DE69635801T2

DE69635801T2 - Prostataspezifisches membranes antigen und seine anwendungen

Info

Publication number: DE69635801T2
Application number: DE69635801T
Authority: DE
Inventors: S. Ron Staten Island ISRAELI; D. Warren New York HESTON; R. William New York FAIR
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1996-02-23
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2016-02-24
Also published as: CA2212846A1; AU717937B2; EP0812356A4; EP1754788A2; EP0812356A1; MX9706311A; ATE317435T1; AU5172596A; JP2005036008A; US7037647B1; WO1996026272A1; JP2001526522A; JP2005185276A; DE69635801D1; JP2005052145A; EP0812356B1; EP1754788A3

Description

Die hierin offenbarte Erfindung wurde zum Teil mit staatlicher Unterstützung angefertigt unter der NIH-Stipendien-Nr. DK47650 und CA58192, CA-39203, CA-29502, CA-08748-29 des US-Gesundheitsministeriums. Dementsprechend hat die US-Regierung bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Im Verlauf dieser Anmeldung wird sich auf verschiedene Referenzen in Klammern bezogen.
Vollständige bibliographische Zitierung dieser Referenzen können am Ende jeder Reihe an Beispielen gefunden werden im Abschnitt der experimentellen Ausführungen.
Prostatakrebs zählt zu den bedeutendsten medizinischen Problemen in den Vereinigten Staaten, da die Krankheit nunmehr der geläufigste bösartige Tumor ist, der in amerikanischen Männern diagnostiziert wird. 1992 waren es über 132,000 neue Fälle von Prostatakrebs die detektiert wurden mit mehr als 36,000 Todesfällen, die der Krankheit zugeschrieben werden konnten, was eine Zunahme von 17,3% im Laufe von vier Jahren repräsentiert (2). Überlebensraten von fünf Jahren für Patienten mit Prostatakrebs erstrecken sich von 88%, für solche mit lokalisierter Krankheit, bis zu 29% für solche mit metastatischer Krankheit. Die rapide Zunahme in der Anzahl der Fälle scheint zum Teil aus einer Zunahme an Krankheitsbewusstsein zu stammen, sowie auch die weit verbreitete Verwendung klinischer Marker, wie die sekretierten Proteine, Prostataspezifisches Antigen (PSA) und Prostataspezifische saure Phosphatase (PAP) (37).
Die Prostatadrüse ist eine Stelle von bedeutender Pathologie, beeinflusst von Gegebenheiten, wie gutartiges Wachstum (BPH), Neoplasie (Prostatakarzinom) und Infektion (Prostatitis). Prostatakrebs stellt die zweitführende Todesursache von Krebs im Mann dar (1). Dennoch ist das Prostatakarzinom der maßgebliche Ort für Krebsentwicklung in Männern. Der Unterschied zwischen diesen beiden Tatsachen betrifft Prostatakrebs, der mit zunehmender Häufigkeit vorkommt, wenn Männer altern, speziell im Alter nach 60, zu einer Zeit, wenn der Tod aufgrund anderer Faktoren oft einschreitet. Ebenfalls ist das Spektrum der biologischen Aggressivität des Prostatakarzinoms beträchtlich, so dass in manchen Männern der Tumor im Anschluss an die Detektion ein latent histologischer Tumor bleibt und nicht klinisch bedeutsam wird, wobei er in Anderen schnell fortschreitet, metastasiert, und den Mann in einem vergleichsweise kurzen Zeitraum von zwei bis fünf Jahren tötet (1, 3).
In Prostatakarzinomzellen kommen zwei spezifische Proteine vor, die in sehr hohen Konzentrationen hergestellt werden, die Prostataspezifische saure Phosphatase (PAP) und das Prostataspezifisches Antigen (PSA) (4, 5, 6). Diese Proteine sind gekennzeichnet worden und sind verwendet worden, um die Reaktion auf Therapie zu beobachten. Mit der Entstehung von Krebs wird die normale Architektur der Drüse verändert, einschließlich Verlust der normalen Duktusstruktur zum Entfernen von Absonderungen und folglich die Absonderungen ins Serum gelangen. Tatsächlich wird die Messung von Serum-PSA vorgeschlagen, als ein mögliches Screening-Verfahren für Prostatakrebs. Tatsächlich nimmt die relative Menge an PSA und/oder PAP im Karzinom ab im Vergleich zu normalem oder gutartigem Gewebe.
PAP war einer der ersten Serummarker zum Detektieren von Metastasierung (4). PAP hydrolisiert Tyrosinphosphat und hat eine ausgedehnte Substratspezifität. Tyrosinphosphorylierung ist bei onkogener Transformation oft erhöht. Es wurde angenommen, dass während der neoplastischen Transformation weniger Phosphataseaktivität vorliegt, die zur Verfügung steht um Proteine zu inaktivieren, die durch Phosphorylierung der Tyrosinreste aktiviert sind. In manchen Fällen hat das Einfügen von Phosphatasen, die Tyrosinphosphataseaktivität besitzen, den malignen Phenotyp rückgängig gemacht.
PSA ist eine Protease und es ist nicht leicht zu verstehen, wie der Verlust ihrer Aktivität mit Krebsentstehung korreliert (5, 6). Die proteolytische Aktivität von PSA wird durch Zink inhibiert. Zinkkonzentrationen sind in normaler Prostata hoch und im Prostatakarzinom reduziert. Möglicherweise ermöglicht der Verlust von Zink eine erhöhte proteolytische Aktivität von PSA. Da Proteasen in Metastasen involviert sind und manche Proteasen mitotische Aktivität stimulieren, könnte bezüglich der möglichen erhöhten Aktivität von PSA angenommen werden, eine Rolle in den Tumormetastasen und der Verbreitung zu spielen (7).
Sowohl PSA als auch PAP kommen in Prostataausscheidungen vor. Beide scheinen für ihre Herstellung von der Anwesenheit von Androgenen abhängig zu sein, und sind im Wesentlichen reduziert im Anschluss an Androgenentzug.
Das Prostataspezifische Membranantigen (PSM), das in der Prostatamembran lokalisiert zu sein scheint, ist identifiziert worden. Dieses Antigen wurde identifiziert als Ergebnis des Herstellens monoklonaler Antikörper gegen eine Prostatakrebszelle, LNCaP (8).
