DE69733891T2

DE69733891T2 - Hybridinterferonzusammensetzungen und verfahren zu deren anwendung

Info

Publication number: DE69733891T2
Application number: DE69733891T
Authority: DE
Inventors: M. Howard JOHNSON; S. Prem SUBRAMANIAM; H. Carol PONTZER
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2017-04-12
Also published as: AU2666197A; ES2243990T3; US5939286A; EP0914435A1; WO1997039127A1; CA2252082A1; TW557301B; AU718864B2; DE69733891D1; CN100343282C; CN1663963A; CN1221452A; CN1219796C; ATE301197T1; EP0914435B1; JP2000508536A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid, bestehend aus einer Region oder Regionen, die von Interferon-τ abgeleitet ist/sind, und einer Region oder Regionen, die von einem anderen Interferon abgeleitet ist/sind.
Bezugnahmen

Aguet, M., und Mogensen, K. E., in INTERFERON, BAND 5 (Gresser, L., Ed.) Academic, New York, S. 1–22 (1983).
Armstrong, J. P., Methods Enzymol. 78: 381–387 (1986).
Ausubel, F. M., et al., in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons., Inc., Media, PA (1988).
Bayne, M. L., et al., Gene 66: 235 (1988).
Bazer, F. W., et al., J. Animal Sci. 57(Supp. 2): 425 (1983).
Bazer, F. W., et al., J. Reproduction and Fertility 76: 841 (1986).
Bazer, F. W., et al., Biology of Reproduction, Bd. 40; (Ergänzung 1): 63, (Zusammenfassung (1989).
Bazer, F. W., et al., PCT^Ausgabe WO/94/10313, veröffentlicht am 11. Mai 1994
Beames, et al., Biotechniques 11: 378 (1991).
Benoit, P., et al., J. Immunol. 150(3): 707 (1993).
Bonnem, E. M., et al., J. Bio. Response Modifiers 3: 580 (1984).
Boyer, S. J., et al., J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 6(3): 99–102 (1992).
Capon, D. J., et al., EP-Patent Nr. 88622, erteilt am 14. September 1983
Crea, R., US-Patent Nr. 4,888,286, erteilt am 19. Dezember 1989
Creasey, A., et al., US-Patent Nr. 4,758,428, erteilt am 19. Juli 1988
Creasey, A. et al., US-Patent Nr. 4,569,908, erteilt am 11. Februar 1986.
Crowe, S. M., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 3(2): 135 (1987).
Cumber, J. A., et al., Methods in Enzymology 112: 207 (1985).
Dalgleish, et al., Nature 312: 763 (1984).
Davis, G. L., et al., N. England J. Med. 321: 1501 (1989).
Davis, G. L. et al., Theriogenology 38: 867 (1992).
Degre, M., Int. J. Cancer 14: 699–703 (1974).
DeMaeyer, E., et al., Interferons and Other Regulatory Cytokines, John Wiley and Sons, New York (1988).
Dianzani, F., J. Interferon Res., Special Issue, 5/92: 109 (1992).
Duncan, R. J. S., et. al., Anal Biochem 182: 6 (1983).
Dusheiko, G. M., et al., J. Hematology 3(Erg. 2): S199 (1986).
Dworkin-RastI, E., et al., US-Patent Nr. 4,820,638, erteilt am 11. April 1989
Eston, M. A. W., et al., US-Patent Nr. 4,719,180, erteilt am 12. Januar 1988
Ecker, D. J., et al., J. Biol. Chem. 264: 7715–7719 (1989).
Elliot, S., et al., J. Biol. Chem. 261: 2936 (1986).
Ernst, J. F., DNA 5: 483 (1986).
Familetti, P. C., et al., Meth. Enzymol. 78: 387 (1981).
Feher, Z., et al., Curr. Genet. 16: 461 (1989).
Fent, K., und Zbinden, G., Trends Pharm. Sci. 8: 100–105 (1987).
Finter, N. B., et al., Drugs 42(5): 749 (1991).
Fish, E. N., J. Inteferon Res. 12: 257–266 (1992).
Foa, P., et al., Cell Tissue Kinet. 15(4): 399–404 (1982).
Francis, M. L., et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 8(2): 199 (1992).
Frangioni, J. V., et al., Anal. Biochem. 210(1): 179–187 (1993).
Godkin, J. D., et al., J. Reprod. Fert. 65: 141 (1982).
Goeddel, D. US-Patent Nr. 4,678,751, erteilt am 7. Juli 1987
Goeddel, D. US-Patent Nr. 4,456,748, erteilt am 26. Juni 1984
Goeddel, D. US-Patent Nr. 4,414,150, erteilt am 8. November 1983
Griggs, N. D., et al., J. Immunol. 149: 517 (1992).
Guan, K. L., et al., Anal. Biochem. 192(2): 262–267 (1991).
Gunther, A., et al., US-Patent Nr. 4,917,887, erteilt im April 1790
Hakes, D. J., et al., Anal. Biochem. 202(2): 293–298 (1992).
Hansen, P. J., et al., US-Patent Nr. 4,997,646, erteilt am 5. März 1991
Harlow, E., et al., in ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1988).
Helmer, S. D., et al., J. Reprod. Fert. 79: 83–91 (1987).
Hitzeman, R. A., et al., US-Patent Nr. 4,775,622, erteilt am 4. Oktober 1988
Hoffman, A. E., et al., Virology 147: 326 (1985).
Howatson, et al., J. Endocrinol. 119: 531 (1988).
Imakawa, K., et al., Nature 330: 377 (1987).
Imakawa, K., et al., Mol. Endocrinol. 3: 127–139 (1989).
Jarpe, M. A., et al., Protein Engin. 7: 863–867 (1994).
Johnson, W. C., Jr., Methods in Enzymology 210: 426–447 (1992).
Kashima, H., et al., Laryngoscope 98: 334 (1988).
Krown, S. E., in MECHANISMS OF INTERFERON ACTIONS, (Pfeffer, L. M., Hrsg.), CRC Press Inc., Boca Raton, Bd. II, S. 143–178, (1987).
Kyte, J., et al., J. Mol. Biol. 157: 105 (1982).
Langer, J. A., und Pestka, S., Methods Enzymol. 119: 305–311.
Langford, M. P., et al., Meth. Enzymol. 78: 339 (1981).
Lawrence, et al., Nucl. Acids. Res. 13: 1777 (1985).
Leibowitz, P. J., et al., US-Patent Nr. 4,892,743, erteilt am 9. Januar 1990
Li, J., und Roberts, R. M., J. Biol. Chem. 269: 13544–13550 (1994).
Lowry, O. H., et al., J. Biol. Chem. 193265–275 (1951).
Ludwig, D. L., et al., Gene 132: 33 (1993).
Maniatis, T., et al., in MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
Martin, E. W., In: DISPENSING OF MEDICATION: A PRACTICAL MANUAL ON THE FORMULATION AND DISPENSING OF PHARMACEUTICAL PRODUCTS (Hoover, J. E., Hrsg.), 8. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA., (1976).
McInnes, B., et al., J. Interferon Res. 9(3): 305–314 (1989).
McPherson, G. A., J. Pharmacol. Methods 14: 213–228 (1985).
Mullis, K. B., US-Patent Nr., 4,683,202, erteilt am 28. Juli 1987
Mullis, K. B., et al., US-Patent Nr. 4,683,195, erteilt am 28. Juli 1987
Miyoshi, E., et al., Int. T. Cancer 52(1): 137–140 (1992).
Nagy, et al., Int. J. Canc. 32: 321 (1983).
Oeda, K., et al., US-Patent Nr. 4,766,068, erteilt am 23. August 1988
Oldham, R. K., Hospital Practice 20: 71 (1985).
Paulesu, et al., J. Biol. Regul. Homeost. Agents 5: 81 (1991).
Pearson, W. R. und Lipman, D. J., PNAS 85: 2444–2448 (1988).
Pearson, W. R., Methods in Enzymology 183: 63–98 (1990).
Pederson, et al., Science 235: 790 (1987).
Perczel, A., et al., Protein Engineering 4(Erg. 6): 669–679 (1991).
Pontzer, C. H., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 152: 801 (1988).
Pontzer, C. H., et al., Cancer Res. 51: 5304 (1991).
Poste, G., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78: 6226 (1981).
Quesada, J. R., et al., N. England J. Med. 310: 15 (1984).
Reilly, P. R., et al., in BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992).
Rothstein, R., DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH, Bd. II (Glover, D. M., Hrsg) Oxford: IRL Press, S. 46–66 (1986).
Rubinstein, M., und Orchansky, P., CRC Crit. Rev. Biochem. 21: 249–275 (1986).
Ruegg, C. L., et al., J. Interferon Res. 10: 621–626 (1990).
Rutter, W. J., et al., US-Patent Nr. 4,769,238, erteilt am 6. September 1988
Sabin, E., et al., Bio/Technology 7: 705–709 (1989).
Sambrook, J., et al., in MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1989).
Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977).
Sato, K., et al., US-Patent Nr., 4,780,530, erteilt am 25. Januar 1988
Senda, T., et al., EMBO J. 11(9): 3193–3201 (1992).
Shaw, K. J., et al., DNA 7: 117 (1988).
Shen, L. P., et al., Sci. Sin: 29: 856 (1986).
Shoulders, C. C., et al., Nucleic Acidc Res. 10(16): 4873–4882 (1982).
Sloma, A., et al., US-Patent Nr., 4,7483,233, erteilt am 31. Mai 1988
Smith, D. B., et al., Gene 67: 31 (1988).
Smith, P. K., et al., Anal. Biochem. 150: 76 (1985).
Stabinsky, Y. US-Patent Nr. 4,897,471, erteilt am 30. Januar 1990
Stewart, H. J., et al., J. Endocrinol. 115: R13 (1987).
Todd, R. F., et al., Leuk. Res. 5(6): 491–495 (1981):
Vallet, J. L., et al., Biol. Reprod. 37: 1307 (1987).
Vallet, J. L., et al., J. Endocrinology 117: R5–R8 (1988).
Wallis, S. C., et al., EMBO J. 2(12): 2369–2373 (1983).
Whaley, A. E., et al., J. Biol. Chem. 269: 10846–10868 (1994).
Wang, C. Y., et al., US-Patent Nr. 4,879,212, erteilt am 7. November 1989
Wang, C. Y., et al., US-Patent Nr. 4,735,896, erteilt am 5. April 1988
Wilson, et al., Biology of Reproduction 20(1): 101A Zusammenfassung (1979).
Wu, D. A., et al., DNA 10: 201 (1991).
Yoshio, T., et al., US-Patent Nr. 4,849,350, erteilt am 18. Juli 1989.
Zoon, K. C., et al., Methods Enzymol. 119: 312–315 (1986).

Konzeptus-Membranen oder Trophektoderm verschiedener Säuger stellen biochemische Signale her, die das Einsetzen und Aufrechterhalten von Schwangerschaft gewährleisten (Bazer, et al., 1983). Ein solches Protein, Schaf Trophoblasten-Protein-eins (oTP-1) wurde als Protein mit niedrigem Molekulargewicht identifiziert, das durch Schaf-Konzeptus zwischen den Tagen 10 und 21 der Schwangerschaft sezerniert wird (Wilson, et al., 1979; Bazer, et al., 1986). Es wurde gezeigt, dass das Protein oTP-1 die uterine Sekretion von Prostaglandin F₂-alpha hemmt, das bei nicht trächtigen Schafen dafür verantwortlich ist, dass das Corpus luteum auf dem Eierstock einen physiologischen und endokrinologischen Tod durchläuft (Bazer, et al., 1986). Entsprechend hat oTP-1 antiluteolytische biologische Aktivität. Es wurde angenommen, dass die primäre Rolle von oTP-1 mit dem Einsetzen der Trächtigkeit in Verbindung steht.
Nachfolgend wurde herausgefunden, dass oTP-1 (i) begrenzte Homologie (50–70%) mit Interferon-alphas (IFNα) verschiedener Arten zeigt (Imakawa, et al., 1987) und (ii) an einen Typ I-Interferonrezeptor bindet (Stewart, et al., 1987). Trotz einiger Ähnlichkeiten mit IFNα hat oTP-1 mehrere Merkmale, die es von IFNα unterscheiden, einschließlich der folgenden: die Rolle von oTP-1 in der reproduktiven Biochemie (es ist nicht bekannt, dass andere Interferone eine Rolle bei der biochemischen Regulierung von Reproduktionszyklen spielen), die zelluläre Quelle von oTP-1 – Trophoblastenzellen (IFNα stammt von Lymphocytenzellen ab), die Größe von oTP-1 – 172 Aminosäuren (IFNα hat typischerweise 165–166 Aminosäuren), außerdem ist oTP-1 durch Viren schwach induzierbar (IFNα ist durch Viren stark induzierbar). Die International Interferon Society erkennt oTP-1 als zu einer vollständig neuen Klasse von Interferonen gehörend an, die Interferon-tau (IFNτ) genannt wurden. Der griechische Buchstabe τ steht für Trophoblast.
Die Interferone wurden in zwei unterschiedliche Gruppen klassifiziert: Typ I-Interferone, einschließlich IFNα, IFNβ und IFNω (auch bekannt als IFNαII); und Typ II-Interferone, repräsentiert durch IFNγ (ein Überblick findet sich in DeMaeyer, et al., 1988). Beim Menschen wird geschätzt, dass es mindestens 17 nicht-allelische Gene für IFNα, mindestens etwa 2 oder 3 nicht-allelische Gene für IFNβ und ein einziges IFNγ-Gen gibt.
Es wurde gezeigt, dass IFNα's verschiedene Typen der Zellvermehrung hemmen. IFNα's sind vor allem gegen hämatologische Malignität wie die Haarzell-Leukämie von Nutzen (Quesada, et al., 1984). Des Weiteren zeigten diese Proteine auch eine Aktivität gegen multiples Myelom, chronische lymphocytäre Leukämie, niedriggradiges Lymphom, Kaposi-Sarkom, chronische myelogene Leukämie, Nierenzellkarzinom, Harnblasentumore, und Eierstockkrebs (Bonnern, et al., 1984; Oldham, 1985). Die Rolle von Interferon und Interferon-Rezeptoren bei der Pathogenese von bestimmten Autoimmun- und entzündlichen Krankheiten wurde ebenfalls untersucht (Benoit, et al., 1993).
IFNα's sind auch gegen verschiedene Arten von viralen Infektionen von Nutzen (Finter, et al., 1991). Alpha-Interferone zeigten eine Aktivität gegen eine Infektion mit menschlichen Papillomaviren, Hepatitis B- und Hepatitis C-Infektionen (Finter, et al., 1991; Kashima, et al, 1988; Dusheiko, et al., 1986; Davis, et al., 1989).
Die Nützlichkeit von IFNα's wurde jedoch durch ihre Toxizität signifikant begrenzt. Die Verwendung von Interferonen bei der Behandlung von Krebs und viralen Erkrankungen resultierte in schwerwiegenden Nebenwirkungen, wie Fieber, Erkältungen Magersucht, Gewichtsverlust und Müdigkeit (Pontzer, et al., 1991; Oldham, 1985). Diese Nebenwirkungen erfordern häufig, (i) dass die Interferon-Dosierung auf Mengen reduziert wird, die die Wirksamkeit der Behandlung begrenzen, oder (ii), dass der Patient aus der Behandlung entfernt wird. Eine solche Toxizität hat die Nützlichkeit dieser starken antiviralen und antiproliferativen Proteine bei der Behandlung der Abschwächung von menschlichen und Tierkrankheiten reduziert.
In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung ein chimeres Nucleinsäuremolekül, das ein Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid codiert. Das Molekül wird aus einem 5'-Endsegment, das die N-terminale Aminosäuresequenz eines Interferon-tau-Polypeptids codiert, und einem 3'-Endsegment, das die C-terminale Aminosäuresequenz eines Nicht-tau-Interferon-Typ-I-Polypeptids codiert, gebildet. Die beiden Segmente sind in einer Region gespleißt, die dem Abschnitt eines reifen Interferon-Polypeptids am Rest 28 entspricht. Beispiele für Nicht-tau-Interferon-Typ-I-Polypeptide umfassen Interferon-alpha und Interferon-beta. In einer Ausführungsform umfasst das 5'-Endsegment des Weiteren eine Leadersequenz.
Das 3'-Endsegment kann in verschiedenen Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz codieren, die von einem Interferon-alpha 1, -alpha 2, -beta oder -omega abstammt. Das 3'-Endsegment kann auch einen Consensus-Sequenz von einem der vorstehenden oder eine intern übereinstimmende Sequenz codieren. Bevorzugte Ausführungsformen sind dort, wo die Sequenz aus einer menschlichen Quelle wie menschlichem IFNα oder menschlichem IFNβ stammt.
In anderen allgemeinen Ausführungsformen kann das Interferon-tau-Polypeptid ein menschliches oder Wiederkäuer- (z.B. Schaf-) Interferon-tau-Polypeptid sein und das Nicht-tau-Interferon-Typ I-Polypeptid kann ebenso ein menschliches oder ein nicht-menschliches Interferon-Typ-I-Polypeptid sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Interferon-tau-Polypeptid ein Schaf-Interferon-tau-Polypeptid und das Nicht-tau-Interferon-Typ-I-Polypeptid ist ein menschliches Interferon-Typ-I-Polypeptid.
Ein beispielhaftes chimeres Nucleinsäuremolekül der vorstehenden Erfindung ist SEQ ID NO: 54, mit einem 5'-Endsegment, das die Aminosäuren 1–28 von menschlichem IFNtau (von SEQ ID NO: 3) codiert, und einem 3'-Endsegment, das die Aminosäuren 29–166 von menschlichem IFNα (Clon pIFN105; Genbank HUMIFNN Acc. M28585) codiert.
Jedes vorstehend beschriebene chimere Nucleinsäuremolekül kann weiter eine Leadersequenz umfassen.
In einer ähnlichen Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid, das aus einem ersten Segment, das die N-terminale Aminosäuresequenz eines Interferon-tau-Polypeptids enthält, und aus einem zweiten Segment, das die C-terminale Aminosäuresequenz eines Nicht-tau-Interferon-Typ-I-Polypeptids enthält, gebildet wird. Die beiden Segmente sind in der Region eines reifen Interferon-Polypeptids am Rest 28 verbunden. Spezifische Ausführungsformen sind wie vorstehend für chimere Säuremoleküle beschrieben. Interferon-α und Interferon-β sind Beispiele für solche Nicht-tau-Typ-I-Interferone. Solche Hybridfusionen können verwendet werden, um die Toxizität der Nicht-tau-Typ-I-Interferone zu reduzieren, wenn die Interferone in pharmazeutischen Formulierungen oder in therapeutischen Anwendungen verwendet werden.
Das erste Segment kann in verschiedenen Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz haben, die in einer Sequenz enthalten ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 und SEQ ID NO: 53. Bevorzugte Ausführungsformen sind dort, wo die Sequenz einem menschlichen Interferon-tau entspricht, wie SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 35.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor, der ein Nucleinsäure hat, enthaltend ein offenes Leseraster (ORF), das ein Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid, einschließlich der vorstehend beschriebenen Nucleinsäure- und Polypeptidsequenzen umfasst. Der Vektor umfasst des Weiteren regulatorische Sequenzen, die wirksam sind, um das offene Leseraster in einer Wirtszelle zu exprimieren: solche Sequenzen können endogen (wie die normalerweise vorkommenden IFN-Leadersequenzen) oder heterolog (wie ein sekretorisches Signal, das in Hefe, Säugerzellen, Insektenzellen, Gewebekultur oder bakteriellen Expressionssystemen erkannt wird) sein. Im Expressionsvektor können regulatorische Sequenzen auch 5' zu der Nucleinsäuresequenz eine Promotorregion und ein ATG-Startcodon im Rahmen mit der Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid-Codierungssequenz (chimeres Nucleinsäuremolekül) und 3' zu der Codierungssequenz ein Translations-Terminationssignal, gefolgt von einem Transkriptions-Terminationssignal, umfassen. Des Weiteren umfasst die Erfindung ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptids unter Verwendung der Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung. Die Expressionsvektoren werden in geeignete Wirtszellen eingeführt. Dann werden die Wirtszellen unter Bedingungen gezüchtet, die die Expression der ORF-Sequenz ergeben.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptids. In dem Verfahren wird der Expressionsvektor, der Sequenzen enthält, die das offene Leseraster (ORF) eines Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptids enthalten, in geeignete Wirtszellen eingeführt, wo der Vektor so angelegt ist, dass er das ORF in den Wirtszellen exprimiert. Die transformierten Wirtszellen werden dann unter Bedingungen gezüchtet, die zur Expression der ORF-Sequenz führen. Zahlreiche Vektoren und ihre entsprechenden Wirte umfassend Lambda gt11-Phagenvektor und E. coli-Zellen, sind bei der praktischen Durchführung dieses Verfahrens der Erfindung von Nutzen. Andere Wirtszellen umfassen Hefe, Säugerzellen, Insektenzellen, Gewebekultur, Pflanzenzellkultur, transgene Pflanzen oder Bakterien-Expressionssysteme.
Die Erfindung umfasst des Weiteren ein Arzneimittel zur Hemmung von Tumorzellwachstum, wobei die Tumorzellen mit einem Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid in einer Konzentration in Kontakt gebracht werden, die ausreicht, um das Wachstum der Tumorzellen zu hemmen. Das Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid kann ein Teil einer verträglichen pharmakologischen Formulierung sein. Tumorzellen, deren Wachstum durch ein Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid gehemmt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Karzinomzellen, hämatopoetische Krebszellen, Leukämizellen, Lymphomzellen und Melanomzellen. In einer Ausführungsform sind die Tumorzellen steroidempfindliche Tumorzellen, zum Beispiel Mamma-Tumorzellen.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptide für die Hemmung der viralen Replikation verwendet, wobei Zellen, die mit einem Virus infiziert sind, mit Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptiden in einer Konzentration, die für die Hemmung der viralen Replikation innerhalb der Zellen wirksam ist, in Kontakt gebracht werden. Das Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid kann ein Teil irgendeiner verträglichen pharmakologischen Formulierung sein. Die Replikation von sowohl RNA- als auch DNA-Viren kann durch Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptide gehemmt werden. Beispielhafte RNA-Viren umfassen Katzen-Leukämievirus, progressiven Schaf-Pneumonie-Virus, Schaf-Lentivirus, infektiösen Pferde-Anämievirus, Rinder-Immunschwächevirus, Visna-Maedi-Virus, Ziegen-Arthritis-Encephalitis-Virus, menschlichen Immunschwächevirus (HIV) oder Hepatitis C-Virus (HCV). Ein beispielhaftes DNA-Virus ist Hepatitis B-Virus (HBV).
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel für die Behandlung einer Autoimmunkrankheit bei einem Individuum, das eine solche Behandlung benötigt. In einer Ausführungsform ist die Autoimmunkrankheit multiple Sklerose. Das Arzneimittel, das dem Individuum verabreicht werden soll, enthält eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptids. Das Hybrid-Interferon (hybIFN) kann zum Beispiel oral oder über intravenöse oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Oral verabreichtes hybIFN wird von dem Individuum bevorzugt aufgenommen.
Andere Ausführungsformen der Erfindung umfassen ein Verfahren zur Behandlung von Lupus erythematodes, Diabetes vom Typ I und rheumatoider Arthritis bei einem Individuum, das eine solche Behandlung benötigt. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptids der vorliegenden Erfindung an das Individuum.
Dieses und andere Ziele und Merkmale der Erfindung werden vollständiger verstanden werden, wenn die folgende detaillierte Beschreibung in Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1A, 1B, 1C, 1D und 1E stellen die Nucleinsäure-Codierungssequenz eines synthetischen Gens von oνIFNτ dar, hergestellt, um 19 einzigartige Enzym-Restriktionsstellen zu umfassen, die gleichmäßig über die Codierungssequenz verteilt sind.
2 zeigt die Clonierungsstrategie, die verwendet wird, um ein synthetisches Gen, das oνIFNτ codiert, herzustellen.
3 zeit einen Vergleich der vorhergesagten Proteinsequenzen eines menschlichen Interferon-τ-Gens und eines Schaf-Interferon-τ-Gens. Abweichende Aminosäuren sind durch Darstellung der alternativen Aminosäure auf der Linie unterhalb der Nucleinsäuresequenzen angezeigt.
4 stellt Daten dar, die zeigen, dass sowohl OvIFNτ als auch IFNα in der Lage waren, das Wachstum von HL-60-Zellen drastisch zu reduzieren.
5 stellt Daten dar, die zeigen, dass rHuIFNα cytotoxisch ist und OvIFNτ nicht. In der Figur werden die Ergebnisse eines von drei Replikationsversuchen als mittlere %uale Lebensfähigkeit ± SA dargestellt.
6 stellt die Polypeptidsequenzen, die von der IFNτ-Sequenz abstammen, dar.
7 stellt die vollständige Nucleinsäure- und Aminosäuresequenz einer OvIFNτ-Sequenz dar.
8 stellt Daten dar, die den Mangel an Cytotoxizität im Vergleich mit IFNα untermauert, wenn IFNτ verwendet wird, um periphere mononucleäre Blutzellen zu behandeln.
9 zeigt die Ergebnisse der Behandlung einer menschlichen kutanen T-Zell-Lymphomlinie, HUT 78, mit IFNτ.
10 zeigt die Ergebnisse der Behandlung einer menschlichen T-Zell-Lymphomlinie, H9, mit IFNτ.
11A stellt Daten für die Peptidhemmung relativ zur FIV (Katzen-Immunschwächevirus)-Replikation von Polypeptiden, die von OvIFNτ mit gesamtem OvIFNτ abstammen, dar.
11B stellt Daten für die Peptidhemmung relativ zur HIV (menschliches Immunschwächevirus)-Replikation von Polypeptiden, die von OvIFNτ mit gesamtem OvIFNτ abstammen, dar.
12 stellt Daten dar, die die Hemmung der antiviralen Aktivität von IFNτ durch von IFNτ abstammenden Peptiden zeigen.
13 stellt Daten dar, die die Hemmung der antiviralen Aktivität von OvIFNτ durch von IFNτ abstammenden Peptiden zeigen.
14 stellt Daten dar, die die Hemmung der antiviralen Aktivität von Rinder-IFNα durch von IFNτ abstammenden Peptiden zeigen.
15 stellt Daten dar, die die Hemmung der antiviralen Aktivität von menschlichem IFNα durch von IFNτ abstammenden Peptiden zeigen.
16 stellt Daten dar, die das Fehlen der Hemmung der antiviralen Aktivität von Rinder-IFNα durch von IFNτ abstammenden Peptiden zeigen.
17 stellt Daten vor, die die Hemmung der antiviralen Aktivität von IFNτ durch Antiserum gegen von IFNτ abstammendes Peptid zeigen.
18 stellt Daten vor, die die Hemmung der Bindung von radioaktiv markiertem IFNτ an Zellen durch Antiserum gegen von IFNτ abstammendes Peptid zeigen.
Die 19A und 19B stellen ein Alignment von Nucleinsäuresequenzen, die IFNτ-Polypeptide codieren, dar.
Die 20A und 20B stellen ein Alignment von Aminosäuresequenzen von IFNτ-Polypeptiden dar.
21 stellt Daten dar, die die Cytotoxizität von IFNτ mit IFNβ vergleichen.
Die 22A und 22B zeigen Cytotoxizitätsprofile von IFNαA (22A) und IFNτ (22B) auf MDBK-Zellen.
Die 23A und 23B zeigen die Wirkung von IFNτ auf die Cytotoxizität von IFNαA auf MDBK-Zellen.
Die 24A und 24B zeigen die Bindung von ¹²⁵I-IFNτ (24A) und ¹²⁵I- IFNαA (24B) an MDBK-Zellen sowie Scatchard-Diagramme der Bindungsdaten.
Die 25A und 25B zeigen die kompetitive Bindung von IFNτ (25A) und IFNαA (25B) an MDBK-Zellen.
26 zeigt die Bindungshemmung von IFNτ und IFNαA an MDBK-Zellen durch Antiseren, die gegen den N-Terminus (durchgehende Säulen) und C-Terminus (gestrichelte Säulen) von IFNτ produziert wurden im Vergleich zu vorher immunbehandelten Kontrollen (leere Säulen).
Die 27A und 27B zeigen Dosisreaktions/Okkupanzkurven für IFNτ (27A) und IFNαA (27B) auf MDBK-Zellen der prozentualen maximalen antiviralen Aktivität (o), Zytotoxizität (☐) und Bindung(♢).
28 zeigt ein Schema eines Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptids.
Kurze Beschreibung der Sequenzen
SEQ ID NO: 1 ist die Nucleotidsequenz eines synthetischen Gens, das Schaf-Interferon-τ (OvIFNτ) codiert. Ebenso gezeigt ist die codierte Aminosäuresequenz.
SEQ ID NO: 2 ist eine Aminosäuresequenz eines reifen OvIFNτ-Proteins.
SEQ ID NO: 3 ist eine synthetische Nucleotidsequenz, die ein reifes menschliches Interferon-τ (HuIFNτ)-Protein codiert.
SEQ ID NO: 4 ist eine Aminosäuresequenz für ein reifes HuIFNτ1-Protein.
SEQ ID NO: 5 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 von SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 6 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 34–64 von SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 7 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 62–92 von SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 8 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 90–122 von SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 9 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 119–150 von SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 10 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 139–172 von SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 11 ist die Nucleotidsequenz eines natürlichen HuIFNτ1-Gens mit einer Leadersequenz.
SEQ ID NO: 12 ist die vorhergesagte Aminosäure-Codierungssequenz der SEQ ID NO: 11.
SEQ ID NO: 13 ist ein 25-meres synthetisches Oligonucleotid gemäß der vorliegenden Erfindung.
SEQ ID NO: 14 ist ein 25-meres synthetisches Oligonucleotid gemäß der vorliegenden Erfindung.
SEQ ID NO: 15 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 von SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 16 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 34–64 von SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 17 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 62–92 von SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 18 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 90–122 von SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 19 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 119–150 von SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 20 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 139–172 von SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 21 ist die Nucleotidsequenz von cDNA HuIFNτ6.
SEQ ID NO: 22 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz, die als SEQ ID NO: 21 dargestellt ist, codiert wird.
SEQ ID NO: 23 ist die Nucleotidsequenz von cDNA HuIFNτ7.
SEQ ID NO: 24 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz, die als SEQ ID NO: 23 dargestellt ist, codiert wird.
SEQ ID NO: 25 ist die Nucleotidsequenz von cDNA HuIFNτ4.
SEQ ID NO: 26 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz, die als SEQ ID NO: 25 dargestellt ist, codiert wird.
SEQ ID NO: 27 ist die Nucleotidsequenz von cDNA HuIFNτ5.
SEQ ID NO: 28 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz, die als SEQ ID NO: 27 dargestellt ist, codiert wird.
SEQ ID NO: 29 ist die Nucleotidsequenz des genomischen DNA-Clons HuIFNτ2.
SEQ ID NO: 30 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz, die als SEQ ID NO: 29 dargestellt ist, codiert wird.
SEQ ID NO: 31 ist die Nucleotidsequenz, einschließlich der Leadersequenz, des genomischen DNA-Clons HuIFNτ3, eines natürlichen HuIFNτ-Gens.
SEQ ID NO: 32 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz (einschließlich der Leadersequenz), die durch die Sequenz, die als SEQ ID NO: 31 dargestellt ist, codiert wird.
SEQ ID NO: 33 ist die Nucleotidsequenz, ohne der Leadersequenz, des genomischen DNA-Clons HuIFNτ3, eines natürlichen HuIFNτ-Gens.
SEQ ID NO: 34 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz eines reifen menschlichen IFNτ-Proteins, codiert durch HuIFNr3, das durch die Sequenz, die als SEQ ID NO: 33 dargestellt ist, codiert wird.
