DE69710887T2

DE69710887T2 - Verfahren zur Herstellung von Taxol

Info

Publication number: DE69710887T2
Application number: DE1997610887
Authority: DE
Inventors: Sunil Kumar Chattopadhyay; Sushil Kumar; Kunnath Padmanabhan Madhusudanan; Ram Prakash Sharma
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 1997-09-05
Filing date: 1997-09-05
Publication date: 2002-09-19
Anticipated expiration: 2017-09-06
Also published as: DE69710887D1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Taxolen. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren zur Isolierung von Taxol- Xylosiden A,B und C (Taxol-Analoga A,B,C) aus der Stammrinde der Himalaja-Eibe Taxus wallichiana und auf die Umwandlung dieser isolierten Taxol-Analoga 7-Xylosyl- 10-deacetyl-taxole A, B und C der folgenden Formel (1),
in der R
C&sub6;H&sub5; (analoges Taxol bzw. Taxol-Analogon A oder Xylosid A) oder
CH&sub3;C=CHCH&sub3; (Taxol-Analogon B oder Xylosid B) oder
C&sub5;H&sub1;&sub1; (Taxol-Analogon C oder Xylosid C) darstellt,
in die 10-Deacetyl-taxole A,B,C (10-DAT-A,B,C) die als ein Zwischenprodukt zur weiteren Umwandlung der isolierten Zwischenprodukte (10-DATS) in Taxole A,B,C verwendet werden.
Die 10-Deacetyl-taxole A,B,C besitzen die Formel (2), in der R= C&sub6;H&sub5; (10-Deacetyl-taxol A) oder
CH&sub3;C=CHCH&sub3; (10-Deacetyl-taxol B), oder
Taxole A,B,C besitzen die Formel (3), in der R= C&sub6;H&sub5; (Taxol A) oder
CH&sub3;C=CHCH&sub3; (Taxol B) oder
C&sub5;H&sub1;&sub1; (Taxol C).