Dr. Horoszewicz etablierte eine Zelllinie, bezeichnet mit LNCaP, aus dem Lymphknoten eines Hormon-unempfindlichen, stark vorbehandelten Patienten (9). Für diese Linie wurde herausgefunden, dass sie einen aneuploiden humanen männlichen Karyotyp aufweist. Sie erhielt die Funktionalität der Prostatadifferenzierung aufrecht insofern, als dass sie sowohl PSA als auch PAP produzierte. Sie besaß einen Androgenrezeptor mit hoher Affinität und Spezifität. Es wurden Mäuse mit LNCaP-Zellen immunisiert, und Hybridome wurden aus sensibilisierten Tieren gewonnen. Ein monoklonaler Antikörper wurde gewonnen und wurde mit 7E11-C5 bezeichnet (8). Die Antikörperfärbung war übereinstimmend mit einer Membranlokalisierung, und isolierte Fraktionen von LNCaP-Zellmembranen zeigten eine stark positive Reaktion im Immunoblotting und bei ELISA-Techniken. Weder inhibierte noch verstärkte dieser Antikörper das Wachstum von LNCaP-Zellen in vitro oder in vivo. Der Antikörper gegen dieses Antigen war bemerkenswert spezifisch für Prostata-Epithelzellen, da keine Reaktivität in irgendeinem anderen Teil beobachtete wurde. Immunhistochemische Anfärbung krebsartiger Epithelzellen war intensiver als die von normalen oder gutartigen Epithelzellen.
Dr. Horoszewicz beschrieb ebenfalls die Detektion von immunreaktivem Material unter Verwendung von 7E11-C5 in Serum von Prostatakrebspatienten (8). Die Immunreaktivität war in annähernd 60% der Patienten mit Stadium D-2 der Krankheit detektierbar und in einem leicht geringeren prozentualen Anteil in Patienten in frühem Stadium der Krankheit, allerdings sind die Zahlen in Patienten in der letzteren Gruppe gering. Patienten mit gutartiger Prostatahyperplasie (BPH) waren negativ. Patienten ohne offensichtliche Krankheit waren negativ, jedoch zeigten 50–60% der Patienten in Remission noch immer mit aktiver beständiger Krankheit oder mit Fortschreiten positive Serumreaktivität. Patienten mit Nicht-Prostatatumoren zeigten keine Immunreaktivität mit 7E11-C5.
Der monoklonale Antikörper 7E11-C5 befindet sich zurzeit in klinischen Studien. Die Aldehydgruppen des Antikörpers wurden oxidiert und der Linker-Chelator Glykol-Tyrosyl-(n, ε-Diethylentriaminpentaessigsäure)-Lysin (GYK-DTPA) wurde an die reaktiven Aldehyde der schweren Kette gekoppelt (10). Der resultierende Antikörper wurde mit CYT-356 bezeichnet. Immunhistochemische Färbemuster waren ähnlich mit Ausnahme, dass der modifizierte Antikörper CYT-356 den Skelettmuskel anfärbte. Der Vergleich von CYT-356 mit dem monoklonalen Antikörper 7E11-C5 legte nahe, dass beide Bindung mit Typ 2 Muskelfasern eingingen. Als Grund für die den Widerspruch mit der früheren Studie, die Skelettmuskel als negativ beschrieben hat, wurde vorgeschlagen, dass sie aufgrund von Unterschieden in den Gewebefixierungstechniken sind. Noch immer wurde die intensivste und deutlichste Reaktion mit Prostata-Epithelzellen, besonders krebsartigen Zellen, beobachtet. Reaktivität mit Maus-Skelettmuskel wurde mit Immunhistochemie, aber nicht in Imaging-Studien, detektiert. Der Indium¹¹¹-markierte Antikörper lokalisierte an LNCaP-Tumoren, die in nackten Mäusen gewachsen waren, mit einer Aufnahme von ungefähr 30% der an vier Tagen injizierten Dosis pro Gramm Tumor. In-vivo wurde keine selektive Retention des Antikörpers in Antigen-negativen Tumoren wie PC-3 und DU-145 oder im Skelettmuskel beobachtet. Über das PSM-Antigen war sehr wenig bekannt. Ein Versuch der Aufreinigung und Kennzeichnung ist auf Meetings von Dr. George Wright und Kollegen beschrieben worden (11, 12).
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A bis 1D: Die oberen zwei Photos zeigen für PSM-Antigen positiv gefärbte LNCaP-Zytospins. Unten links in DU-145 und unten rechts ist PC-3-Zytospin, beide negative bezüglich PSM-Antigenexpression.
2: Vergleich zwischen PSM- und PSM'-cDNA. Dargestellt ist die Sequenz des 5'-Endes der PSM-cDNA (5). Der unterstrichene Bereich bezeichnet Nukleotide, die in der PSM-cDNA-Sequenz vorhanden sind, aber in der PSM'-cDNA fehlen. Der umschlossene Bereich stellt die mögliche Transmembrandomäne des PSM-Antigens dar. * Sternchen bezeichnet die mögliche Translationsinitiationsstelle für PSM'.
3: Graphische Darstellung der PSM- und PSM'-cDNA-Sequenzen, sowie der antisense-PSM-RNA-Sonde (b). PSM-cDNA-Sequenz mit vollständiger kodierender Region (5). (a) PSM'-cDNA-Sequenz aus dieser Untersuchung. (c) Gekreuzt-schraffierte und offene Kästchen bezeichnen die Identität der Sequenzen bei PSM und PSM'. Die schraffierte Box zeigt die Sequenz an, die bei PSM' fehlt. Bereiche der cDNA-Sequenz, die komplementär zur antisense-Sonde sind, sind durch gestrichelte Linien zwischen den Sequenzen angegeben.
4: RNase-Schutzassay mit PSM-spezifischer Sonde in primären Prostatageweben. Gesamtzelluläre RNA wurde aus humanen Prostataproben isoliert: Normale Prostata, BPH, und CaP. Die gespleißten Varianten, PSM und PSM', sind mit Pfeilen rechts angezeigt. Die linke Spur ist eine DNA-Leiter. Proben von verschiedenen Patienten sind klassifiziert als:
Spuren 3–6, CaP, Prostatakarzinom; BPH, gutartige Prostatahypertrophie, Spuren 7–9; normal, normales Prostatagewebe, Spuren 10–12. Autoradiographie wurde für eine längere Zeit exponiert um Spuren 5 und 9 zu lesen.
5: Tumorindex, eine Quantifizierung der Expression von PSM und PSM'. Expression von PSM und PSM' wurde über Densitometrie quantifiziert, und als ein Verhältnis von PSM/PSM' auf der Y-Achse dargestellt. Jeweils drei Proben wurden für primäre CaP, BPH und normale Prostatagewebe quantifiziert. Zwei Proben wurden für LNCaP quantifiziert. Normal, normales Prostatagewebe.
6: Kennzeichnung von membrangebundenem PSM und PSM' im Cytosol.
7A–7D: Sequenz des genomischen Bereichs stromaufwärts der 5'-Transkriptionsstartstelle von PSM.
