unilamellare Vesikel (LUVs) geboten. Diese werden durch Ether Evaporation hergestellt und sind drei bis vier Mal effizienter in dem Einschluß von gelösten Stoffen als MLVs.
Zusätzlich zu den Liposomencharakteristika sind beim Einschluß von Verbindungen die physiko-chemikalischen Eigenschaften der Substanz selber ein wichtiger bestimmender Faktor. Polare Verbindungen werden in den wässrigen Räumen eingeschlossen und nicht polare Verbindungen binden an die Lipiddoppelschicht der Vesikel. Polare Verbindungen werden durch Permeation freigelassen, oder wenn die Doppelschicht gebrochen wird, aber nicht polare Bindungen verbleiben an die Doppelschicht angeschlossen, es sei denn, sie ist durch die Temperatur oder der Einwirkung von Lipoproteinen zerstört. Beide Typen zeigen bei der Phasenübergangstemperatur maximale Ausflussraten.
Liposomen wechselwirken mit den Zellen via vier verschiedenen Mechanismen: Endocytose durch phagocytierende Zellen des reticuloendothelialen Systems, wie zum Beispiel Makrophagen und Neutrophile; Adsorption an die Zelloberfläche, entweder durch nicht spezifische schwache hydrophobe oder elektrostatische Kräfte, oder durch spezifische Interaktionen mit Zelloberflächenkomponenten; Fusion mit der Plasmazellmembran durch Insertion der Lipiddoppelschicht des Liposoms in die Plasmamembran, mit gleichzeitiger Freisetzung des liposomalen Inhalts in das Cytoplasma; und durch Transfer von liposomalen Lipiden zu zellulären oder subzellulären Membranen, oder vice versa, ohne jede Verbindung des liposomalen Inhalts. Es ist oft schwierig zu bestimmen, welcher Mechanismus wirksam ist und mehr als einer kann zur gleichen Zeit wirksam sein.
Das Schicksal und der Verbleib von intravenös injiziertem Liposomen hängen von ihren physikalischen Eigenschaften ab, wie zum Beispiel Größe, der Fluidität und Oberflächenladungen. Sie können für Stunden oder Tage in Geweben verbleiben, in Abhängigkeit von ihrer Zusammensetzung, die Halbzeiten im Blut variieren von Minuten bis mehreren Stunden. Größere Liposomen, wie zum Beispiel MLVs und LUVs, werden schnell durch phagocytierende Zellen des reticuloendothelialen Systems aufgenommen, aber die Physiologie des zirkulatorischen Systems hält den Austritt solcher großen Arten an den meisten Stellen zurück. Sie können lediglich an Stellen austreten, wo große Öffnungen oder Poren in den Kapillaren des Endotheliums bestehen, wie zum Beispiel der Sinusoide der Leber oder der Milz. Auf diese Weise sind diese Organe die vorherrschenden Stellen der Aufnahme. Auf der anderen Seite zeigen SUVs eine breitere Gewebeverteilung, aber nach wie vor werden sie stark in der Leber und der Milz abgesondert. Im Allgemeinen schränkt dieses in vivo-Verhalten das potentielle Targeting von Liposomen in nur jene Organe und Gewebe, die für die Größe zugänglich sind, ein. Diese umfassen Blut, Leber, Milz, Knochenmark und die lymphoiden Organe.
Targeting ist im allgemeinen keine Beschränkung im Hinblick auf die vorliegende Erfindung. Dennoch sollte spezielles Targeting erwünscht sein, sind Verfahren für dieses verfügbar, um durchgeführt zu werden. Antikörper können verwendet werden, um an die Liposomenoberfläche zu binden und den Antikörper und seinen Arzneimittelinhalt auf spezifische antigene Rezeptoren, welche auf bestimmten Zelloberflächen lokalisiert sind, auszurichten. Kohlenhydratfaktoren (Glykoprotein oder Glykolipidzelloberflächenkomponenten, welche eine Rolle in der Zell-Zell-Erkennung spielen, Interaktion und Adhesion) können auch als Erkennungsstellen verwendet werden, da sie das Potential haben, die Liposomen auf bestimmte Zelltypen auszurichten. Meistens ist es vorgesehen, dass die intravenöse Injektionen des liposomalen Präparats zum Einsatz gelangen würde, aber andere Arten der Verabreichung sind auch denkbar.
Wahlweise sieht die Erfindung pharmazeutisch verträgliche Nanokapselzubereitungen der Peptide der vorliegenden Erfindung vor. Nanokapseln können im Allgemeinen Verbindungen in einer stabilen und reproduzierbaren Art einschließen (Henry-Michelland et al., 1987). Um Nebenwirkungen aufgrund intrazellulärer polymerer Überlastung zu vermeiden, sollten solche ultrafeinen Partikel (ungefähr 0, 1μm groß) so gestaltet werden, indem Polymere, die in vivo abgebaut werden können, verwendet werden. Bioabbaubare Polyalkylcyanoacrylat Nanopartikel, die diese Voraussetzungen erfüllen, sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung vorgesehen und solche Partikel können leicht gemacht werden, wie beschrieben worden ist (Couvreur et al., 1984; 1988).
4.10 Verfahren für die Herstellung von Antikörperzusammensetzungen
In einem noch anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung einen Antikörper vor, der immunoreaktiv mit einem Polypeptid der Erfindung ist. Wie oben angegeben, ist eine der Verwendungen für CBPs und CBP-abgeleitete epitopische Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung Antikörper zu generieren. Der Verweis auf Antikörper innerhalb der Beschreibung umfasst die gesamten polyklonalen und monoklonalen Antikörper (mAbs), und Teile davon, entweder allein oder mit anderen Teilen konjugiert. Antikörperteile umfassen Fab und F(ab)₂-Fragmente und einzelkettige Antikörper. Die Antikörper können in vivo in geeigneten Laborlebewesen durch Immunisierung des Donors (bevorzugt Menschen) oder in vitro durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein polyklonaler Antikörper. Mittel für die Herstellung und Charakterisierung der Antikörper sind auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt (siehe zum Beispiel Harlow und Lane, 1988).
In Kürze, ein polyklonaler Antikörper wird durch Immunisierung eines Lebewesens mit einem Immunogen hergestellt, umfassend ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung und das Sammeln der Antiseren aus dem immunisierten Lebewesen. Eine große Auswahl von Lebewesenspezien kann für die Herstellung von Antiseren verwendet werden. Üblicherweise ist ein für die Herstellung von Antiseren verwendetes Lebewesen ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, eine Ziege, oder ein Meerschweinchen. Aufgrund des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen, ist ein Kaninchen die bevorzugte Auswahl für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern.
Antikörper, sowohl polyklonale als auch monoklonale, welche spezifisch sind für CBP und CBP-abgeleiteten Epitopen, können hergestellt werden, indem herkömmliche Immunisierungstechniken verwendet werden, wie im allgemeinen jenen auf dem Fachgebiet bekannt sein wird. Eine Zusammensetzung, umfassend antigene Epitope bestimmter CBPs kann verwendet werden, um eine oder mehrere Versuchstiere zu immunisieren, wie zum Beispiel ein Kaninchen oder eine Maus, welche dann fortfahren, spezifische Antikörper gegen CBP-Peptide herzustellen. Polyklonale Antiseren können nach der Einräumung von Zeit für die Antikörperherstellung, einfach durch Blutung des Lebewesens und Herstellung von Serumproben aus dem gesamten Blut erhalten werden.
Die in der Herstellung von polyklonalen Antikörpern verwendete Menge von immunogenen Zusammensetzungen variiert in Abhängigkeit von der Natur des Immunogens, als auch des für die Immunisierung verwendeten Tieres. Eine Vielzahl von Routen kann verwendet werden, um das Immunogen zu verabreichen (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös, und intraperitoneal). Die Herstellung von polyklonalen Antikörpern kann durch das Entnehmen von Blut des immunisierten Tieres zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung überwacht werden. Es kann auch eine zweite, Boosterinjektion gegeben werden. Das Verfahren des Boosting und des Titerns wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht wird. Wenn ein gewünschter Grad von Immunogenität erhalten wird, kann das immunisierte Tier ausgeblutet werden und das Serum isoliert und gelagert werden, und/oder das Tier kann verwendet werden, um mAbs (unten) zu generieren.
Eines der wesentlichen Merkmale, welches durch die vorliegende Erfindung erhalten wurde, ist ein polyklonales Serum, das relativ homogen in Bezug auf die Spezifität der darin enthaltenen Antikörper ist. Üblicherweise werden polyklonale Antiseren von einer Vielzahl von verschiedenen „Klonen" abgeleitet, d.h. B-Zellen von verschiedener Abstammung. Im Gegensatz dazu werden mAbs als aus Antikörper-produzierenden Zellen mit einem gemeinsamen B-Zellenvorläufer herrührend definiert, demzufolge ihre „Mono"klonalität.
Wenn Peptide als Antigene verwendet werden, um polyklonale Seren zu erzeugen, würde man um einiges weniger Variationen in der klonalen EIgenschaft der Seren erwarten, als wenn ein ganzes Antigen verwendet wird. Unglücklicherweise kann, wenn unvollständige Fragmente eines Epitops präsentiert werden, das Peptid sehr wohl mehrere (wahrscheinlich nicht native) Konformationen annehmen. Als Ergebnis können auch kurze Peptide polyklonale Antiseren mit relativ vielen Spezifitäten ergeben und unglücklicherweise ein Antiserum, das nicht reagiert oder schlecht mit den nativen Molekülen reagiert.
Polyklonale Antiseren gemäß der vorliegenden Erfindung werden gegen Peptide hergestellt, für die vorhergesagt wird, ganze, intakte Epitope zu umfassen. Es wird davon ausgegangen, dass diese Epitope deswegen im immunologischen Sinne stabiler sind und auf diese Weise ein noch konsistenteres immunologisches Target für das Immunsystem bilden. In diesem Modell wird eine Anzahl von potentiellen B-Zellklonen, die auf dieses Peptid reagieren, um einiges kleiner sein und, infolgedessen wird die Homogenität des resultierenden Serums oder der resultierenden Sera größer sein. In verschiedenen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung polyklonale Antiseren zur Verfügung, in denen die Klonalität, d.h. Prozent der Klone, welche mit der gleichen molekularen Determinante reagieren, mindestens 80 % ist. Auch eine höhere Klonalität, bis 90 %, 95 % oder größer ist vorgesehen.
Um mAbs zu erhalten, würde man auch zunächst Versuchstiere, oftmals bevorzugt eine Maus, mit einer CBP enthaltenden Zusammensetzung immunisieren. Man würde dann, nach einer Zeitdauer ausreichend, um die Generierung von Antikörpern zu ermöglichen, eine Population von Milz- oder Lymphzellen aus dem Tier gewinnen. Die Milz- oder Lymphzellen können dann mit Zelllinien fusioniert werden, wie zum Beispiel humane oder Maus-Myeloma-Stämme, um Antikörper absondernde Hybridome herzustellen. Diese Hybridome können isoliert werden, um einzelne Klone zu erhalten, welche dann auf die Herstellung von Antikörpern gegen das gewünschte Peptid hin untersucht werden können.
Nach der Immunisierung werden Milzzellen entfernt und fusioniert, indem ein Standardfusionsprotokoll mit Plasmazytomzellen verwendet wird, um mAbs absondernde Hybridome gegen CBP herzustellen. Hybridome, welche mAbs gegen die ausgewählten Antigene herstellen, werden identifiziert, indem Standardtechniken verwendet werden, wie zum Beispiel ELISA und Westernblotverfahren. Hybridomklone können dann in flüssigen Medien kultiviert werden und die Kulturüberstände gereinigt, um die CBP-spezifischen mAbs bereitzustellen.
Es wird vorgeschlagen, dass die mAbs der vorliegenden Erfindung auch eine nützliche Anwendung in den immunochemischen Verfahren finden, wie zum Beispiel ELISA und Westernblotverfahren, als auch anderen Verfahren, wie zum Beispiel Immunoprezipitation, immunocytologische Verfahren, etc., welche für CBP-spezifische Antikörper verwenden können. Insbesondere können CBP-Antikörper in den immunoabsorbierenden Protokollen verwendet werden, um native oder rekombinante CBPs oder CBP-abgeleitete Peptidarten oder synthetische oder natürliche Varianten davon zu reinigen.
Die hierin offenbarten Antikörper können in Antikörperklonierungsprotokollen verwendet werden, um cDNAs oder Gene erhalten, die CBPs von anderen Arten oder Organismen kodieren, oder um Proteine zu identifizieren, die signifikante Homologie zu CBP aufweisen. Sie können auch in Inhibitionsstudien verwendet werden, um die Effekte von CBP in Zellen, Geweben oder ganzen Tieren zu analysieren. Anti-CBP-Antikörper können auch in Immunolokalisationsstudien nützlich sein, um die Verteilung von Bakterien, die CBPs während einer zellulären Infektion exprimieren, zu analysieren, zum Beispiel um die zelluläre oder gewebespezifische Verteilung von Streptokokken und Staphylokokken unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu bestimmen. Eine besonders nützliche Anwendung solcher Antikörper ist in der Reinigung nativer oder rekombinanter CBPs gegeben, zum Beispiel bei der Verwendung einer Antikörperaffinitätssäule. Das Verfahren all dieser immunologischen Techniken wird jenen auf dem Fachgebiet im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein.
4.11 Rekombinante Expression von CBP
Rekombinante Klone, welche die cna Nukleinsäuresegmente exprimieren, können verwendet werden, um gereinigte rekombinante CBP (rCBP), gereinigte rCBP-abgeleitete Peptid-Antigene, als auch Mutanten oder abweichende rekombinante Proteinarten in signifikanten Mengen herzustellen. Es wird vorgeschlagen, dass die ausgewählten Antigene und Varianten davon einen signifikanten Nutzen für die Diagnose und Behandlung von Infektionen haben, die durch S. Aureus, S. Pyogenes und S. Dysgalactiae verursacht werden. Zum Beispiel wird vorgeschlagen, dass rCBPs, Peptidvarianten davon, und/oder Antikörper gegen solche rCBPs auch in Immunoassays verwendet werden können, um S. Aureus-, S. Pyogenes- und S. Dysgalactiae-Zellen zu detektieren, oder als Impfstoffe oder Immunotherapeutika, um S. Aureus-, S. Pyogenes- und S. Dysgalactiae-Infektionen zu behandeln, und um einer bakteriellen Adhesion an ECM-Komponenten, wie zum Beispiel Col in der gleichen Art und Weise wie native CBP-Zusammensetzungen vorzubeugen.
Zusätzlich ermöglicht die vorliegende Erfindung, durch Anwendung von Techniken, wie zum Beispiel DNA-Mutagenese, die Fertigherstellung von Molekülen der sogenannten "zweiten Generation", welche modifizierte oder vereinfachte Proteinstrukturen haben. Proteine zweiter Generation werden üblicherweise eine oder mehrere Eigenschaften gemeinsam mit dem vollständigen Antigen teilen, wie zum Beispiel eine bestimmte antigene/immunogene epitopische Kernsequenz. Epitopische Sequenzen können von relativ kurzen Molekülen erhalten werden, hergestellt mit der Kenntnis des Peptids, oder der kodierenden DNA-Sequenzinformation. Solche abweichenden Moleküle können nicht nur aus ausgewählten immunogenen/antigenen Regionen der Proteinstruktur erhalten werden, sondern können zusätzlich, oder wahlweise, eine oder mehrere funktionell äquivalente Aminosäuren umfassen, ausgewählt auf der Basis von Ähnlichkeiten oder auch Unterschieden im Hinblick auf die ursprüngliche Sequenz. Dies ist besonders wünschenswert bei der Herstellung von Blockierungsantikörpern, welche der bakteriellen Adhesion an Col, wie hierin umrissen, vorbeugen.
4.12 Antikörperzusammensetzungen und Formulierungen davon
Mittel für die Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern sind auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt (siehe zum Beispiel Harlow und Lane (1988); hierin durch Referenz inkorporiert). Die Verfahren für die Generierung von mAbs beginnen im Allgemeinen analog zu jenen für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern. In Kürze, ein polyklonaler Antikörper wird durch Immunisierung eines Lebewesens mit einer immunogenen Zusammensetzung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung und dem Sammeln der Antiseren aus dem immunisierten Lebewesen hergestellt. Eine große Auswahl von Tierarten kann für die Herstellung von Antiseren verwendet werden. Üblicherweise ist das für die Herstellung von Antiseren verwendete Tier ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege. Aufgrund der relativ großen Blutvolumen von Kaninchen, ist ein Kaninchen die bevorzugte Auswahl für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern.
Wie auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt ist, kann eine bestimmte Zusammensetzung in seiner Immunogenität variieren. Deshalb ist es oftmals notwendig, das Immunsystem des Wirtes zu fördern, was durch die Kuppelung eines Peptid oder Polypeptid-Immunogens an ein Träger erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind Keyhole-Limpet-Hemocynain (KLH), und Rinderserum-Albumin (BSA). Andere Albumine, wie zum Beispiel Ovalbumin, Mausserum-Albumin oder Rattenserum-Albumin können auch als Träger verwendet werden. Mittel für die Konjugierung eines Polypeptids an ein Trägerprotein sind auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt und umfassen Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydrosysuccinimidester, Carbodiimid und bis-biazotizides Benzidin.
mAbs können einfach durch die Verwendung von sehr gut bekannten Techniken hergestellt werden, wie zum Beispiel jenen beispielhaft erläuterten in US-Patent Nr. 4,196,265, hierin durch Referenz inkorporiert. Üblicherweise umfasst diese Technik die Immunisierung eines geeigneten Lebewesens mit einer ausgewählten immunogenen Zusammensetzung, zum Beispiel einem gereinigten oder teilweise gereinigten Protein, Polypeptid oder Peptid. Die Immunisierungszusammensetzung wird in einer Art und Weise verabreicht, die wirksam ist, um Antikörper produzierende Zellen zu stimulieren. Nagetiere, wie zum Beispiel Mäuse und Ratten, sind bevorzugte Tiere, dennoch ist die Verwendung von Kaninchen-, Schaf- oder Froschzellen auch möglich. Die Verwendung von Ratten bietet einige Vorteile (Goding, 1986), aber Mäuse sind bevorzugt, mit der BALB/c Maus als meistbevorzugte, da diese am meisten routinemäßig verwendet wird und üblicherweise einen höheren Prozentsatz von stabilen Fusionen ergibt.
Nach der Immunisierung werden somatische Zellen mit dem Potential für die Herstellung von Antikörpern, speziell B-lymphozyten (B-Zellen), für die Verwendung im Protokoll für die Generierung von mAb, ausgewählt. Diese Zellen können aus Biopsin von Milz, Mandeln oder Lymphknoten, oder aus peripheren Blutproben erhalten werden. Milzzellen und periphere Blutzellen sind bevorzugt, die ersteren, da sie eine reichhaltige Quelle für Antikörper produzierenden Zellen sind, die in der Plasmablasten Teilungsphase sind, die letzteren, da peripheres Blut einfach zugänglich ist. Oftmals wird ein Panel von Tieren immunisiert worden sein und die Milz der Tiere mit den höchsten Antikörperlitern entfernt werden, und die Milzlymphozyten durch Homogenisierung der Milz mit einer Spritze erhalten werden. Üblicherweise enthält eine Milz von einer immunisierten Maus ungefähr annährend 5 × 10⁷ bis ungefähr 2 × 10⁸ Lymphozyten.
Die Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten aus den immunisierten Tieren werden dann mit Zellen einer unsterblichen Myelomazelle fusioniert, üblicherweise einer der gleichen Art wie das Tier, was immunisiert wurde. Myeloma Zelllinien, welche für die Verwendung in Hybridoma Herstellungs-Fusionsverfahren geeignet sind, sind bevorzugt nicht Antikörperproduzierend, haben eine hohe Fusionseffizienz und einen Enzymmangel, der sie unfähig macht, in verschiedenen Selektionsmedien zu wachsen, welche nur das Wachstum der gewünschten Fusionszellen (Hybridoma) unterstützen.
Eine jede von einer Vielzahl von Myelomzellen kann verwendet werden, die jenen auf dem Fachgebiet bekannt ist (Goding, 1986; Campbell, 1984). Zum Beispiel, dort wo das immunisierte Tier eine Maus ist, kann man P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC-11-X45-GTG 1,7 und S194/5XX0 Bul verwenden; für Ratten kann man R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 verwenden; und U266, GMI500-GRG2, LICR-LON-HMy2 und UC729-6 sind nützlich in Verbindung mit menschlichen Zellfusionen.
Eine bevorzugte murine Myelomzelle ist die NS-1 Myelom-Zellinie (auch genannt P3-NS-1-Ag4-1), welche leicht von der NIGMS Human Genetic Mutant Cell Depot auf Anfrage nach der Zellinie mit der Lagernummer GM3573 erhältlich ist. Eine noch andere Maus- Myelomzellinie, die verwendet werden kann, ist die 8-Azaguanin-resistente Maus Murine Myeloma SP2/0 nicht-Hersteller Zelllinie.
