DE69733493T2

DE69733493T2 - Dermatandisulfat,ein hemmer von thrombinerzeugung und komplementaktivierung

Info

Publication number: DE69733493T2
Application number: DE69733493T
Authority: DE
Inventors: L. Cornelius VAN GORP; J. Stephanie BRISTER; R. Michael BUCHANAN; J. Robert LINHARDT
Original assignee: Celsus Biopharmaceuticals Inc Cincinnati; Celsus Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: Celsus Biopharmaceuticals Inc Cincinnati; Celsus Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-02-06
Filing date: 1997-07-03
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2017-07-04
Also published as: EP0983304A1; WO1998034959A1; JP2003512807A; CA2279535A1; US5922690A; AU734112B2; ATE297412T1; AU734112C; DE69733493D1; CA2279535C; ES2242980T3; AU3880797A; PT983304E; EP0983304B1

Description

Fachgebiet
Die Erfindung betrifft eine Antithrombin III-unabhängige, Heparin-Cofaktor II (im Folgenden HCII)-vermittelte Hemmung der Thrombinerzeugung sowie die Hemmung der alternativen klassischen und terminalen Wege der Komplementaktivierung; insbesondere betrifft die Erfindung ein chemisch sulfatiertes Dermatansulfat, das hauptsächlich aus disulfatierten Disaccharid-Dermatanketten besteht, die die Thrombinerzeugung und Komplementaktivierung hemmen.
Hintergrund
Zustände oder Krankheiten, die durch eine übermäßige Thrombinerzeugung gekennzeichnet sind, wie tiefe Venenthrombose (im Folgenden DVT) oder destruktive vaskuläre glatte Muskelzellen (im Folgenden VSMC)-Proliferation, können lebensbedrohlich sein und erfordern eine wirksame Behandlung. Das Trauma führt sowohl zu Gefäßschädigung als auch VSMC-Proliferation, was Gefäßstenose, Restenose und Hyperplasie sowie Aktivierung der Blutkoagulation verursacht. Gefäßrestenose, Hyperplasie und Aktivierung der Blutkoagulation können lebensbedrohlich sein beim Auftreten nach Gefäßtransplantation, Herztransplantation, Ballon- oder Laser-Angioplastie, traumatischer Arterienverletzung, Reparatur von Muskel-Arterien nach chirurgischem Eingriff, Langzeitverbleib von Arterienkathetern, invasiven arteriellen Diagnoseverfahren, Nieren-, Lungen- oder Lebertransplantaten oder Bypass-Operationsverfahren.
Beispielsweise tritt DVT häufig vor einer lebensbedrohlichen Komplikation, der Lungenembolie (im Folgenden PE), auf. Der Großteil der PE(s) und insbesondere der Großteil von tödlichen PEs folgen einer asymptomatischen DVT. Die epidemiologischen Daten zeigen, dass die DVT-Quote jedes Jahr etwa 160 pro 100.000 in der allgemeinen Bevölkerung beträgt, wobei die Quote der tödlichen PEs etwa 60 pro 100.000 beträgt. Somit ist die medizinische Fachwelt bestrebt, DVT zu behandeln und seine Komplikationen zu verhindern. Idealerweise verhindert eine zufrieden stellende Behandlung von DVT PE, die Ausweitung des Thrombus, des venösen Gangräns und der Gelenkverluste, das symptomatische Wiederauftreten von Thrombose, das schwere postthrombotische Syndrom und das progressive Anschwellen des Beins aufgrund eines verstärkten Kompartimentdrucks, der zu anschließender Phlegmasia caerulea dolens führt.
Als Beispiel für die Schwere des Problems tragen Patienten, die eine Art von gewählter Operation erfahren, ein hohes Risiko der Entwicklung eines postoperativen venösen Thromboembolismus. Es ist bekannt, dass ohne präoperative Prophylaxe eine hohe Inzidenz für DVT, vielleicht so hoch wie 50 %, den Hüften-Totalersatz mit einer in der Folge hohen PE-Quote begleitet. Allerdings sind Antikoagulantien zur Prävention von Morbidität und Mortalität bei der Behandlung von DVT wirksam (European Consensus Report; 1992), da es bekannt ist, dass Antikoagulantien im Allgemeinen und Heparin im Besonderen DVT und tödliche PE bei Operationspatienten im Allgemeinen reduzieren können. Heparin, ein Glycosaminoglycan (im Folgenden GAG) mit potenten gerinnungshemmenden Eigenschaften, ist ein heterogenes Gemisch von variabel sulfatierten Polysaccaridketten mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 5.000 bis etwa 30.000 Dalton, die aus Widerholungseinheiten von D-Glucosamin und entweder L-Iduron- oder D- Glucuronsäureresten bestehen. Darum gibt eine gut durchdachte Verfahrensweise vor, dass der Patient vor dem operativen Eingriff eine gerinnungshemmende Prophylaxe, im Allgemeinen Heparin, erhält, die typischerweise 7 bis 10 Tage postoperativ fortgeführt wird.
Weitere lebensbedrohliche Komplikationen treten nach dem operativen Eingriff zur Reparatur von Gefäßschäden auf. Eine schwerwiegende Form von Gefäßschäden, die Atherosklerose, verursacht nahezu 50 % der gesamten Mortalität in Nordamerika, aufgrund einer verschiedenartigen Ansammlung von Krankheiten, einschließlich Herzanfall, Schlaganfall und Gangrän der Extremitäten. Im Allgemeinen verursacht eine übermäßige inflammatorisch-fibroproliferative Reaktion auf verschiedene Formen von Endothel- und Arterienwandverletzung die atherosklerotischen Läsionen. Häufig ist die Behandlung der Wahl zur Bekämpfung von Atherosklerose der chirurgische Eingriff, was zu über 1,5 Millionen Bypass-Transplantations-, Endarterektomie- und perkutanen transluminalen Angioplastie- (im Folgenden PCTA)-Verfahren führt, die jährlich in Nordamerika durchgeführt werden. Leider reduziert, obwohl die unmittelbaren Wirkungen des Verfahrens für den Operationspatienten günstig sind, in vielen Fällen die spätere Beschleunigung des arteriosklerotischen Prozesses nach dem Eingriff stark die Langzeitwirksamkeit des operativen Eingriffs. Insbesondere die VSMC-Proliferation in der Intima führt häufig zu Stenose und Okklusion des Lumens des Gefäßes. Beispielsweise ist die Restenose-Quote nach PCTA in den ersten drei bis sechs Monaten nach dem Verfahren so hoch wie 40 %. Im Falle der über 200.000 Bypass-Transplantate, die jährlich durchgeführt werden, versagen innerhalb von fünf Jahren zwischen 40 bis 60 % aufgrund proliferativer und okklusiver Veränderungen, die die VSMC-Proliferation einschließen. Ferner ist die VSMC-Proliferation für mehr als 50 % des Herztransplantat-Versagens innerhalb von fünf Jahren verantwortlich. Demnach besteht ein Bedarf für Zusammensetzungen und Verfahren zur Verminderung der Beschleunigung der nach kardiovaskulären Verfahren auftretenden arteriosklerotischen Prozesse.
Arzneimittel oder andere Behandlungen, die in die Wachstums-beschleunigende Aktivität, die eine VSMC-Proliferation verursacht, eingreifen, würden den Fortschritt des atherosklerotischen Prozesses verlangsamen. Da es bekannt ist, dass Thrombin eine sehr wirksame VSMC-Wachstums-beschleunigende Aktivität ausübt und unter bestimmten Bedingungen innerhalb der Gefäßwand vorhanden sein kann, sind Thrombin-Inhibitoren die ersten Kandidaten zur Verlangsamung des atherosklerotischen Prozesses. Unter den Zusammensetzungen, die die Wirkung von Thrombin beeinflussen, sind handelsübliche Heparine (Castellot, J.J. J. Cell Biol. 102: 1979–84 (1986)), die Thrombin sowohl in vitro als auch in vivo hemmen. Heparin wird auch als sehr wirksames Antiproliferativum betrachtet, das Thrombin besser hemmt, als jedes andere GAG in vitro (Castellot, J.J. J. Cell Biol. 90: 3722 (1981)). Allerdings existieren nur wenige Beweise, die letztere Möglichkeit in der klinischen Fassung zu stützen.
Ferner unterliegt Heparin vielen Einschränkungen, hauptsächlich aufgrund seiner potenten gerinnungshemmenden Aktivität. Beispielsweise verursachen die hohen Dosen an Heparin (>200 Einheiten/kg (im Folgenden U/kg), die > 3 Antithrombin-Einheiten/ml Plasma erzeugen), die zur Durchführung der erfolgreichen kardiopulmonalen Bypasses (im Folgenden CPB)-Operation und zur Aufrechterhaltung der CPB-Pumpen-Durchgängigkeit erforderlich sind, eine lokale oder ausgiebige Hämorrhagie, die zur Patienten-Morbidität beiträgt. Ein übermäßiger postoperativer Blutverlust und das sich daraus ergebende Erfordernis der Bluttransfusion sind gut dokumentierte Nebenwirkungen, an denen Patienten leiden, die sich einer CPB-Operation unterziehen. (Woodman, R.D., Harker, L.A., Bleeding Complications Associated with Cardiopulmonary Bypass, Blood 76(9): 1680 (1990); Dietrich, W., et. al., The Influence of Preoperative Anticoagulation on Heparin Response during Cardiopulmonary Bypass, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 102: 505 (1991)). Lebensbedrohliche Blutungen werden bei zwischen 5 bis 25 % der Fälle berichtet, und es wird geschätzt, dass die operierenden Ärzte etwa 3 % der CPB-Patienten aufgrund von operativen Blutungen wieder öffnen müssen. Die Blutungskomplikationen beruhen nicht nur auf operativen Blutungen, sondern auch auf einer Verdrängung von Heparin aus verschiedenen Plasmaproteinen, was zu einer verlängerten systemischen Koagulationshemmung und zu einer inhibitorischen Wirkung von Heparin auf die Plättchenfunktion führt. Die Verabreichung einer exakten Menge von Heparin-Antagonist in Form von Protamin kehrt die gerinnungshemmende Wirkung von Heparin um und verhindert einen übermäßigen Blutverlust zum Zeitpunkt der Kanülen-Entfernung. Allerdings ist die Protaminverabreichung in kritischer Weise Dosis-empfindlich, und auch eine Protaminverabreichung in einem moderaten Überschuss verursacht zahlreiche alarmierende und potentiell tödliche Nebenwirkungen, einschließlich Thrombozyten-Aggregationshemmung, Verlängerung der aktivierten partiellen Thromboplastindauer (im Folgenden APTT) und Verlängerung der systemischen Hypotension und der pulmonalen Hypertension. (Ireland, H., Rylance, P.B., Kesteven, P., Heparin as an Anticoagulant During Extracorporeal Circulation, Heparin, David A. Lane and Ulf Lindahl (Hrsg.); 549–74 (1989)). Eine Umfrage von 1985 unter Perfusions-Experten gab die "Protaminreaktion" als häufigsten Perfusionszwischenfall bei CPB-Verfahren an, die bei zweidrittel der Fälle vollständig festgestellt wurde. (Kuruz, 6^th Annual Meeting of Pathophysiology and Extracorporeal Technology, San Diego, CA (1986)). Darum stellt CPB ein ausgezeichnetes in vivo Modell zur Bewertung des Beitrags, den die Kandidaten-Verbindungen oder -Verfahren auf die Verschlimmerung oder Verbesserung der antithrombotischen Aktivität und der Blutungskomplikationen ausüben, bereit.