8: Genomische Organisation des PSM-Gens.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt bereit ein isoliertes Säugetier-Nukleinsäuremolekül, das ein alternativ gespleißtes Prostataspezifisches Membran (PSM')-antigen kodiert.
Die Erfindung stellt bereit ein Verfahren zum Detektieren hämatogener mikrometastatischer Tumorzellen eines Subjekts, und Bestimmen des Fortschreitens von Prostatakrebs in einem Subjekt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Im Laufe der Anmeldung sind Bezugnahmen auf spezifische Nukleotide, Bezugnahmen auf Nukleotide, die auf dem kodierenden Strang der Nukleinsäure vorhanden sind. Die folgenden üblichen Abkürzungen werden im Verlaufe der Beschreibung verwendet, um spezifische Nukleotide anzuzeigen:

C: = Cytosin
A: = Adenosin
T: = Thymidin
G: = Guanosin

Ein "Gen" bezeichnet ein Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz all die Information enthält, die nötig ist für die normale regulierte Herstellung eines speziellen Proteins, einschließlich die strukturelle kodierende Sequenz, Promotoren und Verstärker.
Die Erfindung stellt bereit eine isolierte Säugetier-Nukleinsäure, die ein alternativ gespleißtes Prostataspezifisches Membran (PSM')-antigen kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt bereit ein isoliertes Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 1 beansprucht. Das isolierte Nukleinsäuremolekül kann ein DNA-Molekül sein, alternativ kann es ein RNA- oder ein cDNA-Molekül sein.
In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist die isolierte Nukleinsequenz cDNA aus Mensch, wie in 7A–7D dargestellt. Diese humane Sequenz wurde bei GenBank eingereicht (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico) mit der Zugangsnummer M99487 und der Beschreibung als PSM, Homo sapiens, 2653 Basenpaare.
Hoch stringente Hybridisierungsbedingungen werden gewählt, bei ungefähr 5°C unterhalb des thermischen Schmelzpunkts (Tm) für die jeweilige Sequenz, bei einer definierten Ionenstärke und definiertem pH. Der Tm ist diejenige Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Probe hybridisieren. Typischerweise sind stringente Bedingungen diejenigen, bei denen die Salzkonzentration mindestens ungefähr 0.02 molar bei pH 7 beträgt, und die Temperatur mindestens ungefähr 60°C beträgt. Da weitere Faktoren signifikant die Stringenz der Hybridisierung beeinflussen können einschließlich, unter anderem, Basenzusammensetzung und Größe der komplementären Stränge, die Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln, d. h. Salz- oder Formamidkonzentration, und das Ausmaß von Basenfehlpaarung, ist die Kombination der Parameter wichtiger als das absolute Maß jedes einzelnen. Zum Beispiel kann hohe Stringenz erreicht werden durch beispielsweise Über-Nacht-Hybridisierung bei ungefähr 68°C in einer 6 × SSC-Lösung, Waschen bei Raumtemperatur mit 6 × SSC-Lösung, gefolgt von Waschen bei ungefähr 68°C in einer 6 × SSC in einer 0.6 × SSX-Lösung.
Hybridisierung mit mäßiger Stringenz kann erreicht werden beispielsweise über: 1) Filter-Prähybridisieren und Hybridisieren mit einer Lösung aus 3 × Natriumchlorid, Natriumcitrat (SSC), 50% Formamid, 0.1M Trispuffer bei Ph 7.5, 5 × Denhardt's Lösung; 2.) Prähybridisierung für 4 Stunden bei 37°C; 3) Hybridisierung für 15 Stunden bei 37°C mit einer Menge an markierter Sonde, die insgesamt 3,000,000 cpm entspricht; 4) Waschen in 2 × SSC und 0.1% SDS-Lösung; 5) 4 × Waschen für jeweils 1 Minute bei Raumtemperatur bei 4 × bei 60°C für jeweils 30 Minuten; und 6) Trocknen und gegen Film exponieren.
Die hierin beschriebenen und beanspruchten DNA-Moleküle sind nützlich bezüglich der Information die sie liefern, betreffend die Aminosäuresequenz des Polypeptids, und als Produkte für die Synthese des Polypeptids im großen Maßstab durch eine Vielzahl von rekombinanten Techniken. Das Molekül ist nützlich zum Erzeugen neuer Klonierungs- und Expressionsvektoren, transfomierter und transfizierter prokaryotischer und eukaryotischer Wirtszellen, und neuer und nützlicher Verfahren für Wachstum solcher Wirtszellen in Kultur, die fähig zur Expression des Polypeptids und verwandter Produkte sind.
Darüber hinaus sind die isolierten Säugetier-Nukleinsäuremoleküle, die ein Säugetier-Prostataspezifisches Membranantigen sowie das alternativ gespleißte PSM' kodieren, nützlich für die Entwicklung von Sonden, um die Tumorgenese von Prostatakrebs zu untersuchen.
Die Erfindung stellt ebenfalls bereit ein isoliertes Nukleinsäuremoleküle von mindestens 15 Nukleotiden, das in der Lage ist, spezifisch gegen eine Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls wie in Anspruch 5 definiert, zu hybridisieren.
Dieses hergestellte Nukleinsäuremolekül kann entweder DNA oder RNA sein. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "spezifisch hybridisierend" die Fähigkeit eines Nukeinsäuremoleküls, eine Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu seiner eigenen ist, zu erkennen, und über Wasserstoffbrückenbindung zwischen komplementären Basenpaaren doppelhelikale Abschnitte zu bilden.
Dieses Nukleinsäuremolekül von mindestens 15 Nukleotiden, das in der Lage ist, spezifisch gegen eine Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls, welches das Prostataspezifische Membranantigen kodiert, zu hybridisieren, kann als eine Sonde verwendet werden. Nukleinsäuresonden-Technologie ist dem Fachmann gut bekannt, der leicht erkennt, dass solche Sonden stark in der Länge variieren können, und mit einer detektierbaren Markierung wie einem Radioisotop oder Fluoreszenzfarbstoff markiert werden können, um die Detektion der Sonde zu vereinfachen. DNA-Sondenmoleküle können hergestellt werden durch Insertion eines DNA-Moleküls, welches das PSM-Antigen kodiert, in geeignete Vektoren wie Plasmide oder Bakteriophagen, gefolgt von Transformieren in geeignete bakterielle Wirtszellen, Replikation in den transformierten bakteriellen Wirtszellen, und Ernten der DNA-Sonden unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Verfahren. Alternativ können Sonden chemisch über DNA-Synthesizer hergestellt werden.
RNA-Sonden können erzeugt werden durch Insertieren des PSM-Antigenmoleküls stromabwärts gelegen eines Bakteriophagen-Promoters wie T3, T7, oder SP6. Große Mengen an RNA-Sonde können hergestellt werden durch Inkubieren der markierten Nukleotide mit dem linearisierten PSM-Antigenfragment, sofern es einen stromaufwärts gelegenen Promoter enthält, in Anwesenheit der geeigneten RNA-Polymerase.
