DE69712754T2

DE69712754T2 - Hemmung der selectinbindung

Info

Publication number: DE69712754T2
Application number: DE69712754T
Authority: DE
Inventors: Caroline Bertozzi; Falguni Dasgupta; Jon O. Nagy; Wayne R. Spevak
Original assignee: University of California; University of California Berkeley
Current assignee: University of California; University of California Berkeley
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 2002-10-17
Anticipated expiration: 2017-03-01
Also published as: EP0902681A1; US20010046970A1; JP2001516334A; EP0902681B1; AU718317B2; AU2195097A; CA2247115A1; ATE217788T1; US5962422A; CA2247115C; US5985852A; WO1997031625A1; US6299897B1; DE69712754D1

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft im allgemeinen das Feld therapeutischer Verbindungen, die entworfen sind, um zwischen der Bindung von Kohlenhydratliganden und ihren Rezeptoren auf der Zelloberfläche zu interferieren. Im Spezifischen stellt sie Produkte und Verfahren, für die Hemmung der Zellwanderung und der Aktivierung via P-Selektin und L-Selektin unter Verwendung polymerisierter Glycoliposomen bereit.

Hintergrund

Die Adhäsion zirkulierender Neutrophiler an Endothelzellen ist eines der wichtigen Ereignisse, welche im Prozeß der Entzündung auftreten. Die Rekrutierung Neutrophiler in das Gewebe wird durch eine Adhäsionskaskade initiiert. Über diesen Prozeß rollen Zellen und haften sich schließlich fest an das Endothel an. Die Faktoren, die zu der hohen Bindungsstärke dieser Wechselwirkung beitragen, sind nicht vollständig verstanden, aber man denkt, daß sie Wechselwirkungen zwischen Selektinen auf einer Zelle mit Kohlenhydratliganden auf einer anderen Zelle mit einschließen. Durch das Interferieren mit der Bindung zwischen diesen Komponenten kann es möglich sein, pathologischen Folgeerscheinungen, die mit der Zellwanderung verknüpft sind, entgegenzuwirken.
Eine Anzahl von Adhäsionsmolekülen vermittelt die Wechselwirkung von Neutrophilen und anderen Leukozyten an das Endothel. Unter Ihnen sind die I-CAMs, V-CAM, CD11, CD18, das Integrin α4β1 und verschiedene Rezeptoren, die jetzt kollektiv als Selektine bekannt sind. Ein jedes von diesen Molekülen ist Teil eines Liganden-Rezeptor-Paares, von welchen je eines jeweils auf einer der zwei wechselwirkenden Zellen exprimiert wird. Für einen allgemeinen Review wird der Leser auf Bevilacqua (Annu. Rev. Immunol. 11: 767, 1993) verwiesen. In verschiedenartigen Kombinationen unterstützen diese und andere Moleküle die Leukozytenadhäsion an die Gefäßwand und die Extravasation und können ebenfalls an der Aktivierung von Zelleffektorfunktionen teilnehmen. Die Expression von vielen von diesen Molekülen wird durch lösliche Faktoren wie zum Beispiel Cytokine hochreguliert, wobei diese wirken, um die Rekrutierung von Leukozyten zu einem betroffenen Gebiet zu erhöhen.
Unter der Vielzahl von Adhäsionsmolekülen, die beschrieben worden sind, wurden drei gemeinsam in einer Kategorie gesammelt, die als Selektine bekannt sind. Eines war früher als ELAM-1 bekannt und wurde identifiziert unter Verwendung von inhibierenden monoklonalen Antikörpern gegen Cytokin-aktivierte Endothelzellen. Ein anderes wurde früher als PADGEM, GMP-140 oder CD61 bezeichnet. Es wurde ursprünglich auf Plättchen identifiziert, und ist jetzt als P-Selektin bekannt. Ein drittes auf Leukozyten identifiziertes wurde früher als mLHR, Leu8, TQ-1, gp90MEL Lam-1 oder Lecam-1 bezeichnet und ist nun als L-Selektin bekannt. Die Selektine wurden zusammen gruppiert auf der Basis einer strukturellen Ähnlichkeit bevor sehr viel über ihre Bindungsspezifität bekannt war. Alle sind einzelkettige Polypeptide mit einer Kohlenhydratbindedomäne nahe dem N-Terminus, einem EGF-Repeat und irgendwo zwischen 2 bis 9 Modulen von ~60 Aminosäuren, die jeweils eine Homologie mit Komplement bindenden Proteinen teilen. Für allgemeine Reviews wird der Leser auf Lasky (Annu. Rev. Biochem. 64: 113, 1995) und Kansas (Blood 88: 3259, 1996) verwiesen.
Die drei Selektine weichen von einander in einer Anzahl von wichtigen Aspekten ab. Wie in der Fig. 2 dargestellt haben die Selektine verschiedene Liganden-Gegenstücke in dem Adhäsionsprozeß. Jedes Selektin wird unterschiedlich reguliert und nimmt in einer unterschiedlichen Weise an dem Prozeß der Inflammation oder Immunität teil. Es gibt zudem eine wachsende Anerkennung für die Unterschiede in den Erfordernissen für die Bindung von Liganden zwischen den Selektinen.
E-Selektin hat eine beträchtliche Menge an neuerem Forschungsinteresse erlangt aufgrund seiner Rolle in der Entzündung. Die Wanderung inflammatorischer Mediatorzellen an einen Entzündungsort, so denkt man, wird teilweise durch die Adhäsion der Zellen an vaskuläre Endothelzellen vermittelt. Studien in vitro haben nahe gelegt, daß E-Selektin an der Adhäsion nicht nur von Neutrophilen, sondern ebenfalls von Eosinophilen, Monozyten und einer Subpopulation von Gedächtnis-T-Zellen an das Endothel teilnimmt, das durch Endotoxin, IL- 1 oder TNF aktiviert worden ist. Die Expression von E-Selektin durch endotheliale Monoschichten steigt etwa 10-fach an und erreicht einen Spitzenwert etwa 4 Stunden nach der Stimulation mit IL-1, wobei sie fast auf das Grundniveau innerhalb von 24 Stunden absinkt. Man denkt, daß es die biologische Rolle von E-Selektin ist, ein starkes Bindemittel für Zellen, welche einen geeigneten E-Selektin-Liganden tragen, während eines Zeitverlaufs von 20 min bis zu 1 Stunde insbesondere während des Verlaufes einer örtlichen Entzündung zu sein.
Phillips et al., (Science 250: 1130, 1990) identifizierten zuerst das Bindungsziel von E- Selektin als das Oligosaccharid Sialyl-Lewis X (sLex) (NeuAcα2,3Galβ1,4(fucα1,3)GlcNac-), einer Endstruktur, die auf Glycoproteinen der Zelloberfläche von Neutrophilen gefunden wird.
Dies ist der Prototyp eines Kohlenhydrat-Liganden für die Klasse der Selektine geworden. Dieses und verwandte Oligosaccharide sind der Gegenstand des U.S.-Patents 5 576 305 und der PCT Anmeldung WO 92/07572.
Die Einheit sLex wurde in verschiedenartige polymere Strukturen eingebaut in einem Versuch, ihre schwache Bindung an Selektine zu verbessern. Zum Beispiel offenbart das U.S.-Patent 5 470 843 und DeFrees et al., (J. Am. Chem. Soc. 117: 66, 1995) bivalente Sialyl X Saccharide. Das U.S.-Patent 5 470 843 offenbart ein Kohlenhydrat enthaltendes Polymer mit einem synthetischen Polymer-Rückgrat mit 10-20 sLex, sLex oder GlcNac, verknüpft über einen bifunktionalen Spacer.
DeFrees et al., (J. Am. Chem. Soc. 118: 6101, 1996) beschreiben eine Präparation von sLex, hergestellt mit einer herkömmlichen Phospholipidliposom-Technologie. Die Liposomen enthalten Phosphatidylcholin, Cholesterol, Phospholipid, konjugiert mit Methoxypolyethylenglycol und Phospholipid, konjugiert mit sLex durch einen Polyethylenglycol-Spacer. Es werden Daten präsentiert, die zeigen, daß diese Zusammensetzung 5 · 10³-fach potenter ist als das Monomer sLex bei der Inhibierung der Bindung von E-Selektin an Zellen. Murohara et al., (Cardiovasc. Res. 30: 965, 1995) testeten sLex-Phospholipidliposomen in einem myokardialen Reperfusionsmodell und fanden, daß eine Dosis von 400 ug/kg Körpergewicht die proportionale Größe eines Risikobereiches und von Nekrose reduzierte.
P-Selektin ist ein Transmembran-Glycoprotein von ~140 kDa, wesentlich größer als E- Selektin. Es wurde ursprünglich auf Plättchen beschrieben, in welchen es in α- und in dichten Granula gefunden werden kann. Nach einer Aktivierung der Plättchen mit einem Mediator wie Thrombin, wird P-Selektin schnell wieder auf der Zelloberfläche verteilt. In Endothelzellen wird es in Granula gefunden, die als Weibel-Palade-Körper bekannt sind, aus welchen es nach einer Aktivierung durch Histamin wieder an die Oberfläche verteilt wird. Das Shutteln von P-Selektin in Speichergranula scheint durch ein Sortiersignal, das in der cytoplasmatischen Domäne vorhanden ist und offensichtlich einzigartig ist im Vergleich zu E- Selektin, vermittelt zu sein.
Entsprechend weicht P-Selektin von E-Selektin darin ab, daß es schnell aus Speichergranula exprimiert werden kann, anstatt eine Synthese de novo zu erfordern. P-Selektin bindet an Kohlenhydrat-Liganden, die auf Neutrophilen, Monozyten und Gedächtnis-T-Zellen vorhanden sind. P-Selektin liegt nicht nur in einem vorgeformten Zustand vor, seine Expression wird durch Mediatoren wie Histamin stimuliert, welche ihrerseits in den Zellen von inflammatorischen Zellen vorgeformt sind und gelagert werden. Die Adhärenz von Leukozyten an P-Selektin anstelle von E-Selektin auf Endothelzellen ist vielleicht das anfängliche Ereignis, das für eine Rekrutierung dieser Zellen zu einer verletzten Stelle auftritt. Eine Interferenz mit der Bindung an P-Selektin kann insbesondere wichtig sein, wenn es wünschenswert ist, die Wanderung von Leukozyten zu limitieren.
Das Vorhandensein von P-Selektin auf Plättchen legt einzigartige biologische Rollen im Vergleich zu den anderen Selektinen nahe. In einer Hypothese können Stellen einer Gewebeverletzung akut mit kurzwirkenden Aktivatoren von Plättchen angereichert sein und aktive Plättchen, die P-Selektin exprimieren, können direkt andere Leukozyten rekrutieren. In einer anderen Hypothese können Neutrophile oder Monozyten in einer entzündeten Stelle in der Lage sein, Plättchen über P-Selektin zu fangen, was wiederum zur Bildung von Gerinnseln oder zur Freisetzung von zusätzlichem Mediator führen könnte. In einem experimentellen Thrombus-Modell ist beobachtet worden, daß Plättchen sich erst an der Verletzungsstelle ansammeln, gefolgt von Leukozytenadhärenz und der Ablagerung von Fibrin. Beide der zwei späteren Schritte wurden durch Antikörper gegen P-Selektin inhibiert (Palabrica et al., Nature 359: 848, 1992).
L-Selektin hat eine Anzahl von Eigenschaften, die von den anderen bekannten Selektinen verschieden sind. Zuerst ist das Gewebeverteilungsmuster dem von P- und E-Selektin entgegengesetzt - es wird auf der Oberfläche von Leukozyten exprimiert anstatt auf dem Endothel; während der Ligand, an den es bindet, sich auf dem Endothel befindet anstatt auf den Leukozyten. Zweitens wird L-Selektin konstitutiv exprimiert anstatt während einer Entzündung hochreguliert zu werden, und es wird tatsächlich nach einer Aktivierung abgespalten. Dies kann bewirken, daß es den aktivierten Zellen gestattet wird, nach der Bindung freigesetzt zu werden, oder es kann eine Rolle von L-Selektin bei der zellulären Aktivierung anzeigen. Drittens ist L-Selektin nicht nur auf Neutrophilen und Monozyten vorhanden sondern auf den meisten Lymphozyten; während der Liganden-Widerpart nicht nur auf dem Endothel sondern auch auf Lymphknoten-HEV vorhanden ist. L-Selektin scheint eine Schlüsselrolle beim Homing zu Lymphknoten zu spielen (Shimizu et ab, Immunol. Today 13: 106, 1992; Picker et al., Annu. Rev. Immunol. 10: 561, 1992). Unter pathologischen Bedingungen, welche das Immunsystem einschließen, kann es L-Selektin sein, welches die zentralste Rolle spielt.
Das U.S.-Patent 5 489 578 beschreibt sulfatierte Liganden für L-Selektin und Verfahren zur Behandlung von Entzündung. Die Liganden sind Sulfooligosaccharide, basierend auf den Kohlenhydrat-Strukturen, die auf dem natürlichen Liganden für L-Selektin, GlyCAM-1, vorhanden sind.
Das U.S.-Patent 5 486 536 beschreibt die Verwendung von Sulfatiden als entzündungshemmende Verbindungen. Die Bindungsaktivität wurde einer kritischen Sulfatgruppe an der Position 3 auf dem Pyranosering von Galaktose zugeschrieben. In einem Experiment wurden die Sulfatide in einem proteinhaltigen Puffer beschallt, um Mikrotropfen herzustellen. Es wurde behauptet, daß diese Präparation schützende Wirkungen in zwei Tiermodellen für akute Lungenverletzung und Entzündung habe.
Ein jedes der Selektine zeigt eine Feinspezifität in Bezug auf die Erfordernisse des Kohlenhydrats für die Bindung. Alle drei Selektine binden sialylierte Fucooligosaccharide, von denen der Prototyp das Tetrasaccharid Sialyl-Lewisx (sLex) ist. Direkte Bindungsexperimente zwischen synthetischen Kohlenhydraten und isolierten Selektinen haben eine detailierte Analyse der Erfordernisse für eine Bindung gestattet (z. B., Brandley et al., Glycobiology 3: 633, 1993). E- und L-Selektin erfordern eine α2-3-Bindung für die Sialinsäure in sLex, während P-Selektin Sialinsäure in einer α2-6-Bindung erkennen kann. P-Selektin erfordert ebenfalls keine Hydroxylgruppe in den Fucose 2- und 4-Positionen. P- und L-Selektin binden sulfatierte Strukturen wie sulpho-Lex-(Glc)-cer und Sulfatide in einer Weise die in großem Maße unabhängig ist von divalenten Kationen, während die Bindung von E-Selektin äußerst sensitiv ist für die Gegenwart von Kationen. Die Bindung von P- und L-Selektin an sulfatierte Kohlenhydrate ist nur durch andere sulfatierte Kohlenhydrate hemmbar, wohingegen E- Selektin nicht dieses Erfordernis hat.
Es ist wichtig zu betonen, daß die Selektin-Spezifität in biologischen Reaktionen durch viel mehr vermittelt wird als durch die Kohlenhydrat-Komponente des Liganden. Es binden zum Beispiel P-Selektin und L-Selektin (nicht aber E-Selektin) sulfatierte Moleküle, denen Sialinsäure und Fucose fehlen, wie Sulfatide (Aruffo et al., Cell 67: 35, 1991) und bestimmte Subspezies von Heparin (Norgard-Sumnicht et al., Science 261: 480, 1993). Für einen allgemeinen Review der Vielzahl von Kohlenhydraten, die durch die Selektine erkannt werden, siehe Varki et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7390 1994).
Ein jedes der Selektine hat eine unterschiedliche Familie natürlicher Liganden auf der Oberfläche der gegenüberliegenden Zelle (siehe McEver et al., 270: 11 025, 1995). E- Selektin bindet stark an einen als ESL-1 bezeichneten Liganden. Im Gegensatz dazu zeigen Antikörper-Blockierungsstudien, daß im wesentlichen alle Bindungstellen für P-Selektin auf Leukozyten einem O-glycosylierten Protein, das als PSGL-1 (P-Selektin Glycoprotein Ligand 1) bezeichnet wird, zugeschrieben werden können (Moore et al., J. Cell Biol. 128: 661, 1995). Die natürlichen für L-Selektin identifizierten Liganden sind keine von diesen, sondern schließen andere Glycoproteine ein mit den Bezeichnungen GlyCAM-1, CD34 und MAdCAM-1.
Die Bindungsspezifität zeigt an, daß mindestens zwei von den drei Selektinen eine Liganden- Komponente jenseits der Struktur sLex erkennen müssen. Zusätzlich zu dem Oligosaccharid muß P-Selektin eine Stelle auf PSGL-1 binden mit Eigenschaften, die von ESL-1 und anderen Mucin-ähnlichen, O-glycosylierten Proteinen, wie CD43, verschieden sind.
Ein zweites Erfordernis des Liganden für eine hohe Affinität der Bindung des natürlichen Liganden wurde sowohl für P-Selektin als auch für L-Selektin identifiziert. Das zweite Erfordernis ist ein Sulfatrest, welcher offensichtlich nicht für eine Bindung von E-Selektin erforderlich ist, und hat Implikationen für die Entwicklung wirksamer inhibitorischer Verbindungen.
Imai et al., (Nature 361: 555, 1993) testeten die Erfordernisse für die Bindung von L-Selektin an die Liganden auf Lymphknoten-HEV. Radioaktives anorganisches Sulfat wird in die 50 kDa und 90 kDa Glycoproteine in einer Weise inkorporiert, die durch Natriumchlorat inhibierbar ist. Die untersulfatierten Glycoproteine interagierten in Präzipitationsanalysen nicht länger mit einer L-Selektin-Chimäre. Die Inhibitionsexperimente zeigen nicht genau den Ort der erforderlichen Sulfatgruppe auf dem Kohlenhydrat oder auf dem Proteinrückgrat auf. Wie auch immer, das Erfordernis von Sulfat unterscheidet die Bindungspezpifität von L- Selektin von derjenigen von E-Selektin.
Die Sulfat-Komponente wurde für die Struktur des P-Selektin-Liganden PSGL-1 präziser kartographiert. Das Erfordernis in P-Selektin wird durch ein oder mehrere sulfatierte Tyrosine nahe des N-Terminus des Polypeptid-Rückgrates bereit gestellt, getrennt von der Glycosylierungsstelle.
Wilkins et al., (J. Biol. Chem. 270: 22 677, 1995) zeigten, daß in humanen HL-60-Zellen synthetisiertes PSGL-1 metabolisch mit [³&sup5;S]-Sulfat markiert werden kann. Es wurde gezeigt, daß das meiste von der ³&sup5;S-Markierung in das Polypeptid in Form von Tyrosinsulfat inkorporiert wurde. Eine Behandlung von PSGL-1 mit einer bakteriellen Arylsulfatase setzte Sulfat aus Tyrosin frei und resultierte in einer gleichzeitigen Abnahme der Bindung an P- Selektin.
Pouyani et al., (Cell 83: 333, 1995) zeigten, daß selektive Inhibitoren der Sulfatierung die Bindung von HL-60-Zellen an lösliches P-Selektin nicht aber an E-Selektin beeinträchtigten. Die Zelloberflächenexpression von sLex oder dem Polypeptid war nicht durch die Behandlung beeinträchtigt. Eine Deletionsanalyse von isolierten Konstrukten von PGSL-1 lokalisierte die Bindungskomponente auf den Resten 20-40. Das Segment enthält drei Tyrosinreste und wenn diese zu Phenylalanin verändert wurden, wurde die P-Selektin-Bindungsaktivität zerstört. Außerdem wurde, wenn das Segment von 20 Aminosäuren mit einem anderen Protein fusioniert wurde, dieses wieder sulfatiert während der Biosynthese und hatte eine Bindungsaktivität für P-Selektin. Diese Autoren schlugen vor, daß die sulfatierten Tyrosine mit P-Selektin nicht durch die Kohlenhydratbindungsdomäne von P-Selektin interagieren sondern durch die EGF-ähnliche Domäne, welche in der Proteinsequenz näher an der die Membran durchspannenden Domäne liegt.
Sako et al., (Cell 83: 323, 1995) führten eine andere Reihe von Bindungsexperimenten unter Verwendung der extrazellulären Domäne von PSGL-1, exprimiert als ein Fusionsprotein, durch. Der Test erforderte die Fucosylierung des Proteins und Kationen in dem Testmedium, konsistent mit einer Abhängigkeit von Kohlenhydraten wie sLex. Die Mutation der möglichen N-Glycosylierungsstelle hatte keinen Effekt auf die Bindung von Selektin, was nahelegte, das das Erfordernis für das Kohlenhydrat O-verknüpft war. Die Mutation der drei Tyrosine zu Phenylalanin zerstörte jedoch die Bindungsaktivität für P-Selektin. Die Bindung von E- Selektin, für welches PSGL-1 ebenfalls als Ligand dienen kann, wurde durch die Entfernung der Sulfatierungsstellen nicht beeinträchtigt.
Die Bindungsaffinität von P- und L-Selektin für sLex liegt im mM Bereich (Nelson et al., J. Clinic. Invest. 91: 1157, 1993). Im Gegensatz dazu liegt die Affinität von P-Selektin für den natürlichen Liganden im nM Bereich (Moore et al., J. Cell Biol. 112: 491, 1991), ein Unterschied in der Potenz von ~10&sup6;-fach. Synthetische Oligosaccharide, die multiple sLex- Einheiten enthalten, machen nur zum Teil die Differenz aus, so daß der Effekt nicht nur der Ligandenvalenz zuzuschreiben ist. Die Disparität ist ebenfalls dem Erfordernis von P- und L- Selektin für eine starke anionische Determinante zuzuschreiben, wie den Sulfotyrosinen auf PSGL-1. Verbindungen, die in demselben Konzentrationsbereich wirksam sind wie PSGL-1 müssen in der Lage sein, eine ähnlich wirksame Kombination von Determinanten zur Verfügung zu stellen.
Es gibt einen Bedarf dafür, neue therapeutische Zusammensetzungen zu entwickeln, die in der Lage sind, mit Selektin-Liganden-Wechselwirkungen zu interferieren, da die zelluläre Adhäsion ein frühes Ereignis in einer Anzahl von inflammatorischen und immunologischen Phänomenen ist. Für eine systemische Verabreichung sollten die Zusammensetzungen im nanomolaren Bereich wirksam sein, so daß eine wirksame Menge in einer praktikablen Dosis gegeben werden kann. Es ist wichtig zu betonen, daß mögliche Zusammensetzungen in einem System getestet werden sollten, das die Erfordernisse der natürlichen Wechselwirkung in einer adäquaten Weise repräsentiert. Ein Ein-Komponenten-Inhibitor, der eine Ein-Komponenten- Wechselwirkung wirksam blockiert, wird typischerweise nicht in einer Zwei-Komponenten- Wechselwirkung wirksam sein.
Diese Offenlegung beschreibt polymerisierte Lipidzusammensetzungen, welche alle die Eigenschaften aufweisen, die notwendig sind, um P- oder L-Selektin in nanomolaren Konzentrationen zu hemmen, wenn sie in geeigneten Zell-Bioassays für Ligandenbindung getestet werden. Polymerisierte Liposomen und Lipidschichten wurden in anderen Kontexten vorgeschlagen (Spevak et al., Adv. Mater. 7: 85, 1995; Reichert et al. J. Am. Chem. Soc. 117: 829, 1995, Charych et al., Science 261: 58S, 1993; Charych et al., Chem. Biol. 3. 113, 1996). Die vorliegenden Erfindung ist jedoch das erste Beispiel, wo gezeigt wurde, daß polymerisierte Glycoliposomen in biologischen Systemen wirksam sind, die die Wechselwirkung von zwei eukaryotischen Zellen einschließen. Dies ist ebenfalls der erste Moment, wo gezeigt wird, daß polymerisierte Glycoliposomen ein wirksamer Ligand für ein Bindungsystem mit einer Mehrzahl separater Determianten sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Lipidzusammensetzungen dieser Erfindung stellen ein stabiles Gerüst bereit von dem aus eine Mehrzahl von Eigenschaften, die für die Bindung von Liganden erforderlich sind, präsentiert wird. P- und L-Selektin-Inhibitoren umfassen eine multivalente Ansammlung von Kohlenhydraten mit eingestreuten negativ geladenen Lipid-Kopfgruppen, welche für die Aktivität wesentlich sind. Diese Zusammensetzungen werden vorgeschlagen für die Verwendung bei der Inhibierung biologischer, durch Selektine vermittelter Phänomene, einschließlich der Adhärenz und Extravasation von Neutrophilen und Monozyten und des Trafficking von Lymphozyten durch Blutgefäße, Lymphbahnen und erkranktes Gewebe.
Entsprechend betreffen bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung Verfahren zur Inhibierung der Bindung zwischen einer ersten Zelle mit einem P- oder L-Selektin und einer zweiten Zelle mit einem Liganden für das Selektin, umfassend den Schritt, daß zugelassen wird, daß eine Lipid-Zusammensetzung mit der ersten Zelle in Wechselwirkung tritt; wobei die Lipid-Zusammensetzung eine Schicht aus Lipiden umfaßt, in der ein Anteil der Lipide kovalent kreuzvernetzt ist, ein Anteil der Lipide ein gebundenes Saccharid aufweist, und ein Anteil der Lipide, die kein gebundenes Saccharid aufweisen, eine Säuregruppe hat, die bei neutralem pH-Wert negativ geladen ist. Ein Anteil der Lipide mit dem gebundenen Saccharid oder der Säuregruppe kann kovalent kreuzvernetzt mit anderen Lipiden in der Schicht sein und ein Anteil kann nicht kovalent kreuzvernetzt mit anderen Lipiden sein.
Dies schließt Ausführungsformen ein, worin ein Anteil der Lipide in der Lipidschicht ein erstes gebundenes Saccharid hat, und ein getrennter Anteil der Lipide in der Lipidschicht ein zweites gebundenes Saccharid hat, das von dem ersten verschieden ist. Die Zusammensetzung hat vorzugsweise eine 50% Inhibierungskonzentration (IC&sub5;&sub0;) die 10²-fach oder 10&sup4;-fach niedriger ist als die von dem Monomer sLex.
Ebenfalls eingeschlossen in dieser Erfindung sind Verfahren zur Inhibierung von Leukozytenadhäsion oder -wanderung, Verfahren zur Inhibierung von Leukozytenadhärenz oder Fibrinablagerung, Verfahren zur Inhibierung von Leukozytenadhäsion oder -wanderung, ein Verfahren zur Inhibierung von Lymphozytenadhäsion und andere Arten der Interventionen bei der Zellwechselwirkung, die durch Selektin vermittelt ist, umfassend das Inhibieren der Bindung zwischen einer ersten Zelle mit einem P- oder L-Selektin und einer zweiten Zelle mit einem Liganden für das Selektin, wie bereits herausgestellt.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung der Bindung zwischen einem P- oder L-Selektin und einem Liganden für das Selektin, umfassend den Schritt, daß zugelassen wird, daß eine Lipid-Zusammensetzung mit dem Selektin wechselwirkt in einer Umgebung, wo das Selektin den Liganden kontaktiert; worin die Lipid- Zusammensetzung eine Schicht von Lipiden umfaßt, worin ein Anteil der Lipide kovalent kreuzvernetzt ist, ein Anteil der Lipide ein gebundenes Saccharid hat und ein Anteil der Lipide, die kein gebundenes Saccharid haben, eine Säuregruppe hat, die bei neutralem pH negativ geladen ist. Diese Ausführungsform betrifft ein inhibitorisches Verfahren zwischen Selektin-Liganden-Paaren, nicht notwendigerweise auf Zelloberflächen.
Ebenfalls mit eingeschlossen ist ein Verfahren der Selektion eines polymerisierten Glycoliposoms mit einer Selektin bindenden Aktivität, umfassend die Schritte des Bereitstellens eines Glycoliposoms mit kovalent kreuzvernetzten Lipiden und einem Saccharid, gebunden an einen Anteil der kovalent kreuzvernetzten Lipide; des Einführens des Glycoliposoms in eine Umgebung, welche ein Selektin und eine Zelle mit einem Selektin-Liganden umfaßt; und des Selektierens des Glycoliposoms, ob die relative inhibitorische Konzentration niedriger ist als diejenige von dem Monomer sLex.
Ebenfalls eingeschlossen ist die Verwendung einer polymerisierten Lipid-Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Behandlung einer Erkrankung, welche charakterisiert ist durch die örtliche Veränderung bei der Adhärenz von Leukozyten oder von Krebszellen an vaskuläres Endothel, Plättchen oder Lymphgewebe; insbesondere Erkrankungen inflammatorischer oder immunologischer Ätiologie; worin die polymerisierte Lipid-Zusammensetung eine Schicht von Lipiden umfaßt, worin ein Anteil der Lipide kovalent kreuzvernetzt ist, ein Anteil der Lipide ein gebundenes Saccharid hat und ein Anteil der Lipide, die kein gebundenes Saccharid haben, eine Säuregruppe hat, die bei neutralem pH negativ geladen ist.
Ebenfalls eingeschlossen sind Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung, die charakterisiert ist durch die örtliche Veränderung bei der Adhärenz von Leukozyten oder von Krebszellen an das vaskuläre Endothel, Plättchen oder Lymphgewebe, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einer polymerisierten Lipid-Zusammensetzung, umfassend eine Schicht von Lipiden, worin ein Anteil der Lipide kovalent kreuzvernetzt ist, ein Anteil der Lipide ein gebundenes Saccharid hat und ein Anteil der Lipide, die kein gebundenes Saccharid haben, eine Säuregruppe hat, die bei neutralem pH negativ geladen ist. Erkrankungen von Interesse schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Herzerkrankungen (wie eine Ischämie- Reperfusionsverletzung, Herzinfarkt, Herzmuskelentzündung, Restenose und tiefer Venenthrombose), hämorrhagischen Schock, Arthritis, Asthma und metastasierenden Krebs.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 ist eine Zeichnung von 2 polymerisierten Glycoliposomen, welche ein expandiertes Detail der chemischen Struktur zeigt. Die Struktur "A" ist in der Lage, die Bindung von P-Selektin an HL-60-Zellen bei einer Konzentration des Oligosaccharids unterhalb von 2 nM zu inhibieren, während die Struktur "B" im wesentlichen keine Aktivität hat. Die Vesikel sind unilamellar und aus einzelkettigen Lipiden mit Diyn-Gruppen, welche unter Verwendung von UV-Licht kreuzvernetzt sind, gemacht. An etwa 5% der Lipide konjugiert sind Analoga des Oligosaccharids sLex. Die Präparationen weichen von einander ab in Hinblick auf die nach außen gerichteten Determinanten, die durch die benachbarten Lipide gezeigt werden. In der Struktur "A" stellen die benachbarten Lipide Carbonsäuregruppen bereit, welche bei neutralem pH eine negative Ladung haben. In der Struktur "B" sind die benachbarten Lipide neutral. Die negativ geladenen Lipide arbeiten synergistisch mit dem sLex-Analogen, um eine P-Selektin-Bindungsaktivität zu liefern, gerade wie Sulfotyrosin synergistisch mit sLex in dem natürlichen Liganden arbeitet. P- und L-Selektin weichen von E-Selektin in dem Erfordernis für eine negative Ladungsdeterminante bei der Bindung ab.
Die Fig. 2 ist eine Zeichnung, welche einige Aspekte der Selektin-Bindung zeigt. Das. umrahmte Panel zeigt die Rezeptor-Liganden-Paare, die für L-, P- und E-Selektin bekannt sind. Sie sind auf der selben Zelle aus Zweckmäßigkeit gezeigt, nehmen aber auf verschiedene Weise an der Zelladhäsion und Wanderung teil. Unterhalb ist ein Detail, welches das duale Bindungsstellen-Modell für P-Selektin zeigt. Bei dem Liganden PSGL-1 korrespondieren die negativen Gruppen mit drei Sulfotyrosinresten. Im Gegensatz dazu gibt es keinen Beweis für eine separate Anionenbindungsstelle für E-Selektin.
Die Fig. 3 ist eine Zeichnung von bestimmten Komponenten, die gewählt werden können für den Einbau in Glycoliposomen dieser Erfindung.
Die Fig. 4 ist eine Titrationskurve für die Inhibierung der Bindung von P-Selektin an HL-60- Zellen durch Glycoliposomen. In der Ordung abnehmender Potenz (von links nach rechts) sind die Zusammensetzungen zusammengesetzt aus: sLex-Analog plus saure Lipide, Laktose plus saure Lipide, Maltose plus saure Lipide und sLex-Analog plus neutrale Lipide.
Die Fig. 5 ist ein Balkengraph, der die 50% Inhibierungskonzentration von verschiedenartigen Glycoliposom-Präparationen zeigt.
Die Fig. 6 ist eine Detailzeichnung von polymerisierten Liposomen, die für die Bindung in dem Beispiel 3 getestet wurden. Unter den getesteten Komponenten fand man, daß das Sulfo- Lex-Analog das beste Kohlenhydrat ist, und ein Lipid mit einer Sulfatgruppe am besten das Erfordernis für eine separate negativ geladene Gruppe erfüllte.
Die Fig. 7 und 8 sind Zeichnungen zusätzlicher exemplarischer Kohlenhydrat-Determinanten für den Einschluß in polymerisierte Glycoliposomen.
Die Fig. 9 ist eine Zeichnung, welche die sLex-Struktur und ein gebundenes sLex-Analog mit einem neuartigen Glycoliposom vergleicht, umfassend Sialinsäure und Fucosereste auf benachbarten Lipiden in der kreuzvernetzten Matrix.