SEQ ID NO: 35 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 von SEQ ID NO: 33
SEQ ID NO: 36 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 34–64 von SEQ ID NO: 33
SEQ ID NO: 37 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 62–92 von SEQ ID NO: 33
SEQ ID NO: 38 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 90–122 von SEQ ID NO: 33
SEQ ID NO: 39 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 119–150 von SEQ ID NO: 33
SEQ ID NO: 40 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 139–172 von SEQ ID NO: 33
SEQ ID NO: 41 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 1–23 von SEQ ID NO: 32
SEQ ID NO: 42 ist die Aminosäuresequenz von Fragment 1–23 von SEQ ID NO: 11
SEQ ID NO: 43 ist die Nucleotidsequenz, ohne der Leadersequenz, des DNA-Clons HuIFNτ1.
SEQ ID NO: 44 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz eines reifen menschlichen IFNτ-Proteins, codiert durch HuIFNτ1, das durch die Sequenz, die als SEQ ID NO: 43 dargestellt ist, codiert wird.
SEQ ID NO: 45 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 (reife Sequenz) der Sequenz A40068 (Bin 12, Zugang #gi 108955), die Rinder-TP-1 (Clon bTP509) codiert.
SEQ ID NO: 46 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 (reife Sequenz) der Sequenz BovTPH1Bcds1 (Bin 13, Zugang #gi 163767), die Rinder-TP-1 codiert.
SEQ ID NO: 47 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 (reife Sequenz) der Sequenz BovTPH1Ccds1 (Bin 14, Zugang #gi 163769), die Rinder-TP-1 codiert.
SEQ ID NO: 48 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 (reife Sequenz) der Sequenz A39505 (Bin 15, Zugang #gi 163769), die Rinder-TP-1 (Clon bTP4) codiert.
SEQ ID NO: 49 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 (reife Sequenz) der Sequenz OATP1P5cds1 (Bin 16, Zugang #gi 1412), die Schaf-TPp5 codiert.
SEQ ID NO: 50 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 (reife Sequenz) der Sequenz OATP1P3cds1 (Bin 17, Zugang #gi 1410), die Schaf-TPp3 codiert.
SEQ ID NO: 51 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 (reife Sequenz) der Sequenz SHP010TPcds1 (Bin 18, Zugang #gi 165821), die Schaf-TP-1 codiert.
SEQ ID NO: 52 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 (reife Sequenz) der Sequenz SHP02TPcds1 (Bin 19, Zugang #gi 165823), die Schaf-TP-1 codiert.
SEQ ID NO: 53 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Fragment 1–37 (reife Sequenz) der Sequenz GOTCTPIcds1 (Bin 21, Zugang #gi 164117), die IFN-tau von Capra hircus codiert.
SEQ ID NO: 54 ist die Nucleotidsequenz von chimerem Nucleinsäuremolekül, das von menschlicher DNA abstammt, mit einem 5'-Endsegment, das die Aminosäuren 1–28 von menschlichem IFNtau (von SEQ ID NO: 3) codiert, und einem 3'-Endsegment, das die Aminosäuren 29–166 von menschlichem IFNα (Clon pIFN105; Genbank HUMIFNN Zug. M28585) codiert.
SEQ ID NO: 55 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 54.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen.
Interferon τ (IFNτ) bezieht sich auf jedes aus einer Familie von Interferon-Proteinen, die mehr als 70% oder bevorzugt mehr als etwa 80% oder stärker bevorzugt mehr als etwa 90% Aminosäure-Homologie zu jeder Sequenz, die als (a) SEQ ID NO: 2 oder (b) SEQ ID NO: 34 dargestellt ist, hat. Aminosäure-Homologie kann zum Beispiel unter Verwendung des LALIGN-Programms mit Standard-Parametern bestimmt werden. Dieses Programm wird in der FASTA-Version 1,7-Suite nach den Sequenz-Vergleichsprogrammen (Pearson und Lipman 1988; Pearson 1990; Programm erhältlich von William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, VA) gefunden. Typischerweise hat IFNτ mindestens eine Eigenschaft aus der folgenden Gruppe an Eigenschaften: (a) wird während embryonaler/foetaler Stadien durch Trophectoderm/Plazenta exprimiert (b) antiluteolytische Eigenschaften, (c) antivirale Eigenschaften und (d) antizelluläre Vermehrungseigenschaften. IFNτ kann aus einer Vielzahl an Quellen erhalten werden, einschließlich Kühen, Schafen, Ochsen und Menschen.
Ein Interferon τ-Polypeptid ist ein Polypeptid, das zwischen etwa 15 und 172 Aminosäuren hat, die von einer Interferon-τ-Aminosäure-Codierungssequenz abstammen, wobei die 15–172 Aminosäuren in natürlichem Interferon-τ aufeinanderfolgend sind. Solche 15–172-Aminosäureregionen können auch zu Polypeptiden zusammengesetzt werden, wo zwei oder mehrere solcher Interferon-τ-Regionen, die normalerweise im natürlichen Protein nicht aufeinanderfolgen, verbunden werden.
Eine Polynucleotidsequenz oder -Fragment „stammt von" einer anderen Polynucleotidsequenz oder einem anderen Polynucleotidfragment „ab", wenn sie oder es dieselbe Nucleotidsequenz enthält, wie die, die in der Sequenz oder dem Fragment, von der oder dem sie abstammt, vorliegt. Zum Beispiel enthält ein Bakterienplasmid eine Insertion, die „von" einem ausgewählten menschlichen Gen „abstammt", wenn die Sequenz der Polynucleotide in der Insertion dieselbe ist, wie die Sequenz der Polynucleotide in dem ausgewählten menschlichen Gen.
Ähnlich „stammt" eine Polypeptid-Sequenz oder ein Polypeptid-Fragment „von" einer anderen Polypeptidsequenz oder einem anderen Polypeptidfragment „ab", wenn sie dieselbe Sequenz von Aminosäuren enthält, wie die, die in der Sequenz oder dem Fragment, von der oder dem sie abstammt, vorliegt.
Prozentuale (%) Identität mit Bezug auf zwei Aminosäuresequenzen bezieht sich auf die % an Resten, die in den beiden Sequenzen identisch sind, wenn die Sequenzen optimal ausgerichtet sind und keine Strafe den „Lücken" zugeschrieben wird. In anderen Worten, wenn eine Lücke in die erste Sequenz inseriert werden muss, um sie optimal mit einer zweiten Sequenz auszurichten, so wird die % Identität unter Verwendung lediglich der Reste berechnet, die mit einem entsprechenden Aminosäurerest gepaart sind (d.h. die Berechnung bezieht die Reste in den zweiten Sequenzen nicht mit ein, die in der „Lücke" der ersten Sequenz sind). Optimales Alignment wird als das Alignment definiert, das die höchste % Identitätszahl ergibt. Solche Alignments können unter Verwendung des „GENEWORKS"-Programms durchgeführt werden. Alternativ können Alignments unter Verwendung des lokalen Alignmentprogramms LALIGN durchgeführt werden, mit einem ktup von 1, Standardparametern und dem Standard-PAM.
Eine Krankheit „behandeln" bezieht sich auf die Verabreichung eines therapeutischen Stoffes, der wirksam ist, die Symptome der Krankheit zu reduzieren und/oder die Schwere der Krankheit zu verringern.
II. Isolierung und Charakterisierung von Interferon-τ
A. Schaf- und Rinder-Interferon-τ
1. Interferon-τ-Codierungssequenzen.
Schaf-Interferon-τ (OvIFNτ) ist ein wichtiges sekretorisches Konzeptus-Protein, das durch das embryonale Trophektoderm während der kritischen Phase der mütterlichen Erkennung beim Schaf hergestellt wird. Ein Isolat von reifem OvIFNτ ist 172 Aminosäuren lang (SEQ ID NO: 2). Die cDNA-Codierungssequenz enthält zusätzlich 23 Aminosäuren am aminoterminalen Ende des reifen Proteins (Imakawa, et al., 1987). Die Codierungssequenz dieses OvIFNτ-Isolats wird als 7 dargestellt.
Relativ zu anderen Interferonen teilt oIFNτ etwa 45 bis 68% Aminosäurehomologie mit Interferon-α und die größte Sequenzähnlichkeit von etwa 68% mit den Interferon-ωs (IFN ωs).
Für die Isolation von OvIFNτ-Protein wurden Konzepti von trächtigen Schafen gewonnen und in vitro in einem modifizierten essenziellen Minimalmedium, wie zuvor beschrieben (Godkin, et al., 1982), gezüchtet. Die Konzepti wurden an verschiedenen Tagen der Trächtigkeit gewonnen, wobei der erste Tag der Paarung als Tag 0 beschrieben wurde. OvIFNτ wurde vom Konzeptus-Kulturmedium, im Wesentlichen wie beschrieben durch Vallet, et al., 1987 und Godkin, et al., 1982, gereinigt.
Die Homogenität von OvIFNτ wurde durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE; Maniatis, et al., 1982; Ausubel, et al., 1988) festgestellt. Die Bestimmung der Proteinkonzentration in gereinigten OvIFNτ-Proben wurde unter Verwendung des Bicinchoninsäure (BCA)-Tests (Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Smith, P. K. et al., 1985) durchgeführt.
Ein zu OvIFNτ homologes Protein wurde aus Kühen isoliert (BoIFNτ; Helmer, et al., 1987; Imakawa, et al., 1989). OvIFNτ und BoIFNτ (i) haben bei der mütterlichen Erkennung von Trächtigkeit ähnliche Funktionen und (ii) teilen einen hohen Grad an Aminosäure- und Nucleotidsequenzhomologie zwischen den reifen Proteinen. Die Nucleinsäure- Sequenzhomologie zwischen OvIFNτ und BoIFNτ beträgt 76,3% für die 5'-nicht-codierende Region, 89,7% für die codierende Region und 91,9% für die 3'-nicht-codierende Region. Die Aminosäure-Sequenzhomologie beträgt 80,4%.
Beispiel 1 beschreibt die reproduktiven Funktionen von OvIFNτ. OvIFNτ und rekombinantes menschliches Interferon-α2 (rHUIFNα) wurden in verschiedenen Konzentrationen in das uterine Lumen von Mutterschaften gespritzt. Die Lebensdauer des Corpus luteum wurde durch Untersuchung der interöstrischen Intervalle, der Aufrechterhaltung der Progesteron-Sekretion und der Hemmung der Prostaglandin-Sekretion festgestellt (Davis, et al., 1992). Der Vergleich der Daten, die sich aus diesen Untersuchungen ergeben, zeigte eine beträchtliche Verlängerung des interöstrischen Intervalls, wenn OvIFNτ in einer Höhe von 100 μg/Tag verabreicht wird, und keine bedeutende Wirkung, wenn rHuIFNα verabreicht wird. Diese Daten unterstützen den Schluss, das OvIFNτ die biochemischen Abläufe des östrischen Zyklus deutlich beeinflusst.
Die antiviralen Eigenschaften von Interferon-τ in verschiedenen Stadien des reproduktiven Zyklus wurden ebenfalls untersucht (Beispiel 2). Konzeptus-Kulturen wurden unter Verwendung von Konzeptus, der an den Tagen 12 bis 16 des östrischen Zyklus vom Schaf gewonnen wurde, etabliert. Die antivirale Aktivität des Überstands von jeder Konzeptus-Kultur wurde festgestellt. Kulturüberstände hatten eine zunehmende antivirale Aktivität in Verbindung mit fortschreitender Entwicklung des Konzeptus bis zum Tag 16 nach dem Östrus.
2. Rekombinante Herstellung von IFNτ
Rekombinantes OvIFNτ wurde unter Verwendung von Bakterien- und Hefezellen hergestellt. Die Aminosäure-Codierungssequenz für OvIFNα wurde verwendet, um eine entsprechende DNA-Codierungssequenz zu erzeugen, wobei die Codon-Verwendung für die Expression in E. coli optimiert war (Beispiel 3). Die codierende DNA-Sequenz wurde durch sequentielles Zusetzen von Oligonucleotiden synthetisch konstruiert. Clonierte Oligonucleotide wurden unter Verwendung der Restriktionsspaltungen und -ligierungen, die in 2 erklärt sind, zu einem einzelnen Polynucleotid fusioniert. Die Polynucleotid-Codierungssequenz hatte die Sequenz, die als SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Für die Expression von rekombinanten Interferon-Polypeptiden, wie synthetischem OvIFNτ oder dem Hybrid-Interferon-Polypeptid der vorliegenden Erfindung, kann die chimere Codierungssequenz in eine Vielzahl von bakteriellen Expressionsvektoren platziert werden: zum Beispiel Lambda gt11 (Promega, Madison WI)-; pGEX (Smith, D. B. et al., 1988)-; pGEMEX (Promega)-; und pBS (Stratagene, La Jolla CA)-Vektoren. Andere bakterielle Expressionsvektoren, die geeignete Promotoren enthalten, wie der T7-RNA-Polymerase-Promotor oder der tac-Promotor können ebenfalls verwendet werden. Die Clonierung des synthetischen OvIFNτ-Polynucleotids in einen modifizierten pIN III omp-A-Expressionsvektor wird in Beispiel 3 beschrieben. Die Herstellung des OvIFNτ-Proteins wurde durch Zusetzen von IPTG induziert. Lösliches rekombinantes IFNτ wurde durch Ultraschall oder osmotische Fraktionierung von den Zellen freigesetzt.
Das Protein kann weiterhin durch Standardverfahren, einschließlich der Größenfraktionierung (Säulen-Chromatographie oder präoperative Gelelektrophorese) oder der Affinitätschromatographie zum Beispiel unter Verwendung von anti-Interferon-Antikörpern (fester Träger, erhältlich von Pharmacia, Piscataway NJ) gereinigt werden. Proteinherstellungen können zum Beispiel auch durch Filtration (Amicon, Danvers, Mass.) aufkonzentriert werden.
Das synthetische OvIFNτ-Gen wurde auch in den Hefe-Clonierungsvektor pBS24Ub (Beispiel 4; Sabin, et al., 1989; Ecker, et al., 1989) cloniert. Synthetische Verbindungen wurden konstruiert, um Fusion der OvIFNτ-Codierungssequenzen mit den Ubiquitin-Codierungssequenzen im Vektor im Rahmen zu gewährleisten. Die entstandene Verbindung erlaubte eine Spaltung der Ubiquitin-Sequenzen von den OvIFNτ-Sequenzen in vivo.
Das rekombinante Plasmid pBS24Ub-IFNτ wurde in die Hefe S. cerevisiae transformiert. Die transformierten Hefezellen wurden gezüchtet, lysiert und das rekombinante IFNτ (r-IFNτ)-Protein wurde von den Zelllysaten isoliert.
Die Menge an r-IFNτ wurde durch Radioimmuntest quantifiziert. Die Microsequenzierung des gereinigten r-IFNτ wurde durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten über die ersten 15 Aminosäuren eine Identität mit natürlichem OvIFNτ. Die Ergebnisse bestätigten auch, dass das Ubiquitin/IFNτ-Fusionsprotein in vivo korrekt prozessiert wurde.
Rekombinantes IFNτ, das durch dieses Verfahren erhalten wurde, zeigte eine antivirale Aktivität, die zu der antiviralen Aktivität von IFNτ, das von Konzeptus konditioniertem Kulturmedium gereinigt war, ähnlich war.
Andere Hefevektoren können in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Sie umfassen 2 Micron-Plasmidvektoren (Ludwig, et al., 1993), integrierende Hefeplasmide (YIps; z.B., Shaw, et al., 1988), YEP-Vektoren (Shen, et al., 1986), centromere Hefeplasmide (YCps; z.B., Ernst, 1986) und Ähnliche. Die Vektoren umfassen vorzugsweise eine Expressionskassette, die einen wirksamen Hefe-Promotor, wie den MFα1-Promotor (Ernst, 1986; Bayne, et al., 1988), den GADPH-Promotor (Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase; Wu, et al., 1991), den Galactose-induzierbaren GAL10-Promotor (Ludwig, et al., 1993, Feher, et al., 1989; Shen, et al., 1986) oder den Methanol-regulierten Alkohol-Oxidase (AOX)-Promotor enthält. Der AOX-Promotor ist in Pichia pastoris-Wirtszellen besonders nützlich (zum Beispiel wird der AOX-Promotor in pHIL- und pPIC-Vektoren, die im Pichia-Expressionskit, erhältlich von Invitrogen, San Diego, CA, eingeschlossen sind, verwendet).
Die Expressionskassette kann zusätzliche Elemente enthalten, um die Expression und Reinigung des rekombinanten Proteins zu erleichtern und/oder die Insertion der Cassette in einen Vektor oder ein Hefe-Chromosom zu erleichtern. Zum Beispiel kann die Kassette eine Signalsequenz zur Steuerung der Sezernierung des Proteins enthalten. Eine beispielhafte Signalsequenz, die für die Verwendung in verschiedenen Hefe-Expressionsvektoren geeignet ist, ist die MFα1-prä-pro-Signalsequenz (Bayne, et al., Ludwig, et al., 1993; Shaw, et al., 1988). Andere Signalsequenzen können ebenfalls verwendet werden. Zum Beispiel ist die Pho1-Signalsequenz (Elliot, et al., 1986) in Pichia pastoris- und Schizosaccharomyces pombe-Wirtszellen besonders wirksam.
Beispielhafte Expressionskassetten umfassen (i) eine Kassette, die (5' zu 3') den AOX-Promotor, die Pho1-Signalsequenz und eine DNA-Sequenz enthält, die OvIFNτ codiert, für die Expression in Pichia pastoris-Wirtszellen, und (ii) eine Kassette, die (5' zu 3') den MFα1-Promotor, die MFα1-prä-pro-Signalsequenz und eine DNA-Sequenz enthält, die eine Interferonzusammensetzung der vorliegenden Erfindung codiert für die Expression in S. cerevisiae-Wirtszellen.
Zusätzliche Hefe-Vektoren, die zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf andere Vektoren mit regulierbarer Expression (Hitzeman, et al., 1988; Rutter, et al., 1988; Oeda, et al., 1988). Der Hefe-Transformationswirt ist typischerweise Saccharomyces cerevisiae, jedoch können, wie vorstehend veranschaulicht, auch andere Hefen, die für die Transformation geeignet sind (z.B. Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris und Ähnliche) verwendet werden.
Die DNA, die Interferon-Polypeptid codiert, kann in irgendeine Anzahl an im Handel erhältlichen Vektoren cloniert werden, um die Expression des Polypeptids im geeigneten Wirtssystem zu erzeugen. Diese Systeme umfassen die vorstehend beschriebenen Bakterien- und Hefe-Expressionssysteme sowie folgende: Baculovirus-Expression (Reilly, et al., 1992; Beames, et al., 1991; Clontech, Palo Alto CA); Pflanzenzell-Expression, transgene Pflanzenexpression (z.B. S. B. Gelvin und R. A. Schilperoot, Plant Molecular Biology, 1988) sowie die Expression in Säugerzellen (Clontech, Palo Alto CA; Gibco-BRL, Gaithersburg MD). Diese rekombinanten Polypeptide können als Fusionsproteine oder als natürliche Proteine exprimiert werden. Eine Anzahl von Merkmalen kann in die Expressionsvektoren konstruiert werden, wie Leadersequenzen, die die Sezernierung der exprimierten Sequenzen in Kulturmedium fördern. Die rekombinant hergestellten Polypeptide werden typischerweise von lysierten Zellen oder Kulturmedien isoliert. Die Reinigung kann durch Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich der Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie. Immunaffinitäts-chromatographie kann, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von Antikörpern, die basierend auf den IFN-Polypeptiden erzeugt sind, verwendet werden.
B. Menschliches Interferon-τ
1. Identifikation und Clonierung von menschlichen Genomsequenzen, die ein Interferon-τ-Protein codieren
Menschliche genomische DNA wurde auf homologe Sequenzen zu Interferon-τ abgesucht (Beispiel 5). Verschiedene Sequenzen, die mit der OvIFNτ-CDNA-Sonde hybridisierten, wurden identifiziert. Verschiedene Clone, die Teilsequenzen von menschlichem Interferon-τ enthielten, wurden dann isoliert (Beispiel 6). Zwei synthetische 25-mere Oligonucleotide, die Sequenzen der OvIFNτ-cDNA entsprechen (Imakawa, et al., 1987; Whaley, et al., 1994) wurden synthetisiert. Diese Primer wurden in Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von DNA, die von den folgenden beiden cDNA-Banken abgeleitet wurde, verwendet: menschliche Plazenta und menschliche Cytotrophoblastenzellen, die von Geburts-Plazenta isoliert wurden. Die entstandenen amplifizierten DNA-Fragmente wurden elektrophoretisch getrennt und eine Bande, die menschliche IFNτ-Amplifikationsprodukte enthielt, wurde isoliert. Die Amplifikationsprodukte wurden subcloniert und die inserierten Amplifikationsprodukte unter Verwendung des Didesoxy-Terminierungsverfahrens sequenziert.
Ein Vergleich der Sequenzen von fünf dieser Clone zeigte einen hohen Grad an Sequenzhomologie zwischen den Isolaten, aber die Sequenzen waren nicht identisch. Dieses Ergebnis legt die Existenz von multiplen Varianten an menschlichen Interferon-τ-Genen nahe. Eine Analyse der Nucleotid- und Proteinsequenzen legt nahe, dass menschliche Interferon-τ-Gene auf der Basis der Sequenzhomologie in mindestens drei Gruppen klassifiziert werden können. Die Gruppen sind im Folgenden dargestellt.
Beispiel 7 beschreibt die Isolierung verschiedener menschlicher IFNτ-Gene voller Länge. DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus menschlichen peripheren mononucleären Blutzellen (PBMCs) isoliert und größenfraktioniert. Die Fraktionen wurden unter Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion auf die Gegenwart von IFNτ-Sequenzen getestet: DNA-Moleküle aus Fraktionen, die amplifikationspositiv getestet wurden, wurden verwendet, um eine subgenomische Bank in λgt11 zu erzeugen.
Diese subgenomische Bank wurde ausgestrichen mit einer OvIFNτ-cDNA-Sonde und hybridisiert (Beispiel 7A). Etwa 20 Clone, die mit der Sonde hybridisierten, wurden identifiziert. Plaques, die den positiven Clonen entsprachen, wurden Passagen unterzogen, DNA isoliert und durch Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von OvIFNτ-Primern analysiert. Von diesen 20 Plaques erzeugten sechs Plaques positive PCR-Signale. Der Phage von diesen sechs Clonen wurde gereinigt und die Insertionen sequenziert. Eine dieser Insertionen von einem dieser sechs Clone wurde als Hybridisierungssonde im folgenden Screening verwendet.
Rekombinanter Phage von der subgenomischen λgt11 Bank wurde unter Verwendung der eben beschriebenen Hybridisierungssonde abgesucht (Beispiel 7B). Fünf Clone, die positive Hybridisierungssignale ergaben, wurden isoliert und die Insertionen sequenziert. Die Sequenzen von drei Clonen überlappten und die entstandene Consensus-Nucleinsäuresequenz (HuIFNτ1) wird als SEQ ID NO: 11 dargestellt, wobei die vorhergesagte Proteincodierungssequenz als SEQ ID NO: 12 dargestellt ist. Die vorhergesagte Codierungssequenz des reifen Proteins wird als SEQ ID NO: 4 dargestellt. Die Sequenzen von den anderen beiden Clonen werden als SEQ ID NO: 29 (HuIFNτ2) und SEQ ID NO: 31 (HuIFNτ3) dargestellt. Die vorhergesagte reife Aminosäuresequenz von HuIFNτ2 wird als SEQ ID NO: 30 dargestellt. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz von HuIFNτ3 wird als SEQ ID NO: 32 dargestellt und die reife Aminosäuresequenz als SEQ ID NO: 34.
Ein Vergleich der vorhergesagten Proteinsequenzen (3) von einem der menschlichen Interferon-τ-Gene (SEQ ID NO: 4) und dem Schaf-Interferon-τ-Gen zeigt die Höhe der Sequenzhomologie und -divergenz auf der Ebene der Aminosäuren.
Das Alignment der Nucleinsäuresequenzen der sieben hierin beschriebenen menschlichen Interferon-τ-Nucleinsäuresequenzen (Beispiele 6 und 7) mit Schaf-Interferon-τ ist in den 19A und 19A gezeigt. Die Sequenzen von OvIFNτ (oIFNτ), HuIFNτ1, HuIFNτ2 und HuIFNτ3 starten an der oberen linken Ecke von 19A mit dem Initiationscodon ATC und führen durch die zweite Seite der Figur weiter. Die Sequenzen von HuIFNτ4, HuIFNτ5, HuIFNτ6 und HuIFNτ7 starten etwa bei der Hälfte von 19A mit dem CAG-Codon an der Aminosäureposition 40 (rechts von den Ausrufezeichen) und führen durch die zweite Seite der Figur weiter. Die 5'- und 3'-Enden jedes der Clone für HuIFNτ4, HuIFNτ5, HuIFNτ6 und HuIFNτ7 sind durch Ausrufezeichen dargestellt.
Die vollständige Codierungssequenz von OvIFNτ wird in der oberen Reihe von jedem ausgerichtetem Satz dargestellt. Nucleotide in den anderen Sequenzen sind nur an Stellen angezeigt, wo sie sich von jenen von OvIFNτ unterscheiden. Kleinbuchstaben stehen für Nucleotidveränderungen, die keine Aminosäureveränderungen ergeben, während Großbuchstaben die Veränderungen darstellen, die eine Aminosäuresubstitution ergeben.
Ein Alignment der sieben entsprechenden Aminosäuresequenzen, im Wesentlichen auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben konstruiert, wird in den 20A und 20B dargestellt. Wie vorstehend wird die vollständige Aminosäuresequenz von OvIFNτ in der oberen Reihe dargestellt, und Aminosäuren von anderen Sequenzen sind nur an Stellen angezeigt, wo sie sich von der Schaf-Sequenz unterscheiden.
Eine Untersuchung der Alignments zeigt, dass die sieben Sequenzen in mindestens drei Gruppen gruppiert werden können. Gruppe I enthält HuIFNτ1 und HuIFNτ2, Gruppe II enthält HuIFNτ3, HuIFNτ4 und HuIFNτ5 und Gruppe III enthält HuIFNτ6 und HuIFNτ7. Diese Gruppen können Familien von Interferon-τ-Genen darstellen, die unterschiedliche zelluläre Funktionen haben.
Diese Gruppierungen wurden basierend auf den folgenden Kriterien eingerichtet. In reifen Proteinen haben HuIFNτs von Gruppe I ein Asparagin (ASN) an der Aminosäureposition 95 (Nummern bezogen auf 20A bis 20B), ein Methionin (MET) an der Aminosäureposition 104 und ein Leucin (LEU) an der Aminosäureposition Nummer 120; HuIFNτs von Gruppe II haben eine Asparaginsäure (ASP) an der Aminosäureposition Nummer 95, ein Threonin (THR) an der Aminosäureposition Nummer 104 und ein Methionin (MET) an der Aminosäureposition Nummer 120; und HuIFNτs der Gruppe III haben ein Arginin (ARG) an der Aminosäureposition Nummer 72, ein Valin (VAL) an der Aminosäureposition Nummer 120 und ein Serin (SER) an der Aminosäureposition Nummer 122.
Die menschlichen Nucleinsäure- und Polypeptid-IFNτ-Sequenzen, dargestellt als SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 und SEQ ID NO: 34 können als Quelle für spezifische Primer und Sonden zum Nachweis von Isolaten weiterer menschlicher IFNτ-Codierungssequenzen und/oder Pseudogene verwendet werden. Weiter, wie vorstehend beschrieben, kann es mehr als eine Isoform des IFNτ-Proteins und mehr als eine Codierungssequenz pro Art geben. Die spezifischen Nucleinsäuresonden, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und Antikörper, die mit den IFNτ-Polypeptiden reagieren, können bei der Isolierung von nicht-identifizierten Varianten von Interferon-τ in Säugern gemäß den Verfahren der hierin offenbarten Erfindung von Nutzen sein.
2. Charakterisierung der Expression von Interferon-τ in menschlichen Geweben
Menschliche plazentale cDNA-Banken und eine Schaf-cDNA-Bank wurden durch Hybridisierung mit der OvIFNτ-cDNA-Sonde (Beispiel 8) analysiert. Diese DNA-Hybridisierungsanalyse legte nahe, dass die IFNτ-Signale von menschlichen cDNA-Banken etwa 1/100 des Signals betrugen, das unter Verwendung der Schaf-cDNA-Bank erhalten wurde. OvIFNτ-cDNAs stellen etwa 0,4% aus der Schaf-cDNA-Bank dar. Entsprechend scheint die Abundanz an menschlichen cDNAs, die auf die OvIFNτ-Sonde reagieren, niedrig zu sein, zumindest in der Geburts-Plazenta, von der die cDNA-Banken erzeugt wurden.
Die Gegenwart von HuIFNτ-mRNA in menschlicher Geburts-Plazenta und Aminocyten wurde ebenfalls analysiert. Die Ergebnisse lassen die Gegenwart von HuIFNτ-mRNA in dem foeto-plazentalen Annex annehmen. Die Aminocyten exprimierten ebenfalls die Botschaften, die OvIFNτ-Primern und der menschlichen Sonde entsprachen, was annehmen lässt, dass die Expression von IFNτ-mRNA nicht auf die Geburts-Plazenta beschränkt ist.
Zusätzlich wurde eine RT-PCR-Analyse auf die Gegenwart von HuIFNτ bei der gesamten zellulären RNA, die aus adulten menschlichen Lymphocyten isoliert war, durchgeführt: die Ergebnisse legen nahe, dass IFNτ-mRNA in Lymphocyten existiert.
Die Expression von Interferon-τ in menschlichem Gewebe wurde ebenfalls unter Verwendung von in situ-Hybridisierung untersucht (Beispiel 9). Abschnitte von vier gesunden verschiedenen menschlichen Plazentas zum Zeitpunkt der Geburt und vom ersten Trimester wurden untersucht. Diese Analyse verwendete eine cDNA-Sonde, die von den OvIFNτcDNA-Sequenzen abstammte (Beispiel 9B). In situ-Hybridisierung wurde unter Verwendung einer Antisense-RNA-Sonde durchgeführt. In drei getrennten Versuchen wurde in allen plazentalen Geweben zum Zeitpunkt der Geburt und vom ersten Trimester eine spezifische Hybridisierung beobachtet.
Plazentale Zotten aus dem ersten Trimester (zusammengesetzt aus einer äußeren Schicht von Syncytiotrophoblasten, einer darunterliegenden Schicht aus Cytotrophoblasten und einer zentralen Stroma-Region mit verschiedenen Typen mesenchymaler Zellen) zeigten die höchste IFNτ-Transkriptionsmenge in den Cytotrophoblastenzellen. Weniger intensive, jedoch nachweisbare Mengen waren sowohl im Syncytiotrophoblasten als auch den Stromazellen vorhanden. Ein ähnliches Muster der Transkriptions-Expression wurde in den plazentalen Zotten von Geburtsgewebe gezeigt, jedoch war die Menge des Signalnachweises gering. Trophoblasten außerhalb der Zotten aus dem ersten Trimester zeigten die größte Menge an Boten und färbten sich positiv, wenn sie in den mütterlichen Bluträumen innerhalb der Decidua vorhanden waren.
Howatson, et al., (1988) bemerkte eine IFNα-Produktion in den Syncytiotrophoblasten von Chorion-Zotten sowohl in Geweben aus dem ersten Trimester als auch in Geburtsgewebe. Auch Paulesu, et al., (1991) beobachteten IFNα in Trophoblasten außerhalb der Zotten sowie in Syncytiotrophoblasten, wobei er eine intensivere und reichliche Reaktivität in plazentalem Gewebe des ersten Trimesters im Vergleich zu jenem, das zum Zeitpunkt der Geburt genommen wurde, bemerkte. Diese Forscher verwendeten Antikörper, die gegen menschliche IFNα-Untertypen produziert waren, und keiner beobachtete IFNα in den Zotten-Cytotrophoblasten.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass das menschliche IFNτ-Gen in frühen Plazentageweben durch wandernde Trophoblasten außerhalb der Zotten stark exprimiert wird, jedoch auch in Zotten-Syncytiotrophoblasten, -Cytotrophoblasten und verschiedenen Stromazellen exprimiert wird. Diese Ergebnisse zeigen den Nachweis von IFNτ-Transkripten in menschlichen Schwangerschaftsgeweben und die IFNτ-Expression in den Zotten-Cytotrophoblasten sowie in den Trophoblasten außerhalb der Zotten von Plazenta aus dem ersten Trimester.
