DE69718023T2

DE69718023T2 - Amid und retinol oder retinyl-ester enthaltende hautpflegemittel

Info

Publication number: DE69718023T2
Application number: DE69718023T
Authority: DE
Inventors: Paton Granger; Vincent Rawlings; Richard Scott
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2003-05-15
Anticipated expiration: 2017-09-19
Also published as: ZA978653B; CN1093757C; KR100320137B1; BR9711421A; CZ289857B6; JP3667772B2; DE69718023D1; JP2000503029A; AU714982B2; ES2188903T3; IN189577B; PL332544A1; AR009099A1; EP0929288A1; WO1998013018A1; KR20000048697A; TW491706B; BR9711421B1; RU2177780C2; CN1237898A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Hautpflege-Zusammensetzungen, die Fettsäureamid und Retinol oder Retinylester enthalten und Verfahren, die das Auftragen solcher Zusammensetzungen auf die Haut einbeziehen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Retinol (Vitamin A) ist eine endogene Verbindung, die natürlich im menschlichen Körper vorkommt und für normale epitheliale Zelldifferentiation wesentlich ist. Natürliche und synthetische Vitamin-A-Derivate wurden ausgiebig bei der Behandlung einer Vielzahl von Hautstörungen verwendet und wurden als Hautreparier- und -erneuerungsmittel verwendet. Retinsäure wurde angewendet, um eine Vielzahl von Hautzuständen zu behandeln, beispielsweise Akne, Falten, Psoriasis, Altersflecken und Verfärbung. Siehe beispielsweise Vahlquist, A. et al., J. Invest. Dermatol., Band 94, Holland D. B. und Cunliffe, W. J. (1990), Seiten 496-498; Ellis, C. N. et al., "Pharmacology of Retinols in Skin", Vasel, Karger, Band 3 (1989), Seiten 249-252; Lowe, N. J. et al., "Pharmacology of Retinols in Skin", Band 3 (1989), Seiten 240-248; PCT Patent Anmeldung Nr. WO 93/19743.
Es wird angenommen, dass die Verwendung von Retinol oder Estern von Retinol gegenüber Retinsäure bevorzugt sein würde. Retinol kommt natürlich im menschlichen Körper vor und wird als viel sicherer als Retinsäure angesehen. Ester von Retinol hydrolysieren in vivo, um Retinol zu erzeugen. Es wird angenommen, dass Retinolester und Retinol gemäß dem nachstehenden Mechanismus metabolisch auf der Haut zu Retinsäure umgewandelt werden:
Das Meiste des endogen aufgetragenen Retinols wird allerdings schnell in inaktive Fettsäureester zur Lagerung in epidermalen Zellen (Keratinozyten) umgewandelt. Die Veresterung von Retinol in inaktive Retinylester wird in Zellen durch die Übertragung einer Fettacylgruppe von Acyl-CoA, katalysiert durch die Enzym-Acyl-CoA-Retinoltransferase (ARAT) oder durch die Übertragung einer Acylgruppe aus Phosphatidylcholin, katalysiert durch das Enzym Lecithin-Retinol-Acyltransferase (LRAT), erreicht. Diese Veresterungsreaktionen sind bei Keratinozyten sehr wirksam. Die Mehrheit (95%) von zellulären Retinoiden liegt in Form von Retinylfettsäureestern vor. Somit sind leider, obwohl Retinol und Retinylester zur Anwendung sicherer als Retinsäure sind, diese beim Bereitstellen von Hautvorteilen weniger wirksam als Retinsäure.
Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf dem Auffinden, dass bestimmte N-substituierte Fettsäureamide diese Veresterungsreaktionen inhibieren und somit die Wirkung von Retinol durch Erhöhen der Menge von zur Umwandlung zu Retinsäure verfügbarem Retinol fördern. Somit ist ein Gemisch von diesen N-substituierten Fettsäureamiden mit Retinol oder Retinylestern, was Retinsäure nachahmt, beim Verwenden noch sicherer als Retinsäure. Eine frühere eingereichte Europäische Patent-Anmeldung EP 0 742 005 (Unilever; Prioritätsdatum 8. Mai 1995), veröffentlicht am 13. November 1996 (nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung), offenbart Kombinationen von Fettsäureamiden mit Retinol oder Retinylestern. EP '005 lehrt jedoch nicht speziell N-substituierte Fettsäureamide der vorliegenden Erfindung oder beliebiges Fettsäureamid mit einer verzweigten, Alkoxy-enthaltenden Substitution am Stickstoffatom.

KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung schließt zum Teil eine Haut-konditionierende Zusammensetzung ein, enthaltend:
(a) 0,001% bis 10% von Retinol oder Retinylester;
(b) 0,0001% bis 50% eines N-substituierten Fettsäureamids der Formel I:
worin R&sub1; = Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen;
R&sub2; = Alkyl oder Alkenyl mit 8 bis 25 Kohlenstoffatomen;
R&sub3; = Alkyl, enthaltend 1 bis 5 Kohlenstoffatome, oder ein Phosphatester; und
(c) einen kosmetisch verträglichen Träger.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein kosmetisches Verfahren zum Konditionieren von Haut, umfassend örtliches Auftragen der vorliegenden Zusammensetzung auf die Haut, bereit. Sie stellt weiterhin ein kosmetisches Verfahren bereit, das die Wirkung von Retinsäure auf der Haut, umfassend örtliches Auftragen der vorliegenden Zusammensetzung auf die Haut, nachahmt.
Der wie hierin verwendete Begriff "Konditionieren" bedeutet einen beliebigen oder mehrere der nachstehenden Vorgänge: Verhinderung und/oder Behandlung von trockener Haut, lichtgeschädigter Haut, Aussehen von Falten, Altersflecken und/oder gealterter Haut, Erhöhung der Stratum corneum-Biegsamkeit, Aufhellung der Hautfarbe, Steuern von Sebum- Exkretion und allgemeine Verbesserung der Qualität der Haut.
Es wurde als Teil der vorliegenden Erfindung gefunden, dass N-substituierte Fettsäureamide der Formel I, vorzugsweise bei 100 uM Konzentration, mindestens 20% LRAT- oder ARAT-katalysierte Retinolveresterung, gemessen durch ein mikrosomales in vitro-Assay (nachstehend beschrieben), inhibieren. Somit verbessert das Vorliegen von N-substituiertem Fettsäureamid der Formel I in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen die Leistung von Retinol oder einem Retinylester in kosmetischen Zusammensetzungen wesentlich.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Alle Mengen sind auf das Gewicht der Endzusammensetzung bezogen, sofern nicht anders ausgewiesen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten als einen ersten, wesentlichen Bestandteil eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Retinol und Retinylester. Der Begriff "Retinol" schließt unter anderem die nachstehenden Isomeren von Retinol: all-trans-Retinol, 13-cis- Retinol, 11-cis-Retinol, 9-cis-Retinol, 3,4-Didehydroretinol ein. Bevorzugte Isomeren sind all-trans-Retinol, 13-cis-Retinol, 3,4-Didehydroretinol, 9-cis-Retinol. Besonders bevorzugt ist all-trans-Retinol aufgrund seiner breiten kommerziellen Verfügbarkeit.
Retinylester ist ein Ester von Retinol. Der Begriff "Retinol" wurde vorstehend definiert. Retinylester, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Ester von Retinol, vorzugsweise C&sub2;-C&sub2;&sub0;-Ester und besonders bevorzugt C&sub2;-, C&sub3;- und C&sub1;&sub6;-Ester, weil sie üblicherweise verfügbar sind. Beispiele für Retinylester schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf: Palmitinsäureretinylester, Ameisensäureretinylester, Essigsäureretinylester, Propionsäureretinylester, Buttersäureretinylester, Valeriansäureretinylester, Isovaleriansäureretinylester, Hexansäureretinylester, Heptansäureretinylester, Octansäureretinylester, Nonansäureretinylester, Decansäureretinylester, Undecansäureretinylester, Laurinsäureretinylester, Tridecansäureretinylester, Myristinsäureretinylester, Pentadecansäureretinylester, Heptadecansäureretinylester, Stearinsäureretinylester, Isostearinsäureretinylester, Nonadecansäureretinylester, Arachidonsäureretinylester, Behensäureretinylester, Linolsäureretinylester und Ölsäureretinylester.
Der bevorzugte Ester zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist aus Palmitinsäureretinylester, Essigsäureretinylester und Propionsäureretinylester ausgewählt, weil diese die am besten kommerziell Verfügbaren sind und deshalb die Kostengünstigsten. Linolsäureretinylester ist aufgrund seiner Wirksamkeit ebenfalls bevorzugt.
Retinol und/oder Retinylester wird in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in einer Menge von 0,001% bis 10%, vorzugsweise in einer Menge von 0,01% bis 1%, besonders bevorzugt in einer Menge von 0,01% bis 0,5%, angewendet.
Der zweite essentielle Bestandteil der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist ein N-substituiertes Fettsäureamid der Formel I:
worin R&sub1; = Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen;
R&sub2; = Alkyl oder Alkenyl mit 8 bis 25 Kohlenstoffatomen;
R&sub3; = Alkyl, enthaltend 1 bis 5 Kohlenstoffatome, oder ein Phosphatester.
Vorzugsweise ist R&sub1; eine lineare, gesättigte Alkyl- oder Alkoxygruppe, die 1 bis 5 Kohlenstoffatome, besonders bevorzugt 1 oder 4 Kohlenstoffatome, enthält.
R&sub2; ist vorzugsweise eine lineare, ungesättigte Alkenylgruppe, die 10 bis 20 Kohlenstoffatome, besonders bevorzugt 10 bis 18 Kohlenstoffatome, enthält.
Optimal ist R&sub2; der Linolensäurerest (C18:2).
R&sub3; ist vorzugsweise entweder eine Methylgruppe oder ein Phosphatester, besonders bevorzugt Phosphatester von Cholin oder Glycol.
Besonders bevorzugt ist das N-substituierte Fettsäureamid ausgewählt aus den Verbindungen mit den nachstehenden Formeln A und B. Formel A Formel B
Das N-substituierte Fettsäureamid ist in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einer Menge im Bereich von 0,0001% bis 50%, vorzugsweise 0,01% bis 10%, besonders bevorzugt 0,1% bis 5%, eingeschlossen.
Das N-substituierte Fettsäureamid der Formel I inhibiert vorzugsweise bei einer Konzentration von 100 uM mindestens 20% LRAT- oder ARAT-katalysierte Retinolveresterung, wie durch mikrosomales in vitro-Assay gemessen:

Mikrosomales in vitro-Assay:

Mikrosomen werden wie in: J. C. Saari und D. L. Bredberg, "CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium" J. Biol. Chem. 263, 8084-90 (1988) beschrieben erhalten.
Eine Lösung, enthaltend 0,1M Natriumphosphat, pH 7 Puffer, 5 mM Dithiothreitol, 2 mg/ml Rinderserumalbumin, 40 mikromolar Palmitoyl CoA, 40 mikromolar Dilauroylphosphatidylcholin, 10 mikromolar Retinol und eine Testverbindung oder ein reines Lösungsmittel, wird 1 Stunde bei 37ºC mit einer mikrosomalen Fraktion, die aus retinalen Pigment-Rinder- Epithelialzellen isoliert wurden, inkubiert. Nach Inkubation wird die Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumen Ethanol gestoppt und die gebildeten Retinylester (Laurinsäureretinylester aus der LRAT-katalysierten Reaktion und Palmitinsäureretinylester aus ABEr-katalysierter Reaktion) werden mit Hexan extrahiert. Die Hexanschicht wird entfernt und der Stickstoff verdampft und der Rückstand durch HPLC an einer 3,9 · 300 mm C&sub1;&sub8;-Umkehrphasensäule, unter Verwendung einer mobilen 80% Methanol-in-Tetrahydrofuran-Phase und Fluoreszenzdetektion (325 nm Anregung, 480 nm Emission), analysiert, um den Retinylester zu quantifizieren. Die Menge an in Gegenwart des reinen Lösungsmittels gebildetem Ester wird als 100% angenommen und diese wird verwendet, um die Prozent Inhibierung der Esterbildung für die getesteten Verbindungen zu berechnen. Als eine Kontrolle wird eine aliquote Menge an Mikrosomen durch Sieden für 5 Minuten inaktiviert, was mindestens 95% Inhibierung der Esterbildung ergibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird N-substituiertes Fettsäureamid ausgewählt, das bei 100 uM Konzentration mindestens 40% LRAT- oder ARAT-katalysierte Retinolveresterung inhibiert.

Kosmetisch verträglicher Träger

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst auch einen kosmetisch verträglichen Träger, um als Verdünnungsmittel, Dispersant oder Träger für das Retinol und/oder den Retinylester und das N-substituierte Fettsäureamid zu wirken, um seine Verteilung zu erleichtern, wenn die Zusammensetzung auf die Haut aufgetragen wird.
Träger, die verschieden sind von oder zusätzlich zu Wasser, können flüssige oder feste Erweichungsmittel, Lösungsmittel, Feuchthaltemittel, Verdicker und Pulver einschließen, Ein besonders bevorzugter nichtwässeriger Träger ist ein Polydimethylsiloxan und/oder ein Polydimethylphenylsiloxan. Die erfindungsgemäßen Silikone können jene mit Viskositäten im Bereich von etwa 10 bis 10 000 000 mm²/s (Centistokes) bei 25ºC sein. Besonders erwünscht sind Gemische von Silikonen mit niedriger und hoher Viskosität. Diese Silikone sind von der General Electric Company unter den Handelsmarken Vicasil, SE und SF, und von der Dow Corning Company unter der 200er- und 550er-Reihe erhältlich. Mengen von Silikon, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen angewendet werden können, liegen im Bereich von etwa 5% bis 95%, vorzugsweise 25% bis 90 Gewichtsprozent, der Zusammensetzung.
Der kosmetisch verträgliche Träger wird gewöhnlich 5% bis 99,9%, vorzugsweise 25% bis 80 Gewichtsprozent, der Zusammensetzung ausmachen und kann in Abwesenheit von anderen kosmetischen Hilfsmitteln den Rest der Zusammensetzung bilden. Vorzugsweise ist der Träger mindestens 50%, bevorzugter mindestens 80 Gewichtsprozent Wasser, auf das Gewicht des Trägers. Vorzugsweise umfasst Wasser mindestens 50 Gewichtsprozent der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, besonders bevorzugt 60 bis 80 Gewichtsprozent, auf das Gewicht der Zusammensetzung.