Heparin wurde bisher auch zur Behandlung von Komplementsystem-Anomalien eingesetzt. Das Komplementsystem spielt bei der Wirtsabwehr sowohl durch Zerstörung von eindringenden Organismen als auch durch Entzündungsmediation bei der Wirtsabwehr eine fundamentale Rolle. Komplement-Anomalien sind ungewöhnliche Zustände, die durch einen Mangel oder durch eine Dysfunktion eines der mehr als neunzehn, normalerweise sich gutartig verhaltenden Proteine, die etwa 10 % der Globuline in normalem menschlichem Serum ausmachen, gekennzeichnet sind. Patienten mit Komplementfehlern oder mit komplementären Dysfunktionen können als Ergebnis von übermäßigen entzündlichen Reaktionen auch gegenüber Gewebsverletzungen empfindlich sein. Außerdem löst die Komplementaktivierung im Laufe der Genesung von einer zeitweisen Blutgefäß-Okklusion oder bei der Reaktion auf einen kardiopulmonalen Bypass während einer Herzoperation Gewebeschäden über diejenigen hinaus aus, die durch die Initialverletzung verursacht werden. Es hat sich gezeigt, dass Heparin die Aktivität der alternativen klassischen und terminalen Komplementwege durch Regulierung von C1, C1-Inhibitor, C4-Bindungsprotein, C3b, Faktor H und Protein S in einem Modell hemmt, das die in vivo Komplementhemmeigenschaften vorhersagt. (Edens, R.E., Lindhardt, R.J., Bell, C.S., Weiler, J.M., Heparin and Derivatized Heparin Inhibit Zymosan and Cobra Venom Factor Activation of Complement in Serum, Immunopharmacol. 27: 145153 (1994)). Allerdings trägt die gerinnungshemmende Aktivität von Heparin zu einem erhöhten Blutungsrisiko, Risiko von Elektrolyt-Verschiebungen und zu Thrombozytopenie bei.
Bei einem Versuch, der Thrombusbildung und Blutung, die durch die systemische Verabreichung von Heparin während der CPB-Operation verursacht werden, entgegenzuwirken, wurden Verfahren für die ortsspezifische Verabreichung von Heparin entwickelt, die das Aufbringen von antithrombotischen Verbindungen auf mit Blut wechselwirkende Biomaterialien umfassen. Die antithrombotische Verbindung kann entweder ionisch oder kovalent auf eine polymere Biomaterialoberfläche gebunden sein. Ein Hauptnachteil mit Polymeren, die mit den derzeit erhältlichen Heparinformulierungen beschichtet sind, ist die begrenzte Wirksamkeit von Heparin. Darum ist es von Bedeutung, neue Beschichtungszusammensetzungen zu entwickeln, die die antithrombotische Aktivität optimieren, während sie zufrieden stellend und reproduzierbar auf eine Vielzahl von Materialien, wie natürliche Polymere und synthetische Kunststoffe, aufgebracht werden. Idealerweise führen solche neuen Zusammensetzungen zu einer vollständigen Bedeckung der mit Blut wechselwirkenden Oberflächen eines medizinischen Gegenstands.
Heparin ist ein Naturprodukt und, wie es auf viele Produkte zutrifft, die aus verschiedenen biologischen Quellen erhalten werden, kann Heparin in seiner Struktur, insbesondere im Sulfatierungsgrad variieren. Die selektive O-Sulfatierung verstärkt die Aktivität von einigen Heparinen und Heparin-artigen GAGs. Das Wal-Heparin, mit beispielsweise einem geringen O-Sulfatierungsgrad, kann als Tributylammoniumsalz in Dimethylformamid selektiv 6-O-sulfatiert werden (Uchiyama, H., Metori, A., Ogamo, A., Nagasawa, K.J. Biochem. 107: 377 (1990); Ogamo, A., Metori, A., Uchiyama, H., Hagasawa, K. Carboh. Res. 193: 165–172 (1989)), um seine gerinnungshemmende Aktivität zu erhöhen. Pyridiniumsalze von Heparinsulfat; ein weiteres GAG mit einem geringen N- und O-Sulfatierungsgrad, wurden zur Erhöhung der biologischen Aktivität ebenfalls bereits sulfatiert (Ofosu, F.A., Modi, G.J., Blachman, M.A., Buchanan, M.R., Johnson, E.A. Biochem. J. 248: 889 (1987)). Alternativ wurden auch GAGs, die in Wasser oder in Formamid löslich sind (Kiss, J. Helv. Chimica. Acta. 50: 1423 (1967); Griffin, C.C., Stevenson, J.R., Foley, K.M. XIVth Int. Carbohydr. Symp., Stockholm (1988)), durch Behandlung mit Pyridin oder Trialkylaminschwefeltrioxidkomplexen, wobei Letztere aufgrund ihrer Stabilität bevorzugt sind, sulfatiert. (Levy, L., Petacek, F.J. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 109: 901 (1962)). Die Erhöhung des Sulfatierungsgrades verbessert die katalytischen Wirkungen von Dermatansulfat (im Folgenden DS) auf die Hemmung von Thrombin durch HCII im Plasma. (Ofosu, F.A., Modi, G.J., Smith, L.M., Cerskus, A.L., Hirsch, J., Blajchman, M. A. Blood 64: 742–47 (1984)). Andere Studien haben ein Potential als antithrombotische Arzneimittel für leicht übersulfatierte Dermatansulfat-Derivate nahe gelegt. (Maaroufi, R.M., Tapon Bretaddiere, J., Mardigurian, J., Sternberg, C., Dautzenberg, M.D., Fischer, A.M., Influence of the Oversulfation Method and the Degree of Sulfation on the Anticoagulant Properties of Dermatan Sulfate Derivatives. Thromb. Res. 59: 749–758 (1990)). Allerdings hat keines dieser übersulfatierten GAGs gezeigt, dass es die für Heparin in der klinischen Einstellung vorstehend aufgezeigten Schwierigkeiten behebt.
Neuere Studien stellen weiteren Praktiken zum Ersatz von Heparin als Thrombin-Inhibitor bereit. Beispielsweise kann Thrombin in vitro an Fibrin binden. Dieses Binden beeinträchtigt die Fähigkeit von Heparin zur Katalyse der Thrombinhemmung signifikant (Hogg, D.J., Jackson, C.M., Fibrin Monomer Protects Thrombin from Inactivation by Heparin antithrombin III: Implications for Heparin Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3619–238 (1989)), da Heparin sowohl an die hochaffine Stelle auf ATIII als auch an die anionische Thrombin-Exo-Stelle – die gleiche Stelle, an die Thrombin Fibrin bindet -, um die Thrombinhemmung zu katalysieren – binden muss. Darum beeinträchtigt an Fibrin gebundenes Thrombin den Zugang der Exo-Stelle zu Heparin/ATIII und vermindert die Wirkung von Heparin als Thrombin-Inhibitor sehr stark.
Die Verwendung von Heparin gestattet komplexe vaskuläre operative Verfahrensweisen. Allerdings ist, wie aus der obigen Diskussion gesehen werden kann, Heparin insbesondere bei systemischer Verabreichung nicht der ideale Arzneimittelkandidat zur Hemmung der Thrombose, Prävention von beschleunigter Arteriosklerose, die ein VSMC-Wachstum einschließt, oder Hemmung der Komplementaktivierung, die die vaskulären Verfahren und Organtransplantate begleitet.
Ein viel versprechender Ersatzkandidat für Heparin ist Dermatansulfat, ein Heparin-artiges GAG, auch als Heparin- oder Chondroitinsulfat B bekannt. Dermatansulfat ist ein Polysaccharid, bestehend aus sich wiederholenden Uronsäure->N-Acetyl-D-galactosamindisacchariden, die über alternierende 1,3- und 1,4-Verknüpfungen verbunden sind. In Abhängigkeit von seinem Ursprung und seinem Herstellungsverfahren kann es ein Molekulargewicht von so hoch wie 50.000 Dalton aufweisen. Ursprünglich wird es als Polymer gebildet, das aus sich wiederholenden Uronosyl->N-Acetyl-D-galactosamindisaccharid-Einheiten, die an das Kernprotein über eine Glucuronosyl->Galactosyl->Galactosyl->Xylosyl-Verknüpfungsregion angeknüpft sind, besteht. Da die Monomerkomponenten von Dermatansulfat Saccharide sind, sind sie der Epimerisierung zugänglich. Insbesondere bei der Biosynthese von Dermatansulfat werden einige der D-Glucuronsäurereste an C-5 epimerisiert, was sie in L-Iduronsäurereste überführt, worauf die O-Sulfatierung von N-Acetyl-D-Galactosamin, hauptsächlich am C-4, allerdings auch am C-6, folgt. Dermatansulfat besitzt typischerweise Schwefel- und Stickstoffgehalte zwischen etwa 6,2 bis 6,9 % bzw. zwischen etwa 2,4 bis 2,9 % (Seikagaku America, Inc. 3 (1989)), was strukturell ein monosulfatiertes Dermatandisaccharid, das hier als Dermatansulfat (DS) bezeichnet wird, widerspiegelt.
Es wurde gezeigt, dass allein die Dermatansulfat- und Chondroitinsulfatkomponenten im Knorpel für das Kationenbindungsvermögen verantwortlich sind, dass die Kationenbindungsreaktionen vom Ionenaustauschertyp sind und dass verschiedene Kationen unterschiedliche Affinitätsgrade gegenüber Knorpel aufweisen. (Dunstone JR, Ion-Exchange Reactions Between Acid Mucopolysaccharides and Various Cations. Biochem J. 85: 336–351 (1962)).
In Tiermodellen hat sich gezeigt, dass DS ein sehr wirksames antithrombotisches Mittel mit geringem Hämorrhagie-Risiko ist. (Fernandez, F., Van Rijn, J., Ofosu F.A., Buchanan, M.R., The Hämorrhagic and Anthrombotic Effects of Dermatan Sulfate, Brit. J. Haematol. 64: 3 (1986)). Eine Dosis von 500 μg/kg DS hemmt die Thrombusbildung genauso wie eine 70 μg/kg Dosis an Heparin. Bei höheren Dosen war die Blutungsmenge aus einem standardisierten Einschnitt in einem Kaninchenohr mit Heparin viel stärker als mit DS, was zeigt, dass DS als Antikoagulans wirksamer und sicherer ist als Heparin, was nahe legt, dass DS klinisch geeignet ist, um die Thrombusbildung zu hemmen, ohne eine massive Hämorrhagie auszulösen. Zusätzlich besitzt DS eine geringe in vitro Wirkung auf die Plättchen, und es kann das bis zu 40-Fache der antithrombotischen Dosis von DS in Kaninchen injiziert werden, ohne dass sich die Blutung verstärkt. (Fernandez F., Van Rijn, J. Ofosu, F.A., Hirsch, J., Buchanan, M.R., The hämorrhagic and antithrombotic effect of dermatan sulfate. Br. J. Haematol. 64: 309-1 (1986)). Ferner hat sich gezeigt, dass DS die Hemmung von Thrombin in vitro wirksam katalysiert, ohne Rücksicht darauf, ob es Fibrin-gebunden oder frei ist (Okwusidi, J.I., Anvari, N., Kulczycky, M., Blajchman, M.A., Buchanan, M.R., Ofosu, F.A., In vivo Catalysis of Thrombin Inhibition by Antithrombin III or Heparin Co-factor II and Antithrombotic Effect: Differential Effects of Unfractionated Heparin and Dermatan Sulfate, Thomb. Haemorrh. Disorders. 1: 77-8013 (1990)), und dass es in vivo sowohl das Thrombin- als auch das Fibrin-Wachstum auf vorgeformten Kaninchenthrombi effektiver hemmt als Heparin. DS (30 U/kg) hat auch gezeigt, dass es die Hyperplasie der primären und sekundären Verletzung der Karotidarterien in einem Kaninchenmodel, in dem Heparin (150 U/kg) keine Wirkung besaß, hemmt (Buchanan M.R., Brister S.J. Inhibitor of Injured Vessel Wall Restenosis with Acute Thrombin Inhibtion. Relative Effects Of Heparin and Dermatan Sulfate. Bk of Abst. Joint Conf Arteriosklerosis, Thrombosis, Vascular Biol, Salt Lake City, UT. S. 18 (18.–20. Feb 1987)).
