DE69633617T2

DE69633617T2 - Il-17 receptor

Info

Publication number: DE69633617T2
Application number: DE69633617T
Authority: DE
Inventors: Zhengbin Yao; K. Melanie SPRIGGS; C. William FANSLOW
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1995-03-23
Filing date: 1996-03-21
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2016-03-22
Also published as: CA2215394A1; AU696775B2; PT817847E; EP0817847B1; US20100233186A1; AU5526396A; NO974258D0; DK0817847T3; US6197525B1; US6096305A; US6072033A; ES2229264T3; NZ306653A; NO974258L; US20090068737A1; US6191104B1; JP4373495B2; EP0817847A1; JPH11503309A; DE69633617T3

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Zytokinrezeptoren und insbesondere Zytokinrezeptorproteine, welche eine immunregulatorische Aktivität aufweisen.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Zytokine sind hormonähnliche Moleküle, welche verschiedene Aspekte einer Immun- oder Entzündungsreaktion regulieren. Zytokine üben ihre Wirkungen durch spezifische, auf Zellen vorhandene Bindungsrezeptoren und die Aussendung eines Signals an die Zellen aus. Rouvier et al. (J. Immunol. 150: 5445; 1993) berichteten von einer neuartigen cDNA, welche sie als CTLA-8 bezeichneten. Das putative CTLA8-Protein ist zu 57% homolog zur vorhergesagten Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens (ORF), welcher im Herpesvirus saimiri (HSV), bezeichnet als HVS13 (Nicholas et al. Virol. 179: 1 89, 1990; Albrecht et al., J. Virol. 66: 5047, 1992) vorkommt. Jedoch war weder die Funktion von CTLA-8 oder HVS13 noch ein Rezeptor- oder Bindungsprotein für CTLA-8 oder HVS13 bekannt. Also bestand vor der vorliegenden Erfindung Bedarf in der Technik, die Funktion von CTLA-8 und HVS13 zu bestimmen und Rezeptormoleküle oder Bindungsproteine zu identifizieren, welche eine Rolle bei der Funktion dieser Proteine spielen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung identifiziert einen neuartigen Rezeptor, welcher IL-17 (CTLA-8) und HVS13, ein virales Homolog von IL-17, bindet; es werden DNAs, welche den neuartigen Rezeptor kodieren, und neuartige Rezeptorproteine bereitge stellt. Der Rezeptor ist ein transmembranes Protein vom Typ I; der Mausrezeptor besitzt 864 Aminosäurereste und der humane Rezeptor 866 Aminosäurereste. Lösliche Formen des Rezeptors können hergestellt und dazu verwendet werden, Immunreaktionen in einem therapeutischen Rahmen zu regulieren; dementsprechend werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen, welche lösliche Formen des neuartigen Rezeptors aufweisen, bereitgestellt. Ausgelassene Formen und Fusionsproteine, welche den neuartigen Rezeptor umfassen, und Homologe davon werden außerdem offenbart. Ferner werden Verfahren der Regulierung einer Immunreaktion und Verfahren der Unterdrückung der Abstoßung verpflanzter/n Organe oder Gewebes bereitgestellt. Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung deutlich werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein lösliches IL-17 (CTLA-8)-Protein und ein ORF, welcher im Herpesvirus saimiri (HVS13) vorkommt, wurden als Fusionsproteine exprimiert, welche eine Immunglobulin-Fc-Region aufweisen und zur Untersuchung von Zellen auf die Exprimierung eines Rezeptors für IL-17 verwendet. Man fand heraus, dass T-Zellen-Thymom-EL4-Zellen das HVS13/Fc sowie das murine CTLA8 (IL-17)/Fc-Fusionsprotein binden. Eine cDNA-Bibliothek aus EL4-Zellen wurde hergestellt und auf die Exprimierung des Rezeptors hin untersucht. Der Rezeptor ist ein transmembranes Protein vom Typ I mit 864 Aminosäureresten, welches als IL-17R (CTLA-8R) bezeichnet wird. Verschiedene Formen des IL-17R wurden hergestellt, einschließlich des IL-17R/Fc-Proteins, ein lösliches IL-I7R, welches das Signalpeptid und die extrazelluläre Domäne von IL-17R beinhaltet, sowie ein lösliches IL-17R/Flag^®-Konstrukt. Ein humanes IL-17R wurde durch speziesübergreifende Hybridisierung aus einer humanen peripheren Blutlymphozyten-Bibliothek isoliert und zeigt Ähnlichkeiten zum murinen IL-17R. Außerdem werden Oligonukleotidproben und -primere offenbart.