Die aktuelle Erfindung stellt ferner bereit ein Verfahren zum Detektieren der Expression von PSM', wie in Anspruch 8 beansprucht.
Gesamt-mRNA der Zelle kann über viele Prozeduren die einem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind, isoliert werden. Die Hybridisierungsbedingungen des markierten Nukleinsäuremoleküls können durch routinemäßiges, im Stand der Technik gut bekanntes Experimentieren bestimmt werden. Das Vorhandensein von gegen die Sonde hybridisierter mRNA kann über Gelelektrophorese oder andere im Stand der Technik bekannte Verfahren bestimmt werden.
Die Markierung kann radioaktiv sein. Zum Beispiel können ein oder mehrere radioaktive Nukleotide in die Nukleinsäure, während sie hergestellt wird, eingebaut werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Nukleinsäuren über Präzipitation aus lysierten Zellen extrahiert, und die mRNA wird aus dem Extrakt isoliert unter Verwendung einer Oligo-dT-Säule, die die Poly-A-Schwänze der mRNA-Moleküle bindet (13). Die mRNA wird dann gegen eine radioaktiv markierte Sonde auf einer Nitrozellulosemembran exponiert, und die Sonde hybridisiert gegen-, und markiert dadurch die komplementären mRNA-Sequenzen. Die Bindung kann über Lumineszenz Autoradiographie oder Scintillationszählung detektiert werden. Dennoch sind dem Fachmann andere Verfahren zum Durchführen dieser Schritte gut bekannt, und die obige Diskussion stellt lediglich ein Beispiel dar.
Die in-situ-Hybridisierung unter Verwendung eines markierten Nukleinsäuremoleküls ist im Stand der Technik gut bekannt. Im Wesentlichen werden Gewebeschnitte mit dem markierten Nukleinsäuremolekül inkubiert, um die Hybridisierung zu ermöglichen. Das Molekül trägt einen Marker zur Detektion, weil es "markiert" ist, die Menge des Hybrids wird basierend auf der Detektion der Menge des Markers bestimmt, und damit die Expression des PSM-Antigens.
Die Erfindung stellt weiterhin bereit ein isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, operativ gebunden an einen Promoter für RNA-Transkription, wie in Anspruch 9 beansprucht.
Die Erfindung stellt weiterhin bereit einen Vektor, der ein isoliertes Nukleinsäuremolekül umfasst, wie in Anspruch 10 beansprucht.
Verschiedene Vektoren, einschließlich Plasmidvektoren, Cosmidvektoren, Bakteriophage-Vektoren und andere Viren sind dem durchschnittlich sachkundigen Fachmann gut bekannt. Die Erfindung stellt weiterhin bereit einen Vektor, der das isolierte Nukleinsäuremolekül, das das PSM- oder PSM'-Antigen kodiert, umfasst.
Als Beispiel um diese Vektoren zu erhalten, können sowohl Insert- als auch Vektor-DNA einem Restriktionsenzym ausgesetzt werden, um komplementäre Enden auf beiden Molekülen zu schaffen, die miteinander basenpaaren, und dann durch DNA-Ligase zusammenligiert werden. Alternativ können Linker an die Insert-DNA ligiert werden, die einer Restriktionsstelle in der Vektor-DNA entsprechen, welche dann mit dem Restriktionsenzym, das an dieser Stelle spaltet, verdaut wird. Andere Mittel sind ebenfalls möglich und einem durchschnittlichen Fachmann bekannt.
Die Erfindung stellt weiterhin bereit, ein Wirtsvektorsystem zur Herstellung eines Polypeptids, wie in Anspruch 11 beansprucht.
Diese Vektoren können in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden, um ein Wirtszellvektorsystem zur Herstellung eines Polypeptids mit der biologischen Aktivität des PSM'-Antigens zu bilden.
Regulatorische Elemente, die für die Expression benötigt werden, enthalten Promotorsequenzen um die RNA-Polymerase zu binden, und Transkriptionsinitiationssequenzen zur Ribosomenbindung. Zum Beispiel enthält ein bakterieller Expressionsvektor einen Promotor wie den lac-Promotor, und zur Transkriptionsinitiation die Shine-Dalgarno-Sequenz und das Startkodon AUG (14). In ähnlicher Weise enthält ein eukaryotischer Expressionsvektor einen heterologen oder homologen Promotor für die RNA-Polymerase II, ein stromabwärts gelegenes Polyadenylierungssignal, das Startkodon AUG, und ein Terminationskodon zur Ablösung des Ribosoms. Solche Vektoren können kommerziell bezogen werden oder zusammengesetzt aus den beschriebenen Sequenzen durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren, zum Beispiel die oben beschriebenen Verfahren zum generellen Konstruieren von Vektoren. Expressionsvektoren sind nützlich um Zellen herzustellen, die das PSM-Antigen exprimieren.
Die Erfindung stellt weiter bereit ein hierin bereits beschriebenes isoliertes DNA- oder cDNA-Molekül, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen (wie E. coli und Säugetierzellen.
Die Erfindung stellt weiter bereit ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, wie in Anspruch 13 beansprucht.
Zahlreiche Säugetierzellen können als Wirte verwendet werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf, die Maus-Fibroblastzelle NIH3T3, CHO-Zellen, HeLa-Zellen, Ltk^–-Zellen, Cos-Zellen, etc. Expressionsplasmide, wie das supra beschriebene, können verwendet werden, um Säugetierzellen zu transfizieren durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren, wie Kalziumphosphatpräzipitation, Elektroporation, oder die DNA, die das Säugetier-PSM-Antigen kodiert, kann andererseits in Säugetierzellen eingebracht werden, z. B., durch Mikroinjektion, um Säugetierzellen zu erhalten, die DNA, z. B., cDNA oder ein Plasmid, enthalten, die/das ein Säugetier PSM-Antigen kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt bereit ein Verfahren zum Bestimmen des Fortschreitens von Prostatakrebs in einem Subjekt, wie in Anspruch 17 beansprucht. Vorzugsweise umfasst das Verfahren weiter das Durchführen von in-situ-Hybridisierung.
Beispiele geeigneter Promotoren schließen einen viralen Promotor ein. Virale Promotoren schließen ein: Adenovirus-Promotor, einen Simianvirus 40 (SV40)-Promotor, einen Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, einen mouse mammary tumor virus (MMTV)-Promotor, einen Malony murine leukemia virus-Promotor, einen murine sarcoma virus-Promotor, und einen Rous sarcoma virus-Promotor.