DS aktiviert spezifisch HCII, ein Plasmaprotease-Inhibitor, der Thrombin hemmt, allerdings keine anderen an der Hämostasis beteiligten Proteasen. (Tollefsen, D.W., Majerus, D.W., Blank, M.K., Heparin Cofactor II. Purification and Properties of a Heparin – Dependent Inhibitor of Thrombin in Human Plasma, J. Biol. Chem. 257:2162-9 (1982)). HCII wird durch die DS-Fraktionen, die 12 oder mehr Reste lang sind, die eine Octasaccharidsequenz enthalten, die zum Binden an den Inhibitor erforderlich ist, aktiviert. Eine Hexasaccharidkomponente in DS mit hoher Affinität gegenüber HCII wurde bereits identifiziert. (Tollefsen, D.M., In: Lane, D.A., Bjurk, I., Lindahl, U (Hrsg.), Heparin and Related Polysaccharides. Plenum Press, New York, Ss. 167-7 (1992)).
DS hemmt Thrombin über einen ATIII-unabhängigen Weg durch die beschleunigte HCII-abhängige Hemmung von Thrombin. Ofosu., F.A., Modi, G.J., Blachman, M.A., Buchanan, M.R., Johnson, E.A. Biochem. J. 248: 889 (1987)). DS enthält eine gewisse Menge an übersulfatierten Sequenzen (IdoA2S-GaINAc4S) und (IdoA-GaINAc4S6S), neben der monosulfatierten Disaccharid-Hauptsequenz (IdoA-GaINAc4S). Die Konzentration der übersulfatierten Sequenzen in natürlich vorkommendem DS korreliert mit der HCII-vermittelten Hemmung von Thrombin. (Mascellani, G., Liverani, L., Prete, A., Guppola, P.A., Bergonzini, G., Bianchini, P., Relative Influence of Different Disulphate Disaccharide Cluster on the HCII-mediated Inhibition of Thrombin by Dermatan Sulfates of Different Origins, Thromb. Res. 74: 605-1517 (1994)). Es wurde nahe gelegt, dass der L-Iduronsäuregehalt in DS mit der verstärkten Thrombinhemmung korreliert. (Whinna H.C., Choi H.U., Rosenberg L.C., Church F.C. Interaction of Heparin Cofactor II with Biglycan and Decorin, J. Biol Chem. 268: 3920 – 3924 (1993), DS weist eine geringere spezifische gerinnungshemmende Aktivität als Heparin auf, wie durch einen Vergleich ihrer Aktivitäten gezeigt. Im Vergleich mit Heparin, 150 U/mg, besitzt DS eine Aktivität von weniger als 5 U/mg, wie durch APTT gemessen. (Thomas, D.P., Merton, R.E., Barrowcliffe, T.W., Relative Efficacy of Heparin and Related GAGs as Antithrombotic Drugs, Ann. N. Y. Acad. Sci. 556: 313–22 (1989)). Es hat sich gezeigt, dass DS ein wirksames Antikoagulans ist zur DVT-Prophylaxe bei Patienten, die sich einer orthopädischen Wahl-Operation unterziehen, zur Prävention der Thrombusbildung bei Patienten, die sich einer Hämodialyse unterziehen, und im Experiment zur Durchführung eines erfolgreichen kardiopulmonalen Bypasses bei erwachsenen Schweinen. (Van Rijn, J., McKenna, J., Dermatan Sulfate: A New Concept in Antithrombotic Therapy, Diss. Abstr. Int. B 53: 5662 (1993)); (Ryan, K.E. Lane, D.A., Flynn, A., Ireland, H., Boisclair, M., Sheppard. J., Curtis, J.R., Antithrombotic Properties of Dermatan Sulfate (MF701) in Haemodialysis for Chronic Renal Failure. Thom Haemostas 68: 563 (1992); (Brister S.J., Ofosu, F.A., Heigenhauser G.L.F., Gianese, F., Buchanan M.R., Is Heparin the Ideal Anticoagulant for Cardiopulmonary Bypass? Dermatan Sulphate May Be an Alternate Choice. Thom Haemostas 71: 468–73 (1994)).
Wie wirksam DS auch immer im Labor ist, verursacht es leider praktische klinische Probleme aufgrund seiner geringen spezifischen biologischen Aktivität, kombiniert mit hoher Viskosität und schlechter Löslichkeit. Darum ist die Verabreichung von DS mühsam und unpraktisch.
Es wurde nun gefunden, dass die biologische Aktivität von DS typischerweise mit einer Sulfatgruppe pro Disaccharid durch Addition einer weiteren Sulfatgruppe wesentlich erhöht werden kann. Es wurde ferner gefunden, dass die resultierende Zusammensetzung, Dermatandisulfat (im Folgenden DDS), die hauptsächlich aus sich wiederholenden disulfatierten Disaccharidresten besteht, nicht nur ein wirksamer Thrombininhibitor in vivo ist, sondern auch die Komplementaktivierung wirksam hemmt und die Gefäßwand-Hyperplasie dämpft. Dies trifft besonders für DDS zu, das hauptsächlich aus L-Iduronsäure->4,6-Di-O-sulfatierten-N-acetyl-D-galactosamin-Einheiten (IdoA-GaINAc4S6S) besteht. Außerdem wurde gefunden, dass DDS während CPB die Thrombinerzeugung wirksamer hemmt als Heparin.
Wie bereits festgestellt wurde, umfasst DS hauptsächlich monosulfatierte Monomere, obwohl einige Monomere in natürlich vorkommendem DS übersulfatiert sind. Diejenigen DS-Polymere mit hohem L-Iduronsäuregehalt wurden mit der erhöhten Thrombinhemmung korreliert. (Whinna, H.C., Choi, H.U., Rosenberg, L.C., Church, F.C., Interaction of Heparin Cofactor II with Biglycan and Decorin, J. Bio. Chem. 268: 392S3924 (1993)). Es wurde weiterhin vorgeschlagen, dass die Erhöhung des Sulfatierungsgrades von DS die katalytischen Wirkungen der Hemmung von Thrombin durch HCII im Plasma verbessert. (Ofosu, F.A., Modi, G.J., Smith, L.M., Cerskus, A.L., Hirsch, J., Blajchman, M.A. Blood 64: 742–47 (1984)). Weitere Studien an leicht übersulfatierten Derivaten von DS haben ihr Potential als antithrombotische Arzneimittel nahe gelegt. (Maaroufi, R.M., Tapon Bretaddiere, J., Mardiguian, J., Sternberg, C., Dautzenberg, M.D., Fischer, A.M., Influence of the Oversulfation Method and the Degree of Sulfation on the Anticoagulant Properties of Dermatan Sulfate Derivatives, Thromb. Res. 59: 749–758 (1990)).
Eine lineare Korrelation wurde im Gehalt der disulfatierten Disaccharidreste und der HCII-vermittelten Aktivität für die Dermatansulfatfraktionen, die bis zu 20 % 2,4-O-disulfatierte Disaccharide (IdoA2S-GaINAc4S) enthalten, festgestellt. Wenn allerdings der Gehalt von 2,4-O-disulfatierten Disaccharidresten gering war, vermochten es auch beträchtliche Konzentrationen an 4,6-O-disulfatierten Disaccharidresten (IdoA-GaINAc4S6S) nicht, zur Antithrombinaktivität beizutragen. (Mascellani, G., Liverani, L., Prete, A., Bergonzini, G., Bianchini, P., Torri, G., Bisio, A., Guerrini, M, und Casu, B., Quantitation of Dermatan Sulfate Active Site for Heparin Cofactor II by H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Anal. Biochem. 223: 135–141 (1994)). Andere Studien schreiben Dermatansulfatfraktionen, die etwa 3 % 4,6-O-disulfatierte Dissacharidsequenzen enthalten, prinzipiell eine hohe HCII-vermittelte Hemmung der Thrombinerzeugung zu. (Linhardt, R.J., Desai, U.R., Liu, J., Pervin, A., Hoppensteadt, D., Fareed, J., Low Molecular Weight Dermatan Sulfate as an Antithrombin agent, Biochem. Pharmcol. 47: 1241-1252 (1994)). Neuerdings wurde nahe gelegt, dass die 4-O-Sulfatierung der N-Acetyl-D-galactosaminreste für die gerinnungshemmende Aktivität von DS wesentlich ist und dass die Struktur, die an HCII bindet, die 4-O-sulfatierten-L-Iduronsäure->4-O-sulfatierten-D-Galactosaminsequenzen wiederholt. Pavao, M.S.G., Mourao, P.A.S., Mulloy, B., Tollefsen, D.M., J. Biol. Chem. 270: 31027–36 (1995)).
Rindermucosa und Schweinehaut sind die Hauptquellen für kommerzielle Dermatansulfat-Präparationen, die 2,4-O-disulfatierte Disaccharidreste enthalten (Mascellani, G., Liverani, L., Prete, A., Bergonzini, G., Bianchini, P., Torri, G., Bisio, A., Guerrini, M. und Casu, B., Quantitation of Dermatan Sulfate Active Site for Heparin Cofactor II by H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Anal. Biochem. 223: 135–141 (1994)). Aus Schweinemucosastammende Dermatansulfate besitzen typischerweise auch 4,6-O-disulfatierte Disaccharidreste (Mascellani, G., Liverani, L., Prete, A., Bergonzini, G., Bianchini, P., Torri, G., Bisio, A., Guerrini, M, und Casu, B. Anal. Biochem. 223: 135–141 (1994); Linhardt, R.J., Desai, U.R., Liu, J., Pervin, A., Hoppensteadt, D., Fareed, J., Low Molecular Weight Dermatan Sulfate as an antithrombin agent, Biochem. Pharmcol. 47: 1241–1252 (1994)). Ein GAG aus Tintenfischknorpel, das auch als Chondroitinsulfat E bekannt ist, besteht hauptsächlich aus 4,6-O-disulfatierten Disaccharidresten. Allerdings besteht es hauptsächlich aus D-Glucuronsäure->4,6-O-disulfatierten N-Acetyl-D-galactosamineinheiten (Kawai, Y., Seno, N., Anno, K., J. Biochem. 60: 317 (1966)) statt aus L-Iduronsäure->4,6-O-disulfatiertem N-Acetyl-D-galactosamin (IdoA-GaINAc4S6S).
Der Sulfatierungsgrad ist eine bedeutende funktionelle Eigenschaft, die wesentlich zu der gerinnungshemmenden Wirkung von DS und anderen Heparin-artigen GAGs beiträgt. In DS ist die Galactosamineinheit typischerweise O-sulfatiert, und O-Sulfatgruppen sind oft in der 4-Position und gegebenenfalls in der 6-Position zugegen. Die 2- und/oder 3-Position von Iduronsäure sind gegebenenfalls ebenso sulfatiert.
FR-A-2,584,728 offenbart die Herstellung von Fragmenten von Dermatansulfatnatriumsalz. Offenbart ist außerdem auch die Herstellung von sulfatiertem Dermatansulfatnatriumsalz.
Offenbarung der Erfindung