Hintergrund der Erfindung

Taxole A und B sind in der Literatur auch als Taxol und Cephalomannin bekannt und Taxol C besitzt keinen anderen Namen [Mise en evidence nouveaux analogues du taxol extracts de Taxus baccata. V. Senilh, S. Blechert, M. Colin, D. Guenard, F. Picot, P. Potier und P. Varenne, Journal of Natural products 47, 131-137 (1984)].
Aus den drei Taxolen A,B,C wird nur Taxol A (= Taxol) klinisch zur Behandlung von Eierstock- und Brustkrebserkrankungen verwendet. Verschiedene Typen von Krebserkrankungen sind mit Taxol A behandelt worden und die Ergebnisse bei der Behandlung von Eierstock- und Brustkrebserkrankungen sind sehr vielversprechend. Taxol A (= Taxol) ist durch die Food and Drug Administration (FDA) der Vereinigten Staaten zur Behandlung von Eierstock- und Brustkrebserkrankungen zugelassen worden.
Taxol B (= Cephalomannin) ist aus den Blättern, Stämmen, Wurzeln von Taxus wallichiana isoliert worden; es wird klinisch nicht verwendet. [Antileukämische Alkaloide aus Taxus wallichiana. R. W. Miller, R. G. Powell, C. R. Smith, Jr., E. Arnold, und J. Clardy, Journal of Organic Chemistry 46, 1469-1474 (1981)].
Taxol C ist aus den Wurzeln von Taxus media isoliert worden [Taxol-Analoga aus den Wurzeln von Taxus media. L. Barboni, P. Gariboldi, E. Torregiani, G. Appendino, B. Gabetta und E. Bombardelli, Physiochemistry 36, 987- 990 (1994)]. Taxol C ist auch aus den Zellkulturen von Taxus baccata isoliert worden und dieses hat eine potente und selektive Cytotoxizität gegen Zelllinien von nichtkleinzelligem Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, ZNS-Krebs und Eierstockkrebs gezeigt; [Neue bioaktive Taxoide aus Zellkulturen von Taxus baccata. W. Ma, G. L. Park, G. A. Gomez, M. H. Nieder, T. I. Adams, J. S. Aynsley, O. P. Sahai, R. J. Smith, R. W. Stahlhut, P. J. Hylands, F. Bitsch und C. Shackleton, Journal of Natural Products 57, 116-122 (1994)].
Taxol A, ein hoch sauerstoffhaltiges diterpenoides Molekül und ein potentes Antikrebsmedikament wurde zuerst aus der Stammrinde von Taxus brevifolia isoliert. Danach ist dieses auch aus anderen Taxus-Spezies, einschließlich Taxus wallichiana, isoliert worden. Taxol A, ein strukturell kompliziertes und chemisch labiles Molekül, benötigte für dessen Isolierung aus Pflanzenmaterialien spezielle und sorgfältige Extraktions- und Separationsverfahren. Leider unterliegen die meisten Arbeiten Eigentumsrechten und sind nicht veröffentlicht worden. Die amerikanischen Bearbeiter haben Alkohol verwendet, um Taxol aus der Stammrinde von T. brevifolia zu extrahieren und haben zur Isolierung von Taxol aus dem alkoholischen Extrakt eine sequentielle Säulenchromatographie über Silicagel bzw. Siliciumdioxid mit einer Methanol/Chloroform-Mischung (2 : 98) als das eluierende Lösungsmittel verwendet, um eine Mischung aus Taxol A (= Taxol) und Taxol B (Cephalomannin) zu erzielen. In einem Verfahren nach dem Stand der Technik ist Taxol A aus der Taxol A und der Taxol B enthaltenden Mischung entweder durch wiederholte Säulenchromatographie über Silicagel oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Ausbeute von 0,01% separiert und isoliert worden. [M. C. Wani, H. I. Taylor, M. E. Wall, P. Coggan und A. T. Mc Phail. Pflanzen Antitumormittel VI: Die Isolierung und Struktur von Taxol, ein neues Antileukämie- und Antitumormittel aus Taxus brevifolia Journal of the American Chemical Society 93, 2325 (1971); und J. H. Cardellina: HPLC- Separierung von Taxol und Cephalomannin, Journal of Liquid Chromatography 14, 659 (1991)].
Gemäß einem anderen Verfahren nach dem Stand der Technik ist Taxol A aus der Stammrinde von Taxus wallichiana mit einer Ausbeute von 0,02% isoliert worden. Das Isolierungs-Verfahren beinhaltet die Extraktion der Stammrinde mit Methanol, Verteilung des methanolischen Extrakts zwischen Wasser und Chloroform und Isolierung von Taxol A aus der löslichen Chloroformfraktion durch Säulenchromatographie über Silicagel. [S. K. Chattopadhyay, V. K. Tripathi, R. S. Thakur, R. P. Sharma und S. P. Jain. Isolierung von Taxol, 10-Deacetyl-baccatin III und (-)Betuligenol aus Taxus baccata 33B, 409 (1994)].