Weiterhin ist ein anderer geeigneter Promotor ein Hitzeschock-Promotor. Zusätzlich ist ein Bakteriophage-Promotor ein geeigneter Promotor. Beispiele von geeigneten Bakteriophagen- Promotoren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, einen T7-Promotor, einen T3-Promotor, einen SP6-Promotor, einen Lambda-Promotor, einen Baculovirus-Promotor.
Ebenfalls als ein Promotor geeignet ist ein Tierzell-Promotor wie ein Interferonpromotor, ein Metallothioneinpromotor, ein Immunglobulin-Promotor. Ein Pilzpromotor ist ebenfalls ein geeigneter Promotor. Beispiele von Pilzpromotoren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, einen ADCl-Promotor, einen ARG-Promotor, einen ADH-Promotor, einen CYCI-Promotor, einen CUP-Promotor, einen ENOI-Promotor, einen GAL-Promotor, einen PHO-Promotor, einen PGK-Promotor, einen GAPDH-Promotor, einen "mating type factor"-Promotor. Ferner sind Pflanzenzell-Promotoren und Insektenzell-Promotoren ebenfalls geeignet für die hierin beschriebenen Verfahren.
Die Erfindung stellt weiter bereit ein isoliertes alternativ gespleißtes Prostataspezifisches Membranantigen (PSM'), wie in Anspruch 14 beansprucht.
Die Erfindung stellt weiter bereit ein Verfahren zum Detektieren hämatogener mikrometastatischer Tumorzellen, wie in Anspruch 15 beansprucht. Vorzugsweise stammen die Proben von einem Subjekt, dem die Hormone, epidermaler Wachstumsfaktor, Fibroblast-Wachstumsfaktoren b oder Tumornekrosefaktor, verabreicht wurden.
Die mikrometastatische Tumorzelle kann ein Prostatakarzinom sein, und die DNA-Primer können vom Prostataspezifischen Antigen stammen.
BEISPIEL 1:
ALTERNATIV GESPLEIßTE VARIANTEN DER RNA DES PROSTATASPEZIFISCHEN MEMBRANANTIGENS: VERHÄLTNIS DER EXPRESSION ALS EINE MÖGLICHE MESSUNG DES FORTSCHREITENS
MATERIALIEN UND METHODEN
Zelllinien.
Die Prostatakarzinomzelllinien LNCaP und PC-3 wurden in RPMI, bzw. MEM, ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum, bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert.
Primärgewebe.
Primäre Prostatagewebe wurden über MSKCC's in-house Tumorbeschaffungsservice bezogen. Grobe Proben wurden vom MSKCC's Pathologieservice pathologisch eingestuft.
RNA-Isolierung.
Gesamt-RNA wurde über ein modifiziertes Guanidinium Thiocyanat/Phenol/Chloroformverfahren unter Verwendung eines RNAzol B-Kits (Tel-Test, Friendswood, TX) isoliert. RNA wurde in Diethylpyrocarbonat-behandeltem Wasser bei –80°C aufbewahrt. RNA wurde unter Verwendung spektrophometrischer Absorption bei 260nm quantifiziert.
cDNA-Synthese.
Zwei unterschiedliche Batches normaler Prostata-mRNAs, die von traumatoten Männern erhalten wurden (Clontech, Palo Alto, CA), wurden bei 70°C für 10 min. denaturiert, dann in cDNA revers transkribiert unter Verwendung von Random-Hexameren und reverser Transkriptase, Superscript II (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), bei 50°C für 30 min., gefolgt von einer Inkubation für 5 min. bei 94°C.
Polymerase-Kettenreaktion.
Oligonukleotid-Primer (5'-CTCAAAAGGGGCCGGATTTCC-3' und 5'-AGGCTACTTCACTCAAAG-3'), spezifisch für die 5'- und 3'-Enden der PSM-cDNA wurden so gewählt, dass sie die cDNA-Sequenz überspannen. Die Reaktion wurde in einem 50 μl-Volumen durchgeführt mit einer Endkonzentration der folgenden Reagenzien:
16.6 mM NH₄SO₄, 67 mM Tris-HCl pH 8.8, acetyliertes BSA 0.2 mg/ml, 2mM MgCl₂, 250μM dNTPs, 10 mM β-Mercaptoethanol, und 1 U an rTth-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Insgesamt wurden 25 Zyklen vollständig durchlaufen mit folgendem Profil:
Zyklus 1, 94°C 4 min.; Zyklus 2 bis 25, 94°C 1 min, 60°C 1 min, 72°C 1 min. Die letzte Reaktion wurde für 10 min bei 72°C ausgedehnt. Aliquots der Reaktion wurden auf 1 %-igen Agarosegelen in 1X Tris-Acetat-EDTA-Puffer elektrophoretisiert.
Klonieren der PCR-Produkte.
PCR-Produkte wurden über das TA-Klonierungsverfahren, unter Verwendung eines Kits von Invitrogen (San Diego, CA), in den pCRII-Vektor kloniert. Ligationsgemisch wurden in kompetente Escherichia coli Inv5α transformiert.
Sequenzierung.
Sequenzierung wurde über das Didesoxy-Verfahren unter Verwendung eines Sequenase-Kits von US-Biochemical (Cleveland, OH) ausgeführt. Sequenzierungsprodukte wurden auf einem 5%-igen Polyacrylamid/7M Harnstoff-Gel bei 52°C elektrophoretisiert.
RNase-Schutzassays.
Der Volllängen-PSM-cDNA-Klon wurde mit NgcM 1 und Nhal verdaut. Ein 350 Bp-Fragment wurde isoliert und in einen pSPORTl-Vektor (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) subkloniert. Das resultierende Plasmid, pSP350, wurde linearisiert, und das Insert wurde mit der SP6-RNA-Polymerase transkribiert, um eine antisense-Sonde von 395 Nukleotiden Länge zu erhalten, von denen 355 Nukleotide und/oder 210 Nukleotide vor RNAse-Verdauung durch PSM-, bzw. PSM'-RNA geschützt sein sollten (1). Gesamtzelluläre RNA (20 μg) aus verschiedenen Geweben wurden gegen die vorstehend erwähnte antisense-RNA-Sonde hybridisiert. Assays wurden wie beschrieben (7) durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde tRNA verwendet. RPAs wurden für LNCaP und PC-3 wiederholt.
ERGEBNISSE
RT-PCR von mRNA aus normalem Prostatagewebe.
Zwei unabhängige RT-PCR von mRNA aus normalen Prostatas wurden durchgeführt, wie in Materialen und Methoden beschrieben. Anschließendes Klonieren und Sequenzieren der PCR-Produkte brachte das Vorhandensein einer alternativ gespleißten Variante, PSM', zum Vorschein. PSM' hat eine kürzere cDNA (2387 Nukleotide) als PSM (2653 Nukleotide). Die Ergebnisse der Sequenzanalyse sind in 2 gezeigt. Die cDNAs sind identisch bis auf einen Bereich von 266 Nukleotiden, nahe dem 5'-Ende der PSM-cDNA (Nukleotid 114 bis 380), welcher in der PSM'-cDNA fehlt. Zwei unabhängige Wiederholungen der RT-PCR verschiedener mRNA-Proben führten zu identischen Ergebnissen.
