DE69700303T2

DE69700303T2 - Asymmetrische benzoxanthenfarbstoffe

Info

Publication number: DE69700303T2
Application number: DE69700303T
Authority: DE
Inventors: Scott Benson; Vergine Furniss; Joan Hauser; Kevin Hennessey; Steven Menchen; Peter Theisen
Original assignee: Perkin Elmer Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1997-04-01
Publication date: 2000-02-17
Anticipated expiration: 2017-04-02
Also published as: US6020481A; ATE181741T1; JP2006307218A; US20020115067A1; JP2003192931A; EP0891393A1; CA2250014A1; US5840999A; CA2250014C; JP3386473B2; JP2010070769A; US7179906B2; JP4644155B2; US6617445B2; AU2432397A; US20040225119A1; AU707242B2; JP2000500183A; WO1997036960A1; DE69700303D1

Description

Die Erfindung betrifft im allgemeinen fluoreszierende Farbstoffverbindungen, die als molekulare Sonden geeignet sind. Insbesondere betrifft die Erfindung asymmetrische Benzoxanthen-Farbstoffe, die als fluoreszierende Markierungsreagenzien geeignet sind.
Der nicht-radioaktive Nachweis von biologischen Analyten ist eine wichtige Technik in der modernen analytischen Biotechnologie. Durch die Vermeidung von radioaktiven Markierungen wird die Sicherheit erhöht und der Einfluß der Reagenzentsorgung auf die Umwelt stark vermindert, was zu kostengünstigeren Analysen führt. Beispiele für Verfahren, in denen nicht-radioaktive Nachweisverfahren eingesetzt werden, schließen DNA-Sequenzierung, Verfahren mit Oligonukleotid-Sonden, Nachweis von Produkten der Polymerase-Kettenreaktion, Immunoassays und dergleichen ein.
Bei vielen Anwendungen ist der unabhängige Nachweis vieler räumlich überlappender Analyten in einem Gemisch erforderlich, z. B. bei Einzelröhren-Multiplex-DNA-Sondenassays, Immunoassays, Mehrfarben-DNA-Sequenzierverfahren und dergleichen. Im Fall von Multi- Loci-DNA-Sondenassays kann durch Bereitstellen eines Mehrfarbennachweises die Anzahl von Reaktionsröhrchen verringert werden, wodurch die experimentellen Protokolle vereinfacht werden und die Herstellung von anwendungsspezifischen Kits erleichtert wird. Beim automatischen DNA-Sequenzieren erlaubt eine Mehrfarbenmarkierung die Analyse aller vier Basen in einer einzelnen Spur, wodurch der Durchsatz im Vergleich zu Einzelfarbenverfahren erhöht wird und Unsicherheiten, die mit elektrophoretischen Zwischenspur-Mobilitätsveränderungen zusammenhängen, ausgeschlossen werden.
Der Multiplex-Nachweis führt zu einer Anzahl von schwerwiegenden Einschränkungen bei der Auswahl der Farbstoffmarkierungen, insbesondere für Analysen, die eine elektrophoretische Trennung und eine Behandlung mit Enzymen erfordern, z. B. bei der DNA-Sequenzierung. Erstens ist es schwierig, eine Gruppe von Farbstoffen zu finden, deren Emissionsspektren spektral aufgelöst sind, da die typische Emissionsbanden-Halbwertsbreite für orga nische fluoreszierende Farbstoffe etwa 40-80 Nanometer (nm) beträgt und die Breite des verfügbaren Spektrums durch die Anregungslichtquelle beschränkt ist. Der hier in Bezug auf einen Satz von Farbstoffen verwendete Begriff "spektrale Auflösung" bedeutet, daß die Fluoreszenzemissionsbanden der Farbstoffe in ausreichendem Maß voneinander verschieden sind, d. h. ausreichend nichtüberlappend, so daß Reagenzien, mit denen die jeweiligen Farbstoffe verbunden sind, z. B. Polynukleotide, auf der Basis des durch die jeweiligen Farbstoffe erzeugten fluoreszierenden Signals unter Verwendung von Standard-Photonachweissystemen unterschieden werden können, beispielsweise durch Bandfilter und Photomultiplierröhren, CCDs und Spektrographen oder dergleichen, wie sie beispielsweise in den US-PSen 4,230,558, 4,811,218 oder in Wheeless et al., Seiten 21-76, in: Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis (Academic Press, New York, 1985), beschrieben sind. Zweitens, selbst wenn Farbstoffe mit nicht-überlappenden Emissionsspektren gefunden werden, kann der Satz nach wie vor nicht geeignet sein, wenn die jeweiligen Fluoreszenzausbeuten zu niedrig sind. Beispielsweise kann beim DNA-Sequenzieren ein erhöhtes Beladen der Probe niedrige Fluoreszenzausbeuten nicht ausgleichen, vgl. Pringle et al., DNA Core Facilities Newsletter, 1 : 15-21 (1988). Drittens, wenn verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe parallel verwendet werden, wird eine gleichzeitige Anregung schwierig, da die Absorptionsbanden der Farbstoffe weit voneinander beabstandet sind. Viertens darf die Ladung, die Molekülgröße und die Konformation der Farbstoffe die elektrophoretischen Mobilitäten der Fragmente nicht nachteilig beeinflussen. Schließlich müssen die Fluoreszenzfarbstoffe mit der zur Erzeugung oder Veränderung der Fragmente verwendeten Chemie verträglich sein, z. B. mit DNA-Syntheselösungsmitteln und -Reagenzien, Puffern, Polymeraseenzymen, Ligaseenzymen und dergleichen.
Aufgrund dieser schwerwiegenden Einschränkungen wurden lediglich einige wenige Fluoreszenzfarbstoffsätze gefunden, die in Mehrfarbenanwendungen eingesetzt werden können, insbesondere im Bereich des Vierfarben-DNA-Sequenzierens, vgl. z. B. Smith et al., Nucleic Acids Research, 113: 2399-2412 (1985), Prober et al., Science 238 : 336-341 (1987) und Connell et al., Biotechniques 5: 342-348 (1987). Fig. 1 zeigt Beispiele von fluoreszierenden Xanthen-Farbstoffen, die gegenwärtig als langweilige Markierungen verwendet werden, die oberhalb 550 nm emittieren, einschließlich der beiden Farbstoffe TAMRA (22) und ROX (26) auf Rhodaminbasis und der beiden Farbstoffe HEX (23) und NAN (24) auf Fluoresceinbasis.
WO 91/07507 beschreibt 4,7-Dichlor- und 1',2',7',8'-Dibenzo-4,7-dichlorfluoresceine und deren Verwendung in Verfahren für das automatische DNA-Sequenzieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Klasse von asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffen, die als Fluoreszenzfarbstoffe geeignet sind.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Klasse von asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffen bereitzustellen, die zum gleichzeitigen Nachweis vieler räumlich überlappender Analyten geeignet sind, die die vorstehend beschriebenen Beschränkungen nicht aufweisen und die ein Fluoreszenzemissionsmaximum oberhalb von 550 nm bereitstellen, wenn sie mit Anregungslicht einer Wellenlänge von 480 nm bis 500 nm belichtet werden.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Klasse von asymmetrischen Benzoxanthen- Farbstoffen bereitzustellen, die zum gleichzeitigen Nachweis vieler räumlich überlappender Analyten geeignet sind, die die vorstehend beschriebenen Beschränkungen nicht aufweisen und deren Fluoreszenzeigenschaften durch Veränderung von Substituenten an einer Vielzahl von Positionen eingestellt werden können.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren und Zwischenprodukte bereitzustellen, die zur Synthese der erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe geeignet sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Nukleotide und Polynukleotide bereitzustellen, die mit den erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffen markiert sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Phosphoramiditverbindungen bereitzustellen, die die erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe einschließen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Fragmentanalyseverfahren, einschließlich DNA- Sequenzierverfahren bereitzustellen, bei denen die erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe eingesetzt werden.
In einem ersten Aspekt werden die vorstehenden und andere Aufgaben der Erfindung erreicht durch eine asymmetrische Benzoxanthen-Farbstoffverbindung der allgemeinen Formel
in der die Reste Y&sub1; und Y&sub2; unabhängig eine Hydroxylgruppe, ein Sauerstoffatom, eine Iminium- oder Aminogruppe sind. Die Reste R&sub1;-R&sub6; sind unabhängig ein Wasserstoff-, Fluor-, Chloratom, eine niedere Alkyl-, niedere Alkenyl-, niedere Alkinylgruppe, Sulfonat-, Amino-, Ammonium-, Amido-, Nitril-, Alkoxygruppe, eine verbindende Gruppe oder Kombinationen davon. Der Rest R&sub9; ist eine Acetylen-, Alkan-, Alken-, Cyanogruppe, eine substituierte Phenylgruppe oder Kombinationen davon, wobei die substituierte Phenylgruppe die allgemeine Formel
hat, in der der Rest X&sub1; eine Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppe ist, die Reste X&sub2; und X&sub5; unabhängig ein Wasserstoff-, Chlor-, Fluoratom oder eine niedere Alkylgruppe sind und die Reste X&sub3; und X&sub4; unabhängig ein Wasserstoff-, Chlor-, Fluoratom, eine niedere Alkylgruppe, eine Carbonsäure-, Sulfonsäuregruppe oder eine verbindende Gruppe sind.
In einem zweiten Aspekt schließt die Verbindung Phosphoramiditverbindungen der allgemeinen Formel
ein, in der der Rest X ein Spacer-Arm, der Rest Y eine verbindende Gruppe, der Rest B&sub1; eine Phosphitester-Schutzgruppe ist, die Reste B&sub2; und B&sub3; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer niederen Alkyl-, niederen Alkenyl-, niederen Arylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, einer Arylalkylgruppe und einer Cycloalkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, und D die vorstehend beschriebene asymmetrische Benzoxanthen- Farbstoffverbindung ist. Die Reste Y und D sind durch eine verbindende Gruppe verbunden, die durch Umsetzung einer verbindenden Gruppe mit ihrer komplementären Funktionalität gebildet wird, wobei die verbindende Gruppe in einer der Positionen R&sub1;-R&sub9; an den Farbstoff D gebunden ist.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung eine Phosphoramiditverbindung der allgemeinen Formel
bereit, in der der Rest B&sub1; eine Phosphitester-Schutzgruppe ist, die Reste B&sub2; und B&sub3; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer niederen Alkyl-, niederen Alkenyl-, niederen Arylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, einer Arylalkyl- und Cycloalkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, der Rest B&sub5; eine Säure-spaltbare Hydroxyl-Schutzgruppe, der Rest B eine Nukleotidbase und der Rest D die vorstehend beschriebene Farbstoffverbindung ist. Wenn der Rest B Purin oder 7-Desazapurin ist, ist der Zuckerrest an der N&sup9;-Position des Purins oder des 7-Desazapurins gebunden, und wenn der Rest B Pyrimidin ist, ist der Zuckerrest an der N¹-Position des Pyrimidins gebunden. Die Reste B und D sind durch eine verbindende Gruppe, die durch die Umsetzung einer verbindenden Gruppe mit ihrer komplementären Funktionalität gebildet wird, verbunden, wobei die verbindende Gruppe an einer der Positionen R&sub1;-R&sub9; an den Rest D gebunden ist. Wenn der Rest B ein Purin ist, ist die verbindende Gruppe an die 8-Position des Purins gebunden, wenn der Rest B 7-Desazapurin ist, ist die verbindende Gruppe an die 7-Position des 7-Desazapurins gebunden und wenn der Rest B Pyrimidin ist, ist die verbindende Gruppe an die 5-Position des Pyrimidins gebunden. Der Rest B ist vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Uracil, Cytosin, 7-Desazaadenin und 7-Desazaguanosin ausgewählt.
In einem vierten Aspekt schließt die vorliegende Erfindung eine Verbindung ein, die als Zwischenprodukt in der Synthese der vorstehend beschriebenen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe geeignet ist, wobei die Verbindung die allgemeine Formel
hat, in der die Reste R&sub3;-R&sub7; die vorstehend angegebene Bedeutung haben und der Rest Y&sub2; eine Hydroxyl- oder Aminogruppe ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts ist der Rest R&sub3; ein Fluoratom und der Rest Y&sub2; eine Hydroxylgruppe.
In einem fünften Aspekt schließt die Erfindung ein Nukleotid ein, das mit den vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffen markiert ist, wobei das Nukleotid die allgemeine Formel
hat, in der der Rest B ein 7-Desazapurin, Purin oder eine Pyrimidin-Nukleotidbase ist, die Reste W&sub1; und W&sub2; unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe sind, der Rest W&sub3; eine Hydroxylgruppe oder die Gruppen,
und der Rest D eine erfindungsgemäße Farbstoffverbindung ist. Wenn der Rest D Purin oder 7-Desazapurin ist, ist der Zuckerrest an der N&sup9;-Position des Purins oder des Desazapurins gebunden, und wenn der Rest B Pyrimidin ist, ist der Zuckerrest an der N¹-Position des Pyrimidins gebunden. Die verbindende Gruppe, die die Reste B und D verbindet, ist an einer der Positionen R&sub1;-R&sub9; an den Rest D gebunden. Wenn der Rest B ein Purin ist, ist die verbindende Gruppe an die 8-Position des Purins gebunden, wenn der Rest B 7-Desazapurin ist, ist die verbindende Gruppe an die 7-Position des 7-Desazapurins gebunden, und wenn der Rest B Pyrimidin ist, ist die verbindende Gruppe an die 5-Position des Pyrimidins gebunden. Der Rest B ist vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Uracil, Cytosin, Desazaadenin und Desazaguanosin ausgewählt.
In einem sechsten Aspekt schließt die Erfindung ein markiertes Polynukleotid ein, das ein Nukleotid der allgemeinen Formel
enthält, in der der Rest B ein 7-Desazapurin, Purin oder eine Pyrimidin-Nukleotidbase ist, der Rest Z&sub1; ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, der Rest 22 ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, HPO&sub4; oder Nuc ist, wobei "Nuc" ein Nukleotid bezeichnet. Das Nukleosid und Nuc sind durch eine Phosphodiesterbindung verbunden, wobei die Phosphodiestergruppe an die 5-Position des Restes Nuc gebunden ist, der Rest 23 aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, HPO&sub3; und Phosphat-Analoga davon und Nuc ausgewählt ist, wobei Nuc und das Nukleosid durch eine Phosphodiesterbindung verbunden sind, wobei die Bindung an die 3-Position des Restes Nuc gebunden ist, und der Rest D eine erfindungsgemäße Farbstoffverbindung ist. Phosphat-Analoga von HPO&sub3; schließen Analoga ein, in denen ein nicht-verbrückendes Sauerstoffatom durch einen Nicht-Sauerstoffrest ersetzt ist, z. B. durch ein Schwefelatom, eine Amino-, Anilidat-, Anilinthioatgruppe und dergleichen.
Wenn der Rest B Purin oder 7-Desazapurin ist, ist der Zuckerrest an der N&sup9;-Position des Purins oder des Desazapurins gebunden, und wenn der Rest B Pyrimidin ist, ist der Zuckerrest an der N¹-Position des Pyrimidins gebunden. Die verbindende Gruppe, die die Reste B und D verbindet, ist an einer der Positionen R&sub1;-R&sub9; an den Rest D gebunden. Wenn der Rest B ein Purin ist, ist die verbindende Gruppe an die 8-Position des Purins gebunden, wenn der Rest B 7-Desazapurin ist, ist die verbindende Gruppe an die 7-Position des 7-Desazapurins gebunden und wenn der Rest B Pyrimidin ist, ist die verbindende Gruppe an die 5-Position des Pyrimidins gebunden. Der Rest B ist vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Uracil, Cytosin, Desazaadenin und Desazaguanosin ausgewählt.
In einem siebten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Polynukleotid-Sequenzierung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Farbstoffe bereit. Das Verfahren umfaßt die Schritte des Bildens eines Gemisches einer ersten, einer zweiten, einer dritten und einer vierten Klasse von Polynukleotiden, so daß jedes Polynukleotid in der ersten Klasse ein 3'- terminales Didesoxyadenosin enthält und mit einem ersten Farbstoff markiert ist, jedes Polynukleotid in der zweiten Klasse ein 3'-terminales Didesoxycytidin enthält und mit einem zweiten Farbstoff markiert ist, jedes Polynukleotid in der dritten Klasse ein 3'-terminales Didesoxyguanosin enthält und mit einem dritten Farbstoff markiert ist, und jedes Polynukleotid in der vierten Klasse ein 3'-terminales Didesoxythymidin enthält und mit einem vierten Farbstoff markiert ist. In diesem Verfahren ist einer der ersten, zweiten, dritten oder vierten Farbstoffe ein erfindungsgemäßer asymmetrischer Benzoxanthen-Farbstoff. Die anderen der Farbstoffe sind so gewählt, daß sie vom/von den asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoff(en) und voneinander spektral trennbar sind. Nach dem Bilden des vorstehenden Gemisches werden die Polynukleotide elektrophoretisch getrennt, wodurch Banden von Polynukleotiden mit ähnlicher Größe gebildet werden. Als nächstes werden die Banden mit einem Beleuchtungsstrahl, der Fluoreszenz der Farbstoffe erzeugen kann, beleuchtet. Schließlich werden die Polynukleotidklassen durch das Fluoreszenzspektrum der markierten Polynukleotide in jeder Bande identifiziert.
In einem achten Aspekt schließt die Erfindung ein Verfahren zur Fragmentanalyse ein, in dem die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen verwendet werden. Das Verfahren dieses Aspekts umfaßt die Schritte: Erzeugen eines markierten Polynukleotid-Fragments, wobei das Fragment mit einer erfindungsgemäßen Farbstoffverbindung markiert wird; Unterwerfen des markierten Polynukleotid-Fragments einem größenabhängigen Trennverfahren; und Nachweisen des markierten Polynukleotid-Fragments nach dem Trennverfahren.
Die erfindungsgemäßen Farbstoffe stellen mindestens sieben wichtige Vorteile gegenüber gegenwärtig erhältlichen Farbstoffen bereit, die zum gleichzeitigen Nachweis vieler räumlich überlappender Analyten verwendet werden, insbesondere im Bereich der Mehrfarben-DNA- Sequenzierung auf Fluoreszenzbasis. Erstens sind die erfindungsgemäßen Farbstoffe unter DNA-Synthesebedingungen sehr viel stabiler als die gegenwärtig erhältlichen Farbstoffe, die die gewünschten spektralen Eigenschaften aufweisen. Diese erhöhte Stabilität unter DNA- Synthesebedingungen ermöglicht eine einfachere Herstellung von markierten Oligonukleotid- Reagenzien unter Verwendung automatisierter DNA-Synthesetechniken, z. B. markierte PCR-Primer, DNA-Sequenzier-Primer und Oligonukleotid-Hybridisierungssonden. Zweitens weisen die erfindungsgemäßen Farbstoffe eine beträchtlich höhere Photostabilität auf als die Farbstoffe auf Fluoresceinbasis, die bisher im Wellenlängenbereich oberhalb etwa 550 nm eingesetzt wurden. Drittens haben die erfindungsgemäßen Farbstoffe ein Absorptionsspektrum mit einer "Schulter" im blauen Bereich, wodurch eine wirksamere Anregung der Farbstoffe bei kürzeren Wellenlängen im Vergleich zu Dibenzoxanthen-Farbstoffen oder Farbstoffen auf Rhodaminbasis ermöglicht wird. Viertens haben die erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe beträchtlich höhere Quantenausbeuten als die spektral ähnlichen Farbstoffe auf Rhodaminbasis. Fünftens macht die erhöhte Anregungsausbeute mit typischen Lichtquellen in Verbindung mit den hohen Quantenausbeuten der erfindungsgemäßen Farbstoffe die Farbstoffe beträchtlich heller als die gegenwärtig erhältlichen Farbstoffe mit den gewünschten spektralen Eigenschaften. Helligkeit ist besonders wichtig im Zusammenhang mit DNA-Sequenzier-Anwendungen, wobei die Menge des Analyten durch Elektrophorese-Beladefaktoren beschränkt ist und die Gesamtfluoreszenz über Hunderte von räumlich beabstandeten Spezies verteilt ist. Der hier verwendete Begriff "Helligkeit" bezieht sich auf die kombinierten Effekte des Extinktionskoeffizienten und der Fluoreszenz- Quantenausbeute auf die schließlich erhaltene Intensität der Fluoreszenz-Emisson. Durch Erhöhen der Helligkeit der fluoreszierenden Markierungen können die größeren, weniger häufigen Fragmente einfacher nachgewiesen werden und es ist weniger Probe für die Elektrophorese notwendig, wodurch eine überlegene elektrophoretische Auflösung erhalten wird. Darüber hinaus trägt eine erhöhte Helligkeit der Analyten zu einem besseren Signal- Rauschverhältnis bei, was zu einer verbesserten Auflösung von räumlich und spektral benachbarten Spezies führt. Sechstens erlaubt die Asymmetrie der erfindungsgemäßen Farbstoffe das Einstellen des Emissionsspektrums der Farbstoffe durch Variieren der Substituenten R&sub1;-R&sub9;, insbesondere der Substituenten R&sub1;-R&sub3; an dem von Resorcin abgeleiteten Teil des Farbstoffs. An symmetrischen Dibenzoxanthenverbindungen ist nur eine äquivalente Substituentenposition verfügbar, wodurch die Freiheitsgrade, die für ein spektrales Einstellen der Farbstoffe zur Verfügung stehen, stark eingeschränkt werden. Siebtens können die erfindungsgemäßen Farbstoffe leicht in stabile Phosphoramiditderivate umgewandelt werden, die in der automatischen chemischen Synthese von markierten Oligonukleotiden eingesetzt werden können.
Die nachstehende Beschreibung, die Zeichnungen und die Ansprüche erläutern die Erfindung.
Fig. 1 zeigt die Strukturen verschiedener bekannter Fluoreszenzfarbstoffe, die bisher als langweilige Markierungen, d. h. Markierungen, die oberhalb 550 nm emittieren, eingesetzt wurden.
Fig. 2A und 2B zeigen eine bevorzugte Synthese der erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe.
Fig. 3 zeigt eine bevorzugte Synthese von Oligonukleotiden, die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen markiert sind.
Fig. 4 zeigt die Anregungsspektren von TAMRA (22)- und CI-FLAN (2)-markierten Oligonukleotiden.
Fig. 5 zeigt einen Vergleich der Quantenausbeuten von TAMRA (22)- und CI-FLAN (2)-markierten Oligonukleotiden.
Fig. 6 zeigt einen Vergleich der equimolaren Emissionsintensitäten von TAMRA (22)- und Cl- FLAN (2)-markierten Oligonukleotiden.
Fig. 7 zeigt Fluoreszenz-Emissionsspektren für Mitglieder eines Vierfachsets von Farbstoffmarkierten DNA-Sequenzier-Primern.
Fig. 8 zeigt eine Synthese eines erfindungsgemäßen 2-Fluor-1,3-dihydroxynaphthalin-Zwischenprodukts.
Fig. 9 zeigt die Ergebnisse eines DNA-Sequenzierexperiments unter Verwendung eines Oligonukleotid-Sequenzier-Primers, der mit einer erfindungsgemäßen Farbstoffverbindung markiert ist.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse einer Mikrosatellitenanalyse unter Verwendung eines Oligonukleotid-PCR-Primers, der mit einer erfindungsgemäßen Farbstoffverbindung markiert ist.
Fig. 11 zeigt vier bevorzugte Synthesewege zur Herstellung der erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe.
Fig. 12 zeigt drei bevorzugte Synthesewege zur Herstellung der erfindungsgemäßen 1-substituierten 3-Hydroxynaphthalin-Zwischenprodukte.
Nachstehend wird detailliert auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen. Die nachstehende Beschreibung ist nicht beschränkend aufzufassen. Im allgemeinen umfaßt die vorliegende Erfindung eine neue Klasse von asymmetrischen Benzoxanthen-Verbindungen, die als Fluoreszenzfarbstoffe geeignet sind, Verfahren und Zwischenprodukte zur Synthese solcher Farbstoffe, Reagenzien, in denen solche Farbstoffe als molekulare Markierungen eingesetzt werden und Verfahren, in denen solche Farbstoffe und Reagenzien im Bereich der analytischen Biotechnologie verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen finden insbesondere im Bereich der Mehrfarben-Fluoreszenz-DNA- Sequenzierung und der Fragmentanalyse Anwendung.