C. Antivirale Eigenschaften von Interferon-τ
Die antivirale Aktivität von OvIFNτ wurde gegen mehrere Viren untersucht, einschließlich sowohl RNA- als auch DNA-Viren. Die relative spezifische Aktivität von OvIFNτ, gereinigt zur Homogenität, wurde in antiviralen Tests untersucht (Beispiel 10). OvIFNτ hatte eine höhere spezifische antivirale Aktivität sowohl als rBoIFNα als auch rBoIFNγ (Beispiel 10, Tabelle 3).
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass OvIFNτ eine starke antivirale Aktivität mit begrenzten cytotoxischen Wirkungen hat. Hochgereinigtes OvIFNτ wurde an peripheren Blut-Lymphocyten, die Katzen-AIDS und menschlichen AIDS-Retroviren ausgesetzt wurden, auf anti-retrovirale und cytotoxische Wirkungen getestet (Bazer, et al., 1989). Das Katzen-AIDS-Lentivirus ruft ein chronisches Aids-ähnliches Syndrom bei Katzen hervor und ist ein Modell für menschliches AIDS (Pederson, et al., 1987). Die Replikation der beiden Viren in peripheren Blut-Lymphocyten (PBL) wurde durch reverse Transkriptase (RT)-Aktivität in Kulturüberstanden über die Zeit überwacht.
Um die antivirale Aktivität von IFNτ gegen FIV und HIV zu bestimmen, wurde eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-RT-Aktivität in mit FIV und HIV infizierten Katzen- und menschlichen PBL-Kulturen, die mit OvIFNτ behandelt wurden, getestet (Beispiel 11). Die Replikation von FIV war auf etwa ein Drittel der Kontrollwerte reduziert, wenn Zellen in Gegenwart von OvIFNτ gezüchtet wurden. Zusetzen von OvIFNτ erzeugte einen schnellen, dosisabhängigen Rückgang der reversen Transkriptase (RT)-Aktivität (Beispiel 11, Tabelle 4). Während so geringe Konzentrationen wie 0,62 ng/ml IFNτ die virale Replikation hemmten, waren viel höhere Konzentrationen (40 ng/ml), die größere Auswirkungen auf die RT-Aktivität haben, ohne toxische Wirkungen auf die Zellen. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Replikation des Katzen-Immunschwächevirus im Vergleich zu Kontrollwerten signifikant verringert war, wenn die Zellen in Gegenwart von OvIFNτ gezüchtet wurden.
Es schien, als ob IFNτ keine cytotoxische Wirkung auf die Zellen ausübte, die den Retrovirus beherbergten. Dies war der Fall, sogar wenn IFNτ in einer Menge von 40 ng/ml Kulturmedium vorhanden war. Diese Konzentration an IFNτ entspricht etwa 8.000 antiviralen Einheiten an Alpha-Interferon – wenn OvIFNτ und HuIFNα beide auf ihre Fähigkeit, Madin-Darby-Rindernierenzellen vor der Lyse durch vesikuläre Stomatitisviren zu schützen, getestet werden (Lysetest wie durch Pontzer et al, 1988, beschrieben).
IFNτ wurde auch auf seine Aktivität gegen HIV-Replikation in menschlichen Zellen getestet. Menschliche periphere Lymphocyten, die mit HIV infiziert worden waren, wurden mit verschiedenen Konzentrationen von IFNτ behandelt (Beispiel 12). Die Replikation von HIV in peripheren Blut-Lymphocyten wurde durch reverse Transkriptase-Aktivität in Kulturüberständen über die Zeit überwacht. Über einen IFNτ-Konzentrationsbereich hinweg wurden signifikante anti-HIV-Wirkungen erzeugt (Beispiel 12, Tabelle 5). Eine Konzentration von nur 10 ng/ml ergab nach nur sechs Tagen einen Rückgang der RT-Aktivität von mehr als 50%. Eine Konzentration von 500 ng/ml ergab innerhalb von 10 Tagen einen Rückgang der RT-Aktivität von 90%. Weiterhin gab es keinen Hinweis auf toxische Wirkungen, die der Verabreichung von IFNτ zuzuschreiben waren (Beispiel 12, Tabelle 5).
Weiterhin wurden die antiviralen Wirkungen von IFNτ gegen HIV durch die Behandlung menschlicher PBMC-Zellen mit verschiedenen Mengen von entweder rekombinantem IFNτ oder rekombinantem menschlichem IFNα zum Zeitpunkt der Infektion mit HIV getestet (Beispiel 19). Die Daten aus diesen Versuchen (Beispiel 19, Tabelle 11) unterstützen den Schluss, dass IFNα und IFNτ in ähnlichen Konzentrationen bei der Reduktion der Replikation von HIV in menschlichen Lymphocyten wirksam sind. Die Behandlung von Zellen mit IFNα ergab jedoch eine Cytotoxizität, wohingegen bei der Behandlung mit IFNτ keine solche Cytotoxizität beobachtet wurde, sogar wenn IFNτ in viel höheren Konzentrationen verwendet wurde. Bei der Verwendung von IFNτ wurde keine Cytotoxizität beobachtet, auch wenn IFNτ in der 200-fachen Dosis von Interferon-Alpha II verwendet wurde.
Beide reversen Transkriptasen, FIV und HIV, selbst wurden in Abwesenheit von PBL nicht durch IFNτ beeinträchtigt. Deshalb ist die antivirale Aktivität keiner direkten Wirkung auf die virale RT zuzuschreiben.
Es wurde auch gezeigt, dass Interferon-τ die DNA-Replikation von Hepatitis B-Virus in Leberzellen hemmt (Beispiel 19). Eine menschliche Zelllinie, die von Leberzellen abstammt, die mit Hepatitis B-Virus (HBV) transfiziert wurden, wurde verwendet, um die antiviralen Wirkungen von IFNτ zu testen. Die Zellen wurden sowohl mit dem IFNα als auch mit dem IFNτ über einen Konzentrationsbereich behandelt. Sowohl IFNα als auch IFNτ reduzierten die DNA-Produktion um etwa das zweifache im Vergleich zur Kontrolle ohne Interferon.
Um zu zeigen, dass die Wirkung der Interferone für den infizierenden Virus spezifisch war und nicht das Ergebnis einer Wirkung auf den allgemeinen Zellstoffwechsel, wurden die Hepatocyten auf die Auswirkungen von IFNα und IFNτ auf die hepatospezifische mRNA-Produktion untersucht (Beispiel 19). Zwei Hepatocyten-spezifische Proteine, Apo E und Apo A1, wurden durch Hybridisierungsanalyse nachgewiesen. Es gab für keine hepatospezifische mRNA bei Konzentrationen von bis zu 40.000 Einheiten/ml von entweder IFNα oder IFNτ einen nachweislichen Rückgang der mRNA-Herstellung. Des Weiteren wurde in diesem Test kein Hinweis für eine Hepatotoxizität mit IFNτ gefunden.
Die Wirkungen von rekombinantem Schaf-Interferon-tau (roIFNτ) auf die Schaf-Lentivirus-Replikation (OvLV) wurden ebenfalls untersucht. Die Wirkungen in vitro wurden durch Infizieren von Gelenk-Membranzellen der Ziege mit seriellen Verdünnungen von OvLV getestet. Die infizierten Zellen wurden täglich 6–12 Tage lang mit roIFNτ (0–2.500 antivirale Einheiten/ml [AVU/ml]) behandelt und Virusreplikation und cytopathische Wirkung (CPE; z.B. wie in Beispiel 2) wurden untersucht.
Die Beurteilungsverfahren umfassten virale Wachstumskurven, Zellvermehrungstest (z.B. wie in den Beispielen 13, 14 oder 15), Syncyten-Bildungstest (z.B. wie in Nagy, et al., 1983; Dalgleish, et al., 1984) und Quantifizierung von provialer DNA durch PCR und reversen Transkriptase-Test (Mullis, 1987, Mullis, et al., 1987). Eine Reduktion (< 0,001) des OvLV-Titers und des CPE (80–999%) wurde in den Kulturen beobachtet, die mit roIFNτ behandelt worden waren.
Wirkungen von roIFNτ in vivo wurden durch Inokulation von 24 neugeborenen Lämmern mit 5 Λ 10⁶ TID₅₀ des OvLV-Stamms 85/34 getestet. Elf dieser Lämmer wurden 30 Tage nach der Inokulation (PI) einmal am Tag und danach zweimal die Woche mit 10⁵–10⁶ AVU/kg roIFNτ behandelt. 13 Lämmer wurden als Kontrolle verwendet. Die Virustiter im Blut, bestimmt durch ein Endpunkt-Verdünnungsverfahren, erreichten in beiden Gruppen ihren Höhepunkt 4–6 Wochen PI. Die OvLV-Titer in mit roIFNτ behandelten Lämmern wurden in Relation mit den Kontrolltieren reduziert. Der stärkste Rückgang, ein Rückfang von 90% des OvLV-Titers in behandelten Tieren in Relation zu den Kontrolltieren (p < 0,01), wurde 4 Wochen PI erreicht.
Die vorstehend beschriebenen OvLV-Untersuchungen zeigen an, dass rekombinantes ovIFNτ die OvLV-Replikation signifikant reduzieren kann, und legen nahe, dass IFNτ verwendet werden kann, um klinische Krankheiten, die durch Lentivirus-Infektionen verursacht wurden, zu kontrollieren. Zusammengenommen mit den anderen antiviralen Daten legen diese Ergebnisse nahe, dass IFNτ gegen viele verschiedene Viren, einschließlich sowohl RNA- als auch DNA-Viren, ein wirksames antivirales Mittel ist.
Interferon-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in tiermedizinischen Anwendungen, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf die Behandlung der folgenden Viruskrankheiten, von Nutzen sein: Katzen-Leukämievirus, progressives Schaf-Pneumonie-Virus, Schaf-Lentivirus, infektiöses Pferde-Anämievirus, Rinder-Immunschwächevirus, Visna-Maedi-Virus und Ziegen-Arthritis-Encephalitis.
Vom Menschen abgeleitete Interferon-Zusammensetzungen können für die Behandlung zum Beispiel der folgenden Viruserkrankungen verwendet werden: menschlicher Immunschwächevirus (HIV), Hepatitis C-Virus (HCV) und Hepatitis B-Virus (HBV).
D. Antiproliferative Eigenschaften von IFNτ
Die Wirkungen von IFNτ auf zelluläres Wachstum wurden ebenfalls untersucht. In einer Analyse wurde eine antizelluläre Wachstumsaktivität unter Verwendung eines Kolonie-Inhibitionstests (Beispiel 13) untersucht. Menschliche Amnion (WISH)- oder MDBK-Zellen wurden in geringen Zelldichten ausgestrichen, um Kolonien zu erzeugen, die einzelnen Zellen entsprangen. Interferon-Verdünnungen wurden Dreifach-Vertiefungen zugesetzt und die Platten wurden inkubiert, um eine weitere Koloniebildung zu gewährleisten. IFNτ hemmte in diesen Tests sowohl die Koloniegröße als auch die -anzahl. IFNτ war bei der Hemmung der Zellvermehrung der menschlichen Zelllinie (WISH) wirksamer als menschliches IFNα. Die antiproliferative Aktivität von IFNτ war dosisabhängig. Hohe IFNτ-Konzentrationen stoppten die Vermehrung, während die Zell-Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt wurde.
Basierend auf Zellzyklus-Analyse, unter Verwendung von Durchfluss-Cytometrie, scheint IFNτ den Zellfortschritt durch die S-Phase zu hemmen. Diese Ergebnisse zeigen die antiproliferative Wirkung von IFNτ und unterstrichen ihre niedrige Cytotoxizität.
Die antiproliferativen Wirkungen von IFNτ wurden ebenfalls an Ratten- und Rinderzelllinien untersucht (Beispiel 14). Die Rate des ³H-Thymidin-Einschlusses wurde verwendet, um die Rate der Zellvermehrung festzulegen. Die erhaltenen Daten zeigen, dass IFNτ die Rate der zellulären Vermehrung bei jeder getesteten Zelllinie drastisch reduzierte (Beispiel 14, Tabelle 7).
Die antiproliferative Aktivität und das Fehlen der Toxizität von IFNτ wurden weiterhin unter Verwendung einer Reihe von menschlichen Tumorzelllinien (Beispiel 15) untersucht. Verschiedene menschliche Tumorzelllinien wurden aus den Standardlinien, die beim NIH-Screeningverfahren für antineoplastische Mittel (Pontzer, et al., 1991) verwendet wurden, ausgewählt. Mindestens eine Zelllinie von jeder neoplastischen Haupt-Kategorie wurde untersucht.

Die folgenden Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville MD 20852) erhalten:

NCI-H460	menschliches großzelliges Lungenkarzinom;
DLD-1	menschliches Colon-Adenokarzinom;
SK-MEL-28	menschliches malignes Melanom;
ACHN	menschliches Nieren-Adenokarzinom;
HL-60	menschliche promyelocytäre Leukämie;
H9	menschliches T-Zelllymphom;
HUT 78	menschliches kutanes T-Zelllymphom; und
MCF7	menschliches Brust-Adenokarzinom.

Wie vorstehend wurde die antiproliferative Aktivität durch Messen der Rate des ³H-Thymidin-Einschlusses in Zellen, die mit IFNτ behandelt wurden, erfasst. Signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen wurden durch eine Varianzanalyse, gefolgt durch den Scheffe-F-Test, festgestellt. Zellzyklus-Analyse wurde durch Durchflusscytometrie durchgeführt.
Die Untersuchung der IFNτ-Hemmung der MCF7 (Brust-Adenokarzinom)-Vermehrung zeigte, dass IFNτ die MCF7-Vermehrung in dosisabhängiger Weise reduzierte. Eine Reduktion des ³H-Thymidins von 50% wurde mit 10.000 Einheiten/ml IFNτ beobachtet (Beispiel 15, Tabelle 8). Man hatte zuvor herausgefunden, dass diese Zelllinie auf anti-Östrogenbehandlung nicht reaktiv war.
Ein Vergleich der antiproliferativen Wirkungen von IFNτ und IFNα wurde unter Verwendung von HL-60 (menschliche promyelocytäre Leukämie)-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse mit der promyelocytären Leukämiezelllinie HL-60 sind für jene typisch, die beim Vergleich von IFNτ mit menschlichem IFNα (Beispiel 15) erzielt werden. So geringe Konzentrationen wie 100 Einheiten/ml für beide IFNs erzeugten eine signifikante (> 60%) Wachstumsreduktion. Zunehmende Mengen an IFNs verringerten die Tumorzellvermehrung weiter (4). Hohe Dosen an HuIFNα, aber nicht OvIFNτ, waren cytotoxisch (5). Die Zell-Lebensfähigkeit wurde durch IFNα um etwa 80% verringert. Im Gegensatz dazu blieben nahezu 100% der mit IFNτ behandelten Zellen lebensfähig, wenn IFNτ in einer Menge von 10.000 Einheiten/ml aufgebracht wurde. Somit ist, während beide Interferone die Vermehrung hemmen, nur IFNτ ohne Cytotoxizität. Dieser Mangel an Toxizität liefert einen Vorteil für die Verwendung von IFNτ in Therapien in vivo.
Das menschliche kutane T-Zelllymphom, HUT 78, reagierte ähnlich wie HL-60, wenn es mit IFNτ (Beispiel 15, 9) behandelt wurde. Sowohl OvIFNτ als auch rHuIFNα reduzieren das HUT 78-Zellwachstum, aber IFNα zeigte nachteilige Wirkungen auf die Zelllebensfähigkeit.
Das T-Zelllymphom H9 war gegenüber den antiproliferativen Wirkungen von IFNα weniger empfindlich als die vorstehend beschriebenen Tumor-Zelllinien. Während IFNα für die H9-Zellen nicht toxisch war, versagte es bei der Hemmung der Zellteilung bei jeder der untersuchten Konzentrationen signifikant (Beispiel 15, 10). Im Gegensatz dazu wurde beobachtet, dass IFNτ das HN9-Wachstum um etwa 60% reduzierte. Somit ist nur OvIFNτ ein wirksamer Wachstumshemmer dieses T-Zelllymphoms.
In drei zusätzlichen Tumor-Zelllinien (NCI-H460, DLD-1 und SK-MEL-28) waren IFNτ und IFNα gleich wirksame Antitumoragenzien. Beim Melanom, SK-MEL-28k, wurde die Hemmung der Vermehrung durch IFNα durch einen Rückgang der Lebensfähigkeit um 13% erzielt, wohingegen IFNτ nicht cytotoxisch war. Bei den meisten untersuchten Tumoren ist IFNτ IFNα als antineoplastisches Mittel gegen menschliche Tumore ebenbürtig oder ihm vorzuziehen.
IFNτ zeigt ohne Toxizität eine antiproliferative Aktivität gegen menschliche Tumorzellen und ist ebenso stark oder stärker als menschliches IFNα. Klinische Versuche der IFNα2s zeigten, dass sie wirksame Antitumoragenzien sind (Dianzini, 1992, Krown, 1987). Ein Vorteil von IFNτ als Therapeutikum ist die Vermeidung von toxischen Wirkungen, die mit hohen IFNα-Dosen zu sehen sind.
Eine zusätzliche Anwendung des IFNτ ist die gegen Tumore wie das Kaposi-Sarcom (in Verbindung mit HIV-Infektion), wobei die antineoplastischen Wirkungen von IFNτ mit der Fähigkeit von IFNτ, retrovirales Wachstum zu hemmen, gekoppelt sind.
Die Wirksamkeit der Interferon-τ-Behandlung in vivo wurde in einem Maus-System (Beispiel 16) untersucht. B16-F10 ist ein syngener transplantierbarer Maus-Tumor, der auf Grund des hohen Auftretens von Lungenmetastasen ausgewählt wurde (Poste, et al., 1981). Interferonbehandlung wurde drei Tage nach Einführen der Tumorzellen initiiert. Die Verabreichung von IFNτ in vivo reduzierte B16-F10-Lungentumore dramatisch. Demnach scheint IFNτ ein effizientes antineoplastisches Mittel in vivo sowie in vitro zu sein.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass Interferonzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Verfahren zur Hemmung oder Reduktion des Tumorzellwachstums verwendet werden können, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf die folgenden Typen von Tumorzellen: menschliche Karzinomzellen, hämatopoetische Krebszellen, menschliche Leukämiezellen, menschliche Lymphomzellen, menschliche Melanomzellen und steroidsensitive Tumorzellen (zum Beispiel Mamma-Tumorzellen).
E. Typ I-IFNτ als Behandlung von Autoimmunstörungen
Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um verschiedene Störungen, die mit dem Immunsystem in Verbindung stehen und die durch eine hyper- oder hypoaktive Immunsystemfunktion charakterisiert sind, therapeutisch zu behandeln und dadurch zu lindern. Solche Störungen umfassen Hyperallergenität und Autoimmunstörungen, wie multiple Sklerose, Diabetes mellitus vom Typ I (insulinabhängig), Lupus erythematodes, amyotrophe laterale Sklerose, Morbus Crohn, rheumatoide Arthritis, Stomatitis, Asthma, Allergien, Psoriasis und Ähnliche.
F. Effizienz von oral verabreichtem IFNτ
Versuche, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigen, dass oral verabreichte IFNτ-Polypeptid-Zusammensetzungen hinsichtlich der Behandlung von Krankheiten oder Krankheitszuständen, die von der Behandlung mit IFNτ profitieren, wie Autoimmunkrankheiten (z.B. multiple Sklerose), in der Wirksamkeit mit injizierten IFNτ-Zusammensetzungen vergleichbar sind.
Oral verabreichtes IFNτ war nicht nur bei der Behandlung einer Krankheit, die von der IFNτ-Behandlung profitierte (EAE), wirksam, sondern der orale Verabreichungsweg ergab im Vergleich zur Behandlung mit injizierten IFNτ-Zusammensetzungen unerwartete Vorteile. Zum Beispiel ergab oral verabreichtes IFNτ einen signifikant niedrigeren Wert an anti-IFNτ-Antikörpern im Serum von behandelten Individuen. Dies ist vorteilhaft, weil das oral verabreichte IFNτ somit weniger wahrscheinlich durch eine Wirt-Immunreaktion unwirksam gemacht wird (d.h. Desensibilisierung gegenüber der Behandlung und/oder der Dosismenge wird signifikant herabgesetzt), und das Individuum, das die Behandlung erhält, als ein Ergebnis einer solchen Immunreaktion wahrscheinlich weniger nachteilige Nebenwirkungen erleiden wird.
G. Cytotoxizität von Interferonen
Ein Vorteil von IFNτ gegenüber anderen Interferonen, wie IFNα, ist, dass die Behandlung einer Person mit therapeutischen Dosen von IFNτ anscheinend nicht mit Cytotoxizität in Verbindung steht. Insbesondere scheint IFN-τ in Konzentrationen, in welchen IFN-β Toxizität induziert, nicht toxisch zu sein. Dies wird durch Versuche gezeigt, in denen L929-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von entweder oIFNτ oder MuIFN-β (Lee Biomolecular, San Diego, CA) im Bereich von 6000 U/ml bis 200.000 U/ml behandelt wurden (Beispiel 19E).
OIFNτ, MuIFN-β oder Medium (Kontrolle) wurden zum Zeitpunkt Null zugesetzt und die Zellen wurden 72 Stunden inkubiert. Die Ergebnisse der Experimente sind in 21 gezeigt. Der prozentuale Anteil der lebenden Zellen (relativ zur Kontrolle) wird entlang der y-Achse (± Standardfehler) angezeigt. 100 Prozent entsprechen der Lebensfähigkeit von L929-Zellen, die nur mit Medium behandelt wurden. Die Ergebnisse zeigen an, dass oIFNτ im Wesentlichen in Konzentrationen bis zu 100.000 U/ml nicht toxisch ist, und wesentlich weniger toxisch ist als MuIFN-β über den gesamten therapeutischen Bereich der Verbindungen.
Zuvor wurde gezeigt, dass in vivo-Behandlung mit beiden TypI-IFNs, IFNβ und IFNα, bei Menschen und Tieren eine Toxizität verursacht, die sich als eine Vielzahl von Nebenwirkungen manifestiert, einschließlich Fieber, Lethargie, Tachykardie, Gewichtsverlust, und Leukopenie (Degre, 1974; Fent und Zbinden, 1987). Die Wirkung der Behandlung mit IFNτ, IFNβ und IFNα (10⁵ U/Injektion) in vivo auf die gesamten weißen Blutzellen (WBC), Gesamtzahl der Lymphocyten und Gewichtsmessungen in NZW-Mäusen (Tabelle 13) wurde, wie in Beispiel 19F beschrieben, untersucht. Hinsichtlich WBC, Lmphocytenzahl beziehungsweise Gewichtsveränderungen wurde kein signifikanter Unterschied zwischen mit IFNτ-behandelten und unbehandelten Mäusen beobachtet.
Im Vergleich dazu zeigten mit IFNβ behandelte Mäuse 12 Stunden nach der Injektion eine Depression der Lymphocytenzahlen um 31,7%. Weiterhin dauerte die Depression der Lymphocytenzahlen 24 Stunden nach der IFNβ-Injektion an. Mit IFNα behandelte Mäuse zeigten einen Lymphocytenrückgang und einen signifikanten Gewichtsverlust 12 Stunden nach der Injektion. Zusätzliche Versuche, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung, durchgeführt wurden, zeigten, dass IFNτ Knochenmark nicht in hohen Mengen unterdrückt. Somit fehlt IFNτ anscheinend eine Toxizität in vivo, anders als IFNβ und IFNα, wie durch Studien an peripherem Blut und Gewichtsmessungen offenbart wurde. Wie nachstehend beschrieben, zeigen Versuche, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, dass die reduzierte Toxizität von IFNτ im Hinblick auf IFNβ und IFNα, wie vorstehend aufgelistet, Sequenzen, die in den N-terminalen 37 Aminosäuren von IFNτ vorliegen, zugeschrieben werden können, und dass die Substitution dieser Sequenzen mit den entsprechenden Sequenzen in Nicht-tau-Typ-I-Interferonen wie den IFNβs und/oder den IFNαs eine solche reduzierte Cytotoxizität auf die entstehenden Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptide übertragen kann.
III. Interferon-τ-Polypeptidfragmente und differentielle Erkennung des Typ I-Interferon-Rezeptors durch IFN-τ und IFN-α.
A. IFNτ-Polypeptid-Fragmente
Die Vielfalt der IFNτ-Aktivitäten, ihre Potenz und ihr Mangel an Cytotoxizität, wie durch die vorliegende Spezifizierung gelehrt, legen die Wichtigkeit der Struktur/Funktionsanalyse dieses neuen Interferons nahe. Die strukturelle Basis für die OvIFNτ-Funktion wurde unter Verwendung von sechs überlappenden synthetischen Peptiden, die der gesamten OvIFNτ-Sequenz entsprechen, untersucht (6). Die entsprechenden Polypeptide, die von der Schaf-IFNτ-Sequenz abstammen, sind als SEQ ID NO: 5 bis SEQ ID NO: 10 dargestellt. Es wurde gezeigt, dass drei Peptide, die die Aminosäuren 1–37, 62–92 und 139–172 darstellen, die antivirale Aktivität von IFNτ hemmen (Beispiel 17). Die Peptide waren in Konzentrationen von 300 μM und darüber wirksame Kompetitoren.
Das synthetische Polypeptid, das die C-terminale Region von ovIFNτ, OvIFNτ (139–172) und das interne Peptid OvIFNτ (62–92) darstellt, hemmte die antivirale Aktivität von IFNτ und rBoIFNα_II im selben Maße, wohingegen das N-terminale Peptid OvIFNτ (1–37) bei der Hemmung der antiviralen Aktivität von OvIFNτ effektiver war. Dosisreaktions-Daten zeigten an, dass IFNτ (62–92) und IFNτ (139–172) die antivirale Aktivität von IFNτ in ähnlichem Maße hemmten. Dieselben Peptide, die die antivirale Aktivität von IFNτ blockierten, blockierten auch die antivirale Aktivität von rekombinantem Rinder-IFNα (rBoIFNα); rekombinantes Rinder-IFNγ wurde durch die Peptide nicht beeinträchtigt. Diese beiden IFNτ-Peptide können herkömmliche Rezeptor-bindende Regionen für IFNγ und verschiedene IFNαs darstellen.
Die beiden synthetischen Peptide OvIFNτ(1–37) und OvIFNτ(139–172) blockierten auch die anti-FIV- und anti-HIV-Aktivität von OvIFNτ (Beispiel 17, 11A und 11B). Während beide Peptide die FIV-RT-Aktivität blockierten, schien nur das C-terminale Peptid OvIFNτ(139–172) ein wirksamer Inhibitor der vesikulären Stomatitis-Virus-Aktivität auf die Katzen-Zelllinie Fc9 zu sein.
Polyclonale anti-Peptid-Antiseren gegen die IFNτ-Peptide erzielten ähnliche Ergebnisse wie die vorstehend beschriebenen Polypeptid-Inhibitionsstudien. Antikörper, die gegen dieselben drei Regionen (OvIFNτ(1–37), IFNτ(62–92) und IFNτ(139–172)) gerichtet waren, blockierten die OvIFNτ-Funktion, was die Wichtigkeit dieser drei Domänen in Bezug auf ihre antivirale Aktivität bestätigt (Beispiel 17). Diese Peptide zeigten, obwohl sie offensichtlich an den Interferonrezeptor binden, in sich und von selbst keine Interferon-ähnlichen Wirkungen in den Zellen.
Die antiproliferative Aktivität von IFNτ (Beispiel 17, Tabelle 1) beteiligte eine weitere Region des Moleküls, da IFNτ(119–150) der wirksamste Inhibitor der OvIFNτ-induzierten Reduktion der Zellvermehrung war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Region des Moleküls, die für die Hemmung des Zellwachstums primär verantwortlich ist, die IFNτ(119–150)-Region ist. Diese Region des IFNτ-Moleküls kann allein oder fusioniert mit anderen Proteinen (wie Serumalbumin, einem Antikörper oder einem Interferon-Alpha-Polypeptid) als antineoplastisches Mittel von Nutzen sein. Es wurde gezeigt, dass ein konjugiertes Protein zwischen einem N-terminalen Peptid, das von menschlichem Interferon-α abstammte, und Serumalbumin eine antizelluläre Vermehrungsaktivität hat (Ruegg, et al., 1990).
Schließlich könnte die Bindung von ¹²⁵I-OvIFNτ an seinen Rezeptor auf MDBK-Zellen durch Antiseren gegen 4 der 6 Peptide blockiert werden; die vier Polypeptide stellen die Aminosäuren 1–37, 62–92, 119–150 und 139–172 von OvIFNτ dar. Dies spiegelt die multiplen Bindungsdomänen sowie die funktionelle Signifikanz dieser Regionen wieder. Da verschiedene Regionen von IFNτ bei der Ausübung verschiedener Funktionen beteiligt sind, könnte die Modifikation ausgewählter Aminosäuren potenziell IFNτ-ähnliche Interferone mit selektiver biologischer Aktivität ergeben.
Polypeptid-Fragmente von menschlichen IFNτ-Proteinen, die ähnliche Eigenschaften haben wie die eben beschriebenen OvIFNτ-Polypeptide, werden basierend auf den Daten vorgeschlagen, die vorstehend für OvIFNτ-Polypeptid-Fragmente in Kombination mit der HuIFNτ-Sequenzinformation, die hierin präsentiert sind/offenbart sind. Solche von menschlichen Sequenzen abgeleiteten Polypeptide umfassen folgende, sind jedoch nicht auf sie beschränkt: SEQ ID NO: 15 bis SEQ ID NO: 20 und SEQ ID NO: 35 bis SEQ ID NO: 40.
B. Wirkungen und Interaktionen von IFN-τ und IFN-α an einem Typ-I-Interferon-Rezeptor
Übereinstimmend mit den vorstehend und in Beispiel 17 beschriebenen Peptid-Antagonisten-Studien zeigen die in Beispiel 18 beschriebenen Versuche, dass hohe Konzentrationen (bis zu einem 10-fachen Überschuss) an OvIFNτ bei der Kompetition um den Rezeptor und der Blockierung der toxischen Wirkung von menschlichem IFNαA auf MDBK-Zellen versagten. Ein Vergleich der relativen antiviralen, cytotoxischen, Rezeptorbindungs- und Rezeptor-Kompetitionseigenschaften von OvIFNτ und menschlichem IFNαA liefert eine Einsicht auf Ebene der Ligand-Rezeptor-Interaktionen. IFNτ und IFNαA besitzen ähnliche spezifische antivirale Aktivitäten, wie zuvor gezeigt wurde (Pontzer, et al., 1988). Wie jedoch in Beispiel 18 gezeigt, hat IFNαA einen = 10fach geringeren K_d für den Rezeptor als IFNτ und somit eine höhere Bindungsaffinität für den Rezeptor. Darüber hinaus ist IFNαA in Bindungskompetitionstests unter Verwendung von ¹²⁵I-IFNτ oder ¹²⁵I-IFNαA um ein Vielfaches effektiver als IFNτ (24A, 24B). Da die Anzahl der Bindungsstellen pro Zelle für IFN und IFNαA sehr ähnlich ist und IFNτ mit der IFNαA-Bindung konkurriert, erkennen IFNαA und IFNτ anscheinend denselben Rezeptorkomplex.