RNase-Schutzassays.
Es wurde eine RNA-Sonde verwendet, die komplementär zur PSM-RNA ist, und die 3'-Spleißstelle der PSM'-RNA überspannt, um die relative Expression von PSM- und PSM'-mRNAs zu messen (3). Mit dieser Sonde wurde sowohl PSM- als auch PSM'-RNAs in LNCaP-Zellen detektiert, wobei die vorherrschende Form PSM war. Weder PSM- noch PSM'-RNA wurde in PC-3-Zellen detektiert, in Übereinstimmung mit vorherigen Northern- und Western-Blot-Daten (5, 6). 4 zeigte das Vorhandensein beider Spleißvarianten in humanen primären Prostatageweben. Im primären Prostatatumor ist PSM die dominante Form. Im Gegensatz dazu exprimierte die normale Prostata mehr PSM' als PSM. BPH-Proben zeigten ungefähr gleiche Expression beider Varianten.
Tumorindex.
Die relative Expression von PSM und PSM' (4) wurde über Densitometrie quantifiziert, und als ein Tumorindex ausgedrückt (5). LNCaP hat einen Index im Bereich von 9–11; CaP von 3–6; BPH von 0.75–1.6; normale Prostata hat Werte von 0.075–0.45.
DISKUSSION
Sequenzierungsdaten der PCR-Produkte, die von humaner normaler Prostata-mRNA stammten, mit PSM-Olignonukleotidprimern des 5'- und 3'-Endes, enthüllten eine zweite Spleißvariante, PSM', zusätzlich zu der vorher beschriebenen PSM-cDNA.
PSM ist ein 750 AS-Protein mit einem errechneten Molekulargewicht von 84,330. Für PSM wurde angenommen, dass es ein Typ II integrales Membranprotein ist (5). Ein klassisches Typ II Membranprotein ist der Transferrinrezeptor, und tatsächlich besitzt PSM einen Bereich, der leichte Homologie mit dem Transferrinrezeptor aufweist (5). Analyse der PSM-Aminosäuresequenz durch eines der Verfahren von Rao und Argos (7) oder Eisenburg et. al. (8) sagten nachhaltig eine Transmembranhelix in dem Bereich von AS#20 bis #43 voraus. Beide Programme fanden weitere Bereiche, die membranassoziiert sein könnten, die aber nicht als wahrscheinliche Kandidaten, Transmembranbereiche zu sein, angesehen wurden.
Auf der anderen Seite ist das PSM'-Antigen ein 693 AS-Protein, wie aus seiner mRNA-Sequenz abgeleitet wurde, mit einem Molekulargewicht von 78,000. Dem PSM'-Antigen fehlen die ersten 57 Aminosäuren, die im PSM-Antigen vorhanden sind (2). Es ist wahrscheinlich, dass das PSM'-Antigen cytosolisch ist.
Die Funktion von PSM und PSM' sind möglicherweise verschieden. Die zelluläre Lokalisierung des PSM-Antigens legt nahe, dass es entweder mit extra-, oder intrazellulärem(n) Ligand(en) oder beiden wechselwirken kann; während die von PSM' impliziert, dass PSM' nur mit cytosolischem(n) Ligand(en) reagieren kann. Weiterhin hat das PSM-Antigen 3 potentielle Phosphorylierungsstellen auf seiner cytosolischen Domäne. Diese Stellen fehlen im PSM'-Antigen. Auf der anderen Seite hat das PSM'-Antigen 25 potentielle Phosphorylierungsstellen, 10 N-Myristoylierungsstellen und 9 N-Glykosylierungsstellen. Für das PSM-Antigen würden all diese potentiellen Stellen auf der extrazellulären Oberfläche liegen. Die Modifizierungen dieser Stellen für die homologen Proteine wären unterschiedlich, abhängig von ihren zellulären Lokalisierungen. Folglich würde(n) die Funktion(en) jeder dieser Formen abhängig davon sein, wie sie modifiziert sind.
Die relativen Unterschiede der Expression von PSM und PSM' durch RNase Schutzassays wurde analysiert. Ergebnisse der Expression von PSM und PSM' in primären Prostatageweben legten nachhaltig eine Beziehung zwischen der relativen Expression dieser Varianten und dem Status der Zelle nahe: entweder normal oder krebsartig. Während hier darauf hingewiesen wird, dass die Probengröße der Studie klein ist (4 und 5), ist die Konsistenz des Trends offensichtlich. Die verwendeten Proben waren grobe Proben von Patienten. Die Ergebnisse hätten sogar noch dramatischer sein können, wenn Proben verwendet worden wären, die rein im Gehalt an CaP, BPH oder normal gewesen wären. Nichtsdestotrotz wird in diesen Proben deutlich, dass bei der Änderung von normal zu CaP eine relative Zunahme von PSM- über PSM'-mRNA stattfindet. Der Tumorindex (5) kann beim Messen des pathologischen Status' einer bestimmten Probe nützlich sein. Es ist ebenfalls möglich, dass die Veränderung in der Expression von PSM über PSM' ein Grund für Tumorprogression ist. Ein differenzierteres Tumorstadium kann über PSM' wieder hergestellt werden, entweder durch Transfektion oder durch die Verwendung von Differenzierungsagenzien.
Literaturstellen von Beispiel 1

1. Murphy, G.P. Report on the American Urologic Association/American Cancer Society Scientific Seminar on the Detection and treatment of Early-Stage Prostate Cancer. CA Cancer J. Clin. 44:91-95, 1994.
2. Israeli, R.S., Miller Jr., W.H.,. Su, S.L., Powell, C.T., Fair, W.R., Samadi, D.S., Huryk, R.F., DelBlasio, A., Edwards, E.T, and Heston, W.D.W. Sensitive Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Detection of Circulating Prostatic Tumor Cells: Comparison of Prostate-specific Membrane Antigen and Prostatespecific Antigen-based Assays. Cancer Res., 54: 6325–6329, 1994.
3. Horoszewicz, J.S., Kawinaki, E., and Murphy, G.P. Monoclonal antibodies to a new antigenic marker in epithelial cells and serum of prostatic cancer patients. Anticancer Res., 7:927-936, 1987.
4. Horoszewicz, J.S., Leong, S.S., Kawinski, E., Karr, J.P., Rosenthal, H., Chu, T.M., Mirand, E.A. and Murphy, G.P. LNCaP model of human prostatic Carcinoma. Cancer Res., 43:1809-1818, 1983.