Detaillierte Beschreibung

Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein System bereitzustellen für die Inhibierung der Bindung von P- und L-Selektin an ihre Liganden-Widerparts, insbesondere während der Wechselwirkung zwischen zwei Zellen. Polymerisierte Lipid-Zusammensetzungen werden in Kontakt gebracht mit einer der wechselwirkenden Zellen oder anders eingeführt in eine Umgebung, wo man erwartet, daß die Zellen wechselwirken. Dieser Typ einer Intervention ist von therapeutischem Interesse in jedwedem Umstand, wo die Adhärenz, die Wanderung oder die Aktivierung von Zellen durch ein Selektin vermittelt und für das Wohlergehen des Wirts nachteilig ist.
Polymerisierte Glycolipid-Zusammensetzung für die Verwendung in dieser Erfindung umfassen minimalerweise drei Elemente:
1. Eine stabile Plattform, gemacht aus einer Lipidschicht, stabilisiert durch kovalentes Kreuzvernetzen zwischen einem Anteil der Lipide.
2. Ein Saccharid oder eine ähnliche Struktur, gebunden an ein Lipid in der Lipidschicht, welches bzw. welche das Erfordernis für die Bindung von Kohlenhydrat durch Selektine erfüllt. Typischerweise ist das Glycolipid eines der kreuzvernetzten Lipide in der Struktur, kann aber statt dessen zwischen anderen Lipiden, die das kreuzvernetzte Gerüst bilden eingeschlossen sein.
3. Eine negativ geladene oder elektronegative Gruppe (gewöhnlicherweise eine Carbonsäure oder Oxysäure), welche das anionische Bindungserfordernis von P- und L-Selektin erfüllt. Es gibt kein Erfordernis, daß die Gruppe exakt dieselbe Rolle spielt wie die Sulfotyrosine von PSGL-1, so lange dem anionischen Bindungserfordernis genüge getan wird.
Wenn exemplarische Zusammensetzungen hergestellt wurden und auf inhibierende Aktivität in einem Zell-Bioassay getestet wurden, wurde eine Anzahl wichtiger Beobachtungen gemacht, die die Verbesserung, die durch diese Technologie bereitgestellt wird, unterstreichen.
- Polymerisierte Liposomen wurden zuvor nicht für die Inhibierung von Multikomponentenbindung getestet. Die relative Positionierung des Saccharids und der negativ geladenen Gruppe ist ein Zufall einer randomisierten Polymerisation, nicht eine kontrollierte Struktur wie sie dies in einer schrittweisen chemischen Synthese von kleinen Molekülen ist. Es konnte nicht vorausgesagt werden, daß eine wirksame Orientierung resultieren würde, aber man fand, daß aktive Zusammensetzungen in einer reproduzierbaren Weise ohne Schwierigkeiten hergestellt werden. Neue Kombinationen von Determinanten werden leicht zusammengebaut und auf Aktivität getestet.
- Die negativ geladene Gruppe des natürlichen Liganden PSGL-1 ist Sulfotyrosin, und was die Natur dessen wäre, was erforderlich ist, um dem anionischen Bindungserfordernis in den Liposomen zu genügen, war unbekannt. Man fand, daß das anionische Bindungserfordernis nicht erfordert, daß das Anion auf einem Protein oder einer Kohlenhydratkomponente ist, sondern es kann direkt an die Lipide gekoppelt sein, welche ein Teil der Lipidschicht werden. Überraschenderweise muß die anionische Komponente nicht eine Sulfatgruppe sein, sondern kann bereitgestellt werden als eine einfache Carbonsäurekopfgruppe auf dem Lipid.
- Das Vorhandensein der Säuregruppe auf benachbarten Lipiden reduzierte in einer nicht erwarteten Weise die Stringenz des Erfordernisses des Oligosaccharids. Von neutralen Disacchariden wie Saccharose und Maltose wurde zuvor nicht gezeigt, daß sie irgendwelche Selektin bindende Aktivität haben und sie wurden in die anfänglichen Experimente als "Negativkontrollen" eingeschlossen. Unerwarteterweise waren Zusammensetzungen, welche diese Zucker und anionischen Lipide enthielten, potente Selektin-Inihibitoren. Dies ist von einem beträchtlichen kommmerziellen Interesse, da die Herstellung von Zusammensetzungen, welche Zucker wie Laktose enthalten, einfacher und kostengüstiger als diejenige, welche komplexere Zucker wie sLex enthalten, ist.
- Die inhibitorische Aktivität war in einer beträchtlichen Weise hoch. In dem Zell-Bioassay hatte die Kombination sLex-Analoges - anionisches Lipid eine IC&sub5;&sub0; so gering wie 2 nM, welche bis zu 10&sup6;-fach niedriger ist als diejenige des Monomer sLex. Die Kombination Laktose - anionisches Lipid war wirksam bei 15 nM. Dies bedeutet, daß eine wirksame therapeutische Dosis bei niedrigeren Kosten hergestellt und in einem geringeren Volumen verabreicht werden kann als Zusammensetzungen nach dem Stand der Technik.
Die Fig. 1 zeigt exemplarische Lipid-Zusammensetzungen dieser Erfindung, in welchen ein Analoges von sLex auf der Oberfläche eines polymerisierten unilamellaren Liposoms gezeigt wird. Nur die erste Struktur zeigte inhibitorische Aktivität für die Bindung von P-Selektin in dem Bioassay, was die Wichtigkeit der anionischen Komponente in der Zusammensetzung unterstreicht.
Weil das Kohlenhydrat und die anionischen Determinanten auf getrennten Lipiden in den polymerisierten Lipidzusammensetzungen sind, besteht ein anderer Vorteil der hier beschriebenen Vorgehensweise darin, daß die Komponenten in einer separaten Weise geskreent und titriert werden können, um verbesserte Zusammensetzungen mit verfeinerten Bindungseigenschaften zu produzieren.

Herstellung von polymerisierten Lipid-Zusammensetzungen

Man wird aus der Zeichnung in der Fig. 1 und den in dem Beispiel 2 bereit gestellten Daten leicht Verständnis dafür haben, daß die Praxis dieser Erfindung nicht in einer kritischen Weise von den chemischen Details der Zusammensetzung abhängt. Innerhalb der Beschränkungen der drei vorausstehenden Erfordernisse ist der Fachmann frei die Zusammensetzung entsprechend einer Anzahl von unterschiedlichen Vorgehensweisen zusammenzubauen. Variationen bei der Polymerisationschemie und der Konjugation der Determinanten sind gestattet und innerhalb des Umfangs dieser Erfindung eingeschlossen. Das Entwerfen bestimmter Verknüpfungen zwischen einem Kohlenhydrat und einem Lipid liegt sehr wohl innerhalb der Fähigkeiten des gewöhnlichen Fachmanns. Die Optimierung der Verbindungen kann erreicht werden durch Routineanpassung und dem Verfolgen der Wirkung der Anpassung auf die Selektinbindung in einem von vielen im Fachbereich etablierten Assays.
Der folgende Abschnitt wird nur als eine Erläuterung möglicher Vorgehensweisen für die Bequemlichkeit des Lesers bereit gestellt.