Verfahren für die Generierung von Hydriden von Antikörper-produzierenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen üblicherweise das Mischen somatischer Zellen mit Myelomazellen in einem 2:1-Verhältnis, obwohl das Verhältnis jeweils von ungefähr 20:1 bis ungefähr 1:1 variieren kann, in der Gegenwart von einem Mittel oder Mitteln (chemisch oder elektrisch), die die Fusion der Zellmembranen fördern. Fusionsmethoden, die den Sendai-Virus verwenden, sind beschrieben worden (Kohler und Milstein, 1975; 1976), und solche, die Polyethylenglykol verwenden (PEG), wie zum Beispiel 37 % (v/v) PEG, sind durch Gefter et al. (1977) beschrieben worden. Die Verwendung von elektrisch induzierten Fusionsmethoden ist auch geeignet (Goding, 1986).
Die Fusionsverfahren ergeben üblicherweise lebensfähige Hybride in geringer Dichte, ungefähr 1 × 10^–6 bis ungefähr 1 × 10^–8. Dennoch stellt dies kein Problem dar, da die lebensfähigen, fusionierten Hybride von den elterlichen, unfusionierten Zellen (besonders die unfusionierten Myelomazellen, die normalerweise fortfahren würden, sich unendlich zu teilen) durch Kultur in einem selektiven Medium abgrenzt werden. Das selektive Medium ist im Allgemeinen eines, das ein Mittel enthält, das die de novo-Synthese von Nukleotiden in Gewebekulturmedien blockiert. Beispielhafte und bevorzugte Mittel sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de novo-Synthese von sowohl Purin als auch Pyrimidin, wohingegen Azaserin nur die Purin-Synthese blockiert. Wo Aminopterin oder Methotrexat verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin und Thymidin als einer Quelle von Nukleotiden (HAT-Medium) ergänzt. Wo Azasarin verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin ergänzt.
Das bevorzugte Selektionsmedium ist HAT. Nur Zellen, welche in der Lage sind, Nukleotidhilfspfade anzuwenden, sind in der Lage im HAT-Medium zu überleben. Die Myelomazellen haben einen Defekt in den Schlüsselenzymen der Hilfstoffwechselwege, zum Beispiel Hypoxanthin-phosphoribosyl-transferase (HPRT), und sie können nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Stoffwechselweg betreiben, aber die haben eine beschränkte Lebensspanne in Kultur und sterben ungefähr innerhalb von zwei Wochen. Daher sind jene Hybride, die aus Myeloma- und B-Zellen gebildet wurden, die einzigen Zellen, die in den selektiven Medien überleben können.
Dieses Kultivieren liefert eine Population von Hybridomen, aus welchen spezifische Hybridome gewählt werden können. Üblicherweise wird die Selektion der Hybridome durch das Kultivieren der Zellen durch Einzelklon-Verdünnung in Mikrotiterplatten durchgeführt, gefolgt durch das Testen der einzelnen klonalen Überstände auf die gewünschte Reaktivität (nach ungefähr zwei bis drei Wochen). Der Assay sollte sensitiv, einfach und schnell sein, wie zum Beispiel Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, cytotoxische Assays, Plaque-Assays, Dot Immunobindungsassays und Ähnliches.
Die ausgewählten Hybridome werden dann serienmäßig verdünnt und in einzelne Antikörperproduzierende Zelllinien kloniert, die Klone können dann unbegrenzt vermehrt werden, um mAbs bereitzustellen. Die Zelllinien können für die mAb-Herstellung auf zwei einfache Art und Weisen genutzt werden. Eine Probe der Hybridome kann in ein histokompatibles Tier injiziert werden (oft in die peritoneale Kavität), von der Art, die verwendet wurde, um die somatischen und Myeloma Zellen für die ursprüngliche Fusion bereitzustellen. Die injizierten Tiere entwickeln Tumore, die die spezifischen mAb absondern, die durch die fusionierten Zellhybriden hergestellt werden. Die Körperflüssigkeiten von dem Tier, wie zum Beispiel Serum oder Aszitesfluid, können dann angezapft werden, um die mAbs in hoher Konzentration bereitzustellen. Die einzelnen Zelllinien können auch in vitro kultiviert werden, wobei die mAbs natürlicherweise in das Kulturmedium abgesondert werden, von welchem sie leicht in hohen Konzentrationen erhalten werden können. Die durch beide Wege hergestellten mAbs können, wenn erwünscht, durch die Verwendung von Filtration, Zentrifugation und verschiedener chromatographischer Methoden, wie zum Beispiel HPLC oder Affinitätschromatographie, weiter gereinigt werden.
4.13 Immunoassays
Wie erwähnt, ist es beabsichtigt, dass native und synthetisch abgeleitete Peptide und Peptid-Epitope der Erfindung Anwendung als Immunogene finden werden, zum Beispiel in Verbindung mit der Impfstoffentwicklung, oder als Antigene in Immunoassays für die Detektion von reaktiven Antikörpern. Als erstes zu den Immunoassays wendend, in ihrem einfachsten und direkten Sinn, umfassen bevorzugte Immunoassays der Erfindung die verschiedenen Typen von 'Enzym linked Immunosorbent Assays' (ELISAs), wie sie jenen auf dem Fachgebiet bekannt sind. Jedoch ist es leicht zu verstehen, dass die Verwendung von CBP-abgeleiteten Proteinen und Peptiden nicht auf solche Assays eingeschränkt ist, und dass andere nützliche Ausführungsformen RIAs und andere nicht-Enzym geknüpften Antikörper Bindungsassays und Verfahren umfassen.
In einem bevorzugten ELISA-Assay werden Proteine oder Peptide, die CBP, rCBP, oder CBP-abgeleitete Proteinantigensequenzen umfassen, auf eine ausgewählte Oberfläche immobilisiert, bevorzugt auf einer Oberfläche, welche eine Proteinaffinität aufweist, wie zum Beispiel die Löcher einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Nach dem Waschen, um unvollständig adsorbiertes Material zu entfernen, wünscht man dann im allgemeinen ein nicht spezifisches Protein, das bekannt dafür ist, eine neutrale Antigenität mit Hinblick auf die Test-Antiseren aufzuweisen, wie zum Beispiel Rinderserum-Albumin (BSA) oder Casein, in die Löcher zu binden oder zu beschichten. Dies ermöglicht die Blockierung von nicht-spezifischen Adsorbtionsstellen auf der immobilisierten Oberfläche und reduziert somit den Hintergrund, der durch nicht-spezifische Bindung von Antiseren auf der Oberfläche verursacht wird.
Nach der Bindung von antigenem Material in das Loch, der Beschichtung mit einem nicht reaktiven Material, um den Hintergrund zu reduzieren, und dem Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, wird die immobilisierte Oberfläche mit den zu testenden Antiseren oder klinischen oder biologischen Extrakt in einer Art und Weise kontaktiert, um die Bildung eines Immunkomplexes (Antigen/Antikörper) zu fördern. Solche Bedingungen umfassen bevorzugt das Verdünnen der Antiseren mit Verdünnungsmitteln, wie zum Beispiel BSA, Rinder-Gamma-Globulin (BGG) und Phosphat-gepufferte Saline (PBS)/Tween^TM. Diese zugesetzten Mittel neigen auch dazu, die Reduktion des nicht spezifischen Hintergrunds zu unterstützen. Den aufgeschichteten Antiseren wird es dann ermöglicht, für zum Beispiel von 2 bis 4 Stunden, bei Temperaturen bevorzugt in der Höhe von ungefähr 25° C bis ungefähr 27° C zu inkubieren. Nach der Inkubation wird die Antiseren-kontaktierte Oberfläche gewaschen, um nicht immunokomplexiertes Material zu entfernen. Eine bevorzugte Waschprozedur umfasst das Waschen mit einer Lösung, wie zum Beispiel PBS/Tween^TM oder Borat-Puffer.
Nach der Bildung eines spezifischen Immunkomplexes zwischen der Testprobe und dem gebundenen Antigen, und anschließendem Waschen, kann die Haufigkeit und die Menge der Immunkomplexbildung bestimmt werden, indem der Komplex einem zweiten Antikörper unterzogen wird, welcher Spezifizität für den ersten aufweist. Natürlich dadurch, dass die Testprobe üblicherweise von humaner Herkunft sein wird, wird der zweite Antikörper bevorzugt ein Antikörper mit Spezifizität für humane Antikörper sein. Um ein Detektionsmittel zu bieten, wird der zweite Antikörper bevorzugt eine verknüpfte detektierbare Markierung haben, wie zum Beispiel eine Enzymmarkierung, die ein Signal generiert, wie zum Beispiel Farbentwicklung nach Inkubation mit einem geeigneten chromogenen Substrat. Somit wird man zum Beispiel wünschen, die Antiseren-gebundene Oberfläche mit einem Urease- oder Peroxidase-konjugierten Anti-humanen IgG für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die die Entstehung der Immunkomplexbildung fördern (zum Beispiel Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer PBS enthaltenden Lösung, wie zum Beispiel PBS-Tween^TM) zu kontaktieren und zu inkubieren.
Nach der Inkubation mit dem zweiten Enzym-markierten Antikörper und dem nachfolgenden Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, wird die Menge an Markierung durch Inkubation mit einem chromogenen Substrat quantifiziert, wie zum Beispiel Urea und Bromocresol-purpur oder 2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzothiazolin)-6-sulfonsäure (ABTS) und H₂O₂, in dem Fall, wo Peroxidase die Enzymmarkierung ist. Die Quantifizierung wird dann durch das Messen des Ausmaßes der Farbbildung erreicht, zum Beispiel durch Verwendung eines Spektrophotometers im sichtbaren Spektrum.
ELISAs können in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden. Mit einem solchen ELISA-Assay können Proteine oder Peptide, welche die antigenen Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen, auf eine ausgewählte Oberfläche immobilisiert, werden bevorzugt einer Oberfläche, welche eine Proteinaffinität aufweist, wie zum Beispiel die Löcher einer Polysterol-Mikrotiterplatte. Nach dem Waschen, um die unvollständig adsorbierten Stoffe zu entfernen, ist es wünschenswert, die Löcher der Assayplatte mit einem nicht-spezifischen Protein zu binden oder zu beschichten, welches bekannt dafür ist, eine neutrale Antigenität mit Hinblick auf die Test-Antiseren aufzuweisen, wie zum Beispiel Rinderserum-Albumin (BSA), Casein oder Lösungen von Milchpulver. Dies ermöglicht die Blockierung der spezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierten Oberfläche und reduziert somit den Hintergrund, der durch nicht-spezifische Bindung von Antiseren auf die Oberfläche verursacht wird.
4.14 Immunopräzipitation
Die Anti-CBP-Antikörper der vorliegenden Erfindung sind für die Isolierung von CBP-Antigen durch Immunoprezipitation besonders nützlich. Die Immunopräzipitation umfasst die Separation der Target-Antigenkomponenten aus einem Komplexgemisch, und wird verwendet, um minimale Mengen von Proteinen zu unterscheiden oder zu isolieren. Für die Isolierung von auf Zelloberflächen lokalisierten Proteinen, wie zum Beispiel CBP, müssen die Peptide aus der bakteriellen Zellwand durch Behandlung mit Enzymen, wie zum Beispiel Lysozyme, Lysostaphin oder Mutanolysin, gelöst werden, oder wahlweise in Detergenz-Mizellen. Nicht-ionische Salze sind bevorzugt, da andere Wirkstoffe, wie zum Beispiel Gallensalze, bei saurem pH oder in der Gegenwart von zweiwertigen Kationen präzipitieren.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Antikörper für die enge Nebeneinanderstellung von zwei Antigenen nützlich. Dies ist besonders nützlich für die Erhöhung der lokalen Konzentrationen von Antigenen, wie zum Beispiel Enzym-Substrat-Paaren.
In einer ähnlichen Ausführungsform sind die Antikörper der vorliegenden Erfindung für die Förderung der Bindung von Col an cna Genprodukte nützlich. Solch eine Bindung ist einfach durch die Kontrolle der Ligandenbindung zu messen, indem gut bekannte Verfahren angewendet werden. Die Detektion der Bindung kann durch Verwendung radioaktiv-markierter Antikörper erreicht werden oder alternativ radioaktiv-markiertes Col. Als Alternative sind Assays, die Biotin markierte Antikörper verwenden, auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt, wie beschrieben (Bayer und Wilchek, 1980).
4.15 Western-Blots
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung finden einen bedeutenden Einsatz in Immunoblot- oder Western-Blot-Analysen. Die Anti-CBP-Antikörper können als hoch affine primäre Reagenzien für die Identifikation von Proteinen verwendet werden, welche auf eine feste Trägersubstanz immobilisiert sind, wie zum Beispiel Nitrozellulose, Nylon oder Kombinationen davon. In Verbindung mit der Immunopräzipitation, gefolgt durch eine Gel-Elektrophorese, können diese als ein Einzelschritt-Reagenz für die Verwendung in der Detektion von Antigenen verwendet werden, gegen welche die in der Detektion von den Antigenen verwendeten zweiten Reagenzien einen ungünstigen Hintergrund verursachen.
Dies ist besonders nützlich, wenn die untersuchten Antigene Immunoglobuline sind (ausgeschlossen die Verwendung von Immunoglobulinen, die Komponenten der Bakterienzellwand binden), die untersuchten Antigene mit dem Detektionsmittel kreuz reagieren oder sie bei dem gleichen relativen Molekulargewicht wandern, wie ein kreuzreagierendes Signal. Immunologisch gestützte Detektionsverfahren werden im Zusammenhang mit Western Blotting (einschließlich enzymatisch-, radioaktiv-, oder fluoreszens- markierter Sekundärantikörper gegen den Toxinrest) in dieser Hinsicht als besonders nützlich betrachtet.
4.16 Impfstoffe
Die vorliegende Erfindung sieht Impfstoffe für sowohl aktive als auch passive Immunisierungsausführungsformen vor. Die immunogenen Zusammensetzungen, welche als für die Verwendung als Impfstoff geeignet vorgeschlagen wurden, können sehr einfach direkt von den hierin beschriebenen neuen immunogenen Proteinen und/oder Peptid-Epitopen hergestellt werden. Bevorzugt wird das antigene Material umfangreich dialysiert, um unerwünschte Moleküle mit geringem Molekulargewicht zu entfernen, und/oder lyophilisiert für eine noch besser vorbereitete Formulierung in ein gewünschtes Vehikel.
Die Herstellung von Impfstoffen, die Peptidsequenzen als wirksamen Bestandteil umfassen, ist im Allgemeinen auf dem Fachgebiet sehr gut verstanden, wie beispielhaft erläutert in US-Patenten 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; und 4,578,770. Üblicherweise werden solche Impfstoffe für die Injektion hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, sie können auch in fester Form hergestellt werden, welche geeignet ist für die Lösung in, oder Suspension in, Flüssigkeit vor der Injektion. Die Zubereitung kann auch emulgiert sein. Der wirksame immunogene Bestandteil wird oft mit Hilfsstoffen gemischt, die pharmazeutisch verträglich und kompatibel mit dem wirksamen Bestandteil sind. Geeignete Hilfsstoffe sind, zum Beispiel, Wasser, Saline, Dextrose, Glyzerol, Ethanol, oder Ähnliches und Kombinationen davon. Darüber hinaus können die Impfstoffe, wenn erwünscht, geringe Mengen von Zusatzstoffen enthalten, wie zum Beispiel benetzende oder emulgierende Mittel, pH-puffernde Mittel oder Adjuvantien, die die Wirksamkeit der Impfstoffe erhöhen.
Eine Zusammensetzung, welche CBP oder CBP-abgeleitete Proteine und/oder native oder modifizierte epitopische Peptide davon enthält, kann auch die Grundlage für humane Impfstoffe sein. Die Herstellung solcher Zusammensetzungen, die im wesentlichen frei sind von Endotoxin, kann durch die folgenden veröffentlichten Methoden erfolgen, zum Beispiel, US-Patent 4,271,147 (durch Referenz hierin inkorporiert) offenbart Verfahren für die Herstellung von Neisseria Meningitidis Membranproteine für die Verwendung in Impfstoffen.
Auf CBP und CBP-abgeleitete Epitope basierende Impfstoffe können herkömmlich parenteral, durch Injektion verabreicht werden, zum Beispiel entweder subkutan oder intramuskulär. Weitere Formulierungen, die für andere Arten der Verabreichung geeignet sind, umfassen Zäpfchen, und in einigen Fällen orale Formulierungen. Für Zäpfchen können Bindemittel und Trägerstoffe eingesetzt werden, zum Beispiel Polyalkalenglykol oder Triglyceride: solche Zäpfchen können aus Gemischen gebildet werden, die die wirksamen Bestandteile in dem Bereich von 0,5% bis 10%, bevorzugt 1–2% enthalten. Orale Formulierungen umfassen solch gewöhnlich verwendete Hilfsstoffe, wie zum Beispiel pharmazeutische Grade von Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Zellulose, Magnesiumkarbonat und Ähnliches. Diese Zusammensetzungen haben die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen verzögerter Freisetzungen oder Puder und enthalten 10–95% der wirksamen Bestandteile, bevorzugt 25–70%.
Die Proteine können in die Impfstoffe als neutrale oder Salzformen formuliert werden. Pharmazeutisch wirksame Salze umfassen Säurezusatzsalze (mit freien Aminogruppen der Peptide gebildet) und jenen, die mit inorganischen Säuren gebildet werden, wie zum Beispiel, beispielsweise, Salzsäure oder Phosphorsäure, oder solche organischen Säuren wie Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure, Mandelsäure, und Ähnlichem. Salze, die mit freien Carboxylgruppen gebildet werden, können aus anorganischen Basen abgeleitet werden, wie zum Beispiel, beispielsweise Natrium, Kalium, Ammonium, Kalzium oder Eisenhydroxid, und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-ethylaminoethanol, Histidin, Procain und Ähnlichem.
Die Impfstoffe können in einer Art und Weise verabreicht werden, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist, und in solch einer Menge, wie sie therapeutisch wirksam und immunogen sein wird. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt ab, einschließlich, zum Beispiel der Leistungsfähigkeit des individuellen Immunsystems Antikörper zu bilden, und den Grad des gewünschten Schutzes. Die genauen erforderlichen Mengen der zu verabreichenden wirksamen Bestandteile sind durch den qualifizierten Fachmann einfach zu bestimmen. Wie auch immer, geeignete Dosierungsbereiche sind in dem Bereich von einigen hundert Mikrogramm wirksamer Bestandteile pro Impfung. Auch die geeigneten Regime für die Initialverabreichung und Boosterspritzen sind unterschiedlich, aber können durch eine anfängliche Verabreichung exemplifiziert werden, gefolgt durch anschließende Impfungen oder andere Verabreichungen.
Die Art und Weise der Verabreichung kann weitgehend verschiedenartig sein. Jede der konventionellen Methoden der Verabreichung eines Impfstoffes ist anwendbar. Diese umfassen vermutlich die orale Applikation auf einem festen physiologisch verträglichen Trägermaterial oder in einer physiologisch verträglichen Dispersion, parenteral durch Injektion oder ähnliches. Die Dosierung von dem Vaccin wird von der Route der Verabreichung abhängen und wird gemäß der Größe des Empfängers variieren.
Verschiedene Verfahren für die Erzielung von einem Zusatzeffekt des Impfstoffs umfassen die Verwendung von Mitteln, wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid oder Phosphat (Alaun), üblicherweise verwendet als 0,05–0,1 prozentige Lösung in Phosphat-gepufferter Saline, als Zusatz mit synthetischen Polymeren von Zuckern (Carbopol^®), verwendet als 0,25%-Lösung, Aggregation von dem Protein in dem Impfstoff durch Wärmebehandlung mit Temperaturen in dem Bereich zwischen ungefähr 70° und ungefähr 101°C für jeweils Perioden von 30 Sekunden bis 2 Minuten. Die Aggregation durch Reaktivierung mit Pepsin-behandelten F(ab)-Antikörpern an Albumin, Gemische mit bakteriellen Zellen, wie zum Beispiel C. Parvum oder Endotoxine oder Lipopolysaccharid-Komponenten von Gram-negativen Bakterien, Emulsion in physiologisch verträglichen Ölvehikel, wie zum Beispiel Mannidmonooleat (Aracel-A^TM) oder Emulsionen mit 20%-igen Lösungen von Perfluorcarbon (Fluosol-DA^TM) verwendet als Blockersatz können auch verwendet werden.
In vielen Fällen kann es wünschenswert sein, multiple Verabreichungen von dem Impfstoff zu haben, üblicherweise 6 Impfungen nicht überschreitend, noch üblicher nicht 4 Impfungen überschreitend, bevorzugt ein oder mehrere, üblicherweise mindestens ungefähr 3 Impfungen. Die Impfungen erfolgen für gewöhnlich in Intervallen von 2 bis 12 Wochen, noch üblicher in 3 bis 5 Wochen-Intervallen. Periodische Booster in Intervallen von 1 bis 5 Jahren, üblicherweise 3 Jahre, sind wünschenswert, um die schützenden Mengen der Antikörper aufrechtzuerhalten. Der Verlauf der Immunisierung kann durch Assays für Antikörper für die Überstand-Antigene verfolgt werden. Die Assays können durch Kennzeichnungen mit herkömmlichen Markierungen durchgeführt werden, wie zum Beispiel Radionukleotiden, Enzymen, Fluoreszenzen und Ähnlichem. Diese Techniken sind sehr gut bekannt und können in einer großen Anzahl von Patenten gefunden werden, wie zum Beispiel US-Patente 3,791,932; 4,174,384 und 3,949,064 (jedes speziell durch Referenz hierin inkorporiert, als Veranschaulichung dieser Arten von Assays).
