DE69700107T2 - Verfahren zur Isolation und Reinigung von S-(1,2-Dicarboxyethyl)-Glutathion - Google Patents
Verfahren zur Isolation und Reinigung von S-(1,2-Dicarboxyethyl)-GlutathionInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines Glutathion-Derivats. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von S-(1,2-Dicarboxyethyl)glutathion oder eines pharmakologische annehmbaren Salzes desselben.
- S-(1,2-Dicarboxyethyl)glutathion (nachstehend kurz als DCE-GS bezeichnet) ist ein saures Tripeptid, welches D.H. Calam und S.G. Waley in der Augenlinse von Rindern entdeckten (Biochem. J., 86, 226, 1963). Die nachfolgende Forschung von Ohmori und seinen Mitarbeitern ergab, daß DCE-GS ebenfalls in der Leber und im Herz vorliegt (Archives of Biochemistry and Biophysics Band 279, Nr. 1, 15. Mai 1990, S. 146-150). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben in bezug auf das pharmakologische Profil dieser Substanz bisher gefunden, daß sie eine antikoagulierende Aktivität (JP Kokai 563-8337), eine Antithrombose-Aktivität (JP Kokai H1-79956), eine entzündungshemmende und/oder antiallergische Aktivität (JP Kokai H3-48626) und eine Antihistaminikum- Aktivität und eine leberschützende Aktivität (JP Kokai H3- 118334) aufweist.
- DCE-GS ist leicht erhältlich, wenn Glutathion und entweder Fumarsäure oder Maleinsäure einfach in Wasser gerührt werden. Es wurde gefunden, daß es jedoch schwierig ist, DCE-GS im großtechnischen Maßstab in hochreiner Form aus der Reaktionsmischung zu gewinnen. Die folgenden 3 alternativen Verfahren sind zur Isolierung und Reinigung von DCE-GS nach der Vervollständigung der Reaktion von Glutathion mit entweder Fumarsäure oder Maleinsäure vorgeschlagen worden.
- Ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von DCE-GS umfaßt das Lösen des Reaktionsprodukts in Form der freien Säure oder des Salzes in Wasser, die Zugabe eines organischen Lösungsmittels wie einen Alkohol oder Aceton zu der Lösung, um das Produkt auszufällen, und das Unterziehen des Niederschlags verschiedenen Kristallisationszyklen (JP Kokai H3-118334). Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß die in der Lösung verbleibenden Ausgangsmaterialien, d. h. Glutathion und Fumarsäure, auch mitausgefällt werden, um das DCE-GS zu verunreinigen, wodurch die Isolierung von DCE-GS in reiner Form erschwert wird.
- Ein anderes Verfahren umfaßt die Umwandlung des Produkts DCE-GS in das entsprechende Kupfersalz und die Kristallisation des Salzes aus Wasser-Ethanol (JP Kokai H3-118334). Jedoch auch mittels dieses Verfahrens ist es schwierig, die in kleinen Mengen enthaltenden, verunreinigenden Kupfersalze von Glutathion, oxidiertem Glutathion und Fumarsäure vollständig zu entfernen.
- In dem von Waley et al. vorgeschlagenen Verfahren wird DCE-GS zuerst auf die gleiche Weise wie oben in das entsprechende Kupfersalz umgewandelt, und dann wird das Kupfer mit Oxychinolin entfernt. Jedoch selbst mittels dieses Verfahrens ist es nicht möglich, DCE-GS vollständig zu reinigen, und zusätzlich dazu ist es vom industriellen Standpunkt aus gesehen von Nachteil, daß das Verfahren die Verwendung des kostspieligen Reagens-Oxychinolin und eine komplizierte Arbeitsweise beinhaltet (Biochem. J. 96, 226, 1063).
- Somit ist es schwierig, das Produkt DCE-GS aus der Reaktionsmischung durch irgendeines der obigen bekannten Verfahren in hochreiner Form zu isolieren. Deshalb führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung umfangreiche Forschungsarbeiten durch, um ein kommerziell vorteilhaftes Verfahren zur Isolierung und Reinigung von DCE-GS zu entwickeln. Als Ergebnis fanden die Erfinder, daß DCE-GS in hoher Reinheit isoliert werden kann, indem man eine wäßrige Lösung von Essigsäure, Ameisensäure oder Propionsäure und Aktivkohle verwendet, und somit vervollständigten sie schließlich die vorliegende Erfindung.
- Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Isolierung und Reinigung von DCE-GS, das nicht die oben erwähnten Nachteile aufweist.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von S-(1,2-Dicarboxyethyl)glutathion oder eines pharmakologisch annehmbaren Salzes desselben aus einer Reaktionsmischung, die bei der Umsetzung von Glutathion oder eines Salzes desselben mit Fumarsäure oder eines Salzes derselben oder Maleinsäure oder eines Salzes derselben erhältlich ist, umfassend einen ersten Schritt der Umwandlung von S-(1,2-Dicarboxyethyl)glutathion oder eines Salzes desselben in der Reaktionsmischung in das entsprechende Kupfersalz, des Lösens des Kupfersalzes in einer wäßrigen Lösung von Essigsäure, Ameisensäure oder Propionsäure, und des Entfernens von verunreinigendem Glutathion, oxidiertem Glutathion und Fumarsäure-Kupfersalzen mit Hilfe von Aktivkohle, und einen zweiten Schritt des Lösens oder Suspendierens des isolierten S-(1,2- Dicarboxyethyl)glutathion-Kupfersalzes in Wasser und des Blasens von Schwefelwasserstoff durch die sich ergebende wäßrige Lösung oder Suspension, um Kupfer zu entfernen.
- Das Verfahren zur Isolierung und Reinigung von DCE-GS gemäß der vorliegenden Erfindung wird nun ausführlich beschrieben.
- Zu Beginn werden Glutathion (oder ein Salz desselben) und entweder Fumarsäure (oder ein Salz derselben) oder Maleinsäure (oder ein Salz derselben) in Wasser oder einem alkoholisch-wäßrigen Medium gelöst, und die Lösung wird 1 bis 2 Tage unter Erwärmen auf Raumtemperatur stehengelassen. Durch diese Arbeitsweise wird die Zielverbindung DCE-GS (oder ein Salz derselben) hergestellt. Das so in der Reaktionsmischung hergestelle DCE-GS (oder ein Salz derselben) wird unter Verwendung von Kupferacetat (Monohydrat) oder dergleichen in das entsprechende Kupfersalz überführt. Nachdem dieses Kupfersalz in einer wäßrigen Lösung von Essigsäure, Ameisensäure oder Propionsäure gelöst ist, wird Aktivkohle zu der Lösung zugegeben, um die Kupfersalze von nicht umgesetztem oder überschüssigem Glutathion, oxidiertem Glutathion und Fumarsäure (bei der Umsetzung zwischen Maleinsäure und Glutathion wird die nichtumgesetzte Maleinsäure in Fumarsäure überführt) auf der Kohle zu absorbieren, und die Kohle wird dann abfiltriert. Dann wird dem Filtrat ein Alkohol oder dergleichen zugefügt, und das DCE-GS-Kupfersalz, das sich ausscheidet, wird durch Filtration gewonnen.
- Das so erhaltene DCE-GS-Kupfersalz wird in Wasser gelöst oder suspendiert, und Schwefelwasserstoffgas wird durch die Lösung oder Suspension geleitet. Das Kupfer in Form von Kupfersulfid wird abfiltriert, und das Filtrat wird unter reduziertem Druck eingeengt. Zu dem öligen Rückstand wird ein Alkohol oder dergleichen gegeben, und die sich ergebenden weißen Kristalle werden durch Filtration gesammelt, um DCE-GS in freier Säureform bereitzustellen. Wenn der ölige Rückstand mit einem Alkalimetall- oder Erdalkalimetallion durch Zugabe des entsprechenden Metallhydroxids, -carbonats oder -hydrogencarbonats neutrali siert wird, wird das entsprechende Salz erhalten. Die. Umwandlung in das Salz kann nach der Isolierung von DCE-GS aus der Reaktionsmischung oder in der Reaktionsmischung durchgeführt werden. Die beabsichtigte Verbindung DCE-GS oder ein Salz derselben wird in racemischer Form (da DCE-GS ein asymmetrisches Kohlenstoffatom in seinem Molekül aufweist, kann es in Form optischer Isomerer auftreten) erhalten. Die Reinheit des Produkts ist nicht geringer als 98%.
- Das pharmakologisch annehmbare Salz von DCE-GS schließt ein - ohne darauf beschränkt zu sein - Salze mit Alkalimetallen wie Natrium, Kalium usw. und Salze mit Erdalkalimetallen wie Calcium, Magnesium usw. Das Salz kann derartig sein, daß alle Carboxylgruppen von DCE-GS Salze gebildet haben oder nur einige derselben Salze gebildet haben. DCE-GS in Salzform weist eine längere Lagerbeständigkeit bei Raumtemperatur auf als DCE-GS in freier Säureform.