Herstellung von Komponenten der Lipid-Zusammensetzung:

Die Erfindung verwendet Lipide sowohl um die Determinanten, die erforderlich sind, um Selektinbindung zu inhibieren, zu tragen, als auch als Komponenten für die Bildung der Lipidansammlungen. Beispiele für Lipide, die in der Erfindung verwendet werden können, sind Fettsäuren, bevorzugtermaßen von etwa 8 bis 30 Kohlenstoffatomen enthaltend, in einer gesättigten, einfach ungesättigten oder mehrfach ungesättigten Form; acylierte Derivate von Polyamino, Polyhydroxy oder gemischten Aminohydroxyverbindungen; Glycosylacylglycerole; Pospholipide; Phosphoglyceride; Sphingolipide (einschließlich von Sphingomyelinen und Glycosphingolipiden); Steroide wie Cholesterol; Terpene; Prostaglandine und nicht verseifbare Lipide.
Die negativ geladene Gruppe der Zusammensetzung ist typischerweise eine Säure, die von der äußeren Seite der Lipidschicht aus zugänglich ist. In bestimmten Ausführungsformen ist diese Säure eine organische Säure, insbesondere eine Carbonsäure. In anderen Ausführungsfomen ist die Säure eine Oxysäure der Form (XOn)(O&supmin;)p, worin n + p > 2. In diesem Fall wird das Lipid typischerweise von der Form Rm(XOn)(O&supmin;)p sein, worin jedes R einen aliphatischen Kohlenwasserstoff umfasst (welche nicht notwendigerweise dieselben sind), m 1 ist oder 2, (XOn)(O&supmin;)p eine Oxysäure ist und n + p > 2. Bevorzugte Oxysäuren sind Sulfat, SO&sub3;&supmin; und Phosphat. Ein Phosphat kann über einen oder zwei seiner Sauerstoffe an aliphatische Kohlenwasserstoffe konjugiert sein. Für jedwede negativ geladene Komponente der Zusammensetzung können jedwede zusätzlichen Eigenschaften vorhanden sein zwischen der Säuren und der aliphatischen oder der Membran-verankernden Gruppe. Diese schließen Spacer ein wie Polyethylenglycole und andere Heteroatome enthaltende Kohlenwasserstoffe. Die Säuregruppe kann ebenfalls auf einem Substituenten vorhanden sein, wie einer Aminosäure, einem Zucker oder einem Pseudozucker, was phosphorylierte oder sulfatierte Formen von Cyclohexidin einschließt, insbesondere Hexaphosphatidylinositol und Hexasulfatidylinositol.
Die negativ geladene Gruppe kann bereits in dem Lipid vorhanden sein oder kann durch eine Synthese eingeführt werden. Beispiele für Lipide mit negativ geladenen Kopfgruppen schließen die Fettsäuren selbst ein (wo die negative Ladung durch eine Carboxylatgruppe bereitgestellt wird), Cardiolipin (Phosphatgruppen), Dioleoylphosphatidinsäure (Phosphatgruppen) und die 1,4-Dihexadecylester von Sulfosuccinsäure (Sulfatgruppe).
Negativ geladene Lipide, die nicht kommerziell verfügbar sind, können durch Standardverfahren synthetisiert werden. Einige nicht beschränkende Erläuterungen folgen. In einer Vorgehensweise werden Fettsäuren mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (EDC) in Methylenchlorid aktiviert. Die austretende Gruppe N-Hydroxysuccinimid kann mit einem weiten Bereich von Nukleophilen ersetzt werden. In einem Beispiel wird Glycin verwendet, um ein Fettsäure-Aminosäure-Konjugat mit einer negativ geladenen Kopfgruppe zu ergeben. Glutaminsäure kann an die aktivierte Fettsäure gekoppelt werden, um ein Fettsäure-Aminosäure-Konjugat mit zwei negativen Ladungen in seiner Kopfgruppe zu ergeben. In einer anderen synthetischen Vorgehensweise wird 2,3- bis((1-Oxotetradecyl)oxy)-butandisäure hergestellt durch die Zugabe von Myristoylchlorid in Toluol zu einer Pyridinlösung von dl-Weinsäure. Die geklärte Lösung wird konzentriert, um das Produkt zu erhalten, welches aus Hexan umkristallisiert wird (Kunitake et al., Bull. Chem. Soc. Japan 51: 1877, 1978).
Ein sulfatiertes Lipid, der 1,4-Dihexadecylester von Sulfosuccinsäure, wird hergestellt wie folgt: eine Mischung von Maleinsäureanhydrid und Hexadecylalkohol in Toluol mit einigen Tropfen konzentrierter Schwefelsäure wird mit azeotropischer Entfernung von Wasser 3 h lang erwärmt. Das Dihexadecylmaleat wird rekristallisiert, dann mit einer äquimolaren Menge von NaHSO&sub3; in Wasser bei 100ºC während 2-3 Stunden erwärmt. Das Produkt wird gewonnen durch das Verdampfen des Wassers und das Extrahieren des Lipids in Methanol (Kunitake et al., supra). Alkylsulfonate können synthetisiert werden wie folgt: Ein Lipidalkohol wird von Sigma erhalten oder die Säuregruppe einer Fettsäure wird zu einem Alkohol reduziert durch das Reagierenlassen mit Lithiumaluminiumhydrid in Ether, um das Carboxylat in einen Alkohol umzuwandeln. Der Alkohol kann in Bromid umgewandelt werden durch eine Reaktion mit Triphenylphosphin und Kohlenstofftetrabromid in Methylenchlorid. Das Bromid wird dann zur Reaktion gebracht mit einem Bisulfition, um das Alkylsulfonat zu ergeben. Sulfate können hergestellt werden durch das zur Reaktion bringen einer aktivierten Fettsäure mit einem Sulfat enthaltenden Amin. Zum Beispiel wird der N- Hydroxysuccinimidester von 10,12-Pentacosadiynsäure mit Taurin zur Reaktion gebracht, um N-10,12-Pentacosadiynoyltaurin zu ergeben. Sulfate können ebenfalls hergestellt werden durch das zur Reaktion bringen eines Alkohols, z. B. Laurylalkohol, mit Schwefeltrioxidtrimethylamin-Komplex in wasserfreiem Dimethylformamid während 2,5 h (Bertozzi et al., Biochemistry 34: 14 271, 1995).
Nicht kommerziell erhältliche Phosphat enthaltende Lipide werden ebenfalls leicht synthetisiert. Zum Beispiel wird, um Dialkylphosphat-Verbindungen herzustellen, Phosphorylchlorid mit dem entsprechenden Alkohol zur Reaktion gebracht. Um Dihexadecylphosphat zu machen, wird Phosphorylchlorid mit drei Äquivalenten von Hexadecylalkohol in Benzol zwanzig Stunden lang refluxiert, gefolgt von der Rekristallisation des Produktes (Kunitake et al., supra). Monoalkylphosphate können hergestellt werden durch das zur Reaktion bringen von z. B. 10,12-Hexacosadiyn-1-ol (1 Äqu.) mit Phosphorylchlorid (1,5 Äqu.) bei Umgebungstemperatur in trockenem CCl&sub4; während ~12 h, dann Kochen unter Reflux während 6 Stunden. Die Entfernung des Lösemittels und das Erwärmen des Rückstandes mit Wasser während einer Stunde ergibt das gewünschte 10,12-Hexacosadiyn-1-phosphat (Hupfer et al., Chem. Phys. Lipids 33: 355, 1983). Alternativerweise kann eine mit NHS aktivierte Fettsäure mit 2-Aminoethylphosphat zu Reaktion gebracht werden, um das akylierte Derivat von Aminoethylphosphat zu ergeben.
Kohlenhydrat-Verbindungen, die geeignet sind für eine Verwendung mit dieser Erfindung schließen jedwede Monosaccharide, Disaccharide und größere Oligosaccharide mit einer Selektin bindenen Aktivität ein, wenn sie in eine polymerisierte Lipidschicht inkorporiert werden. Einfache Disaccharide wie Laktose und Maltose haben als Monomere keine Selektin bindende Aktivität, erlangen aber, wenn sie in polymerisierte Liposomen inkorporiert werden eine wesentliche Aktivität. Entsprechend dehnt sich der Bereich geeigneter Kohlenhydrate beträchtlich über das hinaus aus, was in anderen Selektininhibitoren verwendet wird.
In einigen Ausführungsformen ist das Kohlenhydrat ein Disaccharid oder ein neutrales Saccharid mit keiner nachweisbaren Bindung als ein unkonjugiertes Monomer. In anderen Ausführungsformen haben die Kohlenhydrate wesentliche Bindung in der monomeren Form und werden wahlweise synthetisiert als multimeres Oligosaccharid, obwohl dies nicht typischerweise erforderlich ist. Bevorzugte Oligosaccharide sind sialylierte Fucooligosaccharide insbesondere sLex und sLea, Analoga von sialylierten Fucooligosacchariden, sulfatierte Fucooligosaccharide, insbesondere Sulfo-Lex und Analoga von sulfatiertem Fucooligosaccharid. Disaccharide und größere Oligosaccharide können wahlweise andere Eigenschaften oder Spacer-Gruppen von einer Nicht-Kohlenhydrat-Natur zwischen Saccharideinheiten umfassen.
Ein "sialyliertes Fucooligosaccharid-Analog" ist ein Saccharid, welches die strukturellen Minimalkomponenten von sLex, welche an der Selektin-Bindung teilnehmen, in einer räumlich ähnlichen Orientierung zu derjenigen von sLex umfaßt. Diese Komponenten sind die 3-Hydroxygruppe der Fucoseuntereinheit und die negative Gruppe der Neuraminsäureuntereinheit von sLex. In dem Kontext von einer Bindung von L-Selektin schließen bevorzugte Analoga die 2-, 3- und 4-Hydroxygruppen der Fucoseuntereinheit und die negativ geladene Gruppe der Neuraminsäureuntereinheit ein. Die Fucose- und die Sialinsäurekomponenten können über einen Disaccharid-Spacer verknüpft sein, wie sie dies in sLex sind, über einen Kohlenwasserstoff-Linker (wie in den gebundenen Analoga, die nachstehend exemplarisch dargestellt sind), oder über einen synthetischen Spacer von einer geeigneten Länge, welcher solche wahlweisen Eigenschaften enthält, wie zyklische und aromatische Gruppen. Exemplare des letzten Typs sind in dem Review von Sears et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 12 086, 1996) aufgelistet - siehe insbesondere die Fig. 7.
Bestimmte Analoga und andere Oligosaccharide von besonderem Interesse schließen die folgenden ein: 1. Gebundene Disaccharide, die einen Spacer zwischen zwei Zuckern enthalten, insbesondere Sialinsäure oder eine sulfatierte Form davon und Fucose, worin der Spacer eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe (Fig. 9) ist oder ein gemischter Kohlenwasserstoff (Hanessian et al., J. Syn. Lett. 868, 1994). 2. Analoga, umfassend einen Fucoserest und die Carbonsäuregruppe von Sialinsäure, verknüpft durch hydroxylierte Ringstrukturen (Lin et al., Biorganic Med. Chem. Lett. 6: 2755, 1996). 3. Laktose sulfatiert an einer oder mehreren Positionen (Bertozzi et al., Biochemistry 34, 14 271, 1995). 4. Neutrale Disaccharide mit einer Etherbindung an eine Carbonsäuregruppe (Hiruma et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 9265, 1996). 5. Ein Monosaccharid (nicht notwendigerweise Fucose) verknüpft über multiple 5- oder 6-gliedrige Ringstrukturen an eine Carbonsäuregruppe, wobei wenigstens eine von den Ringstrukturen eine Phenylgruppe ist (Dupre et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6: 569, 1996). 7. Glycopeptide, umfassend eine Fucose oder ein ähnliches Monosaccharid, verknüpft über eine Vielzahl von Peptidbindungen mit einer Carbonsäure (Cappi et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996; Wang et al., Tetrahedron Lett. 37: 5427, 1996). 8. Tri- und Tetrasaccharide mit einer Vielzahl von Sulfatgruppen (Nelson et al., Blood 82: 3253, 1993). 9. Phosphorylierte oder hydroxylierte Cyclohexane, insbesondere Hexaphosphatidylinositol und Hexasulfatidylinositol (Cacconi et al., J. Biol. Chem. 269: 15060, 1994).
Viele Mono- und Disaccharide sind kommerziell erhältlich. Die Synthesen von komplexeren Kohlenhydratstrukturen für eine Bindung von Selektin werden extensiv im Fachbereich beschrieben und müssen hier nicht ausgearbeitet werden. Akademische Artikel von Interesse für den Leser können einschließen Tonne et al., (Tetrahedron 45: 5365, 1989); Drueckhammer et al., (Synthesis 499, 1989); Hindsgaul (Sem. Cell. Biol. 2: 319, 1991); Look et al., (Anal. Biochem. 202: 215, 1992); Ito et al., (Pure Appl. Chem. 65: 753, 1993); und DeFrees et al., (J. Am. Chem. Soc. 117: 66, 1995).
Die Konjugation von Kohlenhydraten auf Lipide kann durchgeführt werden durch jedwede etablierte oder abgeleitete synthetische Strategie, die geeignet ist, das Kohlenhydrat während der Konjugierung, wie erforderlich ist, zu schützen. Ein Verfahren ist es, eine durch N- Hydroxysuccinimid aktivierte Fettsäure mit einem Aminozucker wie Glucosamin oder Galactosamin zur Reaktion zu bringen. Falls ein Oligosaccharid-Lipid-Konjugat gewünscht wird, kann das Oligosaccharid zuerst synthetisiert werden unter Verwendung eines Aminozuckers als eine der Untereinheiten. Die Aminogruppe des Aminozuckers wird dann acyliert durch die aktivierte Fettsäure, um das Lipid-Oligosaccharid-Konjugat zu ergeben. Man muß bemerken, daß in einem Oligosaccharid die Aminozucker-Fettsäure-Konjugation sterisch mit der Bindung des gewünschten Ziels interferieren kann. Daher kann es wünschenswert sein, das Oligosaccharid durch das Dazwischensetzen von anderen Zuckeruntereinheiten zwischen das Aminozucker-Lipid-Konjugat und den Anteil des Saccharids, der als ein Ligand wirkt, auszudehnen. Zum Beispiel kann für sLex die Konjugation von Aminozucker-Fettsäure eine sterische Hinderung der Bindung einführen, falls der Aminozucker zu nahe an den Bindungseinheiten von sLex ist. Daher sollte das sLex ausgedehnt werden durch das Koppeln des Aminozuckers an die GlcNAc-Untereinheit von sLex über eine O-glycosidische Bindung anstatt daß der Aminozucker für die GlcNAc- Untereinheit substituiert wird, um eine sterischer Hinderung der Bindung zu vermeiden.
Ein anderes Verfahren unter Verwendung der Aminogruppe eines Aminozuckers ist es, eine Iodacetylgruppe auf der Aminogruppe einzuführen, gefolgt von einer Reaktion der Aminogruppe mit einer Thiol enthaltenden Verbindung (so wie Cystamin oder Cystein), welche zusätzliche funktionale Gruppen für eine weitere Derivatisierung enthält.
O-Glycoside werden leicht durch die Säure-katalysierte Kondensation eines Alkohols mit Monosacchariden wie Glucose oder Mannose gebildet. N-Fmoc-Ethanolamin kann an das reduzierende Ende von Glukose angefügt werden, gefolgt von der Entfernung des Schutzes der Aminogruppe mit Piperidin. Die freie Aminogruppe der Verbindung kann dann acyliert werden mit einer aktivierten Fettsäure, um ein Kohlenhydrat-Lipid-Konjugat zu bilden. Alternativ können Glycosylhalide (gebildet durch das zur Reaktion bringen eines Zuckers mit einer Halogensäure wie HCl) verwendet werden, wo eine nukleophile Ersetzung des Halogenids durch einen Alkohol das O-Glycosid bildet.
Ein anderes Verfahren schließt die Bildung von N-Glycosiden durch das zur Reaktion bringen eines Amins mit einem reduzierenden Zucker ein. Diese Reaktion wird leicht durchgeführt durch das zur Reaktion bringen des Zuckers, z. B. Glucose, mit einem Amin, z. B. Decylamin, bei Umgebungstemperatur für ~48 h. Alternativ wird das Erwärmen des Zuckers mit dem Amin, z. B. Stearylamin (in 2-3 molarem Überschuß) bei 80ºC in einer Ethanol/Wasser- Lösung hinreichen, um das N-Stearyl-Glycosid zu bilden (Lockhoff, Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 30: 1161, 1991). Um die Stabilität des N-Glycosids zu erhöhen, wird das Produkt peracetyliert, durch Rühren in 60% Pyridin/ 40% Essigsäureanhydrid bei 0ºC. Das peracetylierte Produkt wird dann in wasserfreiem Methanol gelöst, 1 M Natriummethoxid wird zugegeben, um den pH auf ~10) einzustellen, und die Mischung wird bei Raumtemperatur 3 h gerührt, um das N-Acetyl-N-glycosid zu ergeben.
Eine Ausweitung dieses Verfahrens der Einführung zusätzlicher Funktionalitäten über N- Glycoside schließt die Zugabe eines polyfunktionalen Amins zu dem Zucker ein. Zum Beispiel kann N-Allylamin zu einem Saccharid mit einem freien reduzierenden Ende zugegeben werden, gefolgt von der Reaktion der Allylgruppe, um einen geeigneten Anheftungspunkt für eine Fettsäure bereit zu stellen. Ein Fachmann wird erkennen, daß die in der Fig. 3 gezeigten Zucker-Konjugate geschaffen wurden durch das zur Reaktion bringen von N-Allylamin mit sLex-Analogem, gefolgt von einer Peracetylierung des N-Glycosids. Der Schutz der Hydroxylgruppen kann mit einer katalytischen Menge von Natriummethoxid entfernt werden, was in dem N-acetylierten N-Allylglycosid resultiert. Alternativerweise kann die Aminogruppe des N-Allylglycosids direkt mit einem Säurechlorid acetyliert werden (Lockhoff Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 30: 1161, 1991). Ein Mercaptoamin wie Cystamin kann dann an das N-Allylglycosid durch Bestrahlung mit UV-Licht angefügt werden (Roy et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1059, 1988), was in einem N-Glycosid mit einer freien Aminogruppe resultiert. Die freie Aminogruppe kann dann leicht an eine aktivierte Fettsäure wie den N-Hydroxysuccinimidester von 10,12-Pentacosadiynsäure gekoppelt werden, um den konjugierten Zucker zu ergeben.
Andere Verfahren der Anheftung von Fettsäuren oder anderen Lipiden an Kohlenhydrate können durchgeführt werden durch das Bilden geeigneter Thioglycoside oder C-Glycoside. Diese Verbindungen können dann weiter derivatisiert werden in einer Weise analog zu den Verfahren, die für die N-Glycoside verwendet wurden. Das C-Allyl-Glycosid von Neuraminsäure zum Beispiel wird leicht durch eine Reaktion von N-Acetylmannosamin und Natriumpyruvat in Gegenwart von NeuAc-Aldolase als Katalysator gebildet, um N- Acetylneuraminsäure zu ergeben. Die Behandlung der rohen Reaktionsmischung mit HCl-Gas in Ethanol ergibt einen Ethylester; dies wird gefolgt durch eine Reaktion mit Acetylchlorid, um ein Glycosylchlorid zu ergeben (dieser Schritt resultiert ebenfalls in der Acetylierung der Hydroxylgruppen). Die Reaktion dieses Glycosylchlorids mit Allyltributylzinn und einer katalytischen Menge von bis(Tributylzinn) unter UV-Bestrahlung (eine 450 Watt Hanovia Lampe, ausgestattet mit einem Pyrex Filter) ergibt ein C-Allylglycosid; die Acetylgruppen werden dann von den Hydroxylgruppen mit Natriumethoxid in Ethanol entfernt. Dies ergibt den Ethylester des C-Allylglycosids von Neuraminsäure (Nagy J. O. et al., Tetrahedron Letters 32: 3953, 1991).
In einer Weise analog zu dem vorausstehend für die N-Allylglycoside beschriebenen Reaktionsschema kann das C-Allylglycosid eines Zuckers mit Cystamin zur Reaktion gebracht werden, was in der Anfügung der Thiolgruppe an die Allylgruppe resultiert, gefolgt von der Reaktion der Aminogruppe mit einer aktivierten Fettsäure.
Die Konjugation eines Kohlenhydrats an ein Lipid über eine Amidbindung kann durchgeführt werden, falls das Kohlenhydrat eine freie Carboxylgruppe hat. Das Mischen des Kohlenhydrates und von 2-(2-(2-(2-Azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)-ethanamin und das Aktivieren der Carboxylgruppe durch die Verwendung von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimid (EDC) und 1-Hydroxxybenzotriazol (HOBt) in Methylenchlorid, gefolgt von einer Reduktion der Azidogruppe zu einem Amin mit H&sub2;/Pd(OH)&sub2;/C in Ethanol/Wasser/- Dioxan/Essigsäure (2 : 1 : 2 : 1), ergibt ein Amin-derivatisiertes Kohlenhydrat, welches dann an eine Fettsäure durch eine Vielzahl von aktivierenden Chemien gebunden werden kann (Lin et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett. 6: 2755, 1996).
Kohlenhydrate können ebenfalls an Lipide unter Verwendung von enzymatischen Verfahren konjugiert werden. Zucker können transphosphatidyliert werden durch das zur Reaktion bringen von Diacylphosphatidylcholin und dem Zucker in Gegenwart von Phospholipase D, was in dem Diacylphosphatidyl-Zucker resultiert (Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 115: 10 487, 1993).