Gewiß wird im Licht der neuen Technologie der DNA-Impfung verstanden, dass so gut wie alle solcher Impfungsregime für die Verwendung mit DNA-Vektoren und Konstrukten, wie beschrieben (Ulmer et al., 1993; Tang et al., 1992; Cox et al., 1993; Fynan et al., 1993; Wang et al., 1993; Whitton et al., 1993, alle hierin durch Referenz inkorporiert) geeignet sind. Zusätzlich zu den parenteralen Routen der DNA-Impfung, einschließlich intramuskulärer und intravenöser Injektionen, ist eine mucosale Impfung vorgesehen, wie durch die Verabreichung von Drops der DNA-Zusammensetzungen in die Nasenhöhlen oder Luftröhre erreicht werden kann. Es ist insbesondere vorgesehen, dass eine Genkanone verwendet werden kann, um eine wirksame immunisierende Menge der DNA auf die Epidermis abzugeben (Fynan et al., 1993).
Die vorliegende Erfindung sieht Impfstoffe für sowohl aktive als auch passive Immunisierungsausführungsformen vor. Immunogene Zusammensetzungen, welche für die Verwendung als Vaccin als geeignet vorgeschlagen wurden, können am einfachsten direkt aus immunogenen Peptiden hergestellt werden, die in der hierin offenbarten Art und Weise hergestellt worden sind. Bevorzugt wird das antigene Material umfangreich dialyisert, um unerwünschte Moleküle mit geringem Molekulargewicht zu entfernen und/oder lyophilisiert, für eine noch besser vorbereitete Formulierung in ein gewünschtes Vehikel. Die Herstellung von Impfstoffen, welche Peptidsequenzen als aktive Bestandteile enthalten, ist im allgemeinen auf dem Fachgebiet sehr gut verstanden, wie beispielhaft erläutert durch US-Patente 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; und 4,578,770, alle hierin durch Referenz aufgenommen. Üblicherweise werden solche Impfstoffe als Injektionen hergestellt. Entweder als flüssige Lösung oder Suspensionen: feste Formen, geeignet für die Lösung oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion, können auch hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch emulgiert werden. Der wirksame immunogene Bestandteil wird oft mit Hilfsstoffen gemischt, welche pharmazeutisch verträglich und kompatibel mit den wirksamen Bestandteilen sind. Geeignete Hilfsstoffe sind, zum Beispiel, Wasser, Saline, Dextrose, Glyzerol, Ethanol oder Ähnliches und Kombinationen davon. Darüber hinaus können die Impfstoffe, wenn erwünscht, geringe Mengen von Zusatzsubstanzen umfassen, wie zum Beispiel benetzende oder emulgierende Mittel, pH-puffernde Mittel oder Adjuvantien, welche die Wirksamkeit der Impfstoffe erhöhen.
4.17 Pharmazeutische Formulierungen
Die hierin offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzungen können oral verabreicht werden, zum Beispiel mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem vergleichbaren verzehrbaren Träger, oder sie können in einer harten oder weichen Gelatine Hüllkapsel verkapselt werden, oder sie können in Tabletten komprimiert werden, oder sie können direkt mit Diätnahrung aufgenommen werden. Für die orale therapeutische Verabreichung kann die wirksame Substanz mit Hilfsstoffen inkorporiert sein und in Form von einnehmbaren Tabletten, Mundtafeln, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Waffeln, und ähnlichem verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Zubereitungen sollten zumindest 0,1% der wirksamen Verbindung enthalten. Der prozentuale Anteil der Zusammensetzung und Zubereitung kann sicherlich verändert werden und kann geeigneterweise zwischen ungefähr 2 bis ungefähr 60% des Gewichts der Einheit betragen. Die Menge der wirksamen Verbindungen in solchen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist so, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und Ähnlichem können auch das folgende enthalten: ein Bindemittel, als Tragantgummi, Akazie, Speisestärke, oder Gelatine; sonstige Bestandteile, wie zum Beispiel Dikalziumphosphat; sich auflösende Mittel, wie zum Beispiel Speisestärke, Kartoffelmehl, Alginsäure und Ähnliches; ein Gleitmittel, wie zum Beispiel Magnesiumstearat; und ein süßendes Mittel, wie zum Beispiel Saccharose, Laktose oder Saccharin können hinzugefügt werden oder ein Aromastoff wie zum Beispiel Pfefferminze, Öle von Wintergrün, oder Kirsch-Aromastoff. Wenn die Dosierungseinheit eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu den Materialien der oben genannten Art einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Stoffe können als Beschichtung enthalten sein oder um physikalische Formen der Dosierungseinheit anderweitig zu modifizieren. Zum Beispiel können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker, oder beidem beschichtet sein. Ein Sirup eines Elixiers kann die wirksamen Verbindungen Saccharose als ein süßendes Mittel, Methyl und Propylparabens als Konservierungsmittel, einen Farbstoff und einen Aromastoff wie zum Beispiel Kirsch- oder Orangen- Aroma enthalten. Sicherlich sollte jeder in der Herstellung der Dosierungseinheit verwendeter Stoff pharmazeutisch rein und im Wesentlichen nicht toxisch in den verwendeten Mengen sein. Des Weiteren können die wirksamen Verbindungen in Retardpräparaten und Formulierungen eingearbeitet werden.
Die wirksamen Verbindungen können auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Lösungen der wirksamen Verbindungen als freie Basen oder pharmazeutisch verträglichen Salzen können in Wasser hergestellt werden, entsprechend mit einem Oberflächen-aktiven Stoff gemischt werden, wie zum Beispiel Hydroxypropylzellulose. Dispersionen können auch in Glycerol, liquidem Polyethylenglykol und Gemischen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter normalen Bedingungen der Lagerung und Verwendung enthalten diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um dem Wachstum von Mikroorganismen vorzubeugen.
Die pharmazeutischen Formulierungen, die für die einspritzbare Verwendung geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Puder für die improvisierte Herstellung einer sterilen injizierbaren Lösung oder Dispersion. In allen Fällen muß die Art steril sein und muß in dem Ausmaß fluid sein, dass eine leichte Einspritzbarkeit besteht. Sie muß unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und muß gegen den kontaminierenden Einfluß der Mikroorganismen, wie zum Beispiel Bakterien und Pilze, konserviert werden. Der Trägerstoff kann ein Lösungsmittel sein oder ein Dispersionsmedium, was zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyalkohole (zum Beispiel Glycerol, Propylenglykol, und liquides Polyethylenglykol, und ähnliches), geeignete Gemische davon, und pflanzliche Öle enthält. Die geeignete Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung einer Beschichtung erhalten werden, wie zum Beispiel Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der benötigten Partikelgröße im Fall von Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen. Die Vorbeugung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antimykotische Mittel erzietl werden, wie zum Beispiel, Paraben, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und ähnlichem. In vielen Fällen ist es bevorzugt, isotonische Mittel mit einzusetzen, wie zum Beispiel Zucker oder Natriumchlorid. Eine anhaltende Absorption der injizierbaren Zusammensetzung kann durch die Verwendung von Mitteln verzögerter Absorption in den Zusammensetzungen hergestellt werden, zum Beispiel Aluminium-monostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen werden durch die Aufnahme der wirksamen Verbindungen in der erforderlichen Menge in dem geeigneten Lösemittel mit verschiedenen anderen der oben einzeln genannten Inhaltsstoffe, wie benötigt hergestellt, gefolgt durch sterile Filtration. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch die Aufnahme der verschiedenen sterilisierten wirksamen Inhaltsstoffe in ein steriles Vehikel hergestellt, welches das Grunddispersionsmedium enthält und die erforderlichen anderen Ingredienzien aus den oben einzeln genannten. Im Falle des sterilen Puders für die Herstellung einer sterilen injizierbaren Lösung sind die bevorzugten Herstellungsmethoden die Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, welche ein Puder der aktiven Inhaltsstoffe ergeben, die zusätzliche erwünschte Inhaltstoffe aus einer zuvor hiervon steril filtrierten Lösung.
Wie hierin verwendet umfasst „pharmazeutisch verträgliche Träger" jede und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedium, Beschichtungen, antibakterielle und antimykotische Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und ähnliches. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt. Mit Ausnahme der konventionellen Medien oder Mitteln, die inkompatibel mit den wirksamen Inhaltsstoffen sind, ist ihre Verwendung in der therapeutischen Zusammensetzung vorgesehen. Ergänzende wirksame Inhaltsstoffe können auch in den Zusammensetzungen umfasst sein.
Für die orale Prophylaxe können die Polypeptide mit Hilfsstoffen enthalten sein und in Form von nicht verdaubaren Mundwassern und Zahnpasten verwendet werden. Ein Mundwasser kann durch Einfügung der Wirksubstanz in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt werden, wie zum Beispiel Natriumboratlösung (Dobell's Lösung). Wahlweise kann die Wirksubstanz in eine antiseptische Spülung eingefügt werden, welche Natriumborat, Glyzerin und Kaliumbikarbonat enthält. Die Wirksubstanz kann auch in Zahnpasten dispergiert sein, einschließlich: Gelen, Pasten, Pudern und Breien. Die wirksamen Bestandteile können in einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zahnpasta hinzugefügt werden, die Wasser, Bindemittel, Poliermittel, Aromastoffe, Schäumungsmittel und Befeuchtungsmittel enthalten kann.
Der Ausdruck „pharmazeutisch verträglich" bezieht sich auf molekulare Stoffe und Zusammensetzungen, die keine allergischen oder ähnliche bedauerliche Reaktionen hervorrufen, wenn sie einem Menschen verabreicht werden. Die Herstellung einer wässrigen Zusammensetzung, die ein Protein als aktiven Bestandteil enthält, ist auf dem Fachgebiet sehr wohl verstanden. Üblicherweise werden solche Zusammensetzungen als Injektionen hergestellt, entweder als liquide Lösungen oder als Suspensionen; feste Formen, geeignet für die Lösung in, oder Suspension in, Flüssigkeit vor der Injektion können auch hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch emulgiert sein.
Die Zusammensetzung kann in einer neutralen oder Salzform formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit der freien Aminogruppe von dem Protein) und welche mit anorganischen Säuren gebildet werden, wie zum Beispiel, beispielsweise, Salzsäure und Phosphorsäuren, oder solchen organischen Säuren wie Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure, Mandelsäure und Ähnlichen. Salze, die mit der freien Carboxylgruppe gebildet werden, können aus anorganischen Basen abgeleitet werden, wie zum Beispiel, beispielsweise, Natrium, Kalium, Ammonium, Kalzium, oder Eisenhydroxid, und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und Ähnlichen. Nach der Formulierung, werden die Lösungen in einer Art und Weise verabreicht, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist und in solch einer Menge, wie sie therapeutisch wirksam ist. Die Formulierungen sind leicht in einer Vielzahl von Dosierungsformen verabreichbar, wie zum Beispiel injizierbare Lösungen, Arzneimittelfreisetzungskapseln und Ähnlichen.
Zum Beispiel sollte die Lösung für die parenterale Verabreichung in einer wässrigen Lösung entsprechend gepuffert sein, wenn erforderlich, und die flüssigen Verdünnungsmittel zunächst isotonisch mit ausreichend Saline oder Glukose gemacht werden. Diese besonderen wässrigen Lösungen sind besonders für die intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Verabreichung geeignet. In diesem Zusammenhang, sterile wässrige Mittel, welche verwendet werden können, werden jenen auf dem Fachgebiet im Lichte der bisherigen Offenbarung bekannt sein. Zum Beispiel kann eine Dosierung in 1 ml einer isotonischen NaCl-Lösung gelöst sein und entweder zu 1000 ml einer Hypodermoclysis-Flüssigkeit zugefügt werden, oder an der vorgesehenen Stelle der Infusion injiziert werden (siehe zum Beispiel „Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. Ausgabe, S. 1035–1038 und 1570–1580). Einige Veränderungen in der Dosierung werden sicherlich in Abhängigkeit von den Bedingungen der zu behandelnden Person erforderlich sein. Die für die Verabreichung verantwortliche Person wird in jedem Fall die geeignete Dosis für die einzelne Person bestimmen. Darüber hinaus sollten die Zubereitungen für die humane Verabreichung die Sterilitäts-, die Pyrogenen, die allgemeinen Sicherheits- und Reinheitsstandards erfüllen, wie durch die FDA Office of Biologics Standards gefordert.
4.18 Screening Assays
Wirtszellen, die transformiert worden sind, können in dem Screening von natürlichen und künstlich abgeleiteten Verbindungen oder Gemischen verwendet werden, um solche auszuwählen, die in der Lage sind, mit den CBP und CBP-abgeleiteten Proteinen der vorliegenden Erfindung zu komplexieren. Dieses könnte auf der Suche nach Verbindungen, die inhibieren oder anderweitig die Fähigkeit der Mikroorganismen an Col zu binden zu unterbrechen oder auch erhöhen, nützlich sein. Es ist vorgesehen, dass wirksame pharmazeutische Mittel durch die Identifikation von Verbindungen, die mit den jeweiligen CBP-Epitopen komplexieren, entwickelt werden können, zum Beispiel Verbindungen, die aus natürlichen Quellen isoliert worden sind, wie zum Beispiel Pflanzen, Tiere und marinen Quellen und verschiedenen synthetischen Verbindungen. Natürliche oder künstlich hergestellte Verbindungen, die in dieser Art und Weise getestet werden können, können auch verschiedene Mineralien und Proteine, Peptide oder Antikörper umfassen.
4.19 Epitopische Kernsequenzen
Die vorliegende Erfindung ist auch auf Proteine oder Peptidzusammensetzungen gerichtet, die frei von ganzen Zellen sind und anderen Peptiden, welche ein gereinigtes Protein oder Peptid umfassen, welches ein Epitop umfasst, das immunologisch kreuzreaktiv ist mit einem oder mehreren der Antikörper der vorliegenden Erfindung.
Wie hierin verwendet, ist es beabsichtigt, dass sich der Begriff „umfassend ein Epitop, das immunologisch mit einem oder mehreren Anti-CBP-Antikörpern kreuzreaktiv ist" auf ein Peptid oder Protein-Antigen bezieht, welches eine primäre, sekundäre oder tertiäre Struktur umfasst, die ähnlich ist zu dem Epitop, welches innerhalb eines CBP-Polypeptid lokalisiert ist. Der Grad der Ähnlichkeit wird im allgemeinen von solch einem Ausmaß sein, dass monoklonale oder polyklonale Antikörper, welche gegen die CBP-Polypeptide gerichtet sind, auch an das kreuzreaktive Peptid oder Protein-Antigen binden, damit reagieren, oder anderweitig erkennen. Verschiedene Immunoassaymethoden können in Zusammenhang mit solchen Antikörpern verwendet werden, zum Beispiel, beispielsweise, Western-Blots, ELISA, RIA, und Ähnliche, alle, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Die Identifikation von CBP-Epitopen, wie zum Beispiel jenen, die von cna oder cna-ähnlichen Genprodukten und/oder ihren funktionellen Äquivalenten abgeleitet sind, welche für die Verwendung in Impfstoffen geeignet sind, ist eine relativ einfache Angelegenheit.
Zum Beispiel kann man die Methoden von Hopp verwenden, wie in US-Patent 4,554,101 gelehrt wird, hierin durch Referenz aufgenommen, welche die Identifikation und Herstellung von Epitopen aus Aminosäuresequenzen auf der Basis von hydrophilen Eigenschaften lehrt. Auch die in vielen anderen Veröffentlichungen beschriebenen Methoden und darauf basierenden Softwareprogramme, können verwendet werden, um epitopische Kernsequenzen zu identifizieren (siehe zum Beispiel Jameson und Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; US-Patent 4,554,101). Die Aminosäuresequenz dieser "epitopischen Kernsequenzen" kann in einfache Peptide inkorporiert werden, entweder durch die Anwendung der Peptidsynthese oder rekombinanter Technologie.
Die für die Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung bevorzugte Peptide werden allgemein im Bereich von ungefähr 5 bis 25 Aminosäure Länge sein, und noch bevorzugter zwischen ungefähr 8 bis ungefähr 20 Aminosäure Länge. Es ist beabsichtigt, dass kürzere antigene Peptidsequenzen in verschiedenen Fällen Vorteile verleihen, zum Beispiel in der Herstellung von Impfstoffen oder immunologischen Detektionsassays. Exemplarische Vorteile umfassen die Leichtigkeit der Herstellung und Reinigung, die relativ geringen Kosten und eine verbesserte Reproduzierbarkeit der Herstellung und eine vorteilhafte Bioverteilung.
Es ist beabsichtigt, dass die jeweiligen Vorteile der vorliegenden Erfindung durch die Herstellung von synthetischen Peptiden realisiert werden können, welche modifizierte und/oder erweiterte epitopische/immunogene Kernsequenzen umfassen, welche ein „universelles" Epitop-Peptid zur Folge haben, welches gegen CBP und CBP-ähnliche Sequenzen gerichtet ist, oder anderen Domänen, welche Col binden oder ähnliche Proteoglykane. Es ist beabsichtigt, dass diese Regionen jene darstellen, welche am wahrscheinlichsten die T-Zell- oder B-Zell-Stimulation in einem Tier fördern, und demzufolge eine spezifische Antikörperherstellung in solch einem Lebewesen auslösen.
Eine epitopische Kernsequenz, wie hierin verwendet, ist ein relativ kurzes Stück von Aminosäuren, das „komplementär" zu Antigenbindungsstellen auf CBP Epitop-spezifischen Antikörpern ist, und diese daher binden wird. Zusätzlich oder wahlweise ist eine epitopische Kernsequenz ein, die Antikörper auslösen wird, die mit Antikörpern kreuzreaktiv sind, welche gegen die Peptidzusammensetzung der vorliegenden Erfindung gerichtet sind. Es ist ersichtlich, dass im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung, sich der Begriff „komplementär" auf Aminosäuren oder Peptide bezieht, die eine Anziehungskraft zueinander zeigen. Auf diese Weise können bestimmte Epitopkernsequenzen der vorliegenden Erfindung in Hinblick auf ihre Fähigkeit, um die Bindung von dem gewünschten Proteinantigen mit den entsprechenden Protein-gerichteten Antiseren zu konkurrieren oder vielleicht zu verdrängen, operativ definiert werden.
Im allgemeinen wird nicht davon ausgegangen, dass die Größe des Polypeptid-Antigens besonders kritisch ist, solange es mindestens lang genug ist, um die identifizierten Kernsequenz oder Kernsequenzen tragen. Die kleinste verwendbare Kernsequenz, welche durch die vorliegende Erfindung erwartet wird, wird im allgemeinen in der Ordnung von ungefähr 5 Aminosäuren in der Länge liegen, wobei Sequenzen in der Ordnung von 8 oder 25 noch bevorzugter sind. Auf diese Weise wird die Größe im allgemeinen zu den kleinsten Peptid-Antigenen korrespondieren, welche in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellt wurden. Jedoch kann die Größe des Antigens größer sein, wo erwünscht, solange es die wesentliche epitopische Kernsequenz enthält.
Die Identifikation von epitopischen Kernsequenzen ist jenen auf dem Fachgebiet bekannt, zum Beispiel, wie beschrieben in US-Patent 4,554,101, hierin durch Referenz aufgenommen, welches die Identifikation und Herstellung von Epitopen aus Aminosäuresequenzen auf der Basis der hydrophilen Eigenschaften lehrt. Darüber hinaus sind zahlreiche Computerprogramme für die Verwendung in der Prophezeiung antigener Teile von Proteinen verfügbar (siehe zum Beispiel Jameson und Wolf, 1988; Wolf et al., 1988). Computergestützte Peptidsequenzanalyseprogramme (zum Beispiel DNAStar^® software, DNAStar, Inc., Madison, WI) können auch beim Entwurf synthetischer CBP-Peptide und Peptidanaloge in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenbarung nützlich sein.
Durch diese Erfindung erhaltene Peptide sind ideale Targets für die Verwendung als Impfstoffe oder Immunoreagenzien für die Behandlung von verschiedenen Staphylokokken- oder Streptokokken-ähnlichen Erkrankungen, und insbesondere jenen, die durch die Arten, welche CBP und CBP-kodierende Gene enthalten, verursacht sind, folglich jenen, welche entweder cna oder cna-ähnliche Genprodukte auf der Zelloberfläche exprimieren und wiederum mit ECM-Komponenten interagieren, wie zum Beispiel Col, um die bakterielle Adhesion an Wirtszellen zu fördern. In diesem Zusammenhang, können bestimmte Vorteile durch die Herstellung von synthetischen Peptiden realisiert werden, die epitopische/immunogene Kernsequenzen umfassen. Diese epitopischen Kernsequenzen können als hydrophile und/oder mobile Regionen der Polypeptide identifiziert werden, oder jene, die ein T-Zell-Motiv umfassen. Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass solche Regionen jene darstellen, die am wahrscheinlichsten die B-Zell- oder T-Zell-Stimulation fördern und infolgedessen eine spezifische Antikörperproduktion auslösen.