IL-17, HVS13 und homologe Proteine
CTLA-8 bezieht sich auf eine cDNA, welche aus einem aktivierten T-Zellen-Hybridomklon (Rouvier et al., J. Immunol. 150: 5445; 1993) geklont wurde. Die Northern-Blot-Analyse zeigte, dass die CTLA-8-Transkription sehr gewebespezifisch war. Man fand heraus, dass die CTLA-8-Gene bei Mäusen an Chromosomenposition 1a und bei Menschen an Position 2q31 kartiert sind. Obwohl ein durch das CTLA-8-Gen kodiertes Protein von Rouvier et al. nie identifiziert wurde, fand man heraus, dass die vorhergesagte Aminosäuresequenz von CTLA-8 mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz eines ORF, der im Herpesvirus saimiri vorkommt, HVS13, zu 57% homolog ist. Das CTLA-8-Protein wird hierin als Interleukin-17 (IL-17) bezeichnet.
Über die komplette Nukleotidsequenz des Genoms von HVS wurde berichtet (Albrecht et al., J. Virol. 66: 5047, 1992). Weitere Studien zu einem der offenen Leserahmen des HVS (ORFs), HVS13, sind in Nicholas et al., Virol. 179: 1 89, 1990 beschrieben. HVS13 ist ein spätes Gen, welches im Hind-III-G-Fragment von HVS vorkommt. Von Antiseren, welche gegen aus HVS13 abgeleitete Peptide entwickelt wurden, glaubt man, dass sie mit einem späten Protein reagieren (Nicholas et al., oben).
Wie in USSN 08/462,353, einer Teilfortführungsanmeldung von USSN 08/410,536, eingereicht am 23. März 1995, beschrieben, wurden ein murines CTLA-8-Protein voller Länge und ein CTLA-8/Fc-Fusionsprotein exprimiert und getestet, und man fand heraus, dass sie als Kostimulus für die Proliferation von T-Zellen agieren. Humanes IL-17 (CTLA-8) wurde durch die Erforschung einer humanen T-Zellen-Bibliothek mit Hilfe eines aus degeneriertem PCR abgeleiteten DNA-Fragmentes identifiziert; man erwartet, dass Homologe von IL-17 (CTLA-8) auch in anderen Spezies existieren. Außerdem wurden ein HVS13-Protein voller Länge sowie ein HVS13/Fc-Fusionsprotein exprimiert und es wurde herausgefunden, dass sie in einer ähnlichen Art und Weise wie das IL-17 (CTLA-8)-Protein agieren. Darüber hinaus kodieren wahrscheinlich auch andere Spezies von Herpesviren Proteine, die homolog zu dem durch HVS13 kodierten sind.
Proteine und Analoga
Die vorliegende Erfindung stellt isoliertes IL-17R und Homologe davon bereit, welche immunregulatorische Aktivitäten aufweisen. Derartige Proteine sind im wesentlichen frei von kontaminierenden endogenen Materialien und, optional, ohne die damit verbundene Ursprungsmuster-Glycosylierung. Zu Derivativen von IL-17R innerhalb des Umfangs der Erfindung gehören auch verschiedene Strukturformen des Primärproteins, welche die biologische Aktivität beibehalten. Aufgrund der Gegenwart ionisierbarer Amino- und Carboxylgruppen zum Beispiel, kann ein IL-17R-Protein in der Form saurer oder basischer Salze oder in der neutralen Form auftreten. Individuelle Aminosäurereste können auch durch Oxidation oder Reduktion modifiziert werden.