Gemäß einem Verfahren nach dem Stand der Technik von K. V. Rao sind die Taxol-Analoga 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol A und B in Taxol A (= Taxol) und Taxol B (Cephalomannin) umgewandelt worden [Verfahren zur Herstellung von Taxol und Deacetyltaxol, K. V. Rao, US Patentanmeldung Nr. 851469, 13. März 1992].
Das Verfahren zur Herstellung von Taxolen A oder B beinhaltete die Umsetzung des Analogon 7-Xylosyl-10- deacetyl-taxols A oder B mit Periodat in Methanol. Chloroform und Schwefelsäuremischung bei 20-60ºC, um ein Dialdehydprodukt zu ergeben, welches dann mit Phenylhydrazin in einer Mischung aus Methanol und wässriger Essigsäure behandelt wurde und bei 50-60ºC erwärmt wurde, um das Dialdehyd in 10-Deacatyl-taxol A oder B abzubauen, welches dann durch Säulenchromatographie isoliert wurde. Das resultierende 10-Deacetyl-taxol A oder 10-Deacetyl-taxol B wurde dann in Taxol A (= Taxol) oder Taxol B umgewandelt, indem 10- Deacetyl-taxol A oder B mit einem acetylierenden Mittel bei 0-100ºC umgesetzt wurde, um die 2'- und 7- Hydroxylgruppen zu blockieren, indem dann die 10- Hydroxylgruppe mit einem Acetylierungsmittel bei 0-100ºC acetyliert wurde, gefolgt von der Schutzgruppenentfernung an den 2'- und 7-Hydroxylgruppen mit einem geeigneten Schutzgruppenentfernungsmittel zu Taxol A oder B.
Das durch Rao beschriebene Verfahren zur Herstellung des Zwischenprodukts 10-Deacetyl-taxol A oder B aus 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol A oder B, und Umwandlung von 10-Deacetyl-taxol A in Taxol A (= Taxol) leidet an größeren Nachteilen, welche folgendes einschließen:
eine geringe Ausbeute des Zwischenprodukts 10-Deacetyl-taxol A oder B, z. B. ergibt 0,5 g- 7-Xylosyl- 10-deacetyl-taxol A oder B 0,2 g 10-Deacetyl-taxol A oder B; genauso wie
eine geringe Ausbeute des Endprodukts A (= Taxol) aus dessen Zwischenprodukt 10-Deacetyl-taxol A; z. B. ergibt 0.5 g 10-Deacetyl-taxol A 0,3 g Taxol A. In den Berichten von Rao wird weder das experimentelle Verfahren noch die Ausbeute der Umwandlung von 10-Deacetyl-taxol B in Taxol B (= Cephalomannin) beschrieben.
Die Gründe für die geringe Ausbeute der Zwischenprodukte 10-Deacetyl-taxol A oder B können aus dem folgenden verständlich gemacht werden:
(i) Ausführen der Periodatoxidation des 7-Xylosyl- 10-deacetyl-taxols A oder B bei Anwesenheit von Mineralsäure (obwohl in der Patentanmeldung von Rao erwähnt wurde, dass die Periodatoxidation in Anwesenheit eines Überschusses von Natriumbicarbonat auch unter neutralen Bedingungen ausgeführt werden kann, kann die Anwesenheit eines Überschusses von gelöstem Natriumcarbonat zum Abbau der Seitenkette des Dialdehyds führen, was eine Mischung aus Produkten ergibt)
(ii) Erwärmen des Periodatoxidationsprodukts mit Phenylhydrazin in einer Mischung aus Methanol und wässriger Essigsäure bei 50-60ºC, um das Periodatoxidationsprodukt in 10-Deacetyl-taxol A oder B abzubauen.
Die Gründe für die geringe Ausbeute des Endprodukts Taxol A (= Taxol) aus dem Zwischenprodukt, wie durch das Rao-Verfahren beschrieben, kann auf der Auswahl von ungeeigneten Schutzgruppen zur Blockierung von 2',7-Hydroxylgruppen und der Nicht-Optimierung der Reaktionsbedingungen beim Schutz der Gruppen, wie etwa der Reaktionszeitdauer und -temperatur, beruhen.
Darüber hinaus sind die Verfahren zur Herstellung des Zwischenprodukts 10-Deacetyl-taxol C aus dem Analogon 7-Xylyoyl-10-deacetyl-taxol C und die Umwandlung des vorstehenden Zwischenprodukts 10-Deacetyl-taxol C in Taxol C in der Patentanmeldung von Rao nicht abgedeckt worden.