Wahlweise Hautvorteilsmaterialien und kosmetische Hilfsstoffe

Ein Öl oder öliges Material kann zusammen mit einem Emulgator vorliegen, unter Bereitstellung von entweder einer Wasser-in-Öl-Emulsion oder einer Öl-in-Wasser-Emulsion, in Abhängigkeit von dem mittleren hydrophilen-lipophilen Ausgleich (HLB) des angewendeten Emulgators.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen schließen vorzugsweise Sonnenschutzmittel ein. Sonnenschutzmittel schließen jene Materialien, die üblicherweise angewendet werden, um Ultraviolettlicht zu blockieren, ein. Erläuternde Verbindungen sind die Derivate von PABA, Cinnamat und Salicylat. Beispielsweise können Methoxyzimtsäureoctylester und 2- Hydroxy-4-methoxybenzophenon (auch bekannt als Oxybenzon) verwendet werden. Methoxyzimtsäureoctylester und 2-Hydroxy-4- methoxybenzophenon sind unter den Handelsmarken Parsol MCX bzw. Benzophenon-3 erhältlich. Die exakte Menge an in den Emulsionen angewendetem Sonnenschutzmittel kann in Abhängigkeit vom erwünschten Schutzgrad vor UV-Sonnenstrahlung variieren.
Ein weiterer bevorzugter, wahlweiser Bestandteil ist ausgewählt aus essentiellen Fettsäuren (EFAs); das heißt jenen Fettsäuren, die für die Plasmamembranbildung von allen Zellen essentiell sind, wobei Keratinozyten-EFA-Mangel Zellen hyperproliferativ macht. Die Ergänzung von EFA korrigiert dies. EFA erhöhen auch die Lipidbiosynthese der Epidermis und stellen Lipide für die Sperrbildung der Epidermis bereit. Die essentiellen Fettsäuren werden vorzugsweise aus Linolsäure, γ-Linolensäure, Homo-γ-linolensäure, Columbinsäure, Eicosan- (n-6,9,13)-triensäure, Arachidonsäure, Timnodonsäure, Hexaensäure und Gemischen davon, ausgewählt.
Ein weiterer bevorzugter, wahlweiser Bestandteil ist ausgewählt aus Azolen, beispielsweise Climbazol, Bifonazol, Clotrimazol, Ketoconazol, Miconazol, Econazol, Itraconazol, Fluconazol, Terconazol, Butoconazol, Sulconazol, Lionazol und Gemischen davon. Das Azol kann in der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einer Menge von 0,001 bis 50 Gewichtsprozent, vorzugsweise 0,001 bis 10 Gewichtsprozent, besonders bevorzugt 0,1 bis 5%, enthalten sein.
In die erfindungsgemäßen kosmetischen Zusammensetzungen werden häufig Erweichungsmittel eingearbeitet. Anteile von solchen Erweichungsmitteln können im Bereich von 0,5% bis 50%, vorzugsweise zwischen 5% und 30 Gewichtsprozent, der Gesamtzusammensetzung liegen. Erweichungsmittel können unter solchen allgemeinen chemischen Kategorien, wie Ester, Fettsäuren und Alkohole, Polyole und Kohlenwasserstoffe, eingeteilt werden.
Ester können Mono- oder Diester sein. Annehmbare Beispiele von Fettsäurediestern schließen Adipinsäuredibutylester, Sebacinsäurediethylester, Dimersäurediisopropylester und Bernsteinsäuredioctylester ein. Annehmbare verzweigtkettige Fettsäureester schließen Myristylsäure-2-ethylhexylester, Stearinsäureisopropylester und Palmitinsäureisostearylester ein. Annehmbare dreibasige Säureester schließen Trilinolsäuretriisopropylester und Zitronensäuretrilaurylester ein. Annehmbare geradkettige Fettsäureester schließen Palmitinsäurelaurylester, Milchsäuremyristylester, Erucasäureoleylester und Ölsäurestearylester ein. Bevorzugte Ester schließen Cococaprylat/Caprat (ein Gemisch von Cococaprylat und Cococaprat), Propylenglycolmyristyletheracetat, Adipinsäurediisopropylester und Octansäurecetylester ein.
Geeignete Fettalkohole und -säuren schließen jene Verbindungen mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen ein. Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen, wie Cetyl-, Myristyl-, Palmitin- und Stearylalkohole und -säuren.
Unter den Polyolen, die als Erweichungsmittel dienen können, sind lineare und verzweigtkettige Alkylpolyhydroxylverbindungen. Beispielsweise sind Propylenglycol, Sorbit und Glycerin bevorzugt. Auch verwendbar können polymere Polyole, wie Polypropylenglycol und Polyethylenglycol, sein. Butylen- und Propylenglycol sind besonders auch als Eindringverstärker bevorzugt.
Beispielhafte Kohlenwasserstoffe, die als Erweichungsmittel dienen können, sind jene mit Kohlenwasserstoffketten, irgendwo von 12 bis 30 Kohlenstoffatomen. Spezielle Beispiele schließen Mineralöl, Vaseline, Squalen und Isoparaffine ein.
Eine weitere Kategorie von funktionalen Bestandteilen innerhalb der erfindungsgemäßen kosmetischen Zusammensetzungen sind Verdickungsmittel. Ein Verdickungsmittel wird gewöhnlich in Mengen etwa von 0,1 bis 20 Gewichtsprozent, vorzugsweise von 0,5% bis 10 Gewichtsprozent, der Zusammensetzung vorliegen. Beispielhafte Verdickungsmittel sind vernetzte Polyacrylatmaterialien, die unter der Handelsmarke Carbopol von B. F. Goodrich Company erhältlich sind. Gummen können als Xanthan-, Carrageenan-, Gelatine-, Karaya-, Pectin- und Johannesbrotbaumgummi angewendet werden. Unter bestimmten Umständen kann die verdickende Funktion durch ein Material, das auch als ein Silikon oder Erweichungsmittel dient, bewirkt werden. Beispielsweise haben Silikongummies mit einer Viskosität oberhalb von 10 Centistokes und Ester, wie Stearinsäureglycerinester, duale Funktionalität.
In die erfindungsgemäße kosmetische Zusammensetzung können Pulver eingearbeitet werden. Diese Pulver schließen Kreide, Talkum, Fullers-Erde, Kaolin, Stärke, Smectittone, chemisch modifiziertes Magnesiumaluminiumsilikat, organisch modifizierten Montmorillonitton, hydratisiertes Aluminiumsilikat, pyrogene Kieselsäure, Aluminiumstärkeoctenylsuccinat und Gemische davon ein.
Andere unterstützende geringe Komponenten können auch in die kosmetischen Zusammensetzungen eingearbeitet werden. Diese Bestandteile können färbende Mittel, Opazitätsmittel und Parfums einschließen. Mengen dieser anderen in geringer Menge vorliegenden Hilfskomponenten können im Bereich von etwa 0,001% bis zu 20 Gewichtsprozent der Zusammensetzung liegen.