Ein Vergleich der Dosisreaktionsokkupanzkurven für die Cytotoxizitäten und antiviralen Aktivitäten (27A und 27B) zeigt, dass die Cytotoxizität mit maximaler Rezeptor-Besetzung und somit den Bindungsaffinitäten in Verbindung steht; IFNαA hat eine größere Bindungsaffinität und besitzt somit im Wesentlichen eine stärkere Toxizität. Auf der anderen Seite ist die antivirale Aktivität in Konzentrationen maximal, die nur eine sehr kleine fraktionale Besetzung der Rezeptoren ergeben, und wird nicht durch Gleichgewichts-Bindungsdaten repräsentiert.
Versuche, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigten ebenfalls, dass Schaf-IFNτ wie IFNαA die sehr schnelle Phosphorylierung der Rezeptor-assoziierten Typ I-Kinase Tyk2 und der Transkriptionsfaktoren Stat1α und Stat2 induzieren können. Betrachtet man die Zeiträume der Stimulierung durch IFNτ und IFNαA, so muss anscheinend nur eine kleine Fraktion der Rezeptoren besetzt sein, um die Phosphorylierung von Tyk2, Stat1α und Stat2 zu induzieren. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass die Phosphorylierung dieser Signaltransduktions-Proteine nicht ausreichen könnte, um die zelluläre Toxizität zu induzieren, die mit „anderen" Typ I-IFNs (d.h. anderen Typ I-IFNs als IFN-tau) assoziiert ist.
Die höhere Bindungsaffinität von IFNαA zum Rezeptor und die unterschiedlichen Kompetitionseigenschaften von IFNτ und IFNαA legen ebenfalls nahe, dass die beiden IFNs den Rezeptor unterschiedlich erkennen. Versuche, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden und die synthetische Peptid-Antagonisten verwendeten, einschließlich der Versuche, die in Beispiel 17 beschrieben sind, zeigten, dass das C-terminale Peptid IFNτ-(139–172) (SEQ ID NO: 10) gegen die Aktivitäten von sowohl IFNαA als auch von IFNτ kompetitiv war, wohingegen das N-terminale Peptid IFNτ-(1–37) (SEQ ID NO: 5) in einer 5- bis 10-mal höheren Konzentration nur gegen die IFNτ-Aktivität wirksam war. Versuche, bei denen Antiseren verwendet wurden, die gegen IFNτ-(139–172) und IFNτ-(1–37) produziert wurden, zeigten, dass Antiserum gegen IFNτ-(1–37) nur die Bindung von IFNτ blockiert, wohingegen Antiserum gegen IFNτ(139–172) sowohl die Bindung von IFNα als auch von IFNτ blockiert. Diese Daten legen nahe, dass die N-terminalen Abschnitte von IFNτ und IFNαA signifikante Determinanten von Hochaffinitäts-Bindung darstellen und dass Unterschiede in der Hochaffinitäts-Gleichgewichtsbindung zwischen IFNαA und IFNτ auf Unterschiede der Rezeptor-Interaktionen an den N-Terminie dieser Moleküle zurückzuführen sind. Entsprechend scheinen die N-Termini dieser Moleküle auch signifikante Determinanten der cytotoxischen Wirkungen der IFNs zu sein.
C. Hybrid-Interferon-Fusionsproteine
Die vorstehenden Daten legen zusammengenommen nahe, dass die C-terminalen Regionen von Typ I-Interferonen an eine herkömmliche Stelle an dem Typ I-Interteron-Rezeptor binden (d.h., an einer Stelle, die die Rezeptor-Aktivierungseigenschaften sowohl von IFNα als auch von IFNτ beeinträchtigen), wohingegen die N-terminale Region bei der Ausübung einzigartiger Funktionen beteiligt sein kann (d.h. an einer Stelle bindet, die nur die Rezeptor-Aktivierungseigenschaften von IFNτ beeinträchtigt). Insbesondere legen die Daten nahe, dass die N-terminale Region für die verringerte Cytotoxizität von IFNτ relativ zu anderen Typ I-Interferonen, z.B. IFNα, verantwortlich ist.
Die vorliegende Erfindung verwendet Beobachtungen hinsichtlich verringerter Toxizität, die durch die N-terminale Region von IFNτ, verliehen wird, zur Stützung von chimeren DNA-Konstrukten, die verwendet werden, um Hybrid-Interferon-Fusionsproteine herzustellen, die einen N-terminalen Abschnitt haben, der von IFNτ abstammt, und die einen C-terminalen Abschnitt haben, der von einem Nicht-tau-Interferon-Typ I-Poylpeptid abstammt, dessen Effizienz als Therapeutikum durch seine relativ hohe Toxizität verringert wird. Beispiele für solche Nicht-tau-Interferon-Typ I-Poylpeptide umfassen IFNβ und die verschiedenen Isoformen von IFNα.
Mit Hinblick auf 28 hat ein solches Hybrid-Interferon-Fusionsprotein oder -Polypeptid 40, codiert durch ein chimeres Nucleinsäuremolekül, einen N-Terminus 42 und einen C-Terminus 44. Das Fusionsprotein setzt sich aus einem ersten (N-terminalen) Segment 46 und einem zweiten (C-terminalen) Segment 48 zusammen. Das N-terminale Segment enthält die N-terminale Aminosäuresequenz eines Interferon-tau-Polypeptids, das durch ein 5'-Endsegment des chimeren Nucleinsäuremoleküls codiert wird. Das C-terminale Segment enthält die C-terminale Aminosäuresequenz eines Nicht-tau-Interferon-Typ I-Polypeptids und die Aminosäuresequenz eines Interferon-tau-Polypeptids, das durch ein 3'-Endsegment des chimeren Nucleinsäuremoleküs codiert wird. Die beiden Segmente werden an einer Verbindungsstelle 50 verbunden oder gespleisst, die sich in einer Region (Verbindungsregion) befindet, die dem Abschnitt eines reifen Interferon-Polypeptids am Aminosäurerest 28 entspricht. Es ist zu bemerken, dass das reife IFNτ-Polypeptid typischerweise mit einem Cystein am Aminosäurerest 24 der vollständigen Sequenz (die die Leadersequenz einschließt und mit einem Methionin beginnt) beginnt.
Die Verbindungsregion ist in dem N-terminalen Peptid aus 37 Aminosäuren (SEQ ID NO: 5) enthalten, das in den vorstehend ausgeführten Versuchen verwendet wurde. Ein Alignment der reifen Aminosäuresequenzen verschiedener IFNτ-, IFNα- und IFNβ-Clone zwischen den Aminosäuren 1 und 37 zeigte, dass der größte Divergenzgrad zwischen den Sequenzen nahe am N-Terminus stattfindet. Insbesondere liegt der größte Divergenzgrad zwischen den Aminosäuren 1 und 16, mit einem dazwischen liegenden Divergenzgrad zwischen den Aminosäuren 17 und 28. Die Region zwischen den Aminosäuren 29 und 37 ist unter den verschiedenen Typ I-Interferonen relativ gut erhalten und es wird angenommen, dass sie an Typ I-Rezeptor-Bindungs-Interaktionen beteiligt ist (Fish, 1992).
Die optimale Verbindung, d.h. die Aminosäurerest-Position, von der ausgehend die Stromaufwärts (in Richtung auf das N-terminale oder 5'-Ende) -Sequenz mit Interferon-tau übereinstimmt und die Stromabwärts (in Richtung auf das C-terminale oder 3'-Ende) -Sequenz mit einem anderen Interferon übereinstimmt, z.B. IFNα oder IFNβ, kann identifiziert werden, z.B. durch die hierin beschriebenen Verfahren, unter Verwendung von Peptiden oder DNA-Sequenzen, die Peptide codieren, die längeren und kürzeren Regionen innerhalb von IFNτ(1–37) entsprechen, in Kombination mit den funktionellen Tests, die hierin beschrieben werden (wie antiviralen, antiproliferativen und Cytotoxizitätstests). Es wird in Betracht gezogen, dass zum Beispiel ein hybrides oder chimeres Interferon der vorliegenden Erfindung, das die Aminosäuren 1–28 von Interferon-tau und die übrigen Aminosäuren von einem Nicht-tau-Typ I-Interferon enthält, die niedrige Toxizität, die mit Interferon-tau assoziiert wird, zusammen mit der biologischen Aktivität besitzt, die normalerweise einem solchen Typ I-Interferon zugeschrieben wird. Zum Beispiel kann ein IFNτ/IFNα-Hybrid zum Beispiel die Toxizität von IFNα reduzieren, jedoch nicht mit den antiviralen Eigenschaften von IFNα interferieren.
Wie zuvor festgestellt hat das Interferon-Fusions-Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz, in der die ersten 28 Aminosäuren des reifen Interferon-Proteins eine Sequenz eines IFNτ-Moleküls haben und die übrigen Aminosäuren eine Sequenz eines Nicht-tau-Interferon-Typ I-Polypeptids haben. Beispielhafte Sequenzen, von denen die ersten 28 Aminosäuren des Interferon-Fusionsproteins ausgewählt werden können, umfassen die Sequenzen, die hierin als SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 und SEQ ID NO: 53 dargestellt sind.
Die restliche Sequenz (d.h., die Aminosäuresequenz des „zweiten", C-terminalen Segments, die durch das 3'-Endsegment des chimeren Nucleinsäuremoleküls codiert wird), kann von jedem geeigneten Nicht-tau-Interferon-TypI-Polypeptid, wie Interferon-alpha (z.B. Alpha-1 oder Alpha-2), Interferon-beta, Interferon-omega, einem Hybridinterferon oder einem Consensus-Interferon ausgewählt werden. Sequenzen für Nicht-tau-Typ I-Interferone sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel werden beispielhafte Sequenzen für Hybridinterferone durch Gunther, et al., 1990, Leibowitz, et al., 1990, Goeddel, 1983, 1984, 1987 und Creasey, et al., 1986, 1988 bereitgestellt. Beispielhafte Sequenzen für Consensus-Interferone werden durch Stabinsky, 1990 bereitgestellt. Beispielhafte Interferon-alpha-Sequenzen werden in Capon, 1983, Dworkin-RastI, 1989, Sato, 1988 und Sloma, 1988 dargestellt. Zusätzliche Interferon-alpha- und -beta-Sequenzen werden in Fish, 1992 bereitgestellt. Geeignete Sequenzen können ebenfalls von GenBank oder anderen öffentlichen Sequenz-Hinterlegungsinstitutes erhalten werden.
Die Bestimmung der Nicht-tau-Typ I-Interferon-Aminosäurerest-Position, mit der das 3'-Ende oder C-terminale Segment beginnt, wird durch optimales Ausrichten der parentalen Sequenzen und Herstellung einer Verbindung in der Weise erreicht, dass die Sequenzen des entstandenen chimeren Interferon-Moleküls perfekt an (i) der parentalen Interferon-tau-Sequenz im 5'-Ende oder dem N-terminalen Segment und (ii) der parentalen Nicht-tau-Typ I-Interferon-Sequenz im 3'-Ende oder dem C-terminalen Segment ausgerichtet werden. Die parentalen Sequenzen sind natürlich die Interteronsequenzen, von denen das 5'-Ende oder N-terminale Segment und das 3'-Ende oder C-terminale Segment abstammen.
Die Position des Rests in dem Nicht-tau-Typ I-Interferon, mit dem das 3'-Ende oder das C-terminale Segment beginnt, ist typischerweise die Zahl, die dem letzten Aminosäurerest des 5'-Endes oder des N-terminalen IFN-tau-Segments folgt.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Fusionsproteine, bei denen die Sequenzen sowohl der N-terminalen als auch der C-terminalen Segmente von menschlichen Interferonsequenzen abstammen. Zum Beispiel Konstruktionen, bei denen die ersten 28 Aminosäuren den ersten 28 Aminosäuren von SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 35 entsprechen und die übrigen Sequenzen jenen eines menschlichen Interferon-alpha oder -beta entsprechen. Menschliche Interferon-tau-Sequenzen sind, z.B. in Bazer, et al., 1994 dargestellt. Menschliche Interferon-alpha- oder -beta-Sequenzen können von GenBank bezogen werden.
Es ist zu verstehen, dass, obwohl die Interferon-Fusionsproteine, die beschrieben werden, reife" Proteine sind, das heißt, dass sie mit dem Rest 24 der vollständigen Interteronsequenz beginnen, die Erfindung auch Fusionsproteine und chimere Nucleinsäuremoleküle umfasst, die Fusionsproteine codieren, die die Leadersequenz enthalten, d.h., die mit dem Initiations-Methionin beginnen. Die Leadersequenz in solchen Interferon-Fusionsproteinen kann entweder von einem tau- oder von einem Nicht-tau-Typ I-Interferon abstammen.
Des Weiteren ist zu verstehen, dass die Sequenzen von sowohl dem ersten als auch dem zweiten Fragment „Consensus"-Sequenzen sein können. In anderen Worten, die Sequenz des 5'-Segments könnte nicht einem „natürlichen" IFNτ entsprechen, sondern einer Consensus-Sequenz, die durch den Vergleich von gegeneinander ausgerichteten Sequenzen von mehreren verschiedenen IFNτs erhalten wird. Ähnlich kann die Sequenz des 3'-Segments nicht einem „natürlichen" Nicht-tau-Typ I-IFN entsprechen, sondern einer Consensus-Sequenz, die durch den Vergleich von gegeneinander ausgerichteten Sequenzen von mehreren verschiedenen Nicht-tau-Typ I-IFNs erhalten wird.
Alternativ kann die Sequenz von jedem Fragment einer „intern konsistenten" Sequenz entsprechen, d.h. einer Sequenz, bei der jede Position in der Sequenz einen Rest enthält, der in mindestens einer natürlich vorkommenden Isoform von entweder einem IFNτ (für das N-terminale Segment) oder einem Nicht-tau-Typ I-IFN (für das C-terminale Segment) an dieser Position vorkommt, bei der jedoch die Endsequenz weder einer natürlich vorkommenden Isoform noch irgendeiner Consensus-Sequenz entspricht. Zum Beispiel ist, wenn zwei Isoformen, beide 3 Aminosäuren lang, die Sequenzen „C R S" und „C K G" haben, eine intern konsistente Sequenz „C R G".
Des Weiteren ist zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung auch komplexere Chimere umfasst, z.B. Chimere, die mehr als eine diskrete Region haben, die von IFNτ abstammt und/oder mehr als eine Region von einem anderen geeigneten Interferon hat. Solche Chimere können zum Beispiel in Fällen entstehen, bei denen das Nicht-tau-Typ I-Interferon, das das zweite (C-terminate) Segment enthält, selbst ein Hybrid-Interferon ist, das z.B. aus einem Alpha-Interferon und einem Beta-Interferon (Creasey, et al., 1986, 1988), einem Alpha-1- und einem Alpha-2-Interferon (Leibowitz, et al., 1990) oder einem Alpha-Interteron und einem Omega-Interferon (Gunther, et al., 1990) gebildet wird.
Wie vorstehend dargelegt, ist die verringerte Toxizität der Zusammensetzungen relativ zu natürlichen Nicht-tau-Typ I-Interferonen, die zum Beispiel als Therapeutika zugelassen wurden, ein beträchtlicher Vorteil, der für Hybrid-Interferon-Fusionsprotein-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Betracht zu ziehen ist. Die Hybrid-Zusammensetzungen können dieselbe biologische Aktivität wie die zugelassenen Nicht-tau-Typ I-IFNs mit der verringerten Cytotoxizität von IFNtau haben.
Chimere Nucleinsäuremoleküle können synthetisch oder mit molekularen Standardprotokollen und -verfahren (Ausubel, et al., 1988; Sambrook, et al., 1989), wie hierin beispielhaft dargestellt, hergestellt werden. DNA-Sequenzen, die die parentalen Polypeptide (die beiden Polypeptide, von deren Sequenzen die beiden Segmente abstammen, die das Hybridprotein bilden) codieren, werden unter Verwendung von rekombinanten Standardverfahren (z.B. durch die Einfügung von Restriktionsstellen, die die translatierte Aminosäuresequenz nicht verändert in die DNA-Sequenzen, Spaltung der Plasmide und Clonierung der geeigneten Fragmente in den ausgewählten Expressionsvektor) benachbart zueinander in einem Expressionsvektor cloniert. Beispiele für geeignete Expressionsvektoren werden vorstehend beschrieben.
Rekombinante Hybrid-Interferon-Fusions-Polypeptide werden dann wie vorstehend beschrieben von solchen Expressionsvektoren hergestellt, gereinigt und für die Behandlung von Krankheiten und/oder Zuständen verwendet, die von der Interferonbehandlung profitieren.
IV. Protein-Modellierung und Protein-Modifikationen
Die Daten in der vorstehenden Abschnitten zeigen die Identifikation von synthetischen Peptiden, die vier diskontinuierliche Stellen auf dem OvIFNτ-Protein haben und die bei der Rezeptor-Interaktion und der biologischen Aktivität beteiligt sind. Um die strukturelle Beziehung dieser Regionen aufzuklären, wurde eine Modellierung der dreidimensionalen Struktur von IFNτ unternommen. Ein dreidimensionales Modell wäre bei der Interpretation vorhandener Daten und den Entwurf von zukünftigen Struktur/Funktionsstudien von Nutzen.
A. Molekulare Modellierung von Protein
Durch Kombination von zirkulären Dichroismus (CD)-Daten sowohl von rekombinantem OvIFNτ voller Länge als auch von IFNβ (einem Protein von bekannter dreidimensionaler Struktur (Senda, et al., 1992) wurde ein Modell von OvIFNτ konstruiert. Das auffallendste Merkmal dieses Modells ist, dass IFNτ in eine Klasse von Proteinen mit einem Motiv von einem Bündel mit vier Helices fällt. Die CD-Spektren von IFNτ wurden auf einem AVIV 60 S-Spektropolarimeter aufgenommen. Zwei verschiedene Verfahren wurden für die Schätzung der Sekundärstruktur verwendet, der Algorithmus von Perczel, et al., (1991) und die variable Selektion von W. C. Johnson, Jr. (1992).
Schätzungen der sekundären Struktur des Spektrums zeigen 70–75% Alpha-Helix (charakterisiert durch Minima bei 222 und 208 nm und ein Maximum bei 190 nm). Der variable Selektions-Algorithmus schätzt für den Rest des Moleküls 20% β-Faltblatt und 10% Schleife. Das Chang-Verfahren schätzt für den Rest 30% Zufallsknäuel. Das Alignment von IFNτ- und IFNβ-Sequenzen zeigte eine Homologie zwischen den beiden Molekülen, spezifisch in den Regionen bekannter helikaler Struktur in IFNβ. Sequenzanalyse von IFNτ zeigte auch, dass vorgeschlagene helikale Regionen eine apolare Periodizität besitzen, die für ein Motiv aus einem Bündel mit vier Helices Indikativ ist.
Der endgültige Modellierungsschritt war die Anwendung der kristallographischen IFNβ-Röntgen-Koordinaten des IFNβ-Kohlenstoffrückgrats auf die IFNτ-Sequenz. Die funktionell aktiven Domänen von IFNτ, vorstehend identifiziert, wurden einer Seite des Moleküls zugeordnet und in starker räumlicher Nähe aufgefunden. Dies stimmt mit multiplen Bindungsstellen auf IFNτ überein, die gleichzeitig mit dem Typ I-IFN-Rezeptor interagieren.
Die dreidimensionalen Modellierungsdaten, gekoppelt mit den vorstehend beschriebenen Funktionsdaten, liefern die Information, die nötig ist, um Sequenzvariationen in spezifische Regionen von IFNτ einzuführen, um ausgewählte Funktionen (z.B. antivirale oder antizelluläre Vermehrung) zu verstärken, oder um eine/mehrere Regionen) mit ausgewählter Funktion in andere Interferon-Moleküle einzuführen (z.B. antivirale, antineoplastische oder reduzierte Cytotoxizität).
B. Rekombinante und synthetische Manipulationen
Die Konstruktion eines synthetischen Gens für OvIFNτ wird in Beispiel 3 beschrieben. Kurz, eine Aminosäuresequenz von ovIFNτ wurde unter Verwendung einer optimalen Codon-Ausnutzung für E.coli von einer ovIFNτ-cDNA rück-translatiert (Imakawa, et al., 1987). Die Sequenz wurde so ausgegeben, dass sie 20 einzigartige Restriktionsstellen hatte, die über die Länge des Konstrukts verteilt waren. Diese synthetische Gensequenz aus 540 Basenpaaren wurde in 11 Oligonucleotidfragmente geteilt. Die einzelnen Fragmente wurden synthetisiert und, entweder einzel- oder doppelsträngig, in entweder pTZ 19R, pTZ 18R oder pBluescript cloniert, amplifiziert und fusioniert. Das synthetische OvIFNτ-Konstrukt wurde dann in einen modifizierten pIN-III-ompA-Expressionsvektor für die Expression in Bakterien cloniert und auch in ein Hefe-Expressionsplasmid cloniert. Ein ähnlich konstruiertes menschliches synthetisches IFNτ-Gen (SEQ ID NO: 3) wurde entworfen, konstruiert und in Hefezellen exprimiert.
Die Expression des synthetischen OvIFNτ-Gens in Hefe (Beispiel 4) erlaubte eine Überproduktion von rekombinantem IFNτ in S. cerevisiae: große Mengen (5–20 mg/l) von rekombinantem IFNτ können unter Verwendung von sequentiellem Ionenaustausch und molekularer Sieb-Chromatographie aus löslichem Hefeextrakt gereinigt werden. Rekombinantes IFNτ, das auf diese Weise gereinigt wurde, zeigte eine starke antivirale Aktivität (2 bis 3 × 10⁸ Einheiten/mg), ähnlich natürlichem OvIFNτ.
Das synthetische Genkonstrukt erleichtert die Einführung von Mutationen für eine mögliche Verstärkung von antitumor- (antizelluläre proliferative) und antiviralen Aktivitäten. Weiter können die ungleichen Regionen des Moleküls, die für verschiedene Funktionen verantwortlich sind, unabhängig voneinander modifiziert werden, um ein Molekül mit einer gewünschten Funktion zu erzeugen. Zum Beispiel wurden zwei Deletions-Mutanten, OvIFNτ(1–162) und OvIFNτ(1–166) konstruiert, um die Rolle von Carboxy-terminalen Sequenzen in IFNτ-Molekülen zu untersuchen.
Zusätzliche mutierte IFNτ-Moleküle wurden konstruiert, um Reste, die für die antiproliferative Aktivität kritisch sind, zu identifizieren. Zum Beispiel wurde für einen bestimmten Rest, TYR 123, eine antizelluläre proliferative Aktivität von IFNα angenommen (Mclnnes, et al., 1989). Das Äquivalent zu TYR 123 in IFNτ ist in dem Peptid OvIFNτ(119–150) enthalten: dieses Polypeptid hemmt OvIFNτ und die antiproliferative Aktivität bei menschlichem IFNα. Mutationen, die TYR 123 in konservatives (TRP) umwandeln, und nicht-konservative (ASP) Substitutionen wurden erzeugt, sowie Mutantensequenzen, die eine Deletion dieses Rests haben. Das Codon für TYR 123 befindet sich innerhalb einer SspI-Stelle; die Entfernung dieser Stelle wurde für das Screening verwendet. Die antiproliferative Aktivität dieses mutierten IFNτ wird, wie hierin beschrieben, bestimmt.
Synthetische Peptide können erzeugt werden, die den IFNτ-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung entsprechen. Synthetische Peptide können kommerziell synthetisiert oder unter Verwendung von Standardverfahren und Geräten aus dem Fachgebiet hergestellt werden (Applied Biosystems, Foster City CA).
Alternativ können Oligonucleotidsequenzen, die Peptide codieren, entweder direkt durch Standardverfahren der Oligonucleotidsynthese synthetisiert werden, oder, im Fall von großen Codierungssequenzen, durch eine Reihe von Clonierungsschritten, die eine Tandem-Anordnung von multiplen Oligonucleotidfragmenten einbeziehen, die der Codierungssequenz entsprechen, synthetisiert werden (Crea, 1989; Yoshio, et al., 1989; Eaton, et al., 1988). Oligonucleotid-Codierungssequenzen können durch rekombinante Standardverfahren exprimiert werden (Maniatis, et al., 1982; Ausubel et al., 1988).
Die biologischen Aktivitäten der vorstehend beschriebenen Interferon-τ-Polypeptide können entweder unter Verwendung der Interferon-τ-Polypeptide allein oder konjugiert oder fusioniert mit anderen Proteinen, wie vorstehend und nachstehend beschrieben, genutzt werden.
V. Herstellung von Fusionsproteinen.
Ebenfalls offenbart ist Interferon-τ, kovalent gebunden an ein zweites Polypeptid, um ein fusioniertes oder Hybridprotein zu bilden. Die Interferon-τ-Sequenzen, die solche fusionierten Proteine bilden, können rekombinant hergestelltes Interferon-τ oder ein bioaktiver Abschnitt davon sein, wie vorstehend beschrieben.
Zum Beispiel können dort, wo Interferon-τ verwendet wird, um die virale Expression zu hemmen, Polypeptide, die von IFNτ abstammen und die eine antivirale Aktivität zeigen, vorteilhaft mit einem Interferon-alpha-Polypeptid fusioniert werden. In einer Ausführungsform, die vorstehend mit Bezug auf Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptide beschrieben wird, stellen die IFNτ-Polypeptide durch Ersetzen von mit Toxizität in Verbindung stehenden Regionen solcher Interferone mit entsprechenden Interferon-τ-Regionen, die eine geringere Toxizität haben, ein Verfahren zur Reduktion der Toxizität von anderen Interferon-Molekülen (z.B. IFNβ oder IFNα) bereit. Ebenfalls offenbart sind Fusionsproteine, die Interferon-τ-Regionen, die antizelluläre Vermehrungseigenschaften haben, enthalten. Solche Regionen können zum Beispiel von den hierin offenbarten menschlichen Interferon-τ-Sequenzen erhalten werden.
Die fusionierten Proteine können durch chemische Konjugation oder durch rekombinante Verfahren gebildet werden. Im ersten Verfahren werden das Interferon und sekundäre ausgewählte Polypeptide durch herkömmliche Kopplungsagentien für eine kovalente Anheftung modifiziert. In einem beispielhaften Verfahren für die Kopplung von löslichem Serumalbumin an ein Interferon-Polypeptid wird Serumalbumin mit N-Succinimidyl-S-acetyl-thioacetat (Duncan, et al., 1983) derivatisiert, wodurch thioliertes Serumalbumin erhalten wird. Das aktivierte Serumalbumin-Polypeptid wird dann mit Interferon zur Reaktion gebracht, das mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (Cumber, et al., 1985) derivatisiert war, um das fusionierte Protein zu erhalten, das durch eine Disulfid-Bindung verbunden ist.
Als alternatives Verfahren kann rekombinantes Interferon mit einem Cysteinrest hergestellt werden, um eine Disulfid-Kopplung des Interferons an einen aktivierten Liganden zu gewährleisten, wodurch die Kopplungsreaktion erleichtert wird. Ein Interferon-τ- Expressionsvektor, der für die Herstellung von rekombinantem Interferon-τ verwendet wird, kann für die Insertion eines internen oder terminalen Cystein-Codons gemäß Standardverfahren der ortsgerichteten Mutagenese modifiziert werden (Ausubel, et al., 1988).
In einem Verfahren wird ein fusioniertes Protein rekombinant unter Verwendung eines Expressionsvektors, in dem die Codierungssequenz eines zweiten ausgewählten Polypeptids mit der Interferon-τ-Codierungssequenz verbunden ist, hergestellt. Zum Beispiel können menschliches Serumalbumin-Codierungssequenzen im Rahmen mit der Codierungssequenz eines Interferon-τ-Polypeptids fusioniert werden, wie zum Beispiel SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 39. Das fusionierte Protein wird dann unter Verwendung einer geeigneten Wirtszelle exprimiert. Das Fusionsprotein kann, wenn nötig, durch molekulare Sieb- und Ionenaustausch-Chromatographieverfahren, mit einer zusätzlichen Reinigung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Trennung und/oder HPLC-Chromatographie gereinigt werden.
Es ist aus dem Vorstehenden zu verstehen, wie Interferon-τ-enthaltende Fusionsproteine hergestellt werden können. Eine Variation der vorstehenden Fusion ist der Austausch von Positionen auf dem Interferon-τ und auf ausgewählten sekundären Proteinmolekülen in dem Fusionsprotein (z.B. Carboxy-terminale versus Amino-terminale Fusionen). Des Weiteren können interne Abschnitte eines natürlichen Interferon-τ-Polypeptids (zum Beispiel Aminosäureregionen von 15 bis 172 Aminosäuren) in Polypeptide vereinigt werden, wo zwei oder mehrere solcher Interferon-τ-Abschnitte fortlaufend sind, die normalerweise in dem natürlichen Protein diskontinuierlich sind.
VI. Antikörper, die mit Interferon-τ reaktiv sind
Fusionsproteine, die die Polypeptid-Antigene der vorliegenden Erfindung fusioniert mit dem Glutathion-S-Transferase (Sj26)-Protein enthalten, können unter Verwendung des pGEX-GLI-Vektorsystems in E.coli-JM101-Zellen exprimiert werden. Das fusionierte Sj26-Protein kann gut durch Glutathion-Substrat-Affinitätschromatographie isoliert werden (Smith, D. B. et al., 1988). Die Expression und partielle Reinigung von IFN-Proteinen wird in (Beispiel 21) beschrieben und ist auf alle löslichen, induzierten Polypeptide anwendbar, die durch Sequenzen codiert werden, die durch die vorliegende Erfindung beschrieben werden.
Unlösliche GST (sj26)-Fusionsproteine können durch präparative Gelelektrophorese gereinigt werden.
Ebenfalls eingeschlossen in die Erfindung ist ein Expressionsvektor wie die vorstehend beschriebenen Lambda gt11- oder pGEX-Vektoren, die IFNτ-Codierungssequenzen und Expressions-Kontrollelemente enthalten, die die Expression der codierenden Regionen in einem geeigneten Wirt gewährleisten. Die Kontrollelemente umfassen im Allgemeinen einen Promotor, ein Translations-Initiationscodon und Translations- und Transkriptions-Terminierungssequenzen sowie eine Insertionsstelle für die Einführung der Insertion in den Vektor.
Die DNA, die das gewünschte Polypeptid codiert, kann in irgendeine Anzahl an Vektoren (vorstehend erörtert) cloniert werden, um die Expression des Polypeptids in dem geeigneten Wirtssystem zu erzeugen. Diese rekombinanten Polypeptide können als Fusionsproteine exprimiert werden. Eine Anzahl von Merkmalen kann in die Expressionsvektoren eingefügt werden, wie Leadersequenzen, die die Sezernierung der exprimierten Sequenzen in das Kulturmedium fördern. Rekombinant hergestellte IFNs und Polypeptide, die davon abstammen, werden typischerweise von lysierten Zellen oder Kulturmedien isoliert. Die Reinigung kann durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich Salz-Fraktionierung, Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitäts-Chromatographie ausgeführt werden. Immunaffinitäts-Chromatographie kann unter Verwendung von Antikörpern, die gegen ausgewählte IFNτ- oder Hybrid-Interferon-Antigene erzeugt wurden, verwendet werden.
VII. Verwendbarkeit
A. Antivirale Eigenschaften
Typ I-Interferone zeigen starke antivirale Eigenschaften. Die antivirale Aktivität von IFNτ hat breite therapeutische Anwendungsbereiche ohne die toxischen Effekte, die üblicherweise mit IFNαs assoziiert sind. Obwohl die Gegenwart von IFNτ in Kulturmedium die reverse Transkriptase-Aktivität des Katzen-Immunschwäche-Virus (Beispiel 11) hemmte, ist dies nicht einer direkten Wirkung von IFNτ auf die reverse Transkriptase zuzuschreiben. Vielmehr scheint IFNτ die Wirtszelle so zu induzieren, dass sie einen/mehrere Faktoren) produziert, der/die die reverse Transkriptase des Virus hemmt/hemmen.