1. Asymmetrische Benzoxanthen-Farbstoffverbindunpen

In einem ersten Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung eine neue Klasse von asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffverbindungen der nachstehenden allgemeinen Formel I. (Alle hier angegebenen Molekülstrukturen sollen nicht nur die dargestellte elektronische Struktur umfassen sondern auch alle Resonanzstrukturen und Protonierungszustände davon einschließen.) FORMEL I
In der allgemeinen Formel I sind die Reste Y&sub1; und Y&sub2; jeweils unabhängig eine Hydroxylgruppe, ein Sauerstoffatom, eine Amino- oder Iminiumgruppe. Wenn der Rest Y&sub1; eine Hydroxylgruppe und der Rest Y&sub2; ein Sauerstoffatom ist, ist die Verbindung analog zu Fluorescein, während wenn der Rest Y&sub1; eine Aminogruppe und der Rest Y&sub2; eine Iminiumgruppe ist, die Verbindung analog zu Rhodamin ist. Vorzugsweise ist der Rest Y&sub1; eine Hydroxylgruppe und der Rest Y&sub2; ein Sauerstoffatom.
Die Reste R&sub1;-R&sub9; sind Substituenten, die zur Veränderung verschiedener Eigenschaften der Farbstoffe durch Modifizieren der elektronischen Struktur des Grundzustands und des angeregten Zustands des Moleküls verwendet werden. Insbesondere beeinflußt die Veränderung der Reste R&sub1;-R&sub9; die spektralen Eigenschaften, die chemische Stabilität und die Photostabilität der Verbindungen. Die Substituenten R&sub1;-R&sub3; und R&sub9; sind bei der Definition der Eigenschaften der Verbindungen der allgemeinen Formel I besonders wichtig. Beispielsweise wurde beobachtet, daß die Einführung eines Fluoratoms an einer der Positionen R&sub1;-R&sub3; zu einer erhöhten chemischen Stabilität und Photostabilität führt und daß, wenn der Rest R&sub9; eine substituierte Phenylgruppe ist, die Einführung eines Chloratoms als Substituenten X&sub2; und X&sub5; zu engeren Emissionsbanden führt. (Vgl. die Definition der Substituenten X&sub2; und X&sub5; nachstehend.)
Die Substituenten R&sub1;-R&sub8; sind vorzugsweise ein Wasserstoff-, Fluor-, Chloratom, eine niedere Alkyl-, niedere Alkenyl-, niedere Alkinylgruppe, eine Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Iminium-, Amido-, Nitril-, Arylgruppe, eine niedere Alkoxygruppe, eine verbindende Gruppe oder Kombinationen davon, wobei der hier verwendete Begriff "verbindende Gruppe" sich auf eine funktionelle Gruppe bezieht, die mit einer "komplementären funktionellen Gruppe", die mit einem Reagenz verbunden ist, reagieren kann, wobei durch eine solche Reaktion eine "Bindung" gebildet wird, die den Farbstoff mit dem Reagenz verbindet. Spezielle verbindende Gruppen, komplementäre funktionelle Gruppen und Bindungen werden nachstehend näher erläutert. Der Rest R&sub1; ist vorzugsweise eine niedere Alkoxygruppe, ein Chlor-, Fluor- oder Wasserstoffatom, der Rest R&sub2; ist eine niedere Alkylgruppe, ein Fluor- oder Chloratom und der Rest R&sub3; ist eine niedere Alkylgruppe oder ein Fluoratom. Mehr bevorzugt ist einer der Reste R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; ein Fluoratom. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist mindestens der Rest R&sub3; ein Fluoratom.
Der hier verwendete Begriff "Niederalkyl" bezeichnet geradkettige und verzweigte Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, d. h. Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, t- Butyl-, Isobutyl-, sec-Butyl-, Neopentyl-, t-Pentylgruppen und dergleichen. "Niedersubstituiertes Alkyl" bezeichnet eine niedere Alkylgruppe mit Elektronen-ziehenden Substituenten wie Halogen-, Cyano-, Nitro- und Sulfogruppen oder dergleichen. "Niederes Halogenalkyl" bezeichnet eine niedersubstituierte Alkylgruppe mit einem oder mehreren Halogenatomsubstituenten, gewöhnlich Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodatome. "Niederalkenyl" bezeichnet einen Kohlenwasserstoff mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, wobei eine oder mehrere der Kohlenstoff-Kohlenstoffbindungen Doppelbindungen sind, wobei die nicht doppelt gebundenen Kohlenstoffatome eine niedere Alkylgruppe oder eine niedersubstituierte Alkylgruppe umfassen. "Niederalkinyl" bezeichnet einen Kohlenwasserstoff mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, wobei eines oder mehrere der Kohlenstoffatome mit einer Dreifachbindung verbunden ist, wobei die nicht dreifach gebundenen Kohlenstoffatome eine Niederalkylgruppe oder eine niedersubstituierte Alkylgruppe umfassen. "Sulfonat" bezieht sich auf Reste, die ein Schwefelatom einschließen, das an drei Sauerstoffatome gebunden ist, einschließlich Mono- und Disalze davon, z. B. Natriumsulfonat, Kaliumsulfonat, Dinatriumsulfonat und dergleichen. "Amino" bezieht sich auf Reste, die ein Stickstoffatom einschließen, das an zwei Wasserstoffatome, Niederalkylreste oder jegliche Kombination davon gebunden ist. "Amido" bezieht sich auf Reste, die ein Kohlenstoffatom einschließen, das eine Doppelbindung zu einem Sauerstoffatom und eine Einfachbindung zu einem Aminorest aufweist. "Nitril" bezieht sich auf Reste, die ein Kohlenstoffatom einschließen, das eine Dreifachbindung zu einem Stickstoffatom aufweist. "Niederalkoxy" bezieht sich auf einen Rest, der eine Niederalkylgruppe einschließt, die durch eine Einfachbindung mit einem Sauerstoffatom verbunden ist. "Aryl" bezieht sich auf einzelne oder mehrere Phenyl- oder substituierte Phenylgruppen, z. B. Benzol, Naphthalin, Anthracen, Biphenyl und dergleichen.
Der Rest R&sub9; ist vorzugsweise eine Acetylen-, niedere Alkyl-, niedere Alkenyl-, Cyano-, Phenyl- oder substituierte Phenylgruppe, eine heterocyclische aromatische Gruppe oder Kombinationen davon, wobei die substituierte Phenylgruppe die allgemeine Struktur
hat, in der die Reste X&sub1;-X&sub5; unabhängig ein Wasserstoff-, Chlor-, Fluoratom, eine niedere Alkylgruppe, eine Carbonsäure-, Sulfonsäuregruppe, die Gruppe -CH&sub2;OH oder eine verbindende Gruppe sind. Der hier verwendete Begriff "heterocyclisch aromatisch" bezieht sich auf aromatische Reste mit einem Heteroatom als Teil der cyclischen Struktur, z. B. Pyrrol, Furan, Indol und dergleichen. Vorzugsweise ist der Rest X&sub1; eine Carbonsäure-, Sulfonsäuregruppe oder die Gruppe -CH&sub2;OH, die Reste X&sub2; und X&sub5; sind unabhängig ein Wasserstoff-, Chlor-, Fluoratom oder eine niedere Alkylgruppe, und die Reste X&sub3; und X&sub4; sind unabhängig ein Wasserstoff-, Chlor-, Fluoratom, eine niedere Alkylgruppe, eine Carbonsäure-, Sulfonsäure gruppe oder eine verbindende Gruppe. Mehr bevorzugt sind die Reste X&sub2; und X&sub5; Chloratome. In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform ist einer der Reste X&sub3; oder X&sub4; eine verbindende Gruppe. Vorzugsweise ist der Rest X&sub1; eine Carbonsäuregruppe. In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform, die zur Bildung der erfindungsgemäßen Phosphoramiditverbindungen einschließlich der erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen besonders geeignet ist, ist einer der Reste X&sub1; oder X&sub5; ein Rest, der einen cyclischen Ester oder cyclischen Ether bilden kann, z. B. eine Carbonsäure-, Sulfonsäuregruppe oder die Gruppe -CH&sub2;OH, oder irgendeine andere Gruppe, die ein spirocyclisches System bilden kann, d. h. eine bicyclische Verbindung mit einem Kohlenstoffatom, das beiden Ringen gemeinsam ist, z. B. Spiro[4.5]decan.
Die erfindungsgemäße verbindende Gruppe ist vorzugsweise eine Isothiocyanat-, Sulfonylchlorid-, 4,6-Dichlortriazinylamin-, Succinimidylestergruppe oder ein anderes aktives Carboxylat, und zwar immer dann, wenn die komplementäre funktionelle Gruppe eine Aminogruppe ist. Die verbindende Gruppe ist vorzugsweise eine Maleinimid-, Halogenacetyl- oder lodacetamidgruppe, und zwar immer dann, wenn die komplementäre funktionelle Gruppe eine Sulfhydrylgruppe ist; vgl. R. Haugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc. (1992). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die verbindende Gruppe ein aktivierter N-Hydroxysuccinimidyl (NHS)-ester, der mit einer komplementären funktionellen Aminogruppe reagiert, wobei zur Bildung des aktivierten NHS-Esters ein erfindungsgemäßer Farbstoff mit einer verbindenden Carboxylatgruppe mit Dicyclohexylcarbodümid und N-Hydroxysuccinimid zur Bildung des NHS-Esters umgesetzt wird (vgl. Fig. 3).
Verschiedene alternative verallgemeinerte Verfahren können zur Synthese der erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffverbindungen verwendet werden, von denen vier hier unter Bezugnahme auf Fig. 11 beschrieben werden. In einem ersten bevorzugten Verfahren, auf das in Fig. 11 unter Weg A Bezug genommen wird, wird die Verbindung 27 mit dem 1,3-Dihydroxy- oder 1,3-Aminohydroxybenzolderivat 28 und dem 1,3-Dihydroxy- oder 1,3-Aminohydroxynaphthalinderivat 29 unter Verwendung gleicher Äquivalente dieser Verbindungen unter Säurekatalyse und Erhitzen umgesetzt, wobei die asymmetrische Farbstoffverbindung 30 erhalten wird. Die Verbindung 27 ist vorzugsweise ein cyclisches oder geradkettiges Anhydrid, z. B. ist LVG OCOR&sub9;, ein Ester, z. B. wenn LVG OR ist, wobei R eine niedere Alkylgruppe, eine Phenyl- oder Sulfonatgruppe ist, oder ein Säurechlorid, z. B. wenn LVG ein Chloratom oder ein anderes Halogenatom ist.
In einem alternativen bevorzugten Syntheseverfahren, auf das in Fig. 11 unter Weg B Bezug genommen wird, wird die Verbindung 27 mit zwei Äquivalenten eines 1,3-Dihydroxybenzolderivats 28 umgesetzt, d. h., der Rest Y&sub1; ist eine Hydroxylgruppe, oder einem 1,3-Aminohydroxybenzolderivat, d. h., der Rest Y&sub1; ist eine Aminogruppe. Dabei wird der symmetrische Xanthen-Farbstoff 31 erhalten. Die Verbindung 31 wird dann mittels Basenhydrolyse zersetzt, wobei das Benzoyl-Kondensationszwischenprodukt 32 gebildet wird. Das Kondensationsprodukt 32 wird dann unter Säurekatalyse und Erhitzen mit Verbindung 29 umgesetzt, wobei der asymmetrische Farbstoff 30 erhalten wird, wobei 29 1,3-Dihydroxynaphthalin ist, wenn der Rest Y&sub2; eine Hydroxylgruppe ist, oder 1,3-Aminohydroxynaphthalin ist, wenn der Rest Y&sub2; eine Aminogruppe ist.
In einem dritten verallgemeinerten Syntheseverfahren, auf das in Fig. 11 unter Weg C Bezug genommen wird, wird die Verbindung 27 mit einem Äquivalent 28 unter Erhitzen umgesetzt, wobei das Benzoyl-Kondensationszwischenprodukt 32 erhalten wird. Verbindung 32 wird dann unter Säurekatalyse und Erhitzen mit 29 umgesetzt, wobei der asymmetrische Farbstoff 30 erhalten wird.
In einem vierten verallgemeinerten Syntheseverfahren, auf das in Fig. 11 unter Weg D Bezug genommen wird, werden gleiche Äquivalente von Verbindung 33, Verbindung 28 und Verbindung 29 unter Säurekatalyse und Erhitzen umgesetzt, wobei das asymmetrische Xanthon-Zwischenprodukt 34 erhalten wird. Vorzugsweise ist 33 ein Carbonat, z. B. ist LVG OR, wobei der Rest R vorzugsweise eine niedere Alkylgruppe oder eine Phenylgruppe ist; oder ein Formiat, z. B. wenn LVG ein Halogenatom und OR ist, wobei der Rest R vorzugsweise eine niedere Alkylgruppe oder eine Phenylgruppe ist. Verbindung 34 wird dann mit einem anionischen organometallischen R&sub9;-Derivat umgesetzt, wobei der asymmetrische Farbstoff 30 erhalten wird, z. B. R&sub9;Li, R&sub9;MgX, wobei der Rest X ein Halogenatom ist, z. B. Br, Cl, I und dergleichen.
Die Fig. 2A und 2B zeigen die Synthese eines Satzes von besonders bevorzugten erfindungsgemäßen asymmetrischen Farbstoffverbindungen. In diesen Synthesen wird ein 1,3- Dihydroxynaphthalinderivat, wie 1,3-Dihydroxynaphthalin (9b) oder 2-Fluor-1,3-dihydroxynaphthalin (9a) mit einem Äquivalent eines Phthalsäureanhydridderivats, z. B. 3,6-Dichlortrimellithsäureanhydrid (10a), und einem Äquivalent eines Resorcinderivats (11a, 11b, 11c oder 11d) umgesetzt und 16 Stunden in organischer Säure, z. B. MeSO&sub3;H unter Argon erhitzt. Der rohe Farbstoff wird dann durch Zugabe zu einem Eis-/Wassergemisch ausgefällt, durch Filtration gewonnen, und dann weiter gereinigt, wobei zwei Isomere 1 und 2 mittels präparativer Dünnschichtchromatographie erhalten werden.
Unsubstituierte Derivate der asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe (R&sub2; und/oder R&sub3; ist H) können weiter mit Halogenierungsreagenzien umgesetzt werden, z. B. käuflichen Quellen von positivem Fluor, NaOCl, NaOH/Br&sub2;, NaOH/I&sub2;, um nach extraktiver Aufarbeitung mit 10% HCl/EtOAc, Trocknen mit Na&sub2;SO&sub4;, Filtrieren und Konzentrieren unter vermindertem Druck quantitativ halogenierte Derivate, z. B. R&sub2;=R&sub3;=Cl, Br, I oder F zu erzeugen (vgl. Kasten in Fig. 2B).