Zusammenfassung der Erfindung

Um die Nachteile der Verfahren des Stands der Technik zu überwinden und gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung haben die Anmelder ein einfaches und praktisches Verfahren zur Herstellung von Taxolen A,B,C gemäß Anspruch 1 entwickelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren folgendes:
(i) Isolieren der Taxol-Analoga 7-Xylosyl-10- deacetyl-taxole A,B,C aus der Stammrinde von Taxus wallichiana durch ein durch die Anmelder entwickeltes verbessertes Verfahren, welches folgendes umfasst:
Extrahieren von luftgetrockneten, pulverisierten Pflanzenmaterialien mit Alkoholen bei Raumtemperatur,
Verdampfen des Lösungsmittels, um einen Rückstand zu erhalten,
Rühren des resultierenden Rückstands mit Wasser zu einem Präzipitat und
Isolieren der Taxol-Analoga
7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol A (Taxol-Analogon A)
7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol B (Taxol-Analogon B) und
7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol C (Taxol-Analogon C)
durch Flash-Chromatographie über Silicagel, welches 0,5% (für Taxol-Analogon A), 0,02% (für Taxol- Analogon B) und 0,0075% (für Taxol-Analogon C) ergibt,
(ii) Umsetzen der isolierten Taxol-Analoga A oder B oder C mit Periodaten in einem polaren Lösungsmittel bei Umgebungstemperatur zu einem Dialdehyd,
(iii) Reduzieren des resultierenden Dialdeyds mit Borhydrid in einer Mischung aus polarem Lösungsmittel und Essigsäure bei 0-40ºC zu einem Acetal,
(iv) Abbauen des Acetals in einer Mischung aus Mineralsäure und chloriertem Lösungsmittel bei 0-40ºC zum Gewinnen des Zwischenprodukts 10-Deacetyl-taxol A oder B oder C,
(v) Versehen der 2',7-Hydroxylgruppen des Zwischenprodukts 10-Deacetyl-taxol A oder B oder C mit einer geeigneten Silan-Schutzgruppe bei 20-40ºC für 20-40 Stunden,
(vi) Acetylieren der freien 10-Hydroxylgruppe mit einem Acetylierungsmittel bei 10-40ºC für 12-18 Stunden,
(vii) Schutzgruppenentfernung von den 2',7-Silylgruppen in Anwesenheit einer Mischung aus Mineralsäure und polarem Lösungsmittel bei 0-10ºC zum Gewinnen des Endprodukts Taxol A oder B oder C.
In dem Verfahren gemäß der Erfindung werden die Mineralsäuren, die in der Mischung aus chloriertem Lösungsmittel zum Ansäuern des Acetals verwendet werden, und auch in der Mischung aus polarem Lösungsmittel zur Schutzgruppenentfernung der 2',7-Hydroxylgruppen aus Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Flußsäure ausgewählt.
Das in der Mischung aus Mineralsäure zum Ansäuern des Acetals verwendete chlorierte Lösungsmittel wird vorzugsweise aus Chloroform, Dichlormethan, Kohlenstofftetrachlorid ausgewählt.
Die zum Schützen der 2',7-Hydroxyl Gruppen der 10-Deacetyl-taxole verwendeten Silane werden vorzugsweise aus Chlortriethylsilan, Chlortriisobutylsilan, Chlortriisopropylsilan und Chlortrimethylsilan ausgewählt.
Die Ausbeuten an Taxolen A,B,C, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden, sind mit den entsprechenden früher erhaltenen Ausbeuten verglichen worden.