Es wurde herausgefunden, dass IFNτ seine antivirale Aktivität ohne nachteilige Wirkungen auf die Zellen ausübt: kein Hinweis auf cytotoxische Wirkungen, die der Verabreichung von IFNτ zuzuschreiben sind, wurde beobachtet. Es ist das Fehlen einer Cytotoxizität bei IFNτ, das es als therapeutisches Mittel in vivo extrem wertvoll macht. Dieses Fehlen von Cytotoxizität hebt IFNτ von den meisten anderen bekannten antiviralen Mitteln und allen anderen bekannten Interferonen ab.
Formulierungen, die IFNτ-enthaltende Hybrid-Interferon-Fusionsverbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten, können verwendet werden, um eine virale Replikation zu hemmen.
Die Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptide der vorliegenden Erfindung können in Verfahren zur Beeinträchtigung der Immunbeziehung zwischen Foetus und Mutter, zum Beispiel bei der Verhinderung der Übertragung von maternalen Viren (z.B. HIV) auf den sich entwickelnden Foetus verwendet werden. Die menschlichen Interferon-Zusammensetzungen sind besonders nützlich für die Behandlung von Menschen, da potenzielle antigene Reaktionen weniger wahrscheinlich ein homologes Protein verwenden.
B. Antizelluläre Vermehrungseigenschaften
Typ I-Interferone zeigen eine starke antizelluläre Vermehrungsaktivität. Hybrid-Interferone, wie hierin beschrieben, können ebenfalls verwendet werden, um zelluläres Wachstum ohne die negativen Nebenwirkungen, die mit anderen Interferonen assoziiert sind die bis jetzt bekannt sind, zu hemmen. Formulierungen, die die Hybrid-Interferonverbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen, können verwendet werden, um Tumorwachstum zu hemmen, zu verhindern oder zu verlangsamen.
Die Entwicklung bestimmter Tumore wird durch Östrogen vermittelt. Versuche, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigen, dass IFNτ die Zahl der Östrogenrezeptoren unterdrücken kann. Deshalb können IFNτ-enthaltende Zusammensetzungen bei der Behandlung oder Prävention von östrogenabhängigen Tumoren verwendet werden.
C. Störungen des Immunsystems
Krankheiten, die unter Verwendung von Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen Autoimmun-, Entzündungs-, proliferative und hyperproliferative Krankheiten sowie cutane Manifestationen von immunologisch vermittelten Krankheiten. Insbesondere sind Verfahren der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von Zuständen, die mit einer Hypersensibilität des Immunsystems in Verbindung stehen, von Vorteil. Es gibt vier Typen der Immunsystem-Hypersensibilität (Clayman). Typ I- oder sofortige/anaphylaktische Hypersensibilität ist einer Mastzellen-Degranulation in Reaktion auf ein Allergen (z.B. Pollen) zuzuschreiben und umfasst Asthma, allergische Rhinitis (Heuschnupfen), Urticaria (Nesselsucht), anaphylaktischen Schock und andere Krankheiten allergischer Natur. Typ II- oder Autoimmun-Hypersensibilität ist Antikörpern zuzuschreiben, die gegen wahrgenommene „Antigene" auf den körpereigenen Zellen gerichtet sind. Typ III-Hypersensibilität ist der Bildung von Antigen/Antikörper-Immunkomplexen zuzuschreiben, die in verschiedenen Geweben lokalisiert sind und weitere Immunantworten aktivieren, und die für Zustände wie Serum-Krankheit, allergische Alveolitis und die großen Schwellungen, die oft nach Wiederholungsimpfungen auftreten, verantwortlich ist. Typ IV-Hypersensibilität ist der Freisetzung von Lymphokinen aus sensibilisierten T-Zellen zuzuschreiben, die eine Entzündungsreaktion nach sich zieht. Beispiele umfassen Kontaktdermatitis, der Ausschlag bei Masern und „allergische" Reaktionen auf bestimmte Wirkstoffe.
Die Mechanismen, durch die bestimmte Zustände bei manchen Individuen eine Hypersensibilität ergeben, sind im Allgemeinen nicht voll verstanden, können jedoch sowohl genetische als auch extrinsische Faktoren beteiligen. Zum Beispiel können Bakterien, Viren oder Wirkstoffe eine Rolle beim Auslösen einer Autoimmunreaktion in einem Individuum spielen, das bereits eine genetische Prädisposition für die Autoimmunkrankheit hat. Es ist anzunehmen, dass das Vorkommen einiger Typen von Hypersensibilität mit anderen korreliert sein könnte. Zum Beispiel wurde vorgeschlagen, dass Individuen mit bestimmten herkömmlichen Allergien für Autoimmunkrankheiten empfänglicher sind.
Autoimmunkrankheiten können lose in solche, die primär auf bestimmte Organe oder Gewebe beschränkt sind, und jene, die den gesamten Körper betreffen, gruppiert werden. Beispiele für organspezifische Krankheiten (wobei das Organ betroffen ist) umfassen multiple Sklerose (Myelinschicht auf Nervenfortsätzen), Typ I-Diabetes mellitus (Pankreas), Hashimoto Thyreoiditis (Schilddrüse), perniziöse Anämie (Magen), Addison Krankheit (Nebennieren), Myasthenia gravis (Acetylcholin-Rezeptoren an neuromuskulärer Verbindung), rheumatoide Arthritis (Gelenkspalte), Uveitis (Auge), Psoriasis (Haut), Gullain-Barresyndrom (Nervenzellen) und Graves Krankheit (Schilddrüse). Systemische Autoimmunkrankheiten umfassen systemischen Lupus erythematodes und Dermatomyositis.
Andere Beispiele für Hypersensibilitäts-Krankheiten umfassen Asthma, Ekzem, atopische Dermatitis, Kontaktdermatitis, andere ekzematöse Dermatitiden, seborrhoische Dermatitis, Rhinitis, Lichen planus, Pemplugus, großblasigen Pemphigus, Epidermolysis bullosa, Urticaria, Angiöedeme, Vasculitiden, Erytheme, kutane Eosinophilien, Alopecia areata, Atherosklerose, primäre biliäre Zirrhose und nephrotisches Syndrom. Damit in Verbindung stehende Krankheiten umfassen intestinale Entzündungen wie Zöliakie, Proktitis, Eosinophilia gastroenteritis, Mastocytose, entzündliche Darmkrankheiten, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa sowie Nahrungsmittelallergien.
Autoimmunkrankheiten, die für die Behandlung unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders empfänglich sind, umfassen multiple Sklerose, Typ I (insulinabhängigen) Diabetes mellitus, Lupus erythematodes, amyotrophe laterale Sklerose, Morbus Crohn, rheumatoide Arthritis, Stomatitis, Asthma, Uveitis, Allergien und Psoriasis.
Medikamente, die hybIFN enthalten, können zur therapeutische Behandlung und dadurch zur Linderung der Symptome von Autoimmunkrankheiten wie den vorstehend erörterten verwendet werden.
D. Arzneimittel
Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptide der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannter Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher Arzneimittel formuliert werden. Formulierungen, umfassend Interferone oder Interferon-ähnliche Verbindungen, wurden zuvor beschrieben (zum Beispiel Martin, 1976). Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung so formuliert, dass eine wirksame Menge des Hybrid-Interferons mit einem geeignete Träger kombiniert wird, um die wirksame Verabreichung der Zusammensetzung zu erleichtern.
Die in diesen Therapien verwendeten Zusammensetzungen können auch in verschiedenen Formen vorliegen. Diese schließen beispielsweise feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen ein, wie Tabletten, Pillen, Puder, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Liposomen, Zäpfchen, injizierbare und Infusionslösungen. Die bevorzugte Form hängt von der beabsichtigen Verabreichungsweise und der therapeutischen Anwendung ab. Die Zusammensetzungen umfassen vorzugsweise auch herkömmliche, pharmazeutisch verträgliche Träger und Adjuvantien, die dem Fachmann bekannt sind. Vorzugsweise sind die Zusammensetzungen der Erfindung in Form einer Einheitsdosierung und werden dem Patienten üblicherweise einmal oder mehrere Male am Tag verabreicht.
Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptide können einem Patienten in jeder pharmazeutisch verträglichen Dosierungsform verabreicht werden, einschließlich oraler Aufnahme, Inhalation, intranasalem Spray, intraperitonealer, intravenöser, intramuskulärer, intralesionaler oder subkutaner Injektion. Spezifisch können Zusammensetzungen und Verfahren, die für andere Interferon-Zusammensetzungen verwendet werden, für die Verabreichung dieser Verbindungen verwendet werden.
Ein primärer Vorteil der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist jedoch die extrem niedrige Cytotoxizität von IFNτ-Proteinen. Auf Grund dieser niedrigen Cytotoxizität ist es möglich, die Hybrid-Interferon-Zusammensetzungen in Konzentrationen zu verabreichen, die größer sind als die, die allgemein für andere Interteron(z.B. IFNα)-Verbindungen verwendet werden können. Somit wird in Betracht gezogen, dass Hybrid-Interferon-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Raten von etwa 5 × 10⁴ bis 20 × 10⁶ Einheiten/Tag bis etwa 500 × 10⁶ Einheiten/Tag oder mehr verabreicht werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Dosierung etwa 20 × 10⁶ Einheiten/Tag. Hohe Dosen sind bevorzugt für systemische Verabreichung. Es ist natürlich zu verstehen, dass die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung in Kombination mit anderen Therapien verwendet werden können.
Ist einmal eine Verbesserung des Zustands des Patienten eingetreten, so wird, wenn nötig, eine Erhaltungsdosis verabreicht. Danach kann die Dosierung oder die Häufigkeit der Verabreichung oder beides als eine Funktion der Symptome auf eine Menge reduziert werden, bei der der verbesserte Zustand erhalten wird. Wenn die Symptome auf das gewünschte Maß reduziert sind, sollte die Behandlung aufhören. Patienten können jedoch bei Wiederauftreten der Krankheitssymptome eine periodische Behandlung auf längere Zeit benötigen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch Standardverfahren verabreicht werden, um verschiedene Krebsarten und virale Krankheiten einschließlich jener, für die andere Interferone zuvor eine Aktivität gezeigt haben, zu behandeln. Vergleiche, zum Beispiel, Finter of al., 1991; Dianzani, 1992; Francis, et al., 1992 und US-Patente Nrn 4,885,166 und 4,975,276. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung haben jedoch, wie vorstehend erörtert, einzigartige Merkmale und Vorteile, einschließlich ihrer Fähigkeit, diese Zustände ohne Toxizität zu behandeln.
E. Behandlung von Hautkrankheiten
Krankheiten der Haut können intralesional unter Verwendung von Hybridinterferonen der vorliegenden Erfindung behandelt werden, wobei Formulierung und Dosierung von dem Verfahren der Verabreichung und von der Größe und Schwere der zu behandelnden Läsion abhängen. Bevorzugte Verfahren umfassen intradermale und subkutane Injektion. Multiple Injektionen in große Läsionen können möglich sein, und mehrere Läsionen auf der Haut eines einzelnen Patienten können auf einmal behandelt werden. Der Zeitplan für die Verabreichung kann durch einen Fachmann festgelegt werden. Formulierungen, die für verzögerte Freisetzung hergestellt sind, können die Häufigkeit der Verabreichung reduzieren.
F. Systemische Verabreichung
Die systemische Verabreichung ist im Wesentlichen für alle Anwendungen gleichwertig. Multiple intravenöse, subkutane und/oder intramuskuläre Dosen sind möglich, und im Fall von implantierbaren Verfahren für die Behandlung sind Formulierungen, die für verzögerte Freisetzung hergestellt sind, besonders nützlich. Die Patienten können ebenfalls unter Verwendung von implantierbaren subkutanen Zugängen, Behältern oder Pumpen behandelt werden.
G. Regionale Behandlung
Die regionale Behandlung mit den Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptiden der vorliegenden Erfindung ist für die Behandlung von Krebs in spezifischen Organen nützlich. Die Behandlung kann durch intraarterielle Infusion erfolgen. Ein Katheter kann chirurgisch oder angiographisch implantiert werden, um die Behandlung in die betroffenen Organe zu lenken. Ein subkutaner Zugang, der mit dem Katheter verbunden ist, kann für chronische Behandlung verwendet werden, oder eine implantierbare, auffüllbare Pumpe kann ebenfalls verwendet werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, sollen sie jedoch in keiner Weise eingrenzen.
Materialien und Verfahren
Restriktions-Endonucleasen, T4-DNA-Ligase, T4-Polynucleotid-Kinase, Tap-DNA-Polymerase und Kälberdarm-Phosphatase wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) oder Promega Biotech (Madison, WI) bezogen: diese Reagenzien wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Für Sequenzierungsreaktionen wurde ein „SEQUENASE DNA II"-Sequenzierungskit verwendet (United States Biochemical Corporation, Cleveland OH). Immunblot- und andere Reagenzien waren von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) oder Fisher Scientific (Needham, MA). Nitrocellulosefilter wurden von Schleicher und Schuell (Keene, NH) erhalten.
Synthetische Oligonucleotid-Linker und Primer werden unter Verwendung im Handel erhältlicher automatischer Oligonucleotid-Synthesegeräte (z.B. einem ABI-DNA-Synthesegerät Modell 380B-02 (Applied Biosystems, Foster City, CA)) hergestellt. Alternativ können maßgeschneidert hergestellte synthetisierte Oligonucleotide gekauft werden, zum Beispiel von Synthetic Genetics (San Diego, CA). cDNA-Synthesekits und Zufallsprimer-Markierungskits werden von Boehringer-Mannheim Biochemical (BMB, Indianapolis, IN) erhalten.
Oligonucleotidsequenzen, die Polypeptide codieren, können entweder direkt durch Standardverfahren der Oligonucleotidsynthese synthetisiert werden, oder, im Fall von großen Codierungssequenzen, durch eine Reihe von Clonierungsschritten synthetisiert werden, bei denen eine Tandem-Anordnung von multiplen Oligonucleotid-Fragmenten, die der Codierungssequenz entsprechen (Crea, 1989; Yoshio, et al., 1989; Eaton, et al., 1988), beteiligt ist. Oligonucleotid-Codierungssequenzen können durch rekombinante Standardverfahren exprimiert werden (Maniatis, et al., 1982; Ausubel et al., 1988). Alternativ können Peptide direkt durch Standardverfahren in vitro synthetisiert werden (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Rekombinantes menschliches IFNα (rHuIFNα) und rBoIFNγ wurden von Genentech Inc. (South San Francisco, CA) erhalten. Die Referenz-Herstellung von rekombinantem menschlichem IFNα (rHuIFNα) wurde von den National Institutes of Health erhalten: rHuIFNα ist bei Lee Biomolecular (San Diego, CA) kommerziell erhältlich. Gereinigtes rekombinantes menschliches IFNαA (2 ×1 0⁸ Einheiten/mg) wurde von Biosource International (Camarillo, CA) erhalten. Wenn nicht anders angezeigt, wurde die Proteinkonzentration mit dem Bicinchoninsäure-Testkit (Pierce, Rockford IL) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Herkömmliche Manipulationen, die bei der Arbeit mit polyclonalen und monoclonalen Antikörpern beteiligt sind, einschließlich der Reinigung von Antikörper aus Seren, werden durch Standardverfahren durchgeführt (Harlow, et al., 1988). Pierce (Rockford, IL) ist eine Quelle für viele Antikörper-Reagenzien.
Affinitäts-gereinigte Kaninchen Antipeptid-Antikörper, die für Tyk2, Stat1α und Stat2 spezifisch sind, wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) bezogen. Monoclonale Antiphosphotyrosin-Antikörper (4G10) wurden von Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) erhalten. Western-Blot-Verfahren wurden mit einem Nachweiskit für verstärkte Chemilumineszenz (ECL) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) entwickelt.
Die Rindernieren-Zelllinie MDBK und die menschliche Burkitt-Lymphom-Zelllinie Daudi wurden von der American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD) erhalten. Die Daudi-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, das mit 20% foetalem Rinderserum und Antibiotika (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) angereichert war, gezüchtet. MDBK-Zellen wurden in essentiellen Eagle-minimalem Medium (EMEM), das mit 10% Pferdeserum und Antibiotika angereichert war (Gibco/BRL), gezüchtet.
Alle Gewebekultur-Medien, Seren und IFNs, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, waren auf Endotoxin negativ, wie durch einen Test mit Limulus-Amoebocyten-Lysat (Associates of Cape Cod, Woods Hole, MA) mit einem Sensitivitätswert von 0,07 ng/ml bestimmt wurde.
Allgemeines ELISA-Protokoll für den Nachweis von Antikörpern
Immulon II (PGC)-Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 5 μg/ml (ml (100 μl pro Vertiefung) Antigen in 0,1 M Carb/Bicarbonatpuffer, pH 9,5, beschichtet. Die Platten wurden mit Parafilm versiegelt und bei 4°C über Nacht gelagert.
Die Platten wurden belüftet und mit 300 μl 10% NGS blockiert und bei 37°C 1 Stunde inkubiert. Die Platten wurden 5-mal mit PBS, 0,5% „TWEEN-20" gewaschen.
Die Antiseren wurden in 0,1 M PBS, pH 7,2, verdünnt. Die gewünschte(n) Verdünnungen) von Antiseren wurde(n) jeder Vertiefung zugesetzt und die Platte 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann 5-mal mit PBS, 0,5% „TWEEN-20" gewaschen.
Mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertes Ziegen-anti-Menschen-Antiserum (Cappel) wurde 1/5.000 in PBS verdünnt. Jeder Vertiefung wurden 0,1 ml dieser Lösung zugesetzt. Die Platte wurde 30 Min bei 37°C inkubiert, dann 5-mal mit PBS gewaschen.
Sigma-ABTS (Substrat) wurde direkt vor dem Zusetzen zur Platte hergestellt.
Das Reagens besteht aus 50 ml 0,05 M Zitronensäure, pH 4,2, 0,078 ml 30% Hydrogen-Peroxidlösung und 15 mg ABTS. 0,1 ml des Substrats wurden jeder Vertiefung zugegeben, dann wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 0,050 ml 5% SDS (Gew./Vol.) gestoppt. Die relative Absorption wird bei 410 nm bestimmt.
BEISPIEL 1
Reproduktive Funktionen von IFnτ
Die Wirkung von Interferon-τ auf die Lebensspanne des Corpus luteum wurde untersucht.
IFNτ wurde in den Konzentrationen, die in Tabelle 1 angegeben sind, in das uterine Lumen von Mutterschafen gespritzt. Rekombinantes menschliches IFNα (rHuIFNα) wurde in ähnlichen Konzentrationen gespritzt. Zusätzlich wurden auch Kontrolltiere, die Kontrollproteine erhielten, verwendet. Die Lebensspanne des Corpus luteum wurde durch Untersuchen von interöstrischen Intervallen, die Aufrechterhaltung der Progesteron-Sezernierung und die Hemmung der Prostaglandin-Sezernierung bestimmt (Davis, et al., 1992).
Tabelle 1 Wirkung von Interferonen auf die reproduktive Physiologie
Der Vergleich der interöstrischen Intervalle für die Kontrolltiere und für die Tiere, die OvIFNτ erhielten, zeigt eine beträchtliche Verlängerung des Intervalls, wenn IFNτ zu 100 μg/Tag verabreicht wird. Auf der anderen Seite zeigte der Vergleich des interöstrischen Intervalls für das Kontrolltier und für Tiere, die rekombinantes menschliches IFNα erhielten, dass rHuIFNα keine bedeutende Wirkung hatte.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Interferon-τ die Fähigkeit hat, die biochemischen Vorkommnisse des reproduktiven Zyklus signifikant zu beeinflussen.
BEISPIEL 2
Antivirale Eigenschaften von Interferon-τ in verschiedenen Stadien des reproduktiven Zyklus
Konzeptus-Kulturen wurden unter Verwendung von Konzeptus, der an den Tagen 12 bis 16 des östrischen Zyklus von Schafen erhalten wurde, eingerichtet. Die antivirale Aktivität von Überständen jeder Konzeptus-Kultur wurde unter Verwendung eines cytopathischen Wirkungstests (Familetti, et al., 1981) festgestellt. Kurz, Verdünnungen von IFNτ oder von andern IFNs wurden mit Madin-Darby-Rindernieren (MDBK)-Zellen 16–18 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Hemmung der viralen Replikation unter Verwendung des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) als Challenger-Virus in einem cytopathischen Wirkungstest bestimmt (Armstrong, 1981).
Eine antivirale Einheit verursachte im Vergleich zu unbehandelten MDBK-Zellen, die mit VSV infiziert waren (Kontrollplatten), eine 50% Reduktion der Zerstörung der Einzelzellschicht. Die spezifischen Aktivitäten wurden des Weiteren unter Verwendung von normalen Schaf-Fibroblasten (Shnf) in einem Plaque-Inhibitionstest (Langford, et al., 1981) bewertet. Ein Minimum von drei Proben wurde zu jedem Zeitpunkt untersucht, und jede Probe wurde in dreifacher Ausführung getestet. Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse sind als mittlere Einheiten/ml exprimiert.
Tabelle 2 Antivirale IFNτ-Aktivität von Konzeptus-Kulturen und Allantoin- und amniotische Flüssigkeiten
Kulturüberstände hatten eine zunehmende antivirale Aktivität in Verbindung mit fortschreitender Entwicklung des Konzeptus (Tabelle 2).
BEISPIEL 3
Expression von INFτ in Bakterien
Die Aminosäure-Codierungssequenz für OvIFNτ (Imakawa, et al., 1987) wurde verwendet, um eine entsprechende DNA-Codierungssequenz zu erzeugen, mit einer Codon-Verwendung, die für die Expression in E.coli optimiert war. Verbindungssequenzen wurden den 5'- und 3'-Enden zugesetzt, um die Clonierung in bakteriellen Expressionsvektoren zu erleichtern. Die Nucleotidsequenz wurde hergestellt, um 19 einmalige Enzym-Restriktionsstellen zu umfassen, die gleichmäßig über die Codierungssequenz verteilt waren (1A und 1B).
Die Nucleotid-Sequenz wurde in elf Oligonucleotid-Fragmente geteilt, die im Größenbereich von 33 bis 75 Basen lagen. Jedes der elf Oligonucleotide wurde auf einem 380-B 2-Säulen-DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems) synthetisiert und einzel- oder doppelsträngig in einen der folgenden Vektoren cloniert: „pBLUESCRIPT⁺(KS)" (Stratagene, LaJolla, CA)-, pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ)- oder pTZ19R (Pharmacia, Piscataway, NJ)-Clonierungsvektoren.
Die Vektoren wurden in den E.coli K.-Stamm „XL1-BLUE" (recA1 endA1 gyrA96 thihsdR17 (r_k ^–, m_k ⁺) supE44 relA1λ – (lac), {F', proAB, lac^qZΔM15, Tn10(tet^R}) transformiert, der bei Stratagene (La Jolla, CA) im Handel erhältlich ist. Transformierte Zellen wurden in L-Brühe, die mit Ampicillin (50 μg/ml) angereichert war, gezüchtet. Oligonucleotid-Clonierung und -Fusion wurden unter Verwendung von rekombinanten DNA-Standardverfahren durchgeführt.
Clonierungsvektoren wurden mit den geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten, um die synthetischen Oligonucleotide zu inserieren. Die Vektoren wurden mit alkalischer Kälberdarm-Phsophatase (CIP) behandelt, um terminale Phosphatgruppen zu entfernen. Oligonucleotide wurden phosphoryliert und entweder als einzel- oder doppelsträngige Moleküle unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in den geeigneten Vektor cloniert. Wenn Einzelstränge in Clonierungsvektoren eingeführt wurden, wurde der zweite Strang nach der Transfektion durch den Bakterienwirt vervollständigt.
Für doppelsträngige Clonierung wurden Oligonucleotide zuerst an ihren synthetischen Komplementärstrang aneliert, dann in den Clonierungsvektor ligiert. Die E.coli-K12-Stämme SB221 oder NM522 wurden dann mit der Ligierung transformiert. E.coli-Stamm GM119 wurde für die Clonierung verwendet, wenn die Methylierungs-sensitiven StuI- und ClaI-Restriktionsstellen beteiligt waren. Restriktionsanalysen wurden in jedem Stadium des Clonierungsverfahrens mit isolierter DNA ausgeführt.
Clonierte Oligonucleotide wurden unter Verwendung der Restriktionsspaltungen und Ligierungen, die in 2 gezeigt werden, in ein einzelnes Polynucleotid fusioniert. Oligonucleotid-enthaltende DNA-Fragmente wurden typischerweise nach elektrophoretischer Größenfraktionierung auf Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt isoliert (Maniatis, et al., 1982; Sambrook, et al., 1989; Ausubel, et al., 1988). Die entstehende IFNτ-Polynucleotid-Codierungssequenz umspannt Position 16 bis 531: eine Codierungssequenz von 172 Aminosäuren.
Die Nucleotidsequenz des finalen Polynucleotids wurde durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Didesoxy-Ketten-Terminierungsverfahrens bestätigt.
Das StuI/SstI-Fragment voller Länge (540 Bp; 2) wurde in einen modifizierten pIN III-omp-A-Expressionsvektor cloniert und in einen kompetenten SB221-Stamm von E.coli transformiert. Für die Expression des IFNτ-Proteins wurden Zellen, die den Expressionsvektor trugen, in L-Brühe, die Ampicillin enthielt, zu einer OD (550 nm) von 0,1–1 gezüchtet, mit IPTG 3 Stunden induziert und durch Zentrifugation geerntet. Lösliches rekombinantes IFNτ wurde durch Ultraschall oder osmotische Fraktionierung aus den Zellen freigesetzt.
BEISPIEL 4
Expression von INFτ in Hefe
Das synthetische IFNτ-Gen, synthetisiert in Beispiel 3, wurde am 5'-Ende durch eine StuI-Restriktionsstelle und am 3'-Ende durch eine SacI-Restriktionsstelle flankiert.
A. Isolierung des synthetischen IFNτ-Gens
Zwei Oligonucleotid-Primer (SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14) wurden verwendet, um unter Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion Linker an das synthetische IFNτ-Gen anzuheften. Der Linker am 5'-Ende gewährleistete die Platzierung des synthetischen IFNτ-Gens in korrekter Ablesung mit der Ubiquitin-Codierungssequenz, die in dem Hefe-Clonierungsvektor pBS24Ub (Chiron Corp., Emeryville, CA) vorhanden war. Der Linker stellte auch eine Ubiquitin-IFNτ-Verbindungsregion bereit, die eine Spaltung der Ubiquitin-Sequenzen von den IFNτ-Sequenzen in vivo gewährleistete. Das 5'-Oligonucleotid codierte auch eine SacII-Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle. Das 3'-Oligonucleotid enthielt eine StuI-Spaltungsstelle.
Der Vektor, der das synthetische IFNτ-Gen trug (Beispiel 3), wurde durch das alkalische Lyseverfahren vom E.coli-Stamm „XL1-BLUE" isoliert. Isolierter Vektor wurde 500-fach in 10 mM Tris, pH 8,0/1 mM EDTA/10 mM NaCl verdünnt. Die PCR-Reaktion wurde in einem 100 μl-Volumen unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase und der Primer SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 14 durchgeführt. Die amplifizierten Fragmente wurden mit StuI und SacII gespalten. Die gespaltenen Fragmente wurden in die SacII- und SmaI-Stellen von „pBLUESCRIPT + (KS)" ligiert.
Das entstandene Plasmid wurde pBSY-IFNτ genannt. Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung von doppelsträngiger DNA als Matrize überprüft.
B. Konstruktion des Expressionsplasmids
Das Plasmid pBSY-IFNτ wurde mit SacII und EcoRV gespalten und das Fragment, das das synthetische IFNτ-Gen enthielt, wurde isoliert. Der Hefe-Expressionsvektor pBS24Ub (Sabin, et al., 1989; Ecker, et al., 1989) wurde mit SalI gespalten. Die stumpfen Enden wurden unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase erzeugt. Die Vektor-DNA wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert (Sambrook, et al., 1989). Das gewonnene linearisierte Plasmid wurde mit SacII gespalten, durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und an das SacII-EcoRV-Fragment, das von pBSY-IFNτ isoliert wurde, ligiert. Das entstandene rekombinante Plasmid wurde pBS24Ub-IFNτ genannt.
Das rekombinante Plasmid pBS24Ub-IFNτ wurde in E.coli transformiert. Rekombinante Clone, die die IFNτ-Insertion enthielten, wurden isoliert und durch Restriktionsenzym-Analyse identifiziert. Plasmid-DNA von Clonen, die IFNτ-Codierungssequenzen enthielten, wurden für die Transformation von S. cerevisiae verwendet (Rothstein, 1986). Transformations-Gemische wurden auf Medium ohne Uracil ausgestrichen und 3–5 Tage bei 30°C inkubiert. Die Kolonien wurden dann ausgestrichen und auf Medium ohne Uracil und Leucin aufrechterhalten (Rothstein, 1986).
C. Expressionsversuche
Für die Expression im kleinen Maßstab wurde eine einzelne Kolonie von S. cerevisiae von einer AB116 enthaltend pBS24Ub-IFNτ Platte ohne Leucin und Uracil genommen und bei 30°C in YEP-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton), das 1% Glucose für induzierende Bedingungen oder 8% Glucose für nicht-induzierende Bedingungen enthielt, gezüchtet. Die Zelllysate wurden gewonnen und in 15% Acrylamid, 0,4% Bisacrylamid (Sambrook, et al., 1989) einer SDS-PAGE unterzogen. Die fraktionierten Proteine wurden durch Coomassie-Blaufärbung sichtbar gemacht.
Rekombinantes IFNτ wurde spezifisch durch Immun-Blot-Verfahren mit monoclonalen Antikörpern oder polyclonalem Antiserum gegen Schaf-IFNτ nach Elektrotransfer des fraktionierten Zellextrakts auf „NYTRAN"-Papier (Rothstein, 1986) sichtbar gemacht.
Für die Expression im großen Maßstab wurde pBS24-IFNτ 24 Stunden bei 30°C in 5 × Medium ohne Uracil und Leucin, das 8% Glucose enthielt, gezüchtet. Diese Kultur wurde dann 20-fach in YEP-Medium, das 1% Glucose enthielt, verdünnt und weitere 24–36 Stunden inkubiert.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 mM Tris, pH 7,6/1 mM EDTA gewaschen und in Waschungspuffer, der 1 mM PMSF enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Bead-Beater-Geräts (Biospec Products, Bartlesville, OK) lysiert. Das Lysat wurde bei 43.000 × g 20 Minuten zentrifugiert. Die Überstand-Fraktion wurde gewonnen und dem nachstehend beschriebenen Reinigungs-Protokoll unterzogen.
D. Reinigung von roIFNτ aus Hefezell-Lysat
Der Überstand wurde auf eine 1 × 10 cm DEAE-Säule geladen und mit 10 mM Tris, pH 8,0 gewaschen. Die zurückgehaltenen Proteine wurden mit einem 300 ml, 0 bis 0,5 M NaCl-Gradienten in 10 mM Tris, pH 8,0 eluiert. Fraktionen von drei Millilitern wurden aufgefangen. 10-Milliliter-Proben der Fraktionen 17–26, die das rekombinante (roIFNτ) enthielten, wurden elektrophoretisch auf 15% SDS-Polyacrylamid-Gelen getrennt. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt.
Die Fraktionen 18, 19 und 20 enthielten die größten Mengen an roIFNτ. Diese Fraktionen wurde einzeln auf eine 1,5 × 90 cm-Sephadex-S-200-Säule geladen und die Proteine wurden in zwei Peaks aufgelöst. Aliquots jedes Protein-Peaks (25 μl) wurden elektrophoretisch auf 15% SDS-Polyacrylamid-Gelen getrennt und die Proteine wurden durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht.
Gereinigte roIFNτ-enthaltende Fraktionen wurden miteinander kombiniert und die Menge an roIFNτ wurde durch Radioimmuntest quantifiziert (Vallet, et al., 1988). Die Gesamt-Proteinkonzentration wurde durch Verwendung des Lowry-Proteintests (Lowry, et al., 1951) bestimmt.