Im Fall der Prävention bakterieller Adhesion ist die Bereitstellung von Epitopen, welche Antikörper erzeugen, welche die Interaktion von einem Col-spezifischen Genprodukt und Col oder Proteoglycanen, welche dem Col strukturell ähnlich sind, inhibieren, besonders wünschenswert.
Um zu bestätigen, dass ein Protein oder Peptid immunologisch kreuzreaktiv ist mit, oder ein biologisches funktionales Äquivalent von, einem oder mehrere Epitope der offenbarten Peptide ist auch eine einfache Angelegenheit. Dies kann einfach, durch Verwendung spezifischer Assays bestimmt werden, zum Beispiel von einer einzigen vorgeschlagenen epitopischen Sequenz, oder durch die Verwendung mehrerer allgemeiner Screens, zum Beispiel von einem Pool wahllos generierter synthetischer Peptide oder Proteinfragmente. Die Screening-Assays können verwendet werden, um entweder äquivalente Antigene oder kreuzreaktive Antikörper zu identifizieren. In jedem Fall ist das Prinzip das gleiche, d.h. es basiert auf der Kompetition der Bindungsstellen zwischen Antikörpern und Antigenen.
Geeignete Kompetitionsassays, die verwendet werden können, umfassen Protokolle, welche auf immunohistochemischen Assays basieren, ELISAs, RIAs, oder Dot-Blots und Ahnliche. In jedem der kompetitiven Assays wird eine der Bindungskomponenten, üblicherweise das bekannte Element, wie zum Beispiel das CBP-abgeleitete Peptid, oder ein bekannter Antikörper, mit einer detektierbaren Kennzeichnung markiert und die Testkomponente, die üblicherweise unmarkiert bleibt, wird auf ihre Fähigkeit hin getestet, die Menge an Markierung, die an den korrespondierenden reaktiven Antikörper oder das Antigen gebunden ist, zu reduzieren.
Als eine beispielhafte Ausführungsform, um eine Kompetitionsstudie zwischen einem CBP und einem Testantigen durchzuführen, würde man zunächst CBP mit einer detektierbaren Markierung kennzeichnen, wie zum Beispiel Biotin oder ein enzymatisches, radioaktives oder fluorogenes Label, um die nachfolgende Identifikation zu ermöglichen. Man würde dann das markierte Antigen mit dem anderen zu bestimmenden Testantigen in verschiedenen Verhältnissen inkubieren (zum Beispiel 1:1, 1:10 und 1:100), und nach dem Mischen würde man dann dem Gemisch einen Antikörper der vorliegenden Erfindung hinzufügen. Bevorzugt würde der bekannte Antikörper immobilisiert sein, zum Beispiel durch Bindung an eine ELISA-Platte. Die Fähigkeit des Gemischs einen Antikörper zu binden würde durch die Detektion des Vorhandenseins eines spezifisch gebundenen Labels bestimmt werden. Dieser Meßwert würde dann mit einem Kontrollmeßwert verglichen werden, in welchem kein potentiell kompetitierendes (Test) Antigen im Inkubationsansatz hinzugefügt worden ist.
Der Assay kann einer aus dem Bereich der immunologischen Assays sein, welche auf Hybridisierung basieren, und das reaktive Antigen würde mit Hilfe der Detektion ihrer Markierung detektiert werden, zum Beispiel durch die Verwendung von Streptavidin im Fall von biotynilierten Antigenen oder durch Verwendung eines chromogenen Substrats in Verbindung mit einem enzymatischen Label oder durch einfache Detektion einer radioaktiven oder fluoreszierenden Markierung. Ein Antigen, das beispielsweise an den gleichen Antikörper wie CBP bindet, ist in der Lage wirksam um die Bindung zu konkurrieren und wird somit die CBP-Bindung signifikant reduzieren, wie durch eine Reduktion der Menge an detektiertem Markierung nachgewiesen werden kann.
Die Reaktivität von dem markierten Antigen, zum Beispiel einer CBP-Zusammensetzung, würde beim Fehlen irgendeines Testantigens den hohen Kontrollwert bilden. Der nierdige Kontrollwert würde durch die Inkubation des markierten Antigens mit einem Überschuß von unmarkiertem CBP-Antigen erhalten werden, wenn die Kompetition erfolgen würde und die Bindung reduziert. Eine signifikante Reduktion markierter Antigenreaktivität in Gegenwart eines Testantigens ist ein Beispiel für ein Testantigen, welches „kreuzreaktiv" ist, d. h. das es Bindungsaffinität für den gleichen Antikörper hat. „Eine signifikante Reduktion" kann im Sinne der vorliegenden Anmeldung definiert werden als eine reproduzierbare (d. h. eine immer wieder beobachtbare) Reduktion in der Bindung.
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Peptidyl-Verbindungen ziehen die Erfinder auch in Erwägung, dass andere sterisch ähnliche Verbindungen formuliert werden können, um die Schlüsselteilbereiche der Peptidstruktur nachzuahmen. Solche Verbindungen, welche als Peptidomimetica bezeichnet werden können, können in der gleichen Art und Weise verwendet werden, wie die Peptide der Erfindung und sind deshalb auch funktionale Äquivalente. Die Herstellung einer strukturellen funktionalen Äquivalenz kann durch die Techniken des Modelling und chemischen Designs erreicht werden, welche jenen auf dem Fachgebiet bekannt sind. Es ist ersichtlich, dass alle solche sterisch ähnlichen Konstrukte in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen.
Die Synthese von epitopischen Sequenzen, oder von Peptiden, welche ein antigenes Epitop innerhalb ihrer Sequenz umfassen, sind leicht auszuführen, indem herkömmliche Synthesetechniken verwendet werden, wie zum Beispiel die Feste-Phasen-Methode (zum Beispiel durch die Verwendung eines kommerziell erhältlichen Peptidgenerators, wie zum Beispiel ein Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer). Peptidantigene, welche in dieser Art und Weise synthetisiert worden sind, können dann in vorher festgelegten Mengen aliquotiert werden und in üblicher Art und Weise gelagert werden, wie zum Beispiel in wässrigen Lösungen oder, noch bevorzugter, in einem Puder oder lyophilisierten Zustand, in Abhängigkeit von der Verwendung.
Im allgemeinen können aufgrund der relativen Stabilität der Peptide diese leicht in wässrigen Lösungen für eine ziemlich lange Zeitdauer gelagert werden, wenn es erwünscht ist, zum Beispiel bis zu sechs Monaten oder mehr, in so gut wie jeder wässrigen Lösung ohne nennenswerten Abbau oder Verlust der antigenen Aktivität. Dennoch, wo eine verlängerte wässrige Lagerung vorgesehen ist, wird es im allgemeinen wünschenswert sein, Mittel einzusetzen, einschließlich Puffer, wie zum Beispiel Tris oder Phosphatpuffer, um den pH von ungefähr 7,0 bis ungefähr 7,5 aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus kann es wünschenswert sein, Mittel einzusetzen, welche das mikrobielle Wachstum inhibieren, wie zum Beispiel Natriumazid oder Merthiolat. Für eine verlängerte Lagerung in wässrigem Zustand wird es wünschenswert sein, die Lösungen bei 4° C zu lagern oder, noch bevorzugter, eingefroren. Sicherlich, wo die Peptide in einem lyophilisierten oder Puderzustand gelagert werden, können sie so gut wie auf unbestimmte Zeit gelagert werden, zum Beispiel in dosierten Aliquots, die mit einer vorbestimmten Menge an Wasser (bevorzugt destilliert) oder Puffer vor der Verwendung dehydriert werden können.
4.20 Ortspezifische Mutagenese
Die ortspezifische Mutagenese ist eine Technik die in der Herstellung von individuellen Peptiden oder biologisch funktionalen äquivalenten Proteinen oder Peptiden, durch spezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA nützlich ist. Die Technik, die jenen auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, bietet weiterhin eine betriebsbereite Fähigkeit, Sequenzvarianten herzustellen und zu testen, zum Beispiel unter Berücksichtigung einer oder mehrerer der vorangehenden Überlegungen, durch die Einführung einer oder mehrerer Nukleotidsequenzänderungen in die DNA. Ortspezifische Mutagenese ermöglicht die Herstellung von Mutanten durch die Verwendung von spezifischen Oligonukleotidsequenzen, welche die DNA-Sequenz mit der erwünschten Mutation kodieren, als auch eine ausreichende Anzahl von angrenzenden Nukleotiden, um eine Primersequenz von ausreichender Größe und Sequenzumfang bereitzustellen, um einen stabilen Duplex auf beiden Seiten der Deletionslücke zu bilden, welche überbrückt wird. Üblicherweise ist ein Primer von ungefähr 14 bis ungefähr 25 Nukleotiden in der Länge bevorzugt, mit ungefähr 5 bis ungefähr 10 Resten an beiden Seiten der Bindung der veränderten Sequenz.
Im Allgemeinen ist die Technik der ortspezifischen Mutagenese auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt, wie durch verschiedene Publikationen veranschaulichend dargestellt wird. Wie verstanden werden wird, verwendet die Technik üblicherweise einen Phagenvektor, welcher sowohl in einzelsträngiger als auch in doppelsträngiger Form existiert. Typische Vektoren, welche in der ortspezifischen Mutagenese verwendbar sind, umfassen Vektoren, wie zum Beispiel den M13-Phagen. Diese Phagen sind leicht kommerziell erhältlich und ihre Verwendung ist dem Fachmann im Allgemeinen sehr gut bekannt. Auch doppelsträngige Plasmide werden in der ortspezifischen Mutagenese routinemäßig verwendet, welche den Schritt des Transfers des Gens von Interesse aus einem Plasmid in einen Phagen vermeiden.
Im Allgemeinen wird die ortspezifische Mutagenese in Übereinstimmung hiermit durchgeführt, indem zuerst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird oder die zwei Stränge des doppelsträngigen Vektors auseinander geschmolzen werden, welcher in seiner Sequenz eine DNA-Sequenz umfasst, welche die gewünschten Peptide kodiert. Ein Oligonukleotidprimer, welcher die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird üblicherweise synthetisch hergestellt. Dieser Primer wird dann mit dem Einzelstrangvektor annealed und DNA-polymerisierenden Enzymen unterworfen, wie zum Beispiel E. Coli Polymerase-I Klenow-Fragment, um die Synthese des mutationstragenden Stranges zu vervollständigen. Auf diese Weise wird ein Heteroduplex gebildet, wobei ein Strang die originale, nicht mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplexvektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen zu transformieren, wie zum Beispiel E. Coli Zellen, und Klone, welche die rekombinanten Vektoren umfassen, welche die mutierten Sequenzarrangements tragen, werden ausgewählt.
Die Herstellung von Sequenzvarianten der ausgewählten Peptid-kodierenden DNA-Segmente durch Verwendung ortspezifischer Mutagenese wird, als ein Mittel der Herstellung, aus potenziell nützlichen Arten erhalten und wird nicht als limitiert betrachtet, da es andere Wege gibt, auf welchen Sequenzvarianten von Peptiden und die sie kodierenden DNA-Sequenzen erhalten werden können. Zum Beispiel können rekombinante Vektoren, welche die gewünschten Peptidsequenzen kodieren, mit mutagenen Mitteln behandelt werden, wie zum Beispiel Hydroxylamin, um Sequenzvarianten zu erhalten. Einzelne Details im Hinblick auf diese Methoden und Protokolle können in den Lehren von Maloy, 1990; Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop und Bajpai, 1991; Kuby, 1994; und Maniatis et al., 1982, gefunden werden, jede hierin mit Referenz mit aufgenommen, für den Zweck.
Die PCR^TM-basierte Strangüberhangverlängerung (SOE) (Ho et al., 1989) für die ortspezifische Mutagenese ist besonders bevorzugt für die ortspezifische Mutagenese der Nukleinsäurezusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Die Techniken der PCR^TM sind jenen auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt, wie hierin oben beschrieben wurde. Die SOE-Prozedur umfasst ein Zwei-Schritt-PCR-Protokoll, in welchem ein komplementäres Paar von internen Primern (B und C) verwendet werden, um die entsprechenden Nukleotidänderungen in die Wild-Typ-Sequenz einzufügen. In zwei separaten Reaktionen werden der flankierende PCR^TM-Primer A (eine Restriktionsstelle wurde in das Oligo eingefügt) und der Primer D (eine wurde in das Oligo eingeführt) jeweils in Verbindung mit den Primern B und C verwendet, um die PCR^TM-Produkte AB und CD zu generieren. Die PCRTM-Produkte werden durch Agarosegel-elektrophorese gereinigt und die zwei überhängenden PCR^TM-Fragmente AB und CD werden mit den flankierenden Primern A und D kombiniert und in einer zweiten PCR^TM-Reaktion verwendet. Das amplifizierte PCR^TM-Produkt wird in einem Agarosegel gereinigt, mit den entsprechenden Enzymen verdaut, in einen Expressionsvektor ligiert und in E. Coli JM101, XL1-Blue^TM (Stratagene, La Jolla, CA), JM105 oder TG1 (Carter et al., 1985) Zellen transformiert. Klone werden isoliert und die Mutationen werden durch Sequenzierung der isolierten Plasmide bestätigt.
4.21 Biologisch-funktionale Äquivalente
In der Struktur der Peptide der vorliegenden Erfindung können Modifikationen und Änderungen erzeugt werden, und den DNA-Segmenten, welche sie kodieren, und nach wie vor ein funktionales Molekül ergeben, das ein Protein oder Peptid mit den gewünschten Charakteristika kodiert. Nachstehend ist eine Diskussion, welche auf Änderungen der Aminosäuren eines Proteins basieren, um ein Äquivalent zu bilden, oder auch Moleküle einer verbesserten zweiten Generation. Die Aminosäureänderungen können durch Änderung der Codons der DNA-Sequenz, gemäß der folgenden Codon-Tabelle erreicht werden:
Tabelle 1
Zum Beispiel können bestimmte Aminosäuren an die Stelle von anderen Aminosäuren in der Proteinstruktur gesetzt werden, ohne einen merklichen Verlust der wechselwirkenden Bindungseigenschaft mit Strukturen, wie zum Beispiel Antigen-Bindungsregionen von Antikörpern oder Bindungsstellen auf Substratmolekülen, zu haben. Da es die wechselwirkende Eigenschaft und Natur von einem Protein ist, welche die biologischfunktionale Aktivität des Proteins definiert, können bestimmte Aminosäuresequenzsubstitutionen in einer Proteinsequenz gemacht werden und sicherlich seiner zugrunde liegenden kodierenden DNA Sequenz, und nichtsdestotrotz ein Protein mit ähnlichen Eigenschaften erzielen. Daher ist es durch die Erfinder vorgesehen, dass verschiedene Änderungen in der Peptidsequenz der offenbarten Zusammensetzungen gemacht werden können, oder der korrespondierenden DNA-Sequenzen, welche besagte Peptide kodieren, ohne nennenswerten Verlust ihres biologischen Nutzens oder Aktivität.
Bei der Anfertigung solcher Änderungen wird der hydropatische Index der Aminosäuren bedacht. Die Bedeutung des hydropatischen Aminosäureindex für die Verleihung interaktiver biologischer Funktionen eines Proteins ist im Allgemeinen auf dem Fachgebiet verstanden (Kyte und Doolittle, 1982, hierin durch Referenz aufgenommen). Es ist anerkannt, dass der relative hydropatische Charakter der Aminosäure zu der sekundären Struktur des resultierenden Proteins beiträgt, welche wiederum die Interaktion von dem Protein mit anderen Molekülen definiert, zum Beispiel Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und Ähnlichem. Jeder Aminosäure wurde ein hydropatischer Index auf der Basis ihrer Hydrophobizität und Ladungscharakteristika zugeteilt (Kyte und Doolittle, 1982), und dies sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5), Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6), Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Aspargin (–3,5); Lysin (–3,9); und Arginin (–4,5).
Es ist auf dem Gebiet bekannt, dass einige Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt werden können, welche einen ähnlichen hydropatischen Index oder Score haben und dennoch in einem Protein mit ähnlicher biologischer Aktivität resultieren, d.h. weiterhin ein biologisch funktionelles Äquivalent des Proteins ergeben. In der Herstellung solcher Änderungen sind die Substitutionen von Aminosäuren, deren hydropatischer Index innerhalb von ±2 ist, bevorzugt, jene, bei welcher er innerhalb von +1 ist, sind besonders bevorzugt, und jene, bei welcher er innerhalb von ±0,5 ist, sind am meisten bevorzugt. Es ist auf dem Gebiet auch selbstverständlich, dass die Substitution von ähnlichen Aminosäuren in wirksamer Weise auf der Basis der hydrophilen Eigenschaften gemacht werden kann. US-Patent 4,554,101, hierin durch Referenz eingefügt, gibt an, dass die größte lokale durchschnittliche hydrophile Eigenschaft eines Proteins, wie durch die hydrophilen Eigenschaften seiner benachbarten Aminosäuren beeinflußt, mit einer biologischen Eigenschaft von einem Protein korreliert.
Wie ausführlich in US-Patent 4,554,101 dargelegt, sind die folgenden hydrophilen Werte den Aminosäureresten zugeteilt worden: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 f 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (– 0,4); Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystin (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (– 1,5); Leucin (–1,8), Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4). Es ist ersichtlich, dass eine Aminosäure durch eine andere substituiert werden kann, welche einen ähnlichen hydrophilen Wert hat und dennoch ein biologisches Aquivalent ergibt, und insbesondere ein immunologisch äquivalentes Protein. Bei solchen Änderungen sind die Substitutionen der Aminosäuren bevorzugt, deren hydrophiler Wert innerhalb von ±2 ist, jene, bei welchen er innerhalb von ±1 ist, sind besonders bevorzugt, und jene, bei welchen er innerhalb von ±0,5 ist, sind am meisten bevorzugt.
Wie oben umrissen wurde, basieren deswegen Aminosäuresubstitutionen im Allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäure Seitenketten Substituenten, zum Beispiel ihrer Hydrophobizität, ihrer hydrophilen EIgenschaft, ihrer Ladung, ihrer Größe und Ähnliches. Exemplarische Substitutionen, welche die verschiedenen der vorangehenden Charakteristika berücksichtigen, sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin; und Valin, Leucin und Isoleucin.
4.22 Bakterielle MSCRAMMs (Adhesine) als Impfstoffkandidaten
Historisch fokussierten Untersuchungen der bakteriellen Adhärenz hauptsächlich auf Gramnegative Bakterien, welche eine breitgefächterte Vielfalt von fimbrialen adhesiven Proteinen (Adhesine genannt) auf ihrer Zelloberfläche exprimieren (Falkow et al., 1992). Diese Adhesine erkennen spezifische Glycokonjugate, die auf der Zelloberfläche der Wirtszellen exponiert sind (insbesondere epithelialen Schichten). Die Verwendung von Lectin-ähnlichen Strukturen bei der Anhaftung ermöglicht den Mikroorganismen die epithelialen Oberflächen effizient zu besiedeln, diese bieten den Bakterien einen excellenten Ort für die Replikation und auch die Möglichkeit, sich in benachbarten Wirts-Geweben zu verbreiten. In vielen Fällen ist gezeigt worden, dass die Immunisierung mit Pilus-Adhesinen Schutz gegen mikrobielle Probleme auslösen kann, wie zum Beispiel in Hemophilus Influenza induzierter Mittelohrentzündung (Otitis Media) in einem Chinchilla Modell (Sirakova et al., 1994), Moraxella Bovis in einer experimentell induzierten infektiösen Rinder-Keratokonjunktivitis (Lepper et al., 1995) und E. Coli induzierter Diarrhö in Kaninchen (McQueen et al., 1993). In den meisten Fällen führt die Immunisierung mit Adhesinen zu der Produktion von Immunantikörpern, die einer Infektion durch Inhibition der bakteriellen Anhaftung und Kolonisation vorbeugen, als auch durch die Erhöhung bakterieller Opsonophagocytose und Antikörper abhängiger Komplement mediierter Zerstörung.
Die Verwendung von Molekülen als Komponenten eines Impfstoffs, die die Adhesion von pathogenen Mikroben an Wirtsgewebekomponenten mediieren, bildet sich als kritischer Schritt in der Entwicklung zukünftiger Impfstoffe heraus. Da die bakterielle Anhaftung der entscheidende erste Schritt in der Entwicklung der meisten Infektionen ist, ist dies ein attraktives Ziel für die Entwicklung von neuen Impfstoffen. Ein verbessertes Verständnis der Wechselwirkung zwischen MSCRAMMs und den Komponenten des Wirtsgewebes auf molekularer Ebene, gekoppelt mit neuen Techniken in der rekombinanten DNA-Technologie, haben zu einer Grundlage für eine neue Generation von Spaltvakzinen geführt. Die gesamte oder spezifische Domänen von MSCRAMMs, entweder in ihrer nativen oder ortspezifisch veränderten Form, können nun hergestellt werden. Darüber hinaus bildet die Fähigkeit MSCRAMMs aus verschiedenen Mikroorganismen zu mischen und anzupassen die Möglichkeit der Entwicklung eines einzelnen Impfstoffs, der gegen multiple Bakterien schützt. Die neuesten klinischen Studien mit einem neuen Spaltvakzine gegen Keuchhusten, bestehend aus gereinigten Bordatella Pertussis MSCRAMMs faserartigem Hemagglutinin und Pertactin, zusätzlich zu inaktivierten Pertussis-Toxin, sind ein wichtiges Beispiel für den Erfolg dieser Art des Ansatzes. Für mehrere Versionen der neuen azellulären Impfstoffe ist gezeigt worden, dass sie sicher und effektiver sind, als die alten Impfstoffe, welche gesamte bakterielle Zellen enthielten (Gerco et al., 1996; Gustaffson et al., 1996).