II. Substituierte Naphthalin-Zwischenprodukte

In einem zweiten Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung neue Zwischenprodukte, die zur Synthese der asymmetrischen Benzoxanthenverbindungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, wobei solche Zwischenprodukte die unmittelbar nachstehend gezeigte allgemeine Strukturformel II haben. Insbesondere erlauben die erfindungsgemäßen Zwischenverbindungen die Synthese von asymmetrischen Benzoxanthenverbindungen mit einer regio-selektiven Anlagerung von Substituenten, beispielsweise Halogenatomen, an der 2- Position von 2-substituierten asymmetrischen Benzoxanthenverbindungen, wobei die 2- Position der Position von R&sub3; in den Verbindungen der allgemeinen Formeln I und II entspricht. FORMEL II
Die Substituenten R&sub3;-R&sub7; in der allgemeinen Formel II entsprechen den gleich numerierten Substituenten in der vorstehend beschriebenen allgemeinen Formel I und der Rest Y&sub2; ist eine Hydroxyl- oder Aminogruppe. Vorzugsweise ist der Rest R&sub3; ein Fluoratom und der Rest Y&sub2; eine Hydroxylgruppe.
Fig. 12 zeigt drei alternative verallgemeinerte Syntheseschemata zur Herstellung der erfindungsgemäßen substituierten Naphthalin-Zwischenprodukte. Bei einem ersten Verfahren, das als Weg A in Fig. 12 gezeigt ist, wird das substituierte Ester-Enolatderivat 35 mit dem aktivierten Homophthalsäureesterderivat 36 unter Bildung des β-Ketoesterderivats 37 umgesetzt, beispielsweise durch spontanen Austritt von CO&sub2;, wenn der Rest R' ein Carboxylatrest ist. In Verbindung 35 ist der Rest R' vorzugsweise ein Wasserstoffatom, eine Carboxylatgruppe oder ein Halogenatom und der Rest R ist eine niedere Alkylgruppe. In Verbindung 36 ist LVG vorzugsweise ein Halogenatom, eine N-Hydroxysuccinimid-, Phenoxid-, Hydroxybenzotriazol- oder Carboxylatgruppe. Die Verbindung 37 wird dann unter Basenkatalyse und Erhitzen cyclisiert, wobei das substituierte 1,3-Naphthalindiol 38 gebildet wird, d. h., der Rest Y&sub2; ist OH.
Bei einem zweiten bevorzugten Syntheseverfahren, das als Weg B in Fig. 12 gezeigt ist, wird die Verbindung 35 mit dem aktivierten Phenylacetatderivat 39 umgesetzt, wobei LVG wie vorstehend für Verbindung 36 in Weg A beschrieben ist, unter Bildung des β-Ketoesterderivats 40, beispielsweise durch spontanen Austritt von CO&sub2;, wenn der Rest R' eine Carboxylatgruppe ist. Die Verbindung 40 wird dann unter Säurekatalyse und Erhitzen cyclisiert, wobei die substituierten 1,3-Naphthalindiole 38 erhalten werden, d. h., der Rest Y&sub2; ist OH.
Bei einem dritten bevorzugten Syntheseverfahren, das als Weg C gezeigt ist, wird die Verbindung 35 mit den Cyanophenylacetatderivaten 41 umgesetzt, wobei LVG wie vorstehend für Verbindung 36 in Weg A beschrieben ist, unter Bildung der Cyano-β-Ketoesterderivate 42, beispielsweise durch spontanen Austritt von CO&sub2;, wenn der Rest R' eine Carboxylatgruppe ist. Die Verbindung 42 wird dann unter Basenkatalyse und Erhitzen cyclisiert, wobei die substituierten 1,3-Amino-3-hydroxynaphthaline 38 erhalten werden, d. h., der Rest Y&sub2; ist NH&sub2;.

III. Reagenzien, in denen Farbstoffverbindungen eingesetzt werden

In einem weiteren Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung Reagenzien, die mit den asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffverbindungen der allgemeinen Formel I markiert sind. Erfindungsgemäße Reagenzien können nahezu alle sein, die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen verbunden werden können. Die Farbstoffe sind vorzugsweise kovalent an das Reagenz gebunden. Reagenzien schließen Proteine, Polypeptide, Polysaccharide, Nukleotide, Nukleoside, Polynukleotide, Lipide, Trägermaterialien, organische und anorganische Polymere und Kombinationen und Zusammenstellungen davon ein, wie Chromosomen, Kerne, lebende Zellen wie Bakterien, andere Mikroorganismen, Säugerzellen, Gewebe und dergleichen.

A. Nukleotid-Reagenzien

Eine bevorzugte Klasse erfindungsgemäßer Reagenzien umfaßt Nukleotide und Nukleoside, die die erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe einschließen. Solche Nukleotid-Reagenzien sind besonders nützlich im Zusammenhang mit markierten Polynukleotiden, die durch enzymatische Synthese gebildet werden, z. B. Nukleotidtriphosphate, die im Zusammenhang mit der PCR-Amplifikation, dem Polynukleotid-Sequenzieren nach Sanger und Nick-Translationsreaktionen verwendet werden.
Der hier verwendete Begriff "Nukleosid" bezieht sich auf eine Verbindung, die aus einer Purin-, Desazapurin- oder Pyrimidin-Nukleosidbase besteht, z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Desazaadenin, Desazaguanosin und dergleichen, die in der 1'-Position an eine Pentose gebunden ist, einschließlich 2'-Desoxy- und 2'-Hydroxylformen, wie es beispielsweise in Kornberg und Baker, DNA Replication, 2. Auflage (Freeman, San Francisco, 1992) beschrieben ist. Der hier verwendete Begriff "Nukleotid" bezieht sich auf einen Phosphatester eines Nukleosids, z. B. auf Triphosphatester, wobei die gebräuchlichste Veresterungsstelle die an der C-5-Position der Pentose gebundene Hydroxylgruppe ist. "Analoga" in Bezug auf Nukleoside schließen Nukleoside mit modifizierten Basenresten und/oder modifizierten Zuckerresten ein, wie es allgemein von Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980) beschrieben ist. Der Begriff "markiertes Nukleosid" bezieht sich auf Nukleoside, die durch eine Bindung kovalent an die Farbstoffverbindungen der allgemeinen Formel I gebunden sind.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nukleotide haben die nachstehende allgemeine Formel III FORMEL III
wobei der Rest B eine Nukleotidbase, z. B. Uracil, Cytosin, Desazaadenin oder Desazaguanosin ist. Die Reste W&sub1; und W&sub2; sind unabhängig H oder OH. Der Rest W&sub3; ist OH oder die Gruppen
einschließlich gegebenenfalls vorhandener Gegenionen, z. B. H, Na, NH&sub4; und dergleichen. Der Rest D ist eine Farbstoffverbindung der allgemeinen Formel I. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Nukleotide Didesoxynukleotidtriphosphate der nachstehend gezeigten allgemeinen Formel III. 1, einschließlich gegebenenfalls vorhandener Gegenionen. FORMEL III. 1
Markierte Didesoxynukleotide, wie die der allgemeinen Formel III. 1 werden besonders häufig als Kettenabbruch-Reagenzien in DNA-Sequenzierverfahren nach Sanger angewandt. In einer zweiten besonders bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Nukleotide Desoxynukleotidtriphosphate der nachstehenden allgemeinen Formel III. 2, einschließlich gegebenenfalls vorhandener Gegenionen. FORMEL III. 2
Markierte Desoxynukleotide, wie die der allgemeinen Formel III. 2, werden besonders häufig als Mittel zum Markieren von Polymerase-Verlängerungsprodukten eingesetzt, beispielsweise in der Polymerase-Kettenreaktion.
Wenn der Rest B ein Purin oder 7-Desazapurin ist, ist der Zuckerrest an der N&sup9;-Position des Purins oder Desazapurins gebunden, und wenn der Rest B Pyrimidin ist, ist der Zuckerrest an der N¹-Position des Pyrimidins gebunden.
Die Bindung, die B und D verbindet, ist an einer der Positionen R&sub1;-R&sub9; an D gebunden. Vorzugsweise ist die Bindung nicht an R&sub1;-R&sub3; gebunden. Wenn die erfindungsgemäßen Farbstoffe aus Trimellithsäureanhydrid hergestellt werden, ist der Rest R&sub9; vorzugsweise eine substituierte Phenylgruppe und die Bindung ist an einer der X&sub3;- oder X&sub4;-Positionen der substituierten Phenylgruppe an den Farbstoff gebunden, wobei die andere Position ein Wasserstoffatom ist.
Wenn der Rest B ein Purin ist, ist die Bindung, die B und D verbindet, an die 8-Position des Purins gebunden, wenn der Rest B 7-Desazapurin ist, ist die Bindung an die 7-Position des 7-Desazapurins gebunden, und wenn der Rest B Pyrimidin ist, ist die Bindung an die 5-Position des Pyrimidins gebunden.
Eine Nukleosidmarkierung kann unter Verwendung irgendeiner Technik einer großen Zahl bekannter Nukleosidmarkierungstechniken unter Verwendung bekannter Bindungen, verbindender Gruppen und dazugehöriger komplementärer Funktionalitäten durchgeführt werden. Die Bindung, die den Farbstoff und das Nukleosid verbindet, sollte (i) unter Oligonukleotidsynthesebedingungen stabil sein, (ii) die Oligonukleotid-Zielhybridisierung nicht stören, (iii) mit relevanten Enzymen, z. B. Polymerasen, Ligasen und dergleichen verträglich sein und (iv) die Fluoreszenz des Farbstoffs nicht quenchen (löschen).
Die Farbstoffe sind vorzugsweise kovalent an C-5 von Pyrimidinbasen und an C-7 von 7- Desazapurinbasen gebunden. Es wurden verschiedene geeignete Basenmarkierungsverfahren beschrieben, die in der Erfindung verwendet werden können, z. B. Gibson et al., Nucleic Acids Research 15: 6455-6467 (1987), Gebeyehu et al., Nucleic Acids Research 15: 4513- 4535 (1987), Haralambidis et al., Nucleic Acids Research 15: 4856-4876 (1987), Nelson et al., Nucleosides and Nucleotides 5(3): 233-241 (1986), Bergstrom et al., JACS 111: 374-375 (1989), US-PSen 4,855,225, 5,231,191 und 5,449,767.
Die Bindungen sind vorzugsweise Alkin-Amido- oder Alken-Amido-Bindungen, wobei die Bindung zwischen dem Farbstoff und der Nukleotidbase durch Umsetzung eines aktivierten N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Esters des Farbstoffs mit einer Alkinylamino- oder Alkenylamino-derivatisierten Base eines Nukleotids gebildet wird. Mehr bevorzugt ist die erhaltene Bindung 3-(Carboxy)-amino-1-propinyl oder 3-Amino-1-propin-1-yl (Formel III. 3). Verschiedene bevorzugte Bindungen zur Bindung der erfindungsgemäßen Farbstoffe an eine Nukleosidbase sind nachstehend in den Formeln III. 3, III. 4 und III. 5 gezeigt. FORMEL III .3 FORMEL III .4 FORMEL III.5
Die Synthese von Alkinylamino-derivatisierten Nukleosiden wird von Hobbs et al. in der EP 87305844.0 (EP-A-0 251 786) und in J. Org. Chem. 54: 3420 (1989) beschrieben. Kurz gesagt werden die Alkinylamino-derivatisierten Nukleotide dadurch hergestellt, daß das geeignete Halogendidesoxynukleosid (gewöhnlich 5-Iodpyrimidin- und 7-Iod-7-desazapurindidesoxynukleoside, wie es von Hobbs et al. beschrieben wird (vorstehend zitiert)), und Cu(I) in einem Kolben unter Argon gesetzt, mit trockenem DMF und anschließend mit einem Alkinylamin, Triethylamin und Pd(0) versetzt wird. Das Reaktionsgemisch kann mehrere Stunden lang gerührt werden oder solange, bis eine Dünnschichtchromatographie den Verbrauch des Halogendidesoxynukleosids anzeigt. Wenn ein ungeschütztes Alkinylamin verwendet wird, kann das Alkinylaminonukleosid durch Konzentrieren des Reaktionsgemisches und Chromatographieren auf Kieselgel gewonnen werden, und zwar unter Verwendung eines Elutionslösungsmittels, das Ammoniumhydroxid enthält, um den bei der Kupplungsreaktion erzeugten Halogenwasserstoff zu neutralisieren. Wenn ein geschütztes Alkinylamin verwendet wird, kann dem Reaktionsgemisch Methanol/Methylenchlorid zugesetzt werden, gefolgt von der Hydrogencarbonatform eines stark basischen Anionen-Austauscherharzes.
Die Aufschlämmung kann dann etwa 45 Minuten gerührt werden, anschließend filtriert und dann das Harz mit zusätzlichem Methanol/Methylenchlorid gewaschen werden. Die vereinigten Filtrate können konzentriert und mittels Flash-Chromatographie auf Kieselgel unter Verwendung eines Methanol-Methylenchlorid-Gradienten gereinigt werden. Die Triphosphate werden mittels Standardverfahren erhalten.