Die primäre Aminosäurestruktur kann durch die Bildung kovalenter oder aggregierter konjugierter Verbindungen mit anderen chemischen Hälften, wie z. B. Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphaten, Acetylgruppen und ähnlichen, oder durch die Erzeugung von Aminosäuresequenzmutanten modifiziert werden. Kovalente Derivate werden durch die Verknüpfung besonderer funktionaler Gruppen an Aminosäureseitenketten oder an die N- oder C-Termini hergestellt.
Außerdem innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen lösliche Formen von IL-17R. Das Nukleotid und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des murinen IL-17R sind in SEQ ID NR. 1 und 2 dargestellt. Die Computeranalyse zeigte, dass das Protein ein N-terminales-Signalpeptid mit einer Spaltstelle zwischen Aminosäure 31 und 32 besitzt. Der Fachmann wird erkennen, dass die tatsächliche Spaltstelle eine andere sein kann als die durch die Computeranalyse vorhergesagte. Daher wird erwartet, dass die N-terminale-Aminosäure des gespaltenen Peptids innerhalb von etwa fünf Aminosäuren auf jeder Seite der vorhergesagten Spaltstelle liegt. Dem Signalpeptid folgen eine extrazelluläre 291-Aminosäurendomäne, eine trans membrane 21-Aminosäurendomäne und ein 521-Aminosäuren-Zytoplasmaschwanz. Lösliches IL-17R umfasst das Signalpeptid und die extrazelluläre Domäne (Reste 1 bis 322 von SEQ ID NR. 1) oder ein Fragment davon. Alternativ dazu kann ein anderes Signalpeptid für die Reste 1 bis einschließlich 31 von SEQ ID NR. 1 substituiert werden.
Das Nukleotid und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des humanen IL-17R wird in SEQ ID NR. 9 und 10 gezeigt. Es teilt viele Merkmale mit dem murinen IL-17R. Die Computeranalyse zeigte, dass das Protein ein N-terminales-Signalpeptid mit einer Spaltstelle zwischen Aminosäure 27 und 28 besitzt. Der Fachmann wird erkennen, dass die eigentliche Spaltstelle eine andere sein kann als die durch die Computeranalyse vorhergesagte. Man erwartet also, dass die N-terminale-Aminosäure des gespaltenen Peptides innerhalb von etwa fünf Aminosäuren auf jeder Seite der vorhergesagten Spaltstelle liegt. Dem Signalpeptid folgt eine extrazelluläre 293-Aminosäurendomäne, eine transmembrane 21-Aminosäurendomäne und ein 525-Aminosäuren-Zytoplasmaschwanz. Lösliches IL-17R umfasst das Signalpeptid und die extrazelluläre Domäne (Reste 1 bis 320 von SEQ ID NR. 1) oder ein Fragment davon. Alternativ dazu kann ein anderes Signalpeptid für das ursprüngliche Signalpeptid substituiert werden.
Zu weiteren Derivaten des IL-17R-Proteins und Homologen davon innerhalb des Umfangs dieser Erfindung gehören kovalente oder aggregierte konjugierte Verbindungen des Proteins oder seiner Fragmente mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie z. B. durch Synthese in rekombinierter Kultur als N-terminale- oder C-terminale-Fusionen. Zum Beispiel kann das konjugierte Peptid eine Signal-(oder eine Leit-)Polypeptidsequenz an der N-terminalen-Region des Proteins sein, welches cotranslational oder posttranslational die Übertragung des Proteins von seiner Synthesestelle zu seiner Funktionsstelle innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder -wand (z. B. der Hefe-α-Faktorleiter) lenkt.
Proteinfusionen können Peptide umfassen, die hinzugefügt werden, um die Reinigung oder Identifikation von IL-17R-Proteinen und Homologen (z. B. Poly-His) zu vereinfachen. Die Aminosäuresequenz des erfinderischen Proteins kann auch mit einem Identifikationspeptid wie dem von Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988 beschriebenen verknüpft werden. Ein solches hochantigenes Peptid stellt ein Epitop bereit, welches durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper umgekehrt gebunden ist, wodurch eine schnelle Untersuchung und leichte Reinigung von exprimiertem rekombiniertem Protein möglich ist. Die Sequenz von Hopp et al. ist ferner durch Rinderschleimhautenterokinase spezifisch gespalten, wodurch die Entfernung des Peptids aus dem gereinigten Protein möglich wird. Mit solchen Peptiden versehene Fusionsproteine können außerdem gegen die intrazelluläre Degradation in E. coli resistent sein.