4.23 Derzeitige S. Aureus-Impfstoffkomponenten
Die Entwicklung von Penicillin, um S. Aureus zu bekämpfen, war ein großer Fortschritt in der Kontrolle und Behandlung von Infektionen. Unglücklicherweise tauchten sehr schnell Penicillin-resistente Organismen auf und der Bedarf nach neuen Antibiotika war überragend. Mit jeder Einführung von neuen Antibiotika war S. Aureus imstande, dem mit Beta-Lactamasen, veränderten Penicillin-Bindungsproteine und mutierten Zellmembranproteinen entgegenzuwirken, was dem Bakterium ermöglichte zu bestehen. Somit haben sich Methicillin-resistente S. Aureus (MRSA) und Multidrug-resistente Organismen gebildet und bedeutende Stützen in den Hospitälern und Schwesternheimen rund um die Welt gebildet.
Die Immunität gegenüber S. Aureus-Infektionen bleibt schlecht verstanden. Üblicherweise zeigen gesunde Menschen und Tiere einen hohen Grad von angeborener Resistenz gegenüber S. Aureus-Infektionen. Der Schutz wird dem intakten Epithel und Mucosabarierren und normalen zellulären und humoralen Antworten zugeschrieben. Titer von Antikörpern gegen S. Aureus-Komponenten sind nach einer schlimmen Infektion erhöht (Ryding et al. 1995), dennoch sind bis heute keine serologischen Beweise einer Korrelation zwischen Antikörperlitern und humaner Immunität vorhanden.
Über die letzten verschiedenen Jahrzehnte sind lebende, Hitze-getötete und Formalin-fixierte Präparate von S. Aureus Zellen als Impfstoffe getestet worden, um Staphylokokken-Infektionen vorzubeugen. Eine multizentrische klinische Studie wurde geplant, um die Effekte von kommerziellen Impfstoffen, bestehend aus einem Staphylokokken Toxoid und gesamten getöteten Staphylokokken, auf die Inzidenz von Peritonitis, Ausstrittsstelleninfektionen und dem nasalen Transport von S. Aureus unter ständigen peritoneale Dialysepatienten (Poole-Warren et al., 1991). Obwohl die Immunisierung mit dem Impfstoff eine Erhöhung der Menge von spezifischen Antikörpern gegen S. Aureus auslöste, war die Inzidenz der Peritonitis unbeeinflußt. In ähnlicher Weise konnte die Immunisierung von Kaninchen mit gesamten Zellen von S. Aureus nicht die Entwicklung der experimentellen Endokarditis vorbeugen oder irgendeine Phase ändern, die Inzidenz von Nierenabzeß reduzieren oder die bakterielle Last in infizierten Nieren vermindern (Greenberg et al., 1987).
Derzeit gibt es keine FDA-zugelassenen Impfstoffe für die Prävention von S. Aureus-Infektionen (Foster 1991). Dennoch wird ein S. Aureus-Impfstoff (StaphVAX), der auf Kapselpolysacchariden basierent, derzeit durch die NABI (North American Biologicals Inc.) entwickelt. Dieser Impfstoff besteht aus Typ 5 oder Typ 8 Kapselpolysacchariden, die an Pseudomonas Aeruginosa Exotoxin A (rEPA) konjugiert worden sind. Der Impfstoff ist entwickelt worden, um typspezifische Opsonin-Antikörper zu induzieren und die Opsonophagocytose zu erhöhen (Karakawa et al., 1988). Durch die Verwendung eines raffiniert tödlichen Test Mausmodells (refined lethal challenge mouse model) (Fattom et al. 1996) ist gezeigt worden, dass die intraperitoneale Infusion von Typ 5 spezifischen IgG die Mortalität von Mäusen reduziert, die intraperitoneal mit S. Aureus beimpft worden sind. Die Typ 5 Kapselpolysaccharide-rEPA-Impfstoffe sind auch verwendet worden, um 17 Patienten mit Endstadium-Nierenerkrankungen zu impfen (Welch et al. 1996). Das Geometrische Mittel (GM) der IgG-Antikörpermengen gegen Typ 5-Konjugate stieg zwischen das 13 und 17-fache nach der ersten Immunisierung an, dennoch konnten keinen zusätzlichen Zunahmen nach zusätzlichen Injektionen detektiert werden. Interessanterweise waren die GM IgM-Mengen der geimpften Patienten signifikant niedriger als die der Kontrollpersonen. Unterstützt durch Tierstudien haben die Impfstoffe kürzlich eine Phase II Studie in ständig ambulanten peritoneal Dialysepatienten beendet. Die klinische Studie zeigte, dass die Vaccine sicher sind, aber ineffektiv in der Prävention der einer Staphylokokken Infektion (NABI SEC FORM 10-K405, 12/31/95). Zwei mögliche Erklärungen für die Unfähigkeit von StaphVAX den Infektionen, die zu peritonealer Dialyse in den geimpften Patienten in Beziehung stehen, vorzubeugen, sind, dass die Immunogenität der Impfstoffe aufgrund suboptimaler Impfstoffdosierung zu gering war oder dass Antikörper im Blutkreislauf nicht in der Lage waren, die Infektion in bestimmten anatomischen Gebieten anzugreifen, wie zum Beispiel dem Peritoneum.
4.24 Die Verwendung von S. Aureus-CBP als eine Impfstoffkomponente 4.24.1 Sepsis
Die mit Gram-positiven Bakterien in Beziehung stehende Sepsis nimmt zu. In der Tat werden zwischen einem Drittel und der Hälfte aller Fälle von Sepsis durch Gram-positive Bakterien verursacht, insbesondere S. Aureus und S. Epidermidis. In den Vereinigten Staaten wird geschätzt, dass über 200.000 Patienten eine mit Gram-positiven in Beziehung stehende Sepsis indiesem Jahr entwickeln. Durch die Verwendung eines Mausmodells (Bremell et al. 1991) haben die Erfinder deutlicht gezeigt, dass die aktive Immunisierung mit M55 Domänen (SEQ ID Nr: 2) der Col-bindenden MSCRAMM Mäuse gegen Sepsis-induzierten Tod schützen kann. Die Mäuse wurden subkutan entweder mit M55 oder mit einem Kontrollantigen (Rinderserum-Albumin) immunisiert und dann mit intravenösem S. Aureus befallen. 83 % (35/42) der mit M55 immunisierten Mäuse überlebte im Vergleich zu nur 27 % der BSA-immunisierten Mäuse (12/45). Dies ist eine Zusammenstellung von drei separaten Studien.
4.25 Herstellung eines Prototypen eines auf MSCRAMM basierenden multivalenten Impfstoffs
Eine Serie von rekombinanten Proteinen, welche die Domänen von Col, Fn und Fbg-bindenden MSCRAMMs darstellen, wurden in E. Coli überexprimiert und durch Metallchelat-bildende Chromatographie, wie vorher beschrieben wurde, gereinigt (Joh et al., 1994; McDevitt et al., 1994; Patti et al., 1995): (1) Aminosäuren, enthalten in der rekombinanten CBP M17; SEQ ID Nr: 6); (2) Aminosäuren, enthalten in den rekombinanten Fib-bindenden MSCRAMM (pCF33), und (3) Aminosäuren, enthalten in dem rekombinanten Fibronectin-bindenden MSCRAMM (pQD).
5. Beispiele
Die folgenden Beispiele sind eingefügt worden, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darzustellen. Es sollte von jenen auf dem Fachgebiet verstanden werden, dass die in den Beispielen offenbarten Techniken, welche Folgen, um die durch die Erfinder aufgefundenen Techniken darzustellen, sehr gut in der Ausübung der Erfindung funktionieren, und somit in Betracht kommen, bevorzugte Verfahren für seine Ausübung darzustellen. Dennoch sollten die Fachmänner im Lichte der vorliegenden Offenbarung verstehen, dass viele Änderungen in den spezifischen Ausführungsformen gemacht werden können, welche offenbart sind und dennoch ein gleiches oder ähnliches Ergebnis ergeben, ohne sich vom Geist und Umfang der Erfindung zu entfernen.
5.1 Beispiel 1 – Entscheidende Reste in der Liganden-Bindungsstelle von S. Aureus-CBP
Eine separate Col-Bindungsstelle ist innerhalb des S. Aureus-Col-Adhesin identifiziert worden, welches in einer Region zwischen den Aminosäuren Asp²⁰ ⁹ und Tyr²³³ lokalisiert ist. Polyklonale Antikörper, die gegen eine rekombinante Form des Col-Adhesins erzeugt worden sind, inhibieren die Bindung von Typ II-Col an S. Aureus. Wenn überlappende synthetische Peptide, die die Segmente von den Adhesinfragmenten imitieren, auf ihre Fähigkeit hin getestet wurden, die inhibitorische Aktivität von dem Antikörper zu neutralisieren, wurde nur ein Peptid, CBD4 gefunden, das aktiv war. CBD4 hat direkt an Col gebunden und inhibitierte in hohen Konzentrationen die Bindung von Col an S. Aureus. Ein synthetisches Peptidderivat von CBD4, welchem die 2 Carboxyl-terminalen Reste (Asn²³², Tyr²³³) fehlen, hatte eine nur minimale inhibitorische Aktivität. Die Bedeutung dieser Reste für die Col-Bindung wurde durch biospezifische Interaktionsanalysen bestätigt. Mutante Adhesinproteine N²³² → A und Y²³³→ A zeigten drastische Änderungen in der Col-Bindungsaktivität. Die dominante Dissoziationsrate für die Bindung von mutanten Adhesinproteinen N²³² → A an immobilisiertes Col II geht nahezu um das zehnfache zurück, während die Y²³³ → A und die Doppelmutante eine noch signifikantere Abnahme in der Affinität und dem scheinbaren Bindungsverhältnis zeigte, im Vergleich zu dem Wild-Typ-Protein.
5.1.1 Polyklonales IGG gegen MSCRAMM-Fragmente inhibieren die Col-Bindung an S. Aureus
Studien wurden durchgeführt, um die Ligandenbindungsstelle von S. Aureus CBP durch Bestimmung der Bindungsaktivität von rekombinanten MSCRAMM-Fragmenten mit stufenweise abnehmender Größer zu identifizieren. Verkürzungen über ein 168-Aminosäuren langes Segment (CBD(151–318) hinaus haben einem Verlust der Col-Bindungsaktivität zur Folge, aber betrafen auch die Faltung der resultierenden Proteine, wie durch CD-Spektroskopie gezeigt worden ist. Somit ist es möglich, dass die Ligandenbindungsstelle auch innerhalb des kurzen Segments von CBD(151–318) enthalten ist, aber aufgrund der ungenügenden Faltung von dem Protein die Col-Bindungsstelle nicht in aktiver Form ist. Um diese Möglichkeit zu untersuchen wurde ein Antikörper-Inhibitions-Neutralisiationsansatz entwickelt. Eine ähnliche Strategie wurde erfolgreich verwendet, um die Reinigung des nativen CBP aus S. Aureus Zellen zu überwachen (Switalski et al., 1989). Um einen inhibierenden Antikörper zu generieren, CBD(151–297), wurde eine rekombinante Version von dem größten Segment, das nicht an Col bindet und eine geänderte Konfirmation zeigte, als Antigen verwendet. Auf diesem Wege wurde die Generierung inhibierender Antikörper, welche die konformativen abhängigen Epitope erkennen, minimiert. Ein inhibierender monoklonaler Antikörper, der gegen ein biologisch aktives CBP generiert worden ist, erkannte ein von der Konformation abhängiges Epitop und wurde auf die Verwendung in der Identifikation der Bindungsstelle eingeschränkt.
Kaninchen wurden mit CBD(157–297) wie beschrieben immunisiert. Seren wurden auch vor der Immunisierung gesammelt und auf Reaktivität gegenüber CBD(151–297) getestet. Die Reaktivität des Antiserums mit verschiedenen Segmenten von CBD(151–297) wurde in einem ELISA getestet, indem eine Serie von acht 25 Aminosäure langen synthetischen Peptiden mit teilweise überlappenden Sequenzen als Targets verwendet wurde. Gereinigtes IgG reagierte stark mit den Peptiden 2, 3, 5, 6 und 7, und schwach mit den Peptiden 1,4 und 8. Wenn das Vorimmun-IgG mit den CBP-Peptiden getestet wurde, konnte nur eine geringe Reaktion detektiert werden. Die relative immunologische Reaktivität der verschiedenen Peptide korrelierte eng mit ihren Antigenindex, unter Verwendung des Algorithmus von Jameson und Wolf (1988).
Gereinigtes αCBD(151–297) IgG inhibierte die Bindung von S. Aureus an ¹²⁵I-markierten Col in einer Dosis-abhängigen Art und Weise. Die Menge von ¹²⁵I-Col, gebunden durch 10⁸ bakterielle Zellen, wurde über 50 % durch 5 μg reduziert und im Wesentlichen vollständig durch 10 μg von dem gereinigten Immun-IgG inhibiert. Umgekehrt hatten Antikörper aus gereinigten Präimmunseren keine signifikante inhibitorische Aktivität. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die αCBD(151–297)-Antikörper ein Epitop an oder nahe der aktiven Stelle von MSCRAMM erkennen, dadurch die Col-Bindung inhibieren oder sterisch in die Col-Bindung eingreifen.
5.1.2 Synthetische Peptide neutralisieren die inhibitorische Aktivität von αCBD(151–297) IGG
Die verschiedenen oben beschriebenen synthetischen CBD-Peptide, für welche gezeigt wurde, mit dem αCBD(151–297) IgG zu reagieren, wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die inhibitorische Aktivität von dem Antikörper zu neutralisieren. Das αCBD(151–297) IgG (12 μg) wurde mit einer einzigen Dosis (100 μg) von jedem Peptid in einem Schritt vorinkubiert. Die S. Aureus-Zellen wurden dann hinzugefügt und die Vorinkubation fortgesetzt. Schließlich wurde das ¹²⁵I-markierte Typ-II-Col hinzugefügt. Das Peptid CBD4 neutralisierte 68% der inhibitoriscen Aktivität des αCBD(151–297) IgG, während die anderen untersuchten Peptide nur einen geringen oder gar keinen Effekt hatten. Diese Ergebnisse zeigen, dass nur Antikörper, welche Epitope erkennen, die in CBD4 vorhanden sind, fähig sind, die Col-Bindung an Bakterien zu inhibieren. Obwohl andere Peptidsequenzen noch immunogener sind als CBD4, waren die Antikörper, welche die korrespondierenden Epitope erkennen, nicht inhibitorisch. Diese Daten zeigen an, dass die Ligandenbindungsstelle des MSCRAMM nahe oder innerhalb der Sequenz lokalisiert ist, welche in dem Peptid CBD4 enthalten ist.
Um die Interaktion zwischen dem Peptid CBD4 und αCBD(151–297) IgG und seine Beeinflussung auf die Col-Bindung zu untersuchen, wurde eine festgelegte Konzentration von dem Antikörper mit einer zunehmenden Menge des Peptids CBD4 inkubiert. Um den Assay noch sensitiver zu gestalten, wurde eine αCBD(151–297) IgG-Konzentration (12 μg/ml) gewählt, welche in einer 50%-igen Reduktion der Col-Bindung an 10⁸ S. Aureus Zellen resultiert. Auf diese Weise konnte eine relativ geringe Reduktion in der Inhibition leicht detektiert werden. Bei geringen Konzentrationen scheint das Peptid die inhibitorische Aktivität zu neutralisieren, und in dieser Studie stellten 100 μg des Peptids CBD4 die Level der Col-Bindung an S. Aureus wieder her, die in Abwesenheit von αCBD(151–297) IgG beobachtet wurden. Ein wenig überraschend hatte die Zugabe von mehr CBD4Peptid eine dosisabhängige Abnahme der Col-Bindung an S. Aureus zur Folge.
5.1.3 Das Peptid CBD4 inhibiert direkt die Col-Bindung an S. Aureus
Um die Rolle der Aminosäuren 209–233 in der Col-Bindung zu bestimmen, wurde das Peptid CBD4 auf seine Fähigkeit hin getestet, direkt die Bindung von ¹²⁵I-Col an S. Aureus zu inhibieren. Auch das Peptid CBD7, welches stark mit αCBD(151–297) IgG in dem ELISA-Assay reagierte, wurde getestet. Wenn zunehmende Mengen von dem Peptid CBD4 mit ¹²⁵I-Col vor der Zugabe von S. Aureus inkubiert wurden, wurde die Bindung an Col in einer dosisabhängigen Art und Weise inhibiert. 5 μM CBD4 inhibierten die Bindung über 50%. Das Peptid CBD7 hatte keinen inhibitorischen Effekt, wenn es mit ¹²⁵I-Col vorinkubiert wurde. Diese Daten legen nahe, dass das Peptid CBD4 lösliches ¹²⁵I-Col binden kann und das CBD4 Reste enthält, die die Col-Bindungsstelle innerhalb des MSCRAMM-Proteins darstellen.
5.1.4 Kritische CBD4-Reste, die für die Col-Bindungsaktivität erforderlich sind
Um die Reste innerhalb des CBD4 zu identifizieren, welche für die Col-Bindung notwendig sind, wurden mehrere synthetische kleinere, überlappende Peptide synthetisiert. Eine Serie von Peptiden, die 2-Amino-terminalen Reste umfasst und ein Peptid, das eine Deletion von 2-Aminosäuren am Carboxyl-Terminus umfasst, wurden hergestellt. Die Peptide (10 μM) wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Bindung von ¹²⁵I-markierten Col an S. Aureus zu inhibieren. Das Peptid CBD4 inhibierte die Col-Bindung zu 76 %, wohingegen alle Peptide, welche die aminoterminale Verkürzung umfassen, nur eine geringe Aktivität bei den untersuchten Konzentrationen zeigten. Diese Daten zeigen, dass, wenn weniger als 5 Reste aus Peptiden mit einer aktiven Stelle entfernt werden, die Fähigkeit, Col zu binden, verlorenen geht. Darüber hinaus hat die Deletion von 2 Carboxyl-terminalen Aminosäuren einen vollständigen Verlust der biologischen Aktivität zur Folge. Das zeigt, dass die Aminosäuren am C-Terminus von CBD4, Asn²³² und Tyr²³³ oder beide integrale Elemente der aktiven Stelle von CBP sind.
5.1.5 Col-Bindungsaktivität von definierten MSCRAMM-Mutanten
Die Bedeutung der Aminosäurereste Asn²³² und Tyr²³³ in dem MSCRAMM für die Col-Bindung wurde durch den Entwurf spezifischer Mutanten von CBD (30–529) und durch die Charakterisierung der Wechselwirkung dieser Mutanten mit immobilisierten Typ-II-Col durch Verwendung von BIAcore untersucht. In den hergestellten Mutationen wurden die identifizierten Aminosäurereste einzeln durch Alanin (N²³² → A, Y²³³ → A) oder als ein Paar, (N²³²→ Y²³³ → A) ersetzt, einem Rest, von dem nicht erwartet wird, mit der bestehenden Sekundärstruktur zu interferieren. Die korrespondierenden Basenänderungen wurden durch Verwendung der beschriebenen Overlap Extensions PCR^TM gemacht und die Sequenzänderungen wurden experimentell bestätigt. Die rekombinanten Proteine, welche die Mutationen enthalten, wurden bis zur Homogenität mit Metal-Ionen-Chelatbildungs-Chromatographie gereinigt. Strukturelle Analysen von dem isolierten Protein durch Nah- und Fern-UV CD-Spektroskopie weist darauf hin, dass keine signifikanten Anderungen in der Sekundär- oder Tertiärstruktur als Folge der Mutation aufgetreten sind.
Unter den beschriebenen Bedingungen zeigte CBD (30–529) eine komplexe multiphasische Wechselwirkung, wenn durch Verwendung des BIAcore analysiert wurde. Ein echtes Gleichgewicht wurde während der Zeitdauer der Injektion aufgrund der geringen Dissoziationsrate (k_off) nicht erreicht. Die Assoziationsphase zeigte eine multiphasische Bindung mit einer Interaktion, die durch einen schnellen k_off, sichtbar beim Start der Injektion, charakterisiert ist, gefolgt durch eine zweite Phase, charakterisiert durch einen viel langsameren k_off. Die Dissoziationsphase gibt Informationen über den k_off, diese Rate ist unabhängig von der Anzahl der Bindungsstellen, der Analytkonzentration und der Flußrate. Die Analyse dieser Daten zeigt zumindest eine Drei-Komponenten-Dissoziation mit den zwei schnellsten Raten größer als 10^–2 s^–1 an und die langsamste k_off bei 5 × 10^–4 s^–1. Die Assoziationsphase enthält die Information um die Assoziationsrate k_off der Interaktion zu bestimmen, wird aber auch durch die Dissotiationsrate, der Anzahl der Bindungsstellen für jede Interaktion und der Konzentration des Analyts beeinflußt. Auf Grund der Komplexität dieser Interaktion und der Abwesenheit von meßbaren Gleichleichgewichtsdaten, war es nicht möglich, die Bindungskonstante (K_D), scheinbare Bindungsverhältnis (BR_app) und k_on zu bestimmen.