Es wurde nun gefunden, dass Dermatansulfat (DS) typischerweise mit einer Sulfatgruppe pro Disaccharid mindestens ein ebenso wirksames Antikoagulans ist wie Heparin, dass es die Thrombinerzeugung wirksamer verhindert als Heparin und die intimale Hyperplasie wirksamer dämpft als Heparin. Wir fanden, dass diese biologischen Aktivitäten durch die Addition einer zusätzlichen Sulfatgruppe wesentlich verbessert werden können. Es wurde ebenfalls gefunden, dass das resultierende Dermatandisulfat (DDS), das hauptsächlich aus sich wiederholenden L-Iduronsäure->4,6-O-disulfatierten Disaccharidresten besteht, nicht nur ein wirksamer Thrombininhibitor ist, sondern auch die Komplementaktivierung wirksam hemmt.
Ein Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Hemmung der Thrombinerzeugung durch Verabreichung einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge von Dermatandisulfat (DDS) enthält, das aus sich wiederholendem L-Iduronsäure->N-acetyl-D-galactosamindisaccharid mit mehr als 2 Sulfatgruppen pro Disaccharid besteht.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die eine wirksame Menge an Dermatandisulfat (DDS) enthält, das aus mehr als etwa 75 % sich wiederholenden L-Iduronsäure->4,6-O-disulfatierten N-Acetyl-D-galactosamindisaccharid-Einheiten und einem Molekulargewicht zwischen etwa 5.000 und etwa 30.000 Dalton besteht.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Formulierung, die eine wirksame Menge an Dermatandisulfat (DDS) enthält, das aus sich wiederholenden L-Iduronsäure->N-Acetyl-D-galactosamindisaccharid-Einheiten mit mehr als 2 Sulfatgruppen pro Disaccharid besteht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Einzelheiten unserer Erfindung werden im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
1 ein Diagramm der chemischen Zusammensetzung eines typischen Disaccharids in der erfindungsgemäßen DDS-Zusammensetzung;
2 das H-NMR-Spektrum bei 500 MHz in D₂O der DS-Zusammensetzung;
3 das H-NMR-Spektrum bei 500 MHz in D₂O der erfindungsgemäßen DDS-Zusammensetzung;
4 eine graphische Darstellung der Komplementhemmung in Prozent vs. Konzentration durch DS, DDS und Heparin;
5 eine graphische Darstellung der aktivierten Gerinnungszeiten (ACT) in Schweinen, die 400 U/kg Heparin, 25 U/kg Heparin und DDS erhielten, während und nach CPB;
6 graphische Darstellungsänderungen in den TAT- und T/HCII-Spiegeln vs. Zeit in einem Schwein, das eine CPB mit DDS-Gerinnungshemmung erfuhr;
7 eine graphische Darstellung der Antithrombinaktivität vs. Zeit in einem Schwein, das 400 U/kg Heparin, 25 U/kg Heparin und DDS erhielt, während und nach CPB; und
8 eine graphische Darstellung der Antithrombinaktivität (Anti-IIa) vs. Zeit, während CPB bei Schweinen, die entweder Heparin oder DDS erhielten.
Beste Weise zur Durchführung der Erfindung
Dermatansulfat (DS) bezieht sich auf eine Präparation, die auf die herkömmliche Weise zur Herstellung von DS aus Geweben erhalten, anderweitig synthetisiert oder aus dem Handel erhalten wurde. DS ist dadurch gekennzeichnet, dass es eine geringe oder keine ATIII-verwandte Aktivität und in vitro eine HCII-verwandte gerinnungshemmende Aktivität aufweist. Die Biosynthese epimerisiert einige der D-Glucoronsäurereste an C-5 und wandelt sie in L-Iduronsäurereste um. Anschließend wird N-Acetyl-D-galactosamin primär an C-4 und sekundär an C-6 O-sulfatiert. Die Fachwelt versteht die Abfolge der an der biosynthetischen Epimerisierung und Sulfatierung beteiligten Schritte gut. Säugergewebe, beispielsweise Säugerhaut, die, falls gewünscht, menschliches Gewebe einschließt, dient als Quellen für DS. Im Allgemeinen sind vaskularisiertes Gewebe und Haut vom Schwein oder Rind als Quellen für DS bevorzugt, wobei die Darmmucosa die bevorzugte kommerzielle Quelle für DS bereitstellt. Im Allgemeinen wird das DS-Ausgangsmaterial aus der gewählten Gewebequelle dadurch hergestellt, das man das Gewebe einer Hydrolyse unterzieht und die Polyanionen durch Anionenaustauscherchromatographie und anschließendes selektives Ausfällen von DS mit Kupfersulfat sammelt.
Unter Bezugnahme auf 1 ist nun ein erfindungsgemäßes Dermatandisulfat (DDS) gezeigt, das ein Gemisch von Dermatanpolymerketten umfasst, die hauptsächlich verknüpfte disulfatierte Disacchariddimere enthalten, die durch chemische Sulfatierung von nativem DS erhalten wurden. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Polymere sich wiederholende L-Iduronsäure->N-Acetyl-D-galactosamindisaccharid-Einheiten mit mehr als 2 Sulfatgruppen pro Disaccharid. Es ist auch bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Polymere sich wiederholende L-Iduronsäure->N-Acetyl-D-galactosamin-4,6-O-disulfatierte Disaccharideinheiten umfassen. Vorzugsweise besitzen die erfindungsgemäßen Polymere ein Molekulargewicht im Bereich zwischen etwa 5.500 bis etwa 37.500 Dalton, vorzugsweise zwischen etwa 5.000 bis etwa 30.000 Dalton, entsprechend etwa 16 bis etwa 100 Monosaccharideinheiten in den Polymerketten.
DDS mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 30.000 Dalton wird vorzugsweise durch Spalten längerkettiger Polysaccharide entweder (1) durch Sulfatierung eines Fragments des nativen Dermatansulfats (DS) oder (2) durch Depolymerisation des DDS erhalten.
Die Dermatanketten werden durch eine Vielzahl von enzymatischen und chemischen, der Fachwelt bekannten Verfahren depolymerisiert, einschließlich derjenigen, wobei (1) Chondroitinase die nativen Dermatansulfatverknüpfungen zwischen N-Acetylgalactosamin und Uronsäure unter Bildung von Oligosacchariden, die 4,5-ungesättigte Uronsäurereste am nicht reduzierenden Ende tragen, spaltet (Linhardt, R.J., In: Current Protocols in Molecular Biology, A Varki, Hrsg. 2:17.13.17-17.13.32 (1995); (2) Ester der Iduronsäure-Carboxylgruppen von Dermatan der Eliminierung (Kiss, J., Adv Varbohydr Chem. Biochem, 29:229-303 (1974)) bei alkalischem pH (Mardiguian, J.S., U.S. Patentschrift 4.440.926 (1984)) unter Bildung von 4,5-ungesättigter Uronsäure am nicht-reduzierenden Ende unterzogen werden; (3) nicht sulfatierte Uronsäurereste von Dermatanen durch Oxidation mit Periodat gespalten und anschließend die resultierenden Dialdehyde mit Borhydrid reduziert und unter milden sauren Bedingungen hydrolysiert werden (Wolfrom, M.L., Wang, P.Y., Honda, S., Carbohydr Res. 11:179 (1969)), wodurch somit mit dem Rest der nicht sulfatierten Uronsäure Endgruppen erzeugt werden; (4) die glycosidischen Bindungen der Dermatane durch einen Radikalmechanismus unter Verwendung von Wasserstoffperoxid gespalten werden, was als oxidative reduktive Depolymerisation bekannt ist (Gilbert, D.L., Gershman, R., Ruhm, K.B., Price, W.E., J. Gen Physiol, 41:989 (1958)); (Pigman, W., Hawkins, W., Grauling, E., Rizi, S., Holley, H., Arch Biochem Biophys, 89:184 (1960)); (Pigman, W., Rizi, S., Biochem Biophys Res Comm 1:39 (1959)), was zu Fragementen mit reduzierenden Endgruppen führt und (5) Dermatanketten gleichzeitig mit der Sulfatierung durch die Wirkung eines Gemisches von Schwefelsäure und Chlorsulfonsäure gespalten werden (Naggi, A., Torri, G., US-Patentschrift 4,727,063 (1988)). Die erfindungsgemäßen Polymere besitzen eine nennenswerte ATIII-unabhängige Antithrombinaktivität, die durch die Wirkung von HCII vermittelt wird.
Im Allgemeinen wird DDS vorzugsweise durch Sulfatieren von nativem Dermatansulfat (DS) synthetisiert. Handelsüblich erhältliches DS, gelöst in einem polaren Lösungsmittel, vorzugsweise einem polarem Lösungsmittel, wie Wasser oder Formamid, oder einem aprotischen polaren Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, wird mit einem Sulfatierungsmittel, Vorzugsweise einem milden Sulfatierungsmittel, wie Tri-Niederalkylamin-Schwefeltrioxidkomplex, wobei Niederalkyl hier im Folgenden so definiert ist, dass es Alkylreste von fünf oder weniger Kohlenstoffatomen einschließt, bei einer Temperatur zwischen etwa –20° bis 100 °C zwischen etwa einer bis 48 h behandelt. Sämtliche Iduronsäurereste, die nicht entweder 2-Sulfat oder 3-Sulfat oder beides enthalten, und Galactosaminreste, die kein 4-Sulfat oder 6-Sulfat enthalten, wären darum gegenüber der Sulfatierung empfindlich; allerdings werden die empfindlichen Galactosaminreste viel schneller als die Iduronsäurereste sulfatiert, was der Reaktion einen hohen Selektivitätsgrad verleiht. Dieser Selektivitätsgrad gestattet die Herstellung besonders aktiver DDS-Antikoagulans-Formulierungen. Das hergestellte DDS kann ein Salz bilden. Bevorzugte Kationen für die Salzbildung sind aus der Gruppe ausgewählt, umfassend Barium-, Calcium-, Kupfer-, Lithium-, Natrium-, Kalium-, Zink- und Ammoniumionen, ausgewählt aus der Gruppe, die aus NR₁R₂R₃R₄ ⁺ besteht, wobei die R-Gruppen die gleichen oder verschiedene Niedrigalkylgruppen oder Wasserstoff sein können. Es ist bevorzugt, dass das Reaktionsgemisch durch Ladungsdichtefraktionierung gereinigt wird. DDS kann auch zum Einbau reaktiver Gruppen derivatisiert werden, um sein Binden an mit Blut wechselwirkende Vorrichtungen durch reduktive Aminierung zu ermöglichen. Bei einer Ausführungsform ist es bevorzugt, dass DDS mit einem Amin, vorzugsweise mit einem Amin, das Strahlungspfropfen auf mit Blut wechselwirkende Biomaterialien gestattet, komplexiert wird.