B. Phosphoramidit-Reagenzien

Eine weitere bevorzugte Klasse von Reagenzien umfaßt Phosphoramiditverbindungen, die die erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe einschließen. Solche Phosphoramidit-Reagenzien sind besonders für die automatisierte chemische Synthese von Polynukleotiden geeignet, die mit den erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen- Farbstoffen markiert sind. Solche Phosphoramiditverbindungen bilden bei Umsetzung mit einer 5'-Hydroxylgruppe eines Nukleotids oder Polynukleotids einen Phosphitester-Linker, der wiederum oxidiert wird, um einen Phosphatester-Linker zu erhalten, z. B. US-PSen 4,458,066 und 4,415,732.

1. Nicht-Nukleotid-Phosphoramidit-Reagenzien

Im allgemeinen haben in einem Aspekt die erfindungsgemäßen Phosphoramidit-Reagenzien die Struktur der nachstehenden allgemeinen Formel IV FORMEL IV
in der der Rest X ein Spacer-Arm, der Rest D ein asymmetrischer Benzoxanthen-Farbstoff der allgemeinen Formel I oder ein geschütztes Derivat davon ist, der Rest Y eine Bindung ist, die mit einer verbindenden Gruppe auf dem Farbstoff ausgebildet ist, der Rest B, eine Phosphitester-Schutzgruppe ist und die Reste B&sub2; und B&sub3; unabhängig voneinander eine niedere Alkyl-, niedere Alkenyl-, niedere Arylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe, oder eine Cycloalkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen sind. Nicht-nukleotidische Phosphoramidite der allgemeinen Formel IV sind besonders gut zum Markieren des 5'-Endes eines chemisch synthetisierten Polynukleotids über den Zuckerteil des Nukleotids geeignet.
Der Spacer X und die Bindung Y können viele Formen annehmen, die Struktur X-Y muß jedoch so gestaltet sein, daß sie (i) unter DNA-Synthesebedingungen stabil ist, (ii) die Oligonukleotid-Ziel-Hybridisierung nicht stört und (iii) die Fluoreszenz des Farbstoffs, an den sie gebunden ist, nicht löscht; z. B. US-PSen 5,231,191, 5,258,538, 4,757,141, 5,212,304.
Vorzugsweise ist die Gruppe X eine lineare oder cyclische niedere Alkyl-, lineare oder cyclische substituierte niedere Alkylgruppe, Polyethylenoxid, eine Arylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, ein Peptid oder ein Polyether. Die Bindung Y ist vorzugsweise eine Amido-, Sulfonamido-, Harnstoff-, Urethan- oder Thioharnstoffgruppe. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Bindung Y eine Amidogruppe und der Spacer X ist eine lineare Alkylgruppe der nachstehenden allgemeinen Formel IV. 1 FORMEL IV.1
in der n den Wert 2 bis 30, vorzugsweise 2 bis 10 und insbesondere 2 bis 6 hat. In einer zweiten besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Bindung Y eine Amidogruppe und der Spacer X ist ein lineares Polyethylenoxid der nachstehenden allgemeinen Formel IV. 2 FORMEL IV.2
in der n den Wert 2 bis 30, vorzugsweise 2 bis 10 und insbesondere 2 bis 6 hat.
Vorzugsweise bilden die Reste B&sub2; und B&sub3; zusammengenommen eine Alkylkette mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen in der Hauptkette und insgesamt bis zu 10 Kohlenstoffatomen, wobei beide endständige Valenzbindungen der Ketten an das Stickstoffatom gebunden sind. Alter nativ bilden die Reste B&sub2; und B&sub3; zusammen mit dem Stickstoffatom einen gesättigten Stickstoff-Heterocyclus, der ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatom enthält. Vorzugsweise sind die Reste B&sub2; und B&sub3; unabhängig voneinander Isopropyl-, t-Butyl-, Isobutyl- oder sec-Butylgruppen und B&sub2; und B&sub3; bilden zusammengenommen eine Morpholinogruppe.
Der Rest B&sub1; ist eine Phosphitester-Schutzgruppe, die eine unerwünschte Verlängerung des Polynukleotids verhindert, an das das Phosphoramidit gebunden ist. Der Rest B&sub1; ist unter Polynukleotidsynthesebedingungen stabil, kann aber vom Polynukleotidprodukt mit einem Reagenz entfernt werden, das die Einheitlichkeit des Polynukleotids oder des Farbstoffs nicht nachteilig beeinflußt. Vorzugsweise ist der Rest B&sub1; eine Methyl-, β-Cyanoethyl- oder 4- Nitrophenylethylgruppe. Die Reste B&sub2; und B&sub3; sind unabhängig voneinander Isopropyl-, t- Butyl-, Isobutyl- oder sec-Butylgruppen und B&sub2; und B&sub3; bilden zusammengenommen die Morpholinogruppe.
Die Bindung, die die Reste Y und D verbindet, ist an einer der Positionen R&sub1;-R&sub9; an den Rest D gebunden. Vorzugsweise ist die Bindung nicht an R&sub1;-R&sub3; gebunden. Wenn die erfindungsgemäßen Farbstoffe aus Trimellithsäureanhydrid synthetisiert werden, ist der Rest R&sub9; vorzugsweise mit einer Phenylgruppe substituiert und die Bindung ist an einer der Positionen X&sub3; oder X&sub4; der substituierten Phenylgruppe an den Farbstoff gebunden.
Solche Phosphoramiditverbindungen können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Im allgemeinen läuft die Synthese wie folgt ab. Phenolische Hydroxylgruppen des Farbstoffs sind mit Farbstoff-Schutzgruppen geschützt, die mit einem DNA-Synthese-Entschützungsmittel entfernt werden können, z. B. mit Ammoniak, Ethanolamin, Methylamin/Ammoniumhydroxidgemischen und Gemischen von t-Butylamin/Wasser/Methanol (1 : 2 : 1), vgl. z. B. US-PS 5,231,191. Die so geschützten Farbstoffe werden hier als "geschützte Derivate" des Farbstoffs bezeichnet. Bevorzugte Schutzgruppen schließen Benzoesäure- oder Pivalinsäureester ein. Die verbindende Gruppe des geschützten Farbstoffs, z. B. eine Carbonsäuregruppe, wird dann z. B. mit einem Carbodiimid aktiviert und mit einem Alkohol-Linkerderivat, z. B. einem Aminoalkohol wie Ethanolamin, Hexanolamin oder dergleichen, in N,N-Dimethylformamid (DMF) oder einem ähnlichen aprotischen Solvens umgesetzt, um einen geschützten Farbstoff mit einer freien Alkohol-Funktionalität zu erhalten, z. B. ein Alkoholamidderivat. Der freie Alkohol wird dann mit einem Phosphitylierungsmittel nach Standardverfahren umgesetzt, z. B. Di-(N,N-diisopropylamino)-methoxyphosphin in Acetoni tril, das katalytische Mengen von Tetrazoldiisopropylamin enthält, um das Phosphoramidit zu erhalten, z. B. US-PS 5,231,191.

2. Nukleotidische Phosphoramidit-Reagenzien

Im allgemeinen haben in einem zweiten Aspekt die erfindungsgemäßen Phosphoramidit- Reagenzien die Struktur der nachstehenden allgemeinen Formel V FORMEL V
in der die Reste B&sub1;-B&sub3; die vorstehend angegebene Bedeutung haben, der Rest B&sub5; ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe, der Rest B eine Nukleotidbase und der Rest D ein asymmetrischer Benzoxanthen-Farbstoff der allgemeinen Formel I oder ein geschütztes Derivat davon ist. Nukleotidphosphoramidite wie die der allgemeinen Formel V sind besonders gut für das interne Markieren von chemisch hergestellten Polynukleotiden geeignet.
Wenn der Rest B ein Purin oder 7-Desazapurin ist, ist der Zuckerrest an die N&sup9;-Position des Purins oder Desazapurins gebunden. Alternativ, wenn B Pyrimidin ist, ist der Zuckerrest an die N¹-Position des Pyrimidins gebunden. Die Reste B und D sind mittels einer Bindung, die durch die Umsetzung einer verbindenden Gruppe und ihrer komplementären Funktionalität gebildet wird, verbunden, wobei solche Bindungen zwischen Farbstoffen und Nukleotidbasen vorstehend detailliert beschrieben wurden. Wenn der Rest B ein Purin ist, ist die Bindung an die 8-Position des Purins gebunden, während, wenn der Rest B 7-Desazapurin ist, die Bindung an die 7-Position des 7-Desazapurins gebunden ist. Wenn der Rest B Pyrimidin ist, ist die Bindung an die 5-Position des Pyrimidins gebunden.
Der Rest B&sub5; bezieht sich im allgemeinen auf ein Wasserstoffatom oder eine säurespaltbare Hydroxyl-Schutzgruppe. Vorzugsweise ist der Rest B&sub5; die Triphenylmethylgruppe und ihre Elektronen-spendend-substituierten Derivate, wobei wie hier verwendet der Begriff "Elektronen-spendend" die Neigung eines Substituenten bezeichnet, Valenzelektronen an benachbarte Atome im Molekül abzugeben, von denen er ein Teil ist, d. h., der Substituent ist in Bezug auf benachbarte Atome elektropositiv. Vorzugsweise schließen die Elektronenspendenden Substituenten Amino-, niedere Alkyl-, niedere Arylgruppen mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, niedere Alkoxygruppen und dergleichen ein. Mehr bevorzugt sind die Elektronenspendenden Substituenten Methoxygruppen. Beispiele für Tritylgruppen schließen die 4,4'- Dimethoxytrityl-, d. h. Bis-(p-anisyl)-phenylmethyl-, Monomethoxytrityl-, α-Naphthyldiphenylmethyl-, Tri-(p-methoxyphenyl)-methylgruppe und dergleichen ein. Bindungs- und Spaltungsbedingungen für diese und andere Tritylgruppen beschreiben Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Auflage (John Wiley, New York, 1991).
Im allgemeinen können die erfindungsgemäßen Nukleotidphosphoramidite wie folgt hergestellt werden. Ein Nukleosid, das eine Hydroxy-Schutzgruppe an der 5'-Hydroxylgruppe und eine geschützte komplementäre Funktionalität an der Base trägt, wird selektiv entschützt, um nur die komplementäre Funktionalität freizusetzen. Dann wird ein geschützter Farbstoff (wie vorstehend beschrieben) durch Umwandeln einer verbindenden Gruppe in ihre reaktive Form aktiviert. Die aktivierte verbindende Gruppe des Farbstoffs wird dann mit der komplementären Funktionalität des Nukleosids umgesetzt, um das Farbstoff-markierte Nukleosid zu bilden, das an der 5'-Hydroxylgruppe (und an der 2'-Hydroxylgruppe im Fall von RNA) und an den phenolischen Gruppen des Farbstoffs Schutzgruppen trägt. Das Farbstoff-markierte Nukleosid wird dann wie vorstehend beschrieben mit einem Phosphitylierungsmittel umgesetzt, um das Nukleotid-Phosphoramidit zu erzeugen.
Bei einem bevorzugten Verfahren, wobei die komplementäre Funktionalität eine Aminogruppe und die bindende Gruppe eine Carboxylgruppe ist, läuft die Synthese wie folgt ab. Ein geschütztes Nukleosid, das eine Hydroxyl-Schutzgruppe an der 5'-Hydroxylgruppe, z. B. eine Tritylgruppe, und eine geschützte komplementäre Amino-Stickstoff-Funktionalität an der Base trägt, wird selektiv entschützt, um das Amin freizusetzen, wobei eine solche selektive Entschützung dazu dient, nur die Amin-Funktionalität zu entschützen, ohne die geschützte 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Ein geschützter Farbstoff (wie vorstehend beschrieben) wird durch Umwandeln einer verbindenden Carboxylgruppe mit Dicyclohexylcarbodümid und N-Hydroxysuccinimid in ihren NHS-Ester aktiviert. Der NHS-Ester wird mit der Aminogruppe des Nukleosids unter Bildung des Farbstoff-markierten Nukleosids umgesetzt, das Schutzgruppen an der 5'-Hydroxylgruppe (und an der 2'-Hydroxylgruppe im Fall von RNA) und an den phenolischen Gruppen des Farbstoffs trägt. Das Farbstoff-markierte Nukleosid wird dann wie vorstehend beschrieben mit einem Phosphitylierungsmittel umgesetzt.