Zusammenbau der Lipid Zusammensetzung:

Geeignet derivatisierte Lipide werden kombiniert, zu einer geeigneten Zusammensetzung gebildet und kreuzvernetzt.
Wo geeignet, schließt der Kombinationsschritt das Mischen von Lipiden mit dem Kohlenhydrat-Erfordernis für die Selektinbindung mit Lipiden mit dem anionischen Erfordernis ein. Zusätzliche Lipide können ebenfalls aus einer Vielzahl von Zwecken eingeschlossen werden. Die zusätzlichen Lipide können ein anderes Kohlenhydrat haben, oder sie können Gerüst- Lipide sein, die an der Kreuzvernetzung teilnehmen aber keine Bindungsdeterminate haben, oder sie können Füll-Lipide sein, die keine kreuzvernetzenden Gruppen haben. Nicht kreuzvernetzte Lipide können entweder die Kohlenhydrat-Determinante tragen oder die anionische Determinante oder beide und in der Zusammensetzung stabilisiert werden durch das Einfangen zwischen anderen kreuzvernetzten Lipiden.
Die Lipide werden dann zu einer Lipid-Zusammensetzung gebildet. Obwohl die Lipid- Zusammensetzungen am typischsten Liposomen sind, kann jedwede andere Anordnung verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie dem beabsichtigten Wirkort zuführbar ist und die Determinanten, die für eine Selektinbindung notwendig sind, aufweist. Die teilnehmenden Lipide sind kreuzvernetzte Mitglieder einer Lipidschicht, aber die Lipidschicht muß nicht Teil einer Lipiddoppelschicht sein. Micellen und Mikrotropfen sind Beispiele für alternative partikuläre Formen, geeignet für das Aufweisen der Bindungsdeterminanten. Eine einzelne Lipidschicht kann ebenfalls über einem hydrophoben Kern einer geeigneten aliphatischen Verbindung gebildet werden. Lipid kann ebenfalls ausgesät werden als eine einzelne Schicht oder eine Doppelschicht über einer anderen Kernsubstanz, wie einem Proteinkomplex. Jedwede Beschreibungen in dieser Offenlegung, die sich auf Liposomen beziehen, finden ebenfalls Anwendung für andere Typen von Lipid-Zusammensetzungen, falls nicht anders erforderlich.
Liposomen sind die gewöhnlichere Form der Zusammensetzung wegen ihrer Einfachheit bei der Herstellung. Eine Anzahl von Verfahren ist im Fachbereich für die Herstellung von Liposomen verfügbar. Der Leser wird verwiesen auf Gregoriadis (Hrsg.): "Liposome technology 2nd ed. Vol I Liposome preparation and related techniques", CRC Press Boca Raton, 1993; Watwe et al., (Curr. Sci. 68: 715, 1995), Vernuri et al., (Pharm. Acta Helvetiae 70: 95, 1995), und die U.S.-Patente 4 737 323; 5 008 050 und 5 252 348. Häufig verwendete Techniken schließen die Hydratation einer Lipidschicht, die Injektion, die Beschallung und Tensid-Dialyse ein. Wenn Diyn-Chemie und einzelkettige Fettsäuren für die Kreuzvernetzung verwendet werden, ist ein bevorzugtes Verfahren die Beschallung, wie in einem der Originalartikel beschrieben (Hub et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 19: 938, 1980). Dieses Verfahren ist einfach zu verwenden und erzeugt unilamellare sphärische Vesikel von kleiner und einheitlicher Größe. Kurz gesagt, es wird eine dünne Schicht von Lipid mit Wasser oberhalb von 90ºC erwärmt und dann auf etwa 4ºC abgekühlt, welches unterhalb von der Tc ist (Lopez et al., Biochim. Biophys. Acta 693: 437, 1982), um es den Lipiden zu gestatten, einen "fest-analogen" Zustand zu bilden. Die Mischung wird dann einige Minuten lange beschallt, wobei längere Zeiten (~15 min) typischerweise einheitlichere Vesikel erzeugen.
Nach der Bildung können die Vesikel in der Größe reduziert werden, falls gewünscht durch Einfrier-Auftau-Zyklen oder durch Extrudieren durch Filter von kleiner werdender Porengröße. Vesikel jedweden Durchmessers sind innerhalb des Umfangs dieser Erfindung eingeschlossen, aber sie sind bevorzugtermaßen kleiner als etwa 400 nm im mittleren Durchmesser, und mehr zu bevorzugen kleiner als etwa 200 nm im Durchmesser. Die Vesikel kleinerer Größe können steril filtriert werden und sind weniger empfänglich für eine Aufnahme durch phagozytierende Zellen.
Die in jedweder dieser Zusammensetzungen verwendeten Lipide werden mit funktionalen Gruppen präpariert worden sein, welche kovalent kreuzvernetzt werden können, wenn die Lipidschicht einmal gebildet ist.
Im Fachbereich sind verschiedene Vorgehensweisen für ein kovalentes Kreuzvernetzen von Lipiden bekannt. Eine Polymerisation kann durchgeführt werden durch eine Bestrahlung mit ultraviolettem Licht oder durch eine Radikal-Initiation mit Verbindungen wie Wasserstoff- oder Benzoylperoxid, wie geeignet, von Lipiddiynen, Styrol enthaltenden Lipiden, Acryl enthaltenden Lipiden und Lipiddienen; eine Polymerisation (durch das Bilden von Amidbindungen) von Lipiden, welche freie (nicht geschützte) Amin- und Carboxylgruppen enthalten; und Polymerisation (durch die Oxidation von Thiolgruppen) von Thiol enthaltenden Lipiden (worin jedes Lipid wenigstens zwei Thiolgruppen enthalten muß, um kreuzvernetzt zu werden). Azide, Epoxide, Isocyanate und Isothiocyanate und Benzophenone leisten ebenfalls Verfahren der Kreuzvernetzung von Lipiden (Wong 5.5., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, Boston: CRC Press, 1993; Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, San Diego. Academic Press, 1996).
Ein Beispiel der Polymerisation von Lipiden durch die Bindung von Amidbindungen ist die Polymerisation von N-&epsi;-Palmitoyl-L-lysin-N-β-(2-acetylamino-2-deoxy-ß-glucopyranosyl)-L- asparagin durch Carbodiimide. Das Kohlenhydrat-, Lipid-modifizierte Dipeptid wird leicht durch Standardverfahren der Fest-Phasen-Peptidsynthese zusammengebaut unter Verwendung von kommerziell erhältlichem N-α-Fmoc-N-β-(3,4,6-Tri-O-acetyl-2-(acetylamino)-2-deoxyβ-glucopyranosyl)-L-asparagin (von Novablochem) und von N-α-Fmoc-N-&epsi;-palmitoyl-L-lysin (welches leicht synthetisiert wird durch das Koppeln von Palmitinsäure, aktiviert mit N- Hydroxysuccinimid, an das freie &epsi;-Amino von kommerziell erhältlichem N-α-Fmoc-L-lysin). Die Entfernung des modifizierten Dipeptids von dem Fest-Phase-Harz und die Entfernung des Schutzes der funktionalen Gruppen wird durch Standardverfahren durchgeführt. Das Kohlenhydrat- Lipid-modifizierte Dipeptid kann mit einem zweiten Dipeptid kopolymerisiert werden, N-&epsi;-Palmitoyl-L-lysin-L-asparaginsäure, um ein Liposom sowohl mit Kohlenhydrat tragenden als auch mit negativ geladenen Gruppen auf seiner Oberfläche bereit zu stellen.
Ein Beispiel für die Polymerisierung von Lipiden durch die Oxidation von Thiolgruppen ist wie folgt: 10-Undecensäure (10-Undecylensäure) wird durch die Zugabe von HBr durch eine Markonikov-Addition über die Doppelbindung bromiert, resultierend in 10-Bromundecansäure (Streitweiser et al., Introduction to Organic Chemistry, New York, Macmillan: 1976, 5. 278-285). 10-Thioundecansäure wird hergestellt durch die Behandlung von 10-Brom- undecansäure mit Thioharnstoff in Ethanol und nachfolgender Hydrolyse durch wäßriges NaOH (Streitweiser et al., Introduction to Organic Chemistry, New York, Macmillan: 1976, S. 242-243). Das Thiol wird dann mit der Tritylgruppe geschützt durch Erwärmen mit Triphenylmethanol und Bortrifluoridetherat in Eisessig, gefolgt von Aufarbeitung mit Ethanol, Wasser und pulverförmigem Natriumacetat (Bodanszky ci crl., The Practice of Peptide Synthesis, New York: Springer-Verlag, 1984, S. 83). Die geschützte Thiolfettsäure wird dann aktiviert mit N-Hydroxysuccinimid und zur Reaktion gebracht mit S-Trityl-L- cystein (Novablochem). Das Fettsäure-Aminosäure-Konjugat wird dann mit Trifluoressigsäure behandelt, um die Tritylgruppen zu entfernen, was in N-(10'-Thioundecanoyl)-cystein resultiert. Das Dithiol kann dann durch eine Oxidation mit molekularem Sauerstoff polymerisiert werden.
Zusätzliche Beispiele für Lipide, die kreuzvernetzt werden können, werden in Ringsdorf et al., Angew. Chemie Int. Ed. Engl. 27: 113-158 (1988) in einem Übersichtsartikel dargestellt, und die Referenzen darin, und Johnston D. S., et al., "Polymerized Liposomes and Vesicles", Kapitel 9 in Liposome Technology, Bnd. 1 (G. Gregoriadis, Hrsg.), Boca Raton, Florida: CRC Press 1984, S. 123-129 und Referenzen darin.
Ein bevorzugtes Verfahren der Polymerisation von Lipiden ist durch die Polymerisation von Lipid-Diynen wie 10,12-Pentacosadiynsäure (Farchan Laboratories, Gainesville, FL) durch ultraviolettes Licht. Polymerisationsreaktionen von Diacetylenverbindungen wurden extensiv studiert und wurden bei der Bildung von polymerisierten Liposomen, Micellen und anderen supramolekularen Ansammlungen verwendet (siehe Frankl et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 7436, 1991; Furhop et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 7437-7439, 1991, Spevak et al., Advanced Materials 7: 85, 1995). Diyne sind zweckmäßig, weil sie einfach unter Verwendung von UV- Licht polymerisiert werden, was den Bedarf für einen Radikal-Initiator vermeidet. Zusätzlich ist das polymerisierte Lipid gefärbt und der Grad der Polymerisation kann einfach überwacht werden.
Ein Beispiel für die Herstellung eines kreuzvernetzbaren Diacyl-Lipids, 1,2,3-Triamino-(bis- N1, N3-pentacosa-10,12-diynoyl)propan ist wie folgt. Die t-Butyloxycarbonyl- (Boc) -gruppe wird verwendet, um die Aminogruppe von 2-Amino-1,3-Propandiol zu schützen. Das Diol wird in ein Dimesylat mit Mesylchlorid umgewandelt, gefolgt von einer sofortigen Reaktion mit Tetrabutylammoniumazid in DMF. Die Azidgruppen werden in Amine umgewandelt durch eine Reaktion mit PtO&sub2;/H&sub2;. Die Verbindung wird dann zur Reaktion gebracht mit dem N-Hydroxysuccinimid-derivat von 10,12-Pentacosadiynsäure. Schließlich wird die Boc- Gruppe mit Trifluoressigsäure entfernt, um das 1 N, 3 N-bis-(10,12-Pentacosadiynoyl)-1,2,3- triaminopropan zu ergeben.
Die Lipide der Zusammensetzung werden durch eine Aktivierung, die dem Typ der Polymerisationschemie, die verwendet wird, angemessen ist, kreuzvernetzt. Diyn-Lipide werden durch UV-Bestrahlung kreuzvernetzt, wie ursprünglich beschrieben (Hub et al., supra), wobei die sichtbare Absorption überwacht wird, um dem Reaktionsverlauf zu folgen, welcher gewöhnlich nach 20-60 min vollendet ist. Freie Radikal-Initiatoren, wo verwendet, werden aus der Präparation nach der Polymerisierung durch eine geeignete Technik wie Dialyse entfernt.

Eigenschaften der polymerisierten Lipid-Zusammensetzung

Einer der Vorteile der kreuzvernetzten Zusammensetzungen ist die Einfachheit mit welcher verschiedene Substituenten auf die Selektin-Bindung geskreent und titriert werden können. Der optimale Anteil einer bestimmten Kohlenhydrat-Determinante und einer bestimmten anionischen Determinante wird empirisch bestimmt, durch die Titrierung eines jeden Substituenten in die Zusammensetzungen und das Durchführen eines geeigneten Selektin- Aktivtätsassays. Diese Vorgehensweise wird weiter in den Beispielen 2 und 3 erläutert.
Der Anteil von Lipiden, welche ein komplexes Oligosaccharid wie sLex tragen, ist bevorzugtermaßen zwischen etwa 1% und 25% bevorzugtermaßen etwa 2% bis 10% optimalerweise etwa 5%. Niedrige Werte sorgen wahrscheinlich nicht für eine hinreichende Valenz, während man glaubt, daß höhere Werte sterische Probleme sowohl für die Polymerisierung als auch für die Zugänglichkeit für eine Bindung schaffen. Der Anteil an Lipiden, welche die elektronegative Determinante tragen, hängt von der Stärke der Determinante ab. Für viele Anwendungen ist es nicht schädlich, ein Hydroxyl- oder Carboxyl-Lipid für den Ausgleich des Lipids in der Schicht zu verwenden. Stärkere Säuren können jedoch eine größere Sorgfalt erfordern. Ein übermäßiger Anteil an Sulfat oder an Phosphat kann der Zusammensetzung eine inhibitorische Aktivität für andere biologische Reaktionen verleihen, insbesondere für diejenigen, welche durch in hohem Maße geladene Moleküle wie Heparin inhibiert werden. Wo dies ein Thema ist, kann der Anteil solcher Säuren auf einen Bereich herunter titriert werden, von etwa 1% bis 50% oder 1% bis 10% oder 0,5% bis 2%, wie angemessen.
Der Grad der Polymerisation zwischen Lipiden in der Lipidschicht ist ein Faktor des Anteils von Lipiden, welche kreuzvernetzbare Substituenten haben, und der Vollständigkeit der Polymerisationsreaktion. Der Fachmann kann die Menge der Polymerisation durch den Einschluß von Lipiden in der Präparation limitieren, welche nicht an der Kreuzvernetzung teilnehmen werden. Während nicht beabsichtigt wird, durch Theorie gebunden zu werden, ist es eine Hypothese dieser Offenlegung, daß die Synergie zwischen den Kohlenhydrat- und den anionischen Komponenten teilweise durch die Steifheit der polymerisierten Lipidstruktur verliehen wird. Es wird empfohlen, daß wenigstens 25%, bevorzugtermaßen 50%, mehr zu bevorzugen 75% und noch mehr zu bevorzugen 90%, sogar noch mehr zu bevorzugen 95% und noch immer mehr zu bevorzugen fast 100% der Lipide in der Schicht kreuzvernetzt sind.
Die gesamte Schicht soll in eine Einheit polymerisiert sein oder in separate Flecken oder Platten.
Wo ein Anteil von nicht reaktiven Lipid als ein Füllmittel eingeschlossen ist, um den Grad der Kreuzvernetzung zu reduzieren, sind die Kohlenhydratdeterminante und die anionische Determinante typischerweise auf dem kreuzvernetzten Lipid anstatt auf dem Fülllipid. Die umgekehrte Anordnung ist jedoch möglich, insofern als das Fülllipid durch die benachbarten Kreuzvernetzungen eingefangen wird. Daher werden in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung entweder die Kohlenhydrat-Determinante oder die anionische Determinante für die Selektinbindung oder beide durch nicht kreuzvernetzte Lipide, die in einer Lipidschicht vorhanden sind, welche andere Lipide, die kreuzvernetzt sind, umfaßt, bereit gestellt. Diese Vorgehensweise ist insbesondere angemessen, wenn Glycosphingolipide verwendet werden, um der Kohlenhydrat-Determinante zu genügen. Bevorzugte Lipide dieses Typs sind Sulfoglucuronylglycosphingolipide (Needham et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 1359, 1993).
Beide, Kohlenhydratgruppen und elektronegative Gruppen, werden wahlweise in das Lipid über eine Spacergruppe konjugiert. Wie aus den zuvor beschriebenen synthetischen Methoden bereits eingeschätzt werden wird, sorgen Kohlenwasserstoffspacer von etwa 2 Kohlenstoffen in der Länge für eine zweckmäßige Vorgehensweise bei der Konjugation. In bestimmten Ausführungsformen sind die Spacergruppen Polyethylenglycole, welche das Verborgensein der Liposomen vor der Aufnahme durch reticuloendotheliale Zellen verbessern. Da die anionische Gruppe und die Kohlenhydratgruppe gemeinsam arbeiten müssen, sollte die Länge der Arme der Spacer passen. Man glaubt, daß die Potenz von polymerisierten Lipidzusammensetzungen teilweise von der strukturellen Steifigkeit herrührt und viele Ausführungsformen haben Spacer von einer minimalen Länge.
In bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung hat ein Anteil der Lipide in der Lipidschicht ein erstes gebundenes Saccharid, und ein separater Anteil der Lipide hat ein zweites gebundenes Saccharid, welches von dem ersten verschieden ist. Die zwei Glycolipide sind bevorzugtermaßen Teil der kreuzvernetzten Struktur. Ausführungsformen, wo es eine höhere Pluralität verschiedener unabhängig konjugierter Saccharide gibt, werden betrachtet. Jedwede Kombination von Lipiden in dieser Anordung, welche das Kohlenhydrat bindende Erfordernis von Selektinen erfüllt, ist geeignet. In einem Beispiel ist das erste gebundene Kohlenhydrat ein saures Monosaccharid wie Sialinsäure oder ein ähnlicher Zucker und das zweite Kohlenhydrat ist Fucose oder ein ähnlicher Zucker. Die Kombination von Lipiden, die mit verschiedenen Monosacchariden oder Disacchariden oder deren Analoga konjugiert sind, sind von kommerziellem Interesse wegen der Einfachheit ihrer Synthese.
Polymerisierte Liposomen dieser Erfindung können auf der Basis ihrer Potenz in verschiedenen Testassays, die im Fachbereich bekannt sind, klassifiziert werden. Zum Beispiel sind, wenn sie für die Inhibition der Bindung von isoliertem Selektin an Zellen, welche einen Selektinliganden wie PSGL-1 exprimieren, getestet werden, die Liposomen bevorzugtermaßen in der Lage, die Bindung in einer Weise zu inhibieren, welche 50% maximale Inhibition (IC&sub5;&sub0;) bei einer Konzentration von nicht mehr als etwa 10 uM erreicht, bevorzugtermaßen nicht mehr als etwa 1 uM, immer noch mehr zu bevorzugen nicht mehr als etwa 100 nM und sogar noch mehr zu bevorzugen nicht mehr als etwa 10 nM Äquivalente Oligosaccharid. Ein bevorzugter Bindungsassay dieses Typs verwendet HL-60-Zellen wie in dem Beispiel 2 erläutert ist. Polymerisierte Liposomen können ebenfalls kategorisiert werden in jedwedem Assay auf der Basis der relativen IC&sub5;&sub0; im Vergleich zu einem geeigneten Standard. Der Standard kann ein Oligosaccharid sein, welches unkomplexiert Liposomen präsentiert wird oder in einer monomeren Form, so wie sLex oder sLex-Analoges. Der Standard kann ebenfalls ein Liposom ohne Oligosaccharid sein aber sonst mit derselben Lipid-Zusammensetzung oder ein Liposom, welches mit 100% Carboxy-terminierten oder Hydroxy-terminierten Lipiden gemacht ist. In bestimmten Ausführungsformen haben die polymerisierten Liposomen eine IC&sub5;&sub0;, welche bevorzugtermaßen 10²-fach geringer ist, mehr zu bevorzugen 10³-fach geringer, mehr zu bevorzugen 10&sup4;-fach geringer, immer noch mehr zu bevorzugen, etwa 10&sup5;-fach geringer und sogar noch mehr zu bevorzugen etwa 10&sup6;-fach geringer als diejenige des Standards.
Diese Erfindung schließt ebenfalls Ausführungsformen ein, welche selektiv sind für P- und L- Selektin im Vergleich zu E-Selektin oder selektiv sind für P- oder L-Selektin im Vergleich zu den anderen beiden Selektinen. Ein polymerisiertes Liposom ist selektiv, falls es eine IC&sub5;&sub0; in einem Assay für die Inhibierung eines Selektins hat, welche höher ist als seine IC&sub5;&sub0; in einem Assay für die Inhibierung eines anderen Selektins. Ein Assay wird bevorzugtermaßen für diese Bestimmung verwendet, der es dem bestimmten Selektin gestattet, die einzige Variable zu sein. Der HL-60-Selektin-Bindungsassay, der in dem Beispiel 1 herausgestellt wird, kann für den Vergleich von P- und E-Selektin-Inhibition verwendet werden unter Verwendung derselben Zellen und dem Austausch der Chimären. In einer ähnlichen Weise bindet das plattierte Mucin in dem in dem Beispiel 3 beschriebenen ELISA eine Chimäre von jedwedem der drei Selektine und kann verwendet werden, um die inhibitorische Kapazität einer bestimmten Zusammensetzung für alle drei Selektine zu vergleichen. Selektive Inhibitoren haben bevorzugtermaßen eine IC&sub5;&sub0;, die etwa 5-fach höher für das Ziel-Selektin im Vergleich zu dem anderen Selektin ist. Mehr zu bevorzugen ist sie 25-fach höher, immer noch mehr zu bevorzugen ist sie 100-fach höher.
Inhibitoren, die selektiv sind für P- und/oder L-Selektin sind von besonderem Interesse wegen neuerer Beobachtungen, daß E-Selektin-Antagonisten zu Bedingungen führen können, die an Erkrankungen einer Leukozytenadhäsionsdefizienz erinnern (LAD-2), wo Neutrophile nicht normal an Endothelgewebe anhaften und wiederkehrende bakterielle Infektionen der Lunge, der Haut und des Zahnfleischgewebes häufig sind. Das Beispiel 3 stellt Illustrationen von selektiven polymerisierten Liposomen bereit. Nicht sulfatierte Zucker wie sLex und die neutralen Disaccharide Laktose und Maltose sind selektiv für L- und P-Selektin, wenn sie in dem Kontext von Carboxy-terminierten Lipiden präsentiert werden. sLex ist ebenfalls selektiv in dem Kontext von Hydroxyl-terminierten Lipiden. Liposomen mit Sulfatgruppen, entweder auf Sulfo-Lex oder auf einem Lipid in Kombination mit sLex waren nicht selektiv.
Ebenfalls eingeschlossen sind Ausführungsformen, die entworfen sind, um die Bindung an multiple Selektine zu optimieren. Diese Zusammensetzungen können eine Mehrzahl von verschiedenen Kohlenhydraten und eine Mehrzahl von verschiedenen Anionen oder elektronegativen Gruppen auf separaten Lipiden haben.