DDS kann durch elektrostatische Mittel zum "Kleben" an Biomaterialien gebracht werden. Quaternäre Ammoniumsalze können an adsorptive Oberflächen binden und können darum zum Überziehen von Biomaterialien, die mit Blut in Kontakt kommen, verwendet werden. Die positiven Aminreste von primären, sekundären und tertiären Aminen und quaternären Ammoniumverbindungen binden die negativen Sulfatreste von DDS elektrostatisch. Quaternäre Ammoniumsalze, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus NR₁R₂R₃R₄ ⁺ besteht, wobei zwischen einer und vier der R-Gruppen die, gleichen oder verschiedene Arylgruppen, Alkylgruppen sein können, mit der Maßgabe, dass mindestens eine Gruppe ein Alkyl mit mehr als 8 Kohlenstoffatomen oder Wasserstoff ist. Quaternäre Ammoniumsalze, wie Benzalkoniumchlorid ein Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid, wobei die Alkylgruppe von C8 bis C18 reicht, sind für diese Funktion bevorzugt. Alkylreste mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen besitzen ähnliche Bindungseigenschaften, ohne Rücksicht darauf, welche anderen Reste an die Amingruppe gebunden sind. Die Verminderung der Anzahl von Kohlenstoffen an den Alkylgruppen auf 12 ergibt eine wesentliche Abnahme im Grad der Tensid-Kunststoffoberflächen-Fixierung. Mit quaternären Ammoniumsalzen komplexierte DDS binden aufgrund ihrer sehr wirksamen oberflächenaktiven Eigenschaften physikalisch an adsorptive Oberflächen und können somit verwendet werden, um künstliche Materialien, die den Blutstrom kontaktieren, zu überziehen. Copolymere von Aminen und DDS können durch Gammastrahlen, ein aus der Technik bekanntes Verfahren der Strahlungspfropfung, ebenfalls irreversibel an Polymere gebunden werden.
Bei einer bevorzugten Synthese wird ein Reaktionsgemisch in Formamid gelöst, das im Handel erhältliches DS in einer Konzentration zwischen etwa 2,5 % bis 25 % (Gew./Vol.), allerdings vorzugsweise von etwa 7,5 (Gew./Vol.) enthält, und mit dem Trimethylaminschwefeltrioxidkomplex für mehr als 4, vorzugsweise mehr als 6 h inkubiert wird. Während die Reaktion bei etwa 10 °C und 30 °C, vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur gut abläuft, kann eine niedrigere Temperatur zur Verstärkung der Reaktionsselektivität bevorzugt sein. Der bevorzugte Bereich von Temperaturen kann im Bereich zwischen etwa –10 °C und 60 °C liegen. Die resultierende Zusammensetzung enthält modifizierte disulfatierte (und trisulfatierte) Disaccharide von Molekulargewichten im Bereich zwischen etwa 5.000 bis 35.000 Dalton mit einer mittleren Kettenlänge zwischen etwa 16 bis 100 Monosaccharid-Einheiten, wobei mindestens 75 % der Reste mehr als 2 Sulfatgruppen pro Disaccharid aufweisen, und einer HCII-vermittelten in vitro Antithrombinaktivität, je nach mittlerem Molekulargewicht, von etwa 25 bis 125 U/mg. In einer typischen Präparation wird die HCII-vermittelte Antithrombinaktivität der im Handel erhältlichen DS-Präparation, die für die Synthese verwendet wird (im Allgemeinen etwa <10 U/mg), mehr als zweifach, vorzugsweise mehr als 8-fach auf zwischen etwa 25 bis 125 U/mg, je nach Molekulargewicht, erhöht. Die Hemmung der Thrombinerzeugung und Komplementaktivierung durch die Präparation ist auf gravimetrischer Grundlage größer als diejenige des ursprünglichen nativen DS.
Die so synthetisierte Zusammensetzung DDS ist als allgemeines Antikoagulant für Blut geeignet und kann somit bei der Sammlung und Analyse von Blut in vitro als Überzug auf Biomaterialien, die Blut kontaktieren, oder therapeutisch, wobei die Hemmung der Thrombinerzeugung und/oder die Hemmung der Komplementaktivierung erwünscht ist, verwendet werden. DDS besitzt vorzugsweise eine Anti-IIa-Aktivität im Bereich von zwischen etwa 25 bis 125 U/mg, und mehr bevorzugt von größer als 75 U/mg.
Die antithrombotischen erfindungsgemäßen DDS-Zusammensetzungen sind bei therapeutischen Anwendungen zur Behandlung von Zuständen oder Krankheiten geeignet, die durch eine übermäßige Erzeugung von Thrombin- und Komplementaktivierung gekennzeichnet sind. Diese Zustände treten häufig auf, wo das Individuum einem Trauma ausgesetzt war, wie im Falle von Operationspatienten. Das durch Wunden oder Operation verursachte Trauma führt nicht nur zu einer Gefäßschädigung und sekundären glatten Muskelzellproliferation, die zu vaskulärer Restenose und Hyperplasie führt, sondern auch zur Aktivierung der Blutgerinnung.
Diese unerwünschten Ergebnisse können nach einer Gefäßtransplantation, traumatischer penetrierender Herzverletzung, postoperativer Reparatur von Muskelarterien, Langzeitverbleib von Arterienkathetern, invasiven arteriellen Diagnoseverfahren, Nieren-, Lungen- oder Lebertransplantaten und Bypassoperationsverfahren auftreten. Die Wirksamkeit von DDS zur Behandlung der oben aufgeführten Zustände kann unter Anwendung von Schweine- und/oder Kaninchenmodellen getestet werden.
Die Wirkungen von DS und Heparin auf Hyperplasie wurden beispielsweise folgendermaßen getestet: Kaninchen-Karotidarterien wurden durch Fluiddruck-Dilatation verletzt. Die Hälfte der Tiere wurde während zwei Stunden vor/nach der Verletzung mit 30 U/kg DS oder mit 150 U/kg Heparin behandelt. Vier Wochen später wurden die Tiere getötet und der Grad der verletzten Gefäßwand-Hyperplasie wurde unter Anwendung eines computergestützten Bildanalysators histologisch bestimmt. Die andere Hälfte der Tiere wurde zum Zeitpunkt der ersten Verletzung nicht behandelt, sie wurden allerdings genesen gelassen. Zwei Wochen später wurden diese Tiere anästhesiert und beide verletzten Karotidarterien (nun aufgrund von Hyperplasie okkludiert) wurden isoliert. Eine Karotid-Endarterektomie wurde an jedem okkludierten Gefäß unter Wiederherstellung des Blutflusses durchgeführt. Zum Zeitpunkt der zweiten Verletzung wurde jedes Tier mit DS oder Heparin, wie vorstehend beschrieben, behandelt und für weitere vier Wochen genesen gelassen. Diese Tiere wurden getötet und die Gefäßwand-Hyperplasie wurde bestimmt. DS dämpfte die Gefäßwand-Hyperplasie in beiden Verletzungsmodellen. Heparin besaß keine Wirkung.
Für alle diese Krankheiten und Zustände ist die Verabreichung von geeigneten Mengen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignet. Bevorzugte Verabreichungsweisen umfassen die in vivo Verabreichung durch parenterale Verabreichung, adventitiale Verabreichung, intraluminale Verabreichung an die Gefäßwand und Implantation der Zusammensetzung. Sie kann auch ex vivo angewandt werden. Die Verabreichung erfolgt über typische Wege und umfasst allgemein die systemische Verabreichung, wie durch Injektion. Besonders bevorzugt ist die intravenöse Injektion, da eine kontinuierliche Injektion über lange Zeiträume leicht fortgeführt werden kann. Ebenfalls bevorzugt ist das Einbringen in das Gefäßsystem über intraluminale Verabreichung oder durch adventitiale Verabreichung unter Verwendung osmotischer Pumpen. Typische Implantate enthalten biologisch abbaubare Materialien, wie Kollagen, Polyacetat und Polylactat/Polyglycosidgemische, die vorzugsweise als Pflaster oder Perlen formuliert sind.
Die typische Dosierung reicht von etwa 0,1 – 5 mg/kg/h auf konstanter Basis während eines Zeitraums zwischen etwa 5 bis 30 Tagen, vorzugsweise zwischen etwa 7 bis 14 Tagen. Die besonders bevorzugte Dosierung beträgt etwa 0,3 mg/kg/h, oder es können im Falle eines 70 kg schweren Erwachsenen auch andere konventionellere Verabreichungsweisen angewandt werden. Die subkutane oder intramuskuläre Injektion bei geringerer Dosis oder die orale Verabreichung bei einer etwas höheren Dosis als die intravenöse Injektion oder die transmembranöse oder transdermale oder eine andere topische Verabreichung für eine lokale Verletzung kann ebenfalls wirksam sein. Die lokale Verabreichung über eine kontinuierlich freisetzende Vorrichtung, wie eine Trägermatrix, vielleicht eingeschlossen in ein Gefäß-Transplantatmaterial ist besonders geeignet, wo die Stelle des Traumas zugänglich ist. Formulierungen, die für die zuvor genannten Verabreichungsweisen geeignet sind, sind aus der Technik bekannt, und ein geeignetes Kompendium von anderen Formulierungen wird bei Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, neuste Ausgabe, gefunden.
Die erfindungsgemäßen DDS-Zusammensetzungen können auch unter Anwendung herkömmlicher Verfahren, einschließlich von radioaktivem Markieren, Fluoreszenzmarkieren, Chromophore oder Enzyme, biologisch markiert werden. Die DDS-Zusammensetzungen können auch in einem kompetitiven Test auf die antithrombotische Menge in einer biologischen Probe verwendet werden. Antikörper, die mit DDS spezifisch immunreaktiv sind, können durch gut bekannte herkömmliche Verfahrensweisen hergestellt und zweckmäßigerweise als Markierungen für die obigen Tests eingesetzt werden.
BEISPIELE
Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf die folgenden erläuterten Beispiele der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besser verstanden werden. Die Beispiele sollen die Erfindung erläutern und den Umfang der Erfindung keinesfalls einschränken.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von Dermatandisulfat (DDS).
Unter konstantem Rühren wurden 67 g natives Dermatansulfat (Celsus Laboratories, Cincinnati, Ohio, Chargen Nr. D1-10494) mit einem mittleren Molekulargewicht von 36.000 Dalton und einer optischen Rotation von –62° einem Heparintest von 5 U/mg und einer HCII/Anti-IIa-Aktivität von 7 U/mg in 900 ml Formamid, das zuvor über 4-Å-Molekularsieben getrocknet wurde, solubilisiert. Anschließend wurden dem Reaktor 100 g (32 mmol) Trimethylaminschwefeltrioxid zugesetzt, der mit einem Calciumchloridtrockenrohr vor Feuchtigkeit geschützt war. Das Gemisch wurde 24 h bei 60 °C umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde in 1 l 95 % Ethanol übergeführt und 30 min vor Zugabe von 5 bis 10 l 1 % wässriger Natriumchloridlösung 30 min gehalten. Der pH-Wert wurde auf neutral eingestellt und die Lösung sterilisiert, entfärbt und gegen 5 Volumina 1 % wässriges Natriumchlorid (bis sämtliches freies Trimethylamin aus dem Reaktionsgemisch entfernt war) und anschließend mit 2 Volumina gereinigtem Wasser diafiltriert. Das Produkt wurde konzentriert und lyophilisiert und ergab 58 g DDS. Tabelle 1 zeigt die Eigenschaften des aus der Reaktion isolierten DDS. TABELLE 1 (Typische Eigenschaften von Dermatandisulfat)