5. Israeli, R.S., Powell, C.T., Fair, W.R. and Heston, W.D.W. Molecular cloning of a complementary DNA encoding a prostate-specific membrane antigen. Cancer Res., 53:227-230, 1993.
W.D.W. Expression o6. Israeli, R.S., Powell, C.T., Corr, J.G., Fair, W.R. and Heston, f the prostate-specific membrane antigen. Cancer Res., 54:1807-1811, 1994.
7. Melton, D.A., Krieg, P.A., Rebagliati, M.R., Maniatis, T., Zinn, K. and Green, M.R. Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter. Nucleic Acids Res., 12:7035-7056, 1984.
8. Rao, M.J.K. and Argos, P. A conformational preference parameter to predict helices in integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta, 869:197-214, 1986.
9. Eisenburg, D., Schwarz, E., Komaromy, M. and Wall, R. Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophbic moment plot, J. Mol. Biol. 179:125-142, 1984.
10. Troyer, J.K. and Wright Jr.,G.L. Biochemical characterization and mapping of 7E-11 C-5.3. Epitope of the prostate specific membrane antigen (PSMA). American Aspect oAssociation for Cancer Research Special Conference: Basic and Clinical f Prostate Cancer. Abstract C-38, 1994.

BEISPIEL 2
MODULIERUNG DER EXPRESSION DES PROSTATASPEZIFISCHEN MEMBRANANTIGENS (PSM) IN VITRO DURCH ZYTOKINE UND WACHSTUMSFAKTOREN.
Die Effektivität von CYT-356-Imaging wird durch Manipulieren der Expression von PSM verstärkt. PSM-mRNA-Expression wird durch Steroide runterreguliert. Das ist übereinstimmend mit den klinischen Beobachtungen, dass PSM sowohl in anaplastischen, als auch Hormon-unempfindlichen Läsionen stark exprimiert wird. Im Gegensatz dazu ist die PSA-Expression im Anschluss an Hormonentzug verringert. Bei Hormon-unempfindlicher Krankheit wird angenommen, dass die Tumorzellen sowohl Wachstumsfaktoren, als auch Rezeptoren herstellen können, und somit eine autokrine Schleife aufbauen, die es den Zellen erlaubt, normale Wachstumsbeschränkungen zu überwinden. Viele Prostatatumor-Epithelzellen exprimieren sowohl TGFα als auch seinen Rezeptor, den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor. Die Ergebnisse zeigen an, dass die Wirkungen von TGFα und anderen ausgewählten Wachstumsfaktoren und Zytokinen auf die Expression von PSM invitro, in der humanen Prostatakarzinomzelllinie LNCaP.
2 × 10⁶ LNCaP-Zellen, die in Androgen-abgereichertem Medium wachsen, wurden für 24 bis 72 Stunden mit EGF, TGFα, TNFβ oder TNFα in Konzentrationen im Bereich von 0.1 ng/ml bis 100 ng/ml behandelt. Gesamt-RNA wurde aus den Zellen extrahiert, und PSM-mRNA-Expression wurde über Northern-Blot-Analyse und Laser-Densitometrie quantifiziert. Sowohl b-FGF als auch TGFα ergaben eine dosisabhättgige 10-fache Hochregulierung der PSM-Expression, und EGF eine 5-fache Hochregulation, verglichen mit unbehandelten LNCaP. Im Gegensatz hierzu haben andere Gruppen im selben in-vitro-Model, eine durch diese Wachstumsfaktoren induzierte merkliche Runterregulierung der PSA-Expression gezeigt. TNFα, welches cytotoxisch für LNCaP-Zellen ist, und TNFβ regulierten die PSM-Expression in Androgen-abgereicherten LNCaP-Zellen 8-fach runter.
TGFα ist mitogen für aggressive Prostatakrebszellen. Es gibt zahlreiche Formen von PSM und lediglich die Membranform kommt in Verbindung mit Tumorprogression vor. Die Fähigkeit die PSM-Expression durch Behandlung mit Zytokinen und Wachstumsfaktoren zu manipulieren, kann die Wirksamkeit von Zytogen-356-Imaging und das therapeutische Targeting von Prostatametastasen erleichtern.
BEISPIEL 3:
NEOADJUVANTE ANDROGEN-DEPRIVATIONS-THERAPIE (ADT) VOR RADIKALER PROSTATEKTOMIE FÜHRT ZU EINER SIGNIFIKANT REDUZIERTEN HÄUFIGKEIT VON VERBLEIBENDER MIKROMETASTATISCHER KRANKHEIT, WIE DURCH NESTED RT-PCT MIT PRIMERN DETEKTIERT.
Radikale Prostatektomie bei klinisch lokalisiertem Prostatakrebs wird von vielen als die "goldene Standard"-Behandlung angesehen. Fortschritte im Laufe der letzten Dekade haben dafür gesorgt, die Morbidität drastisch zu verringern. Verbesserungen dazu gedacht, den klinischen Ärzten zu helfen, Patienten präoperativ besser einzustufen sind entwickelt worden, dennoch überschreitet die Häufigkeit der Verbreitung außerhalb der Prostata immer noch 50 %, wie in zahlreichen Studien beschrieben. Eine Phase-III randomisierte prospektive klinische Studie wurde durchgeführt, die derart gestaltet war, die Wirkungen von ADT über 3 Monate zu vergleichen, in Patienten, die sich einer radikalen Prostatektomie unterziehen mit ungefähr passenden Kontrollen, die lediglich die Operation erhielten. Die vorher abgeschlossene Phase II-Studie zeigte eine positive Quote von 10% in der ADT-Gruppe (N = 69) im Vergleich zu einer 33 %igen positiven Quote (N = 72) in der "Nur Operation"-Gruppe. Patienten, die die Phase III-Studie abgeschlossen hatten, wurden analysiert um zu bestimmen, ob es irgendwelche Unterschiede zwischen den zwei Gruppen im Hinblick auf verbleibende mikrometastatische Krankheit gibt. Ein positives PCR-Ergebnis in einem post-Prostatektomie-Patienten kennzeichnet entwicklungsfähige metastatische Zellen im Kreislauf.
Nested RT-PCR wurde mit PSM-Primern bei 12 Patienten aus der ADT-Gruppe und bei 10 Patienten der Kontrollgruppe durchgeführt. Mikrometastatische Zellen wurden in 9/10 Patienten in der Kontrollgruppe detektiert (90%), im Vergleich zu lediglich 2/12 (15.7%) in der ADT-Gruppe. In der ADT-Gruppe wurde 1 von 7 Patienten mit auf das Organ begrenzter Krankheit positiv getestet, im Vergleich zu 3 von 3 Patienten in der Kontrollgruppe. In Patienten mit Krankheit außerhalb der Prostata, waren 1 von 5 positiv in der ADT-Gruppe, im Vergleich zu 6 von 7 in der Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse zeigen an, dass durch die Verwendung von neoadjuvanter ADT eine signifikant höhere Anzahl von Patienten vom Tumor befreit, und möglicherweise "geheilt" werden kann.