Detaillierte Beschreibung des Verfahrens:

Die Aufgabe des vorliegenden Verfahrens ist es, ein verbessertes Verfahren zur Isolierung von Xylosiden von Taxol A,B,C (Taxol-Analoga A,B,C), 7-Xylosyl-10-deacetyltaxol A,B,C der Formel (1), aus der Stammrinde der Himalaja-Eibe Taxus wallichiana mit höheren Ausbeuten zu entwickeln, in der R folgendes darstellt:
C&sub6;H&sub5; (Taxol-Analogon A oder Xylosid A)oder
CH&sub3;C=CHCH&sub3; (Taxol-Analogon B oder Xylosid B) oder
C&sub5;H&sub1;&sub1; (Taxol-Analogon C oder Xylosid C).
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches und kosteneffektives Verfahren zur Umwandlung von diesen isolierten Taxol-Analoga 7-Xylosyl- 10-deacetyl-taxolen A,B,C in die Zwischenprodukte 10-Deacetyl-taxole A,B,C (10-DAT A,B,C) der Formel (2) zu entwickeln, in der R folgendes darstellt:
C&sub6;H&sub5; (10-Deacetyl-taxol A), oder
CH&sub3;C=CHCH&sub3; (10-Deacetyl-taxol B) oder
C&sub5;H&sub1;&sub1; (10-Deacetyl-taxol C);
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Zwischenprodukte 10-Deacetyl-taxol A,B,C in Taxole A,B,C der Formel (3) umzuwandeln, in der R folgendes darstellt:
C&sub6;H&sub5; (Taxol A) oder
CH&sub3;C=CHCH&sub3; (Taxol B) oder
C&sub5;H&sub1;&sub1; (Taxol C);
Gemäß der ersten Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Isolierung der Taxol- Analoga 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol A,B,C aus der Stammrinde von Taxus wallichiana entwickelt worden, in welchem keine Lösungsmittelverteilung verwendet worden ist, um die Analoga zu isolieren. Das verbesserte Isolierungsverfahren umfasst:
Extrahieren von luftgetrockneten, pulverisierten Pflanzenmaterialien mit Alkoholen bei Raumtemperatur,
Verdampfen des Lösungsmittels, um einen Rückstand zu erhalten,
Rühren des resultierenden Rückstandes mit Wasser, um ein dickes Präzipitat zu erhalten,
Isolieren der Analoga 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol A, 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol B und 7-Xylosyl-10-deacetyltaxol C aus dem Präzipitat durch Flash-Chromatographie über ein Bett aus Silicagel.
Gemäß einer anderen Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Umwandlung der isolierten Taxol- Analoga 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxole A,B,C in die Zwischenprodukte 10-Deacetyl-taxole A,B,C (10-DAT A,B,C) der Formel (2) entwickelt worden, in der R =
C&sub6;H&sub5; (10-DAT A) oder
CH&sub3;C=CHCH&sub3; (10-DAT B) oder
C&sub5;H&sub1;&sub1; (10-DAT C),
welches folgendes umfasst:
Auflösen des isolierten Analogs 7-Xylosyl-10- deacetyl-taxols A oder B oder C in einem polaren Lösungsmittel,
Umsetzen der resultierenden Lösung mit Periodat für 20-40 Stunden bei 20-40ºC zur Spaltung des Diolsystems des Xylosids zu einem Dialdehyd,
Reduzieren der Dialdehydlösung in einer Mischung aus polarem Lösungsmittel und Essigsäuremischung mit Borhydrid bei einer Temperatur von 0-40ºC,
Ansäuern des resultierenden Acetals mit einer Mineralsäure in einem chloriertem Lösungsmittel für 2-4 Stunden bei 0-40ºC zu 10-Deacetyl-taxol A oder B oder C.
Gemäß einer weiteren Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Umwandlung der intermediären 10-Deacetyltaxole A,B,C in die Endprodukttaxole A, B und C der Formel (3), in der R=
C&sub6;H&sub5; (Taxol A) oder
CH&sub3;CH=CHCH&sub3; (Taxol B) oder
C&sub5;H&sub1;&sub1; (Taxol C),
entwickelt worden, welches folgendes umfasst:
Behandeln des resultierenden 10-Deacetyl-taxols A oder B oder C mit Silanen (im einzelnen Chlortriethylsilan, Chlortriisobutylsilan, Chlortrimethylsilan, Chlorisopropylsilan) in einer Base bei 10-40ºC für 20-40 Stunden, um die 2'-,7- Hydroxylgruppen von 10-Deacetyl-taxol mit einer Schutzgruppe zu versehen,
Acetylieren der verbleibenden freien 10- Hydroxylgruppe in situ mit einem Acetylierungsmittel bei 10-40ºC für 12-18 Stunden zu einem 2'-,7-disylierten Taxolderivat und
Umsetzen des resultierenden Derivats mit einer Mischung aus Mineralsäure und polarem Lösungsmittel bei 0-10ºC für 10-12 Stunden, um die Schutzgruppen von den 2'-, 7-Hydroxylgruppen zu entfernen und
Isolieren der Taxole A oder B oder C durch Säulenchromatographie über Silicagel.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann das polare Lösungsmittel, das beim Auflösen der Taxol-Analoga 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxole A,B,C in der Mischung aus polarem Lösungsmittel und Essigsäure verwendet wird, um das Dialdehyd zur Borhydridreduktion aufzulösen, und in der Mischung aus polarem Lösungsmittel und Mineralsäuremischung verwendet wird, um die Schutzgruppen von den 2'-, 7-Hydroxylgruppen zu entfernen, aus Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol ausgewählt werden;
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung können geeignete Periodate beim Spalten des Diolsystems des Xylosids aus Natriumperiodat, Kaliumperiodat, Periodsäure, Paraperiodsäure ausgewählt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung, können die beim Reduzieren des Dialdehyds in das Acetal verwendeten Borhydride aus Natriumborhydrid, Kaliumborhydrid, Lithiumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid ausgewählt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Mineralsäure, die in der Mischung aus chloriertem Lösungsmittel zum Ansäuern des Acetals verwendet wird, und auch in der Mischung aus polarem Lösungsmittel verwendet wird, um die Schutzgruppen von den 2',7-Hydoxylgruppen zu entfernen, aus Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Flußsäure ausgewählt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das chlorierte Lösungsmittel in der Mischung mit Mineralsäure zum Ansäuern des Acetals aus Chloroform, Dichlormethan, Kohlenstofftetrachlorid ausgewählt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Basen, die in Anwesenheit von Silanen zum Schützen der 2'-, 7-Hydroxylgruppen verwendet werden, und die auch mit den Acetylierungmitteln zur Acetylierung der 10-Hydoxylgruppe verwendet werden, aus Pyridin, Triethylamin, Dimethylaminopyridin, Piperidin, Morpholin ausgewählt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, können die Silane, die zum Schützen der 2'-,7-Hydroxylgruppen von 10-Deacetyl-taxol A,B,C verwendet werden, aus Chlortriethylsilan, Chlortriisobutylsilan, Chlortriisopropylsilan, Chlortrimethylsilan ausgewählt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Acetylierungsmittel, die zum Acetylieren der 10-Hydroxylgruppe verwendet werden, aus Acetylchlorid, Essigsäureanhydrid, Acetylbromid ausgewählt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Adsorbiermittel, das bei der Flash- Chromatographie zum Isolieren der Taxol-Analoga 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxole A,B,C und zum Reinigen der Taxole A,B,C verwendet wird, aus Silicagel, Florosil, Aluminiumoxid ausgewählt werden.
Die Erfindung wird im Detail in den nachstehend angegebenen Beispielen beschrieben, welche zur Veranschaulichung der Erfindung bereitgestellt werden und daher den Umfang der Erfindung nicht begrenzen sollen.