Testen der polymerisierten Lipid-Zusammensetzungen

Testen in vitro und Optimieren der Zccsammensetzung:

Assays für die Bestimmung der Fähigkeit einer polymerisierten Lipid-Zusammensetzung, Selektin-Liganden aufzuweisen, können klassifiziert werden entweder als direkte Bindungsassays oder als Inhibitionsassays.
Direkte Bindungsassays werden durchgeführt, indem man der Zusammensetzung gestattet direkt entweder mit einem Selektin oder mit einer Zelle, welche ein Selektin exprimiert, wechselzuwirken. Eine Lipidschicht, welche verschiedenartige Selektin bindende Testdeterminanten enthält, kann direkt auf einem Mikroskop-Objektträger polymerisiert werden (Spevak et al., Adv. Mater. 7: 85, 1995) und mit Selektin titriert, oder umgekehrt kann das Selektin auf die Mulden bzw. Wells einer Mikrotiterplatte beschichtet werden und mit markierten, polymerisierten Lipidpartikeln titriert werden. Polymerisierte Partikel können ebenfalls auf eine direkte Bindung an Zellen, welche Selektin-Liganden exprimieren, wie HL- 60-Zellen, getestet werden.
Da die meisten der Anwendungen für polymerisierte Liposomen gemäß dieser Erfindung eine Inhibition einer Bindung zwischen Selektinligand-Rezeptor-Paaren betrifft, ist es üblicher, Zusammensetzungen in Inhibitionsassays zu entwickeln und zu testen.
Die Inhibitionskapazität kann in zellfreien Assays getestet werden, wo ein Partner des Selektinliganden-Rezeptor-Paares an eine feste Oberfläche gekoppelt ist und der zweite für die Bindung in Gegenwart des potentiellen Inhibitors präsentiert wird. Nach dem Waschen wird die Menge des gebundenen zweiten Partners quantifiziert mittels eines zuvor · gebundenen oder anschließend gebundenen Markierungssystems. Dieser Typ eines Assays ist zweckmäßig für vergleichendes Skreening einer Anzahl von unterschiedlichen Lipid- Zusammensetzungen, die zum Beispiel verschiedene Kohlenhydrat- und anionische Determinanten aufweisen.
Viele der augenblicklichen zellfreien Selektin-Assay-Systeme verwenden Selektinchimären, in welchen ein N-terminaler Anteil des Selektins, welcher die Bindungsdomäne umfaßt, an ein zweites Proteinfragment fusioniert ist, welches als ein Anheftungsmittel für ein Markierungssystem verwendet werden kann. Ein häufig verwendetes zweites Fragment ist eine IgG-Fc-Region, welche dann unter Verwendung von einem mit Protein A oder anti-Fc gemachten Konjugat nachgewiesen werden kann. Die Konstruktion von Chimären und verwandten Assays wird von Watson et al., (J. Cell. Biol. 115: 235, 1992), Aruffo et al., (Cell. 67: 35, 1991), und Foxall et al. (J. Cell Biol. 117: 895, 1992) beschrieben.
Eine Erläuterung eines bequemen zellfreien Assays ist der L-Selektin-ELISA, der in Bertozzi et al., (Biochemistry 34: 14 275, 1995) beschrieben wird. Kurz gesagt, wird eine rohe Präparation von GlyCAM-1 aus Mäuseserum erhalten. Mikrotiterplatten werden mit polyklonalem Antikörper, der spezifisch für das Peptid-Rückgrat des Mucins ist beschichtet, mit dem Mucin überschichtet und dann gewaschen. Eine Chimäre von L-Selektin, fusioniert an Fc wird mit biotinyliertem F(ab')&sub2;-anti-Fc komplexiert, welches wiederum an ein Streptavidin-Alkalische-Phosphatase-Konjugat komplexiert wird. Das kombinierte Konjugat wird mit dem potentiellen Inhibitor 30 min lang vorinkubiert, dann auf die Mulden der Mikrotiterplatten transferiert. Nach 30 min bei Raumtemperatur werden die Mulden gewaschen und mit dem Enzymsubstrat entwickelt. In einer Variation dieses Typs eines Assays werden Ersatzstoffe für Selektin-Liganden wie Sulfatide verwendet, welche direkt auf die Platte beschichtet werden können. In einer anderen Variation ist das feste Substrat ebenfalls ein polymerisiertes Lipid (Spevak et al., Adv. Mater. 7: 85, 1995), welches Determinanten exprimiert, die wenigstens genau so potent für eine Bindung von Selektin sind wie die als Inhibitoren getesteten Zusammensetzungen.
Jenseits der anfänglichen Skreening-Stufe werden Ein-Zell oder Zwei-Zell-Bioassays bevorzugtermaßen während der Entwicklung von Zusammensetzungen verwendet, da sie repräsentativer für eine Inhibition in einem biologischen System sind.
Ein zweckmäßiger Ein-Zell-Assay für P-Selektin-Inhibitoren verwendet HL-60-Zellen, die von der ATCC erhältlich sind. HL-60 exprimieren natürlicherweise das Antigen PSGL-1 mit etwa 36 000 Stellen pro Zelle (Ushiyama et al., J. Biol. Chem. 268: 15 229, 1993). Der Assay wird in Brandley et al., (Glycobiol. 3: 633, 1993) beschrieben. Kurz gesagt, wird eine E- oder P-Selektin-Chimäre mit biotinyliertem Ziege-F(ab')anti-human IgG-Fe und einem Konjugat von Alkalischer-Phosphatase-Streptavidin 30 min lang inkubiert. Dieser Komplex wird dann mit potentiellen Inhibitoren für ~45 min bei 37ºC inkubiert. 50 ul der Mischung werden zu jeder Mulde von Rundboden-Mikrotiterplatten, die zuvor mit BSA geblockt worden sind, zugegeben. Eine gleiche Menge einer HL-60-Zell-Suspension wird zugegeben und die Platte wird 45 min bei 4ºC inkubiert. Die Zellen werden auf die Böden der Mulden durch eine Zentrifugation pelletiert, gewaschen und entwickelt unter Verwendung von p- Nitrophenylphosphat.
Andere Ein-Zell-Assays werden mit Zellisolaten anstelle von Zelllinien durchgeführt. Die Fähigkeit, die Adhäsion von Neutrophilen an gereinigtes P-Selektin, welches auf Plastik- Vertiefungen immobilisiert ist, zu inhibieren, kann bestimmt werden unter Verwendung des von Geng et al., (Nature 343: 757, 1990) beschriebenen Assays. Kurz gesagt, werden humane Neutrophile aus Heparin-Gesamtblut isoliert durch eine Dichtegradientenzentrifugation auf Mono-PolyTM auflösendem Medium (Flow Laboratories) und in Hank's balancierter Salzlösung, die Ca&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus; und humanes Serumalbumin (HBSS/HSA) enthält, suspendiert. P- Selektin wird erhalten durch rekombinante Expression oder isoliert von überalterten Lysaten humaner Plättchen durch eine Immunaffinitätschromatographie auf Antikörper-S12-Sepharose und Ionenaustauschchromatographie auf einer Mono-QTM-Säule (U.S.-Patent 5 464 935). Das P-Selektin wird auf Mikrotiterplattenvertiefungen mit 5 ug/ml aufbeschichtet. Die Zellen werden mit ~2 · 10&sup5; pro Mulde zugegeben, bei 22ºC 20 min lang inkubiert. Die Vertiefungen werden dann mit HBSS/HSA gefüllt, mit Azetatband versiegelt und zentrifugiert. Nach dem Verwerfen der nicht adhärenten Zellen und der Überstände werden die Inhalte von jeder Mulde solubilisiert mit 0,5% Hexadecyltrimethylammoniumbromid in Phosphatpuffer und auf Myeloperoxidase-Aktivität hin getestet (Ley et al., Blood 73: 1324, 1989).
Zwei-Zell-Adhärenz-Assays werden durchgeführt durch das Testen der Fähigkeit einer Zusammensetzung mit der Anheftung von einer Zelle mit einem Selektin an eine andere Zelle mit einem Liganden für das Selektin zu interferieren. Eine Erläuterung verwendet COS- Zellen, transfiziert, um das geeignete Selektin zu exprimieren (siehe allgemein Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8473, 1987). Transfizierte Zellklone werden auf ihre Fähigkeit selektiert, die Adhäsion von HL-60-Zellen zu unterstützen. Die Klone werden dann expandiert und in kleinen Mulden- bzw. Well-Kulturplatten als ein Substrat für den Assay gezogen. Ein anderes geeignetes Substrat sind humane Endothelzellen der Nabelschnurvenen (HUVEC) erhältlich von Cell Systems Inc., und stimuliert mit 100 U/ml IL-1β während 4 h (Martens et al., J. Biol. Chem. 270: 21 129, 1995). HL-60-Zellen werden durch die Inkorporierung von 3,7 · 10&sup4; Bq (1 uCi)/ml [³H]-Thymidin oder 10 ug/ml Calcein markiert. Der mögliche Inhibitor wird mit den markierten HL-60-Zellen vorinkubiert, den Substratzellen präsentiert und dann werden die Mulden bzw. Wells gewaschen und gezählt.
Die Lymphozytenadhärenz kann bestimmt werden durch die Verwendung des Gefrierschnittassays, der ursprünglich von Stamper et al., (J. Exp. Med. 144: 828, 1996) beschrieben wurde, seither modifiziert von Stoolman et al., (J. Cell Biol. 96: 722, 1988), Arbones et al., (Immunity 1: 247, 1994), und Brandley et al., (supra). Kurz gesagt werden Lymphozyten der Lymphknoten des Mesenteriums der Maus oder Milzzellen mit CMFDA fluoreszenzmarkiert und mit dem Testinhibitor für ~30 min bei 0ºC inkubiert. Die Lymphozytensuspension wird dann auf Gefrierschnitten von 10 um von Lymphknoten des Mesenteriums oder peripheren Lymphknoten aufbeschichtet (~3 · 10&sup4; Zellen/Schnitt) und auf Eis während 30 min auf einem rotierenden Apparat inkubiert. Die Suspension wird sanft von dem Objektträger ablaufen gelassen und die Schnitte werden mit 3% Glutaraldehyd fixiert und mit Acridinorange gegengefärbt. Fucoidan kann als eine Positivkontrolle für die Inhibition verwendet werden. Die in diesem Assay beobachtete Adhärenz ist einer L-Selektin-Bindung zuschreibbar.
Leukozyten-Fluß- (Roll-Zell-) Assays werden in Martens et al., (supra) ebenfalls beschrieben. Neutrophile werden von venösem Blut durch Dextransedimentation und Ficoll-HypaqueTM- Zentrifugation isoliert. HUVEC werden durch eine Kollagenasebehandlung geerntet, auf mit 0,1% Gelatine beschichteten Flaschen plattiert und kultiviert. Eine HUVEC-Monoschicht wird auf die Flußkammer montiert und 2 min lang mit Calcium und Glucose enthaltendem Puffer perfundiert. Die isolierten Neutrophilen werden mit dem Testinhibitor in demselben Puffer vorinkubiert. Die Suspension der Neutrophilen wird dann über die HUVEC- Monoschicht passagiert bei einer Wand-Scherbeanspruchung von ~1,85 Dyn/cm². Die Wechselwirkung wird auf Video aufgenommen während etwa 10-20 min unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops und ein bildgebendes Softwareprogramm wird verwendet, um die durchschnittliche Anzahl von Neutrophilen, die auf der Monoschicht rollen, in einigen verschiedenen Ansichtsfeldern zu bestimmen.

Testen in vivo:

Tiermodelle für verschiedenarige Erkrankungen mit einer inflammatorischen oder einer immunologischen Ätiologie sind im Fachbereich bekannt und können zum Tragen gebracht werden bei dem Testen von jedweder Zusammensetzung, die eine vielversprechende Selektin inhibierende Wirkung zeigt. In Modellen von hyperakuter Erkrankung wie Reperfusionsverletzung, wird die Zusammensetzung typischerweise innerhalb von Minuten oder Stunden des einleitenden Ereignisses verabreicht, um eine klinische Umgebung zu simulieren. In Modellen von einer chronischen Erkrankung wird die Zusammensetzung typischerweise in regelmäßigen Perioden von einer Woche oder mehr während der Phase der Progression verabreicht. Das Tier wird durch zelluläre und klinische Kriterien auf die Fähigkeit der Zusammensetzung hin, die Bedingung zu lindern, bewertet.
Unter den Modellen, die für das Testen von Selektininhibitoren geeignet sind, sind die folgenden: Die Herz-Ischämie-Reperfusionsmodelle von Weyrich et al., (J. Clin. Invest. 91: 2620, 1993) Murohara et al., (Cardiovasc. Res. 30: 965, 1995), Ma et al., (Circulation 88: 649, 1993); Tojo et al., (Glycobiology 6: 463, 1996) und Garcia-Criado et al., (J. Am. Coll. Surg. 181: 327, 1995), das Herzinfarktmodell von Silver et al., (Circulation 92: 492, 1995); die Lungen-Ischämie-Reperfusions- Modelle von Steinberg et al., (J. Heart Lung Transplant. 13: 306, 1994) und Kapelanski et al., (J. Heart Lung Transplant 12: 294, 1993); das Kobra- Gift-Modell akuter Lungenverletzung und das Immunkomplex-Lungenentzündungsmodell in dem U.S.-Patent 5 486 536, das Modell für hämorrhagischen Schock von Kushimoto et al., (Thrombosis Res. 82: 97, 1996); die durch peritoneales Ausscheidungsprodukt und Endotoxin induzierten Modelle für Uveitis von der WO 96/35 418; das bakterielle Peritonitis-Modell von Sharar et al., (J. Immunol. 151: 4982, 1993); das Meningitis-Modell von Tang et al., (J. Clin. Invest. 97: 2485, 1996); das Colitis-modell von Meenan et al., (Scand. J. Gastroenterol. 31: 786, 1996); das Dacron-Transplantat-Modell für einen experimentellen Thrombus von Palabrica et al., (Nature 359: 848, 1992); das Modell für Tumormetastase von der WO 96/34 609; das Modell für allergisches Asthma von der WO 96/35 418; das Allergenvermittelte Lungen-Hypersensitivitäts-Modell von Gundel et al., (Am. Rev. Respir. Dis. 146: 369, 1992), die Modelle für Diabetes von Martin et al., (J. Autoimmunity 9: 637, 1996) und Yang et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10 494, 1993); das Modell für Immunkomplex- Alveolitis und dermale Vaskulitis von Mulligan et al., (J. Clin. Invest. 88: 1393, 1991); das Lymphozyten-Trafficking-Modell von Hicke et al., (J. Clin. Invest. 98: 2688, 1996); das Modell für die IgE-vermittelte Hautreaktion von Wada et al., (J. Med. Chem. 39: 2055, 1996); und die Modelle für Kollagen-induzierte Arthritis und für Haut-Hypersensitivität vom verzögerten Typ von Zeidler et al., (Autoimmunity 21: 245, 1995).

Verwendung für polymerisierte Liposomen

Verwendung in der Forschung:

Polymerisierte Lipid-Zusammensetzungen dieser Erfindung können verwendet werden, um die Natur der Bindung zwischen möglichen Ligand-Rezeptorbindenden Zellen zu charakterisieren. Es wird zum Beispiel vermutet, daß neu isolierter Protein-Rezeptor, welcher isolierte Neutrophile oder HL-60-Zellen in einer Weise bindet, die inhibierbar ist durch die Liposomen dieser Erfindung, ein Selektin ist. Es wird vermutet werden, daß ein neu isoliertes Mucin, welches HUVEC oder Zellen, welche mit Selektin transfiziert sind, in einer Weise bindet, die durch die Liposomen dieser Erfindung inhibierbar ist, ein Selektin-Ligand ist. Man wird vermuten, daß die Adhäsion oder die Aktivierung von einer Zelle durch eine andere in einer Weise, welche durch die Liposomen dieser Erfindung inhibierbar ist, durch eine Selektin-Liganden-Kopplung vermittelt ist.

Verwendung in der Diagnostik:

Polymerisierte Lipid-Zusammensetzungen können ebenfalls für den Nachweis humaner Erkrankungen verwendet werden, in welchen die Liganden für die Selektine defekt sein können. Solche Erkrankungen würden mit größter Wahrscheinlichkeit in Patienten gesehen werden mit einer erhöhten Empfänglichkeit für Infektionen, welche eine Abnormalität bei der Wanderung von Leukozyten oder Aktivierung von Lymphozyten einschließen.
Für diagnostische Verfahren in vitro werden Zellen, die getestet werden sollen, aus Blut gesammelt, durch Ficoll-HypaqueTM-Zentrifugation separiert und dann auf ihre Fähigkeit hin getestet, ein polymerisiertes Liposom mit einer Selektin bindenden Aktivität zu binden. Das Liposom kann mit einer Radioisotop- oder Fluoreszenz-Markierung markiert sein, oder falls es auf Diyn-Chemie basiert, mittels seiner intrinsischen Farbe überwacht werden. Eine direkte Bindung der Zusammensetzung an die Zellen kann für ein Maß von Selektin auf der Zelloberfläche sorgen. In einer Erläuterung werden T-Zellen oder aus einer Tumorzell-Biopsie dispergierte Zellen isoliert, und die Zusammensetzung wird verwendet, um die Dichte von Selektin zu messen. In einer anderen Erläuterung wird die Zusammensetzung in einer gemischten Leukozyten-Population verwendet, um die Anzahl von Zellen zu zählen, die Selektin exprimieren.
Für diagnostische Verfahren in vivo wird die Lipid-Zusammensetzung durch eine Konjugation mit oder eine Einkapselung von einem geeigneten Mittel markiert. Radioisotope wie ¹¹¹In oder 99mTe können als Markierungen für eine Szintigraphie verwendet werden oder nicht radioaktive dichte Atome können verwendet werden, um den Röntgenstrahlkontrast zu erhöhen. Die Zusammensetzung wird intravenös an einer peripheren Stelle oder über eine lokale Intubierung verabreicht. Eine abnormale Lokalisierung an einer bestimmten Stelle kann ein ungewöhnliches Trafficking von Zellen oder eine Aktivierung mit klinischen Implikationen widerspiegeln.