Verwendung der Zusammensetzung

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist hauptsächlich als Produkt zur örtlichen Auftragung auf menschliche Haut, insbesondere als Mittel zum Konditionieren und Glätten der Haut und Verhindern oder Vermindern des Aussehens von faltiger oder gealterter Haut vorgesehen.
Bei der Verwendung wird eine kleine Menge der Zusammensetzung, beispielsweise 1 bis 100 ml, auf exponierte Flächen der Haut aus einem geeigneten Behälter oder Applikator aufgetragen und, falls erforderlich, wird sie dann darüber verteilt und/oder unter Verwendung von Hand oder Fingern oder einer geeigneten Vorrichtung in die Haut eingerieben.

Produktform und Verpackung

Die erfindungsgemäße örtliche Hautbehandlungszusammensetzung kann als Lotion, Fluidcreme, Creme oder Gel formuliert werden. Die Zusammensetzung kann in einem geeigneten Behälter verpackt werden, der sich für ihre Viskosität und zur vorgesehenen Verwendung durch den Verbraucher eignet. Beispielsweise kann eine Lotion oder Creme in eine Flasche oder einen Rollkugelapplikator oder eine Kapsel oder eine mit Treibmittel betriebene Aerosolvorrichtung oder einen mit einer Pumpe zur geeigneten Fingerbetätigung ausgestatteten Behälter verpackt werden. Wenn die Zusammensetzung eine Creme darstellt, kann sie einfach in einer nicht verformbaren Flasche oder einem Quetschbehälter, wie eine Tube oder eine mit Deckel versehene Dose, gelagert werden. Die Zusammensetzung kann auch in Kapseln, wie jene, beschrieben in US-Patent 5 063 057, eingeschlossen sein.
Die Erfindung stellt folglich auch einen verschlossenen Behälter, der eine hierin definierte kosmetisch verträgliche Zusammensetzung enthält, bereit.
Die nachstehenden speziellen Beispiele erläutern weiterhin die Erfindung, jedoch ist die Erfindung nicht darauf begrenzt.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Zellkultur:

Humankeratinozyten, isoliert aus neonataler Vorhaut durch Trypsinbehandlung, wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-(DME) plus Hams F12-(1 : 1)-Medium/10%igem fötalem Kalbsserum in Gegenwart von bestrahlten 3T3-Maus-Fibroblasten zur Herstellung einer Teilung von Keratinozytenkolonien wachsen lassen. Die Zellen wurden unter der vorstehenden Bedingung wachsen lassen bis zu ihrer zweiten Passage und bis zur zukünftigen Verwendung gefroren gehalten. Gefrorene Keratinozyten im zweiten Durchgang wurden aufgetaut und in dem vorstehenden Medium angeordnet und für fünf Tage wachsen lassen, bevor sie zu einem serumfreien MCDB-153-Basenmedium Keratinozytenwachstumsmedium (KGM) von Clonetics Corporation, San Diego, CA, enthaltend 0,15 mM Ca, oder Keratinozyten serumfreiem Medium (KSFM) von GIBCO, enthaltend 0,09 mM Ca) umgestellt wurden. Am Tag 7, als die Zellen 80-90% zusammengeflossen waren, wurden sie trypsinisiert und für verschiedene Versuche in serumfreiem Medium angeordnet.