C. Polynukleotid-Reagenzien

Eine weitere bevorzugte Klasse von erfindungsgemäßen Reagenzien umfaßt Polynukleotide, die mit den erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffen markiert sind. Solche markierten Polynukleotide sind in einer Anzahl von wichtigen Bereichen geeignet, wie z. B. als DNA-Sequenzier-Primer, PCR-Primer, Oligonukleotid-Hybridisierungssonden und dergleichen.
Wie hier verwendet beziehen sich die Begriffe "Polynukleotid" oder "Oligonukleotid" auf lineare Polymere von natürlichen oder modifizierten Nukleosidmonomeren, einschließlich doppel- und einsträngiger Desoxyribonukleosiden, Ribonukleosiden, α-anomeren Formen davon und dergleichen. Gewöhnlich sind die Nukleosidmonomeren durch Phosphodiesterbindungen verbunden, wobei sich der hier verwendete Begriff "Phosphodiesterbindung" auf Phosphodiesterbindungen oder Analoga davon bezieht, einschließlich Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Phosphoroselenoat, Phosphorodiselenoat, Phosphoroanilothioat, Phosphoranilidat, Phosphoramidat und dergleichen, einschließlich dazugehöriger Gegenionen, z. B. H, NH&sub4;, Na und dergleichen, falls solche Gegenionen anwesend sind. Die Polynukleotide haben eine Größe im Bereich von wenigen monomeren Einheiten, z. B. 8-40, bis mehrere Tausend Monomereinheiten. Immer dann, wenn ein Polynukleotid mit einer Buchstabensequenz dargestellt wird, wie z. B. "ATGCCTG", soll dies bedeuten, daß die Nukleotide in 5'→3'-Richtung von links nach rechts angeordnet sind und daß "A" Desoxyadenosin, "C" Desoxycytidin, "G" Desoxyguanosin und "T" Tymidin bezeichnet, falls nichts anderes angegeben ist.
Die erfindungsgemäßen markierten Polynukleotide schließen ein Nukleotid der allgemeinen Formel VI FORMEL VI
ein, in der der Rest B eine 7-Desazapurin-, Purin- oder Pyrimidin-Nukleotidbase ist. Der Rest Z, ist H oder OH. Der Rest 22 ist H, OH, HPO&sub4; oder der Rest Nuc, wobei sich Nuc auf ein Nukleosid oder Polynukleotid bezieht. Das Nukleosid der allgemeinen Formel VI und der Rest Nuc sind durch eine Phosphodiesterbindung verbunden, wobei die Bindung an die 5'- Position von Nuc gebunden ist. Der Rest 23 ist H, HPO&sub3; oder der Rest Nuc, wobei Nuc und die Nukleoside mittels einer an die 3'-Position von Nuc gebundenen Phosphodiesterbindung verbunden sind. Der Rest D ist eine Farbstoffverbindung der allgemeinen Formel I. Die Base B ist, wie es vorstehend für das erfindungsgemäße Nukleotid-Phosphoramidit-Reagenz beschrieben ist, an den Zuckerrest und an die Farbstoffverbindung gebunden. Definitionsgemäß kann das markierte Nukleotid der allgemeinen Formel VI das 5'-terminale Nukleotid, das 3'-terminale Nukleotid oder irgendein internes Nukleotid des Polynukleotids sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließen die erfindungsgemäßen markierten Polynukleotide mehrere Farbstoffe ein, die so positioniert sind, daß ein Fluoreszenz-Energietransfer zwischen einem Donorfarbstoff und einem Akzeptorfarbstoff stattfindet. Solche Mehrfachfarbstoff-Polynukleotide finden Anwendung als spektral-abstimmbare Sequenzier- Primer, z. B. Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4347-4351 (1995) und als Hybridisierungssonden, z. B. Lee et al., Nucleic Acids Research 21: 3761-3766 (1993).
Markierte Polynukleotide können entweder enzymatisch, beispielsweise unter Verwendung einer DNA-Polymerase oder -Ligase, z. B. Stryer, Biochemistry, Kapitel 24, W. H. Freeman und Co. (1981), oder durch chemische Synthese hergestellt werden, z. B. nach dem Phosphoramiditverfahren, dem Phosphittriesterverfahren und dergleichen, z. B. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (1990). Markierungen können während einer enzymatischen Synthese unter Verwendung von markierten Nukleotid-Triphosphat-Monomeren, während der chemischen Synthese unter Verwendung von markierten Nicht-Nukleotid- oder Nukleotid- Phosphoramiditen, wie es vorstehend beschrieben ist, oder nach der Synthese eingeführt werden.
Im allgemeinen, wenn das markierte Polynukleotid unter Verwendung einer enzymatischen Synthese hergestellt wird, kann das folgende Verfahren verwendet werden. Eine Matrizen- DNA wird denaturiert und ein Oligonukleotid-Primer wird an die Matrizen-DNA gebunden. Ein Gemisch von Desoxynukleotidtriphosphaten einschließlich dGTP, dATP, dCTP und dTTP wird dem Reaktionsgemisch zugesetzt, wobei wenigstens ein Teil von einem der Desoxynukleotide mit einer erfindungsgemäßen Farbstoffverbindung, wie es vorstehend beschrieben ist, markiert wird. Dann wird ein Polymeraseenzym unter Bedingungen zugesetzt, bei denen es aktiv ist. Ein markiertes Polynukleotid wird durch Einverleiben der markierten Desoxynukleotide während der Polymerasestrangsynthese gebildet. Bei einem alternativen enzymatischen Syntheseverfahren werden anstelle von einem Primer zwei Primer verwendet, wobei ein Primer komplementär zum +-Strang und der andere komplementär zum -Strang des Ziels ist, wobei die Polymerase thermostabil ist und die Reaktionstemperatur zwischen einer Denaturierungstemperatur und einer Verlängerungstemperatur wechselt, wodurch ein markiertes Gegenstück zur Zielsequenz exponentiell durch PCR hergestellt wird, z. B. PCR Protocols, Innis et al., Hrsg., Academic Press (1990).
Markierte Polynukleotide können unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens chemisch hergestellt werden. Detaillierte Beschreibungen der zur Bildung von Polynukleotiden nach dem Phosphoramiditverfahren verwendeten Chemie finden sich z. B. in Caruthers et al., US-PS 4,458,066, Caruthers et al., US-PS 4,415,732, Caruthers et al., Genetic Engineering 4: 1-17 (1982), Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, Seiten 6-1 bis 6-22, Applied Biosystems, Teil Nr. 901237 (1991).
Das Phosphoramiditverfahren der Polynukleotidsynthese ist aufgrund des effizienten und schnellen Kuppelns und der Stabilität der Ausgangsmaterialien das bevorzugte Verfahren. Die Synthese wird mit der an einem Trägermaterial gebundenen wachsenden Polynukleotidkette durchgeführt, so daß überschüssige Reagenzien, die sich in der flüssigen Phase befinden, leicht mittels Filtration entfernt werden können, wodurch der Bedarf für Reinigungsstufen zwischen den Zyklen entfällt.
Im folgenden werden kurz die Stufen eines Polynukleotid-Synthesezyklus unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens beschrieben. Als erstes wird ein Trägermaterial, das ein geschütztes Nukleotid-Monomer einschließt, mit Säure behandelt, z. B. mit Trichloressigsäure, um eine 5'-Hydroxyl-Schutzgruppe zu entfernen, und damit die Hydroxylgruppe für eine nachfolgende Kupplungsreaktion freizusetzen. Dann wird durch gleichzeitige Zugabe eines geschützten Phosphoramidit-Nukleosid-Monomers und einer schwachen Säure, z. B. einem Tetrazol, zum Reaktionsgemisch ein aktiviertes Zwischenprodukt gebildet. Die schwache Säure protoniert das Stickstoffatom des Phosphoramidits, wodurch ein reaktives Zwischenprodukt gebildet wird. Die Anlagerung des Nukleosids ist innerhalb 30 Sekunden abgeschlossen. Dann wird eine Capping-Stufe durchgeführt, die jegliche Polynukleotidketten abbricht, die keiner Nukleosidanlagerung unterworfen wurden. Das Capping wird vorzugsweise mit Essigsäureanhydrid und 1-Methylimidazol durchgeführt. Die Internukleotid-Bin dung wird dann durch Oxidation mit Iod als bevorzugtes Oxidationsmittel und Wasser als Sauerstoffdonor vom Phosphit in den stabileren Phosphotriester umgewandelt. Nach der Oxidation wird die Hydroxyl-Schutzgruppe mit einer protischen Säure, wie z. B. Trichloressigsäure oder Dichloressigsäure entfernt, und der Zyklus wird wiederholt, bis die Kettenverlängerung abgeschlossen ist. Nach der Synthese wird die Polynukleotidkette unter Verwendung einer Base, wie z. B. Ammoniumhydroxid oder t-Butylamin, vom Trägermaterial abgespalten. Die Abspaltungsreaktion entfernt auch jegliche Phosphat-Schutzgruppen, z. B. Cyanoethylgruppen. Schließlich werden die Schutzgruppen an den exocyclischen Aminen der Basen und die Hydroxyl-Schutzgruppen der Farbstoffe durch Behandeln der Polynukleotidlösung in einer Base bei einer erhöhten Temperatur, z. B. 55ºC, entfernt.
Jegliche der Phosphoramiditnukleosid-Monomeren können Farbstoff-markierte Phosphoramidite sein, wie es vorstehend beschrieben ist. Wenn die 5'-endständige Position des Nukleotids markiert ist, kann ein erfindungsgemäßes markiertes nicht-nukleotidisches Phosphoramidit während der letzten Kondensationsstufe verwendet werden. Wenn eine interne Position des Oligonukleotids markiert werden soll, kann ein erfindungsgemäßes markiertes nukleotidisches Phosphoramidit während irgendeiner der Kondensationsstufen verwendet werden.
Nach der Synthese kann das Polynukleotid an einer Anzahl von Positionen, einschließlich dem 5'-Ende, markiert werden, vgl. Oligonucleotides and Analogs, Eckstein, Hrsg., Kapitel 8, IRL Press (1991) und Orgel et al., Nucleic Acids Research 11(18): 6513 (1983), US-PS 5,118,800; das Phosphodiestergerüst, z. B. a. a. O., Kapitel 9, oder am 3'-Ende, z. B. Nelson, Nucleic Acids Research 20(23): 6253-6259 und US-PSen 5,401,837 und 5,141,813. Für einen Überblick über Oligonukleotidmarkierungsverfahren vgl. R. Haugland in Excited States of Biopolymers, Steiner, Hrsg., Plenum Press, NY (1983).
Bei einem bevorzugten, nach der Synthese stattfindenden chemischen Markierungsverfahren wird ein Oligonukleotid wie folgt markiert. Ein Farbstoff, der eine verbindende Carboxylgruppe einschließt, wird durch Umsetzung mit etwa einem Äquivalent 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid und etwa 3 Äquivalenten N-Hydroxysuccinimid in trockenem Ethylacetat 3 Stunden bei Raumtemperatur in den N-Hydroxysuccinimidester umgewandelt. Das Reaktionsgemisch wird mit 5% HCl gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert, wobei ein Feststoff erhalten wird, der in DMSO resuspendiert wird. Die DMSO-Farbstoff-Vorratslösung wird dann im Überschuß (10-20-fach) zu einem Aminohexyl-derivatisierten Oligonukleotid in 0,25 M Hydrogencarbonat/Carbonatpuffer bei pH 9,4 zugegeben und 6 Stunden umgesetzt, vgl. z. B. US-PS 4,757,141. Das Farbstoff-markierte Oligonukleotid wird durch einen Durchlauf durch eine Größenauschluß-Chromatographiesäule von nicht umgesetztem Farbstoff befreit, wobei mit Puffer, z. B. 0,1 M Triethylaminacetat (TEAA) eluiert wird. Die Fraktion, die das rohe markierte Oligonukleotid enthält, wird weiter durch RP-HPLC mit Gradientenelution gereinigt.