mittleres MW 28.000

optische Rotation –41,3 °

Heparintest, U/mg 10

Stickstoff, % 1,80

Gesamtschwefel, % 8,24

Anti-IIa, U/mg 88
Anti-IIa-Aktivität – Die HCII-vermittelte Antithrombinaktivität von DDS wurde durch 180 s Inkubieren bei 37 °C von 80 μl einer Probenlösung, die 0,3 ml Probe (5,345 μg/ml) und 0,1 PEU gereinigten menschlichen Heparincofaktor II (verkauft von Celsus Laboratories, Cincinnati, Ohio, Katalog-Nr. 44405) enthielt, mit 20 μl gereinigtem menschlichen Thrombin (7,5 NIH-Einheiten/ml) bestimmt. Anschließend wurden 50 μl chromogenes Substrat (2,5 μmol/ml Ethyl-Malonyl-Pro-Arg-pNA, verkauft von Celsus Laboratories als Chromogenic THII, Cat.Nr. 01505) zugesetzt, und die amidolytische Thrombinaktivität wurde bei 405 nm gemessen. Die Messungen wurden an einem ACL 300 Plus (Instrumentation Laboratory, Lexington, MA) durchgeführt und als Vergleich zu dem USP-Heparinreferenzstandard K-3 (U.S. Pharmakopö-Konvention, Inc., Rockville MD) berechnet.
Mittleres Molekulargewicht – Das mittlere Molekulargewicht wurde durch Auflösen von Proben bis 0,8 % Gew./Vol. in 0,5 M Natriumchlorid bestimmt. Die Auslaufzeit in Sekunden wurde mit einem Ostwald-Kapillarviskosimeter in einem auf 25 °C äquilibrierten Wasserbad gemessen, und das Molekulargewicht wurde wie bereits beschrieben berechnet.
Stickstoff und Schwefel – Der Stickstoff- und Schwefelgehalt wurden durch Elementaranalyse (ASTM 5291 bzw. D4239) von Galbraith Laboratories (Knoxville, TN) bestimmt.
NMR-Analyse – Proben von DS und DDS wurden für H-NMR vor einer etwa 5 % (Gew./Vol.)-Verdünnung mit D₂O (Deuteriumoxid) ausgetauscht. Die H-NMR-Spektren wurden mit einer digitalen Auflösung von 0,24 Hz und bei 60 °C aufgezeichnet, um zu verhindern, dass das HOD-Signal die breiten Signale von δ 4,64 bis 4,74 überlappt. Die Spektren von DS und DDS sind in den 2 bzw. 3 gezeigt. Obwohl im Allgemeinen ähnlich, unterscheiden sich die beiden Spektren bei 4,1 und stellen für DDS einen erhöhten Gehalt von 4,6-O-disulfatiertem-N-acetyl-D-galactosamin dar. 2 zeigt, dass DS ein typisches natives DS ist, das nur Iduronsäurereste enthält und anscheinend vollständig 4-O-sulfatiert ist. 3 zeigt, dass DDS ebenfalls vollständig 4-O-sulfatiert ist (δ 4,9), allerdings auch fast vollständig 6-O-sulfatiert ist (δ 4,1) und eine kleine Menge 2-O-sulfatierte Iduronsäure (δ 5,25) und eine Spur 2,3-di-O-sulfatierte Iduronsäure (δ 5,48) enthält.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel zeigt die in vitro Antithrombin III- und HCII-vermittelte Hemmung der Thrombinerzeugung in Gegenwart von DDS oder Heparin.
Blut wurde aus menschlichen gesunden Freiwilligen gesammelt und in getrennte Röhrchen, die jeweils 25 Anti-IIa U/ml DDS oder Heparin enthielten, abgegeben. Die in vitro Thrombinerzeugung war für beide Verbindungen ungefähr die gleiche. Allerdings war die Mehrheit der Anti-IIa-Aktivität von DDS mit HCII verknüpft, während die Mehrheit der Anti-IIa-Aktivität von Heparin mit ATIII zusammenhing. Siehe Tabelle 2.
TABELLE 2 (erzeugtes Thrombin in pmol)
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel zeigt die Komplement-inhibitorische in vitro Aktivität von DDS. Heparin, DS und DDS wurden auf ihre Fähigkeit zur Regulierung des klassischen Komplementweges, wie bereits beschrieben, getestet und wurden in verschiedenen Konzentrationen von 0,15 bis 40 μg in 100 μl halbisotonischer Veronal-gepufferter Salzlösung, pH 7,5, enthaltend 0,1 Gelatine, 0,15 M Calcium, 0,5 mM Magnesium und 2,5 % Dextrose (DGVB⁺⁺), hergestellt und in Röhrchen auf Eis gegeben. Anschließend wurde Meerschweinchen C2 (C2gp) vortitriert, um einen Durchschnitt von 1 hämolytischem Ereignis pro Zelle (Z/Lyse) zu erzeugen, zu jedem Röhrchen in 100 μl DGVB++ zugesetzt. Zuletzt wurden jedem Röhrchen 1 × 10⁷ Schaf-Erythrocyten, die Oberflächen-C1 und -C4 (EAC1,4b) enthielten, in 100 μl DGVB++ zugesetzt, und die Röhrchen wurden sofort in einem geschüttelten Wasserbad bei 30 °C, 10 min (tmax) inkubiert. Sodann wurden jedem Röhrchen 0,3 ml Meerschweinchenkonzentrat (GPC), verdünnt in Gelatine-Veronal-gepufferter Salzlösung, die 40 mM Ethylendiamin enthielt, als Quelle der terminalen Komplementwegkomponenten zugesetzt, und die Inkubation wurde 60 min lang bei 37 °C fortgesetzt. Schließlich wurden jedem Röhrchen 1,5 ml Salzlösung zugesetzt (mit der Ausnahme der 100-%-Lyseröhrchen, die Wasser erhielten), die Röhrchen wurden geschüttelt und zentrifugiert, und die Lyse wurde durch Bestimmung der Hämoglobinfreisetzung bei 414 nm bewertet. Die Röhrchen, die kein GAG oder keine GAG-Derivate enthielten, wurden als nicht-inhibierte Kontrolle bezeichnet und waren so beschaffen, dass sie etwa 1 hämolytisches Ereignis pro Zelle (1Z der Lyse) aufwiesen. Die Reagens-Blindprobe und die 100-%-Lyseröhrchen erhielten weder GAGs noch C2. Die Hemmung wurde auf der Basis der Lyse der Zellintermediate (Z) in der Testprobe im Vergleich mit den nicht gehemmten Kontrollröhrchen berechnet.
Unter Bezugnahme auf 4 ist nun ein Vergleich von vier verschiedenen Arten von Antikoagulantien gezeigt. Es kann gesehen werden, dass DDS im Wesentlichen die gleiche inhibitorische Aktivität wie Heparin, allerdings beträchtlich mehr Aktivität als DS aufweist.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von DDS im Vergleich zu Heparin und DS bei einem CPB-Vorgang in einem erwachsenen Schwein.
Erwachsene Yorkshire-Schweine (60–70 kg) wurden mit Ketamin anästhesiert, intubiert und beatmet (Tidenvolumen 15 mg/kg, Rate 12–16 pro min). Die Angemessenheit der Ventilation wurde kontinuierlich durch Messen von pH-, pCO₃- und pCO₂-Spiegel in Blutproben, die während des Experiments nacheinander gesammelt wurden, aufgezeichnet. Die Anästhesie wurde mit Ethrane (Anaquest, Mississauga, Ontario) und intravenösem Somnotol (MTC Pharmaceutical Cambridge, Ontario) aufrechterhalten. Die Paralyse, wenn notwendig, wurde mit intravenösem Pancuronium (Abbott STD, Abbott Laboratories, Saint Laurent, Quebec) aufrechterhalten. Die bilateralen Femoralarterien- und Venenleitungen wurden zur Überwachung des Blutdrucks inseriert, um zusätzliche Blutproben zu sammeln und um Fluide und die Testverbindung zu verabreichen.
Der CPB-Kreislauf bestand aus Polyethylenschlauch und Kanülen (Baxter Health Care, Bentley Division, Irvine, CA), einem Membran-Oxygenator mit Venenreservoir (Cobe CML, Cobe Canada Ltd., Scarborough, Canada) und einem arteriellen Inlinefilter (Pall Stat Prime Blood filter, Pall Biomedical Inc., Figuerido, Puerto Rico). Der Kreislauf wurde mit Ringers Lactat initialisiert. Der Blutfluss wurde unter Verwendung einer Sarns-Walzenpumpe (Modell-Nr. 5000, Sarns Inc. Ann Arbor, Michigan) reguliert, und die Körpertemperatur wurde unter Verwendung eines Sarns 3M HeaterCooler (Modell-Nr. 48103) aufgezeichnet.
Die Schweine wurden anästhesiert und wie vorstehend beschrieben, präpariert. Ihre Brustkästen wurden über eine mediane Sternotomie geöffnet. Anschließend wurde den Schweinen entweder eine Bolusdosis (400 U/kg) Heparin oder DDS verabreicht, das entweder als Bolus oder als Bolus plus Infusion gegeben wurde. Die Verbindung wurde auch der Pumpeninitialisierung in einer der erwartenden Plasmakonzentration entsprechenden Konzentration zugesetzt, um jeden mit dem Start von CPB zusammenhängenden Plasma-Verdünnungseffekt zu vermeiden. Als nächstes wurden die aortale und atriale Kanüle an Ort und Stelle befestigt, und der CPB wurde gestartet.
Die gerinnungshemmenden Aktivitäten, der arterielle Widerstand, die Kreislauf-Okklusion und der Blutverlust wurden wie folgt bewertet: Gerinnungshemmende Aktivitäten – Die gerinnungshemmende Aktivität wurde gemessen als i) Verlängerung der aktivierten Gerinnungsdauer (ACT) und ii) Antithrombin und Antifaktor-Xa-Aktivitäten (U/ml) in Blutproben, die unmittelbar vor der Injektion der Verbindung gesammelt wurden, und in Blutproben, die während und bis zu 120 min post-CPB nacheinander gesammelt wurden. Die ACT wurde in einem Hämocron R-400 (International Technidyne Corp., New Jersey) gemessen. Die Antithrombin- und Antifaktor-Xa-Aktivitäten wurden unter Verwendung von chromogenen Standardtests gemessen.
Blutverlust – Der gesamte Blutverlust an der operativen Eingriffsstelle in die Thoraxhöhle vor und nach der Kanülen-Entfernung wurde gesammelt und sein Volumen gemessen. Sämtliche Schwämme, die zum Packen des Brustraumes post-CPB verwendet wurden, wurden in 1 l Wasser gegeben, um die roten Blutzellen zu lysieren. Anschließend wurde die Menge an Blut durch Messen der Menge des in dem Wasser vorhandenen Hämoglobins spektralphotometrisch bestimmt. Der gesamte Blutverlust wurde als Summe dieser beiden Messungen berechnet.
Bewertung der Thrombusbildung – Am Ende des CPB und nach der Kanülen-Entfernung wurde der CPB-Kreislauf von Blut abgetropft, und sämtliche Komponenten wurden auf sichtbare Thrombi- und Fibrinstränge untersucht.
Thrombin/ATIII (TAT)-Komplexe – Thrombin ist ein Schlüsselenzym bei der Pathogenese der Thrombose und wird gebildet, wenn Prothrombinase Prothrombin in Thrombin- und Prothrombinfragmente spaltet. Nach der Bildung im Plasma wird Thrombin durch eine natürlich vorkommende Antiproteinnase, ATIII, unter Bildung eines Komplexes von Thrombin/ATIII (TAT) gehemmt (Teitel, J.M., Bauer, K.A., Lau, H.K., Rosenberg, R.D., Studies of the prothrombin activation pathway utilizing radioimmunoassay for the F2/F1+2-fragment and thrombin-antithrombincomplex, Blood 59: 1086–97 (1990)). Es wurde gezeigt, dass die präoperativen TAT-Spiegel mit dem Risiko der Entwicklung von DVT nach einer größeren Operation korrelieren. Für die Tests wurde Blut in ein Vacutainer-Rohr (Becton Dickinson-Nr. 6416); Becton Dickinson, Mountain View CA), das 0,105 gepuffertes Citrat enthielt, aufgezogen. Das Plasma wurde durch Zentrifugation bei 1700 × g für 15 min bei 22 °C sofort von den Zellelementen abgetrennt und bis zur Durchführung der Chargen-Tests bei –70 °C in Aliquoten eingefroren. Die TAT-Spiegel wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen ELISA-Kits (Behringwerke, Marburg, Deutschland) gemessen.
Thrombin/Heparin Cofaktor II-Komplexe (T/H/CII) – Der Heparin Cofaktor II (HCII) ist ein zweiter endogener Inhibitor von Thrombin im menschlichen Plasma. Die DS/HCII-abhängige Hemmung von Thrombin unterdrückt die Thrombusbildung, das Thrombuswachstum und die Hyperplasie in Kaninchen wirksamer als Heparin/ATIII. Studien haben nahe gelegt, dass HCII ein wirksamerer Inhibitor von Thrombin ist, das im Extravaskulärraum kompartimentalisiert oder an die Oberfläche einer verletzten Gefäßwand, eines gebildeten Thrombus oder an eine künstliche Oberfläche gebunden ist (VanRyn-McKenna J., Ofosu F.A., Gary E., Hirsh J., Buchanan M.R. Effects of dermatan sulfate and heparin on inhibition of thrombus growth in vivo, Ann NY Acad Sci; 556: 304 (1989)); (Ofosu F.A., Fernandez F., Gauthier D., Buchanan M.R. Heparin Cofactor II and other endogenous factors in the mediation of the antithrombotic and anticoagulant effects of heparin and dermatan sulfate. Semin Throm Haemost; 11: 133 (1985)); (Okwusidi J.I., Anvari N., Kulczycky M., Blajchman M.A., Buchanan M.R. Fibrin moderates the catalytic action of heparin but not that of dermatan sulphate on thrombin inhibition in human plasma. J Lab Clin Med; 117: 359 (1991)). Für die Tests wurde das Blut auf die TAT-Spiegel untersucht.
Bezogen auf die spezifische (ATIII- + HCII-vermittelte) Anti-Thrombinaktivität von 10 Einheiten wurde ein 0,8 mg/kg Bolus von DDS (Charge-Nr. OD-00195, Celsus Laboratories, Cincinnati, Ohio) an erwachsene Schweine (67 – 70 kg) und anschließend 2,4 mg/kg/h-Infusionen von DDS während CPB für 90 min verabreicht, wobei somit insgesamt 4,4 mg/kg DDS verabreicht wurden (dies ist mit einer typischen Dosis von 2,67 mg/kg Heparin mit einer Aktivität von 150 U/mg vergleichbar). Der CPB wurde trotz einer mäßigen Verlängerung der aktivierten Gerinnungsdauer (ACT) auf 270 s während CPB erfolgreich durchgeführt. Diese ACT war mit minimalen Antithrombinspiegeln und nicht nachweisbaren Anti-Faktor-Xa-Spiegeln verbunden. Wichtiger kehrte die ACT schnell auf die Grundlinienmessungen zurück, wenn die Infusion angehalten wurde (siehe 4). Die Masse des während CPB erzeugten Thrombins wurde durch HCII gehemmt, wie durch die erhöhten Spiegel von Thrombin/HCII (T/HCII)-Komplexen in 6 gezeigt. Dies steht im deutlichen Gegensatz zu dem klinisch und experimentell mit Heparin Festgestellten, wenn die ACTs um mehr als 700 s verlängert sind und die TAT-Spiegel für mindestens 24 h erhöht bleiben, während beim Absetzen von DDS sowohl die TAT- als auch T/HCII-Spiegel auf die Grundlinie zurückkehrten. Dieser Abfall in den TAT- und T/HCII-Spiegeln post-CPB legt nahe, dass DDS/HCII-Thrombin wirksamer als Heparin/ATIII hemmt.