Im Vergleich der drei mutanten Proteine mit dem Wildtyp CBD(30–529) ist es leicht ersichtlich, dass jede von den eingefügten Mutationen die Col Bindungsfähigkeiten der generierten Proteine beeinflußt. Während die Form des Bindungssensogram im Wesentlichen das Gleiche für die Mutante N²³² → A bleibt, weist die Analyse der Dissotiationsphase darauf hin, dass die langsamste Dissotiationsrate auf das nahezu 10fache angestiegen ist. Obwohl eine Dissasotiationskonstante (K_D) nicht bestimmt werden konnte, scheint es, dass die Affinität dieser Mutante für Typ II Col auch durch diese Mutation beeinflußt worden ist. Sowohl die Y^{233 →} A als auch die Doppelmutante binden immobilisiertes Typ II. Die Analyse der Daten, die mit der Doppelmutante erhalten wurden, ergeben eine monophasische Bindungskonstante, wenn durch entweder Scatchard-Analyse oder Equation 1 bewertet wurde. Darüber hinaus hat das BR_app um annähernd 2 bis 3 hoch affine Stellen abgenommen.
Aus den Biosensor Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Reste Asn²³² und Tyr²³³ sehr wichtig für sowohl die Affinität, als auch der Spezifität der CBD(30–529) Bindung an Typ II Col sind. Jedoch scheint kein additiver Effekt der Doppelmutation vorhanden zu sein, wenn mit den einfachen Mutationen verglichen wird.
5.2 Beispiel 2 – Struktur der Col-Bindungsdomäne aus dem S. Aureus CBP
Die hier dargestellte strukturelle Basis für das Trageting auf Wirtsgewebe durch S. Aureus zeigt, dass die Col-Bindungsdomäne CBP (151–318) sehr gut konstruiert wurde, um mit den dreifach helikalen Col-Strukturen zu intergieren. Die Bindungsgrenzfläche der Domäne ist entlang einer Furche auf einem konkaven β-Faltblatt eingebaut und hat eine erhebliche geometrische und chemische Komplementarität zu dem Col helikalen Segment, welches vier Repeats von Gly-Pro-Hyp oder Gly-Pro-Pro pro Kette enthält. Mutationsanalysen haben die vermeindlichen Col-Bindungsstellen bestätigt und weisen darauf hin, dass das einfache Andockmodel eine breitere Bedeutung haben kann. In diesem Model ist die Col-Trippel-Helix ihrerseits ein wichtiges Erkennungselement für das bakterielle Adhesin, welches die komplementären Bindungsstellen enthält. Dieses liefert eine strukturelle Erklärung für die früheren Beobachtungen der MSCRAMM Spezifität für tripel-helikale Strukturen (Speziale et al., 1986). Darüber hinaus scheinen die vorgeschlagenen Bindungsstellen auf dem Adhesin vielseitig zu sein, da sie eine entsprechende Vielfältigkeit ermöglichen, aber beschränkt durch strukturelle Komplementarität. Die allgemeine Gültigkeit dieses Models muß strukturelle Analysen der anderen Proteine, die an die Col-Tripel-Helix binden, abwarten.
5.2.1 Methoden
5.2.1.1 Kristallisation und Datenerhebung
Das rekombinante Polypeptid CBD (151-318) wurde durch die „hanging drop vapor" Diffusionsmethode durch Verwendung von PEG 4000 als Fällungsmittel, 50 mM HEPES Puffer zwischen pH 6,2 und 6,9 und dem Detergens n-Oktoyl-β-D-Glukopyranosid kristallisiert. Die Kristalle gehören zu der trigonalen Raumgruppe P3₂21 oder dem Enatiomorph P3₁21. Die Parameter der Elementarzelle sind a = 74,0 Å, b = 74,0 Å, c = 56,7 Å, α = 90°, β = 90°, γ = 120°. Es gibt ein Molekül pro asymmetrischer Einheit mit einem geschätzten solvent content von 44 %. Die Diffraktionsdaten wurden bei Raumtemperatur in einem Siemens Histar Area Detektor erhoben und mit einem X-GEN von Molecular Simulations Inc. bearbeitet. Eine Anzahl Datensets von potentiell schweren Atomabkömmlingen (potential heavy atom derivative data Sets) wurden erhoben, dennoch waren nur HgCL₂ und K₂PtCl₄ Derivative für das MIR Phasing verwendbar.
5.2.1.2 Strukturauflösung und Verbesserung
Die Phasenauflösung (phasing solution) mit der Rechtshändigkeit war konsistent mit der Raumgruppe P3₂21 und stellte eine interpretierbare Abbildung bereit. Die solvent flattened MIR Abbildungen bei 3 Å Auflösung zeigte wichtige Merkmale der Struktur und war für sowohl die Kettenverfolgung als auch des Sequenzabgleichs geeignet. Von der abgeleiteten Sequenz von 168 Aminosäuren wurden 150 Reste zwischen 169–318 mit der Abbildung abgeglichen. Das anfängliche Model wurde bei einer 2,4 Å Auflösung mit X-PLOR (Brunger, 1992) verfeinert, indem ein Konjugatgradient-Minimierung, MIR Phasenbeschränkung (MIR phases constraints) und F > 2σ_F verwendet wurde. Auf dieser Stufe war der R-Faktor und R-Free jeweils 34,3 % und 41,4 %. Das Model wurde durch einige Zyklen von simulierter Annealingverbesserung und manuellem Model-Building weiter verbessert. Vor der Zugabe von Wassermolekülen wurde die isotropischen Temperaturfaktoren der einzelnen nichthydrogenen Atome verfeinert und der R-Faktor und R-Free auf jeweils 25,3 % und 31,3 gesenkt, für die Auslösungsrandzone (resolution shell) 10,0 bis 2,0 Å. Wassermoleküle wurden in die FO-FC Abbildung bei 3σ Level eingepasst. Einige finale Runden der Konjugatgradient-Minimierung und manuellem Model-Building resultierten in einem R-Faktor von 20,0 % und einem R-Free von 24,9 %. Die Atomkoordinaten der Kristallstruktur werden in der Proteindatenbank hinterlegt.
5.2.1.3 Dockingsuche
In Kürze, Punktoberflächen (Connolly, 1993) mit normalen Vektoren wurden für das Target und die Probe jeweils kalkuliert und in Flächenwürfel (surface cubes) und internen Würfeln (interior cubes) geteilt. Das nächste Atom zu jedem Punkt bestimmt die chemische Neigung, dargestellt durch einen einfachen sechsfarbigen Kode. Der Rotationsraum der „gewürfelten" (cubed) Probe wird abgetastet und für jeden Rotationsschritt werden alle integeren Translationen der Probenwürfel (probe cubes) zu dem stationären Würfel (stationary cube) kalkuliert. Jede Translation der Probe wird gemäß der Übereinstimmung mit dem normalen Vektor, der Kompatibilität der Farbkodes und der überlappenden interner Würfel (interior cubes) gepunktet. Gebündelte Auflösungen mit den besten Punkten sind gemittelt und die korrespondierenden Rotationen und Translationen den Atomkoordinaten der Probe angelegt.
5.2.1.4 CD Spektren
Alle CD Spektren wurden durch Verwendung eines Jasco J720 Spektropolarimeters gesammelt, welcher mit einer 0,1 % (wt./vol.) 10-Kamphorsulfonsäure-D Lösung kalibriert wurde. Die Spektren wurden bei 25° C gemessen und 5 Scans wurden gemittelt. Eine 0,05 cm Weg lange Zelle wurde für das Nah-UV (250–320 nm) CD verwendet und eine 1 cm Weg lange Zelle wurde für das Fern-UV (190–250 nm) CD verwendet.
5.2.2 Strukturdeterminanten
Die Kristallstruktur von CBD (151–318) wurde durch Verwendung üblicher heavy atom/multipler Isomorphous Replacement Verfahren (MIR) bestimmt und wurde zu einem kristallograpischen R-Faktor von 20 % (R_Frce = 24,9 %) durch Verwendung von Difraktionszahlen zwischen 10,0 und 2,0 Å Auflösung (Tabelle 2) verfeinert. Die verfeinerten Modelle umfassen 150 Aminosäuren zwischen den Resten 169–318 und 74 Wassermoleküle. Die mittlere quadratische Abweichung (RMS) aus der idealen Bindungslänge ist 0,012 Å und die RMS Abweichung der idealen Winkel ist 1,625°. Das Model erreicht eine hohe in PROCHECK (Laskowski et al., 1993) Analyse und ein Ramachandran Plot von φ, Ψ Konformationswinkel hat keinen Ausreißer. Die Elektrondichte war von guter Qualität durch die Struktur und es waren acht ungeordnete (disordered) Seitenketten in dem finalen Model. Keine Elektronendichte wurde für die N-terminalen Reste 151–168 beobachtet.
5.2.3 Strukturbeschreibung
Die Molekülstruktur der rekombinanten Col-Bindungsdomäne ist sehr kompakt mit ungefähren Dimensionen von 55 × 35 × 25 Å. Die Polypeptidkette von CBD (169–318) ist zu einem topologischen Model einer „Biskuitrolle" („Jelly-roll") gefaltet (1) (Richardson, 1981). Die Sekundärstruktur der Domäne besteht aus 53 % β-Faltblättern, 39 % Coil-Strukturen und 8 % Helix. Es sind keine Disulfidbrücken oder freie Zysteine vorhanden. Die gesamte Domäne ist im Wesentlichen aus zwei β-Faltblättern zusammen gesetzt, die parallel zueinander, und zwei kleinen α-Helices (2). Die β-Faltblätter I und II bilden ein Sandwich mit einem großen hydrophoben Innenbereich. Die exponierte Seite des β-Faltblatts I hat einen konkaven Verlauf, wo hingegen das β-Faltblatt II eine konvexe Oberfläche hat. Es gibt fünf antiparallele Stränge in jedem β-Faltblatt; die Stränge D und J zeigen Auflockerungen mit einer weniger definierten Sekundärstruktur. Eine kleine Zwei-Turn α- Helix ist in dem crossover zwischen den Strängen E und F auf der breiteren Seite des Sandwichs vorhanden. Ein einzelner α-helikaler Turn ist in der Verbindung zwischen den Strängen G und H. Andere Verbindungen nehmen verschiedene Formen der gecoilten Struktur an. Drei geladene Reste, K176, D209 und E301, sind in dem Inneren des Moleküls verdeckt und sind in der Elektronendichtedarstellung wohl definiert. K176 und D209 werden durch N293 durch Wasserstoffbrücken überbrückt und der Rest E301 durch eine Wasserstoffbrücke an S199 gebunden. Die Kristall-Packung resultiert in großen solventen Kanälen (solvent channels), ungefähr 35 Å im Durchmesser, entlang der dreifachen Schraubenachsen (screw axes). Die Domänen sind entlang der Schraubenachsen gepackt, wobei das meiste des β-Faltblattes II den solventen Kanälen ausgesetzt ist.
Die Connollys Molekularoberfläche (Connolly, 1983) der CBD (169–318) Kristallstruktur zeigt eine sichtbare Furche auf dem β-Faltblatt I (3A), was auf eine mögliche Col-Bindungsdomäne hinweist. Diese Furche ist ungefähr 10 Å breit und erstreckt sich diagonal quer durch die Stränge D, H und B in ungefährer Richtung von T221-N196. Mit Ausnahme der ungeordneten N-terminalen Reste 169 und 170 eines Symmetrie-ähnlichen Models, gibt es keine signifikanten kurzen intermolekularen Kontakte der Reste in und um die Furche herum. Die äußeren Reste auf dem β-Faltblatt I, insbesondere K280, R189, F191, Y175, E197, S235, Y233, N225, T227 und K198 (3A) begrenzen und bilden die Wände der Furche. Die Reste N193, N223, S274 und N278, mit einem zugänglichen Oberflächengebiet kleiner als 20 Å², sind in der Furche bedeckt; wo hingegen N196 und S276 sich auch innerhalb der Furche befinden, aber relativ mehr exponiert (3A). Die einzigen hydrophoben Reste in der vermeidlichen Col-Bindungsregion sind V172, L181 und F191. Die geladenen Rest D179, E197, K198, D218 und K280 sind rund um die Ränder der Furche zusammen mit Y175 und Y233 lokalisiert, deren Phenolringe in Richtung auf das Innere der Furche gerichtet sind. Die Konformationen einiger Seitenketten sind durch Wasserstoffbrücken-Verbindungen stabilisiert, zum Beispiel R189 ist durch eine Wasserstoffbrücke an D179 gebunden, und K198 an S274. Es werden keine fest gebundenen Wassermoleküle auf dem β-Faltblatt I gefunden.
Für die Peptidsequenz D290–Y233 wurde zuvor gezeigt, dass sie wesentlich ist für die Col-Bindungsaktivität (Patti et al., 1995). In der Kristallstruktur erstreckt sich diese Sequenz über Strang D und Teilen von den Strängen C und E mit den äußeren Resten T221, N223, N225, T227 und Y233 in der vermeintlichen Col-Bindungsregion. Darüber hinaus zeigte die Mutation des Restes 233Y → A in der 55-kDa Domäne A des Col MSCRAMM eine dramatisch reduzierte Col-Bindungsaktivität (Patti et al., 1995).
5.2.4 Col-Docking
Bisherige Studien haben gezeigt, dass das Col bindende MSCRAMM von S. Aureus verschiedene Stellen in verschiedenen Col-Typen bindet (Patti et al., 1993), aber Kollagene in dreifach helikaler Form erkennt (Speziale et al., 1986); daher sollte die Col-Bindungsstelle innerhalb des MSCRAMM Vorkehrungen für die direkte Wechselwirkung mit einem tripelhelikalen Motiv haben. Kollagene sind in verschiedenen Graden in Abhängigkeit von dem Gewebe glykosyliert. Die Möglichkeit der Col-Bindung wurde durch die Kohlenhydrate durch ko-Kristallisation und dem Eintauchen von CBD (151–318) in jeweils Glukose, Galaktose und Laktose getestet. Obwohl ein isomorpher Kristall mit hoher Qualität erhalten wurde, zeigten abweichende Fourier-Darstellungen nicht jede nennenswerte Bindung der Kohlenhydrate. Die grundlegende tripel-helikale Konformation, ungefähr 15 Å im Durchmesser, besteht aus drei supergecoilten Polyprolin II Helices, die das Vorhandensein von Glyzinresten in jeder dritten Position der Sequenz erfordern. Dieses resultiert in ein (GLY-X-Y)_n Wiederholungsmuster, in welchem die X und Y Positionen häufig durch Prolin und 4-Hydroxyprolin (Hyp) Reste jeweils besetzt sind. Die Hydroxylgruppen der Hyp-Reste, die essentiell für die Strukturierung des Wassernetzwerks um die dreifachen Helices herum sind, spielen eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung des Col (Bella et al., 1994). Andere Aminosäuren in der X und Y Position folgen keinem klaren Muster. Das S. Aureus Col bindende MSCRAMM erkennt die synthetischen Peptide (Gly-Pro-Pro)_n und (Gly-Pro-Hyp)₁₀ (Speziale et al., 1986), welche dafür bekannt sind, eine Col-ähnliche dreifache Helix in Lösung zu bilden (Sakakibara et al., 1973; Heidemann und Roth, 1982). Umgekehrt erkennt der Rezeptor nicht Polyprolin, welches nicht die Col dreifach Helix bilden kann, oder (Gly-Ala-Pro)_n, welches in Lösung gecoiled ist (Segal und Traub, 1969). Vor der Biosensoranalyse der MSCRAMM Bindung an Typ II Col wurden viele Bindungsstellen mit verschiedenen Affinitäten für Col angedeutet. Insbesondere CBD (151–318) scheint zwei Klassen von Bindungsstellen zu erkennen mit den scheinbaren Dissotiationskonstanten von jeweils 3 × 10- und 3 × 10^–5 M (Patti et al., 1993). Es ist wahrscheinlich, dass das MSCRAMM mit einer höheren Affinität an spezifische Col Sequenzen bindet, aber die dreifach helikalen Strukturen der sich wiederholenden Gly-Pro-Pro/Hyp scheint ein allgemeines Bindungsmotiv darzustellen.
Die Kompaktheit und relativ geringen Größen der CBD (169-318) Domäne, die scheinbar enge Verbinding seiner β-Faltblätter, und zusätzlichen Informationen über die Adhesin-Spezifität für die dreifach helikalen Strukturen (Speziale et al., 1986) stellen eine einmalige Gelegenheit für systematische Dockingstudien zur Verfügung. Proben mit Gly-Pro-Pro/Hyp Wiederholungen wurden in der Durchsicht der gesamten molekularen Oberfläche der Col-Bindungsdomäne für Regionen mit geometrischer und chemischer Kompatibilität verwendet. Ein vorläufiges manuelles Docking des Col Models an CBD (169–318) weist darauf hin, dass die Oberfläche des β-Faltblatts I ein Fragment von bis zu vier Wiederholungen von Gly-Pro-Hyp oder Gly-Pro-Pro pro Kette aufnehmen kann. Vier Col Proben wurden aus der Proteindatenbank für die Dockingkalkulationen abgeleitet: IBBE (Nemethy et al., 1992), ein theoretisches Model von [(Gly-Pro-Pro)₄]₃, wo die Acetyl und Methylamin terminalen Gruppen beseitigt worden waren; 2CLG (Chen et al., 1991), ein theoretisches Model von [(Gly-Pro-Hyp)₁₂]₃, das zu [(Gly-Pro-Hyp)₄]₃ und zu [(Gly-Pro-Hyp)₆]₃ gekürzt worden war; und 1CAG (Bella et al., 1994), der Kristallstruktur eines Col ähnlichen Peptids [(Pro-Hyp-Gly)₄ Pro-Hyp-Ala (Pro-Hyp-Gly)₅]₃ gekürzt zu dem C-Terminalen [(Gly-Pro-Hyp)₄]₃. Das Andockziel (Docking Target) war die verbesserte Kristallstruktur von CBD (172–318), wobei die ungeordneten N-Terminalen Reste 169–171 ausgeschlossen waren. Das Docking wurde als eine vollständige sechsdimensionale Suche durchgeführt, in dem die Algorithmen der gepaarten Würfel (matching cubes algorithm) (Jiang und Kim, 1991) in das Programm SoftDock implementiert wurden. Die besten 16 Auflösungen wurden in jeder Suche beurteilt und Auflösungen mit den besten Punktzahlen wurden durchweg entlang der Furche auf dem β-Faltblatt I in Richtung T221-N196 gefunden. Col-Helices waren immer in dieser Richtung von N- zum C-Terminus orientiert. Die Docking Punktzahl wurde dramatisch schlechter, wenn in die Gegenrichtung forciert wurde. Scheinbar entspricht an dieser Stelle die Col-„Schraube" (Screw) dem Adhesin- „Gewinde" (Nut) (3B). Veränderungen der Probenlängen, der helikalen Parameter und der Prolinringkonfirmationen und das Vertauschen von Pro und Hyp an der Y-Position der Probe haben nur geringe Effekte auf die endgültigen Dockpositionen (docked positions). Sowohl die bildlichen als auch die berechneten Analysen weisen nicht auf beträchtliche Konflikte in den chemischen Neigungen und Atomabständen zwischen den Bindungsstellen und Col-Proben hin. Alle erfolgreich angedockten Komplexe sind Energie-minimierbar in X-PLOR (Brunger, 1992) mit einem geringen Verlust von regulärer Helizität und subtiler konformativen Änderungen in den Rezeptorseitenketten.
5.2.5 Mutationsanalysen
Mutationsanalysen wurden verwendet, um die putative Bindungsstelle, die durch die Dockingsuche definiert wurde, zu beurteilen. Oberflächenreste, die eine Abnahme in ihrer solvent accessible area zeigten, wurden als Ziel gesetzt (Tabelle 3 und 4). Das Oberflächengebiet, das durch das angedockte Col bedeckt wurde, ist ungefähr 1630 Å², was ungefähr 22 % der gesamten solvent accessible area von CBD (172–318) ausmacht. Es gibt 19 Reste an der Berührungsfläche, die eine Abnahme in der solvent accessible area über mehr als 10 Å² zeigten. Neun dieser Reste waren mutiert, als auch zwei zusätzliche Reste außerhalb der putativen Bindungsregion. Die Lysin und Alanin Mutationen an den Einzelmutationsorten wurden entwickelt, um die Oberfläche der putativen Col-Bindungsfurche des Wildtyps CBD (151–318) zu zerstören. Die mutanten Proteine zeigten keine signifikanten Änderungen in einer der beiden, der Kurz-UV oder der Lang-UV, Zirkulardichroismusspektren, im Vergleich zu dem rekombinanten Wildtyp; bestätigend, dass die verschiedenen Mutationen keinen meßbaren Effekt auf die Gesamtkonfirmation haben. Das MSCRAMM erkennt gewöhnliche dreifach helikale Strukturen (Speziale et al., 1986; Sakakibara et al., 1973; Heidemann und Roth, 1982), daher wurden Änderungen in der low Affinity Dissotiationskonstante verwendet, um Änderungen in der Bindung der mutanten Proteine zu beurteilen (House-Pompeo et al., 1994).