Therapeutische Verwendung:

Da die Selektine verschiedene Funktionen haben, die mit der Adhärenz von Leukozyten, der Entzündung und der Koagulation verknüpft sind, können Verbindungen, welche mit der Bindung von P-Selektin oder von L-Selektin interferieren, verwendet werden, um die pathologischen Konsequenzen dieser Ereignisse zu modulieren.
Eine inflammatorische Antwort kann Schaden bei dem Wirt verursachen, falls unkontolliert, da Leukozyten viele toxische Moleküle freisetzen, welche normales Gewebe schädigen können. Diese Moleküle schließen proteolytische Enzyme und freie Radikale ein. Beispiele für pathologische Situationen in welchen Leukozyten einen Gewebeschaden verursachen können, schließen eine Verletzung durch Ischämie und Reperfusion ein, bakterielle Sepsis und disseminierte intravaskuläre Koagulation, das Atemnotsyndrom von Erwachsenen, rheumatoide Arthritis und Atherosklerose.
Eine Reperfusionsverletzung ist ein Hauptproblem bei der klinischen Kardiologie. Therapeutische Mittel, welche die Adhärenz von Leukozyten in ischämischem Myokard reduzieren, können in einer signifikanten Weise die therapeutische Effizienz von thrombolytischen Mitteln erhöhen. Eine thrombolytische Therapie mit Mitteln wie Gewebeplasminogen-Aktivator oder Streptokinase können die Verstopfung der Koronararterie in vielen Patienten mit einer schweren myokardialen Ischämie lindern vor einem irreversiblen myokardialen Zelltod. Viele von solchen Patienten leiden jedoch an einer myokardialen Nekrose trotz der Wiederherstellung des Blutflusses. Man weiß, daß eine Reperfusionsverletzung mit der Adhärenz von Leukozyten an das vaskuläre Endothel in der ischämischen Zone verknüpft ist, vermutlich zum Teil wegen einer Aktivierung von Plättchen und von Endothel durch Thrombin und Cytokine, welche sie adhäsiv für Leukozyten machen (Romson et al., Circulation 67: 1016, 1983). Die adhärenten Leukozyten können durch das Endothel wandern und das ischämische Myokard zerstören, gerade wenn es durch eine Wiederherstellung des Blutflusses gerettet wird. Eine Ischämie kann auf einen Herzinfarkt folgend auftreten oder als ein Ergebnis von Komplikationen eines chirurgischen Eingriffs, wie einer Thrombose der tiefen Venen. Eine andere inflammatorische Bedingung von Bedeutung in der Kardiologie ist Restenose.
Es gibt eine Anzahl anderer häufiger klinischer Erkrankungen, in welchen eine Ischämie und eine Reperfusion zu einer Organverletzung führt, die durch eine Adhärenz durch Leukozyten an vaskuläre Oberflächen vermittelt ist, einschließlich von Schlaganfällen; mesenteriale und periphere Gefäßerkrankung; Organtransplantation; und multiples Organversagen, folgend auf einen Kreislaufschock. Bakterielle Sepsis und eine disseminierte intravaskuläre Koagulation existieren oft gemeinsam in kritisch kranken Patienten. Diese Bedingungen sind assoziiert mit einer Erzeugung von Thrombin, Cytokinen und anderen inflammatorischen Mediatoren, einer Aktivierung von Plättchen und von Endothel, und der Adhärenz von Leukozyten und der Aggregation von Plättchen im gesamten Gefäßsystem. Eine von Leukozyten abhängige Organschädigung ist eine wichtige Eigenschaft dieser Bedingungen.
Das Atemnotsyndrom des Erwachsenen ist eine zerstörerische Lungenerkrankung, welche in Patienten mit Sepsis oder auf ein Trauma folgend auftritt, welche mit einer weit verteilten Adhärenz und Aggregation von Leukozyten im Lungenkreislauf assoziiert ist. Dies führt zur Extravasation von großen Mengen von Plasma in die Lungen und einer Zerstörung von Lungengewebe, beides in großen Teilen vermittelt durch Leukozytenprodukte.
Tumorzellen von vielen bösartigen Erkrankungen (einschließlich von Karzinomen, Lymphomen und Sarkomen) metastasieren an entlegene Stellen über die Gefäße. Die Mechanismen für eine Adhäsion von Tumorzellen an Endothel und ihre nachfolgende Wanderung sind nicht gut verstanden, können jedoch zumindest in einigen Fällen denjenigen von Leukozyten ähnlich sein. Die Assoziation von Plättchen mit metastasierenden Tumorzellen ist gut beschrieben worden, was eine Rolle für die Plättchen bei der Streuung von einigen Krebsarten nahelegt. Es wurde berichtet, daß P-Selektin an Tumorzellen in Schnitten von humanem Karzimomgewebe bindet und an Zelllinien, welche von Karzinomen stammen (Aruggo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2292, 1992). Zusätzlich können bestimmte Tumore selbst Selektin oder Selektin-Liganden exprimieren, welche an der Adhärenz von metastasierenden Zellen an Endothelzellen oder HEV an einer neuen Stelle teilnehmen können.
Antagonisten von P-Selektin können nützlich sein für das Blockieren von Plättchen- Leukozyten-Wechselwirkungen während Thrombi sich entwickeln (Welpy et al., Biochim. Biophys. Acta 117: 215, 1994). In Pavianen verminderte die Verabreichung von anti-P- Selektin eine Fibrinanlagerung auf Dacron-Gewebeimplantaten, ohne eine Ansammlung von Plättchen in die Transplantate zu vermindern (Palabrica et al., Nature 359: 848, 1992). Die Ergebnisse legen nahe, daß das Fangen von Leukozyten über eine Wechselwirkung mit Plättchen zu der Ablagerung von Fibrin beitragen kann. Das Blockieren von P-Selektin sollte diese Wechselwirkung verhindern und kann einen Wert als eine anti-thrombogene Therapie haben.
In dem Ausmaß, in dem eine Initiation einer akuten Abstoßung eines Allotransplantats oder Xenotransplantats eine von Selektin vermittelte Rekrutierung von inflammatorischen oder Immun-Mediator-Zellen einschließt, können Selektin-Antagonisten in den wenigen Tagen nach der Transplantation zum Tragen gebracht werden.
Antagonisten von P- und L-Selektin sind ebenfalls von Interesse bei der Linderung von Autoimmunerkrankungen. Für einen Review der Rolle von Adhäsionsmolekülen in diesen Erkrankungen wird der Leser auf Murray (Semin. Arthritis Rheum. 25: 215, 1996) verwiesen.
Rheumatoide Arthritis ist charakterisiert durch eine symmetrische polyartikuläre Entzündung von synovial ausgekleideten Gelenken und kann extraartikuläre Gewebe mit einschließen wie das Perikard, die Lunge, und Blutgefäße. Adhäsionsmoleküle scheinen eine wichtige Rolle zu spielen (Postigo et al., Autoimmunity 16: 69, 1993). Lösliche Selektine sind in der Synovialflüssigkeit vorhanden und in Blut von betroffenen Patienten, was mit erhöhten ESR und synovialen PMN-Zahlen korreliert (Carson CW et al., J. Rheumatol. 21: 605, 1994). Eine konventionelle anti-rheumatische Therapie kann die synoviale Entzündung durch das Verändern der Leukozytenadhäsion modifizieren. Corticosteroide, Gold-Verbindungen und Colchizin regulieren die endotheliale Expression von Selektinen herab (Corkill et al., J. Rheumatol. 18: 1453, 1991; Moad et al., Athritis Rheum. 35: 535, 1992).
Systemischer Lupus Erythematodes ist charakterisiert durch die Bildung von anti-nukleären Antikörpern und manifest durch entzündliche Läsionen auf der Haut und im gesamten Körper. Die Expression von Selektin ist erhöht auf der Gefäßendothelwand der Haut von Patienten mit erhöhter Schwere der Erkrankung (Belmont et al., Arthritis Rheum. 37: 376, 1994). Sjoren's Syndrom, Schilddrüsen-Autoimmunerkrankung, multiple Sklerose und Diabetes sind andere Bedingungen mit einer schweren Implikation von veränderten Adhäsionsproteinen wie ICAM-1, LFA-1 und -3, VCAM-1 und Selektinen (Murray, supra) und können auf eine Therapie mit Selektin-Inhibitoren anschlägen.
Asthma ist charakterisiert durch eine Blockade des Luftweges, eine Entzündung und eine erhöhte Responsivität gegenüber einer Vielzahl von Stimuli, manifest durch Episoden des Hustens, der Dyspnoe und des Keuchens. Die bei einer chronischen Entzündung des Luftweges vorgeschlagenen Schritte schließen einen Entzündungsstimulus, der die Freisetzung von Mediatoren auslöst, ein, gefolgt von einer Aktivierung der Kaskade der Leukozyten-Endothel-Adhäsion, was zu einer Adhäsion der Leukozyten an das Endothel führt. Damit in Verbindung gebrachte Moleküle schließen Selektine ein, VCAM-1 und ICAM-1, welche folgend auf eine Allergen-Belastung hochreguliert werden können (Pilewski et al., Am. Rev. Respir. Dis. 148, S31, 1993).

Timing und Ziele der Behandlung.

Eine wirksame Menge von polymerisierten Lipid- Zusammensetzungen kann für die Behandlung eines Individuums verwendet werden, für eine Bedingung, bei der die Ätiologie einen veränderten Zellverkehr oder eine Aktivierung, die zum Teil durch Selektine vermittelt wird, einschließt.
Ein "Individuum", das durch das Verfahren dieser Erfindung behandelt wird, ist ein Vertebrat, insbesondere ein Säugetier (einschließlich von Farmtieren, Sporttieren und Schoßtieren) und typischerweise ein Mensch.
Die "Behandlung" bezieht sich auf eine klinische Intervention in einem Versuch, den natürlichen Verlauf des Individuums, das behandelt wird, zu verändern, und kann entweder durchgeführt werden für eine Prophylaxe oder während des Verlaufs einer klinischen Pathologie. Wünschenswerte Wirkungen schließen das Verhindern des Auftretens oder des Wiederauftretens einer Erkrankung ein, die Linderung von Symptomen, die Verringerung jedweder direkter oder indirekter pathologischer Konsequenzen der Erkrankung wie eine Hyperresponsivität, eine Entzündung oder eine Nekrose, das Verhindern von Metastase, das Erniedrigen der Rate der Krankheitsprogression, die Verbesserung oder die Linderung des Erkrankungszustandes und das Nachlassen oder eine verbesserte Prognose. Die "Pathologie", die mit einer Erkrankungsbedingung assoziiert ist, ist alles, was das Wohlsein, die normale Physiologie oder die Lebensqualität des betroffenen Individuums beeinträchtigt.
Eine Behandlung wird durchgeführt durch die Verabreichung einer wirksamen Menge einer polymerisierten Lipid-Zusammensetzung dieser Erfindung. Eine "wirksame Menge" ist eine Menge, die hinreichend ist, um ein nützliches oder gewünschtes klinisches Ergebnis zu bewirken und kann in einer oder mehreren Dosen verabreicht werden.
Die in dieser Erfindung betrachteten Behandlungs-Modi schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden:
1. Das Inhibieren der Leukozytenadhäsion oder Wanderung, umfassend das Verabreichen eines P-Selektin-Inhibitors, um so die Bindung zwischen einer vaskulären Endothelzelle und einem Leukozyten zu inhibieren, der ausgewählt ist aus der Neutrophile, Monozyten, Eosinophile umfassenden Gruppe von Leukozyten und von Lymphozyten, welche einen P- Selektin-Liganden tragen, von denen man denkt, daß sie Gedächtnis-T-Zellen sind. Die Inhibition kann durchgeführt werden entweder durch das Einführen des Inhibitors in eine Umgebung, wo die wechselwirkenden Zellen in Kontakt kommen, insbesondere nahe an der betroffenen Stelle, oder durch das Kontaktieren der das Selektin tragenden Zelle mit dem Inhibitor in Abwesenheit von der den Liganden tragenden Zelle.
2. Das Inhibieren der Plättchen-Aggregation oder der Ablagerung von Fibrin durch das Verabreichen eines P-Selektin-Inhibitors an eine Umgebung, welche Plättchen enthält oder empfänglich ist für die Akkumulierung von Plättchen.
3. Das Inhibieren der Adhäsion oder der Wanderung von Leukozyten, umfassend das Verabreichen eines L-Selektin-Inhibitors, um so das Binden zwischen einem Lymphozyten, einem Neutrophilen oder einem Monozyten und einer Endothelzelle oder Lymphgewebe, insbesondere einer HEV-Zelle, zu inhibieren.
4. Das Inhibieren der Lymphozyten-Adhäsion, -Wanderung oder -Aktivierung, umfassend das Verabreichen eines L-Selektin-Inhibitors an den Lymphozyten.
5. Das Inhibieren der Metastase eines Tumors, von dem man vermutet, daß er einen Selektin- Liganden oder Rezeptor exprimiert, durch das Verabreichen eines Inhibitors für das Selektin an den Tumor oder an den Kreislauf.
Die Kriterien für die Bewertung der Antwort auf die therapeutischen Bedingungen, welche die Lipid-Zusammensetzung dieser Erfindung verwenden, werden durch den spezifischen Zustand diktiert; zum Beispiel kann die Behandlung, um eine Extension eines Herzinfarktes zu verhindern, können überwacht werden durch eine Reihenbestimmung von Marker-Enzymen für eine myokardiale Nekrose und durch EKG, Vitalzeichen und die klinische Antwort. Eine Behandlung eines akuten Atemnotsyndroms kann überwacht werden durch das Verfolgen der arteriellen Sauerstoffniveaus, die Auflösung von Lungeninfiltraten und die klinische Verbesserung, wie gemessen durch veringerte Dyspnoe und Tachypnoe. Andere Zustände, die unter Verwendung der Verfahren dieser Erfindung behandelt werden, werden gemessen entsprechend medizinischen Standard-Verfahren, die für den Zustand angemessen sind.

Pharmazeutische Präparationen und Verabreichung:

Zusammensetzungen, die für die Verwendung gemäß dieser Erfindung hergestellt sind, können hergestellt werden für eine Verabreichung an ein Individuum, welches dieser bedarf, insbesondere Menschen, in Übereinstimmung mit allgemein akzeptierten Verfahren für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen. Bevorzugte Methoden für die Herstellung von hierin beschriebenen Liposomen sind hinreichend flexibel, daß Chargengrößen von 5 ml bis zu mehreren Litern oder mehr in einer reproduzierbaren Weise unter sterilen Bedingungen hergestellt werden können.
Allgemeine Verfahren für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin Hrsg., Mack Publishing Co., PA. beschrieben. Flüssige, pharmazeutisch verabreichbare Zusammensetzungen können zum Beispiel hergestellt werden durch das Dispergieren eines Liposoms in einem flüssigen Arzneimittelträger, wie Wasser, Salzlösung, wäßriger Dextrose oder Glycerol. Die Liposom- Suspension kann Lipid schützende Mittel einschließen, um die Lipide gegen freie-Radikal- und Lipid-peroxidative Schäden während der Lagerung zu schützen. Lipophile Quencher für freies Radikal wie Alphatocopherol und wasserlösliche Eisen-spezifische Chelatbildner wie Ferrioxamin können verwendet werden. Einer der Vorteile der polymerisierten Lipid- Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist die Stabilität gegenüber vielen von den gewöhnlichen Abbauwirkungen, welche während der Lagerung akkumulieren. Die Zusammensetzung kann wahlweise ebenfalls andere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel und Träger enthalten.
Die Zusammensetzungen für eine Injektion können als flüssige Lösungen oder als Suspensionen oder als feste Formen, die geeignet sind für eine Lösung oder für eine Suspension in einer Flüssigkeit vor der Injektion, geliefert werden. Für eine Verabreichung an das Tracheen- und das Bronchialepithel ist eine bevorzugte Zusammensetzung eine, welche entweder ein festes oder ein flüssiges Aerosol bereit stellt, wenn sie mit einer geeigneten, ein Aerosol bildenden Vorrichtung verwendet wird. Obwohl es nicht erforderlich ist, werden pharmazeutische Zusammensetzungen in einigen Fällen in einer Einheitsdosierungsform, welche für eine Verabreichung einer präzisen Menge geeignet ist, geliefert.
Der Verabreichungsweg einer pharmazeutischen Zusammensetzung hängt unter anderem von dem beabsichtigten Zielort, dem klinischen Zustand und der Natur des zu behandelnden Zustandes ab. Eine intravenöse oder intralymphoide Verabreichung oder Injektion direkt in eine betroffene Stelle sind die gebräuchlichsten Wege. Eine Verabreichung in die Lunge durch ein Aerosol wird durchgeführt unter Verwendung einer Vernebelungsvorrichtung. Ein Apparat und Verfahren für das Bilden von Aerosolen werden beschrieben in Kirk-Othmer, "Encyclopedia of Chemical Technology". 4. Auflage, Bnd. 1, Wiley NY, S. 670-685, 1991.
Die Größe der Dosis wird ausgewählt, indem das erwartete Volumen der Verteilung der Zusammensetzung in Rechnung gezogen wird, bevor sie den beabsichtigten Wirkort erreicht und dann das Bereitstellen von ausreichendem Inhibitor (in nM Zuckeräquivalent), um die IC&sub5;&sub0; Konzentration zu erreichen oder zu überschreiten, wie in einem geeigneten Zell-Bioassay gemessen, typischerweise etwa 2-20-fach die IC&sub5;&sub0; Konzentration. Bei der Planung der Dosis kann es nicht notwendig sein, alle Selektin-Rezeptoren vollständig zu blockieren. Für eine normale Heilung kann es notwendig sein, daß wenigstens einige Leukozyten zu der betroffenen Stelle wandern müssen. Die Menge des Inhibitors wird entsprechend eingestellt.
Die Bewertung der klinischen Eigenschaften und das Design eines geeigneten therapeutischen Behandlungsplanes für den individuellen Patienten ist letztendlich die Verantwortung des verschreibenden Arztes.
Die vorausgehende Beschreibung stellt unter anderem eine detaillierte Erklärung dafür bereit, wie polymerisierte Lipid-Zusammensetzungen verwendet werden können, um zelluläre, durch Selektin-Bindung vermittelte Ereignisse zu inhibieren.
Die nachstehend präsentierten Beispiele werden bereitgestellt als ein weiterer Führer für einen Fachmann von gewöhnlicher Fähigkeit im Fachbereich und sind nicht dazu gedacht in irgend einer Weise zu beschränken.

Beispiele

Beispiel 1: Entwicklung von zwei-Komponenten-Glycoliposomen

Die Glycoliposomen wurden gebildet durch das Anheften einer Kohlenhydrat-Komponente an ein polymerisierbares Lipid, das Mischen mit einem zweiten polymerisierbaren Lipid mit einer polaren Kopfgruppe, der Bildung von Liposomen und dann der Polymerisierung der Lipide.
Die Fig. 3 zeigt das Sialyl-Lewisx (sLex) -Tetrasaccharid (Struktur 1) im Vergleich mit den in Liposomen versammelten Komponenten. Die als 2a markierten Kohlenhydrate (ein sLex- Analoges), 3a (Laktose) und 4a (Maltose) wurden für das Synthetisieren der polymerisierbaren Glycolipide verwendet, hierin nachstehend jeweils als 2b, 3b und 4b bezeichnet. Das polymerisierbare Vorläuferlipid war 10,12-Pentacosadiynsäure (PDA), welches mit dem Kohlenhydrat durch Standardtechniken konjugiert wurde. Das zweite polymerisierbare Lipid, das während der Liposomenbildung verwendet wurde, war entweder die Verbindung 5 (PDA), welche eine negativ geladene Kopfgruppe umfaßt, oder die Verbindung 6, welche eine polare aber ungeladene Kopfgruppe umfaßt.
Die Fig. 1 zeigt eine expandierte Ansicht von polymerisierten Glycoliposomen, welche entweder die Verbindungen 2b und 5 (A) oder 2b und 6 (B) enthalten. Die polymerisierten Glycoliposomen wurden gebildet wie folgt: Verschiedene molare Prozentsätze von Lipiden wurden hergestellt, um 1 mM Lösungen im Gesamt-Lipid zu ergeben, während die Prozentsätze der Glycolipide in dem Bereich von 0,5 bis 50% variiert wurden. Die Glycolipide wurden zu Liposomen durch das Probenbeschallungsverfahren (R. R. C. New, S. 33-104, in "Liposomes: a practical approach", Oxford U. Press 1990) gebildet. Die Lipide erschienen mischbar zu sein, basierend auf einer Analyse ihrer Langmuir-Isothermen (G. L. Gaines in "Insoluble monolayers at liquid-gas interfaces" Wiley: NY1966).
Die Polymerisierung der Liposomen wurde durchgeführt durch die Exposition der wäßrigen Lösungen gegenüber UV-Licht bei 254 nm (Hub et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 19: 938, 1980; Spevak et al., J. Amer. Chem. Soc. 115: 1146, 1993). Die Polymerisation von Lipid- Diacetylenen erfordert, daß die Monomere einen fest-analogen Zustand annehmen. Die hier berichteten Prozentsätze der Kohlenhydrate sind Abschätzungen der Zuckergruppen, welche sowohl auf der inneren als auch auf der äußeren Oberfläche der Liposomen auftreten. Mit Prozentsätzen der Glycolipid-Komponente oberhalb von etwa 40% wurde eine Polymerisation in wesentlicher Weise inhibiert. Dies wird erklärt durch das sterische Drängen bei einander liegender Kohlenhydrat-Kopfgruppen, was verhindert, daß die proximalen Diacetylene polymerisieren.
Die Charakterisierung der polymerisierten Glycoliposomen durch eine Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeigte, daß die Präparation aus Kugeln zwischen 20-100 nm im Durchmesser bestand.