Fusionsproteine umfassen ferner die Aminosäuresequenz eines IL-17R verknüpft mit einer Immunglobulin-Fc-Region. Eine exemplarische Fc-Region ist ein humanes IgG1, welches eine in SEQ ID NR. 4 dargelegte Nukleotid- und Aminosäuresequenz aufweist. Außerdem können Fragmente einer Fc-Region verwendet werden, wie auch Fc-Muteine wie die in USSN 08/145,830, eingereicht am 29. Oktober 1993, beschriebenen. Abhängig vom Anteil der verwendeten Fc-Region kann ein Fusionsprotein durch die Bildung von Disulfidbrücken als ein Dimer exprimiert werden. Werden die Fusionsproteine sowohl mit schweren als auch mit leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt, besteht die Möglichkeit ein Proteinoligomer mit bis zu vier IL-17R-Regionen zu bilden.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen IL-17R und Homologe davon eine oligomerisierte Zipper-Domäne. Zipper-Domänen sind in USSN 08/107,353, eingereicht am 13. August 1993, beschrieben, deren relevante Offenbarung durch Bezugnahme hierin eingefügt wird. Beispiele von Leucin-Zipper-Domänen sind die im Hefetranskriptionsfaktor GCN4 gefundenen und ein hitzestabiles DNA-Bindungsprotein, welches sich in Rattenleber findet (C/EBP; Landschulz et al., Science 243: 1681, 1989), die nuklear transformierenden Proteine, fos und jun, welche vorzugsweise ein Heterodimer bilden (O'Shea et al., Science 245: 646, 1989; Turner and Tijan, Science 243: 1689, 1989) sowie das Genprodukt aus dem murinen Protoonkogen, c-myc (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988). Die fusogenen Proteine mehrerer verschiedener Viren, einschließlich des Paramyxovirus, Coronavirus, Masernvirus und vieler Retroviren, besitzen auch Leucin-Zipper-Domänen (Buckland and Wild, Nature 338: 547, 1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart and Mosialos, AIDS Research and Humman Retroviruses 6: 703, 1990).
Derivate von IL-17R können ferner als Immunogene, Reagenzien bei in vitro Versuchen oder als Bindungsmittel für Affinitätsreinigungsverfahren verwendet werden. Solche Derivate erhält man auch durch die Quervernetzung von Agenzien, wie M-Maleimidobenzoyl-Succinimidester und N-Hydroxy-Succinimidester, an Cystein- und Lysin-Resten. Die erfinderischen Proteine können auch durch reaktive Seitengruppen kovalent an verschiedene unlösliche Substrate wie Cyanogenbromid-aktivierte, Bisoxiran-aktivierte, Carbonyldiimidazol-aktivierte oder Tosyl-aktivierte Agarose-Strukturen oder durch die Absorption an Polyolefinoberflächen (mit oder ohne Glutaraldehyd-Quervernetzung) gebunden werden. Nach der Bindung an ein Substrat können Proteine dazu verwendet werden, gegen das IL-17R oder gegen andere Proteine, welche dem IL-17R ähnlich sind, gezüchtete Antikörper, sowie weitere Proteine, die IL-17R oder seine homologen Proteine binden, selektiv zu binden (zu Versuchs- oder Reinigungszwecken).