TRANSGLUTAMINASE-ASSAY

Transglutaminase-Assay und Reratinozyten-Differentiation

Während des Vorgangs der terminalen Differentiation in der Epidermis wird eine 15 nm dicke Schicht Protein, bekannt als verhornter Umschlag (CE), auf der inneren Oberfläche der Zellperipherie gebildet. Der CE ist aus zahlreichen verschiedenen Proteinen zusammengesetzt, die miteinander durch die Bildung von N&epsi;-(γ-Glutamyl)lysinisodipeptidbindungen, katalysiert durch die Wirkung von mindestens zwei verschiedenen in der Epidermis exprimierten Transglutaminasen (TGasen) vernetzt sind. Transglutaminase I (TGase I) wird im Überschuss in den differenzierten Schichten der Epidermis, insbesondere der granulären Schicht, exprimiert und liegt in der undifferenzierten Basalepidermis nicht vor. Somit ist TGase I ein verwendbarer Marker von epidermaler Keratinozytendifferentiation bei hohen TGase-I-Spiegeln, was einen differenzierteren Zustand ausweist. Ein auf ELISA basierendes TGase-I-Assay unter Verwendung eines TGase-I-Antikörpers wurde zum Bewerten des Zustands der Differentiation von gezüchteten Keratinozyten in den folgenden Beispielen verwendet.
Für Beispiel 1 wurde das nachstehende Verfahren verwendet:
Keratinozyten (gezüchtet wie vorstehend beschrieben) wurden in 96-Vertiefungs-Platten bei einer Dichte von 3 000 Zellen pro Vertiefung in 200 ul Medien plattiert. Nach Inkubation für vier Tage wurden die Medien zu Medien, die Testverbindungen enthalten (sechs Wiederholungen pro Test), geändert. Die Zellen wurden für weitere 72 Stunden gezüchtet, wonach die Medien belüftet wurden und die Platten bei -70ºC gelagert wurden. Die Platten wurden aus dem Gefrierschrank entfernt und die Zellen mit PBS gewaschen. 100 ul steriles Wasser wurden zugesetzt und die Zellen wurden gefrier-gebrochen durch Gefrieren bei -70ºC, dann Auftauen. Die Zellen wurden eine Stunde bei Raumtemperatur (R/T) mit PBS/3% BSA (Waschpuffer, Rinderserumalbumin) inkubiert, dann mit einer frischen aliquoten Menge Waschpuffer gespült. Die Zellen wurden mit 50 ul von primärem Antikörper monoklonalen Anti-Human- Transglutaminase-Maus-Antikörper (IgG), erhalten von Biomedical Industries, verdünnt 1 : 2 000 in Waschpuffer für eine Stunde, 37ºC, dann zweimal mit Waschpuffer gespült, inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 50 ul sekundärem Antikörper (Fab Fragment, Peroxidase, konjugiertem Anti-Maus-IgG, erhalten von Amersham), verdünnt 1 : 4 000 in Waschpuffer für eine Stunde bei 37ºC, dann zweimal mit Waschpuffer gespült, inkubiert. Die Zellen wurden mit Substratlösung (4 mg o-Phenylendiamin und 3, 3 ul 30%igem H&sub2;O&sub2; in 10 ml 0, 1M Citratpuffer, pH 5,0) für fünf Minuten R/T in der Dunkelheit (unter Aluminiumfolie) inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 ul 4 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die Absorption der Proben wurde bei 492 nm in einem Plattenleser gelesen. Außer den sechs Wiederholungen wurden vier mit beiden Antikörpern behandelt, wobei zwei nur mit dem sekundären Antikörper (das heißt zum Bestimmen des Hintergrundbindens des Enzymkonjugierten Ab) behandelt wurden. TGase-Spiegel wurden durch Subtrahieren des Hintergrunds von den Lesungen von jeder Behandlung und Bestimmen der mittleren ± Standardabweichung für die für beide Antikörper ausgedrückten Wiederholungen bestimmt.
Für Beispiel 3 wurde das nachstehende Verfahren verwendet:
Keratinozyten (gezüchtet wie vorstehend beschrieben) wurden in 96-Vertiefungs-Platten bei einer Dichte von 3 000 Zellen pro Vertiefung in 200 ul Zellkulturmedien angeordnet. Nach Inkubation für 4 Tage wurden die Medien zu Medien, die Testverbindungen enthalten (sechs Wiederholungen pro Test), geändert. Die Zellen wurden für weitere 72 Stunden gezüchtet, wonach die Medien belüftet wurden und die Platten bei -70ºC gelagert wurden. Anschließend wurden die Platten aus dem Gefrierschrank entfernt, die Zellen wurden weiter gefriergebrochen durch Gefrieren und Auftauen und dann 3x mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden eine Stunde bei Raumtemperatur (R/T) mit TBS/5% BSA Puffer inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 100 ul monoklonaler Anti-Human-Transglutaminase-(IgG)-Maus- Antikörper (primärer Antikörper), erhalten von Biomedical Technologies Inc., verdünnt 1 : 2 000 in TBS/1% BSA Puffer, für zwei Stunden bei 37ºC inkubiert und dann sechsmal mit Waschpuffer (TBS/1% BSA/0,05% Tween-20) gespült. Die Zellen wurden dann mit 100 ul Fab-Fragment, Peroxidase-konjugiertem Anti- Maus-IgG-Antikörper (sekundärer Antikörper) von Amersham), verdünnt 1 : 4 000 in Waschpuffer, für zwei Stunden bei 37ºC inkubiert und dann dreimal mit Waschpuffer und dreimal mit PBS gespült. Die Zellen wurden mit Substratlösung (4 mg o-Phenylendiamin und 3,3 : 1 30% H&sub2;O&sub2; in 10 ml 0,1M Citratpuffer, pH 5,0) für fünf Minuten bei R/T und in der Dunkelheit (unter Aluminiumfolie) inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 ul 4 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die Absorption der Proben wurde bei 492 nm in dem Plattenleser gelesen. Außerhalb der sechs Wiederholungen wurden vier mit beiden Antikörpern behandelt, wobei zwei nur mit dem sekundären Antikörper behandelt wurden (das heißt, um das Hintergrundbinden des Enzymkonjugierten Antikörpers zu bestimmen). Transglutaminase- I-(TGase-I)-Spiegel wurden durch Subtrahieren des Hintergrunds von den Lesungen von jeder Behandlung und Bestimmen der mittleren ± Standardabweichung für die beiden Antikörper exponierten Wiederholungen bestimmt.

DNA-Assay

Der Spiegel von TGase I, detektiert nach Behandlung der Zellen, könnte durch die Zellzahl beeinflusst werden; das heißt, je größer die Anzahl von Zellen, umso größer ist der detektierte TGase-I-Spiegel. Der TGase-I-Spiegel wurde auf DNA-Gehalt der Zellen in der gleichen Vertiefung normalisiert, wodurch somit die Variation aufgrund der Unterschiede in der Zellzahl beseitigt wird. Die DNA-Zahlenangabe ist ein besonders verwendbarer Indikator der Zellzahl, einschließlich der Keratinozytenzellzahl, weil jede Zelle für alle Absichten und Zwecke ein identisches Genom aufweist und deshalb eine gleiche Menge an DNA. Der Gesamt-DNA-Gehalt einer Vertiefung von Zellen ist deshalb direkt proportional der Zellzahl in der Vertiefung. Die Mengenangabe der DNA wurde verwendet, um die TGase-Daten der Zellzahl zu normalisieren.
Keratinozyten wurden in 96-Vertiefungs-Platten bei einer Dichte von 3 000 Zellen pro Vertiefung in 200 ul Medien plattiert. Nach Inkubation für vier Tage wurden die Medien auf Medien-enthaltende Testverbindungen (6 Wiederholungen pro Test) verändert. Die Zellen wurden für weitere 72 Stunden gezüchtet, wonach die Medien belüftet wurden und die Platten für mindestens 1,5 Stunden bei -70ºC gelagert wurden. Die Platten wurden aus dem Gefrierschrank entfernt und 30 Minuten aufgetaut. 100 ul/Vertiefung Hoechst Farbstoff (1 ug/ml Endkonzentration) wurden zugegeben und dies wurde 15 Minuten inkubiert, bedeckt und dann in einem Fluorimeter (Ex. 360 nm und Em. 460 nm) gelesen. Die Farbstofflösung wurde entfernt und die Vertiefungen wurden mit PBS in der Zubereitung für das TGase-Assay gespült.