Für die Mutanten 212Q → A, 232N → A, 221T → K und 225N → K (Tabelle 3) unterschied sich die Col-Bindungsaktivität, als scheinbare Dissotiationskonstante K_D (apparent dissociation constant K_D) ausgedrückt, nicht signifikant von der eines Wildtyps CBD (151–218). Der Rest Q212 ist auf dem β-Faltblatt II lokalisiert, weit entfernt von der vorgeschlagenen Bindungsstelle und wurde als Kontrollrest mutiert. Dieses zeigte keine signifikante Änderung in der Affinität für das Col. Die Seitenkette von N232 ist nicht Teil der Bindungsprobe (3A und 4) und zeigt keine Abnahme in der solvent accessible area auf das Andocken von dem Col. Im Einklang hiermit hatte die Mutation 232N → A in CBD (151–318) einen sehr kleinen Effekt auf die Col Bindung. Die Reste T221 und N225 sind am Rande befindliche Reste der Bindungsfurche mit relativ kleinen Seitenketten. Modellierungsstudien zeigen, dass die Lysin-Seitenketten an den Positionen 221 und 225 Konformationen einführen, welche keine Auswirkungen auf Col-Proben haben und in die solvent region zeigen.
Mutationsort spezifische Änderungen der Reste N193, N223 und N278 in Lysin-Reste resultierten in rekombinante Proteine mit einer signifikant verminderten Affinität für Col. Diese Stellen befinden sich im Inneren der BindungsFurche und, gemäß dem Andockmodel, sind sie praktischer Weise durch das gebundene Col verdeckt. Infolgedessen haben die Lysin-Seitenketten an diesen Stellen weniger Konformationsfreiheit und können das Adhesin sterisch von der Annahme einer geeigneten Position entlang der Col-Helix abhalten. Eine signifikant höhere Dissotiationskonstante für 193N → K, verglichen mit zwei anderen Mutationen, können seiner Nähe zu der putativen „Wand" der Col Bindungsfurche und den kritischen Resten Y175 und F191 zugeschrieben werden.
Mutationen in den Positionen Y233, F191, R189 und Y175 resultieren in Proteine mit einer extrem geringen Affinität für Col, verglichen zum Wildtyp CBD (151–318), was darauf hindeutet, dass diese einige der wichtigen bestimmenden Faktoren für die Col-Bindung sind. Alle vier Mutationsstellen umfassen große, relative exponierte Reste, welche die Seitenwände der putativen Bindungsfurche bilden. Die größte Abnahme in der solvent accessible area auf das Col-Docking ist für Y233 zu beobachten und Modelierungsstudien haben eine Anzahl von Kontakten mit Col-Sonden für diesen Rest nahegelegt. Obwohl die Reste R189 und Y175 relativ wenige Kontakte mit den angedocken Col-Sonden zeigten, zerstört die Mutation dieser Reste im Wesentlichen die Col-Bindung mit K_D Werten annähernd dem Millimolar Bereich. Die Ergebnisse für diese beiden Reste können die Einfachheit der Sonden wiedergeben, die in dem Modelling verwendet wurden und eventuelle Optimierungen in ihrem Docking. Es ist wichtig zu erwähnen, dass obwohl gewöhnliche Peptide in den Andockstudien verwendet wurden, die Biosensoranalysen der Orts-spezifischen Mutationen einen hohen Grad der Korrelation mit nativem Col-Typ II zeigen.
Die Mutationsanalyse zeigt zwei allgemeine Trends. Die Lys/Ala Mutation der großen Reste, welche die Wände der Bindungsfurche bilden, beeinflußt dramatisch die Affinität des Adhesins an Col. Die Mutation kleiner Reste, die innerhalb der Furche oder nahe seiner Wände gefunden werden, zeigten moderate bis gar keinen Effekt auf die Bindung. Insgesamt sind die Ergebnisse der Mutationsanalysen in guter Übereinstimmung mit den Wechselwirkungen, die in dem Col-Bindungsmodel gesehen wurden, abgeleitet aus dem systematischen Andocken der gewöhnlichen Col-Sonden. Die Bindung des nativen Col wird einige nicht-prolin Reste in X/Y Positionen umfassen. Weitere Modellierungsstudien weisen darauf hin, dass, zusätzlich zu der Erkennung der generischen Triplets, die Bindungsstelle von CBD (151–318) auch andere kleine nicht-Prolin Reste aufnehmen kann. Die vorherrschende Verteilung der kleinen polaren Reste (Thr, Asn und Ser) in der Bindungsfurche könnten möglicherweise die notwendige Hydration in stabilisierende Hydroxyproline imitieren. Darüber hinaus können sie sterisch die Bindung der vorgeschlagenen diversen Reste in der Col-Sequenz vereinfachen. Somit ist es möglich, dass spezifische Col-Sequenzen besser binden können als die generischen Tripletts, die in den Andockungsstudien verwendet wurden, und können die beobachtete höher affinen Bindungsstellen in Col II bedingen (Patti et al., 1993).
Tabelle 2

¹R_SYM = Σ_hΣ_i|I(h) – I_i(h)|/Σh Σ_i I(h), wobei I_i(h) und I(h) die i-th und die arithmetischen Messungen der Intensität der Reflekion h sind.
² R_MERGE = in Σ_h|F_p(h) – F_PH(h)|Σ F_p(h), wobei F_p(h) und F_PH(h) beobachtete nativ und skalierte Derivative Struktur Faktoren (scaled derivative factors) der Reflexion h sind.
³ Phasung Power ist das Verhältnis mttleren quadratischen Abweichung (root mean square 'RMS' deviation) der kalkulierten heavy-atom Struktur Amplitude z dem RMS des Mangels an Auflösung (lack of closure).
⁴R_CULLIS = Σ|||F_PH|_OBS – |F_P|_OBS – |F_H|_CALC|/Σ||F_PH|_OBS + |F_P|_OBS|, wobei F_PH und F_P die beoachteten Struktur Faktor Amplituden für die heavy atom Derivative und das nativen Daten-Set sind, mit Summe aller zentrischen Reflexionen und F_H der heavy atom Struktur Faktor ist.
⁵R_KRAUT = Σ||F_PH|_OBS – Σ|F_PH|_CALC|/Σ|F_PH|_OBS mit der Summe aller azentrischen Reflexionen
⁶ Gesamtleistungszahl (figure of merit) ist 0,662.

Tabelle 3
Die scheinbare Dissotiationskonstante (K_D) (apparent dissociation constant K_D) und die ungefähren Bindungsverhältnisse (BR) für die Bindung von CBD (151–318) und die korrespondierenden Mutanten zu dem Col-Typ II, wie durch Biosensoranalysen bestimmt worden ist. Eine Reihe von Verdünnungen eines jeden Proteins, jeweils Wildtyp und Mutanten, wurden über covalent immobiliertes Typ II Col [Sigma] gegeben. Die Equilibrium-Bindungsantwort nach 10 Sekunden Injektion wurde verwendet, um die Konstanten zu kalkulieren (Patti et al., 1995; House-Pompeo et al., 1994).
5.3 Beispiel 3 – Passive Immunisierung durch Verwendung von Epitopen von MSCRAMMs
Unterstrichene Aminosäuren wurden in dem Vektor pQE^TM-30 (Qiagen Inc. Chatsworth, CA) kodiert.
5.3.1 S. Aureus Col bindendes MSCRAMM Derivat M17 (SEQ ID NO: 2)
5.3.2 S. Aureus CBP Epitope M17 DNA (SEQ ID NO: 1)
5.3.3 S. Aureus Col bindendes MSCRAMM Derivat M31 (SEQ ID NO: 4)
5.3.4 S. Aureus CBP Epitope M31 DNA (SEQ ID NO: 3)
5.3.5 S. Aureus Col bindendes MSCRAMM Derivat M55 (SEQ ID NO: 6)
5.3.6 S. Aupeus CBP Epitope M55 DNA (SEQ ID NO: 5)
5.3.7 S. Aureus FIB bindendes MSCRAMM Derivat _PCF33 (SEQ ID NO: 7)
5.3.8 S. Aureus Fibronektin bindendes MSCRAMM Derivat _PQD (SEQ ID NO: 8)
5.3.9 Verwendung der gereinigten Polyclonalen Kaninchen Hyperimmun anti-MSCRAMM IgG in der passiven Immunisierung
5.3.9.1 Rindermastitis
Einige Studien haben nahe gelegt, dass die Zerstörung der Epithelzellen und die Exposition der ECM Moleküle innerhalb der Brustwarzenkanalöffnung und der Brustwarze kritische Faktoren sind, die zu der Entwicklung einer Mastitis führen (Gudding et al. 1984; Olmsted and Norcross 1992; Cifrian et al. 1995). Die S. Aureus Adhesion an Brustdrüsengewebe wird als erster Schritt in der Entwicklung einer Mastitis angesehen. Daher sind Adhesine, die die S. Aureus Bindung an das Rinderbrustdrüsengewebe vermitteln, entscheidende Ziele für die Entwicklung von blockierenden Antikörpern. Polyklonale Hyperimmun Antikörper, die gegen einige MSCRAMMs generiert worden sind, sind auf ihre Fähigkeit hin analysiert worden, die Bindung des S. Aureus Stammes M60 an kultivierte Rinderbrustsekretions-Epithelzellen zu inhibieren. Eine Dosisabhängige Abnahme in der Anhaftung von S. Aureus wurde mit dem polyklonalen Kaninchen Anti-MSCRAMM IgG gegen die CBPs der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 gezeigt.
5.3.9.2 Experimentelle Details
In Kürze, 5 × 10⁴ sekretorische Epithelzellen wurden in 100 μl Kulturmedium einer flachbodigen, Col-beschichteten 96-Lochplatte hinzugefügt und bis zur Konfluenz bei 37° C gezüchtet. Die S. Aureus Stämme wurden über Nacht in Tryptikasesojabroth (TSB) bei 37° C gezüchtet. Die Über-Nacht-Kultur wurde mit frischem TSB verdünnt und wachsen gelassen, bis die Kultur die exponentielle Phase erreichte, die Organismen wurden geerntet und in 3 ml fischem Kulturmedium suspendiert. Die Bakterien (3,1 × 10⁸) wurden mit zunehmenden Mengen von Anti-MSCRAMM IgG für 30 Minuten bei 37° C inkubiert. Die vorbehandelten Bakterien wurden dann dem Zell-Monolayern hinzugefügt (4,1 × 10⁶ Epithelzellen) und für 3 Stunden bei 37° C inkubiert. Die Monolayer wurden dann fünfmal mit Phosphat gepufferter Saline gewaschen. Die Monolayer wurden mit Methanol fixiert und mit Giemsa angefärbt. Zwanzig Felder (100X Objektiv) wurden in jedem Monolayer auf die Präsenz von adherenten Bakterien hin untersucht.
5.3.10 Peritonitis
Dialyse Patienten (kontinuierliche ambulante peritoneale Dialyse, Hemodialyse) haben ein erhöhtes Risiko für die Entstehung einer Staphylokokken Infektion. Durch Verwendung eines Tiermodels einer Peritonitis (Menzies und Kernodle 1996) hatten wir gezeigt, dass die passive Immunisierung mit einer einzigen subkutanen Dosis eines anit-MSCRAMM IgGs die Mäuse gegen eine intraperitoneale S. Aureus Befall schützen. Wenn die Mäuse mit S. Aureus befallen werden, bekommen nur 27 % (10/37) der Mäuse, die passiv mit anti-MSCRAMM IgG immunisiert worden sind, eine Infektion. Umgekehrt bekamen 76 % der Mäuse, die passiv mit normalem Kaninchenserum immunisiert worden sind, eine Infektion. *Erfassung von drei seperaten Studien.
Männliche NIH Swiss-Mäuse, im Alter von 6–8 Wochen, mit einem Gewicht von 18–22 g (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) wurden verwendet. Anti-MSCRAMM IgG wurde in Form einer 0,25 ml subkutanen (s.c.) Injektion in die Schenkel der Mäuse verabreicht. Kontrollmäuse erhielten eine äquivalente Menge von normalen Kaninchen IgG (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO). 48 Stunden nach der Immunisierung wurden die Mäuse intraperitoneal (i.p.) mit S. Aureus befallen. Die bakteriellen Stämme wurden durch das Wachstum über Nacht in einem Gehirn-Herz-Infusionsbroth (Becton Dickinson Microbiology System, Cockeysville, MD) hergestellt, zweimal in PBS gewaschen und in PBS resuspendiert, und durch die Lichtdurchlässigkeit auf eine Konzentration von 6 × 10⁸ cfu/ml eingestellt. Mäuse wurden mit 0,5 ml der bakteriellen Suspension beimpft. Ein Aliquot der bakteriellen Suspension wurde auf Schafsblut-Agar plattiert, um die exakte cfu/ml zu bestimmen.
Die Mäuse wurden 48 Stunden nach der bakteriellen Beimpfung getötet. Es wurden beide Nieren wurden aus jeder Maus aseptisch entfernt, gewogen und in einer sterilen Tüte, welche 0,5 ml PBS enthält, plaziert und 30 Sekunden durch Verwendung eines Tekmar Tissumizer (Tekmar, Chincinnati, OH) homogenisiert. Das Homogenat wurde serienmäßig mit sterilem Wasser verdünnt und auf Schafsblut-Agar-Platten plattiert und bei 37° C inkubiert. Die Platten wurden 18–24 Stunden später gezählt. Die Homogenate der Nieren aus Mäusen, welche < 100 cfu/ml enthalten, wurden als negativ betrachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
5.3.11 Demonstration der therapeutischen Wirksamkeit in einem Pneumonie-Model
Staphylocokkus Aureus ist ein lebensbedrohlicher Erreger der nosokomialen Pneumonie in immunsupprimierten Patienten. Häufig zeigt aus diesen Patienten isoliertes S. Aureus eine Resistenz gegen ein breites Spektrum Antibiotika, insbesondere Methizillin. Ein experimentelles Mausmodell einer Staphylocokken Pneumonie (Ramisse et al., 1993) wurde verwendet, um die Fähigkeit von Anti-MSCRAMM IgG neutropenische Mäuse gegen eine S. Aureus mediierte Pneumonie zu schützen, zu beurteilen. Mäuse, die 3 Stunden nach der bakteriellen Beimpfung intranasal mit anti-MSCRAMM IgG behandelt worden sind, zeigten eine 1000-fache Abnahme der Menge an Bakterien, die in ihren Lungen gefunden worden waren (p < 0,01), verglichen zu den PBS Kontrollbehandelten Tieren.
5.3.11.1 Experimentelle Details
Weibliche, 4 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden intravenös mit Cyklophosphamid, mit 150 mg/kg am Tag 4 und 75 mg/kg am Tag 1 vor dem baktiellen Befall behandelt. Cyklophosphamid induziert eine transiente Neutropenie in den Mäusen. S. Aureus wurde über Nacht bei 37° C in einen Tryptikase Soja Broth (TSB) wachsen gelassen. Die Kulturen wurden gewaschen und dann auf 6,3 × 10⁶ cfu/ml in PBS eingestellt. Ein Aliquot der bakteriellen Suspension wurde auf Schaftsblut-Agar plattiert, um die exakte cfu/ml zu bestimmen. Die Mäuse wurden anästhesiert und mit 15 μl der bakteriellen Suspension beimpft. 3 Stunden nach dem bakteriellen Befall erhielt jede Maus intranasal entweder 7,5 μg anti-MSCRAMM IgG, 75 μg anti-MSCRAMM IgG, oder PBS. Um die Kolonisation der Lungen durch die Bakterien zu kontrollieren wurden 5 Mäuse pro Zeitpunkt getötet. Die bakterielle Auszählung wurde aus Homogenaten der Lungen bestimmt (die Lungen wurden vorsichtig aus den Hauptbronchien präpariert), welche serienmäßig in PBS durch das Ausplattieren von 100 μl Aliquots auf Tryptikase Soja Agar verdünnt wurden und die cfu nach der 24 Stunden Inkubation bei 37° C gezählt wurden. Die bakterielle Auszählung wurde als arithmetisches Mittel (± SE) ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde durch den Student's t-Test bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
5.3.12 Passive Immunisierung durch Verwendung von CBP Epitopen
In separaten Studien wurden, wie hierin beschrieben, Ratten mit M55 oder BSA als Kontrolle immunisiert. Sie wurden ausgeblutet und die IgG Fraktion durch eine Amoniumsulfat Präzipitation erhalten. Die IgG Fraktion (16 mg) wurde Mäusen einen Tag vor dem IV Befall mit S. Aureus verabreicht. Diese passiven Immunisierungsdaten bestätigen die Wirksamkeit der aktiven Immunisierung – d. h., Antikörper gegen M55 des CBP gerichtet schützen gegen lethale Dosen von S. Aureus (8).
5.4. Beispiel 4 – Tierstudien, welche S. Aureus CBP involvieren
Die korneale Infektion ist eine Hauptursache des optischen Verlusts und ist ein bedeutendes Problem der öffentlichen Gesundheit in den United States. Bakterielle Keratitis entsteht, wenn mikrobielle Virulenzfaktoren den Abwehrmechanismus des Wirtes bewältigen. Das erfolgreiche korneale Pathogen bindet an die korneale Oberfläche, dadurch den Reinigungsmechanismus des Tränenfilms vermeidend. Spezifische bakterielle Oberflächenproteine binden an spezifische Komponenten der Kornea, wie z.B. Fibronektin, Fibrinogen und Col. Spezifische mikrobielle Adhesine mediieren diese Adherenz durch eine ausgeklügelte Interaktion mit den Molekülen des Wirtes.
Die S. Aureus MSCRAMMs sind durch Verwendung verschiedener tierischer Modelle untersucht worden. Diese MSCRAMMs sind auf der Oberfläche von S. Aureus lokalisiert und wechselwirken mit den ECM Komponenten mit hoher Affinität und hoher Spezifität. MSCRAMMs die Fibronektin, Fibrinogen und Col erkennen, sind zuvor mit Hinsicht auf ihre strukturelle Organisation, Liganden-Bindungsdomänen, Bedeutung in der Kolonisation und Invasion des Wirtes, und ihrer biologischen Rolle als Virolenzfaktoren beschrieben worden.
Die Erfinder haben wohl in vitro als auch in vivo Studien angewendet, um die Rolle von CBP in der Pathophysiologie der infektiösen Keratitis zu bestimmen.
5.4.1 Col-Bindung durch okulare Isolate
20 klinische Isolate von S. Aureus aus dem Cullen Eye Institut am Baylor College of Medicine (Houston, TX) wurden zufällig ausgewählt. Jedes wurde aus aus Fällen mit einer vorherigen bakterieller Keratitis mit klinischen Standard Techniken isoliert. Typ II Col wurde mit ¹²⁵I durch die Chloramin-T-Methode markiert. Eine 5 ml Kultur von jedem Stamm wurde über Nacht in einem Gehirn-Herz Infusions-Broth wachsen gelassen. Die Zellen wurden zentrifugiert und in 1 ml PBS resuspendiert. Für jeden Assay wurden 50 μl der bakteriellen Zellen (annähernd 5 × 10⁸ cfu/ml) mit 400 μl PBS mit 0,1 % BSA und 0,1 % Tween 80^® und 5 × 10⁴ cpm von dem ¹²⁵I markierten Typ II Col inkubiert. Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert und end-over rotiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3 ml eisgekühltem PBS, welches 0,1 % Tween 80^® enthält, gestoppt und die Röhrchen wurden unverzüglich bei 1500 × g für 20 Minuten zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstands wurden die Pellets, die die bakteriellen Zellen enthalten, auf ihre Radioaktivität in einem Gamma-Counter hin analysiert. Die Proben wurden in dreifacher Ausführung analysiert und die Hintergrundwerte, welche die Radioaktivität, die in den Röhrchen wieder erlangt wurde, die in Abwesenheit von Bakterien inkubiert worden sind, wurde subtrahiert.
Die Analyse der klinischen Isolate deutet darauf hin, dass die Bindung an Col ein „Alles oder gar Nichts" Phänomen ist. 30 % (6/20) der S. aureus-Isolate haben an markiertes Col gebunden. Zusätzlicher 18S. aureus Stämme, die aus dem Glaskörper der Patienten mit bakterieller Keratitis isoliert worden sind, wurden auch auf die Col-Bindung hin analysiert. Interessanterweise haben 72 % (13/18) von jenen Stämmen an Col gebunden. Zusammen genommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Col-Bindung ein wichtiger, die Virulenz bestimmender Faktor in der Pathogenese der S. aureus-Augeninfektionen ist.