Mikrosequenzierung von gereinigtem roIFNτ zeigte die Identität mit natürlichem IFNτ über die ersten 15 Aminosäuren, was bestätigte, dass das Ubiquitin/roIFNτ-Fusionsprotein in vivo korrekt prozessiert wurde.
Gereinigtes roIFNτ zeigte 2 bis 3 × 10⁸ Einheiten antiviraler Aktivität pro Milligramm Protein (n = 3 Replikationsplatten), was der antiviralen Aktivität von IFNτ ähnelt, das von Konzeptus-konditioniertem Kulturmedium (2 × 10⁸ U/mg) gereinigt wurde.
BEISPIEL 5
Southern-Blot-Analyse von menschlicher Hochmolekulargewichts-DNA
Venöse menschliche Blutproben von gesunden Spendern wurden in heparinisierten Röhren gesammelt und periphere Blut-Lymphocyten wurden durch Dichtegradienten-Zentrifugation unter Verwendung eines Ficoll-Isopaque-Gradienten (1,077 g/ml) (Sigma Chemical Co.) isoliert. Hochmolekulargewichts(HMW)-DNA wurde von diesen Zellen isoliert (Sambrook, et al., 1989).
Zwei 10 μg-Proben von HMW-DNA wurden mit den Restriktions-Endonucleasen HindIII oder PstI (Promega) zwei Stunden bei 37°C gespalten, und die DNA-Fragmente wurden in einem 0,8% Agarosegel (Bio-Rad, Richmond, CA) bei 75 Volt 8 Stunden elektrophoretisch getrennt. Die DNA-Fragmente wurden auf eine Nylonmembran (IBI-International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) überführt. Die Membran wurde 2 Stunden bei 80°C gebacken und bei 42°C 4 Stunden in der folgenden Prä-Hybridisierungslösung inkubiert: 5 × SSC (1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 0,15 M Natriumcitrat), 50% Vol./Vol. Formamid, 0,6% (Gew./Vol.) SDS, 0,5% (Gew./Vol. fettfreie Trockenmilch, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 4 mM EDTA und 0,5 ng/ml einzelsträngige Heringsspermien-DNA (Promega).
Der Filter wurde dann in einer Hybridisierunglösung (5 × SSC, 20% Vol./Vol. Formamid, 0,6% (Gew./Vol.) SDS, 0,5% (Gew./Vol.) fettfreie Trockenmilch, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 4 mM EDTA und 2 × 10⁸ CpM/ml mit ³²P markierter OvINFτ-cDNA (Imakawa, et al., 1987) 18 Stunden bei 42°C inkubiert. Der Filter wurde bei 42°C 15 Minuten mit 2 × SSC und 0,1% (Gew./Vol.) SDS gewaschen und bei –80°C 48 Stunden in Gegenwart eines intensivierenden Bildschirms einem Röntgenfilm (XAR, Eastman Kodak, Rochester, NY) ausgesetzt.
Die Autoradiographie wies ein Hybridisierungssignal bei etwa 3,4 kB in DNA, die mit PstI gespalten wurde, und ein etwas kleineres (= 3,0 kB) Fragment in der mit HindIII gespaltenen DNA nach. Diese Ergebnisse zeigen die Gegenwart von menschlichen DNA-Sequenzen an, die zu der OvIFNτ-cDNA-Sonde komplementär sind.
BEISPIEL 6
Isolation einer partiellen Sequenz von menschlicher IFNτ-cDNA durch PCR
Zwei synthetische Oligonucleotide (jedes 25-mer), die den Nucleotiden in der DNA-Sequenz von 231 bis 255 (enthalten in SEQ ID NO: 13) und 566 bis 590 (enthalten in SEQ ID NO: 14) von OvIFNτ-cDNA (Nummerierung in Relation zur Cap-Stelle, Imakawa, et al., 1987) entsprachen, wurden synthetisiert. Diese Primer enthielten dementsprechend Spaltungsstellen für die Restriktions-Endonucleasen PstI und EcoRI. SEQ ID NO: 13 wurde so modifiziert, dass sie die EcoRI-Stelle enthielt, die an Position 569 beginnt.
DNA wurde von etwa 1 × 10⁵ Plaque bildenden Einheiten (PBE) der folgenden beiden cDNA-Banken isoliert: menschliche Geburts-Plazenta (Clontech, Inc., Palo Alto, CA) und menschlicher Geburts-Cytotrophoblast (Dr. J. F. Strauss, University of Pennsylvania, Philadelphia PA). Die DNA wurde in Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Amplifikationen verwendet (Mullis, 1987, Mullis et al., 1987; Perkin Eimer Cetus Corp. Norwalk CT). Die Amplifikationsreaktionen wurden für 30 Zyklen unter Verwendung der Primer SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 14 durchgeführt (45°C, 1 m; 72°C, 2 m; 94°C, 1 m) (Thermocycler und Reagenzien, Perkin Elmer Cetus).
Die Amplifikations-Produkte wurden elektrophoretisch getrennt (100 Volt in einem 1,5% Agarosegel (Bio-Rad)) und auf eine Nylonmembran (IBI) überführt. Die Membran wurde 2 Stunden bei 80°C gebacken und mit ³²P markierter OvINFτ-cDNA, wie vorstehend beschrieben, prähybridisiert und hybridisiert. Die Membran wurde in 5 × SSC/0,1% (Gew./Vol.) SDS bei 42°C 5 Minuten und in 2 × SSC/0,1% (Gew./Vol.) SDS bei 42°C 2 Minuten gewaschen. Sie wurde dann bei –80°C 24 Stunden in Gegenwart eines intensivierenden Bildschirms einem „XAR"-Röntgenfilm (Eastman Kodak) ausgesetzt. Ein Amplifikationsprodukt, das mit der markierten Sonden-DNA hybridisierte, wurde nachgewiesen.
PCR wurde wiederum, wie vorstehend angeleitet, durchgeführt. Die amplifizierten Produkte wurden mit den Restriktions-Endonucleasen EcoRI und PstI (Promega) 90 Minuten bei 37°C gespalten. Die entstandenen DNA-Fragmente wurden elektrophoretisch aufgetrennt, wie vorstehend beschrieben, und die Bande, die das IFNτ-Amplifikationsprodukt enthielt, wurde von dem Gel ausgeschnitten. DNA-Fragmente wurden durch Elektro-Elution gewonnen, in mit EcoRI/PstI gespaltenem dephosphoryliertem Plasmid pUC19 subcloniert und im E.coli-Stamm JM101 (Promega) durch das Calciumchlorid-Verfahren (Sambrook, et al., 1989) transformiert. Die Plasmide wurden isoliert und das inserierte Amplifikationsprodukt unter Verwendung des Didesoxy-Terminierungsverfahren sequenziert (Sanger, et al., 1977; „SEQUENASE"-Reaktionen; United States Biochemical, Cleveland, OH). Die Nucleotidsequenzen wurden bestimmt, und ein Vergleich derselben sowie der abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit anderen IFN-Sequenzen wurde unter Verwendung on „DNA STAR SOFTWARE" (Madison, WI) durchgeführt.
Ein Vergleich der Sequenzen dieser Clone legte die vier folgenden verschiedenen Clone offen: von menschlicher plazentaler Bank, HuIFNτ6 (299 Bp), HuIFNτ7 (288 Bp) und HuIFNτ4 (307 Bp), die in ihren Nucleotidsequenzen 95% Identität zeigen; von der Cytotrophoblasten-Bank den Clon CTB 35 (HuIFNτ5; 294 Basenpaare), der mit HuIFNτ6 und HuIFNτ4 95% beziehungsweise 98% Identität teilt.
BEISPIEL 7
Isolierung von menschlichem IFNτ-Genen voller Länge
Zehn Mikrogramm PBMC-HMW-DNA wurde mit der Restriktions-Endonuclease EcoRI gespalten und in einem 0,8% Agarosegel einer elektrophoretischen Analyse unterzogen. Eine Reihe von Proben, die Bereiche von DNA-Fragmenten in der Größenordnung von 1,5 bis 10 kB (z.B. 1,5 bis 2,5 kB, 2,5 kB bis 3 kB) enthielten, wurden von dem Gel ausgeschnitten. Die DNAs wurden elektro-eluiert und gereinigt. Jede DNA-Probe wurde, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung der OvIFNτ-Primer amplifiziert. Die DNA-Moleküle jeder Probe, die ein positives PCR-Signal ergaben, wurden in λgt11 (der subgenomischen λgt11-Bank) cloniert.
A. PCR-Identifikation von Clonen, die Sequenzen enthalten, die komplementär zu OcIFNτ sind
Der λgt11-Phage wurde dann für Plaques plattiert und Plaque-Lift-Hybridisierung wurde unter Verwendung der mit ³²P markierten OvINFτ-cDNA-Sonde durchgeführt. Etwa 20 Clone wurden identifiziert, die mit der Sonde hybridisierten.
Plaques, die mit der Sonde hybridisierten, wurden weiter durch PCR unter Verwendung der vorstehend beschriebenen OvIFNτ-Primer analysiert. Sechs Plaques, die positive PCR-Signale erzeugten, wurden gereinigt. Die Phagen-DNA von diesen Clonen wurde isoliert und mit EcoRI-Restriktions-Endonuclease gespalten. Die DNA-Insertionen wurden in pUC19-Vektoren subcloniert und ihre Nucleotidsequenzen durch Didesoxy-Nucleotid-Sequenzierungen bestimmt.
B. Hybridisierungs-Identifikation von Clonen, die Sequenzen enthalten, die komplementär zu PCR-positiven Phagen sind
Rekombinante Phagen von der subgenomischen λgt11-Bank wurden in E.coli Y1080 vermehrt und mit E.coli Y1090 in einer Dichte von etwa 20.000 Plaques/150 ml Platte plattiert. Die Platten wurden mit Duplikat-Nitrocellulosefiltern überschichtet, die mit einer ³²P-markierten Sonde von einem der sechs menschlichen IFNτ-cDNA-Clone, die vorstehend isoliert wurden, hybridisiert wurden.
Clone, die positive Hybridisierungs-Signale ergaben, wurden weiter durchmustert und gereinigt. Die Phagen-DNAs von Hybridisierungs-positiven Clonen wurden isoliert, mit EcoRI gespalten, in pUC19-Vektor subcloniert und sequenziert. Die Sequenzinformation wurde dann analysiert.
1. HuIFNτ1
Drei Clone ergaben eine überlappende Sequenzinformation für über 800 Basen relativ zu der mRNA-Cap-Stelle (Clone wurden in beide Richtungen sequenziert). Die kombinierte Nucleinsäure-Sequenzinformation wird als SEQ ID NO: 11 präsentiert und die vorhergesagte Protein-Codierungssequenz wird als SEQ ID NO: 12 präsentiert. Ein Vergleich der vorhergesagten reifen Proteinsequenz (SEQ ID NO: 12) dieses Gens mit der vorhergesagten Proteinsequenz von OvIFNτ wird in 3 gezeigt.
2. HuIFNτ2, HuIFNτ3
Zwei zusätzliche Clone, die positive Hybridisierungs-Signale ergaben (HuIFNτ2 und HuIFNτ3), wurden wie vorstehend ebenfalls durchmustert, gereinigt und die Phagen-DNAs wurden subcloniert und sequenziert. Die Sequenzen dieser beiden Clone sind in den 19A und 19B dargestellt. Wie aus den 19A und 19B zu verstehen ist, ist die Nucleotidsequenz beider Clone (HuIFNτ2 und HuIFNτ3) zu der von HuIFNτ1 und OvIFNτ homolog.
HuIFNτ2 (SEQ ID NO: 29) kann ein Pseudogen sein, da es den Anschein hat, dass es ein Stop-Codon an Position 115–117 enthält. Die Sequenz, SEQ ID NO: 29, wird ohne die Leadersequenz dargestellt. Die Leadersequenz wird in 20A gezeigt. Wie aus der in 20A dargestellten NuIFNτ2-Sequenz ersichtlich, ist die erste Aminosäure, die in reifem HuIFNτ1 (ein CYS-Rest) vorhanden ist, nicht in der HuIFNτ2-Sequenz vorhanden. Entsprechend entspricht die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 29 dargestellt ist, mit Ausnahme des ersten CYS-Rests und des internen Stop-Codons einem reifen IFNτ-Protein.
Das interne Stop-Codon in der Nucleinsäure-Codierungssequenz kann durch Standardverfahren modifiziert werden, um das Stop-Codon mit einem Aminosäurecodon, das zum Beispiel GLN codiert, zu ersetzen. Die Aminosäure GLN ist in den anderen Isolaten von menschlichem IFNτ (HuIFNτ) an dieser Position vorhanden. Rekombinante Standard-Manipulationen erlauben auch die Einführung des initialen CYS-Rests, wenn erwünscht.
HuIFNτ3 (SEQ ID NO: 31) codiert anscheinend ein menschliches IFNτ-Protein. Die translatierte Aminosäuresequenz des gesamten Proteins, einschließlich der Leadersequenz, wird als SEQ ID NO: 32 dargestellt. Die translatierte Aminosäuresequenz des reifen Proteins wird als SEQ ID NO: 34 dargestellt.
BEISPIEL 8
Analyse der Gegenwart von HuIFNτ-mRNA durch RT-PCR
Menschliche plazentale cDNA-Banken und eine Schaf-cDNA-Bank, hergestellt von Konzepti vom Tag 15–16, wurden durch Hybridisierung mit der IvIFNτ-cDNA-Sonde, die vorstehend beschrieben wurde, analysiert. cDNAs wurden auf Agarosegelen größenfraktioniert und auf Filter (Maniatis, et al., 1982; Sambrook, et al., 1989) überführt. Southern Blot-Analyse mit einer OvIFNτ-Sonde zeigte, dass die autoradiographischen Signale von menschlichen cDNA-Banken etwa 1/100 des Signals betrugen, das unter Verwendung der OvIFNτ-cDNA-Bank erhalten wurde.
Die Gegenwart von HuIFNτ-mRNA in menschlicher Geburts-Plazenta und in menschlichen Amniocyten (26 Wochen, 2 Millionen Zellen) wurde unter Verwendung des reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR)-Verfahrens (Clontech Laboratories, Palo Alto CA) analysiert.
Die gesamte zelluläre RNA (tcRNA), die von menschlicher Plazenta, von menschlichen Amniocyten und Schaf-Konzepti isoliert wurde, wurde unter Verwendung des Primers SEQ ID NO: 14 revers transkribiert. Der Primer SEQ ID NO: 13 wurde dann der Reaktion zugesetzt, und eine Polymerase-Kettenreaktion über 40 Zyklen durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf Agarosegelen größenfraktioniert und auf Filter transferiert. Die DNA auf den Filtern wurde mit ³²P-markierten OvIFNτ- und HuIFNτ-cDNAs hybridisiert. Die Ergebnisse dieser Analysen zeigen die Gegenwart von menschlicher IFNτ-mRNA im foeto-plazentalen Annex. Die Amniocyten exprimierten ebenfalls die Botschaften, die OvIFNτ-Primern und menschlicher Sonde entsprachen.
Zusätzlich wurde eine RT-PCR-Analyse auf die Gegenwart von HuIFNτ auf die tcRNA, die von adulten menschlichen Lymphocyten isoliert wurde, angewendet. Eine densitometrische Analyse zeigte, dass IFNτ-mRNA in Lymphocyten existiert.
BEISPIEL 9
In situ-Hybridisierung
A. Gewebe
Objektträger von halbseriellen in Paraffin eingebetteten 5 μ-Schnitten von vier gesunden, verschiedenen menschlichen Plazentas zum Zeitpunkt der Geburt und vom ersten Trimester wurden untersucht.
B. Herstellung einer cRNA-Sonde
Von dem cDNA-Clon, der von der amplifizierten OvIFNτ-Bank isoliert worden war, wurde ein Fragment, das dem OvIFNτ-cDNA-Basen #77–736 entsprach (Base #1 ist die Cap-Stelle; offenes Leseraster von OvIFNτ-cDNA ist die Base #81–665; 7), in den Transkriptionsvektor pBS (New England Biolabs) subcloniert. Verschiedene pBS-Clone wurden isoliert, subcloniert und ihre Nucleotide wurden sequenziert. Von diesem Clon wurde ein 3'-Fragment (Basen #425–736) unter Verwendung der Restriktions-Endonucleasen NlaIV und EcoRI ausgeschnitten und in den Transkriptionsvektor pBS subcloniert. Dieser Vektor wurde pBS/OvIFNτ genannt.
Nach der Linearisierung des pBS/OvIFNτ-Plasmids wurde eine cRNA-Antisense-Sonde durch in vitro-Transkription (Sambrook, et al., 1989) unter Verwendung von T₇-RNA-Polymerase (Stratagene) synthetisiert. Eine Spur von ³H-CTP (NEN-DuPont, Cambridge, MA) wurde in der Transkriptionsreaktion verwendet. dUTP, das mit Digoxigenin (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) markiert war, wurde in die cRNA eingeschlossen und der Ertrag wurde durch TCA-Präzipitation und Szintillations-Zählung geschätzt.
C. Hybridisierung
In situ-Hybridisierung wurde, wie bei Lawrence, et al. (1985) beschrieben, unter Verwendung der Antisense-RNA-Sonde durchgeführt, mit den folgenden Modifikationen. Entparaffinierte und hydratisierte Schnitte wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), das 5 mM MgCl₂ enthielt, prähybridisiert. Nucleinsäuren in den Schnitten wurden 10 Minuten bei 65°C in 50% Formamid/2 × SSC denaturiert. Die Schnitte wurden über Nacht bei 37°C mit einem Hybridisierungs-Cocktail (30 μl/Objektträger), der 0,3 μg/ml Digoxigenin-markierte cRNA-Sonde enthielt, inkubiert und dann jeweils bei 37°C in 50% Formamid/1 × SSC 30 Minuten gewaschen. Die finalen Waschungen wurden jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur in 1 × SSC und 0,1 × SSC durchgeführt. Die Schnitte wurden 30 Minuten mit 0,5% Triton X-100 (Sigma) und 0,5% fettfreier Trockenmilch blockiert.
Das Hybridisierungssignal wurde unter Verwendung von gereinigten Antidioxigenin-Fab-Fragmenten von Schaf, die mit alkalischer Phosphatase konjugiert waren (Boehringer-Mannheim), nachgewiesen. Nachdem die ungebundenen Antikörper entfernt waren, wurde Nitroblau-Tetrazolium/5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-Substrat (Promega) und Levamisol (Bector Laboratories, Burlingame, CA) für den Signalnachweis über kolorimetrische Substrat-Erzeugung zugesetzt. Die Gewebe wurden in Methylgrün (Sigma) gegengefärbt, dehydratisiert und fixiert.
Als Kontrolle wurden einige Gewebeschnitte mit 100 μg/ml Pankreas-RNaseA (Sigma) 30 Minuten bei 37°C vorbehandelt. Die Rase wurde auf dem Objektträger mit 400 Einheiten RNase-Inhibitor (Promega) inaktiviert. Die Objektträger wurden dann zweimal in 250 ml PBS/5 mM MgCl₂ gewaschen. In anderen Kontrollversuchen wurde tRNA (Sigma) für die Digoxigenin-Sonden substituiert.
Spezifische Hybridisierung wurde in allen plazentalen Geburtsgeweben und Geweben aus dem ersten Trimester in drei getrennten Versuchen mit verschiedenen Konzentrationen der OvIFNτ-cRNA-Sonde und Blockierungs-Reagenzien beobachtet.
Die plazentalen Zotten des ersten Trimesters, die sich aus einer äußeren Schicht aus Syncytiotrophoblasten, einer darunterliegenden Schicht aus Cytotrophoblasten und einer zentralen Stromaregion mit verschiedenen Typen mesenchymaler Zellen zusammensetzen, zeigten die höchste Transkriptionsmenge von IFNτ in den Cytotrophoblastenzellen. Weniger intensive, jedoch nachweisbare Mengen waren sowohl in den Syncytiotrophoblasten als auch den Stromazellen vorhanden. Ein ähnliches Muster der Transkriptions-Expression wurde in den plazentalen Zotten von Geburts-Gewebe gezeigt, jedoch war die Menge des Signalnachweises gering. Trophoblasten des ersten Trimesters außerhalb der Zotten zeigten die höchste Botenmenge und färbten sich positiv, wenn sie in den maternalen Bluträumen vorhanden waren.
BEISPIEL 10
Antivirale Aktivität von IFNτ
Die relative spezifische Aktivität von OvIFNτ, das zur Homogenität aufgereinigt war, wurde in antiviralen Tests untersucht. Die antiviralen Tests wurden, im Wesentlichen wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt. Die spezifischen Aktivitäten sind in antiviralen Einheiten/mg Protein, erhalten von antiviralen Tests unter Verwendung von entweder Madin-Darby-Rindernieren(MDBK)-Zellen oder normalen Schaf-Fibroblasten (Shnf), ausgedrückt. Alle Proben wurden gleichzeitig getestet, um eine Variabilität zwischen den Tests zu vermeiden. Die Ergebnisse, gezeigt in Tabelle 3, sind die Mittelwerte von vier Bestimmungen, wobei die Standardabweichung weniger als 10% des Mittelwerts betrug.
Tabelle 3 Antivirale Aktivität von IFNτ und bekannten IFNs
IFNτ hatte eine höhere spezifische Aktivität als entweder rBoIFNα oder als rBoIFNγ (Tabelle 3). Die NIH-Standardherstellung von rHuIFNα hatte eine ähnliche spezifische Aktivität, wohingegen eine im Handel erhältliche Herstellung von rHuIFNα geringe spezifische antivirale Aktivität zeigte. Vergleichbare relative antivirale Aktivität wurde unter Verwendung von entweder Rinder- oder Schafzellen gezeigt.
BEISPIEL 11
Antiretrovirale Aktivität und cytotoxische Wirkungen von IFNτ
Hochgereinigtes OvIFNτ wurde auf anti-retrovirale und cytotoxische Wirkungen auf periphere Katzen-Blut-Lymphocyten, die dem Katzen-Immunschwäche-Retrovirus ausgesetzt wurden, getestet. Dieses Lentivirus ruft ein chronisches, AIDS-ähnliches Syndrom bei Katzen hervor und ist ein Modell für menschliches AIDS (Pederson, et al., 1987). Die Replikation des Virus in peripheren Blut-Lymphocyten wird durch die reverse-Transkriptase-Aktivität in Kulturüberständen über die Zeit überwacht. Die Daten dieser Tests werden in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4 Wirkung von OvIFNτ auf die FIV-Replikation
Zusetzen von OvIFNτ rief eine schnelle, dosisabhängige Abnahme der reversen Transkripase-RT-Aktivität hervor (Tabelle 4). Während so niedrige Konzentrationen wie 0,62 ng/ml IFNτ die virale Replikation hemmten, waren viel höhere Konzentrationen (40 ng/ml), die größere Auswirkungen auf die RT-Aktivität hatten, ohne toxische Wirkung auf die Zellen. Die Ergebnisse lassen annehmen, dass die Replikation des Katzen-Immunschwäche-Virus im Vergleich zu Kontrollwerten signifikant verringert wurde, wenn die Zellen in Gegenwart von OvIFNτ gezüchtet wurden.
IFNτ schien keine cytotoxische Wirkung auf die Zellen auszuüben, die das Retrovirus beherbergten. Dies war sogar dann der Fall, wenn IFNτ in einer Menge von 40 ng pro ml Kulturmedium vorhanden war.
BEISPIEL 12
Wirkungen von IFNτ auf HIV-infizierte menschliche periphere Lymphocyten
INFτ wurde ebenfalls auf Aktivität gegen HIV-Infektion in menschlichen Zellen getestet. Menschliche periphere Blut-Lymphocyten, die mit HIV infiziert worden waren (Crowe, et al., 1987), wurden mit verschiedenen OvIFNτ-Konzentrationen behandelt. Die Replikation von HIV in peripheren Blut-Lymphocyten wurde durch die reverse Transkriptase-Aktivität in Kulturüberständen über die Zeit überwacht. Die reverse Transkriptase-Aktivität wurde im Wesentlichen durch das Verfahren von Hoffmann, et al. (1985) gemessen. Die Daten von diesen Tests sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5 Wirkung von OvIFNτ auf die HIV-Replikation in menschlichen peripheren Lymphocyten
Wie in Tabelle 5 gezeigt, produzierten Konzentrationen von OvIFNτ signifikante antivirale Wirkungen. Eine Konzentration von nur 10 ng/ml ergab nach nur sechs Tagen eine Reduktion der RT-Aktivität um mehr als 50%. Eine Konzentration von 500 ng/ml ergab innerhalb von 10 Tagen eine Reduktion der RT-Aktivität um 90%.
Die Lebensfähigkeit von menschlichen peripheren Blut-Lymphocyten nach Behandlung mit IFNτ wurde über einen Konzentrationsbereich 3–13 Tage durch Trypanblau-Ausschluss untersucht. Die Ergebnisse dieser Lebensfähigkeits-Analyse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6 Wirkung von OvIFNτ auf die Lebensfähigkeit von mit HIV infizierten menschlichen peripheren Lymphocyten
Die in Tabelle 6 gezeigten Daten zeigen keinen Hinweis auf cytotoxische Wirkungen, die der Verabreichung von IFNτ zuzuschreiben sind.
BEISPIEL 13
Hemmung des zellulären Wachstums
Die Wirkungen von IFNτ auf zelluläres Wachstum wurden ebenfalls untersucht. Antizelluläre Wachstumsaktivität wurde unter Verwendung eines Kolonie-Inhibitionstests untersucht. Menschliche Amnion(WISH)- oder MDBK-Zellen wurden in geringen Zelldichten ausgestrichen, so dass sie Kolonien bildeten, die von einzelnen Zellen abstammten. Die Zellen wurden bei 200 oder 400 Zellen/Vertiefung in Platten mit 24 Vertiefungen in HMEM, das mit 2% foetalem Rinderserum (FBS) und essenziellen und nicht-essenziellen Aminosäuren supplementiert war, gezüchtet. Verschiedene Verdünnungen von Interferonen wurden zu Dreifach-Vertiefungen zugesetzt und die Platten wurden 8 Tage inkubiert, um die Koloniebildung zu gewährleisten. Die Kolonien wurden nach Färben mit Kristallviolett sichtbar gemacht und gezählt. Zellzyklus-Analyse wurde mit HMEM, das 0,5% „verbrauchtes" Medium enthielt, für zusätzliche 7 Tage durchgeführt. WISH-Zellen wurden verwendet, ohne synchronisiert zu werden.
Für die Untersuchung der IFNτ-Aktivität wurden die Zellen erneut zu 2,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in HMEM mit 10% FBS in Platten mit 6 Vertiefungen plattiert. Verschiedene Verdünnungen von OvIFNτ allein oder in Verbindung mit Peptiden wurden zugesetzt, um ein Endvolumen von 1 ml zu erhalten. Die Platten wurden bei 37°C 12, 15, 18, 24 oder 48 Stunden in 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt, mit einer Zentrifugation von geringer Geschwindigkeit aufgefangen und gewaschen. Das Zell-Pellet wurde trocken geblottet und jedem Röhrchen wurden 250 μl nukleärer Färbelösung (5 mg Propidium-Jod, 0,3 ml NP40 und 0,1 g Natriumcitrat in 100 ml destilliertem H₂O) zugesetzt. Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 10 Minuten wurden jedem Röhrchen 250 μl RNase (500 Einheiten/ml in 1,12% Natriumcitrat) zugesetzt und zusätzliche 20 Minuten inkubiert. Die Nuclei wurden durch Maschen von 44 μm flitriert und auf einem FACStar (Becton Dickinson, Mountain View, CA) unter Verwendung der DNA-Star 2.0-Software analysiert.
Bei dem zellulären Wachstumstest, bei dem die Koloniebildung sowohl der epithelialen Rinderlinie, MDBK, als auch der amniotischen menschlichen Linie, WISH, verwendet wurde, hemmte OvIFNτ sowohl die Koloniegröße als auch die -zahl. Schaf-IFNτ war auf die menschliche Zelllinie wirkungsvoller als menschliches IFNα; es ist somit sehr wirksam in der artübergreifenden Aktivität. Seine Aktivität war dosisabhängig, und die Hemmung der Vermehrung konnte bei so niedrigen Konzentrationen wie 1 Einheit/ml beobachtet werden. So hohe Konzentrationen wie 50.000 Einheiten/ml (Einheiten der antiviralen Aktivität/ml) stoppten eine Vermehrung, während die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt wurde.
Zellzyklus-Analyse durch Durchfluss-Cytometrie mit Propidiumjodid-gefärbten WISH-Zellen zeigte einen angestiegenen Zellanteil in G2/M nach 48 Stunden Behandlung mit OvIFNτ. IFN scheint somit den Fortschritt von Zellen durch die S-Phase zu hemmen. Antiproliferative Wirkungen von Schaf-IFNτ können schon 12 Stunden nach Beginn der Kultur beobachtet werden und werden über 6 Tage aufrechterhalten.
Die vorstehend dargestellten Ergebnisse zeigen sowohl die antiproliferative Wirkung von IFNτ als auch seine geringe Toxizität.
BEISPIEL 14
Weitere antiproliferative Wirkungen von IFNτ
Die antiproliferativen Wirkungen von OvIFNτ wurden für eine Ratten-Zelllinie und eine Rinder-Zelllinie untersucht. Die Rate des ³H-Thymidin-Einschlusses wurde verwendet, um die Rate der zellulären Vermehrung festzustellen.
Ratten(MtBr7 .c5)- oder Rindernieren(MDBK)-Zellen wurden in Phenolrot-freiem DME-F12-Medium, das mit 3% Dextran beschichtetem, mit Kohle abgelöstem Controlled Process Serum Replacement 2 (CPSR 2, Sigma) und 5% Dextran beschichtetem, mit Kohle abgelöstem foetalen Rinderserum (FBS) angereichert war, ausgesät. Nach etwa 15–18 Stunden Anheftung wurden die Zellen einmal mit serumfreiem DME-F12-Medium gewaschen. Das Medium wurde durch Phenolrot-freies DME-F12-Medium, das angereichert war mit 3% abgelöstem CPSR2, 1% („3/1"-Medium) oder FBS3/1-Medium, das OvIFNτ in verschiedenen Einheiten antiviraler Aktivität enthielt, wie im vesikulären Stomatitisvirus-Challenge-Test für Interferone (Beispiel 2) bestimmt wurde, ersetzt. Medien, die eine ähnliche Pufferverdünnung (nicht-verdünnter Puffer = 10 mM Tris, 330 mM NaCl, [TS]) enthielten, in dem das OvIFNτ gelöst war, wurden als Kontrolle verwendet.
Die Zellen wurden mit ³H-Thymidin ungefähr 48 Stunden nach der Behandlung 2 Stunden pulsmarkiert. Die durch Trichloressigsäure (TCA) präzipitierbaren eingeschlossenen Zählimpulse wurden durch Szintillations-Zählung bestimmt. Pro Behandlung wurden drei Wiederholungen eingeschlossen. Die Mittelwerte für OvIFNτ-Behandlungen wurden mit Proben verglichen, die vergleichbare Verdünnungen von TS-Trägerpuffer enthielten. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7 Einschluss von ³H-Thymidin
Wie aus Tabelle 7 ersichtlich, reduzierte OvIFNτ die Rate der zellulären Vermehrung (basierend auf dem Thymidin-Einschluss) für jede getesteten Zelllinien drastisch.
BEISPIEL 15
Antiproliferative Wirkungen von IFNτ auf menschliche Tumorzelllinien
Die antiproliferative Aktivität von OvIFNτ auf menschliche Tumorzelllinien wurde durch Messen der Rate des ³H-Thymidin-Einschlusses in Zellen, die mit OvIFNτ behandelt worden waren, erfasst.