BEISPIEL 1

Retinsäure ist wirksamer als Retinol beim Verändern des Keratinozyten-Differentiationszustands

Die Wirkung von Transglutaminasespiegeln, normalisiert auf DNA-Gehalt der Zellen, nach Zugabe von Retinsäure (RA) und Retinol (ROH) wurde geprüft und die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1
n = 3
Alle Konzentrationen von getesteter Retinsäure; das heißt 2,5 · 10&supmin;&sup7; M, 2,5 · 10&supmin;&sup8; M und 2,5 · 10&supmin;&sup9; M, senkten die Keratinozytendifferentiation zu einem wesentlich größeren Ausmaß als jede der entsprechenden 2,5 · 10&supmin;&sup7; M, 2,5 · 10&supmin;&sup8; M und 2,5 · 10&supmin;&sup9; M Retinolbehandlung. Die Senkung des Transglutaminasespiegels war für sowohl Retinsäure als auch Retinol dosisabhängig. Dies stimmt mit der Retinsäure mit einer größeren inhibitorischen Wirkung auf epitheliale Differentiation als Retinol überein.

BEISPIEL 2

Mikrosomale in vitro-Veresterung von Retinol:

Mikrosomen werden wie in: J. C. Saari und D. L. Bredberg, "CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium" J. Biol. Chem. 23, 8084-90 (1988) beschrieben erhalten.
Eine Lösung, enthaltend 0,1 M Natriumphosphat, pH 7, Puffer, 5 mM Dithiothreitol, 2 mg/ml Rinderserumalbumin, 40 mikromolar Palmitoyl CoA, 40 mikromolar Dilauroylphosphatidylcholin, 10 mikromolar Retinol und eine Testverbindung oder reines Lösungsmittel, wurde 1 Stunde bei 37ºC mit einer mikrosomalen Fraktion, isoliert aus retinalen Rinder-Pigment- Epithelialzellen, inkubiert. Nach Inkubation wurde die Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens Ethanol gestoppt und die gebildeten Retinylester (Palmitinsäureretinylester aus der ARAT-katalysierten Reaktion und Laurinsäureretinylester aus der LRAT-katalysierten Reaktion) wurden mit Hexan extrahiert. Die Hexanschicht wurde entfernt, unter Stickstoff verdampft und der Rückstand mit HPLC an einer 3,9 · 300 mm C18- Umkehrphasensäule, unter Verwendung einer 80% Methanol in Tetrahydrofuran mobilen Phase, und Fluoreszenzdetektion (325 nm Anregung, 480 nm Emission) zum Quantifizieren der Retinylester analysiert. Die Menge an in Gegenwart von reinem Lösungsmittel gebildetem Ester wurde als 100% genommen und diese wurde verwendet, um die Prozent Inhibierung der Esterbildung für die getesteten Verbindungen zu berechnen. Als Kontrolle wurde eine aliquote Menge Mikrosomen durch Sieden für 5 Minuten inaktiviert, was mindestens 95% Inhibierung der Esterbildung ergab.
Die erhaltenen Ergebnisse werden in Tabellen 2A und 2B zusammengefasst.
Die Verbindungen in Tabelle 2A wurden bei einer 100 uM Konzentration getestet. Die Verbindungen in Tabelle 2B wurden bei einer 10 uM Konzentration getestet.
Die Verbindung der Formel C, die nicht in den Umfang der vorliegenden Erfindung fällt, wurde auch getestet. Formel C
Aus den Ergebnissen in Tabellen 2A und 2B wird ersichtlich, dass N-substituierte Fettsäureamide, worin R&sub2; nicht mehr als 7 Kohlenstoffatome aufweist (das heißt Formeln A und B), starke Inhibitoren von LRAT- und ARAT-katalysierter Retinolveresterung darstellen.