Beispiel 2: Bioassay für die Selektin-Inhibitions-Aktivität

Die Fähigkeit der in dem Beispiel 1 hergestellten Zusammensetzungen, die Selektin-Bindung zu inhibieren; wurde in einem Standard-Bioassay getestet. Der Assay für das Messen der P- Selektin-Bindung an HL-60-Zellen wurde von der Beschreibung von Brandley et al., (Glycobiol. 3: 633, 1993) genommen. Kurz gesagt wurde es einer P-Selektin-Chimäre gestattet, einen Komplex mit biotinyliertem Ziege-F(ab')-anti-human-IgG-Fc und Alkalische- Phosphatase-Streptavidin zu bilden, und sie wurde mit Inhibitoren vorinkubiert, bevor sie mit HL-60-Zellen gemischt wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und mit TBS gewaschen. Chromagen wurde zugegeben und die Farbe, die sich entwickelte wurde als eine OD bei 405 nnm gelesen. Alle Assays wurden in Quadruplikaten laufen gelassen.
Die Fig. 4 zeigt die Inhibitions-Titrations-Kurve für verschiedenartige polymerisierte Glycoliposom-Präparationen, welche 5% Kohlenhydrat-gebundene Lipide enthalten. Offene Dreiecke: sLex-Analog-Konjugat plus saure Lipide. Offene Kreise: sLex-Analog-Konjugat plus neutrale Lipide. Geschlossene Kreise: Laktose-Konjugat plus saure Lipide. Quadrate: Maltose-Konjugat plus saure Lipide. Es ist aus den Ergebnissen dieses Assays ersichtlich, daß das Vorhandensein des sauren Lipids für eine meßbare Inhibition kritisch ist, selbst wenn die effektivsten Kohlenhydrat-Konjugate von denjenigen, die getestet wurden, das sLex-Analoge, verwendet werden. Die neutralen Disaccharide Laktose und Maltose haben ebenfalls eine Selektin inhibierende Aktivität, wenn sie gemeinsam mit sauren Lipiden verwendet wurden. Alle die Zusammensetzungen mit einem Saccharid und einem negativ geladenen Lipid inhibierten die P-Selektin-Bindung in einer von der Dosis abhängigen Weise.
Die Fig. 5 zeigt die Konzentration, welche eine 50%-ige Inhibition (IC&sub5;&sub0;) für verschiedenartige polymerisierte Glycolipidzusammensetzungen ergab. Die IC&sub5;&sub0;-Werte basieren auf der Gesamtkonzentration von Glycolipid. Keine Reduktion wurde gemacht für irgendwelches Glycosid, welches nicht zugänglich sein kann aufgrund einer Inkorporierung in die innere Schicht des Liposoms. Daher repräsentieren diese IC&sub5;&sub0;-Werte ein oberes Limit für das tatsächliche Glycosid, welches für die Bindung verfügbar ist.
Das linke Panel der Fig. 5 ist eine Titrationsanalyse des optimalen Verhältnisses von Kohlenhydrat-Lipid zu dem Gesamtlipid in der Zusammensetzung. Dieses Experiment wurde durchgeführt mit dem sLex-Analogen-Lipid-Konjugat, wobei die Balance der Zusammensetzung das Lipid mit der Carbonsäure-Kopfgruppe war. Es ist offensichtlich, daß der optimale Prozentsatz etwa 5% ist, obwohl Zusammensetzungen von bis zu wenigstens 50% eine inhibitorische Aktivität enthalten, und Zusammensetzungen bis zu etwa 20% eine inhibitorische Aktivität in dem nM Bereich haben. Die Abnahme bei der inhibitorischen Aktivität bei den höheren Prozentsätzen korreliert mit der erhöhten Schwierigkeit bei der Polymerisation dieser Zusammensetzungen, welche einer sterischen Hinderung durch das Kohlenhydrat zugeschrieben wird. Die 2 nM IC&sub5;&sub0; für die 5%-ige Zusammensetzung kontrastiert mit etwa 1 bis 5 · 10&sup6; mit den Werten, die in diesem Assay für das Monomer sLex erhalten wurden.
Das rechte Panel der Fig. 5 ist ein Vergleich der IC&sub5;&sub0; für verschiedenartige Zusammensetzungen mit unterschiedlichen Kohlenhydrat-Bestandteilen. Sowohl Laktose als auch Maltose sorgen für eine signifikante inhibitorische Aktivität (15 nM bzw. 200 nM) wenn sie in dem Kontext von sauren Lipiden bereit gestellt werden. Der Wert für Laktose im besonderen vergleicht sich in einer günstigen Weise mit demjenigen von sLex-Zusammensetzungen. Die letzten zwei Balken zeigen das Fehlen nachweisbarer Inhibition durch polymerisierte Liposomen, welche mit sauren oder mit neutralen Lipiden alleine gemacht wurden.
Daher sind sowohl ein geeignetes Kohlenhydrat und ein separates negativ geladenes Lipid in diesen Präparationen erforderlich, um für eine Selektin-Inhibitions-Aktivität zu sorgen. Im Nachhinein spekulieren wir, daß die Bindung anderer inhibitorischer Verbindungen, so wie von bestimmten Typen von Heparin, Inositolhexakisphosphat, Sulfoglucuronylglycolipiden, Fucoidan, Sulfatide und einem sLex-RGD-Konjugat als eine Kombination eines Kohlenhydrats oder eines Kohlenhydrat-artigen Moleküls und separat mit einem Spacer versehener multipler Säuregruppen erklärt werden kann.
Die Möglichkeit einer Interkalation der Liposomen in die Zellen, wodurch ihre Fähigkeit P- Selektin zu binden ausgeübt wurde, wurde ebenfalls angegangen. Die Zellen wurden mit den Liposomen vorbehandelt und gewaschen, um die Liposomen zu entfernen vor der Zugabe von der P-Selektin-Chimäre. Dies führte nicht zu irgendeiner Reduktion bei der Selektin-Bindung an die Zellen. Die Inhibition war in den Experimenten unbeeinflußt, wo die Reagenzien und die Inhibitoren gleichzeitig zu den Mikrotiterplatten zugegeben wurden.
Mittels eines Vergleiches ist das Niveau von sLex oder von sLex-Analogem, welches als ein Mnomer präsentiert wird, das erforderlich ist, um die IC&sub5;&sub0; in diesem Assay zu erreichen -1 bis 50 mM. Die relative Verbesserung, die durch die Inkorporierung in dem polymerisierten Liposom verliehen wird, ist etwa 10&sup6;-fach.

Beispiel 3: Weitere Bestätigung des Erfordernisses für negativ geladene Lipide

Zusätzliche polymerisierte Glycoliposom-Zusammensetzungen wurden hergestellt für das Testen in einem anderen Assaysystem.
Der Assay ist ein ELISA, in welchem die polymerisierten Liposomen auf die Fähigkeit gestestet werden, die Bindung von Selektin-Chimären an isoliertes GlyCAM-1 zu inhibieren. Eine vollständige Beschreibung wird in Bertozzi et al., (Biochemistry 34: 14 275, 1995) bereit gestellt. Kurz gesagt wurde eine rohe Präparation von GlyCAM-1 aus Mäuseserum erhalten durch eine Extraktion mit 2 : 1 Chloroform/Methanol, dem Gewinnen der wäßrigen Phase und durch Konzentration. Dieses Mucin wirkt in diesem Assay als ein Ligand für jedwedes der drei Selektine. Mikrotiterplatten werden mit polyklonalem Antikörper beschichtet, der für das Peptid-Rückgrat des Mucins spezifisch ist, mit dem Mucin überschichtet und dann gewaschen. Mittlerweile wird ein Komplex gebildet zwischen a) einer Chimäre des jeweiligen Selektins, fusioniert an die Fe-Region der schweren Kette von humanem IgG; b) biotinyliertem F(ab')&sub2;-anti-Fc; c) Streptavidin-Alkalische-Phosphatase-Konjugat. Diese Lösung (70 ul) wird kombiniert mit 70 ul des Inhibitors und 30 min lang inkubiert, dann auf die Mulden der Mikrotiterplatte transferiert. Nach 30 min bei Raumtemperatur werden die Mulden gewaschen und mit dem Enzym-Substrat p-Nitrophenylphosphat entwickelt.
Die Fig. 6 zeigt die polymerisierten Liposomen, die für das Testen hergestellt wurden. Fünf verschiedene Gruppen wurden hergestellt mit entweder keinem Oligosaccharid (Gruppe 1) oder einem von vier verschiedenen Oligosaccharid-konjugierten Lipiden bei einer relativen molaren Konzentration von 5% (Gruppen 2 bis 5). Innerhalb einer jeden Gruppe wurde der Substituent auf den Lipiden, die nicht mit dem Oligosaccharid konjugiert waren (gezeigt als ein "X" in dem Diagramm) wie folgt variiert:
- ein Amin, welches eine positive Ladung bei einem neutralen pH hat;
- eine Hydroxylgruppe, welche neutral aber elektonegativ ist;
- eine Carbonsäure, welche eine negative Ladung bei einem neutralen ph hat; oder
- eine Mischung, umfassend entweder 5% oder 50% Lipid mit dem Oxysäuresulfat, wobei die Balance ein Lipid mit einer Hydroxyl-Kopfgruppe ist.
Diese Zusammensetzungen ergaben die folgenden Ergebnisse in dem Selektin- Inhibitionsassay:
Die IC&sub5;&sub0;-Werte basieren alle auf der Gesamtmenge von Liposom-gebundenem Kohlenhydrat, außer in der Gruppe 1, wo die Werte aus der Gesamtmenge der Kopfgruppen der Matrix berechnet werden.
Die Ergebnisse unterstützen die folgenden Schlüsse. Erstens hat der sulfatierte Kohlenhydrat Sulfo-Lex-Analoges eine sehr niedrige IC&sub5;&sub0; (hohe inhibitorische Kapazität) für L-, E- oder P- Selektin in einem Kontext von sauren oder polaren Lipiden (aber nicht von positiv geladenen Lipiden). Wo das Saccharid das nicht sulfatierte sLex-Analoge ist, ist ein saures, benachbartes Lipid erforderlich für eine vollständige inhibitorische Aktivität, welche selektiv ist für L- und P-Selektin. Sulfat-Lipide unterstützen die Bindung von sLex besser als Carboxylat-Lipide, selbst bei einem relativen Anteil von 50%. Wie in dem vorausgehenden Beispiel verändert die Anwesenheit von sauren Lipiden ineffektive neutrale Disaccharide wie Laktose und Maltose in effektive Inhibitoren. Diese Wirkung trat nur für L- und P-Selektin auf, da keine der neutralen Disaccharid-Zusammensetzungen die Bindung von E-Selektin inhibierte. Die beitragende Wirkung von Säuregruppen bei der Bindung von L- und P-Selektin ist konsistent mit der Arbeitshypothese, daß die Lipid-Säuregruppen ein Selektin bindendes Erfordernis erfüllen, äquivalent zu demjenigen, welches durch Sulfotyrosin oder seinem Äquivalent in den biologischen Liganden bereit gestellt wird.
Diese Vorgehensweise einer gemischten Konstruktion kombiniert mit einem einfachen Platten-Bindungsassay sorgt für ein schnelles Verfahren für eine Identifizierung von Kohlenhydrat-Säuregruppen-Kombinationen, welche in der Lage sind, die Bindung verschiedener Selektin-Liganden-Paare selektiv zu inhibieren.

Beispiel 4: Zell-Aktivitäts-Assays bestätigen die biologische Effizienz von Glycoliposomen

Glycoliposomen, die 5% Sulfo-Lex-Analoges und 95% Hydroxyl-terminiertes Lipid enthalten, wurden in einem Fluß-Adhäsionsassay getestet (Alon et al., Nature 374: 539, 1995). Kurz gesagt wird eine P-Selektin-Chimäre in einer Flußkammer immobilisiert, und die Affinität von HL-60-Zellen für dieses Substrat ist manifest wegen ihrer Fähigkeit, langsam auf der Oberfläche zu rollen. Die Wechselwirkung ist spezifisch für die PSGL-1-Mucin-Domäne auf den HL-60-Zellen und die Fähigkeit des Inhibitors, die Zell-Adhäsion unter physiologischem Fluß anstatt unter statischen Bedingungen zu blockieren. Bei einer Glycolipid-Konzentration von 1 uM war diese Glycoliposom-Formulierung in der Lage, das Rollen von HL-60-Zellen auf P-Selektin-Oberflächen vollständig zu inhibieren. Das Kontroll-Liposom (ohne das Kohlenhydrat) hatte keinen Effekt.
Dieselbe Liposom-Formulierung wurde in dem Stamper-Woodruff-Lymphozyten-Homing- Assay getestet (Stamper et al., J. Exp. Med. 144: 828, 1976). Dieser Assay mißt die Fähigkeit von Lymphozyten für ein Homing in den Lymphknoten durch die Venolen des hohen Endothels (IIEV), ein Verfahren, von dem bekannt ist, daß es durch L-Selektin vermittelt ist.
Lymphozyten des Thorax-Traktes (thoracic duct) (TDC) wurden auf fixierten Schnitten von HEV in Gegenwart der Liposomen gezählt. Das 5% Glycoliposom inhibierte die TDC vollständig von einer Bindung an HEV bei einer Konzentration von 1 uM. Das Kontroll- Liposom hatte keinen Effekt.

Beispiel 5: Alternative Saccharid-Komponenten

Eine weitere Verfeinerung der Kohlenhydrat-Komponente von polymerisierten Liposomen wird an verschiedenen Fronten durchgeführt.
In einer experimentellen Reihe werden die Prototyp-Oligosaccharide sLex und Sulfo-Lex in verschiedenartige Substituenten zergliedert und in unabhängigen Zusammensetzungen getestet. Die Fig. 7 zeigt einige Monosaccharid- und Disaccharid-Lipid-Konjugate von Interesse. Andere Saccharide von Interesse sind Laktosamin, 3'-Sialyl-Lactosamin und 3'Sialyl-Laktose. Die Identifizierung von aktiven Unterkomponenten der Saccharide hat zwei Zwecke. Einer besteht darin, die Bindungserfordernisse für ein jedes Selektin weiter zu erhellen, welche dann verwendet werden können, um kostengünstige Analog-Strukturen mit einer erhöhten Bindung oder Selektin-Spezifität zu entwickeln. Der andere besteht darin, Mono-und Disaccharide zu identifizieren, welche in einem gemischten Saccharid-Liposom verwendet werden können, wie nachstehend erklärt.
In einer anderen experimentellen Reihe werden Oligosaccharide, von denen man glaubt, daß sie eine gleiche oder eine bessere Aktivität wie die Prototypen als Monomere haben, in Liposom-Zusammensetzungen getestet, um zu bestimmen, ob ihre Aktivität weiter erhöht werden kann. Konjugate von Interesse sind in der Fig. 8 gezeigt. Andere Konjugate von Interesse sind verschiedenartige sLex-Analoge und andere Strukturen, die anderswo in der Offenlegung aufgelistet sind.
Die Konjugate werden in einer gleichen Weise wie diejenigen in den vorausstehenden Beispielen gebildet: Durch die Bildung von peracetyliertem beta-Nac-allyl-Glycosid, kombiniert mit Cystaminhydrochlorid unter UV-Licht und dann direkt gekoppelt mit der aktivierten Säure von PDA.
Misch- Saccharid-Liposomen haben verschiedene Saccharide, konjugiert an verschiedene Lipide in der Zusammensetzung. Es wird vorgeschlagen, daß die verschiedenen Saccharide gemeinsam arbeiten können, um das Kohlenhydrat-Erfordernis für eine Selektin-Bindung zu liefern, wenn sie in dem Kontext von anderen Lipiden präsentiert sind, welche dem anionischen Bindungserfordernis in einer polymerisierten Lipidschicht genügen. Von besonderem Interesse ist eine Kombination von Sialinsäure und Fucose, da man glaubt, daß diese die Reste in sLex sind, welche für eine Selektin-Bindung verantwortlich sind.
Das Sialinsäure-Konjugat wird hergestellt gemäß dem Standardverfahren, das in Spevak et al., J. Amer. Chem. Soc. (1993) 115, 1146, herausgestellt wird. Das Fucosekonjugat wird hergestellt wie folgt. Zuerst wird das perbenzoylierte Glycosylchlorid von Fucose C-allyliert durch Trimethylallylsilan und Trimethylsilyltriflat (Hosomi et al., Tetrahedron Lett. 2383, 1984) um das C-Glycosid zu ergeben. Diese Verbindung wird nit Natrium/Ammoniak entschützt. Das perbenzoylierte C-Glycosid von Fucose wird in t-Butanol gelöst und zu refluxierendem, wasserfreiem Ammoniak, geschützt vor Feuchtigkeit zugegeben. Festes Natriummetall wird dann zugegeben bis die blaue Farbe wenigstens 20 min lang überdauert. Die Reaktion wird dann mit Ammoniumchlorid gequencht und der Ammoniak wird dann verdampfen gelassen. Der feste Rest wird in Wasser gelöst, auf einen pH von etwa 2 mit konzentrierter HCl gebracht und mit Methylacetat einige Male extrahiert. Die kombinierten organischen Lösungen werden mit Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Verdampfen wird das Produkt C-Glycosid durch Flash-Chromatographie gereinigt. Das C- Glycosid wird mit Cystaminhydrochlorid (3 Äqu.) in entgastem Wasser gelöst, um eine 1 M Zuckerlösung zu ergeben. Die Lösung wird unter einem konstanten Mantel von Stickstoff gehalten, und mit UV-Licht (254 nm) bestrahlt. Nach 12 Stunden wird die Lösung neutralisiert mit festem Natriumbicarbonat, Konzentriert und Flash-chromatographiert, was das Amin ergibt. Dieses wird dann in einer minimalen Menge von Methanol gelöst, zu dieser Lösung von NHS-PDA (1,2 Äqu.) zugegeben und 12 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wird mit Chloroform verdünnt, mit gesättigtem wäßrigem Natriumbicarbonat gewaschen und dann mit Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach der Verdampfung wird der rohe Glycolipidrest durch eine Flash-Chromatographie gereinigt.
Das Sialinsäure-Konjugat und das Fucose-Konjugat werden in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt und dann mit PDA mit 5 bis 10% des Glycokonjugates als dem molaren Prozentsatz vom Gesamtlipid kombiniert. Die Vesikelbildung und die Lipid-Polymerisation schreiten wie normal voran, um ein gemischtes Glycoliposom mit einer Oberflächenstruktur, die in der Fig. 9 gezeigt ist, zu bilden.
Die in diesem Beispiel beschriebenen Lipid-Zusammensetzungen werden gemäß dem in dem Beispiel 3 gezeigten Assay getestet.