Für Versuche auf Tumor-Linien, die in Suspension wachsen, wurde 1 ml Zellen von 2,5–5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in Platten mit 24 Vertiefungen plattiert. Dreifache Vertiefungen erhielten entweder die geeigneten Medien, 100, 1.000 oder 10.000 Einheiten/ml OvIFNτ oder äquivalente antivirale Konzentrationen von rHuIFNα2A (Lee Biomolecular). Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Zellen gezählt und die Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss festgestellt.
Adhärente Tumorlinien wurden zu 2,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in 1 ml in Platten mit 6 Vertiefungen plattiert. Sie erhielten Interferonbehandlungen, wie zuvor beschrieben, wurden vor dem Zählen jedoch trypsinisiert.
Signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen wurden durch eine Varianzanalyse, gefolgt von Scheffe-F-Test, festgestellt. Zellzyklus-Analyse wurde durch Durchfluss-Cytometrie unter Verwendung von Propidiumjodid durchgeführt.
A. Brust-Adenokarzinomzellen
Menschliche MCF7-Brust-Adenokarzinomzellen wurden von logarithmisch wachsenden Kulturen in Phenolrot-freiem DME-F12-Medium, das mit 3% Dextran beschichtetem, mit Kohle abgelöstem CPSR und 5% Dextran beschichtetem FBS angereichert war, ausgesät. Nach etwa 15–18 Stunden Anheftung wurden die Zellen einmal mit serumfreiem DME-F12-Medium gewaschen. Das Medium wurde durch Phenolrot-freies DME-F12-Medium, das angereichert war mit 3% abgelöstem CPSR2, 1% abgelöstem FBS („3/1"-Medium) oder 3/1-Medium, das OvIFNτ in der angezeigten Anzahl an Einheiten antiviraler Aktivität enthielt, wie im vesikulären Stomatitisvirus-Challenge-Test für Interferone bestimmt wurde, ersetzt. Medien, die eine ähnliche Pufferverdünnung (nicht-verdünnter Puffer = 10 mM Tris, 330 mM NaCl, [TS]) enthielten, wurden als Kontrolle verwendet. Die Zellen wurden ungefähr 48 Stunden nach der Behandlung mit ³H-Thymidin 2 Stunden pulsmarkiert.
Die durch Trichloressigsäure (TCA) präzipitierbaren eingebauten Zählimpulse wurden durch Szintillations-Zählung bestimmt. Pro Behandlung wurden drei Wiederholungen eingeschlossen. Die Mittelwerte für OvIFNτ-Behandlungen wurden mit Proben verglichen, die vergleichbare Verdünnungen von TS-Trägerpuffer enthielten. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8 Einschluss von ³H-Thymidin
Wie aus den Ergebnissen von Tabelle 8 ersichtlich, war OvIFNτ in der Lage, die Rate des ³H-Thymidin-Einschlusses in der menschlichen Karzinom-Zelllinie deutlich zu reduzieren. Dies zeigt die Wirksamkeit von OvIFNτ bei der Hemmung der Tumorzell-Vermehrung, insbesondere der Mamma-Tumorzellvermehrung.
B. Menschliche promyelocytäre Leukämie
Ein Vergleich der antiproliferativen Wirkungen von OvIFNτ und IFNα wurde unter Verwendung von HL-60 (menschliche Leukämie)-Zellen (Foa, et al., 1982; Todd, et al., 1981), im Wesentlichen wie vorstehend für MDBK-Zellen beschrieben, durchgeführt. Sowohl OvIFNτ als auch rHuIFNα hemmen die HL-60-Zellvermehrung. Die Ergebnisse eines von drei Wiederholungsversuchen sind als Mittelwert der %ualen Wachstumsreduktion ± SA in 4 gezeigt. 4 zeigt, dass sowohl OvIFNτ als auch IFNα in der Lage waren, das Wachstum von HL-60-Zellen drastisch zu reduzieren. Die Wachstumsreduktion für jede Verbindung überstieg bei jeder getesteten Konzentration 60%. Bei 10.000 Einheiten/ml verursachte OvIFNτ eine Wachstumsreduktion von etwa 80%, während IFNα eine Wachstumsreduktion von 100% verursachte.
Die in 4 gezeigten Daten zeigen jedoch, dass ein wesentlicher Faktor bei der Fähigkeit von IFNα, Wachstum zu reduzieren, seine toxische Wirkung auf die Zellen ist. Bei 10.000 Einheiten/ml ergab die Toxizität von IFNα bei weniger als 25% der Zellen, dass sie lebensfähig blieben. Im Gegensatz dazu blieben nahezu 100% der Zellen lebensfähig, wenn OvIFNτ zu 10.000 Einheiten/ml angewendet wurde.
5 zeigt Daten, die zeigen, dass rHuIFNα cytotoxisch ist. In der Figur werden die Ergebnisse von einem der drei Wiederholungsversuche als Mittelwert der %ualen Lebensfähigkeit ± SA gezeigt.
C. Menschliches kutanes T-Zelllymphom
Das kutane T-Zelllymphom, HUT78, reagierte ähnlich wie HL-60, wenn es mit IFNτ behandelt wurde (9). Sowohl OvIFNτ als auch rHuIFNα reduzieren das HUT 78-Zellwachstum, jedoch verringerten 10.000 Einheiten/ml rHuIFNα die Zellzahl unter die ursprünglich plattierte Zellzahl (5 × 10⁵). Dies zeigt eine Reduktion der Lebensfähigkeit der Zellen auf etwa 60% an.
Zellzyklus-Analyse (durchgeführt durch Zell-Durchfluss-Cytometrie) zeigte 48 Stunden nach der Behandlung mit beiden Interferonen einen angestiegenen Anteil an Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus (Tabelle 9). In Tabelle 9 sind die Ergebnisse eines der drei Wiederholungsversuche als prozentualer Anteil der Zellen in jeder Phase des Zellzyklus dargestellt. 10.000 Ereignisse wurden pro Probe analysiert.
Dieses Ergebnis ist wahrscheinlich dem langsameren Durchlauf der Zellen durch den Zellzyklus zuzuschreiben. In dem Beispiel, das mit 10.000 Einheiten/ml rHuIFNτ behandelt wurde, war ein großer prozentualer Anteil von Ereignissen mit geringer vorwärts- und hoher Seitenstreuung, wodurch tote Zellen identifiziert werden, vorhanden. Dies stimmt mit den Daten überein, die aus Vermehrungsversuchen erhalten wurden, bei denen nur OvIFNτ HUT 78-Vermehrungszellen ohne Toxizität hemmte.
Tabelle 9 HUT 78-Zellzyklusanalyse
D. Menschliches T-Zelllymphom
Die T-Zelllymphomlinie, H9, war auf die antiproliferativen Wirkungen der IFNs etwas weniger sensitiv als die vorstehend beschriebenen Tumor-Zelllinien. Die Ergebnisse von einem von drei Wiederholungsversuchen sind in 10 als Mittelwert der %ualen Wachstumsreduktion ± SA gezeigt. Während rHuIFNα auf die H9-Zellen nicht toxisch war, versagte es bei der Hemmung der Zellteilung bei jeder untersuchten Konzentration signifikant. Im Gegensatz dazu wurde beobachtet, dass OvIFNτ das H9-Wachstum um etwa 60% reduzierte (10). Somit ist nur OvIFNτ ein wirksamer Wachstumsinhibitor dieses T-Zelllymphoms.
Die vorstehend dargestellten Ergebnisse zeigen sowohl die antiproliferative Wirkung von IFNτ als auch seine niedrige Cytotoxizität.
BEISPIEL 16
Vorläufige Behandlung mit OvIFNτ in vivo
Drei Gruppen von 4 C57B1/6-Mäusen wurden pro Gruppe 2,5 × 10⁴ B16-F10-Zellen über die Schwanzvene gegeben: B16-F10 ist eine syngener transplantierbarer Mäusetumor, der auf Grund seines hohen Vorkommens an Lungenmetastasen (Poste, et al., 1981) ausgewählt wurde. Die Interteronbehandlung wurde 3 Tage nach der Einführung der Tumorzellen begonnen. Jede Maus erhielt i.v. pro Tag 3 aufeinanderfolgende Tage lang 100 μl entweder PBS allein, PBS, das 1 × 10⁵ Einheiten OvIFNτ enthielt, oder PBS, das 1 × 10⁵ Einheiten rekombinantes murines IFNα MuIFNα enthielt.
Die Mäuse wurden nach 21 Tagen getötet, und die Lungen wurden in 10% gepuffertem Formalin konserviert. Die Häufigkeit der Lungenmetastasen wurde zwischen Kontrollmäusen (PBS), mit OvIFNτ behandelten Mäusen und mit MuIFNα behandelten Mäusen verglichen. Die Ergebnisse dieser Verabreichungen in vivo zeigten, dass OvIFNτ B16-F10-Lungentumore dramatisch reduzierte. Diese Ergebnisse unterstützen die Verwendung von INFτ als wirksames antineoplastisches Mittel in vivo.
BEISPIEL 17
Kompetitive Bindung von IFNτ-Peptidfragmenten
A. Die Fähigkeit von auf IFNτ basierenden Peptiden, die antivirale Aktivität von IFNτ und IFNα zu blockieren
Überlappende synthetische Peptide wurden entsprechend der gesamten IFNτ-Sequenz (6) synthetisiert. Durchschnittliche Hydropathie-Werte wurden durch Nehmen der Summe der Hydropathie-Werte für jede Aminosäure, geteilt durch die Gesamtzahl der Aminosäuren in jeder Sequenz, berechnet. Die Hydropathie-Werte wurden von Kyte, et al., (1982) genommen.
Diese Peptide hatten in etwa dasselbe Molekulargewicht, unterschieden sich jedoch leicht in der Gesamt-Hydrophifie. Trotz dieser Differenz waren alle Peptide antigen, wie durch die Herstellung von Kaninchen-Antiseren mit Titern über 1:3.000 gezeigt wurde, wie durch ELISA bestimmt wurde (Harlow, et al., 1988).
Die Peptide wurden verwendet, um die antivirale Aktivität (Beispiel 2) von OvIFNτ und rBoIFNα zu hemmen. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 12 dargestellt: 1 mM N- und C-terminale Peptide blockierten beide wirkungsvoll die antivirale Aktivität von OvIFNτ unter Verwendung von MDBK-Zellen. Ein drittes Peptid, das die Aminosäuren 62–92 darstellte, reduzierte ebenfalls die antivirale Aktivität von IFNτ (70% Hemmung). Das Peptid OvIFNτ(119–150) zeigte minimale inhibitorische Aktivität. Die OvIFNτ(34–64)- und (90–122)-Peptide hatten keine offensichtliche inhibitorische Aktivität.
Die Peptid-Hemmung der antiviralen Aktivität von OvIFNτ wurde ebenso wie folgt untersucht. Einzelschichten von Madin-Darby-Rindernierenzellen wurden mit 40 Einheiten/ml OvIFNτ in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen an OvIFNτ-Peptiden inkubiert (vgl. 13). Die Ergebnisse in 13 sind als prozentualer Anteil der antiviralen Kontrollaktivität ausgedrückt; das heißt, in Abwesenheit eines kompetitierenden Peptids. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte von 6 Wiederholungsversuchen. Die Daten zeigen, dass sich die Hemmung durch OvIFNτ(1–37), (62–92), (119–150) und (139–172) bei 10^–3 M und 3 × 10^–3 M signifikant von OvIFNτ(34–64) und (90–122) unterschied. OvIFNτ(139–172) unterschied sich bei 10^–3 M signifikant von allen anderen Peptiden. Die Signifikanz wurde durch Varianzanalyse, gefolgt von Scheffe-F-Test, bei p < 0,05 festgestellt. Somit können OvIFNτ(1–37), (62–92), (119–150) und (139–172), insbsondere (139–172), Rezeptorbindungsregionen für IFNτ darstellen.
Die Fähigkeit der OvIFNτ-Peptide, die antivirale Aktivität von Rinder-IFNα (BoIFNα) zu hemmen, wurde wie folgt untersucht. Einzelschichten von Madin-Darby-Rindernierenzellen wurden mit 40 Einheiten/ml Rinder-IFNα in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von OvIFNτ-Peptiden inkubiert. Die Ergebnisse sind in 14 dargestellt und sind als prozentualer Anteil der antiviralen Kontrollaktivität in Abwesenheit von OvIFNτ-Peptiden ausgedrückt. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte von 4 Wiederholungsversuchen. Die Ergebnisse zeigen an, dass sich die Hemmung durch OvIFNτ(62–92), (119–150) und (139–172) bei 10^–3 M signifikant von OvIFNτ(1–37), (34–64) und (90–122) unterschied. OvIFNτ(139–172) unterschied sich bei 3 × 10^–3 M signifikant von OvIFNτ(1–37), (34–64) und (90–122). Signifikanz wurde durch Varianzanalyse, gefolgt von Scheffe-F-Test, bei p < 0,05 festgestellt. Somit können OvIFNτ(62–92), (119–150) und (139–172), insbsondere (139–172), allgemeine Rezeptorbindungsregionen für IFNτ und Rinder-INFα darstellen.
Die Peptid-Hemmung durch OvIFNτ-Peptide von menschlicher antiviraler IFNα-Aktivität wurde ebenfalls untersucht. Einzelschichten an Madin-Darby-Rindernierenzellen wurden mit 40 Einheiten/ml menschlichem IFNα in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von OvIFNτ-Peptiden inkubiert. Die Ergebnisse sind als prozentualer Anteil der antiviralen Kontroll-Aktivität in Abwesenheit von OvIFNτ-Peptiden ausgedrückt. Die Daten sind in 15 dargestellt und sind die Mittelwerte von 3 Wiederholungsversuchen. OvIFNτ(139–172) unterschied sich signifikant von allen anderen Peptiden bei 10^–3 M. Signifikanz wurde durch Varianzanalyse, gefolgt von Scheffe-F-Test, bei p < 0,05 festgestellt. Somit kann OvIFNτ(139–172) eine allgemeine Rezeptorbindungsregion für IFNτ und verschiedene INFα(s) darstellen.
Die vorstehend beschriebenen OvIFNτ-Peptide scheinen keine Wirkung auf die antivirale Aktivität von INFγ zu haben. Die Peptidhemmung der antiviralen Aktivität von Rinder-INFγ wurde wie folgt untersucht. Einzelschichten von Madin-Darby-Rindernierenzellen wurden mit 40 Einheiten/ml Rinder-IFN-gamma in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von OvIFNτ-Peptiden inkubiert. Die Ergebnisse sind als prozentualer Anteil der antiviralen Kontrollaktivität in Abwesenheit von OvIFNτ-Peptiden ausgedrückt. Die Daten sind in 16 dargestellt und sind die Mittelwerte von 3 Wiederholungsversuchen. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Peptiden, wie durch Varianzanalyse, gefolgt von Scheffe-F-Test, bei p < 0,05 festgestellt wurde.
Die beiden synthetischen Peptide, OvIFNτ(1–37) und OvIFNτ(139–172), blockierten ebenfalls die anti-FIV- und anti-HIV-Aktivität von OvIFNτ. Die reverse Transkriptase(RT)-Aktivität (Beispiele 12 und 13) wurde über einen Zeitraum von 14 Tagen in mit FIV infizierten FET-1-Zellen (1 × 10⁶/ml) und mit HIV infizierten HPBL (1 × 10⁶/ml) überwacht. Die Kontroll-Kulturen erhielten kein OvIFNτ. OvIFNτ wurde zu 100 ng/ml verwendet und die Peptide wurden zu 200 μM verwendet. Daten von einem repräsentativen Versuch sind als CpM/ml Kulturüberstand ausgedrückt und sind für mit FIV infizierten Zellen, 11A, und für mit HIV infizierten Zellen, 11B, dargestellt. Sowohl der N- als auch der C-Terminus von OvIFNτ scheinen an seiner anti-retroviralen Aktivität beteiligt zu sein. Während beide Peptide die FIV-RT-Aktivität blockierten, war nur das C-terminale Peptid, OvIFNτ(139–172) ein wirksamer Inhibitor der vesikulären Stomatitisvirus-Aktivität auf die Katzen-Zelllinie Fc9. Somit können die C-terminalen Regionen von Typ I-IFNs an die übliche Stelle auf dem Typ I-IFN-Rezeptor binden, wohingegen die N-terminale Region bei der Ausübung einzigartiger Funktionen beteiligt sein kann.
B. Anti-Pegtidseren
Die Fähigkeit von anti-Peptid-Antiseren, die antivirale Aktivität von OvIFNλ zu hemmen, wurde ebenfalls bestimmt. Die Antipeptid-Antiseruminhibition der antiviralen Aktivität von OvIFNτ wurde wie folgt bestimmt. Einzelschichten von MDBK-Zellen wurden mit 20 Einheiten/ml OvIFNτ in Gegenwart einer 1:30-Verdünnung von entweder präimmunen Seren oder Antiseren gegen jedes der vorstehend beschriebenen OvIFNτ-Peptide inkubiert. In 17 sind die Daten aus doppelten Versuchen als mittlere prozentuale Hemmung der antiviralen Aktivität von OvIFNτ, hervorgerufen durch Antipeptid-Antiseren, im Vergleich zu den geeigneten Präimmunseren ± Standardabweichung dargestellt. Signifikante Differenzen wurden durch Varianzanalyse, gefolgt von Scheffe-F-Test, bei p < 0,05 festgestellt. Übereinstimmend mit der Peptidhemmung von antiviralen Aktivitäten waren Seren, die Antikörper enthielten, die gegen OvIFNτ(1–37), OvIFNτ(62–92) und OvIFNτ(139–172) immunreaktiv waren, auch die wirkungsvollsten Hemmstoffe der antiviralen Aktivität von OvIFNτ, wobei die Antikörper, die gegen die N-terminalen und die C-terminalen Peptide gerichtet waren, die effizientesten waren.
Dieselben Seren wurden auch verwendet, um ihre Wirkung auf die Bindung von IFNτ an seinen Rezeptor zu untersuchen.
Der IFNτ-Bindungstest wurde wie folgt durchgeführt. Fünf μg IFNτ wurde 2 Minuten mit 500 μCi Na ¹²⁵I (15 mCi/μg; Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) in 25 μl 0,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 und 10 μl Chloramin-T (5 mg/ml) (Griggs, et al., 1992) jodiert. Die spezifische Aktivität des jodierten Proteins betrug 137 μCi/μg. Für die Bindungstests wurden Einzelschichten von MDBK-Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und mit 5% fettfreier Trockenmilch blockiert. Die Zellen wurden mit 5 nM ¹²⁵I-IFNτ in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 1% BSA 2 Stunden bei 4°C in Gegenwart oder Abwesenheit einer 1:30-Verdünnung von Seren, die Antikörper enthielten, die gegen IFNτ-Peptide hergestellt wurden, oder der entsprechenden präimmunen Seren inkubiert. Die spezifische Bindung wurde durch Inkubation mit einem 100-fachen molekularen Überschuss von unmarkiertem IFNτ festgestellt. Die spezifische Bindung von 36% wurde durch Kompetition mit 500 nM unmarkiertem IFNτ bestimmt. Zum Beispiel betrugen die gebundenen Gesamtzählimpulse 6850 ± 133, und ein 100-facher molarer Überschuss von OvIFNτ brachte 4398 ± 158 Zählimpulse pro Minute hervor. Nach der Inkubation wurden die Einzelschichten dreimal gewaschen, mit 1% Natrium-Dodecylsulfat solubilisiert, und die Radioaktivität wurde gezählt. Daten von drei Wiederholungsversuchen sind in 18 als mittlere prozentuale Reduktion der spezifischen Bindung von OvIFNτ, bewirkt durch Antipeptidseren, relativ zu den entsprechenden Präimmunseren ± Standardabweichung dargestellt. Signifikante Unterschiede wurden durch Varianzanalyse, gefolgt von Scheffe-F-Test, festgestellt.
Dieselben Seren (Antikörper enthaltend, die gegen OvIFNτ(1–37), OvIFNτ(62–92) und OvIFNτ(139–172) immunreaktiv waren), waren die effizientesten Hemmstoffe der ¹²⁵I-IFNτ-Bindung an seinen Rezeptor auf MDBK-Zellen. Die fehlende Wirkung von Seren, die gegen andere IFNτ-abgeleitete Peptide immunreaktiv waren, war nicht eine Funktion des Titers gegen OvIFNτ, da alle Seren im Vergleich zu den drei hemmenden Seren einen gleichen oder einen größeren Titer zu ihrem jeweiligen Peptid hatten: ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Serumreaktivität gegen das gesamte OvIFNτ-Molekül für jedes Serum durch ELISA festgestellt wurde.
Diese Peptide übten, obwohl sie offensichtlich an den Interteron-Rezeptor banden, in sich und von sich aus keine Interferon-ähnlichen Wirkungen in den Zellen aus.
C. Antiproliferative Aktivität
Funktionell wichtige Stellen für die antiproliferative Aktivität von IFNτ wurden ebenfalls unter Verwendung von synthetischen Peptiden untersucht (Tabelle 10). Die zelluläre Vermehrung wurde, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von MDBK-Zellen getestet. MDBK-Zellen wurden zu 5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in den Versuchen 1 und 2 beziehungsweise zu 10 × 10⁵ Zellen in Versuch 3 gezüchtet und mit Medium allein, IFNτ in einer Konzentration von 300 Einheiten/ml und Peptiden in Höhe von 1 mM 48 Stunden gezüchtet. Doppelte Vertiefungen wurden in jedem von drei Wiederholungsversuchen gezählt. Für die statistische Analyse wurden die Daten basierend auf Medium allein normalisiert und durch Varianzanalyse, gefolgt vom Multiplatten-Vergleichstest des Kleinsten Signifikanten Unterschieds (p > 0,05) bestimmt.
Tabelle 10 Peptidhemmung der antiproliferativen Aktivität von IFNτ
Wenn die Vermehrung von MDBK-Zellen über einen Zeitraum von zwei Tagen überwacht wurde, nahm die Zellzahl um etwa das zweifache zu, mit einer Lebensfähigkeit von mehr als 95%. Zusetzen von 300 Einheiten/ml, OvIFNτ eliminierte die Zellvermehrung vollständig, ohne eine Abnahme der Zell-Lebensfähigkeit. Schaf-IFNτ(119–150) war der wirkungsvollste Hemmstoff der antiproliferativen Aktivität von IFNτ.
Antiseren gegen IFNτ(119–150), die die Bindung von OvIFNτ an den Rezeptor hemmten, drehten ebenfalls die antiproliferative Wirkung von OvIFNτ um. Mehrere andere Peptide, besonders IFNτ(139–172), drehten die antiproliferative Wirkung von OvIFNτ um, jedoch in einem geringeren Ausmaß.
BEISPIEL 18
Differenzielle Erkennung des Typ I-Interferon-Rezeptors durch IFNτ und IFNα
A. Relative Cytotoxizitäten von OvIFNτ und menschlichem IFN-αA. getestet auf MDBK-Zellen.
Cytotoxizitätstests wurden auf MDBK-Zellen durchgeführt, die in Platten mit 96 Vertiefungen zur Konfluenz gezüchtet waren. Testzellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen (angezeigt in den Figuren) von IFNs, in dreifacher Ausführung, in 100 μl EMEM, angereichert mit 2% Neugeborenen-Kälberserum behandelt, und Kontrollzellen wurden mit Medium allein behandelt. OvIFNτ-DNA-Codierungssequenzen wurden in das pHIL-S1-Pichia-Expressionsplasmid (Invitrogen, San Diego, CA) cloniert, das Plasmid wurde mit BgIII geschnitten und das linearisierte Plasmid wurde verwendet, um Pichia pastoris (Stamm GS115; Invitrogen)-Sphäroblasten gemäß den Anweisungen des Herstellers zu transformieren. Rekombinantes OvIFNτ-Protein wurde durch transformierte His⁺Mut^–-Hefezellen exprimiert und durch Ionenaustausch und Hydroxylapatit-Chromatographie zur Homogenität (0,8 × 10⁸ Einheiten/mg) gereinigt. Gereinigtes rekombinantes menschliches IFNαA (2 × 10⁸ Einheiten/mg) wurden von Biosource International (Camarillo, CA) erhalten.
Die Zellen wurden bei 37°C inkubiert, bis durch mikroskopische Untersuchung signifikanter Zelltod offensichtlich war. Dann wurden die Zellen mit Kristallviolett gefärbt, die Platten wurden gewaschen und luftgetrocknet, und die Färbung wurde mit 2-Methoxyethanol (Methyl-Cellosolve) extrahiert. Die Absorption des eluierten Färbemittels wurde bei 570 nm gemessen.
Die Ergebnisse sind in den 22A und 22B gezeigt. IFNτ war mindestens 30-mal weniger toxisch gegenüber MDBK-Zellen als IFNα. Die Konzentration, die 50% Zelltod verursachte, lag für IFNα bei etwa 2500 Einheiten/ml, im Vergleich zu etwa 85.000 Einheiten/ml für IFNτ. Diese Ergebnisse bestätigen weiterhin, dass IFNτ und IFNα deutlich in ihren cytotoxischen Wirkungen differieren.
B. OvIFNτ hemmt IFN-αA-vermittelte Cytotoxizität nicht
Die Potenziale von subtoxischen Konzentrationen von IFNτ, als kompetitiver Antagonist zur toxischen Wirkung von IFNα zu wirken, wurde unter Verwendung des direkt vorstehend beschriebenen Cytotoxizitätstests untersucht.
Im ersten Versuch, gezeigt in 23A, wurde entweder IFNτ (50.000 Einheiten/ml) und/oder IFNαA (5.000 Einheiten/ml) Zellen zugesetzt, und der Test wurde, wie direkt vorstehend beschrieben, durchgeführt. Die Daten zeigen an, dass IFNτ-Behandlung in einer 10-mal höheren (aber subtoxischen) Konzentration als IFNαA die Toxizität von IFNαA auf MDBK-Zellen nicht blockierte.
Im zweiten Versuch, gezeigt in 23B, wurden die Zellen vor dem Zusetzen von IFNαA (5.000 Einheiten/ml) ohne Entfernen von IFNτ 1 Stunde bei 37°C mit IFNτ (25.000 Einheiten/ml) behandelt. Die Ergebnisse zeigen, dass Zusetzen von IFNτ in einer 5-mal höheren Konzentration 1 Stunde vor dem Zusetzen von IFNαA zu den Zellen die Toxizität von IFNαA nicht blockierte.
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass IFNτ ein schlechter Antagonist zu der cytotoxischen Wirkung von IFNαA ist. Dies war in Hinblick auf die festgelegte strukturelle und funktionelle Homologie dieser beiden Typ I-Interferone (Jarpe, et al., 1994) und ihren ähnlichen spezifischen antiviralen Aktivitäten auf MDBK-Zellen (Pontzer, et al., 1988) eine überraschende Beobachtung. Die Unfähigkeit von IFNτ, die Cytotoxizität von IFNαA zu blockieren, legt nahe, dass diese IFNs auf verschiedene Weise, eventuell durch Initiieren verschiedener Signalgebungen, an den Typ I-Rezeptorkomplex bindet.
C. Bindung von mit ¹²⁵I markiertem IFNτ und IFNα an MDBK-Zellen
IFNαA und IFNτ wurden mit dem Bolton-Flunter-Reagens (mono[¹²⁵I]Jod-Derivat ~2000 Ci/mMol, Amersham; 1 Ci = 37 GBq), wie beschrieben (Langer und Pestka, 1986) markiert. Die spezifische Aktivität von markierten Proteinen lag bei 40–70 μCi/μg). Die markierten IFNs behielten die komplette antivirale Aktivität auf MDBK-Zellen, die mindestens 4 Wochen bei 4°C unverändert blieb, bei.
Bindungstests unter Verwendung von MDBK-Zellen wurden, wie für IFNα (Zoon, et al., 1986) beschrieben, durchgeführt. Konfluente Einzelschichten von MDBK-Zellen in Platten mit sechs Vertiefungen, die auf 4°C vorgekühlt waren, wurden mit den geeigneten Konzentrationen an markierten oder unmarkierten IFNs in 2 ml vollständigem Wachstumsmedium bei 4°C 4 Stunden für ¹²⁵I-IFNαA oder über Nacht (≥ 17 Std.) für ¹²⁵I-IFNτ inkubiert, um die Bindung zu einem Gleichgewicht zu bringen. Sättigungs-Bindungsdaten wurden mit dem „EBDA"-Programm (McPherson, 1985) analysiert.
Die Ergebnisse sind in den 24A (¹²⁵I-IFNτ) und 24F (¹²⁵I-IFNαA) gezeigt. Die spezifische Bindung wurde durch Subtrahieren der nichtspezifischen Bindung, die für jede Konzentration in Gegenwart eines 100-fachen Überschusses des entsprechenden unmarkierten IFN bestimmt wurde, errechnet. Unspezifische Bindung lag für IFNτ bei < 20% und für IFNαA bei < 7%. Die Werte sind als Mittelwerte ± SA dargestellt. Die Einblendungen in jeder Figur zeigen die Scatchard-Diagramme der Bindungsdaten (B, gebunden, F, frei).
Die Daten zeigen ¹²⁵I-IFNτ, das mit hoher Spezifität an MDBK-Zellen gebunden ist (24A). Die Scatchard-Analyse der Bindung (Einblendung in 24) zeigte einen offensichtlichen K_d von 3,90 × 10^–10 M. Der K_d-Wert liegt innerhalb des Bereichs (von 10^–10 bis 10^–9 M) für die Bindung der verschiedenen IFNαs an verschiedene Zelltypen (Rubinstein, et al., 1986; Aguet, et al., 1983) und ähnelt dem Wert für die Bindung von rekombinantem Rinder-IFNαD (3,5 × 10^–10 M) und rekombinantem Rinder-IFNτ (3,7 × 10^–10 M) an endometriale Rinder-Membranen (Li und Roberts, 1994). Die Scatchard-Analyse der Bindung von ¹²⁵I-IFNα an MDBK-Zellen (24B) erzielte jedoch einen offensichtlichen K_d von 4,45 × 10^–11 M für IFNα, ähnlich dem zuvor berichteten (6,0 × 10 × 10_–11 M) (Zoon, et al., 1986). Die gesamte Rezeptorkonzentration für ¹²⁵I-IFNαA (4,62 pM) war dem für ¹²⁵I-IFNτ (4,22 pM) aus den Sctachard-Diagrammen sehr ähnlich. Diese Ergebnisse zeigen an, dass IFNαA einen nahezu um das 10-fache kleineren K_d für IFN-Rezeptoren auf MDBK-Zellen hat als IFNτ. Weiterhin legen die Ergebnisse nahe, dass dieser wesentliche Unterschied der Bindungsaffinitäten für die Unfähigkeit von IFNτ, um den Rezeptor zu „kompetitieren" und die Toxizität von IFNαA zu blockieren, verantwortlich ist.
D. Kompetitive Bindung von mit ¹²⁵I markiertem IFNτ und IFNα an MDBK-Zellen
Kompetitive Bindungsversuche wurden durchgeführt, um zu bestätigen, dass IFNτ und IFNαA an denselben Rezeptor banden. Konfluente Einzelschichten von MDBK-Zellen in Platten mit sechs Vertiefungen wurden mit den angezeigten Konzentrationen an unmarkiertem IFNαA oder IFNτ und 0,2 nM¹²⁵I-IFNτ (25A) oder 0,02 nM ¹²⁵I-IFNαA (25B) in dreifacher Ausführung inkubiert. Die Werte sind als prozentuale spezifische Bindung der Kontrolle, die in Abwesenheit des Kompetitors bestimmt wurde, dargestellt. Ein 100%-Wert bedeutet eine mittlere spezifische Bindung von 1673 ± 51 CpM (Mittelwert ± SA) für ¹²⁵I-IFNτ und 1255,7 ± 16,3 CpM (Mittelwert ± SA) für ¹²⁵I-IFNαA. Die unspezifische Bindung wurde für ¹²⁵I-IFNτ in Gegenwart von 200 nM unmarkiertem IFNτ (11% unspezifische Bindung) und in Gegenwart von 20 nM unmarkiertem IFNαA für FNaA (5% unspezifische Bindung) bestimmt und wurde von der gesamten Bindung subtrahiert.