IV. Verfahren, in denen erfindungsgemäße Verbindungen und Reagenzien eingesetzt werden

Die erfindungsgemäßen Farbstoffe und Reagenzien passen gut zu jedem Verfahren, bei dem ein Fluoreszenznachweis eingesetzt wird, insbesondere zu Verfahren, die einen gleichzeitigen Nachweis von mehrfach räumlich überlappenden Analyten erfordern. Erfindungsgemäße Farbstoffe und Reagenzien sind besonders gut zur Identifizierung von Polynukleotidklassen geeignet, die einem biochemischen Trennverfahren unterworfen wurden, wie z. B. Elektrophorese, wobei eine Reihe von Banden oder Flecken von Zielsubstanzen mit ähnlichen biochemischen Eigenschaften, z. B. Größe, Konformation, Ladung, Hydrophobie und dergleichen, in einer linearen oder planaren Anordnung vorliegen. Der hier verwendete Begriff "Banden" schließt irgendeine räumliche Gruppierung oder Ansammlung von Analyten auf der Basis von ähnlichen oder gleichen biochemischen Eigenschaften ein. Gewöhnlich treten Banden bei der Trennung von Farbstoff-Polynukleotid-Konjugaten durch Elektrophorese auf.
Polynukleotidklassen können in vielen Bereichen auftreten. In einer bevorzugten Kategorie von Verfahren, die hier als "Fragmentanalyse-" oder "genetische Analyse"verfahren bezeichnet werden, werden markierte Polynukleotidfragmente durch Matrizen-gerichtete enzymatische Synthese unter Verwendung von markierten Primern oder Nukleotiden erzeugt, z. B. durch Ligation oder Polymerase-gerichtete Primer-Extension; die Fragmente werden einem größenabhängigen Trennverfahren unterworfen, z. B. Elektrophorese oder Chromatographie; und die getrennten Fragmente werden nach der Trennung nachgewiesen, z. B. mittels Laser-induzierter Fluoreszenz. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden viele Polynukleotidklassen gleichzeitig getrennt und die verschiedenen Klassen mittels spektral auflösbarer Markierungen unterschieden.
Ein solches Fragmentanalyseverfahren, das als amplifizierter Fragmentlängen-Polymorphismusnachweis (AmpFLP) bekannt ist, beruht auf amplifizierten Fragmentlängen-Polymorphismen, d. h. Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen, die mittels PCR amplifiziert werden. Diese amplifizierten Fragmente verschiedener Größe dienen als verbundene Marker, um mutante Gene durch Familien hindurch zu verfolgen. Je näher das amplifizierte Fragment dem mutanten Gen auf dem Chromosom ist, desto höher ist die Bindungskorrelation. Da Gene für viele genetische Defekte nicht identifiziert wurden, dienen diese Bindungsmarker dazu, bei der Bewertung von Krankheitsrisiken oder Vaterschaft zu unterstützen. Bei der AmpFLP-Technik können die Polynukleotide unter Verwendung eines markierten Polynukleotid-PCR-Primers oder unter Verwendung von markierten Nukleotidtriphosphaten in der PCR markiert werden.
Bei einem anderen Fragmentanalyseverfahren, das als Nick-Translation bekannt ist, wird eine Reaktion verwendet, um unmarkierte Nukleosidtriphosphate in einem doppelsträngigen DNA-Molekül durch markierte zu ersetzen. Freie 3'-Hydroxylgruppen werden innerhalb der unmarkierten DNA durch-"Nicks" erzeugt, die durch Desoxyribonuklease I (DNAase I)- Behandlung verursacht werden. DNA-Polymerase I katalysiert dann die Anlagerung eines markierten Nukleotids an das 3'-Hydroxylende des Nicks. Gleichzeitig entfernt die 5'- zu 3'- Exonukleaseaktivität dieses Enzyms die Nukleotideinheit vom 5'-Phosphorylende des Nicks. Ein neues Nukleotid mit einer freien 3'-OH-Gruppe wird an der Position des ursprünglichen entfernten Nukleotids einverleibt und der Nick wird um eine Nukleotideinheit in 3'-Richtung verschoben. Diese 3'-Verschiebung wird zu einer aufeinanderfolgenden Anlagerung von neuen markierten Nukleotiden an die DNA unter Entfernung von bestehenden unmarkierten Nukleotiden führen. Das Nick-translatierte Polynukleotid wird dann unter Verwendung eines Trennverfahrens, z. B. Elektrophorese, analysiert.
Ein anderes beispielhaftes Fragmentanalyseverfahren beruht auf einer variablen Zahl von Tandern-Wiederholungen oder VNTRs. VNTRs sind Bereiche von doppelsträngiger DNA, die angrenzende Mehrfachkopien einer besonderen Sequenz enthalten, wobei die Anzahl von Wiederholungseinheiten variabel ist. Beispiele von VNTR-Loci sind pYNZ22, pMCT118 und Apo B. Eine Untergruppe von VNTR-Verfahren sind Verfahren, die auf dem Nachweis von Mikrosatelliten-Wiederholungen oder kurzen Tandern-Wiederholungen (STRs) beruhen, d. h. Tandern-Wiederholungen von DNA, die durch eine kurze (2-4 Basen) wiederholte Sequenz gekennzeichnet ist. Eine der am häufigsten, eingeschobenen repetitiven DNA-Familien im Menschen ist die (dC-dA)n-(dG-dT)n-Dinukleotid-Wiederholungsfamilie (auch als (CA)n- Dinukleotid-Wiederholungsfamilie bezeichnet). Es wird vermutet, daß sich 50.000 bis 100.000 (CA)n-Wiederholungsbereiche im menschlichen Genom befinden, typischerweise mit 15 bis 30 Wiederholungen pro Block. Viele dieser Wiederholungsbereiche sind in ihrer Länge polymorph und können daher als nützliche genetische Marker dienen. Vorzugsweise in VNTR- oder STR-Verfahren wird die Markierung unter Verwendung eines Farbstoff-markierten PCR-Primers in die Polynukleotidfragmente eingeführt.
Bei einem besonders bevorzugten Fragmentanalyseverfahren werden erfindungsgemäß identifizierte Klassen als endständige Nukleotide bezeichnet, so daß ein Zusammenhang zwischen den vier möglichen endständigen Basen und den Mitgliedern eines Satzes von spektral auflösbaren Farbstoffen hergestellt wird. Solche Sätze werden aus den erfindungsgemäßen Farbstoffen einfach durch Messen der Emissions- und Absorptionsbandbreiten mit käuflichen Spektrophotometern zusammengestellt. Mehr bevorzugt treten die Klassen im Zusammenhang mit chemischen Verfahren oder Kettenabbruchverfahren bei der DNA- Sequenzierung auf und insbesondere im Zusammenhang mit dem Kettenabbruchverfahren, z. B. dem Didesoxy-DNA-Sequenzieren oder dem Sanger-Sequenzieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Synthese eines DNA-Stranges mittels einer DNA-Polymerase in vitro unter Verwendung eines einzelsträngigen oder doppelsträngigen DNA-Templats, dessen Sequenz bestimmt werden soll. Die Synthese wird an nur der einen Stelle eingeleitet, wobei sich ein Oligonukleotid-Primer an die Matrize anlagert. Die Synthesereaktion wird durch Einverleiben eines Nukleotid-Analogons abgeschlossen, das die fortgesetzte DNA-Verlängerung nicht unterstützt. Die Ketten-abbrechenden Nukleotid-Analoga sind die 2'-, 3'-Didesoxynukleosid- 5'-triphosphate (ddNTPs), bei denen die 3'-OH-Gruppe fehlt, die für eine 3'- zu 5'-DNA-Kettenverlängerung notwendig ist. Wenn passende Anteile von dNTPs (2'-Desoxynukleosid-5'- triphosphaten) und eines der vier ddNTPs verwendet werden, wird die Enzym-katalysierte Polymerisation in einem Teil der Population von Ketten an jeder der Stellen abgebrochen werden, wo das ddNTP eingebaut werden kann. Wenn markierte Primer oder markierte ddNTPs für jede Umsetzung verwendet werden, kann die Sequenzinformation durch Fluoreszenz nach der Trennung mittels hochauflösender Elektrophorese nachgewiesen werden. Beim Kettenabbruchverfahren können erfindungsgemäße Farbstoffe angelagert werden, um entweder Primer oder Didesoxynukleotide zu sequenzieren. Farbstoffe können an eine komplementäre Funktionalität am 5'-Ende des Primers gebunden werden, z. B. nach Fung et al., US-PS 4,757,141; auf der Basis eines Primers oder auf der Basis eines Didesoxynukleotids, z. B. über die verbindenden Alkinylaminogruppen, die von Hobbs et al., EP 87305844.0, die vorstehend diskutiert wurde, beschrieben werden.
Bei jedem der vorstehenden Fragmentanalyseverfahren werden markierte Polynukleotide vorzugsweise durch elektrophoretische Verfahren getrennt, z. B. Gould und Matthews, vorstehend zitiert, Rickwood und Hames, Hrsg., Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach (IRL Press Limited, London, 1981) oder Osterman, Methods of Protein and Nucleic Acid Research, Bd. 1, Springer-Verlag, Berlin, 1984). Der bevorzugte Typ der elektrophoretischen Trägermatrix ist vernetztes oder nicht-vernetztes Polyacrylamid mit einer Konzentration (Gewicht zu Volumen) von etwa 2 bis 20 Gew.-%. Mehr bevorzugt beträgt die Polyacrylamidkonzentration von etwa 4 bis 8%. Vorzugsweise im Zusammenhang mit dem DNA-Sequenzieren schließt die elektrophoretische Trägermatrix ein Strang-trennendes oder -denaturierendes Mittel ein, z. B. Harnstoff, Formamid und dergleichen. Detaillierte Verfahren zur Konstruktion solcher Trägermatrizen werden angegeben von Maniatis et al., "Fractionation of Low Molecular Weight DNA and RNA in Polyacrylamide Gels Containing 98% Formamide or 7 M Urea", in: Methods in Enzymology 65: 299-305 (1980), Maniatis et al., "Chain Length Determination of Small Double- and Single-Stranded DNA Molecules by Polyacrylamide Gel Electrophoresis", Biochemistry 14: 3787-3794 (1975), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982), Seiten 179-185 und ABI PRISM® 377 DNA Sequencer Users Manual, Rev. A, Januar 1995, Kapitel 2 (p/n 903433, The Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA). Die optimale Polymerkonzentration, der pH-Wert, die Temperatur, die Konzentration des Denaturierungsmittels, usw., die in einer bestimmten Trennung eingesetzt werden, hängen von vielen Faktoren ab, einschließlich dem Größenbereich der zu trennenden Nukleinsäuren, ihren Basenzusammensetzungen, ob sie einzelsträngig oder doppelsträngig sind und von der Natur der Klassen, von denen mittels Elektrophorese Information gewonnen werden soll. Demgemäß kann die Anwendung der Erfindung Standard-Vorversuche erfordern, um Bedingungen für bestimmte Trennungen zu optimieren. So wurden beispielsweise Oligonukleotide mit Größen im Bereich von zwischen etwa 20 bis 300 Basen erfindungsgemäß in der folgenden Trägermatrix getrennt und nachgewiesen: 6% Polyacrylamid, das aus 19 : 1 Teilen Acrylamid: Bisacrylamid hergestellt wurde, und zwar gebildet in einem Tris-Borat-EDTA-Puffer bei pH 8,3.
Nach der elektrophoretischen Trennung werden die Farbstoff-Polynukleotidkonjugate durch Messen der Fluoreszenzemission der Farbstoff-markierten Polynukleotide nachgewiesen. Um einen solchen Nachweis durchzuführen, werden die markierten Polynukleotide durch eine Standardeinrichtung beleuchtet, z. B. durch Quecksilberdampflampen hoher Intensität, Laser oder dergleichen. Die Beleuchtungseinrichtung ist vorzugsweise ein Laser mit einem Beleuchtungsstrahl bei einer Wellenlänge von 488 und 550 nm. Mehr bevorzugt werden die Farbstoff-Polynukleotide mit Laserlicht beleuchtet, das von einem Argon-Ionenlaser erzeugt wird, insbesondere von den 488- und 514 nm-Emissionslinien eines Argon-Ionenlasers oder von der 532 nm-Emissionslinie eines Neodym-Festkörper-YAG-Lasers. Es sind verschiedene Argon-Ionenlaser am Markt verfügbar, die Laserlicht gleichzeitig bei diesen drei Linien abgeben, z. B. Cyonics, Ltd. (Sunnyvale, Calif.), Modell 2001 oder dergleichen. Die Fluores zenz wird dann mit einem lichtempfindlichen Detektor nachgewiesen, z. B. einer Photomultiplier-Röhre, einem CCD oder dergleichen.

IV. Beispiele

Die Erfindung wird nachstehend durch nicht beschränkende Beispiele erläutert.
Falls nichts anderes angegeben ist, wurden alle Chemikalien von Aldrich Chemical Company (Milwaukee, W1) erworben und ohne weitere Behandlung verwendet. 3-Fluorresorcin (11a) wurde aus 2,4-Dimethoxyanilin gemäß Literaturverfahren hergestellt (Perkin, J. Chem. Soc. 110: 1658-1666 (1980)). 2-Chlor-4-methoxyresorcin (11c) wurde aus 3-Hydroxy-4-methoxybenzaldehyd gemäß US-PS 4,318,846 hergestellt. 3,6-Dichlortrimellithsäure wurde gemäß US-PS 4,318,846 hergestellt und durch 4stündiges Erhitzen unter Rückfluß in Essigsäureanhydrid und Ausfällen des gekühlten Gemisches mit Diethylether in das Anhydrid 10a umgewandelt. Das Anion des Fluormalonsäureethylesters wurde aus Fluormalonsäurediethylester gemäß Literaturverfahren hergestellt (Org. Syn. Coll. 4: 417-419 (1963)). Tributylphosphonium-Fluoressigsäureethylester (19) wurde gemäß Literaturverfahren hergestellt (Tet. Lett. 30: 6113 (1980)). 2-Fluor-1,3-dihydroxynaphthalin (9a) wurde hergestellt, wie es hier beschrieben ist. Trockenes Dichlormethan (CH&sub2;Cl&sub2;) wurde vor der Verwendung über Calciumhydrid und Tetrahydrofuran (THF) über Lithiumaluminiumhydrid (LAH) destilliert. Absolutes Ethanol wurde ohne weitere Behandlung verwendet oder mittels Destillation über Natrium getrocknet und über aktiviertem Molekularsieb aufbewahrt. Trockenes Ethylacetat (EtOAc) wurde nach Vortrocknen mit MgSO&sub4; über P&sub2;O&sub5; destilliert. Trockenes Dimethylformamid (DMF) wurde nach dem Vortrocknen mit Magnesiumsulfat destilliert und über aktiviertem Molekularsieb aufbewahrt. Alle Umsetzungen wurden unter Ausschluß von Feuchtigkeit unter trockenem Argon durchgeführt. Die Umsetzungen wurden per Dünnschichtchromatographie (DC) verfolgt (Kieselgel 60, A&sub2;&sub5;&sub4;). Für die Flash-Chromatographie wurde Kieselgel 60 (200-400 mesh, Baxter) verwendet. Die abschließende Reinigung der asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe zur Gewinnung der mit "1" und "2" bezeichneten reinen Isomeren wurde mit präparativer DC auf Kieselgel 60 PDC-Platten (EM Science) unter Elution mit CH&sub2;Cl&sub2; : MeOH : AcOH (7 : 3 : 0,1) durchgeführt. Reine Farbstoffisomere wurden dadurch identifiziert, daß sie einen einzelnen Fleck auf dem DC mit CH&sub2;Cl&sub2; : MeOH : AcOH (7 : 3 : 0,1) ergaben, wobei der Fleck mit kurz- und langwelligem UV-Licht sichtbar gemacht wurde. Das Isomer 2 läuft sowohl auf normalen als auch auf RP-Medien langsamer. Zwischenprodukte wurden mittels ¹H-NMR-Spektren auf einem Varian 300 MHz NMR identifiziert. Absorptionsspektren der gereinigten Farbstoffe wurden auf einem Hewlett Packard 8451A Diodenarray- Spektrophotometer und Fluoreszenzemissionsspektren wurden auf einem Perkin-Elmer LS 50-B Lumineszenzspektrophotometer aufgenommen. Die HPLC-Reinigung der Farbstoffmarkierten Oligonukleotide wurde mit einer Perkin-Elmer-Pumpe der Reihe 200, die mit einem PE LC 240 Fluoreszenzdetektor und einem PE LC 295 UV/VIS-Detektor verbunden war, durchgeführt, wobei die Detektoren wiederum mit einem Zweikanal-PE 1022 Integrator verbunden waren. Die für die Reinigung und Identifizierung der Farbstoff-markierten Oligonukleotide verwendeten Puffer schließen Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan / Borat / EDTA (TBE), Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan / EDTA (TE) und Triethylammoniumacetat (TEAA) ein. Puffer wurden als 10 · Lösungen bei 0ºC aufbewahrt und vor der Verwendung frisch verdünnt. Zur HPLC-Reinigung wurde eine Umkehrphasen-RP-18-Säule eingesetzt.

BEISPIEL 1

Synthese von asymmetrischen Benzoxanthenen

Die Verbindungen 1-7 in den Fig. 2A und 2B wurden durch Umsetzen eines 1,3-Dihydroxynaphthalinderivats wie 1,3-Dihydroxynaphthalin 9b oder 2-Fluor-1,3-dihydroxynaphthalin 9a (0,2 Mol) mit 1,1 Äquivalenten des Phthalsäureanhydridderivats 3,6-Dichlortrimellithsäureanhydrid 10a und 1 Äquivalent eines Resorcinderivats 11 (0,2 Mol), 11a, 11b, 11c oder 11d, abhängig vom gewünschten Endprodukt, und 16 Stunden lang in unverdünnter MeSO&sub3;H (3 ml) bei 110ºC unter Argon hergestellt. Der rohe Farbstoff (bei Umsetzungen mit 10a ein Gemisch von Regioisomeren) wurde durch Zugabe zu einem Eis-/Wassergemisch ausgefällt, durch Filtration gewonnen und gereinigt, wobei durch präparative Dünnschichtchromatographie nach Elution mit einem Gemisch von CH&sub2;Cl&sub2; : MeOH : Essigsäure (70 : 30 : 1) zwei Isomere 1 und 2 erhalten wurden.
Der Kasten in Fig. 2B zeigt, daß R&sub2;- und/oder R&sub3;-unsubstituierte (R&sub2;=R&sub3;=H) Derivate der asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe, gezeigt für Isomer 2 des Farbstoffs 5, weiter 3 Stunden bei 0ºC mit halogenierenden Reagenzien (NaOCl, NaOH/Br&sub2;, NaOH/I&sub2;) reagieren, um nach der extraktiven Aufarbeitung mit 10% HCl/EtOAc, Trocknen mit Na&sub2;SO&sub4;, Abfiltrieren und Konzentrieren unter vermindertem Druck quantitativ die halogenierten Derivate wie 8 (R&sub2;=R&sub3;=Cl, Br, I, F) zu erzeugen.

BEISPIEL 2

Synthese von Farbstoff-markierten Oligonukleotiden

Die Synthese der erfindungsgemäßen Farbstoff-markierten Oligonukleotide wird unter Bezugnahme auf Fig. 3 beschrieben. CI-FLAN, Farbstoff 2, wurde durch Umsetzen mit 1, 2 Äquivalenten 1,3-Dicyclohexylcarbodümid und 3 Äquivalenten N-Hydroxysuccinimid in trockenem Ethylacetat 3 Stunden bei Raumtemperatur in den N-Hydroxysuccinimidester 12 umgewandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 5% HCl gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert, wobei ein Feststoff erhalten wurde, der in DMSO resuspendiert wurde (10 mg Farbstoff / 50 ul DMSO). Die DMSO-Farbstoff-Vorratslösung (5-10 ul) wurde im Überschuß (10-20-fach) zu einem Aminohexyl-derivatisierten -21M13-Oligonukleotid-Primer (1 · 10&supmin;³ M) in 0,25 M Hydrogencarbonat./ Carbonatpuffer bei pH 9,4 zugesetzt und 6 Stunden umgesetzt. Der Aminohexyl-derivatisierte Primer wurde durch automatisierte Festphasen-DNA-Synthese unter Verwendung von Aminolink-2 im letzten Zyklus hergestellt (PE p/n 400808). Das Farbstoff-markierte Oligonukleotid wurde von nicht umgesetztem Farbstoff mittel Durchlauf durch eine Sephadex G-25-Säule getrennt, wobei mit 0,1 M Triethylaminacetat (TEAA) eluiert wurde. Die Fraktion, die das rohe markierte Oligonukleotid enthielt, wurde mittels RP-HPLC unter Verwendung von Gradientenelution von 8% bis 25% AcCN in 0,1 M TEAA über 25 Minuten unter Verwendung einer RP-18-Chromatographiesäule gereinigt. Das reine Farbstoff-markierte Oligonukleotid 13 wurde zu einem Feststoff gefriergetrocknet und in 1 · TE-Puffer, pH 8,4, resuspendiert. Die Konzentration des Farbstoff-markierten Oligonukleotids wurde mittels UV-Absorption bei 260 nm bestimmt, wobei additive Werte des Extinktionskoeffizienten von 6650 für T, 7350 für C, 11.750 für G und 14.900 für A angenommen wurden und wobei die relative Verteilung der Farbstoffabsorption bei 260 nm von Spektren des freien Farbstoffs, die im gleichen Puffer gemessen wurden, bestimmt wurde.