Vergleichsbeispiele – Insgesamt 12 Tieren wurden ein CPB angelegt, und ihnen wurden vor CPB-Beginn 1 bis 3 Behandlungen verabreicht.

Serie 1	DDS 25
n=4	Dermatindisulfat 25 U/kg Bolus, (2,5 mg/gk) (Celsus Laboratories, Cincinnati, Ohio, Chargen-Nr. OD-00195)
Serie 2	HEP 25
n=4	Heparin 25 U/kg Bolus (17 mg/kg) (Organon, Canada, Ltd., Toronto, Canada)
Serie 3	HEP 400
n=4	Heparin 400 U/kg Bolus (2,7 mg/kg) (Organon, Canada, Ltd., Toronto, Canada) (Dies ist die bei CPB, bei Menschen verwendete Standarddosis.)

CPB war sowohl in den mit hochdosiertem Heparin behandelten Tieren als auch in den mit DDS behandelten Tieren erfolgreich; es waren nämlich während CPB keine makroskopischen Gerinnsel in den Kreisläufen zu sehen, das Blut verblieb post-CPB fluide, und die Tiere litten an keinen ungünstigen Wirkungen. Dies steht im deutlichen Gegensatz zu CPB in den mit niedrig dosiertem Heparin behandelten Tieren, in denen während CPB Gerinnsel sichtbar waren, das Blut in dem Kreislauf gerann, wenn die Flüsse beim Ablösen des CPB herabgesetzt wurden, wodurch eine Rückkehr des CPB, falls notwendig, unmöglich gemacht wurde. Diese Notwendigkeit tritt etwa in 30 % der Fälle klinisch ein. Ferner ist das geronnene Blut für den Patienten verloren, wodurch sich das Risiko des post-operativen Blutens und die Verwendung von homologen Blutprodukten erhöhen. Der Blutverlust war in DD25- oder HEP25-Tieren im Vergleich zu HEP400-behandelten Schweinen geringer. Siehe Tabelle 3.
TABELLE 3 (Brustkorbwandblutung, ml/2h)
In den DDS-behandelten Tieren überstieg die ACT während CPB 270 s nicht und kehrte innerhalb der zweistündigen Überwachungsdauer (5) in den DDS behandelten Tieren auf normal zurück. Diese ACT hing mit einer minimalen zirkulierenden Antithrombinaktivität zusammen (7). Die TAT- und T/HCII-Spiegel erhöhten sich während der Dauer des CPB nicht (8). In den HEP25-behandelten Tieren waren die Ergebnisse ähnlich. Die ACT überstieg während CPB 260 s nicht (5), und wiederum hing sie mit der minimalen zirkulierenden Antithrombinaktivität zusammen (7). In HEP400 (menschliche klinische Standarddosis)-behandelten Tieren war die ACT deutlich über die Basislinie erhöht, wie in der klinischen Situation gesehen. Dies hing mit einer nennenswerten Antithrombinaktivität zusammen (7). Die TAT- und T/HCII-Spiegel erhöhten sich während CPB, waren allerdings sowohl in DDS25- als auch HEP25-behandelten Tieren geringer (8).
Diese Daten legen nahe, dass 1) DDS/HCII Thrombin wirksamer hemmt als Heparin/ATIII; da mit DDS ein erfolgreicher CPB bei einer geringeren systemischen gerinnungshemmenden Dosis erreicht wird und die Thrombinerzeugung post-CPB mit DDS verbessert war, wohingegen dies mit Heparin nicht der Fall war; und 2) diese Wirkung mit einer geringeren gerinnungshemmenden Dosis erreicht werden kann, wodurch das Blutungsrisiko vermindert wird.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel zeigt wie andere Salzformen von DDS gebildet werden.
Wie es der Fachwelt bekannt ist, bestimmt die Salzform die Affinität für bestimmte ionisierte Elektrolyten im Blut, die bei der Bestimmung der Blutgas-Bestandteile kritisch sein können. Das Natriumsalz der DDS-Zusammensetzung von Beispiel 1 wird mit dem Chlorid eines unterschiedlichen Kations zur Herstellung von anderen Salzformen oder Mischungen von verschiedenen Salzen umgesetzt. Ein solcher Ionenaustausch mit der DDS-Zusammensetzung kann durch Überleiten über ein zuvor geladenes Kationenaustauscherharz, Aufschlämmen mit einer Chloridlösung und anschließendes Lösungsmittel-Ausfällen oder Diafiltration gegen eine wässrige Lösung, die ein unterschiedliches Chlorid enthält, erreicht werden.
Alternativ wird die erfindungsgemäße DDS-Zusammensetzung, die im Allgemeinen in einer Natriumform vorliegt, als Ergebnis der Neutralisation mit verdünntem kaustischem Soda während der Herstellung mit gereinigtem Wasser auf eine Konzentration zwischen etwa 1 und 15 %, vorzugsweise etwa 7 % verdünnt und der Diafiltration über eine Membran mit einem Molekulargewichtsausschluss von 1000 Dalton (PCAC of Millipore Corporation, Bedford MA) in einem geeigneten Gerät (Pellican, Millipore Corporation, Bedford, MA) unterzogen. Die Konzentration an DDS wird durch kontinuierliche Zugabe von etwa 0,5 – 2,0 M Calciumchlorid (eingestellt mit Calciumhydroxid auf pH 7,4) konstant gehalten. Jeder Überschuss an Calciumchlorid wird durch Diafiltration durch kontinuierliche Zugabe von gereinigtem Wasser entfernt, und das Calciumsalz von DDS wird durch Lyophilisation gewonnen. Eine typische Ausbeute bei der Umwandlung ist größer als 90 %, mit mehr als 9,5 % Calcium und einem Natriumgehalt von weniger als 1000 ppm, wie durch Flammenphotometrie bestimmt.
Der gleiche Weg wird bei der Herstellung von anderen Salzen, einschließlich der Ammonium-, Barium-, Kupfer-, Lithium-, Kalium- und Zinksalze, verwendet.
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines Fragments von Dermatansulfat (DS).
Oxidative-reduktive Depolymerisation von Dermatansulfat – 50 g natives DS (Celsus Laboratories, Cincinnati, Ohio Charge Nr. DI-10394) mit einem mittleren Molekulargewicht von 35.000 Dalton, einem Schwefel- und einem Stickstoffgehalt von 2,0 bzw. 6,59 % und einem Heparintest von 4 U/mg wurde mit gereinigtem Wasser auf eine Konzentration von 10 % (Gew./Vol.) verdünnt. Unter Rühren wurde Duolite C-20 (Rohm & Hass, Philadelphia, PA), das zuvor mit Chlorwasserstoffsäure regeneriert wurde, zur Herabsetzung des pH-Wertes auf 2,5 zugesetzt, wonach das Harz durch Filtration über einen Büchnertrichter entfernt wurde. Die DS-Lösung wurde dann unter Rühren auf 75 °C vorgeheizt, und 10 ml 35 % Wasserstoffperoxid wurden zugesetzt, anschließend wurde 15 min bei 159 kPa (23 psi)-Druck sterilisiert. Nach Abschluss des Zyklus wurde die Lösung aus dem Sterilisator genommen, auf unter 40 °C abgekühlt und der pH mit kaustischem Soda auf 6,5 – 7,0 eingestellt. 1 Volumen Ethanol wurde zur Ausfällung von DS zugesetzt. Der Niederschlag wurde durch Trocknen in vacuo entfernt. Das depolymerisierte DS hatte die folgenden Eigenschaften: TABELLE 4 (Typische Eigenschaften eines Fragments von DS)