Beispiel 1

Isolierung von 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxolen A,B,C:

Die Taxol-Analoga 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxole A,B,C wurden durch ein verbessertes Verfahren, das durch uns entwickelt wurde, isoliert, in welchem kein Lösungsmittelverteilungsschritt verwendet wurde. Luftgetrocknete, pulverisierte Stammrinde (1kg) von Taxus wallichiana wurde mit Methanol (3 Liter · 3) für 72 Stunden bei Umgebungstemperatur extrahiert. Das methanolische Extrakt wurde bis auf einen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde mit Wasser verdünnt und mechanisch zu einem dicken Präzipitat verrührt. Das Präzipitat wurde filtriert, getrocknet und die getrocknete Masse wurde in einem minimalen Volumen einer Mischung aus Ethylacetat und Methanol aufgelöst und der Flash-Chromatographie durch ein Bett aus Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat als das Eluiermittel unterworfen. Das Eluiermittel Acetylacetat wurde mit 2-5% Methanol variiert. 2% Methanol in Ethylacetat ergaben 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol A (5 g), 4% Methanol in Ethylacetat ergaben 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol B (0,2 g)und 5% Methanol in Ethylacetat ergaben 7-Xylosyl- 10-deacetyl-taxol C (75mg).

Beispiel-2a

Herstellung von 10-Deacetyl-taxol A

Zu einem kleinen Reaktionskolben wurde das durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren isolierte, Analogon 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol A (100 mg) in Ethanol (20 ml) gegeben; Natriumperiodat (231 mg in 2 ml Wasser) wurde zu der resultierenden alkoholischen Lösung gegeben und die Reaktionsmischung wurde für 20-40 Stunden bei 20-40ºC gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat (2 · 30 ml) extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf einen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde in einer Mischung aus Ethanol und Essigsäure aufgelöst und mit Natriumborhydrid (50 mg) bei 0-40ºC unter Rühren behandelt. Die resultierende Reaktionsmischung wurde dann mit Chloroform (30 ml) verdünnt und mit verdünnter Salzsäure für 2-4 Stunden bei 0-40ºC gerührt; Die Chloroformschicht wurde mit Wasser (2 · 30 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf einen Rückstand konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde mit einer Mischung aus Hexan und Chloroform pulverisiert und filtriert, um 10-Deacetyltaxol A (70 mg) zu ergeben, wobei festgestellt wurde, dass dieses mit einer authentischen Probe in jeder Hinsicht identisch war. [19-Hydroxybaccatin III, 10-Deacetyl-cephalomannin und 10-Deacetyl-taxol: new antitumor toxane aus Taxus wallichiana. J. L. McLaughlin, R. W. Miller, R. G. Powell und C. R. Smith, Jr. Journal of Natural Products 44, 312-319 (1981).]

Beispiel-2b

Herstellung von 10-Deacetyl-taxol B

In einen Reaktionskolben wurde das durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren isolierte, Analogon 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol B (100 mg) in Methanol (20 ml) gegeben und zu diesem wurde Kaliumperiodat (230 mg in 2 ml) gegeben; Die Reaktionsmischung wurde 20-40 Stunden bei 20-40ºC gerührt und mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat (2 · 30 ml) extrahiert; Die Ethylacetatphase wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und im Vakuum bis auf einen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde in einer Mischung aus Methanol und Essigsäure aufgelöst und wurde mit Kaliumborhydrid (50 mg) bei 0-40ºC unter Rühren behandelt. Die resultierende Reaktionsmischung wurde dann mit Dichlormethan (30 ml) verdünnt und mit verdünnter Schwefelsäure für 2-4 Stunden bei 0-40ºC gerührt; Die Dichlormethanschicht wurde mit Wasser (2 · 30 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum bis auf einem Rückstand konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde mit einer Mischung aus Hexan und Dichlormethan pulverisiert und filtriert, um 10-Deacetyl-taxol B (70 mg) zu erzielen, welches in jeder Hinsicht mit einer authentischen Probe identisch war [R. W. Miller et al.; J. Org. Chem. 46, 1469-1474 (1981)].

Beispiel-2c

Herstellung von 10-Deacetyl-taxol C

Das Ausgangsmaterial 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol C zur Herstellung vom 10-Deacetyl-taxol C wurde durch ein in Beispiel 1 beschriebenes Verfahren isoliert. Unter Befolgung des in Beispiel 2a oder 2b beschriebenen Verfahrens wurde 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol C (100 mg) in 10-Deacetyl-taxol C (70 mg) umgewandelt, das in jeder Hinsicht mit einer authentischen Probe identisch war [W. Ma et al., J. Nat. Prod. 57 116-122 (1994)].

Beispiel-3a

Herstellung von Taxol A aus 10-Deacetyl-taxol A (10-DAT A).

Das durch das Verfahren von Beispiel 2a hergestellte 10-deacetyl-taxol A (70 mg) wurde in Pyridin (5 ml) aufgelöst und mit Chlortriethylsilan (0,4 ml) bei 10-40ºC für 20-40 Stunden behandelt, um die 2'-,7-Hydroxylgruppen von 10-DAT A, mit Schutzgruppen zu versehen. Die Reaktionsmischung wurde dann in situ mit Essigsäureanhydrid (0,2 ml) bei 10-40ºC 12-18 Stunden behandelt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit gehacktem Eis abgeschreckt und für eine halbe Stunde stehengelassen und mit Chloroform (30 ml) extrahiert. Die Chloroformschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis auf einen öligen Rückstand konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde mit Hexan pulverisiert und verfestigt. Die Feststoffe wurden filtriert und dann mit einer Mischung aus Methanol und Salzsäure bei 0-10ºC für 10-12 Stunden behandelt, um die Reaktion zu vervollständigen. Die Reaktionsmischung wurde mit kaltem Wasser verdünnt und mit Chloroform (30 ml) extrahiert; Die Chloroformschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben. Der Rückstand wurde gereinigt, indem er durch eine Säule aus Silicagel in Chloroform geführt wurde; 2% m Ethanol in Chloroform eluierten Taxol A, welches als Feststoffe isoliert wurde; die Feststoffe kristallisierten aus einer Mischung aus Hexan und Ethylacetat als Nadeln, um Taxol A (50 mg) zu erzielen.

Beispiel-3b

Herstellung vom Taxol B aus 10-Deacetyl-taxol B (10-DAT B).