BEISPIEL 4:
GENOMISCHE ORGANISATION DER PSM EXON-/INTRONVERBINDUNGSSEQUENZEN
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein alternativ gespleißtes Prostata-spezifisches Membran (PSM') Antigen kodiert, wobei das Antigen eine Aminosäuresequenz hat, die identisch zu dem Teil der Aminosäuresequenz des Prostata-spezifischen Membran (PSM) Antigens ist, der mit Methionin an Position 58 beginnt und mit Alanin an Position 750 endet, und wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül nicht den Teil der Aminosäuresequenz des PSM-Antigens kodiert, der mit Methionin an Position 1 beginnt und mit Asparagin an Position 57 endet.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure ein DNA-Molekül ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei die Nukleinsäure ein cDNA-Molekül ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure ein RNA-Molekül ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül von mindestens 15 Nukleotiden, das spezifisch über eine Exon-Exon-Verbindung hybridisiert, die als Folge von alternativem Spleißen ausgebildet wird, welches diejenigen Nukleotide entfernt, die den Nukleotiden 114 bis 380 der cDNA-Sequenz entsprechen, und die das Prostata-spezifische Membran (PSM) Antigen kodieren.
DNA-Molekül nach Anspruch 5.
RNA-Molekül nach Anspruch 5.
Verfahren zum Detektieren der Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, welches das alternativ gespleißte Prostata-spezifische Membran (PSM') Antigen nach Anspruch 1 kodiert, umfassend das Erhalten von Gesamt-mRNA der Zelle, das In-Kontaktbringen der so erhaltenen mRNA mit einem markierten Nukleinsäuremolekül, das spezifisch über eine Exon-Exon-Verbindung hybridisiert, die als Folge von alternativem Spleißen ausgebildet wird, welches unter Hybridisierungsbedingungen diejenigen Nukleotide entfernt, die den Nukleotiden 114 bis 380 der cDNA-Sequenz entsprechen, und die das Prostata-spezifische Membran (PSM) Antigen kodieren, Bestimmen des Vorhandenseins von mRNA, die an das Molekül hybridisiert ist, und dadurch das Detektieren der Expression des alternativ gespleißten Prostataspezifischen Membran (PSM') Antigens in der Zelle.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, das funktionell mit einem Promotor der RNA-Transkription verbunden ist.
Vektor, der das isolierte Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 umfasst mit der Bedingung, dass alle zusätzlichen Vektorsequenzen nicht denjenigen Teil der Aminosäuresequenz des PSM-Antigens kodieren, der mit Methionin an Position 1 beginnt und mit Asparagin an Position 57 endet.
Wirtsvektorsystem für die Herstellung eines Polypeptides, wobei das Polypeptid alternativ gespleißtes Prostata-spezifisches Membran (PSM') Antigen ist und wobei das Wirtsvektorsystem den Vektor nach Anspruch 10 in einer geeigneten Wirtszelle umfasst.
Wirtsvektorsystem nach Anspruch 11, wobei die geeignete Wirtszelle eine Bakterienzelle, Insektenzelle oder Säugetierzelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides, wobei das Polypeptid alternativ gespleißtes Prostata-spezifisches Membran (PSM') Antigen ist, und welches das Wachsen des Wirtsvektorsystems nach Anspruch 12 unter geeigneten Bedingungen umfasst, und das die Herstellung des Polypeptides und die Rückgewinnung des so hergestellten Polypeptides erlaubt.
Isoliertes alternativ gespleißtes Prostata-spezifisches Membran (PSM') Antigen, wobei das Antigen eine Aminosäuresequenz hat, die identisch zu dem Teil der Aminosäuresequenz des Prostata-spezifischen Membran (PSM) Antigens ist, der mit Methionin an Position 58 beginnt und mit Alanin an Position 750 endet.
Verfahren zum Detektieren von hämatogenen mikrometastatischen Tumorzellen eines Subjekts, umfassend (A) die Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) von Blut, Knochenmark oder Lymphknotenproben des Subjekts unter Verwendung von Primern, die spezifisch für alternativ gespleißtes Prostata-spezifisches Membran (PSM') Antigen sind, wobei die Primer dazu verwendet werden, ein Nukleinsäuremolekül zu amplifizieren, das alternativ gespleißtes PSM' Antigen kodiert, das eine Aminosäuresequenz hat, die identisch zu dem Teil der Aminosäuresequenz von Prostata-spezifischem Membran (PSM) Antigen ist, der mit Methionin an Position 58 beginnt und mit Alanin an Position 750 endet, und weiterhin wobei sich mindestens ein Primer über eine Exon-Exon-Verbindung erstreckt, die als Folge von alternativem Spleißen ausgebildet wird, welches diejenigen Nukleotide entfernt, die den Nukleotiden 114 bis 360 der cDNA-Sequenz entsprechen, und die das PSM Antigen kodieren, und (B) Verifizieren der Mikrometastasen durch DNA-Sequenzierung und Southern-Analysen wodurch hämatogene mikrometastatische Tumorzellen des Subjekts detektiert werden.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Proben von einem Subjekt sind, dem Hormone, epidermaler Wachstumsfaktor, b-Fibroblast-Wachstumsfaktoren oder Tumornekrosefaktor verabreicht wurden.
Verfahren zur Bestimmung des Fortschreitens von Prostatakrebs in einem Subjekt durch Analyse einer Prostata-Gewebeprobe von diesem Subjekt, die umfasst: (a) Extrahieren der RNA aus einer Prostata-Gewebeprobe; (b) Durchführen eines RNAase-Schutz-Assays mit der RNA, wodurch ein RNA-RNA-Duplex gebildet wird; (c) getrennte Bestimmung der Menge von Prostata-spezifischem Membran (PSM) Antigen, und alternativ gespleißtem Prostata-spezifischem Membran (PSM') Antigen in der Gewebeprobe, wobei das PSM' Antigen eine Aminosäuresequenz hat, die identisch zu dem Teil der Aminosäuresequenz des Prostata-spezifischen Membran (PSM)-Antigens ist, der mit Methionin an Position 58 beginnt und mit Alanin an Position 750 endet; (d) Kalkulieren eines PSM/PSM' Tumorindexes, und (e) Bestimmung des Fortschreitens des Prostatakrebses in dem Subjekt hieraus.
Verfahren nach Anspruch 17, das weiter die Durchführung von in-situ Hybridisierung umfasst.