Gewinnung, g 40

mittleres Molekulargewicht 5,600

Test, U/mg <2

Stickstoff, % 2,42

Gesamtschwefel, % 6,49
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines Fragments von Dermatandisulfat (DDS).
DDS kann an seinen Uronsäure-Carboxylgruppen verestert und durch kontrollierte Eliminierung unter alkalischen Bedingungen unter Anwendung dem Fachmann bekannten Vorgehensweisen gespalten werden. Bei diesem Verfahren wird DDS durch Kontakt mit einem hydrophoben quaternären Ammoniumsalz, wie Hyamine 1622, in eine organische Lösungsmittellösliche Form übergeführt. Eine Lösung des Hyaminesalzes von DDS in einem Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Benzyl (oder einem zweckmäßig substituierten Benzyl)-chlorid wird zugesetzt, und die Substanzen werden 3 Tage bei Umgebungstemperatur in Kontakt belassen.
Anschließend wird ein gleiches Volumen einer 10%igen Natriumacetatlösung in Methanol zugesetzt, und der gebildete Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, mit Methanol gewaschen und unter Erhalt des Natriumsalzes des DDS-Esters in vacuo getrocknet. Das Produkt wird durch die UV-Absorption der Benzylgruppe bei etwa 200 nm charakterisiert. Der Benzylester wird sodann unter Bedingungen, die der Fachwelt gut bekannt sind, der alkalischen Eliminierung unterzogen.
Alternativ wird DDS in 0,15 M Acetat – 0,15 M NaCl – 0,005 M CaCl – pH 6,9 gelöst. Nach Zugabe von Polysaccharidlyase wird das Gemisch bei Umgebungstemperatur inkubiert, bis die mittlere Molekülmasse des Disulfats auf etwa 5000 Dalton reduziert ist. Die Depolymerisation wird durch Erhöhung der UV-Absorption bei 232 nm (aufgrund der Erzeugung einer Doppelbindung am nicht reduzierenden Ende des Saccharids) und durch Messen der mittleren Molekülmasse des Polymergemisches durch Viskosimetrie aufgezeichnet.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von Dermatansulfat (DS)- und Dermatandisulfat (DDS)-Fraktionen.
Natives Dermatansulfat (DS) kann fraktioniert und anschließend sulfatiert werden. Die aus der Fachwelt bekannten Fraktionierungstechniken, die auf DS und andere strukturell verwandte Glycosaminoglycane angewandt werden (Lindhardt, R.J., Desai, U.R., Liu, J., Pervin A., Hoppensteadt D., Fareed J., Low Molecular Weight Dermatan Sulfate As An Antithrombotic Agent, Biochem Pharmacol 49: 1241:1252 (1994)), umfassen Lösungsmittelfraktionierung, Ultrafiltration und Ionenaustausch, Affinitäts- und Gelchromatographie.
Ladungsdichtefraktionierung von DS – Eine 7,5'' × 50''-Säule, die Anionenaustauscherharz (Lewatit S-6238-A, Bayer, Pittsburgh PA) enthielt, wurde mit Chlorwasserstoffsäure regeneriert, mit gereinigtem Wasser, USP, sorgfältig gespült und mit 29 l 0,5 M NaCl äquilibriert. Anschließend wurden 400 g DS (Chargen-Nr. DI-10094, gelöst in 19 l 0,5 M NaCl) bei einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/min auf die Säule aufgegeben. Anschließend wurde die Säule mit zusätzlichen 12 l 0,5 M NaCl gewaschen. Anschließend wurden 28 l DF-104-1 bei 200 ml/min gesammelt, gegen gereinigtes Wasser, USP, bis zu einer Leitfähigkeit von weniger als 200 S diafiltriert, durch einen qualitativen Molischtest (Dische Z. General color reactions. Mtds Carbohydr Chem 1963;I: 478–81) auf Kohlehydrate identifiziert, durch Ultrafiltration konzentriert und gefriergetrocknet. Andere Untertraktionen wurden auf ähnliche Weise durch Aufgeben von 28-ml-Inkrementen von 1,2, 1,6 und 2,0 molalem NaCl auf die Säule zum Sammeln der Fraktionen DF-104-2 bis DF-104-4 eluiert. Siehe Tabelle 5.
TABELLE 5 (Fraktionen von nativem Dermatansulfat, erhalten durch Ladungsdichtefraktionierung)
Ladungsdichtefraktionierung von DDS – 5 g OD-00195 wurden in 750 ml 0,5 M NaCl gelöst und auf eine 4,4 × 43 cm Säule, äquilibriert mit 0,5 M NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml/h aufgegeben. Die Säule wurde mit einem Säulenvolumen von 0,5 M NaCl gewaschen. Der Durchbruch vereinigt mit den 1,4-M- und 1,6-M-Eluaten wurde als 001951 gesammelt. Ein 2-M-NaCl-Eluat wurde als 001952 gesammelt. Nach Stoppen der Säule wurde ein zweites 2-M-Eluat als 001953 gesammelt. Das Haupteluat mit 2,5 M NaCl wurde als 001954 gesammelt. Nach Anhalten der Säule über Nacht wurde ein zweites 2,5-M-NaCl-Eluat als 001955 gesammelt. Nach Anhalten über Nacht wurde die Säule sodann gewaschen. Die Elution mit 3 M NaCl vermochte kein zusätzliches Material zu eluieren. Die in Tabelle 5 gezeigten Daten legen nahe, dass die Ladungsdichte ein wirksames Verfahren der Optimierung der Anti-IIa-Aktivität von DDS ist.
TABELLE 6 (Fraktionen von DDS, erhalten durch Ladungsdichtefraktionierung)
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines auf Dermatandisulfat basierenden thrombusresistenten Überzugs.
DDS in Wasser wird mit einem stöchiometrischen Überschuss einer wässrigen Lösung eines hydrophoben quaternären Ammoniumsalzes, wie Benzalkoniumchlorid, Tridodeceylmethylammoniumchlorid oder eines anderen dem Fachmann bekannten Salzes vermischt. Das resultierende quaternäre Ammoniumsalz von DDS wird durch Vakuumfiltration gesammelt, ausgiebig mit Wasser gewaschen und in vacuo getrocknet. Dieses Salz, das in Wasser oder verdünnter Salzlösung unlöslich ist, wird in Ethanol, Isopropanol oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst und zum Überziehen künstlicher Oberflächen verwendet, die mit dem Blutstrom in Kontakt kommen können.
BEISPIEL 10
Dieses Beispiel zeigt das kovalent immobilisierte Dermatandisulfat.
Copolymere von Aminen und DDS können durch Gammabestrahlung, ein aus der Technik bekanntes Verfahren der Strahlungspfropfung, irreversibel an Polymere angeknüpft werden.
Alternativ wird DDS in wässriger Lösung bei pH 3 und 4 °C mit einer stöchiometrisch begrenzten Menge von Natriummetaperiodat 24 h reagieren gelassen. Während dieses Zeitraums wird eine kleine Portion der unsulfatierten Uronsäurereste in DDS mit Periodat gespalten, und die neu gebildeten Aldehydgruppen werden nachgewiesen und durch den MBTH-Test quantifiziert (Sawicki, E., T.R., Stanely, T.W. und Elbert, W. Anal. Chem. 33, 93–96 (1961)). Das gespaltene DDS-Derivat wird durch Ausfällen mit 3 Volumina 95 % Ethanol, Abdekantieren und Auflösen in 1 M Natriumchlorid gewonnen. Anschließend wird das Derivat durch Widerausfällen mit 3 Volumina 95 % Ethanol gereinigt, durch Abdekantieren oder Filtrieren gesammelt, nacheinander mit 95 % Ethanol und Aceton durch Verreiben mit dem Lösungsmittel dehydratisiert, und der Feststoff wird durch Dekantieren oder Filtrieren gesammelt. Die eingeschlossenen Lösungsmittel werden in vacuo entfernt, um einen weißen Feststoff zu ergeben. Das aktivierte DDS-Derivat kann nun kovalent durch eine Schiff-Basenbildung und Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid unter Anwendung von der Fachwelt hinreichend bekannten Bedingungen kovalent an Amin-tragenden Materialien immobilisiert werden.
Obwohl die Erfindung hauptsächlich bezüglich spezifischer Beispiele und Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist es offensichtlich, dass die vorhergehende Beschreibung der Fachwelt viele alternativen Modifikationen und Variationen nahe legt.

Claims

Zusammensetzung, umfassend Dermatansulfat mit mehr als 75 % sich wiederholenden Einheiten von L-Iduronsäure->4,6-di-O-sulfatiertem N-Acetyl-D-galactosamindisaccharid.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Dermatansulfat ein kationisches Gegenion aufweist und wobei das kationische Gegenion Natrium ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Dermatansulfat ein kationisches Gegenion aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ammonium, Barium, Calcium, Kupfer, Eisen, Lithium, Kalium und Zink.
Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das die chemische Sulfatierung von nativem Dermatansulfat umfasst.
Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das die vollständige chemische Synthese umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das native Dermatansulfat aus natürlichen Quellen isoliert wird, die anschließend gereinigt werden.
Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das das Reinigen über Ladungsdichtefraktionierung einer heterogenen Dermatansulfat-Präparation umfasst.
Verwendung eines Dermatansulfats mit mehr als 75 % sich wiederholenden Einheiten von L-Iduronsäure->4,6-di-O-sulfatiertem N-Acetyl-D-galactosamindisaccharid bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Thrombinerzeugung.
Verwendung eines Dermatansulfats mit mehr als 75 % sich wiederholenden Einheiten von L-Iduronsäure->4,6-di-O-sulfatiertem N-Acetyl-D-galactosamindisaccharid bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Komplementaktivierung.
Verwendung eines Dermatansulfats mit mehr als 75 % sich wiederholenden Einheiten von L-Iduronsäure->4,6-di-O-sulfatiertem N-Acetyl-D-galactosamindisaccharid bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Intimahyperplasie.