10-Deacetyl-taxol B (70 mg, hergestellt durch das Verfahren von Beispiel 2b) wurde in Triethylamin (5 ml) aufgelöst und mit Chlortriisobutylsilan (0,4 ml) bei 10-40ºC für 20-40 Stunden behandelt, um die 2'-, 7-Hydroxylgruppen von 10-DAT B mit Schutzgruppen zu versehen. Die Reaktionsmischung wurde dann in situ mit Acetylchlorid (0,3 ml) bei 10-40ºC für 12-18 Stunden behandelt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit gehacktem Eis behandelt und eine halbe Stunde stehengelassen und mit Dichlormethan (30 ml) extrahiert. Die Dichlormethanschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zu einem öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde mit Hexan pulverisiert und verfestigt. Die Feststoffe wurden filtriert und mit einer Mischung aus Ethanol und Schwefelsäure bei 0-10ºC 10-12 Stunden behandelt, um die Reaktion zu vervollständigen. Die Reaktionsmischung wurde mit kaltem Wasser verdünnt und mit Dichlormethan (30 ml) extrahiert. Die Dichlormethanschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben. Der Rückstand wurde gereinigt, indem er durch eine Säule aus Florosil in Dichlormethan geführt wurde; 3% Methanol in Dichlormethan eluierten Taxol B, welches als Feststoff isoliert wurde. Es kristallisierte aus Methanol/Wasser als Nadeln, um Taxol B (50 mg) zu erzielen.

Beispiel-3c.

Herstellung von Taxol C aus 10-Deacetyl-taxol C (10-DAT, C)

Ausgehend von 10-Deacetyl-taxol C (70 mg), das durch das im Beispiel 2c beschriebene Verfahren hergestellt wurde, wurde dem in Beispiel 3a oder 3b beschriebenen Verfahren folgend Taxol C (50 mg) hergestellt. Das Taxol C erwies sich als in jeder Hinsicht mit einer authentischen Probe identisch [L. Barboni et al., Phytochemistry 36, 987-990 (1994)].

Vorteile

1) Es wurde kein Lösungsmittelverteilungsschritt, wie in einem publizierten Stand der Technik [V. Senilh et al., J. Nat. Prod. 47, 131-137 (1984)] berichtet, zur Isolierung von Taxol-Analoga 7-Xylosyl-10-deacetyl-taxolen A,B,C in den Verfahren zur Isolierung der Analoga der vorliegenden Erfindung verwendet. Die Abwesenheit vom Lösungsmittelverteilungsschritt führte zu höheren Ausbeuten der isolierten Analoga,
7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol A, Ausbeute 0,5%;
7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol B, Ausbeute 0,02%;
7-Xylosyl-10-deacetyl-taxol C, Ausbeute 0,0075%,
verglichen mit den berichteten Ausbeuten [V. Senilh et al., J. Nat. Prod. 47, 131 (1984)].
2) Verglichen mit dem Stand der Technik wurde das Diol des Xylosidsystems der isolierten Analoga unter nicht sauren Bedingungen zu einem Dialdehyd gespalten. Es wurde keine Säure in dem Periodatoxidationsschritt verwendet.
3) Das Reduzieren des Dialdehyds mit Borhydrid zu einem Acetal, gefolgt von einem Abbau in 10-Deacetyl-taxole A,B,C (10-DAT A,B,C) wurde unter milderen Bedingungen 0-40ºC erreicht, was zu höheren Ausbeuten der Zwischenprodukte (10-DAT A,B,C) führte.
4) Die Verwendung von Silanen führte zum selektiven Schutz der 2'-,7-Hydoxylgruppen von 10-Deacetyl-taxolen A,B,C auf effiziente Weise und erleichterte auch die Abspaltung der Schutzgruppen unter milden Bedingungen (0-10ºC), was zu höheren Ausbeuten von Taxolen A,B,C führte.
5) Bisher ist kein Verfahren zur Herstellung von Taxolen mit diesen Ausbeuten beschrieben worden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung der Taxole A, B, C der Formel (3),

R=C&sub6;H&sub5; (taxol A)

=CH&sub3;C=CH-CH&sub3; (taxol B)

=C&sub5;H&sub1;&sub1; (taxol C)

wobei R folgendes darstellt:

C&sub6;H&sub5; (Taxol A) oder

CH&sub3;C=CHCH&sub3; (Taxol B) oder

C&sub5;H&sub1;&sub1; (Taxol C),

welches das Isolieren der analogen 7-Xylosyl-10-deacetyltaxole A, B, C der folgenden Formel (1),

R=C&sub6;H&sub5; (taxol analogue A)

=CH&sub3;C=CHCH&sub3; (taxol analogue B)

=C&sub5;H&sub1;&sub1; (taxol analogue C)

wobei R folgendes darstellt:

C&sub6;H&sub5; (analoges Taxol A oder Xylosid A) oder

CH&sub3;C=CHCH&sub3; (analoges Taxol B oder Xylosid B) oder

C&sub5;H&sub1;&sub1; (analoges Taxol C oder Xylosid C),

aus der Stammrinde von Taxus wallichiana umfasst, durch

(a) Extrahieren der luftgetrockneten, pulverisierten Stammrinde mit Alkoholen bei Umgebungstemperatur,

(b) Verdampfen des Lösungsmittels, um einen Rückstand zu erhalten,

(c) Rühren des Rückstands mit Wasser, um ein dickes Präzipitat zu erhalten,

(d) Isolieren der durch eine geeignete Separierungstechnik, wie etwa Flash- Chromatographie, erhaltenen analogen 7-Xylosyl- 10-deacetyl-taxole A, B, C aus dem Präzipitat,