IFNαA war ein wirksamer Kompetitor der Bindung von ¹²⁵I-IFNτ an MDBK-Zellen (25A). In der Tat war IFNαA bei der Hemmung der Bindung von ¹²⁵I-IFNτ beim Wert von 50% 40-mal wirksamer als IFNτ selbst. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn rekombinantes menschliches IFNαD als Kompetitor verwendet wurde. Kreuz-Kompetitions-Untersuchungen unter Verwendung von ¹²⁵I-IFNαA (25B) zeigten aufs Neue, dass IFNαA bei der Verdrängung von ¹²⁵I-IFNαA bei einem Ausmaß von 50% > 40-mal wirksamer war als IFNτ.
Diese Daten zeigen an, dass IFNαA eine viel höhere Affinität zu den IFN-Rezeptoren auf MDBK-Zellen hat als IFNτ, ein Ergebnis, das mit dem 10-mal geringeren K_d übereinstimmt. Darüber hinaus liefern die Ergebnisse der Kompetitionsversuche eine Erklärung für die Unfähigkeit von überschüssigem (5:1) IFNτ, die cytotoxische Wirkung von IFNαA auf MDBK-Zellen zu blockieren. Eine höhere Rezeptor-Affinität von IFNαA deutet auf differenzielle Rezeptorerkennung durch IFNτ und IFNαA hin und erklärt die Unfähigkeit von IFNτ, die Toxizität von IFNαA zu blockieren.
E. Hemmung der Bindung von IFNs auf MDBK-Zellen durch Antiseren gegen die N- oder C-Termini von IFNτ
Kaninchen-Antiseren, die gegen die IFNτ-Peptide IFNτ(1–37) (N-Terminal; SEQ ID NO: 5) und IFNτ(139–172) (C-Terminal; SEQ ID NO: 10) hergestellt wurden, wie in Beispiel 17 beschrieben, wurden auf ihre Fähigkeit, die Bindung von IFNα und IFNτ an MDBK-Zellen zu blockieren, getestet. Konfluente Einzelschichten von MDBK-Zellen in Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit 0,3 μM biotinyliertem IFNα oder IFNτ in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 5% foetales Rinderserum und eine 1:30-Verdünnung des geeigneten Antiserums enthielt, 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 5% foetales Rinderserum enthielt, wurden die Platten mit einem „EXTRAVIDIN"-alkalische Phosphatase-Konjugat unter Verwendung von p-Nitrophenyl-Phosphat als Substrat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) entwickelt. IFNα und IFNτ wurden mit dem Immunopure NHS-LC-Biotinylierungskit (Pierce) gemäß den Anweisungen des Herstellers biotinyliert. Die spezifische Bindung wurde, wie vorstehend für mit ¹²⁵I markierten IFNs beschrieben, bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 26 gezeigt. Die durchgehenden Säulen zeigen die Hemmung der Bindung von IFNτ und IFNαA an MDBK-Zellen durch Antiseren, die gegen den N-Terminus hergestellt sind, wohingegen die gestrichelten Säulen die Hemmung durch Antiseren darstellen, die gegen den C-Terminus hergestellt sind. Die Daten sind als mittlere Absorption ± SA dargestellt. Die Kontrollproben wurden mit Präimmunserum (leere Säulen) behandelt.
Die Daten zeigen, dass das Antiserum zu dem N-terminalen Peptid IFNτ (1–37) (SEQ ID NO: 5) die Bindung von IFNτ an MDBK-Zellen spezifisch blockierte, jedoch nicht die von IFNα. Im Gegensatz dazu blockierte Antiserum gegen das C-terminale Peptid IFNτ(139–172) (SEQ ID NO: 10) die Bindung sowohl von IFNτ als auch von IFNα. Diese Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, dass IFNτ(1–37) ein Epitop enthält, dass für IFNτ einzigartig ist und das sowohl bei der Bindung als auch der biologischen Aktivität von IFNτ auf MDBK-Zellen ausschlaggebend ist. Des Weiteren weisen die Daten darauf hin, dass diese unterschiedliche Interaktion an den N-Termini von IFNτ und IFNα zumindest teilweise für die unterschiedliche Kompetition am Rezeptor auf den MDBK-Zellen verantwortlich ist.
F. Dosis-Reaktions/Okkupanz-Kurven für IFNτ und IFNαA auf MDBK-Zellen
Dosis-Reaktions/Okkupanz-Kurven oder Konzentrations-Effekt-Kurven für (i) maximale prozentuale antivirale Aktivität, (ii) maximale prozentuale Cytotoxizität, und (iii) maximale prozentuale Bindung von IFNτ und IFNαA an MDBK-Zellen wurden unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Daten berechnet und als Funktionen der Konzentrationen in den 27A (IFNτ) und 27B (IFNαA) aufgetragen. Die antivirale Aktivität wurde durch einen cytopathischen Wirkungs-Inhibitionstest unter Verwendung des vesikulären Stomatitisvirus (Armstrong, 1981), wie in Beispiel 2 beschrieben, quantifiziert und unter Verwendung einer Menge von 2 × 10⁸ Einheiten/mg für IFNαA normalisiert. Daten von Cytotoxizitäts-Dosis-Reaktionskurven und Sättigungs-Bindungskurven wurden als maximale prozentuale Werte aufgetragen. Die Konzentrationen wurden aus antiviralen Einheiten bestimmt, wobei eine spezifische Aktivität von 2,0 × 10⁸ Einheiten/mg für IFNαA und 0,8 × 10⁸ Einheiten/mg für IFNτ auf MDBK-Zellen verwendet wurde. Die Symbole sind wie folgt: maximale prozentuale antivirale Aktivität (o), maximale prozentuale Cytotoxizität (σ) und maximale prozentuale Bindung (☐).
Die Ergebnisse zeigen, dass Cytotoxizität mit einer Sättigungsbindung an den Rezeptor in Verbindung steht, wohingegen antivirale Aktivität eine fraktionale Okkupanz der Rezeptoren beteiligt. Mit anderen Worten, Toxizität ist mit dem K_d korreliert. IFNαA bindet mit einer 10-mal höheren Affinität an MDBK-Zellen als IFNτ und ist in viel geringeren Konzentrationen toxisch. Die spezifischen antiviralen Aktivitäten der beiden IFNs sind ähnlich, 2 × 10⁸ Einheiten/mg Protein für IFNαA und 0,8 × 10⁸ Einheiten/mg für IFNτ, was mit der Induktion der maximalen antiviralen Aktivität mit nur einer geringen fraktionalen Okkupanz der Rezeptoren übereinstimmt.
G. Tyk2, Stat1α- und Stat2-Phosghorylierung, induziert durch IFNτ und IFNαA
Die Bindung von IFNs an Rezeptoren wird innerhalb der Zelle durch eine Signal-Transduktionsmaschinerie übersetzt, bei der eine Reihe von Tyrosin-Kinasen und Transkriptionsfaktoren beteiligt sind, die durch Phosphorylierung aktiviert werden. Es wurden deshalb Versuche durchgeführt, um festzustellen, ob die Bindungsunterschiede von IFNα und IFNτ sich in Veränderungen der Aktivierung der Typ I-Rezeptor-assoziierten Tyrosin-Kinase Tyk2 und der Transkriptionsfaktoren Stat1α und Stat2 manifestieren.
Daudi-Zellen in RPM11640-Medium (4–5 × 10⁷ Zellen pro 1 ml Probe) wurden mit IFNαA oder IFNτ zu 5000 Einheiten/ml stimuliert, oder wurden 4 Min (Tyk2) oder 10 Min (Stat1α und Stat2) bei 37°C unbehandelt gelassen. Die Zellen wurden dann bei 4°C 20 min in 500 μl eiskaltem Lysepuffer, bestehend aus 50 mM Tris HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 2 mM EGTA, 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 20 mM B-Glycerylphosphat, 2 mM Na₃VO₄, 0,05 mM p- Nitrophenyl-p-guanidinobenzoat (aus einer in Dimethylformamid gelagerten Lösung), Leupeptin (10 μg/ml), Pepstatin (10 μg/ml), Aprotinin (10 μg/ml), Benzamidin (5 μg/ml), 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid, 10% (Vol./Vol.) Glycerin und 1% (Vol./Vol.) „NONIDET P-40", lysiert.
Nach Immunpräzipitation der Extrakte (500 μl) mit 1 μg anti-Tyk2-Antikörpern oder einem Gemisch von 1 μg anti-Stat1α- und 1 μg anti-Stat2-Antikörpern und Immun-Blotting wurden die Blots mit monoclonalen anti-Phosphotyrosin (anti-PY)-Antikörpern (4G10) sondiert (Western Blot), und die Tyrosin-Phsophorylierung von Tyk2, Stat1α und Stat2 wurde. mit ECL (Amersham) nachgewiesen. Die Blots wurden dann von anti-PY befreit und wiederum entweder mit Antikörpern gegen das Tyk2-Protein oder mit einem Antikörpergemisch gegen Stat1α und Stat2 erneut sondiert.
Die Ergebnisse zeigten, dass IFNτ bei der Phosphorylierung von Tyk2 ebenso effektiv war wie IFNα. Bei den Werten von Tyk2-Protein in unstimulierten Zellen und Zellen, die mit den IFNs stimuliert waren, waren keine Unterschiede zu sehen. Des Weiteren induzierten IFNτ und IFNα vergleichbare Phosphorylierungsmengen sowohl bei Stat1α als auch bei Stat2. Wiederum waren keine Unterschiede in den Proteinwerten von Stat1α und Stat2, die von stimulierten oder unstimulierten Zellen immunpräzipitiert waren, zu sehen. Somit ähnelt IFNτ bei der Aktivierung dieser Signaltransduktions-Proteine, die mit dem Typ I-Rezeptor assoziiert sind, durch seine strukturellen und funktionellen Ähnlichkeiten mit den IFNαs IFNα.
BEISPIEL 19
Weitere Analyse der zellulären und antiviralen Wirkungen von IFNτ
A. Antivirale Wirkungen gegen HIV
Die antiviralen Wirkungen von IFNτ gegen HIV wurden durch Behandlung menschlicher PBMC-Zellen mit verschiedenen Mengen an entweder rekombinantem Schaf-IFNτ (r-OvIFNτ) oder rekombinantem menschlichem IFNα2a zum Zeitpunkt der HIV-Infektion untersucht. IFNτ war während des gesamten Versuchs zugegen. Am Tag 7 und am Tag 14 wurde die p24-Herstellung bestimmt (durch ELISA (Wang, et al., 1988, 1989) und mit einer Kontrolle ohne Wirkstoff verglichen. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 11 präsentiert.
Tabelle 11
Die Daten aus diesen Versuchen unterstützen den Schluss, dass IFNα2a und IFNτ in relativ geringen Konzentrationen bei der Reduktion der Replikation von HIV in menschlichen Lymphocyten wirksam sind.
B. Cytotoxizitätstest in PBMCs in vitro
Menschliche PBMCs wurden zu 5 × 10⁵ Zellen/ml ausgesät. Die Zellen wurden am Tag 0 mit 3 μg/ml PHA stimuliert. Die Zellen wurden mit rekombinantem menschlichem IFNα2A (in Konzentrationen von 10, 100, 1.000 und 10.000 Einheiten/ml) und IFNτ (in Konzentrationen von 2,6, 26, 260, 2600, 26.000, 260.000 und 2.600.000 Einheiten/ml) in 200 μl/Vertiefung (4 Wiederholungen jeder Konzentration unter Verwendung von Flachboden-Platten mit 96 Vertiefungen) behandelt. Kontrollzüchtungen wurden keine Interferone gegeben. Nach 4 Tagen Inkubation wurden die Zellen 9 Stunden unter Verwendung von ³H-Thymidin zu 1 μCi/Vertiefung gepulst. Die Zellen wurden geerntet und der Einschluss von markiertem Thymidin in DNA wurde bestimmt (8).
Keine Cytotoxizität wurde durch Messen der Aufnahme von Thymidin bei jeder Konzentration von IFNτ beobachtet. rHuIFNα2 war bei 1.000 Einheiten/ml jedoch auf Zellen toxisch.
In einem zweiten Versuch wurden dieselben menschlichen PBMCs entweder mit IFNτ oder menschlichem IFNα2A in Konzentrationen von 100 Einheiten/ml oder 10.000 Einheiten/ml behandelt. Nach 3 Tagen oder 8 Tagen der Inkubation wurden lebensfähige Zellen durch Durchflusscytometrie gezählt. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 12 gezeigt.
Tabelle 12
In den Zellen, die mit IFNτ behandelt wurden, wurde keine Cytotoxizität beobachtet. Es gab jedoch bei Zellen, die mit IFNα2a behandelt wurden, am Tag 3 10% Zelltod und am Tag 8 49% Zelltod.
C. Hemmung der Hepatitis B-Virus-DNA-Replikation in Hepatocyten
Die verwendete Zelllinie, HepG2-T14, ist eine menschliche Zelllinie, die von Leberzellen, die mit Hepatitis B-Virus (HBV) transfiziert waren, abgeleitet wurde. Die Zelllinie produziert semistabil HBV-Virus: mit der Zeit nimmt die Herstellung von intrazellulärer HBV-DNA und sezerniertem Virus der Zelllinie ab. Um die Produktion von HBV-DNA und -Virus zu maximieren, werden die Zellen mit deAZA-C (5-Azacytidin); Miyoshi, et al., 1992) vorbehandelt, um die Herstellung des Virus zu induzieren. Die Behandlung lief über 2–3 Tage und die Induktionsmenge lag bei etwa einem Faktor von zwei.
Die Zellen wurden dann entweder mit dem IFNα oder dem IFNτ bei Werten von 0, 5.000, 10.000, 20.000 und 40.000 Einheiten pro ml behandelt.
Alle Werte von entweder IFNα oder IFNτ reduzierten im Vergleich zu der Kontrolle ohne Wirkstoff die DNA-Produktion um etwa einen Faktor von zwei.
D. Hemmung von hepatospezifischer Messenger-RNA-Produktion in Hepatocyten
Die Hepatocyten-Zelllinie HepG2-T14 (vorstehend beschrieben) wurde auf die Wirkung von IFNα und IFNτ auf hepatospezifische mRNA-Produktion untersucht. Die Zellen wurden in Konzentrationen von IFNα oder IFNτ bei 0, 5.000, 10.000, 20.000 und 40.000 Einheiten pro ml inkubiert. Die Messenger-RNAs für die Hepatocyten-spezifischen Proteine Apo E und Apo A1 wurden durch Hybridisierungsanalyse (Sambrook, et al., 1989; Maniatis, et al., 1982) unter Verwendung von Sonden, die für diese beiden mRNAs spezifisch sind (Shoulders, et al., 1982; Wallis, et al., 1983), nachgewiesen.
Hinsichtlich der Apo E- oder Apo A1-mRNA-Produktion wurde mit bis zu 40.000 Einheiten von entweder IFNα oder IFNτ kein Rückgang der mRNA-Produktion beobachtet. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Reduktion viraler DNA-Replikation in vorherigen Versuchen nicht der Wirkung von IFNs auf zelluläre Haushalts-Aktivitäten zuzuschreiben war; der Rückgang war vielmehr wahrscheinlich der spezifischen Hemmung der viralen Replikation in den Wirtszellen zuzuschreiben.
E. In vitro-Toxizität des IFNβ-, IFNγ- und IFNτ – L929-Zelltests
Die Toxizität der IFN-Behandlung wurde in vitro gegen die Mäuse-Zelllinie L929 gemessen. L929-Zellen wurden mit 6000 U/ml bis 200.000 U/ml von entweder OvIFNτ oder MuIFNβ gemessen. Die Interferone wurden zum Zeitpunkt null zugesetzt, und die Zellen wurden 72 Stunden inkubiert und mit Kristallviolett gefärbt. Der prozentuale Anteil an lebenden Zellen wurde durch Messen der Absorption bei 405 nm bestimmt.
Beispielhafte Daten sind in 21 gezeigt. Die Werte sind als prozentuale Lebensfähigkeit ± Standardfehler dargestellt, wobei 100 Prozent der Lebensfähigkeit von L929-Zellen entspricht, die nur mit Medium behandelt wurden. Bei 6000 U/ml zeigten mit IFNβ behandelte Zellen eine Lebensfähigkeit von 77,0 ± 0,6%. Die Lebensfähigkeit der L929-Zellen nahm auf dosisabhängige Weise in dem Maß ab, in dem die Konzentrationen von IFNβ zunahmen. Im Gegensatz dazu zeigten L929-Zellen bei keiner der getesteten IFNτ-Konzentrationen eine Abnahme der Lebensfähigkeit. Diese Daten zeigen an, dass, anders als IFNβ, IFNτ bei hohen Konzentrationen in vitro keine Toxizität hat.
Zusammengenommen zeigen die vorstehend summierten Ergebnisse, dass IFNτ bei Konzentrationen, bei denen IFNβ sowohl in vitro als auch in vivo Toxizität induziert, im Wesentlichen nicht toxisch ist.
F. In vivo-Toxizität von IFNβ, IFNγ und IFNτ – Zellzahlen und Gewichtsveränderungen
Die Wirkung der Behandlung in vivo mit IFNτ, IFNβ und IFNα (10⁵ U/Injektion) auf die gesamten weißen Blutzellen (WBC), gesamten Lymphocytenzahlen und Gewichtmessungen bei NZW-Mäusen wurde wie folgt festgestellt. Interferone (OvIFNτ, MuIFNβ und MuIFNα) wurden intraperitoneal (i.p.) in einer Konzentration von 10⁵ U in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml in PBS in Gruppen von New Zeland White (NZW)-Mäusen injiziert (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Drei bis vier Tiere wurden in jede Gruppe eingeschlossen. Die Anzahl der weißen Blutzellen (WBC) wurde vor der Injektion und an ausgewählten Zeitpunkten (typischerweise 12 und 14 Stunden) danach unter Verwendung eines Hämocytometers und Standardverfahren bestimmt. Differenzielle WBC-Zählungen wurden auf mit Wright-Giemsa gefärbten Blutsabstrichen durchgeführt. Vor der Injektion lag das Gewicht der Tiere zwischen 20 und 23 Gramm.
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 13 gezeigt.
Tabelle 13 In-vivo-Toxizität von Interferonen, gemessen durch Anzahl der weißen Blutzellen und prozentuale Gewichtveränderung
Keine signifikanten Unterschiede der WBC-Zahlen, Lymphocytenzahlen oder der Gewichtsveränderung wurden zwischen mit IFNτ behandelten und unbehandelten Mäusen beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten mit IFNβ behandelte Mäuse 12 Stunden nach der Injektion einen Rückgang der Lymphocytenzahlen um 31,7%, der zumindest über die nächsten 12 Stunden weiterging. Mit IFNα behandelte Mäuse zeigten 12 Stunden nach der Injektion einen Rückgang der Lymphocytenzahlen um 55,8% und einen signifikanten Gewichtsverlust. Diese Daten zeigen an, dass, anders als IFNβ und IFNα, IFNτ bei den vorstehenden Konzentrationen in vivo keine Toxizität hat, wie durch periphere Blutzellzahlen und Gewichtsmessungen belegt wird.
BEISPIEL 20
Isolierung von Hybrid-Interferon-Fusionsprotein
Sepharose 4B-Kugeln, die mit anti-beta-Galactosidase konjugiert sind, werden von Promega bezogen. Die Kugeln werden in eine 2 ml-Säule gepackt und sukzessiv mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,02% Natriumazid und 10 ml TX-Puffer (10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, 1% Aprotinin) gewaschen.
Eine Hybrid-Interferon-Codierungssequenz wird in die Polylinker-Stelle von Lambda gt11 cloniert. Die chimere Codierungssequenz wird im Rahmen mit den aminoterminalen β-Galactosidase-Codierungssequenzen in Lambda gt11 platziert. Lysogene, die mit gt11/IFN infiziert sind, werden verwendet, um 500 ml NZYDT-Brühe zu inokulieren. Die Kultur wird bei 32°C unter Belüftung auf eine O.D. von etwa 0,2 bis 0,4 inkubiert, dann schnell in einem Wasserbad 15 Minuten auf 43°C gebracht, um die gt11-Peptidsynthese zu induzieren, und weiter 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert, in 10 ml Lysepuffer (10 mM Tris, pH 7,4, enthaltend 2% „TRITON X-100" und 1% Aprotinin, das direkt vor der Verwendung zugesetzt wird) suspendiert.
Die resuspendierten Zellen werden in flüssigem Stickstoff gefroren, dann aufgetaut, was eine im Wesentlichen vollständige Zelllyse ergibt. Das Lysat wird mit DNase I behandelt, um bakterielle und Phagen-DNA zu spalten, wie durch einen allmählichen Verlust der Viskosität in dem Lysat offenbar wird. Nicht-solubilisiertes Material wird durch Zentrifugation entfernt.
Das geklärte Lysat-Material wird auf die Sepharosesäule geladen, die Enden der Säule werden verschlossen, und die Säule wird 2 Std. bei Raumtemperatur und 16 Stunden bei 4°C auf einen rotierenden Schüttler gesetzt. Nachdem sich die Säule gesetzt hat, wird sie mit 10 ml TX-Puffer gewaschen. Das fusionierte Protein wird mit 0,1 M Carbonat/Bicarbonatpuffer, pH10 eluiert. Typischerweise werden 14 ml Elutionspuffer durch die Säule geschickt, und das Fusionsprotein wird in den ersten 4–6 ml Eluat eluiert.
Das Eluat, das das Fusionsprotein enthält, wird in „CENTRICON-30"-Patronen (Amicon, Danvers, Mass.) konzentriert. Das Endprotein-Konzentrat wird zum Beispiel in 400 μl PBS-Puffer resuspendiert. Die Protein-Reinheit wird durch SDS-PAGE analysiert.
Für polyclonale Antikörper wird das gereinigte fusionierte Protein subkutan in Freundschem Adjuvans in ein Kaninchen injiziert. Etwa 1 mg fusioniertes Protein wird an den Tagen 0 und 21 injiziert, und Kaninchenserum wird typischerweise nach 6 und 8 Wochen gewonnen.
BEISPIEL 21
Herstellung von anti-hybIFN-Antikörper
A. Expression von Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteinen
Ein chimeres Nucleinsäuremolekül einer Hybrid-Interferon-Codierungssequenz wird in den pGEX-Vektor cloniert (Boyer, et al., 1992; Frangioni, et al., 1993; Guan, et al., 1991; Hakes, et al., 1992; Smith, D. B. et al., 1988). Der pGEX-Vektor (Smith, D. B. et al., 1988) wurde durch Insertion einer Thrombin-Spaltsequenz im Rahmen mit dem Glutathion-S-Tranferase-Protein (GST-sj26-Codierungssequenz) modifiziert. Dieser Vektor wird pGEXthr genannt. Die Hybrid-IFN (hybIFN)-Codierungssequenz wird im Rahmen mit den sj26-Thrombin-Codierungssequenzen platziert (Guan, et al., 1991; Hakes, et al., 1992).
Die Hybrid-Interferon-Codierungssequenz wird mit dem linearisierten pGEXthr-Vektor ligiert. Das Ligierungsgemisch wird in E.coli transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien werden selektiert. Plasmide werden von den Ampicillin-resistenten Kolonien isoliert und durch Restriktionsenzym-Spaltung analysiert, um Clone zu identifizieren, die die IFN-Insertion enthalten (Vektor, genannt pGEXthr-hybIFN).
Der E.coli-Stamm XL-I-Blue wird mit pGEXthr-hybIFN transformiert und bei 37°C über Nacht gezüchtet. DNA wird aus zufällig herausgenommenen Kolonien hergestellt. Die Gegenwart der Codierungssequenz der Insertion wird typischerweise durch (i) Restriktionsspaltungs-Kartierung, (ii), Hybridisierungs-Screening unter Verwendung von markierten hybIFN-Sonden (d.h. Southern-Analyse) oder (iii) direkte DNA-Sequenzanalyse bestätigt.
B. Partielle Reinigung von Fusionsproteinen
Ein pGEXthr-hybIFN-Clon wird über Nacht gezüchtet. Die über-Nacht-Kultur wird 1:10 mit LB-Medium, das Ampicillin enthält, verdünnt und eine Stunde bei 37°C gezüchtet. Alternativ wird die über-Nacht-Kultur 1:100 verdünnt und vor dem Zusetzen von IPTG (Isopropylthio-β-galactosid) auf eine OD von 0,5–1,0 gezüchtet. IPTG (GIBCO-BRL, Gaithersburg MD) wird auf eine Endkonzentration von 0,2–0,5 mM für die Induktion der Proteinexpression zugesetzt, und die Inkubation wird typischerweise 2–5 Stunden, vorzugsweise 3,5 Stunden, fortgeführt.
Bakterienzellen werden durch Zentrifugaiton geerntet und in 1/100 Kulurvolumen von MTPBS (150 mM NaCl, 16 mM Na₂HPO₄, 4 mM NaH₂PO₄) resuspendiert. Die Zellen werden durch Lysozym, Ultraschall oder French-Presse lysiert, und die Lysate werden durch Zentrifugation von Zelltrümmern befreit.
Ein Aliquot des Überstands, erhalten von IPTG-induzierten Kulturen von pGEXthr-hybIFN-enthaltenden Zellen, und ein Aliquot des Überstands, erhalten von durch IPTG induzierten Kulturen von pGEXthr-Vektor allein, werden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gefolgt von Western-Blot-Verfahren, wie nachstehend beschrieben, analysiert.
Wenn nötig, können die Extrakte durch Ultrafiltration, zum Beispiel durch die Verwendung eines „CENTRICON 10"-Filters konzentriert werden.
Alternativ werden die Fusionsproteine partiell über eine Glutathion-Agarose-Affinitätssäule gereinigt, wie durch Smith, D. B. et al., 1988, detailliert beschrieben. In diesem Verfahren werden 100 ml-Kulturen über Nacht gezüchtet. Die Kulturen werden auf 1 Liter verdünnt, und die Zellen werden eine weitere Stunde bei 37°C gezüchtet. Die Expression der Fusionsproteine wird unter Verwendung von IPTG induziert. Die induzierten Kulturen werden 3,5 Stunden bei 37°C gezüchtet. Die Zellen werden geerntet und ein Ulltraschallgerät wird verwendet, um die Zellen zu lysieren. Die Zelltrümmer werden pelletiert und das klare Lysat wird auf eine Glutathion-„SEPHAROSE"-Säule geladen. Die Säule wird mit mehreren Säulenvolumina gewaschen. Das Fusionsprotein wird mit reduziertem Glutathion von der Affinitätssäule eluiert und dialysiert. Das IFN kann durch Behandlung mit Thrombin von dem kombinierten Hybridprotein freigesetzt werden. Die sj26- und hybIFN-Fragmente des kombinierten Hybridproteins können dann durch Größenfraktionierung über Säulen oder auf Gelen getrennt werden.
Alternativ wird der hybIFN-Abschnitt des kombinierten Hybridproteins durch Behandlung mit Thrombin (Guan, et al., 1991; Hakes, et al., 1992) freigesetzt.
C. Antikörper gegen das Fusionsprotein
Ein gereinigtes fusioniertes Sj26/IFN-Protein wird subkutan in Freundschem Adjuvans in ein Kaninchen injiziert. Etwa 1 mg fusioniertes Protein wird an den Tagen 0 und 21 injiziert, und Kaninchenserum wird typischerweise nach 6 und 8 Wochen gewonnen. Ein zweites Kaninchen wird auf ähnliche Weise mit gereinigtem Sj26-Protein, das von bakteriellem Kontroll-Lysat erhalten wurde, immunisiert.
Minilysate von den folgenden Bakterienkulturen werden hergestellt: (1) KM392-Zellen, die mit pGEXthr und mit pGEXthr, das die hybIFN-Insertion enthält, infiziert waren; und (2) Zellen, die mit Lambda gt11, das die hybIFN-Insertion enthält, infiziert waren. Die Minilysate und eine im Handel erhältliche Quelle von β-Galactosidase werden durch SDS-PAGE fraktioniert und die Bande für Western-Blot-Verfahren auf Nitrocellulosefilter transferiert (Sambrook, et al., 1989; Ausubel, et al., 1988).
Nimmt man die erwarteten Ergebnisse zusammen, ist Serum von Kontroll(Sj26)-Kaninchen mit jedem der fusionierten Sj26- und Sj26-Proteinantigene immunreaktiv. Serum von dem Tier, das mit fusioniertem Sj26/hybIFN-Fusionsprotein immunisiert worden war, ist mit allen Sj-26- und beta-gal-Fusionsproteinen, die hybIFN-Codierungssequenzen enthalten, reaktiv, was die Gegenwart einer spezifischen Immunreaktion mit dem hybIFN-Antigen anzeigt. Von keinem der Seren wird erwartet, dass es mit beta-Galactosidase immunreaktiv ist.
Anti-hybIFN-Antikörper, die in den Seren von dem Tier, das mit dem Sj26/hybIFN-Protein immunisiert ist, vorhanden sind, wird durch Affinitätschromatographie (unter Verwendung von rekombinant hergestelltem hybIFN als Ligand, im Wesentlichen wie vorstehend in Beispiel 12 für die anti-beta-Galactosidase-Antikörper beschrieben) gereinigt.
Während die Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Verfahren und Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist es so zu verstehen, dass verschiedene Modifikationen und Veränderungen gemacht werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen.

Claims

Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid, gebildet aus einer ersten Aminosäuresequenz, welche von Aminosäurerest 1 bis Aminosäurerest 28 eines reifen Interferon-tau-Polypeptids reicht, und einer zweiten Aminosäuresequenz, welche von Aminosäurerest 29 bis zum C-terminalen Aminosäurerest eines Nicht-tau-Interferon-Typ-I-Polypeptids reicht.
Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid nach Anspruch 1, wobei das Interferon-tau-Polypeptid ein Wiederkäuer-Interferon-tau-Polypeptid und das Nicht-tau-Interferon-Typ-1-Polypeptid ein menschliches Nicht-tau-Interferon-Typ-1-Polypeptid ist.
Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid nach Anspruch 1, wobei das Nicht-tau-Interferon-Typ-1-Polypeptid Interferon-α oder Interferon-β ist.
Nucleinsäure, welche eine offener Leserahmen (ORF)-Sequenz einschließt, die das Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid nach Anspruch 1 codiert.
Expressionsvektor, welcher einschließt: (a) die Nucleinsäure nach Anspruch 4, und (b) regulatorische Sequenzen, welche wirksam sind, um die ORF-Sequenzen in einer Wirtszelle zu exprimieren.
Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptids, umfassend die Einführung eines rekombinanten Expressionsvektors, der die Nucleinsäure nach Anspruch 4 enthält, in eine geeignete Wirtszelle, wobei der Vektor ausgelegt ist, um die ORF-Sequenz in den Wirtszellen zu exprimieren, und die Züchtung der Wirtszelle unter Bedingungen, welche zur Expression der ORF-Sequenz führen.
Arzneimittel zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen in einem Patienten, umfassend das Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid nach Anspruch 1 in einer Menge, die wirksam ist, um das Wachstum der Tumorzellen zu hemmen.
Arzneimittel zur Hemmung viraler Replikation in Zellen eines Patienten, welcher mit einem Virus infiziert ist, umfassend das Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptid nach Anspruch 1 in einer Menge, die wirksam ist, um virale Replikation in den Zellen zu hemmen.
Arzneimittel zur Behandlung einer Autoimmunkrankheit in einem Patienten, der solch eine Behandlung benötigt, umfassend eine wirksame Menge des Hybrid-Interferon-Fusionspolypeptids nach Anspruch 1.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 7 bis 9, welches formuliert ist, um durch intraperitonale, intravenöse, intramuskuläre, intralesionale oder subkutane Injektion verabreicht zu werden.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 7 bis 9, welches formuliert ist, um oral verabreicht zu werden.