Die vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem IL-17R mit oder ohne die damit verbundene Ursprungsmuster-Glycosylierung. In Hefe- oder Säugetier-Exprimierungssystemen, z. B. COS-7-Zellen, exprimierte Proteine können abhängig vom Exprimierungssystem im Vergleich zu den Ursprungsmolekülen im Molekulargewicht und dem Glycosylierungsmuster ähnlich oder leicht verändert sein. Die Exprimierung von DNAs, welche die erfinderischen Proteine in Bakterien wie E. coli kodieren, stellt nicht-glycosylierte Moleküle bereit. Funktionale Mutantenanaloga des IL-17R-Proteins oder Homologen davon, welche deaktivierte N-Glycosylierungsstellen aufweisen, können durch Oligonukleotidsynthese und Ligation oder durch positionsspezifische Mutageneseverfahren hergestellt werden. Diese analogen Proteine können mit Hilfe von Hefeexpressionssystemen mit guter Ausbeute in einer homogenen, Kohlenhydrat-reduzierten Form hergestellt werden. N-Glycosylierungsstellen bei eukariotischen Proteinen sind durch das Aminosäu rentriplet Asn-A₁-Z gekennzeichnet, wobei A₁ jede Aminosäure außer Pro und Z Ser oder Thr ist. In dieser Sequenz bietet Asparagin eine Seitenketten-Aminogruppe für die kovalente Anlagerung von Kohlenhydrat. Eine solche Stelle kann durch die Substituierung einer anderen Aminosäure für Asn oder für Rest Z, wobei Asn oder Z weggelassen werden, oder das Einfügen einer Nicht-Z-Aminosäure zwischen A₁ und Z, oder einer Aminosäure, die nicht Asn ist, zwischen Asn und A₁, eliminiert werden.
IL-17R-Proteinderivate erhält man auch durch Mutationen des ursprünglichen IL-17R oder seiner Untereinheiten. Ein mutiertes IL-17R-Protein, wie hierin bezeichnet, ist ein Polypeptid, welches zu einem IL-17R-Protein homolog ist, aber eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich aufgrund einer oder mehrerer Deletionen, Einfügungen oder Ersetzungen vom ursprünglichen IL-17R unterscheidet. Die Wirkung einer in einer DNA, welche ein IL-17R-Peptid kodiert, erzeugten Mutation, kann durch die Analyse der Fähigkeit des mutierten IL-17R-Peptids, die Kostimulation von T- oder B-Zellen durch IL-17 (CTLA-8) oder homologe Proteine zu verhindern oder Proteine zu binden, welche spezifisch IL-17R (zum Beispiel Antikörper oder Proteine, welche durch die CTLA-8-cDNA oder den HVS13 ORF kodiert werden) binden, leicht bestimmt werden. Weiters kann die Aktivität von IL-17R-Gegenstücken, Muteinen oder Derivaten durch eines der hierin beschriebenen Versuchsverfahren bestimmt werden. Ähnliche Mutationen können bei Homologen von IL-17R erzeugt und auf ähnliche Art und Weise getestet werden.
Bioäquivalente Analoga der erfinderischen Proteine können zum Beispiel durch die Durchführung verschiedener Substituierungen von Resten oder Sequenzen oder dem Löschen von End- oder Innenresten oder Sequenzen, welche für die biologische Aktivität nicht benötigt werden, hergestellt werden. Zum Beispiel können Cystein-Reste gelöscht oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um bei der Renaturierung die Bildung inkorrekter intramolekularer Disulfidbrücken zu verhindern. Weiter Ansätze zur Mutagenese beinhalten die Modifizierung benachbarter zweibasiger Aminosäurereste zur Verbesserung der Exprimierung in Hefesystemen, in denen KEX2-Proteaseaktivität vorliegt.
Im Allgemeinen sollten Substitutionen konservativ vorgenommen werden, d. h. die bevorzugtesten Substitut-Aminosäuren sind diejenigen, welche die Fähigkeit der erfinderischen Proteine, ihre Liganden in einer Art und Weise zu binden, die im wesentlichen der von nativem mIL-17R oder hIL-17R entspricht, nicht beeinflussen. Zu Beispielen zurückhaltender Substitutionen gehört die Substitution von Aminosäuren außerhalb der Bindungsdomäne(n) und die Substitution von Aminosäuren, welche die sekundäre und/oder tertiäre Struktur von IL-17R und Homologen davon nicht verändern. Zu weiteren Beispielen gehören die Substituierung eines aliphatischen Restes mit einen anderen, wie Ile, Val, Leu oder Ala miteinander oder Substitutionen eines polaren Restes mit einem anderen, wie zwischen Lys und Arg, Glu und Asp oder Gln und Asn. Weitere solcher konservativer Substitutionen, zum Beispiel Substitutionen kompletter Regionen, welche ähnliche hydrophobe Eigenschaften aufweisen, sind gut bekannt.