(e) Auflösen der isolierten Analoga in einem polaren Lösungsmittel

(f) Umsetzen der resultierenden Lösung mit Periodaten bei 20-40ºC für 20-40 Stunden, um das Diolsystem der Xyloside in Dialdehyde zu spalten,

(g) Reduzieren der Dialdehyd-Lösung mit Borhydriden bei 0-40ºC in einer Mischung aus polarem Lösungsmittel und Essigsäure,

(h) Ansäuern des resultierenden Acetals mit einer Mineralsäure in einem chlorierten Lösungsmittel bei 0-40ºC für 2-4 Stunden, um 10-Deacetyltaxole A, B, C der folgenden Formel (2) zu erhalten:

R=C&sub6;H&sub5; (10-deacetyl taxol A)

=CH&sub3;C=CHCH&sub3; (10-deacetyl taxol 8)

=C&sub5;H&sub1;&sub1; (10-deacetyl taxol C)

wobei R folgendes darstellt:

C&sub6;H&sub5; (10-Deacetyl-taxol A) oder

CH&sub3;C=CHCH&sub3; (10-Deacetyl-taxol B) oder

C&sub5;H&sub1;&sub1; (10-Deacetyl-taxol C),

(i) Behandeln der resultierenden 10-Deacetyl-taxole A, B, C mit spezifischen Silanen, die aus Chlortriethylsilan, Chlortriisobutylsilan, Chlortriisopropylsilan und Chlortrimethylsilan ausgewählt werden, bei einer spezifischen Temperatur von 10-40ºC für eine Dauer von 20-40 Stunden, um die 2',7-Hydroxylgruppen der 10-Deacetyl-taxole A, B, C zu blockieren;

(j) Acetylieren der verbleibenden freien 10-Hydroxylgruppe in situ mit einem Acetylierungsmittel bei 10-40ºC für 12 bis 18 Stunden, um einen festen Rückstand zu erhalten;

(k) Umsetzen der resultierenden Feststoffe mit einer Mischung aus Mineralsäure und polarem Lösungsmittel bei 0-10ºC für 10-12 Stunden, um die Schutzgruppen an den 2',7-Hydroxylgruppen zu entfernen und

(l) Isolieren der Taxole A, B, C durch eine geeignete Separierungstechnik, wie etwa der Säulenchromatographie.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die polaren Lösungsmittel, die beim Auflösen der analogen 7-Xylosyl- 10-deacetyl-taxole A, B, C in der Mischung aus polarem Lösungsmittel und Essigsäure zur Auflösung des Dialdehyds für die Borhydrid-Reduktion, und in der Mischung aus polarem Lösungsmittel und Mineralsäuremischung zur Schutzgruppenentfernung von den 2',7-Hydroxylgruppen verwendet werden, aus Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol ausgewählt werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die beim Spalten des Diols verwendeten Periodate aus Natriumperiodat, Kaliumperiodat, Periodsäure, Paraperiodsäure ausgewählt werden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Borhydride, die beim Reduzieren des Dialdehyds in das Acetal verwendet werden, aus Natriumborhydrid, Kaliumborhydrid, Lithiumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid ausgewählt werden.

5. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Anspruch, wobei die Basen, die in Anwesenheit von Silanen zum Schützen der 2',7-Hydroxylgruppen und auch mit den Acetylierungsmitteln zum Acetylieren der 10-Hydroxylgruppe verwendet werden, aus Pyridin, Dimethylaminopyridin, Piperidin ausgewählt werden.

6. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Anspruch, wobei die Acetylierungsmittel, die zum Acetylieren der 10-Hydroxylgruppe verwendet werden, aus Essigsäureanhydrid, Acetylchlorid, Acetylbromid ausgewählt werden.

7. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Anspruch, wobei das Adsorbierungsmittel, das bei der Flash-Chromatographie zum Isolieren der Taxol-Analoga A, B, C und zum Reinigen der Taxole A, B, C verwendet wird, aus Silicagel, Florosil und Aluminiumoxid ausgewählt wird.

8. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Anspruch 1, wobei die Mineralsäure, die in der Mischung mit chloriertem Lösungsmittel zum Ansäuern des Acetals und auch in der Mischung mit polarem Lösungsmittel zur Schutzgruppenentfernung von den 2',7-Hydroxylgruppen verwendet wird, aus Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure und Flußsäure ausgewählt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das chlorierte Lösungsmittel, das in der Mischung mit der Mineralsäure zum Ansäuern des Acetals verwendet wird, aus Chloroform, Dichlormethan, Kohlenstofftetrachlorid ausgewählt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Silane, die zum Schützen der 2',7-Hydroxylgruppen der 10-Deacetyl-taxole verwendet werden, aus Chlortriethylsilan, Chlortriisobutylsilan, Chlortriisopropylsilan, Chlortrimethylsilan ausgewählt werden.