- Um bei dem Isolierungs- und Reinigungs-Verfahren der vorliegenden Erfindung das DCE-GS-Kupfersalz zu kristallisieren, wird das DCE-GS-Kupfersalz vor der Kristallisation aus einem Alkohol zuerst in einer wäßrigen Lösung von Essigsäure, Ameisensäure oder Propionsäure gelöst. Das Vorliegen einer derartigen Säure ist dahingehend vorteilhaft, daß die Löslichkeit des DCE-GS- Kupfersalzes erhöht wird und die Kristallisation von DCE-GS aus dem Alkohol erleichtert wird. Beim Fehlen einer derartigen Säure bildet das DCE-GS-Kupfersalz bei der Kristallisation mikrofeine Kristalle, die nicht leicht durch Filtration gesammelt werden können.
- In der obigen Arbeitsweise zur Isolierung und Reinigung von DCE- GS wird, wenn z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure anstelle von Essigsäure, Ameisensäure oder Propionsäure zur Kristallisation des DCE-GS-Kupfersalzes verwendet werden, teilweise das Kupferchlorid- oder Kupfersulfat-Salz gebildet, so daß bei der Zugabe eines Alkohols zum Ausfällen des DCE-GS-Kupfersalzes, das oben erwähnte Salz auch mitausgefällt wird. In dem Verfahren zur Isolierung und Reinigung von DCE-GS gemäß der vorliegenden Erfindung wird Schwefelwasserstoff-Gas durch das System geleitet, um Kupfer in Form von Kupfersulfid zu entfernen. Es wurde jedoch gefunden, daß eine geringe Menge Salzsäure oder Schwefelsäure, falls sie verwendet wurden, nach dem Entfernen des Kupfers in dem Filtrat zurückbleibt, wobei sich ergibt, daß beim Einengen des Filtrats die Konzentration der Säure zunimmt, um eine teilweise Zersetzung des DCE-GS in dem Filtrat zu verursachen. Wenn das Filtrat neutralisiert wird, bilden weiterhin die Salzsäure oder die Schwefelsäure ein anorganisches Salz, und wenn ein Alkohol zugegeben wird, wird es ausgefällt und kann nicht leicht entfernt werden. Demgegenüber werden, wenn wie in der vorliegenden Erfindung Essigsäure, Ameisensäure oder Propionsäure verwendet werden, die obigen Probleme vermieden, so daß DCE-GS in hochreiner Form isoliert werden kann.
- Die bevorzugte Konzentration der wäßrigen Lösung von Essigsäure, Ameisensäure oder Propionsäure zur Verwendung bei dem Isolierungs- und Reinigungs-Verfahrens der vorliegenden Erfindung des DCE-GS beträgt unveränderlich etwa 1 bis 50 v/v %.
- In dem Verfahren zur Isolierung und Reinigung von DCE-GS gemäß der vorliegenden Erfindung wird zum Entfernen der Kupfersalze des nichtumgesetzten oder überschüssigen Glutathions oder oxidierten Glutathions und von Fumarsäure Aktivkohle verwendet. Es wurde gefunden, daß ohne die Hilfe der Aktivkohle das Ausgangs- Glutathion und die Fumarsäure selbst durch verschiedenen Kristallisationszyklen nicht entfernt werden können. Dies läßt sich darauf zurückführen, daß die Kupfersalze von Glutathion und Fumarsäure weniger löslich sind als das DCE-GS-Kupfersalz. Die Menge der in dem Verfahren zur Isolierung und Reinigung von DCE- GS gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Aktivkohle beträgt in bezug aus das S(1,2-Dicarboxyethyl)glutathion-Kupfersalz vorzugsweise etwa 5 bis 20 w/w %.
- Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
- In einem konischen 300 ml Kolben wurden 9,5 g Natriumhydroxid in 200 ml Wasser gelöst, und 12,75 g (0,11 mol) Fumarsäure und 30,7 g (0,1 mol) Glutathion wurden zugegeben. Der Kolben wurde hermetisch verschlossen, und die Inhaltsstoffe desselben wurden 4 Stunden bei 50ºC gerührt.