BEISPIEL 3

Die Wirkung von Verbindungen und in Tabelle 3 angeführten Kombinationen auf die Keratinozytendifferentiation wurde geprüft. Die Ergebnisse wurden als % Kontrolle ausgedrückt. Transglutaminasespiegel wurden auf DNA normalisiert. TABELLE 3 Wirkung von Retinol und Amid von Formel A auf Keratinozyten- TGase/DNA
n = 3
2,5 · 10&supmin;&sup7; M Retinsäure war wirksam bei der Repression von Keratinozyten-TG1-Spiegeln (auf 69% Kontrollspiegel). 2, 5 · 10&supmin;&sup7; M Retinol und 10&supmin;&sup4; M Verbindung der Formel A waren einzeln verwendet beim Inhibieren von Keratinozyten-TGase-I- Spiegel weniger wirksam. Jedoch reprimierte vereinigte 2,5 · 10&supmin;&sup7; M Retinol + 10&supmin;&sup4; M Verbindung der Formel A Keratinozyten- TGase-I auf 58% Kontrollspiegel. Dieses Beispiel stellt auch eine gute Korrelation zwischen mikrosomalem Assay und Zellkulturdaten her.
Beispiele 4-9 erläutern örtliche Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Zusammensetzungen können in herkömmlicher Weise verarbeitet werden. Sie sind zur kosmetischen Anwendung geeignet. Insbesondere sind die Zusammensetzungen zur Auftragung auf faltige, raue, trockene, fleckige, gealterte und/oder UV-geschädigte Haut geeignet und um das Aussehen und das Anfühlen davon zu verbessern sowie zur Auftragung auf gesunde Haut, um die Verschlechterung davon zu verhindern oder zu verzögern.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel erläutert eine Wasser-in-Öl-Emulsion mit hoher innerer Phase, die die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält.
% Gewicht/Gewicht
Retinol 0,5
Vollständig hydriertes Kokosnussöl 3,9
Formel A 5
Brij 92* 5
Bentone 38 0,5
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,3
Butyliertes Hydroxytoluol 0,01
Parfüm qs
Wasser auf 100
* Brij 92 ist Polyoxyethylen(2)oleylether
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel erläutert eine Öl-in-Wasser-Creme, die die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält.
% Gewicht/Gewicht
Retinol 0,15
Mineralöl 4
Formel B 2
Brij 56* 4
Alfol 16RD* 4
Triethanolamin 0,75
Butan-1,3-diol 3
Xanthangummi 0,3
Butyliertes Hydroxytoluol 0,01
Wasser auf 100
* Brij 56 ist Cetylalkohol-POE (10)
Alfol 16RD ist Cetylalkohol

BEISPIEL 6

Dieses Beispiel erläutert eine alkoholische Lotion, die die erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthalt.
% Gewicht/Gewicht
Palmitinsäureretinylester 0,15
Formel B 0,5
Ethanol 40
Butyliertes Hydroxytoluol 0,01
Wasser auf 100

BEISPIEL 7

Dieses Beispiel erläutert eine weitere alkoholische Lotion, die die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält.
% Gewicht/Gewicht
Retinol 0,15
Formel A 0,2
Ethanol 40
Antioxidanz 0,1
Wasser lauf 100

BEISPIEL 8

Dieses Beispiel erläutert eine Sonnenschutzcreme, die die erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthält.
% Gewicht/Gewicht
Retinol 0,01
Formel A 0,3
Silikonöl 200 cSt 7,5
Glycerylmonostearat 3
Cetosterylalkohol 1,6
Polyoxyethylen-(20)-cetylalkohol 1,4
Xanthangummi 0,5
Parsol 1789 1,5
Methoxyzimtsäureoctylester (PARSOL MCX) 7
Parfüm qs
Farbe qs
Wasser auf 100

BEISPIEL 9

Dieses Beispiel erläutert eine nicht-wässerige Hautpflegezusammensetzung, die die erfindungsgemäßen Kombination enthält.
% Gewicht/Gewicht
Palmitinsäureretinylester 0,15
Formel B
Silikongummi SE-30 ¹ 10
Silikonfluid 345 ² 20
Silikonfluid 344 ³ 55,79
Squalen 10
Linolensäure 0,01
Cholesterin 0,03
2-Hydroxy-n-octansäure 0,7
Vitamin-E-linoleat 0,5
Kräuteröl 0,5
Ethanol 2
¹ Ein Dimethylsilikonpolymer mit einem Molekulargewicht von mindestens 50 000 und einer Viskosität von mindestens 10 000 Centistokes bei 25ºC, erhältlich von GEC
² cyclisches Dimethylsiloxan-Pentamer, erhältlich von Dow Corning Corp.
³ Dimethylsiloxantetramer, erhältlich von Dow Corning Corp.
Die in den Beispielen getesteten Verbindungen wurden aus den nachstehenden Quellen erhalten:

VERBINDUNG / QUELLE

Retinol Sigma
Palmitinsäureretinylester Sigma
Retinsäure Sigma
N-substituierte Fettsäureamide Universität Utrecht, Niederlande

Claims

1. Hautpflegezusammensetzung, umfassend:

(a) 0,001% bis 10% einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Retinol, Retinylester und Gemischen davon;

(b) 0,0001% bis 50% eines N-substituierten Fettsäureamids der nachstehenden Struktur:

worin R&sub1; = Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen;

R&sub2; = Alkyl oder Alkenyl mit 8 bis 25 Kohlenstoffatomen;

R&sub3; = Alkyl, enthaltend 1 bis 5 Kohlenstoffatome, oder ein Phosphatester;

(c) einen kosmetisch verträglichen Träger.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das N- substituierte Fettsäureamid bei einer Konzentration von 100 uM Lecithin-Retinolacyltransferase-(LRAT)- oder Acyl-CoA-Retinoltransferase-(ARAT)-katalysierte Retinolveresterung, gemessen durch ein mikrosomales in vitro-Assay, zu mindestens 20% inhibiert.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das N- substituierte Fettsäureamid bei einer Konzentration von 100 uM LRAT- oder ARAT-katalysierte Retinolveresterung, gemessen durch ein mikrosomales in vitro-Assay, zu mindestens 40% inhibiert.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-3, worin der Retinylester aus der Gruppe, bestehend aus Palmitinsäureretinylester, Essigsäureretinylester, Propionsäureretinylester und Gemischen davon, ausgewählt ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-3, worin der Retinylester Linolsäureretinylester ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-3, worin Verbindung (a) Retinol ist.

7. Kosmetisches Verfahren zum Konditionieren der Haut, wobei das Verfahren örtliche Auftragung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-6 auf die Haut umfasst.

8. Kosmetisches Verfahren zum Nachahmen der Wirkung von Retinsäure auf der Haut, wobei das Verfahren Auftragen einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-6 auf die Haut umfasst.