Gleichermaßen sollte beim Einsatz einer Entfernungs- oder Einfügestrategie die potentielle Wirkung der Entfernung oder Einfügung auf die biologische Aktivität beachtet werden. Untereinheiten des erfinderischen Proteins können durch das Entfernen von End- oder Innenresten oder -sequenzen hergestellt werden. Fragmente von IL-17R, welche IL-17R binden können einfach hergestellt (zum Beispiel mit Hilfe von Restriktionsenzymen zur Entfernung von Teilen der DNA) und auf ihre Fähigkeit, IL-17 zu binden, getestet werden. Eine weitere Anleitung zu den Mutationsarten, welche erzeugt werden können, wird durch einen Vergleich der Sequenz von IL-17R zu Proteinen bereitgestellt, welche ähnliche Strukturen aufweisen, sowie durch die Durchführung einer strukturellen Analyse des erfinderischen Proteins.
Mutationen bei Nukleotidsequenzen, welche zur Exprimierung von analogem IL-17R (CTLA-8R) erzeugt wurden, müssen natürlich die Leserahmen-Phase der Kodierungssequenzen bewahren, und erzeugen vorzugsweise keine komplementären Regionen, welche hybridisieren könnten, um sekundäre mRNA-Strukturen wie Schleifen oder Schlaufen zu erzeugen, welche die Translation der Rezeptor-mRNA negativ beeinflussen würden. Obwohl eine Mutationsstelle vorhergesagt werden kann, ist es nicht notwendig, dass die Art der Mutation an sich vorherbestimmt wird. Zum Beispiel kann zur Auswahl optimaler Eigenschaften von Mutanten an einer vorgegebenen Stelle zufällige Mutagenese am Zielcodon durchgeführt werden, und die exprimierten mutierten Virusproteine werden auf die gewünschte Aktivität hin untersucht.
Nicht alle Mutationen in der Nukleotidsequenz, welche ein IL-17R-Protein oder ein Homolog davon kodiert, wird im Endprodukt exprimiert; zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen zur Verbesserung der Exprimierung erzeugt werden, und zwar primär dazu, um sekundäre Strukturschleifen in der transkribierten mRNA zu vermeiden (siehe EP-A 75 444 A, durch Bezugnahme hierin eingefügt), oder um Codons bereitzustellen, welche sich durch den ausgewählten Wirt, z. B. die gut bekannten E. coli-Präferenzcodone für die E. coli-Exprimierung, leichter translatieren lassen.
An bestimmten Stellen können durch die Synthetisierung von Oligonukleotiden, welche eine Mutantensequenz enthalten, die durch Restriktionsstellen flankiert ist, welche die Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen, Mutationen erzeugt werden. Nach der Ligation kodiert die so entstandene rekonstruierte Sequenz ein Gegenstück, welches die gewünschte Aminosäureeinfügung, -ersetzung oder -entfernung aufweist.
Alternativ dazu können Oligonukleotid-gerichtete, positionsspezifische Mutageneseverfahren eingesetzt werden, um ein verändertes Gen bereitzustellen, welches bestimmte Codons aufweist, die gemäß der erforderlichen Substitution, Entfernung oder Einfügung verändert wurden. Beispielhafte Verfahren zur Erzeugung der oben dargelegten Veränderungen wurden durch Walder et al. (Gene 42: 133, 1986), Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, Januar 1985, 12–19); Smith et al. (Genetic Engineerung: Principles and Methods, Plenum Press, 1981) offenbart, und US-Patentschrift Nr. 4,518,584 und 4,737,462 offenbaren geeignete Verfahren und sind durch Bezugnahme hierin eingefügt.