- Zu dieser Reaktionsmischung wurden 50 ml Essigsäure und 22,0 g (0,11 mol) Kupferacetat (Monohydrat) unter Rühren gegeben. Zu der sich ergebenden Lösung wurden etwa 3 g Aktivkohle gegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten gerührt und dann filtriert. Die Kohle wurde mit einer geringen Menge Wasser gewaschen, und das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt. Nach dem Kühlen wurde 1 l Methanol in einem Zug zugegeben. Die Mischung wurde gerührt, bis sie homogen war, und das ausgefällte, hellblaue Kupfersalz wurde durch Filtration gewonnen, mit Methanol gespült und getrocknet.
- Dann wurde das Kupfersalz zur Kristallisation in 400 ml einer 10 v/v %igen wäßrigen Essigsäure-Lösung gelöst, und nach der Zugabe von etwa 3 g Aktivkohle wurde die Mischung 20 bis 30 Minuten gerührt. Die Kohle wurde abfiltriert, und 1 l Methanol wurde auf einmal zu dem gekühlten Filtrat gegeben. Das ausgefällte Kupfersalz wurde durch Filtration gewonnen und mit Methanol gespült. Das Kupfersalz wurde wiederum auf die gleiche Weise wie oben kristallisiert, um 40 g als Kupfersalz zu ergeben.
- Dieses Kupfersalz wurde in 800 ml Wasser gelöst (wobei es teilweise ungelöst blieb), und Schwefelwasserstoff wurde unter Rühren durch die Lösung geleitet. Das sich ergebende Kupfersulfid wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck bei einer Temperatur eingeengt, die 40ºC nicht überstieg. Der verbleibende Sirup wurde in 200 ml Wasser gelöst, worauf die tropfenweise Zugabe von 10%igem Natriumhydroxid erfolgte, um den pH der Lösung auf 7,4 einzustellen. Die Mischung wurde bei 40ºC eingeengt, und der sich ergebende Sirup wurde aus Ethanol kristallisiert. Nach dem Kühlen wurde der kristalline Sirup durch Filtration gewonnen und aus Wasser-Ethanol umkristallisiert. Die so erhaltenen Kristalle wurden im Vakuum bei 40ºC getrocknet, um 34 g (Ausbeute: 65,8%) der Zielverbindung als weiße, pulverige Kristalle zu erhalten.
- Elementaranalyse für
- C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub8;O&sub1;&sub0;N&sub3;SNa&sub3; · 1,5 H&sub2;O (516,366)
- Berechnet (%): C 32,56; H 4,10; N 8,14
- Gefunden (%): C 32,67; H 4,26; N 8,13
- Durch die Isolierungs- und Reinigungs-Technologie der vorliegenden Erfindung kann DCE-GS oder ein Salz desselben in hoher Reinheit aus der Reaktionsmischung isoliert werden, die aus der Umsetzung von Glutathion oder eines Salzes desselben mit Fumarsäure (oder eines Salzes derselben) oder Maleinsäure (oder eines Salzes derselben) erhältlich ist. Deshalb ist die Technologie der vorliegenden Erfindung von großem wirtschaftlichen Wert.
Claims (2)
1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von
S-(1,2-Dicarboxyethyl)glutathion oder eines pharmakologisch
annehmbaren Salzes desselben aus einer Reaktionsmischung, die
bei der Umsetzung von Glutathion oder eines Salzes
desselben mit entweder Fumarsäure oder eines Salzes
derselben oder Maleinsäure oder eines Salzes derselben
erhältlich ist, umfassend
eine erste Stufe der Umwandlung von
S-(1,2-Dicarboxyethyl)glutathion oder eines Salzes desselben in der
Reaktionsmischung in das entsprechende Kupfersalz, des
Lösens des Kupfersalzes in einer wäßrigen Lösung aus
Essigsäure, Ameisensäure oder Propionsäure, und des
Entfernens des kontaminierten Glutathions, des oxidierten
Glutathions und der Fumarsäure-Kupfersalze mit Hilfe von
Aktivkohle, und
eine zweite Stufe des Lösens oder Suspendierens des
isolierten S-(1,2-Dicarboxyethyl)glutathion-Kupfersalzes in
Wasser und des Leitens von Schwefelwasserstoffgas durch
die sich ergebende wäßrige Lösung oder Suspension, um
Kupfer zu entfernen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Aktivkohle in einem
Anteil von 5-20 Gew./Gew-% in bezug auf das S-(1,2-
Dicarboxyethyl)glutathion-Kupfersalz verwendet wird, und
die Konzentration der wäßrigen Lösung aus Essigsäure,
Ameisensäure oder Propionsäure 1-50 Vol./Vol.-% beträgt.
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