Beispiel 6: Therapeutisches Testen in Tiermodellen

Polymerisierte Liposomen-Zusammensetzungen mit guter Inhibitionsaktivität in Selektin- Bindungsassays werden weiter für ihre Wirksamkeit in Krankheitsmodellen getestet. Alle durchgeführten Versuche wurden in Übereinstimmung und mit der Zustimmung des geeigneten Animal Use Committee durchgeführt.
Myokardiale Ischämie und Reperfusionsverletzung werden im Modell dargestellt gemäß Protokollen ähnlich zu denjenigen von Weyrich et al., (J. Clin. Invest. 91: 2620, 1993). Murohara et al., (Cardiovascular Res. 30: 965, 1995) und Ma et al., (Circulation 88: 649, 1993). Kurz gesagt wurden erwachsene Säugetiere einer höheren Spezies (typischerweise Hund, Katze oder Schaf) anästhesiert und eine mittelsternale Thorakotomie wird durchgeführt. Eine seidene Abbindungsschnur wird um die linke vordere absteigende Coronarartherie 8-10 mm von dem Ursprung entfernt herumgebunden. Das EKG und das MABP werden beständig überwacht. Man gestattet es den Tieren sich zu stabilisieren, dann wird eine myokardiale Ischämie (MI) herbeigeführt durch das Verengen der Schnur bis zu einem kompletten Verschluß. Das therapeutische Testmittel wird dann intravenös in einem Bolus 80 min später gegeben. Zum Zeitpunkt von 90 min wird die Schnur aufgebunden und man läßt das Myokard 270 min reperfundieren.
Die Schnur wird wieder verengt und die Arterie, die das Risiko trägt, wird durch die Injektion von Evans Blau identifiziert. Nach der Excision werden irreversibel geschädigte Teile des Herzens durch Sezieren und von Färbung unter Verwendung von 0,1% Nitroblautetrazolium identifiziert und berechnet als ein Prozentsatz der Masse des Organs. Das proportionale Gebiet, das betroffen ist, wird nach einer erfolgreichen Behandlung reduziert. Die Myeloperoxidase-Aktivität in dem ischämischen Myokard, bestimmt gemäß Mullane et al., (J. Pharmacol. Med. 14: 157, 1985) ist bevorzugtermaßen ebenfalls reduziert. Das ischämischreperfundierte coronare Endothel kann ebenfalls für die Adhärenz isolierter autologer PMN gemessen werden und ist bevorzugtermaßen in den behandelten Tieren reduziert. Die Tiere werden in drei Gruppen getestet: MI-induziert und Inhibitor-behandelt, MI-induziert und Kontroll-behandelt und Schein-behandelte MI (operiert aber ohne Gefäßverschluß).
Behandelte Tiere in den zitierten Studien antworteten auf 400 ug/kg von sLex, präsentiert als ein Phospholipid-Liposom oder 1 mg/ kg des monoklonalen anti-L-Selektin-Antikörpers DREG-200. Im vorliegenden Experiment werden polymerisierte Liposomen im Bereich von etwa 10-400 ug von Kohlenhydrat-Äquivalent pro kg Körpergewicht getestet. Eine gleiche Anzahl von polymerisierten Liposomen, gemacht aus 100% neutralen Lipiden wird in einer gleichen Dosis (auf einer Basis per Liposom) als eine Vehikelkontrolle gegeben. In dem Ausmaß, in welchem Nekrosen, die durch andere Typen akuter entzündlicher Ereignisse des Herzens induziert werden, wie Myokarditis, Restenose und tiefe Venenthrombose, durch ähnliche Mechanismen vermittelt werden, kann die wirksame Dosis, die in dem Herz- Reperfusionsmodell etabliert wurde, ebenfalls für diese Zustände betrachtet werden.
Die Lungen-Reperfusionsverletzung wird modelliert gemäß Protokollen, ähnlich denjenigen von Steinberg et al., (J. Heart Lung Transplant 13: 306, 1994) und Kapelanski et al., (J. Heart Lung Transplant. 12: 294, 1993). Kurz gesagt wird eine allgemeine Anästhesie induziert und die linke Lunge wird exponiert durch die Exzision der nahe dabei liegenden Rippen, Intercostalmuskeln und des Neurovaskulären Systems (neurovasculature). Nach einer Erholungsperiode von 30 min wurden die Tiere für die Fortsetzung ausgewählt, welche einen arteriellen Sauerstoffdruck oberhalb von 200 mm Hg und einen Kohlendioxiddruck unterhalb von 45 mm Hg haben. Nach einer systemischen Heparinisierung wurde die Ischämie der linken Lunge eingeleitet durch den Verschluß der linken Lungenhauptarterie. Die Periode der Ischämie dauert etwa 3 Stunden, wonach die Lunge belüftet wird und man sie reperfundieren läßt. 10 min vor einer Reperfusion empfangen die Tiere einen Bolus einer intravenösen Infusion der therapeutischen Testverbindung. 10 min nach Beginn der Reperfusion wird die rechte Lungenarterie ligiert und die Spitze eines Endotrachealtubus wird vorangeschoben bis jenseits der Öffnung des Trachealbronchus und der rechte Hauptbronchus wird bei der Endausatmung geklammert. Die physiologischen Parameter werden während 6 Stunden aufgezeichnet. Die Tiere werden verglichen auf der Basis der Überlebensdaten plus einiger der folgenden: gravimetrisches Lungenwasser, Partialdrücke von Sauerstoff und Kohlendioxid, inerte Gasverschiebung (gas shunt), Lungengefäßresistenz und die Zahlen der zirkulierenden WBC, Neutrophilen und Lymphozyten. Die Scheintiere werden operiert aber die Lungenarterie wird nicht ligiert - beide Lungen werden während der Periode von 3 Stunden belüftet und dann wie in den Testtieren aufgearbeitet.
In der ersten vorausstehend zitierten Studie antworteten ischämische Tiere auf 1 mg/kg des monoklonalen Antikörpers EL-246, spezifisch für L- und E-Selektin. In dem vorliegenden Experiment werden polymerisierte Liposomen in einem Bereich von etwa 10-400 ug von Kohlenhydrat-Äquivalent pro kg Körpergewicht getestet. Eine gleiche Anzahl polymerisierter Liposomen, die aus 100% neutralen Lipiden gemacht sind, wird bei einer gleichen Dosis (auf einer Basis pro Liposom) als eine Vehikelkontrolle gegeben.
Eine Lungengefäßverletzung, induziert durch einen hämorrhagischen Schock, wird modelliert gemäß Protokollen ähnlich zu denjenigen von Kushimoto et al. (Thrombosis Res. 82: 97, 1996). Kurz gesagt werden erwachsene Ratten mit Pentobarbital anästhesiert, die rechte Karotisarterie wird mit einer Kanüle versehen (cannulated) für das Überwachen des Blutdrucks, und die linke femorale Arterie wird mit einer Kanüle versehen, um Blutproben zu nehmen und Flüssigkeiten zu verabreichen. Eine Phlebotomie wird herbeigeführt durch ein graduelles Entnehmen von 25 ml Blut/kg über 15 min unter Verwendung einer Spritzpumpe. Der durchschnittliche arterielle Druck wird aufrechterhalten zwischen ~30-40 mm Hg während 30 min und dann werden die Ratten wiederbelebt mit 75 ml/kg laktathaltiger (lactated) Ringers Lösung, infundiert während 30 min. Die physiologische Körpertemperatur wurde während dieses Verfahrens unter Verwendung einer Heizlampe aufrecht erhalten. Scheintiere (sham animals) werden auf dieselbe Weise mit einer Kanüle versehen, aber kein Blut wird entfernt. Eine Ansammlung von Leukozyten in der Lunge, gemessen als Myeloperoxydase-Aktivität und die vaskuläre Permeabilität der Lunge gegenüber von Rinderserumalbumin (BSA) erreicht bei 6 Stunden einen Spitzenwert. Der hämorrhagische Schock ist reversibel, da die Tiere, die die ersten 6 Stunden überleben und denen gestattet wird, sich zu erholen, mindestens weitere 5 Tage überleben.
Die therapeutische Verbindung wird getestet durch die Verabreichung von Boli der Testverbindung durch die femorale Arterie in regelmäßigen Intervallen über die kritishe Periode hinweg (0, 2 und 4 Stunden folgend auf die Flüssigkeits-Wiederbelebung). ¹²&sup5;I-BSA wird 30 min vor dem Schlachten zum Zeitpunkt von 6 Stunden injiziert. Eine Mittellinien- Laparotomie wird durchgeführt, Blut wird aus der Abdominal-Aorta gezogen und das Lungen- Gefäßsystem wird mit physiologischer Kochsalzlösung über die rechte ventrikuläre Punktierung perfundiert. Die vaskuläre Permeabilität der Lunge wird berechnet äls ein Verhältnis der CPM in der Lunge gegenüber dem Plasma und ist eine Anzeige für vaskulären Schaden der Lunge. Lungenproben werden homogenisiert und auf Myeloperoxidaseaktivität gemäß Warren et al.,(J. Clin. Invest. 84: 1873, 1989) getestet, als eine Indikation für die Anzahl der Neutrophilen in der Lunge. Die Reduktion der Myeloperoxidaseaktivität und/oder der Permeabilität der Test-Zusammensetzung im Vergleich mit einer Vehikelkontrolle, ist eine Indikation der Wirksamkeit.
In der zitierten Studie antworteten hämorrhagische Tiere auf 1 mg/kg des monoklonalen Antikörpers PB1.3. In dem vorliegenden Experiment werden polymerisierte Liposomen in einem Bereich von etwa 10-400 ug von Kohlenhydrat-Äquivalent pro kg Körpergewicht pro Verabreichung getestet.
Tumormetastase wird modelliert entsprechend zu Protokollen ähnlich denjenigen, die in der PCT-Anmeldung WO/34 609 beschrieben werden. Dieses Modell basiert auf dem in hohem Maße metastasierenden Klon BL6 von der B16-Melanom-Zelllinie (Dr. Jean Starkey, Montana Stane U. Bozeman MT) oder einer ähnlichen Linie, etabliert und kloniert durch Standardverfahren aus einem herausgeschnittenen Melanom oder Karzinom. Eine Suspension metastasierender Zellen wird suspendiert und für 5-10 min bei 37ºC mit der therapeutischen Testverbindung bei verschiedenen Konzentrationen oder einer Vehikelkontrolle inkubiert. Folgend auf die Inkubation werden etwa 2-5 · 104 Zellen in einem Volumen von 200 ul in die Schwanzvene von 8 Wochen alten syngenen Mäusen injiziert. Nach etwa 3 Wochen werden die Tiere geschlachtet. Die Lunge und die Leber werden excisiert und in 10% Formaldehyd fixiert, und die Tumorzellkolonien werden unter einem Seziermikroskop gezählt. Kolonien mit einem Durchmesser von > 1 mm werden separat von kleineren Kolonien gezählt. Ein positives Resultat wird angezeigt durch eine wesentliche Verminderung in der Gesamtzahl der Kolonien oder in dem Anteil von größeren Kolonien. Polymerisierte Liposom-Präparationen werden in einem Bereich von 5 nM-10 uM Endkonzentration von Kohlenhydrat-Äquivalent in der Zellinkubationsmischung getestet.
Allergisches Asthma wird modelliert gemäß Protokollen ähnlich zu denjenigen, die in der PCT-Anmeldung WO 96/35418 beschrieben wurden. Kurz gesagt werden erwachsene Schafe ausgewählt auf der Basis, daß sie eine frühe und eine späte Bronchialantwort gegenüber inhaliertem Antigen von Ascaris suum haben. Die Tiere werden gebändigt, und die Nasenwege werden lokal mit Lidocan anästhesiert. Die Tiere werden mit einem abgedichteten (cuffed) Endotracheal-Tubus über das gegenüberliegende Nasenloch mit einem flexiblen faseroptischen Bronchoskop als Führung intubiert. Der Pleuraldruck wird abgeschätzt mit einem ösophagialen Ballonkatheter. Der Lateraldruck wird gemessen mit einem Seitenloch- Katheter (sidehole catheter) (i.D. 2,5 mm) eingeführt durch und positioniert distal zu der Spitze des Endotrachealtubus. Die Tracheal- und Pleuraldruckkatheter sind verknüpft mit einem Differenzdruckumformer, um den transpulmonaren Druck zu messen. Der Luftfluß wird gemessen durch das Verbinden des proximalen Endes des Endotrachealtubus an einen Pneumotachographen. Der Lungenflußwiderstand wird berechnet als die Veränderung im transpulmonaren Druck, geteilt durch die Veränderung im Fluß bei Mittel-Hub-Volumen (mid-tidal) im Durchschnitt über 5 Atemzüge. Das Gasvolumen des Thorax wird gemessen in einem Körper-Plethysmographen mit konstantem Volumen, um den spezifischen Lungenwiderstand (specific lung resistance SRL) zu erhalten.
Aerosole von therapeutischen Testsuspensionen werden erzeugt unter Verwendung eines Vernebelungsgerätes, welches einen durchschnittlichen aerodynamischen Durchmesser von ~3 um verfügbar macht. Das Vernebelungsgerät wird verbunden mit einem Dosimetersystem, bestehend aus einem Magnetventil und einer Quelle für komprimierte Luft. Das Magnetventil wird I sec lang am Beginn des Einatemzyklus des Atmenden aktiviert. Die Aerosole werden mit einem Hubvolumen (tidal volume) von 500 ml bei einer Rate von 20 Atemzügen pro Minute geliefert. Die therapeutische Testverbindung wird über das Vernebelungsgerät verabreicht. Um eine bronchiale Responsivität zu bewerten, werden kumulative Konzentration- Antwort-Kurven bestimmt durch das Messen von SRL direkt nach einer Inhalation von Puffer und nach einer jeden folgenden Verabreichung von 10 Atemzügen steigender Konzentration von Carbachol in dem Bereich von ~0,25% bis ~4% (Gew./Vol). Der Test wird beendet, wenn die SRL 400% des anfänglichen Wertes übersteigt oder die maximale Dosis erreicht wird. Die bronchiale Responsivität wird bewertet durch das Bestimmen des Punktes, an welchem SRL 400% erreichte. Polymerisierte Liposom-Präparationen werden in einem Bereich von 5 nM - 10 uM Endkonzentration des Kohlenhydrat-Äquivalentes in einer Aerosol-Lösung getestet.
Arthritis wird modelliert gemäß dem Kollagen-Typ-II-induzierten Arthritis-Modell von Zeidler et al., (Autoimmunity 21: 245, 1995). Kurz gesagt werden Gruppen von altersabgestimmten DBA/1-Mäusen intradermal mit 100 ug Kollagen-Typ-II von Rinderknorpeln, emulgiert in komplettem Freund'schem Adjuvans, immunisiert, anschließend 18 Tage später mit 50 ug in unvollständigem Freund'schem Adjuvans. Die therapeutischen Test-Zusammensetzungen werden wöchentlich verabreicht von etwa der Woche 4 bis zu etwa der Woche 8, folgend auf die erste Kollagen-Injektion. Die Erkrankung wird täglich durch visuelle Zeichen von Erythem und von Anschwellen von einem oder mehreren Gelenken bewertet. Immunologische Zeichen einer Autoimunität werden überwacht durch Standard-Immungssays für Serum-Antikörper gegen Kollagen Typ II, Kollagen Typ I und Proteoglycane. Die Reduktion der Titer der Autoantikörper oder eine Verzögerung im Auftreten visueller Zeichen einer Arthritis sind Anzeichen für Wirksamkeit. Polymerisierte Liposomen werden in einem Bereich von etwa 10-400 ug Kohlenhydrat-Äquivalent per kg Körpergewicht getestet. In dem vorliegenden Experiment ewrden polymerisierte Liposomen in einem Bereich von etwa 10-400 ug Kohlenhydrat-Äquivalent per kg Körpergewicht per Verabreichung getestet oder eine gleiche Anzahl von Kontroll-Liposomen.
Andere etablierte Tiermodelle werden implementiert in dem Testen von polymerisierten Liposomen für die Behandlung zusätzlicher klinischer Zustände von Interesse.

Claims

1. Ein Verfahren zur Inhibierung der Bindung zwischen einer ersten Zelle mit einem P- oder L-Selektin und einer zweiten Zelle mit einem Liganden für das Selektin in vitro, umfassend den Schritt, dass zugelassen wird, dass eine Lipid- Zusammensetzung mit der ersten Zelle in Wechselwirkung tritt; wobei die Lipid-Zusammensetzung eine Schicht aus Lipiden umfasst, in der ein Anteil der Lipide kovalent vernetzt sind, ein Anteil der Lipide ein gebundenes Saccharid aufweisen, und ein Anteil der Lipide, die kein gebundenes Saccharid aufweisen, eine Säuregruppe haben, die bei neutralem pH-Wert negativ geladen ist.

2. Verwendung einer Lipid-Zusammensetzung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung der Bindung zwischen einer ersten Zelle mit einem P- oder L-Selektin und einer zweiten Zelle mit einem Liganden für Selektin; wobei die Lipid- Zusammensetzung eine Schicht aus Lipiden umfasst, in der ein Anteil der Lipide kovalent vernetzt sind, ein Anteil der Lipide ein gebundenes Saccharid aufweisen, und ein Anteil der Lipide, die kein gebundenes Saccharid aufweisen, eine Säuregruppe haben, die bei neutralem pH-Wert negativ geladen ist.

3. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Saccharid ein sialyliertes Fucooligosaccharid oder ein Analog davon ist.

4. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Saccharid ein sulfatiertes Fucooligosaccharid ist.

5. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Saccharid ein neutrales Saccharid ist.

6. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß Anspruch 5, worin das Saccharid Lactose oder Maltose ist.

7. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Saccharid ein Disaccharid ist.

8. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin ein Anteil der Lipide, die ein gebundenes Saccharid aufweisen, kovalent mit anderen Lipiden in der Schicht vernetzt sind.

9. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin ein Anteil der Lipide, die ein gebundenes Saccharid aufweisen, nicht kovalent mit anderen Lipiden in der Schicht vernetzt sind.

10. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin ein Anteil der Lipide in der Lipidschicht ein erstes gebundenes Saccharid aufweisen, und ein separater Anteil der Lipide in der Lipidschicht ein zweites gebundenes Saccharid aufweisen, das verschieden ist von dem ersten.

11. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß Anspruch 10, worin das erste gebundene Saccharid Fucose ist und das zweite gebundene Saccharid ein sulfatiertes oder saures Monosaccharid ist.

12. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Säuregruppe eine Carbonsäure ist.

13. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die Säuregruppe eine negativ geladene Sulfat- oder Phosphatgruppe ist.

14. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Lipidschicht in der Lipiddoppelschicht eines Liposoms enthalten ist.

15. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin jedes der Lipide einen einfachen aliphatischen Kohlenwasserstoff enthält.

16. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Zusammensetzung die Bindung des Liganden an das Selektin inhibiert.

17. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Zusammensetzung eine 50% Inhibierungskonzentration (IC&sub5;&sub0;) aufweist, die 10² mal geringer ist als die von Monomer sLex.

18. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Zusammensetzung eine 50% Inhibierungskonzentration (IC&sub5;&sub0;) aufweist, die 10&sup4; mal geringer als die von Monomer sLex ist.

19. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Zusammensetzung eine IC&sub5;&sub0; in einem Selektin-an-Zelle-Bindungsassay von weniger als 100 nM hat.

20. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Selektin P-Selektin ist.

21. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Selektin L-Selektin ist.

22. Ein Verfahren oder eine Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Inhibierung von Leukozyten-Adhäsion oder -Wanderung, worin die erste Zelle eine vaskuläre Endothelzelle ist, dass Selektin P-Selektin ist, und die zweite Zelle ein Leukozyt ist, der aus Neutrophilen, Monozyten, Eosinophilen, und Gedächtnis-T-Lymphozyten ausgewählt ist.

23. Ein Verfahren oder eine Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Inhibierung von Leukozyten-Adherenz oder Fibrin-Ablagerung, worin die erste Zelle ein Plättchen ist und Selektin P-Selektin ist.

24. Ein Verfahren oder eine Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Inhibierung von Leukozyten-Adhäsion oder -Wanderung, worin die erste Zelle ein Leukozyt ist, der aus Lymphozyten, Neutrophilen und Monozyten ausgewählt wird, das Selektin L-Selektin ist, und die zweite Zelle eine vaskuläre Endothelzelle oder eine lymphatische Zelle ist.

25. Ein Verfahren oder eine Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Inhibierung von Lymphozyten-Adhäsion, -Wanderung oder -Aktivierung, worin die erste Zelle ein Lymphozyt ist und das Selektin L-Selektin ist.

26. Das Verfahren oder die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die ersten und zweiten Zellen in einer Umgebung aus Mikrogefäßen oder einem lymphoiden Gewebe sind.

27. Ein Verfahren zur Inhibierung der Bindung zwischen einem P- oder L-Selektin und einem Liganden für das Selektin, umfassend den Schritt, dass zugelassen wird, dass eine Lipid-Zusammensetzung mit dem Selektin in einer in vitro-Umgebung in Wechselwirkung tritt, wo das Selektin den Liganden berührt; wobei die Lipidzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 19 definiert ist.

28. Ein Verfahren zur Selektion eines polymerisierten Glykollposoms mit Selektin-Bindungsaktivität, umfassend die Schritte von:

Bereitstellen eines Glykoliposoms mit kovalent vernetzten Lipiden, und einem gebundenen Saccharid an einem Anteil der kovalent vernetzten Lipide;

Einführen des Glykoliposoms in eine in vitro-Umgebung umfassend ein Selektin und eine Zelle mit einem Selektinliganden; und

Selektieren des Glykoliposoms, falls die IC&sub5;&sub0; 10² mal geringer als die von Monomer sLex ist.

29. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 25, worin das Arzneimittel für die Behandlung einer Krankheit dient, die durch lokale Veränderung der Adherenz von Leukozyten oder Krebszellen an vaskuläres Endothelium, Plättchen oder lymphatisches Gewebe gekennzeichnet ist.

30. Die Verwendung gemäß Anspruch 29, worin die Krankheit eine Entzündungs-Äthiologie aufweist.

31. Die Verwendung gemäß Anspruch 29, worin die Krankheit eine immunologische Äthiologie aufweist.

32. Die Verwendung gemäß Anspruch 29, worin die Krankheit aus Herzerkrankung, Blutungsschock, Arthritis, Asthma und methastatischem Krebs ausgewählt ist.

33. Die Verwendung gemäß Anspruch 32, worin die Krankheit eine Herzerkrankung ist, die aus Ischämie-Reperfusion-Verletzung, Herzinfarkt, Herzmuskelentzündung, Restinose und tiefer Venenthrombose ausgewählt ist.

34. Die Verwendung gemäß Anspruch 33, worin die Krankheit Ischämie-Reperfusion-Verletzung oder Herzinfarkt ist.

35. Die Verwendung gemäß Anspruch 32, worin die Krankheit Blutungsschock ist.

36. Die Verwendung gemäß Anspruch 32, worin die Krankheit rheumatoide Arthritis ist.

37. Die Verwendung gemäß Anspruch 32, worin die Krankheit Asthma ist.

38. Die Verwendung gemäß Anspruch 32, worin die Krankheit methastatischer Krebs ist.