BEISPIEL 3

Vergleich der Anregungsspektren von TAMRA (22)- und CI-FLAN (2)-markierten Oligonukleotiden von Beispiel 2

Anregungsspektren wurden von jedem Farbstoff in 1 · TBE-Puffer bei pH 8,4 aufgenommen. Die Farbstoffe lagen in equimolaren Konzentrationen (ca. 1 · 10&supmin;&sup6; M) vor. Die Emissionsintensität wurde bei λmaxEm für jeden Farbstoff aufgenommen. Fig. 4 zeigt, daß bei Anregung bei 488 nm die relative Anregungseffizienz von CI-FLAN etwa 2,5 mal so hoch als die des TAMRA-Farbstoffs ist, während bei Anregung bei 514 nm die relative Anregungseffizienz von CI-FLAN etwa 1,5 mal so hoch ist als die des TAMRA-Farbstoffs.

BEISPIEL 4

Vergleich der Quantenausbeute von TAMRA (22)- und CI-FLAN (2)-markierten Oligonukleotiden von Beispiel 2

Fig. 5 zeigt Emissionsspektren und die Fluoreszenzemissionsintensität eines TAMRA (22)- markierten -21M13-Oligonukleotids und eines CI-FLAN (2)-markierten -21M13-Oligonukleotids, und zwar angeregt am Absorptionsmaximum eines jeden Farbstoffs. Die Oligonukleotide wurden wie in Beispiel 2 hergestellt. Die Daten zeigen eine um 60% größere Quantenausbeute für das CI-FLAN (2)-markierte Oligonukleotid im Vergleich zum TAMRA (22)-markierten Oligonukleotid. Die Spektren wurden in 1 · TE-Puffer bei pH 8,4 bei einer Konzentration aufgenommen, die zu einer gleichen λmaxAbs von 0,05 für jedes markierte Oligonukleotid führt. Die Emissionsspektren wurden für jeden Farbstoff mit Bestrahlung bei λmaxAbs für jeden Farbstoff aufgenommen.

BEISPIEL 5

Vergleich der molaren Emissionsintensität von CI-FLAN (2)- und TAMRA (22)-markierten Oligonukleotiden

Die Emissionsspektren von equimolaren Konzentrationen (ca. 1 · 10&supmin;&sup6; M) eines TAMRA (22)-markierten Oligonukleotids und eines CI-FLAN (2)-markierten Oligonukleotids, die in 1 · TE-Puffer bei pH 8,4 gelöst wurden, wurden durch Bestrahlen eines jeden Oligonukleotids bei 488 nm und 514 nm und Addieren der Spektren gemessen, um sich der Strahlung eines Mehrlinien-Argonlasers anzunähern. Fig. 6 zeigt, daß die Fluoreszenzintensität des CI-FLAN (2)-markierten Oligonukleotids mehr als 2 mal größer ist als die des TAMRA (22)-markierten Oligonukleotids.

BEISPIEL 6

Ein Multiplex-Farbstoff-markierter Oligonukleotid-Satz

Die langweilige Fluoreszenzemission eines CI-FLAN (2)-markierten Oligonukleotid -21M13- Sequenzier-Primers wurde mit der Emission eines -21M13-Sequenzier-Primers verglichen, der mit 6-FAM-, TET- und HEX 23-Farbstoffen markiert war. 6-FAM bedeutet 6-Carboxytluorescein, "TET" 6-Carboxy-4,7,2',7'-tetrachlorfluorescein und "HEX" 6-Carboxy-4,7,2',4',5',7'- hexachlorfluorescein. Die Primer wurden wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben markiert. Die Anregungswellenlänge war 490 nm. Die Emissionsspektren wurden in 1 · TE-Puffer bei pH 8,4 aufgenommen und auf gleiche Intensität normalisiert (ca. 1 · 10&supmin;&sup6; M). Fig. 7 zeigt, daß die Emissionsmaxima bei 573 nm und die geringe Breite des Emissionsspektrums des CI-FLAN (2)-markierten Oligonukleotids das CI-FLAN (2)-markierte Oligonukleotid spektral von den Emissionsspektren der anderen drei Farbstoffe im Satz auflöst. Eine solche spektrale Auflösung zeigt die Eignung eines Farbstoffsatzes, der FAM-, TET- und HEX-markierte Oligonukleotide einschließt, mit dem CI-FLAN (2)-asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoff.

BEISPIEL 7

Herstellung eines 2-Fluor-1,3-dihydroxynaphthalin-Zwischenprodukts

Vgl. Fig. 8. Käufliches Homophthalsäureanhydrid (14) (100 g) wurde mit Ethanol (300 ml) unter Säurekatalyse (0,5 ml TFA) 3 Stunden unter Rückfluß umgesetzt, worauf das Reaktionsgemisch konzentriert und der erhaltene Feststoff aus Toluol umkristallisiert wurde. Das Ethylester-Zwischenprodukt 15 wurde in 95% Ausbeute erhalten. Das Zwischenprodukt 15 (10 g) wurde dann mit 1, 1 Äquivalenten Oxalylchlorid 4 Stunden bei Raumtemperatur in CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml) umgesetzt. Darauf wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur unter Hochvakuum konzentriert, wobei das Säurechlorid 16 als roher Feststoff mit einer Ausbeute von 80% erhalten wurde. Das Rohprodukt 16 wurde in THF suspendiert und weiter mit einem der folgenden beiden Verfahren mit Fluoressigsäure-Äquivalenten zur Herstellung der Verbindung 20 umgesetzt.
Verfahren A: Das Kaliumsalz (17) von Fluoressigsäureethylester (3 Äquivalente), das durch Umsetzung von Fluoressigsäureethylester mit Kalium-t-butoxid in THF bei 0ºC gebildet wurde, oder das Magnesiumsalz des Fluormalonsäuremonoethylesters (18) (1,5 Äquivalente), das durch Umsetzung von Isopropylmagnesiumbromid (2 Äquivalente) und dem Fluormalonsäuremonoethylester bei -60ºC gebildet wurde, wurden langsam zur THF-Suspension von 16 zugesetzt und bei 0ºC 6 Stunden lang umgesetzt. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 5% HCl abgebrochen und das Reaktionsgemisch wurde 3 mal mit EtOAc extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet, konzentriert und das erhaltene rohe Gemisch durch Flash-Chromatographie mit Gradientenelution von 6 : 4 Hexan/CH&sub2;Cl&sub2; bis 100% CH&sub2;Cl&sub2; gereinigt. Die Verbindung 20 wurde in einer Ausbeute von 30-50% erhalten.
Verfahren B: Die THF-Suspension von 16 wurde bei 70ºC langsam mit dem Phosphorylid 19 versetzt, anschließend ließ man das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und 16 Stunden umsetzen. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 5% NaHCO&sub3; abgebrochen und 6 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit THF/Wasser 3 mal extrahiert und das Produkt wie in Verfahren A isoliert, wobei das Zwischenprodukt 20 in einer Ausbeute von > 50% erhalten wurde. Gereinigtes 20 reagierte unter Basenkatalyse (2 Äquivalente NaOEt) unter Ringschluß zu einem cyclischen Zwischenprodukt 21, das in situ decarboxylierte, wobei das 2-Fluor-1,3-dihydroxynaphthalin (9a) in einer Ausbeute von 50% erhalten wurde. Alternativ kann das cyclische Zwischenprodukt 21 in einer Ausbeute von > 80% isoliert werden, wenn Kalium-t-butoxid in THF verwendet wird, und anschließend zu 2-Fluor- 1,3-dihydroxynaphthalin (9a) decarboxyliert wird.

BEISPIEL 8

DNA-Sequenzierung unter Verwendung der asymmetrischen Benzoxanthenverbindung 2

Das Sequenzieren mit automatisiertem Zyklus wurde unter Verwendung einer Perkin-Elmer- Catalyst 800 Molecular Biology Labstation durchgeführt (The Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA (PE)). Es wurden vier getrennte Sanger-Sequenzierreaktionen unter Verwendung der gleichen -21M13-Primer durchgeführt, die mit 6-FAM (C-Terminator), TET (A- Terminator), HEX (G-Terminator) oder CI-FLAN 2 (T-Terminator), wie es vorstehend beschrieben ist, markiert waren. Ein Gemisch der vier Reaktionsgemische wurde beladen und Daten wurden auf einem Perkin-Elmer ABI Prism® 377 DNA-Sequencer und dazugehöriger Datenanalysesoftware erzeugt.
Zyklus-Sequenzierreaktionen wurden mit der Catalyst 800 Molecular Biology Labstation unter Verwendung der 3.02 Software durchgeführt. Die Catalyst-Labstation wurde programmiert, um 0,6 ul pGEM 32+ Matrizen-DNA bei einer Konzentration von 100 ng/ul und 1,9 ul der nachstehend definierten Vormischung abzugeben. Die Sequenzierdaten wurden auf einem ABI Prism® 377 DNA-Sequencer unter Verwendung eines 5% Long Ranger Gel (FMC Corporation, Rockland, Maine) erzeugt. Jede der vier Sequenziervormischungen ist nachstehend in Tabelle I definiert:

TABELLE I

A-Vormischung

60 mM Tris, pH 9,0; 2,5 mM MgCl&sub2;; 4 mM KCl; 0,04 mM DTT; 4 uM EDTA; 0,1 uM TET-markierter Primer; 0,66 U/ul Amplitaq FS; 1,66 U/ul rTth Pyrophosphatase; 0,5 uM ddATP; 125 uM dATP; 125 uM dCTP; 150 uM c7dGTP; 125 uM dTTP.

C-Vormischung

60 mM Tris, pH 9,0; 2,5 mM MgCl&sub2;; 4 mM KCl; 0,04 mM DTT; 4 uM EDTA; 0,1 uM 6-FAM-markierter Primer; 0,66 U/ul Amplitaq FS; 1,66 U/ul rTth Pyrophosphatase; 0,5 uM ddCTP; 125 uM dATP; 125 uM dCTP; 150 uM c7dGTP; 125 uMdTTP.

G-Vormischung

60 mM Tris, pH 9,0; 2,5 mM MgCl&sub2;; 4 mM KCl; 0,04 mM DTT; 4 uM EDTA; 0,1 uM HEX-markierter Primer; 0,66 U/ul Amplitaq FS; 1,66 U/ul rTth Pyrophosphatase; 0,375 uM ddGTP; 125 uM dATP; 125 uM dCTP; 150 uM c7dGTP; 125 uM dTTP.

T-Vormischung

60 mM Tris, pH 9,0; 2,5 mM MgCl&sub2;; 4 mM KCl; 0,04 mM DTT; 4 uM EDTA; 0,1 uM FLAN-markierter Primer; 0,66 U/ul Amplitaq FS; 1,66 U/ul rTth Pyrophosphatase; 0,875 uM ddTTP; 125 uM dATP; 125 uM dCTP; 150 uM c7dGTP; 125 uM dTTP.
Das Zyklus-Sequenzieren wurde mit den vorstehenden Mischungen von Matrize und Vormischungen durchgeführt. Die Zyklusbedingungen auf der Catalyst-Labstation waren wie folgt: ein Zyklus bei 96ºC für 20 Sekunden, 15 Zyklen bei 94ºC für 20 Sekunden, 55ºC für 40 Sekunden und 68ºC für 60 Sekunden und 15 Zyklen bei 94ºC für 20 Sekunden und 68ºC für 60 Sekunden.
Nach den thermischen Cyklen wurden die vier getrennten Reaktionsgemische im Konzentrationspuffer vereinigt (83% DMSO I/25 mM EDTA / 8 mg/ml Blue Dextran) und unter Verwendung von Standard-Express-Beladeverfahren (v 2.02 Catalyst Manual, PE) konzentriert. 2 ml konzentrierte Probe wurden in eine Vertiefung des 377 Sequencers beladen, prozessiert und unter Verwendung der 1.1 Version der Software analysiert. Die Sequenz zwischen den Basen 233 und 263 ist in Fig. 9 gezeigt.

BEISPIEL 9

Mikrosatellitenfragmente, die unter Verwendung von CI-FLAN (2)-, HEX- und TET-markierten Primern markiert und gleichzeitig mit ROX-markierten internen Größenstandards getrennt wurden.

PCR-Reaktionen von vier Loci einer DNA aus einer menschlichen CEPH-Familie unter Verwendung von Farbstoff-markierten Primern wurde, wie es nachstehend beschrieben ist, durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden vereinigt und elektrophoretisch mit einem Perkin- Elmer ABI Prism® 377 DNA-Sequencer (PE) getrennt. Das Fluoreszenzsignal eines jeden Farbstoff-markierten Fragment-Peaks wurde unter Verwendung der GeneScan® Analysesoftware Version 2.02 (PE) analysiert. Unter Bezugnahme auf Fig. 10 entsprechen die roten Peaks (mit R gekennzeichnet) den ROX (26)-markierten internen Standardfragmenten, die blauen Peaks (mit B gekennzeichnet) den TET-markierten Fragmenten, die grünen Peaks (mit G gekennzeichnet) den HEX-markierten Fragmenten und die schwarzen Peaks (mit K gekennzeichnet) den CI-FLAN (2)-markierten Fragmenten.
Die PCR-Reaktionen wurden auf einem Perkin-Elmer 9600-Thermocycler (PE) durchgeführt. Eine getrennte Reaktion wurde unter Verwendung der folgenden Mischung für jeden Farbstoff-markierten Primer durchgeführt:

Reaktionskomponenten Volumen (ul)

Farbstoff-markierte Primermischung (5 uM) 1,0
DNA (50 ng/ul) 1,2
10 X PE PCR-Puffer II 1,5
dNTP-Gemisch (2,5 mM) 1,5
AmpliTaqaa (5 Einheiten/ul) 0,12
2,0 mM MgCl&sub2; 1,2
steriles vollentsalztes Wasser 8,48
gesamtes Gemisch 15,0
Die Gemische wurden unter Verwendung folgender Zyklusbedingungen amplifiziert: 1 Zyklus bei 95ºC für 5 Minuten, 10 Zyklen bei 94ºC für 15 Sekunden, 55ºC für 15 Sekunden und 72ºC für 30 Sekunden, 20 Zyklen bei 89ºC für 15 Sekunden, 55ºC für 15 Sekunden und 72ºC für 30 Sekunden und 1 Zyklus bei 72ºC für 10 Minuten.
Die amplifizierten PCR-Produkte wurden durch Mischen der CI-FLAN (2)- und TET-markierten PCR-Produkte (0,5 ul) mit 1,0 ul eines jeden HEX-markierten PCR-Produkts vereinigt, wobei ein Gesamtverhältnis von gemischten Farbstoff-markierten Fragmenten bestehend aus 1 : 2 : 1 (CI-FLAN : HEX : TET) erhalten wurde. Die vereinigten PCR-Fragmente wurden mit einer Belademischung gemischt, die aus 2,5 ul Formamid, 0,5 ul Blue Dextran (50 mM EDTA, 50 mg/ml Blue Dextran) und 0,5 ul Größenstandard (GS-350 ROX, PE p/n 401735) bestand. Das vereinigte Gemisch wurde dann 5 Minuten bei 95ºC denaturiert und dann auf eine Gelspur eines PE ABI Prism® 377 DNA-Sequencers beladen. Die Fragmente wurden elektrophoretisch unter Verwendung eines Acrylamidgels mit den folgenden Eigenschaften getrennt und nachgewiesen: Dicke 0,20 mm, 4,25 Gew.-% Acrylamid, 19 : 1 Acrylamid / Bisacrylamid (Gewicht/Gewicht), quadratischer Zinkenkamm für 34 Vertiefungen (34 Well Square tooth comb), 10 X TBE-Puffer (89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA), pH 8,3. Das Gerät wurde unter Verwendung des Filterrades A und des GS 36D-2400-Moduls betrieben, das die folgenden Betriebsparameter aufweist: EP-Spannung 3000 V, EP-Strom 60,0 mA, EP-Leistung 200 W, Geltemperatur 51ºC und Laserleistung 40 mW.