5.4.2 Tierstudien, die eine S. Aureus-Keratitis involvieren
In nachfolgenden Studien haben die Erfinder untersucht, ob die Fähigkeit an Col zu binden, von großer Bedeutung in der Entwicklung von mikrobieller Keratitis im Kaninchen war. Die vorhergehenden Tiermodelle der S. aureus-Keratitis erforderten eine direkte intrastromale Injektion, um die Infektion zu induzieren. Mikrobielle Adhäsion an zerstörtes korneales Gewebe ist das höchst wahrscheinliche auslösende Ereignis in der Entstehung von Keratitis, daher wurde, um noch genauer den natürlichen Verlauf der Erkrankung zu imitieren, ein Tiermodell entwickelt, das keine intrastromale Injektion erfordert. Um zu bestimmen, ob das S. aureus-Col MSCRAMM als Virulenzfaktor in der Keratitis betrachtet werden kann, wurde für diese Studie ein Kaninchenmodell entwickelt. Weiche Kontaktlinsen wurden in Kulturmedien von dem S. aureus-Stamm Phillips (CBP⁺) und seinen isogenen Mutations Derivat PH 100 (CBP^–) plaziert. Die Kontaktlinsen wurden 24 Stunden in den Kulturmedien inkubiert, welche annähernd 10⁸-Bakterien enthielten. Dieses resultierte in 1 × 10⁶- an den Kontaktlinsen gebundenen Bakterien für PH 100 und 2 × 10⁵ an die Linsen gebundene Organismen für den Stamm Phillips. Dieser Unterschied war statistisch nicht signifikant. Die weichen Kontaktlinsen wurden mit PBS gewaschen, um jegliche locker gebundenen Organismen zu entfernen und wurden dann auf die de-epithelialisierten Kornea von New Zealand weißen Kaninchen plaziert. Die Nickhautmembranen der Kaninchen wurden entfernt, um eine Dislokation der Kontaktlinsen zu vermeiden und die Augenlider wurden mit 7-0 Vicryl zugenäht. In einer Blindstudie wurde eine Gesamtzahl von 16 Kaninchen, 8 in jeder Gruppe verwendet. Die Augen wurden 48 Stunden nach der Plazierung der Kontaktlinsen geöffnet. Korneale Abschabungen wurden durchgeführt und auf einen Blutagar plaziert, um das Vorhandensein einer Infektion zu bestätigen und die Korneas wurden für histologische Bestimmungen entfernt. Eines der Kaninchen, welches der CBP^–-Gruppe zugeordnet war, entwickelte eine spontane Dehiszenz der Tarsorrhaphie-Schließung und Verlust der Kontaktlinsen, so dass das Tier aus der Studie entfernt wurde. 75 % (6/8) der Kaninchen mit Kontaktlinsen, welche mit dem Phillipsstamm (CBP⁺) inkubiert worden waren, entwickelten eine klinische mikrobielle Keratitis, wie durch eine dichte, zentrale eitrige stromale Keratitis gezeigt wurde. Kulturen bestätigten das Vorhandensein von S. aureus in allen infizierten Fällen. Umgekehrt, 0/7 Kaninchen mit Kontaktlinsen, die mit PH100 inkubiert worden waren, entwickelten eine eitrige Keratitis, obwohl in allen Fällen der epitheliale Defekt zurückblieb.
Dieser Unterschied in dem Anteil der Keratitis war statistisch signifikant. (Fisher's Exakt Test p = 0,006).
Die Wirksamkeit eines kleinen Molekülinhibitors, basierend auf der 3-D-Struktur von CBC(151–318) kann durch Verwendung des bakteriellen Keratitismodells getestet werden. Nach dem die Kontaktlinsen mit S. aureus inkubiert worden sind und gewaschen worden sind, um jegliche locker gebundenen Organismen zu entfernen, werden die kontaminierten Kontaktlinsen in einer Lösung gebracht, die den Inhibitor enthält. Der Inhibitor wird an die aktiven Stellen binden, dadurch die Col MSCRAMM sättigen, dadurch die Bakterien von der Anheftung an exponierte Col-Fasern in der zerstörten Kornea abhalten. Zusätzlich zu der Vorbeugung der S. aureus bakteriellen Keratitis würde der Inhibitor zu den Lösungen hinzugefügt, die im Allgemeinen durch Augenbanken verwendet werden, um Infektionen des Empfängers der Donorlinsen zu verhindern.
5.5 Beispiel 5 – Mausmodell einer septischen Arthritis
Durch die Verwendung eines Mausmodells einer septischen Arthiritis (Bremell et al., 1992) haben die Erfinder die Verwendung von rekombinanten Domänen, CBD(151–297) und CBD(61–343) des S. aureus Col MSCRAMM als eine Impfstoffkomponente untersucht. 18 Mäuse wurden mit 100 μg von dem Protein (GST-61-343) im Freund'schen kompletten Adjuvants (FCA) an den Tagen -34, -21, -9 geimpft. 25 Kontrollmäusen wurde PBS-FCA am gleichen Tag injiziert. Die Mäuse wurden mit einer intravenösen Injektion vom S. aureus-Stamm Phillips am Tag 0 befallen. Die Mäuse, die mit GST-61-343 immunisiert worden waren, zeigten eine 50 %ige Reduktion in der Arthritis, im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Zusätzliche Studien sind auch durchgeführt worden, welche verschiedene Domänen des S. aureus Col MSCRAMM verwenden.
5.6 Beispiel 6 – Nachweis, dass nur bestimmte CBP-Epitope Schutz gegen eine S. aureus-Infektion verleihen
Die folgenden Beispiele zeigen die wirksame Verwendung von CBP-Epitopen als Impfstoffkomponenten, und Zusammensetzungen, die in der Verleihung von Schutz an ein Tier gegen die Infektion durch S. aureus nützlich sind.
5.6.1 Maus Sepsis Modell – verwendete CBP-Epitope

M17 umfasst die Aminosäuren 151–297 des vollständigen CBP (SEQ ID Nr. 2).
M31 umfasst die Aminosäuren 61–343 des vollständigen CBP (SEQ ID Nr. 4).
M55 umfasst die Aminosäuren 30–531 des vollständigen CBP (SEQ ID Nr. 6).
Die DNA-Segmente, welche die M17, M31 und M55 Epitope kodieren, sind jeweils in den Sequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 5 offenbart.

5.6.2 Immunisierungsplan

Tag -31: 100μg/Maus eines CBP-Epitops (d. h. M17, M31 oder M55) oder BSA emulgiert mit Freund'schen komplette Adjuvants (Difco Laboratories) als Kontrolle.
Tag -18: 100μg/Maus eines CBP-Epitops (d. h. M17, M31 oder M55) oder BSA gelöst ist steril Phosphat gepufferter Saline (PBS)
Tag -7: 100μg/Maus eines CBP-Epitops (d. h. M17, M31 oder M55) oder BSA gelöst in PBS Tag 0: Intravenöse Beimpfung mit S. aureus-Stamm Phillips (welcher CBP exprimiert) (Dosis: 2,8 × 10⁷ cfu/Maus)
Tag 14: Ende der Studie; alle überlebenden Mäuse wurden eingeschläfert.

5.6.2 Ergebnisse

10/15 Mäuse starben in der Gruppe M17 Col bindendes MSCRAMM-
12/14 Mäuse starben in der Gruppe M31 Col bindendes MSCRAMM
4/11 Mäuse starben in der Gruppe M55 Col bindendes MSCRAMM
Alle 15 von 15 Mäusen starben in der BSA-Kontrollgruppe.

In einer Kontrollstudie wurden M55 und BSA-immunisierte Mäuse mit einem Stamm von S. aureus befallen, der nicht die das Col-bindende MSCRAMM exprimiert. Die Mortalität in der M55-Gruppe war 50 %, im Vergleich zu 30 % in der BSA-Gruppe. Wichtig ist, dass diese Daten darauf hinweisen, dass der Schutz direkt in Beziehung zu den Antikörpern steht, die gegen den M55-Teil des Col-bindenden MSCRAMM generiert wurde.
Im scharfen Kontrast zu der zuvor identifizierten vollständigen Sequenz, welche keinen Schutz gegen Sepsis in einem in vivo Tiermodell verleiht, zeigen diese Daten klar, dass M55 (nur die A-Domäne umfassend) sehr effektiv in der Vorbeugung gegen Sepsis war.
Überraschenderweise ist nur M55 hochprotektiv, obwohl alle der CBP-Fragmente (M17 und M31) innerhalb der M55-Proteinsequenz umfasst sind.
5.7 Beispiel 7 – Opsonierung, Phagocytose und intrazelluläre Zerstörung von Bakterien
Der Phagocytosetest wurde durch eine Modifikation einer zuvor beschriebenen Methode gemacht (Lissner et al., 1983). In Kürze, peritoneale Makrophagen wurden aus der Peritonealhöhle durch i.p. Injektion von 3 ml eiskaltem Medium (Iscovés Medium, welches 10 % fetales Kälberserum und 100 μg/ml von Gentamycin enthält) gesammelt, nach einer Minute Massage des Abdomens wurde das Macrophagen-enthaltende Medium abgesaugt. Die Macrophagen wurden gewaschen und auf 2 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt, in 200 μl Volumen in eine 24-Lochplatte gesät (Nunc, Roskilde, Denmark) und bei Raumtemperatur für 90 Minuten gelassen. 500 μl des Zellkulturenmediums wurde jedem Loch hinzugefügt und die Zellen wurden für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde dann entfernt und durch 500 μl eines Mediums, welches frei von Antibiotika ist, ersetzt und die Zellen wurden dann über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Staphylokokken für 30 Minuten bei 4°C opsoniert mit entweder a) 50 % Hitze-inaktivierten Seren von Mäusen, die mit M55 hyperimmunisiert worden sind, oder b) mit Seren aus BSA hyperimmunisierten Mäusen, oder wahlweise c) mit Seren aus Mäusen, die eine Infektion mit dem Stamm Phillips ohne vorherige Immunisierung durchgemacht haben. 500 μl von opsonierten Staphylokokken wurden zu jedem Loch in einer Konzentration von 1,4 × 10⁷ Bakterien/ml hinzugefügt. Nach 50 Minuten Inkubation wurden die Macrophagen dreimal in Iscovés gewaschen, um nicht aufgenommene Bakterien zu entfernen. Danach wurden die Macrophagen analysiert, entwerder direkt nach der bakteriellen Inkubation oder 4 Stunden später. Zu den Kulturen, die für 4 Stunden inkubiert worden waren, wurde Iscoves-Medium mit einer minimalen inhibitorischen Konzentration von Gentamycin, passend für den S. aureus-Stamm Phillips (5 μg/ml), zugefügt, um eine extrazelluläre Reproduktion der Bakterien zu vermeiden. Die Macrophagen wurden mit destilliertem Wasser für 20 Minuten lysiert, und das Lysat 1/1, 1/10, 1/100 und 1/1000 verdünnt, wurde auf 5 % Pferdeblut Agarplatten kultiviert. Die Platten wurden über Nacht inkubiert und die Anzahl der Bakterien gezählt.
5.7.1 In Vitro Assays
In vitro Assays wurden durchgeführt, um den Einfluß spezifischer Antikörper gegen Kollagenadhäsion auf die Phagocytose und die intrazelluläre Zerstörungskapazität zu beurteilen. Kollagenadhäsions exprimierender Phillips-Stamm wurde mit entweder Serum, welches M55-spezifische Antikörper enthält oder Serum, welches BSA-Antikörper enthält, oder wahlweise Serum aus natürlichen Mäusen, welche eine Infektion durch Phillips durchgemacht haben, opsoniert.
Die Ergebnisse (5A) zeigen deutlich, dass die intrazelluläre Zerstörung von S. aureus Phillips-Stamm moderat durch eine vorherige Infektion mit demselben Stamm erhöht ist (p = 0,037). Im Gegensatz dazu, Opsonierung von Staphylokokken mit Serum aus M55-immunisierten Mäusen (aber nicht infiziert) zeigten eine signifikant erhöhte intrazelluläre Zerstörungskapazität, im Vergleich zu Kontrollserum (p = 0,009). Die Phagocytosekapazität war durch die Opsonierung von Bakterien mit Serum, welches M55-Antikörper enthält, nur bescheiden betroffen und signifikant betroffen, wenn die Bakterien mit Serum vom Phillips-Stamm-infizierten Mäusen opsoniert waren (5B).
5.8 Beispiel 8 – Detektion von CBP-Antikörpern in S. aureus-infizierten Mäusen
In dieser Studie wurden 15 Mäuse experimentell mit einer sub-lethalen Dosis von S. aureus infiziert, welche das Col-bindende MSCRAMM exprimiert. Anti-M55 (Col MSCRAMM) IgG konnte nicht in den Seren von den infizierten Tieren detektiert werden. Umgekehrt, Tiere, welche mit M55 immunisiert worden waren und mit einer sub-lethalen Dosis S. aureus infiziert worden waren, hatten einen anti-M55 IgG (Col MSCRAMM)-Titer von 32 × 10⁹ Units/ml.
Diese Daten deuten darauf hin, dass während des normalen Verlaufs einer Infektion das CBP vor einer immunologischen Erkennung geschützt ist. Die Induktion einer polyklonalen B-Zellaktivierung, als Konsequenz einer Infektion mit S. aureus, wird die spezifische Immunantwort auf viele bakterielle Zellwandkomponenten runter regulären, einschließlich des nativen CBP.
5.8.1 Experimentelle Details
Die Serummengen von spezifischen Antikörpern gegen das Kollagenadhäsionspeptid M55 wurde durch einen Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) gemessen. 96-Loch-Mikroplatten (Nunc) wurden über Nacht bei 4°C mit 2 μg/ml des M55-Peptids beschichtet. Blockiert wurde mit 0,5 % Ovalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) welches in 0,05 M Tris (pH 7,7) gelöst war. Seren, biotinylierte Antikörper und ExtrAvidin-Peroxidase (Sigma) wurden alle in 0,05 M Tris (pH 7,4)-0,015 M NaCl verdünnt. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C mit den Seren inkubiert, gewaschen und schrittweise mit biotinyliertem Ziege-Anti-Maus IgG-Antikörper (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA), ExtrAvidin-Peroxidase (0,5 μg/ml; Sigma) und ABTS-Substrat inkubiert. Das A405 wurde in einem Titertec Multiscan-Photometer (Flow Laboratories, McLean, VA) gemessen. Ein ähnliches ELISA-Verfahren, wie oben beschrieben, wurde verwendet, um Antikörper gegen M19, M31, als auch gegen die B1-Domäne der Kollagen-Adhäsion zu detektieren. OVA wurde als solides Kontroll Antigen verwendet.
Darüber hinaus wurden 96-Lochplatten mit Poly-L-Lysin (Sigma) beschichtet und dann mit entweder 1,5 × 10⁷ S. aureus Stämmen Phillips oder LS-1 beschichtet. Nach der Blockierungsprozedur wurden die Seren aus immunisierten Mäusen und nicht-immunisierten, aber infizieren Mäusen, als auch natürlichen Maus-Seren inkubiert. Die Entwicklungsschritte wurden dann wie oben beschrieben gemacht. Die Daten sind in 6 gezeigt.
5.9 Beispiel 9 – Detektion der Antikörper gegen Col bindendes MSCRAMMs in mit S. aureus infizierten Menschen
Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse von Studien, um Antikörper gegen Col bindendes MSCRAMM zu detektieren.
Seren aus 34 Patienten, bei welchen klinisch eine S. aureus Infektion diagnostiziert wurde, wurden durch einen ELISA bestimmt. IgG, das das immobilisierte M55 erkennt (Col MSCRAMM) konnte nur detektiert werden, wenn außerordentlich hohe Mengen von Antigenen in dem Assay verwendet wurden. Somit konnten, trotz der Tatsache, dass diese Patienten eine klinisch diagnostiziere S. aureus Infektion hatten, nur eine geringe Erhöhung im α-CBP-Titer detektiert werden. Diese Daten (7A und 7B) legen nahe, dass eine S. aureus-Infektion eine polyklonale B-Zell Aktivierung induzieren, die die humane Immunantwort gegen einige mikrobielle Zellwandkomponenten runterreguliert, einschließlich des CBP.
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7. Sequenzurotokoll
Sämtliche der hierin offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und Methoden können ohne übermäßiges Experimentieren im Lichte der vorliegenden Offenbarung hergestellt und ausgeführt werden. Während die Zusammensetzungen und die Verfahren der Erfindung im Hinblick auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden sind, ist es für jene auf dem Fachgebiet ersichtlich, dass Abweichungen der Zusammensetzung, der Verfahren und in den Schritten oder der Sequenz von Schritten der hierin beschriebenen Methoden angewandt werden können, ohne von dem Konzept, dem Geist und dem Umfang der Erfindung abzuweichen. Noch spezieller, es ist ersichtlich, dass bestimmte Mittel, welche sowohl chemisch als auch physiologisch ähnlich sind, für die hierin beschriebenen Agentien substituiert werden können, während die gleichen oder ähnlichen Ergebnisse erreicht werden. Alle solche ähnlichen Ersatzstoffe und Modifikationen, die jenen auf dem Fachgebiet ersichtlich sind, werden als Inhalt des Geistes, des Umfangs und des Konzeptes der Erfindung betrachtet, wie durch die anhängenden Ansprüche definiert wurde. Dementsprechend sind die exklusiven Rechte, für die Patentschutz begehrt wird, in den Ansprüchen beschrieben.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein CBP-Peptid, wobei das Peptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 aufweist und die bakterielle Anheftung an Collagen inhibiert.
Zusammensetzung, umfassend ein CBP-Peptid, wobei das Peptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 aufweist und die bakterielle Anheftung an Collagen inhibiert, zur Verwendung in der Therapie.
Zusammensetzung nach Anspruch 2 zur Verwendung bei der Inhibierung der bakteriellen Kolonialisierung, bakteriellen Infektion, bakteriellen Sepsis, Staphylokokkeninfektion oder Sepsis in einem Tier.
Verwendung einer Zusammensetzung umfassend ein CBP-Peptid, wobei das Peptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 aufweist und die bakterielle Anheftung an Collagen inhibiert, zur Herstellung eines prophylaktischen Medikaments zur Inhibierung oder der Vorbeugung von bakterieller Kolonialisierung, bakterieller Infektion, bakterieller Sepsis, Staphylokokkeninfektion oder Sepsis in einem Tier.
Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3 oder die Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Peptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 aufweist.
Zusammensetzung oder Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das Peptid die Staphylokokkenanheftung an Collagen inhibiert.
Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes Nukleinsäuresegment, das für ein CBP-Peptid kodiert, wobei das CBP-Peptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 aufweist und die bakterielle Anheftung an Collagen inhibiert, zur Verwendung in der Therapie.
Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Verwendung bei der Inhibierung der bakteriellen Kolonialisierung, bakteriellen Infektion, bakteriellen Sepsis, Staphylokokkeninfektion oder Sepsis in einem Tier.
Verwendung einer Zusammensetzung umfassend ein isoliertes Nukleinsäuresequenz, das für ein CBP-Peptid kodiert, wobei das CBP-Peptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz des SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 aufweist und die bakterielle Anheftung an Collagen inhibiert zur Herstellung eines prophylaktischen Medikaments zur Inhibierung oder der Vorbeugung von bakterieller Kolonialisierung, bakterieller Infektion, bakterieller Sepsis, Staphylokokkeninfektion oder Sepsis in einem Tier.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 oder 8 oder die Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Nukleinsäuresegment die Sequenz von SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 5 aufweist.
Zusammensetzung umfassend einen Antikörper, der an ein CBP-Peptid bindet, wobei das CBP-Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 angegeben ist, wobei der Antikörper die bakterielle Anheftung an Collagen inhibiert, zur Verwendung in der Therapie.
Zusammensetzung nach Anspruch 11 zur Verwendung bei der Inhibierung von bakterieller Kolonialisierung, bakterieller Infektion, bakterieller Sepsis, Staphylokokkeninfektion oder Sepsis in einem Tier.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper der an ein CBP-Peptid bindet, wobei das CBP-Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. oder SEQ ID Nr. 6 angegeben ist, wobei der Antikörper die bakterielle Anheftung an Collagen inhibiert zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Inhibierung oder der Vorbeugung der bakterieller Kolonialisierung, bakterieller Infektion, bakterieller Sepsis, Staphylokokkenanheftung oder Sepsis in einem Tier.
Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12 oder Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Antikörper die Staphylokokkenanheftung an Collagen inhibiert.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11, 12 oder 14 oder die Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei der Antikörper eine Staphylokokkeninfektion nach Verabreichung an ein Tier inhibiert oder ihr vorbeugt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11, 12, 14 oder 16 oder die Verwendung nach einem der Ansprüche 13, 14 oder 15, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Kit, umfassend eine Zusammensetzung in Übereinstimmung mit einem der voranstehenden Ansprüche.
Kit nach Anspruch 16, wobei die Zusammensetzung für die parenterale, orale, intranasale, subkutane oder intravenöse Verabreichung formuliert ist.
Verwendung einer Zusammensetzung umfassend einen Antikörper der an ein CBP-Peptid bindet, wobei das CBP-Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 2 angegeben ist zur Herstellung eines prophylaktischen Medikaments zur Inhibierung oder der Vorbeugung von bakterieller Kolonialisierung, bakterieller Infektion oder bakterieller Sepsis in einem Tier.
Verwendung einer Zusammensetzung umfassend einen Antikörper, der an ein CBP-Peptid bindet, wobei das CBP-Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 2 angegeben ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Staphylokokkeninfektion oder Sepsis in einem Tier.
Kit, umfassend eine Zusammensetzung umfassend einen Antikörper der an ein CBP-Peptid bindet, wobei das CBP-Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 2 angegeben ist, zur Verwendung in der Therapie.
Kit nach Anspruch 21, wobei die Zusammensetzung zur parenteralen, oralen, intranasalen, subkutanen oder intravenösen Verabreichung formuliert ist