BEISPIEL 10

Vergleich der spektralen Eigenschaften, der Photostabilität und der chemischen Stabilität von Rhodamin-Farbstoffen, Xanthen-Farbstoffen und der erfindungsgemäßen asymmetrischen Xanthen-Farbstoffe

Die nachstehende Tabelle II faßt vergleichend verschiedene spektrale und chemische Eigenschaften der erfindungsgemäßen asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoffe und anderer spektral ähnlicher Farbstoffe auf Xanthen- und Rhodaminbasis zusammen. TABELLE II
Für die Strukturen der in der Tabelle genannten Farbstoffe vgl. Fig. 1 und 2. Alle angegebenen Daten beziehen sich auf das reine Farbstoffisomer 2. Alle Emissionsspektren wurden in 1 · TBE-Puffer bei pH 8,4 in Farbstofflösungen mit einer Extinktion von 0,05 bei λmaxAbs (ca. 1 · 10&supmin;&sup6; M) bei Raumtemperatur aufgenommen. Die Photo-Zersetzungsgeschwindigkeit wurde für gleiche Volumina der Farbstoffe bei anfänglich einer Absorptionseinheit bei λmaxAbs bestimmt und in Paaren bei gleichen Volumina unter gleich hoher Bestrahlungsintensität mit weißem Licht bei 35ºC in 1 · TBE-Puffer bei pH 8,4 durchgeführt. Absorptionsspektren von Aliquots wurden in Intervallen von 1 Stunde genommen und die Intensitäten bei λmaxEm wurden an Exponentialkurven erster Ordnung angepaßt, um die t1/2-Rate für den Farbstoffverlust zu bestimmen. Die relative Helligkeit bei λmaxEm wurde mit einer Anregung der Farbstoffe bei 514 nm bei etwa gleichen Konzentrationen bestimmt (λmaxAbs = 0,05). Für die NH&sub4;OH-Stabilitätsmessungen wurden die Farbstoffe in konzentriertem Ammoniumhydroxid mit etwa gleichen Konzentrationen (λmaxAbs = 1) verdünnt und 20 Stunden lang bei 60ºC in verschlossenen Gefäßen inkubiert. Die Absorptionsspektren von Aliquots wurden in Intervallen von 1 Stunde aufgenommen und die Intensitäten bei λmaxEm wurden an Exponentialkurven erster Ordnung angepaßt, um die t1/2 für die Zersetzung des Farbstoffs zu bestimmen.

Claims

1. . Asymmetrische Benzoxanthen-Farbstoffverbindung der allgemeinen Formel

in der die Reste Y&sub1; und Y&sub2; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer Hydroxylgruppe, einem Sauerstoffatom, einer Iminium- ind einer Aminogruppe;

die Reste R&sub1;-R&sub8; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoff-, Fluor-, Chloratom, einer C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppe, Alkenylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, Alkinylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Iminium-, Amido-, Nitril-, C&sub1;-C&sub8;-Alkoxygruppen, einer verbindenden Gruppe und Kombinationen davon; und

der Rest R&sub9; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Acetylengruppe, einer C&sub1;-C&sub8;- Alkylgruppe, Alkenylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, Cyano-, Phenyl-, substituierten Phenylgruppe, heterocyclisch-aromatischen Gruppen und Kombinationen davon, wobei die substituierte Phenylgruppe die allgemeine Formel

hat, in der die Reste X&sub1;-X&sub5; unabhängig ein Wasserstoff-, Chlor-, Fluoratom, eine C&sub1;-C&sub8;- Alkyl-, eine Carbonsäuregruppe, Sulfonsäuregruppe, -CH&sub2;OH oder eine verbindende Gruppe sind.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei einer der beiden Reste Y&sub1; und Y&sub2; ein Sauerstoffatom und der andere Rest eine Hydroxylgruppe ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Rest X&sub1; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Carbonsäuregruppe, Sulfonsäuregruppe und -CH&sub2;OH;

die Reste X&sub2; und X&sub5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoff-, Chlor-, Fluoratom und einer C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppe; und

die Reste X&sub3; und X&sub4; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoff-, Chlor-, Fluoratom, einer C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppe, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäuregruppe und einer verbindenden Gruppe.

4. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Reste X&sub2; und X&sub5; Chloratome sind.

5. Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Rest X&sub1; eine Carbonsäuregruppe ist.

6. Verbindung nach Anspruch 1, wobei einer der Reste X&sub3; oder X&sub4; eine verbindende Gruppe ist und der andere Rest ein Wasserstoffatom ist.

7. Verbindung nach Anspruch 1, wobei einer der Reste X&sub1; oder X&sub5; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Carbonsäuregruppe, Sulfonsäuregruppe und -CH&sub2;OH.

8. Verbindung nach Anspruch 1, wobei einer der Reste R&sub1; bis R&sub3; ein Fluoratom ist.

9. Verbindung nach Anspruch 8, wobei der Rest R&sub3; ein Fluoratom ist.

10. Verbindung nach Anspruch 1, wobei

einer der Reste Y&sub1; und Y&sub2; ein Sauerstoffatom und der andere Rest eine Hydroxylgruppe ist;

der Rest R&sub1; ein Chloratom ist;

der Rest R&sub3; ein Fluoratom ist;

die Reste R&sub2; und R&sub4;-R&sub8; ein Wasserstoffatom sind; und

der Rest R&sub9; eine substituierte Phenylgruppe ist, in der der Rest X&sub1; eine Carboxylgruppe ist, die Reste X&sub2; und X&sub5; Chloratome sind und einer der Reste X&sub3; und X&sub4; eine Carboxylgruppe und der andere Rest ein Wasserstoffatom ist.

11. Verbindung nach Anspruch 1, wobei

die Reste R&sub1; und R&sub3; Fluoratome sind;

die Reste R&sub2; und R&sub4;-R&sub8; Wasserstoffatome sind; und

12. Verbindung nach Anspruch 1, wobei

der Rest R&sub1; eine Methoxygruppe, der Rest R&sub2; ein Chloratom und der Rest R&sub3; ein Fluoratom ist;

die Reste R&sub4;-R&sub8; Wasserstoffatome sind; und

13. Verbindung nach Anspruch 1, wobei

der Rest R&sub3; ein Fluoratom ist; die Reste R&sub1;, R&sub2; und R&sub4;-R&sub8; Wasserstoffatome sind; und

14. Verbindung nach Anspruch 1, wobei

die Reste R&sub1;-R&sub8; Wasserstoffatome sind; und

15. Verbindung nach Anspruch 1, wobei

der Rest R&sub1; ein Chloratom ist; die Reste R&sub2;-R&sub8; Wasserstoffatome sind; und

16. Verbindung nach Anspruch 1, wobei

der Rest R&sub1; eine Methoxygruppe und der Rest R&sub2; ein Chloratom ist;

die Reste R&sub3;-R&sub8; Wasserstoffatome sind; und

17. Verbindung der allgemeinen Formel

in der der Rest R&sub3; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fluor-, Chloratom, einer Sulfonat-, Amino-, Amido-, Nitril-, C&sub1;-C&sub8;-Alkoxygruppe und einer verbindenden Gruppe;

die Reste R&sub4;-R&sub7; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoff-, Fluor-, Chloratom, einer C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppe, Alkenylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, Alkinylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, einer Sulfonat-, Amino-, Amido-, Nitril-, C&sub1;-C&sub8;-Alkoxygruppe und einer verbindenden Gruppe; und

der Rest Y&sub2; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Hydroxyl- und einer Aminogruppe.

18. Verbindung nach Anspruch 17, wobei der Rest R&sub3; ein Fluoratom ist.

19. Verbindung nach Anspruch 17, wobei der Rest R&sub3; ein Chloratom ist.

20. Verbindung nach Anspruch 17, wobei der Rest Y&sub2; eine Hydroxylgruppe ist.

21. Verbindung nach Anspruch 17, wobei der Rest Y&sub2; eine Aminogruppe ist.

22. Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 17 bis 21 zur Herstellung der Benzoxanthen-Farbstoffverbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.

23. Phosphoramiditverbindung der allgemeinen Formel

in der

der Rest X ein Spacerarm ist;

der Rest Y eine verbindende Gruppe ist;

der Rest B&sub1; eine Phosphitester-Schutzgruppe ist;

die Reste B&sub2; und B&sub3; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer C&sub1;-C&sub8;- Alkylgruppe, Alkenylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, Aryl- und Cycloalkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen; und

der Rest D die Farbstoffverbindung nach Anspruch 1 ist;

wobei die Reste Y und D durch eine verbindende Gruppe verbunden sind, die in einer der Positionen R&sub1;-R&sub9; an den Farbstoff D gebunden ist.

24. Verbindung nach Anspruch 23, wobei die Reste B&sub2; und B&sub3; zusammengenommen eine Alkenkette mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen in der Hauptkette bilden und eine Gesamtzahl von bis zu 10 Kohlenstoffatomen enthalten, wobei beide endständigen Bindungen der Ketten an das Stickstoffatom gebunden sind; oder wobei die Reste B&sub2; und B&sub3; mit dem Stickstoffatom zusammengenommen einen gesättigten Stickstoftheterocyclus ausbilden, der ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Stickstoff-, Sauerstoff und Schwefelatom enthält.

25. Verbindung nach Anspruch 24, wobei

der Rest B&sub1; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Methyl-, β-Cyanoethyl- oder 4- Nitrophenylethylgruppe;

die Reste B&sub2; und B&sub3; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus der Isopropyl-, t-Butyl-, Isobutyl- und sec-Butylgruppe; und

die Reste B&sub2; und B&sub3; zusammengenommen die Morpholinogruppe sind.

26. Verbindung nach Anspruch 23, wobei die Reste X und Y zusammengenommen die Gruppe

sind, wobei n einen Wert von 2 bis 10 hat.

27. Verbindung nach Anspruch 23, wobei die Reste X und Y zusammengenommen die Gruppe

sind, wobei n einen Wert von 2 bis 10 hat.

28. Phosphoramiditverbindung der allgemeinen Formel

in der

der Rest B&sub1; eine Phosphitester-Schutzgruppe ist;

die Reste B&sub2; und B&sub3; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer C&sub1;-C&sub8;- Alkylgruppe, Alkenylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, Aryl- und Cycloalkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen;

der Rest B&sub5; eine säurespaltbare Hydroxyl-Schutzgruppe ist;

B eine Nukleotidbase ist; und

der Rest D die Farbstoffverbindung nach Anspruch 1 ist;

wobei, wenn der Rest B Purin oder 7-Desazapurin ist, der Zuckerrest an der N&sup9;-Position des Purins oder des 7-Desazapurins gebunden ist, und wenn der Rest B Pyrimidin ist, der Zuckerrest an der N¹-Position des Pyrimidins gebunden ist;

wobei die Reste B und D durch eine verbindende Gruppe an einer der Positionen R&sub1;-R&sub9; an den Rest D gebunden sind; und

wobei, wenn der Rest B ein Purin ist, die verbindende Gruppe an die 8-Position des Purins gebunden ist, wenn der Rest B 7-Desazapurin ist, die verbindende Gruppe an die 7-Position des 7-Desazapurins gebunden ist, und wenn der Rest B Pyrimidin ist, die verbindende Gruppe an die 5-Position des Pyrimidins gebunden ist.

29. Verbindung nach Anspruch 28, wobei die verbindende Gruppe

ist.

30. Verbindung nach Anspruch 28, wobei die verbindende Gruppe

ist.

31. Verbindung nach Anspruch 28, wobei die verbindende Gruppe

ist.

32. Verbindung nach Anspruch 28, wobei der Rest B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Uracil, Cytosin, Desazaadenin und Desazaguanosin.

33. Ein markiertes Nukleotid der allgemeinen Formel

in der

der Rest B eine 7-Desazapurin-, Purin- oder Pyrimidin-Nukleotidbase ist;

die Reste W&sub1; und W&sub2; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom und der Hydroxylgruppe;

der Rest W&sub3; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Hydroxylgruppe,

und

der Rest D die Farbstoffverbindung nach Anspruch 1 ist;

wobei die verbindende Gruppe, die die Reste B und D verbindet, an einer der Positionen R&sub1;- R&sub9; an den Rest D gebunden ist; und

34. Markiertes Nukleotid nach Anspruch 33, wobei der Rest B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Uracil, Cytosin, Desazaadenin und Desazaguanosin.

35. Markiertes Nukleotid nach Anspruch 33, wobei die verbindende Gruppe

ist.

36. Markiertes Nukleotid nach Anspruch 33, wobei sowohl der Rest W&sub1; als auch der Rest W&sub2; Wasserstoffatome sind und der Rest W&sub3; die Gruppe

ist.

37. Markiertes Nukleotid nach Anspruch 33, wobei der Rest W&sub1; ein Wasserstoffatom; der Rest W&sub2; eine Hydroxylgruppe und der Rest W&sub3;

ist.

38. Markiertes Polynukleotid, enthaltend ein Nukleotid der allgemeinen Formel

in der

der Rest B eine 7-Desazapurin-, Purin- oder Pyrimidin-Nukleotidbase ist;

der Rest Z&sub1; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom und der Hydroxylgruppe;

der Rest 22 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, der Hydroxylgruppe, HPO&sub4; und Nuc, wobei der Rest Nuc und das Nukleosid durch eine Phosphodiestergruppe verbunden sind, wobei die Phosphodiestergruppe an die 5'-Position des Restes Nuc gebunden ist;

der Rest Z&sub3; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, HPO&sub3;, Phosphat-Analoga und Nuc, wobei der Rest Nuc und das Nukleosid durch eine Phosphodiestergruppe verbunden sind, wobei die Phosphodiestergruppe an die 3'-Position des Restes Nuc gebunden ist; und

der Rest D eine Farbstoffverbindung nach Anspruch 1 ist;

wobei, wenn der Rest B Purin oder 7-Desazapurin ist, der Zuckerrest an der N&sup9;-Position des Purins oder Desazapurins gebunden ist, und wenn der Rest B Pyrimidin ist, der Zuckerrest an der N¹-Position des Pyrimidins gebunden ist;

wobei die verbindende Gruppe, die die Reste B und D verbindet, in einer der Positionen R&sub1;-R&sub9; an den Rest D gebunden ist; und

wobei, wenn der Rest B ein Purin ist, die verbindende Gruppe an die 8-Position des Purins gebunden ist, wenn der Rest B ein 7-Desazapurin ist, die verbindende Gruppe an die 7-Position des 7-Desazapurins gebunden ist, und wenn der Rest B Pyrimidin ist, die verbindende Gruppe an die 5-Position des Pyrimidins gebunden ist.

39. Markiertes Polynukleotid nach Anspruch 38, wobei der Rest B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Uracil, Cytosin, Desazaadenin und Desazaguanosin.

40. Markiertes Polynukleotid nach Anspruch 38, wobei die verbindende Gruppe

ist.

41. Polynukleotid-Sequenzierverfahren, umfassend die Schritte:

Bilden eines Gemisches einer ersten, einer zweiten, einer dritten und einer vierten Klasse von Polynukleotiden, sö daß:

jedes Polynukleotid in der ersten Klasse ein 3'-terminales Didesoxyadenosin enthält und mit einem ersten Farbstoff markiert ist;

jedes Polynukleotid in der zweiten Klasse ein 3'-terminales Didesoxycytidin enthält und mit einem zweiten Farbstoff markiert ist;

jedes Polynukleotid in der dritten Klasse ein 3'-terminales Didesoxyguanosin enthält und mit einem dritten Farbstoff markiert ist; und

jedes Polynukleotid in der vierten Klasse ein 3'-terminales Didesoxythymidin enthält und mit einem vierten Farbstoff markiert ist;

wobei einer des ersten, zweiten, dritten oder vierten Farbstoffs der asymmetrische Benzoxanthen-Farbstoff nach Anspruch 1 ist;

die anderen der Farbstoffe vom asymmetrischen Benzoxanthen-Farbstoff und untereinander spektral trennbar sind;

elektrophoretisches Trennen der Polynukleotide, wodurch Banden von Polynukleotiden mit ähnlicher Größe gebildet werden;

Beleuchten der Banden mit einem Beleuchtungsstrahl, der Fluoreszenz der Farbstoffe erzeugen kann; und

Identifizieren der Polynukleotid-Klassen in den Banden durch das Fluoreszenzspektrum der Farbstoffe.

42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die anderen Farbstoffe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 6-Carboxyfluorescein, 6-Carboxy-4,7,2',7'-tetrachlorfluorescein und 6- Carboxy-4,7,2',4',5',7'-hexachlorfluorescein.

43. Verfahren zur Fragment-Analyse, umfassend:

Erzeugen eines markierten Polynukleotid-Fragments, wobei das Fragment mit der Farbstoffverbindung nach Anspruch 1 markiert wird;

Unterwerfen des markierten Polynukleotid-Fragments einem größenabhängigen Trennverfahren; und

Detektieren des markierten Polynukleotid-Fragments nach dem Trennverfahren.

44. Verfahren nach Anspruch 43, wobei das größenabhängige Trennverfahren Elektrophorese ist und die Detektion durch Fluoreszenz stattfindet.