Aufgrund von Code-Degenerierung, können erhebliche Variationen bei Nukleotidsequenzen, welche die gleiche Aminosäuresequenz kodieren, auftreten. Zu weiteren Ausführungsformen gehören Sequenzen, die in der Lage sind, unter moderat stringenten Bedingungen (Vorwaschlösung aus 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von 50°C, 5 × SSC, über Nacht) zu den DNA-Sequenzen zu hybridisieren, welche IL-17R kodieren, sowie weitere Sequenzen, welche zu denen, die IL-17R kodieren, degeneriert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Analoga zu IL-17R in der Aminosäuresequenz zumindest zu etwa 70% identisch mit der Aminosäuresequenz der IL-17R-Proteine wie in SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR. 9 dargelegt. Ähnlich sind Analoga von IL-17R-Homologen in der Aminosäuresequenz zu mindestens etwa 70% identisch mit der Aminosäuresequenz der nativen, homologen Proteine. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform sind Analoga von IL-17R oder Homologe davon in der Aminosäuresequenz zumindest zu etwa 80% identisch mit der nativen Form des erfinderischen Proteins.
Die prozentuale Identität kann mit Hilfe eines Computerprogramms, zum Beispiel dem von Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) beschriebenen und von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) erhältlichen GAP-Computerprogramm bestimmt werden. Bei vom IL-17R-Protein abgeleiteten Fragmenten wird die Identität auf Grundlage des Proteins des IL-17R-Proteins berechnet, welches im Fragment vorkommt. Ähnliche Verfahren können zum Einsatz kommen, um Homologe von IL-17R zu analysieren.
Die Fähigkeit von IL-17R-Gegenstücken, CTLA-8 zu binden, kann durch das Testen der Fähigkeit der Analoga, die IL-17 (CTLA-8)-induzierte T-Zellen-Proliferation zu verhindern, bestimmt werden. Alternativ dazu können geeignete Versuche, zum Beispiel ein Enzym-Immunassay oder ein Dot-Blot, welche CTLA-8 oder HVS13 (oder ein Homolog davon, welches natives IL-17R bindet) einsetzen, verwendet werden, um die Fähigkeit von IL-17R-Analoga, CTLA-8 zu binden, zu bewerten. Solche Verfahren sind in der Technik gut bekannt.
Die hierin beschriebenen IL-17R-Proteine und Analoga besitzen zahlreiche Verwendungszwecke, einschließlich der Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen. Die erfinderischen Proteine sind auch bei der Herstellung von Geräten von Nutzen, welche zur Erkennung von IL-17 oder IL-17R, zum Beispiel in Patientenproben, verwendet werden. Solche Geräte finden außerdem Anwendung bei der Erkennung des Zusammenspiels von IL-17 und IL-17R, wie dies bei der Untersuchung auf Antagonisten oder Mimetika dieses Zusammenspiels (zum Beispiel Peptide oder kleine Moleküle, welche das Zusammenspiel verhindern bzw. imitieren) notwendig ist. Mehrere Versuchsformate sind bei solchen Geräten von Nutzen, einschließlich (jedoch nicht darauf beschränkt) ELISA, Dot-Blot, Festphasenbindungsversuche (wie diejenigen, welche einen Biosensor verwenden), Schnellformat-Versuche und Bioassays.
Exprimierung rekombinierter Rezeptoren für IL-17
Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise mit DNA-Rekombinationsverfahren durch das Einfügen einer DNA-Sequenz, welche das IL-17R-Protein oder ein Homolog davon kodiert, in einen rekombinierten Expressionsvektor und die Exprimierung der DNA-Sequenz in einem rekombinierten mikrobiellen Expressionssystem unter Bedingungen, welche für die Exprimierung förderlich sind, hergestellt. Die Proteine kodierenden DNA-Sequenzen, welche durch diese Erfindung bereitgestellt werden, können aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotidlinkern oder aus einer Reihe von Oligonukleotiden zusammengestellt sein, um ein synthetisches Gen bereitzustellen, welches in einen rekombinierten Expressionsvektor eingefügt und in einer rekombinierten Transkriptionseinheit exprimiert werden kann.
Zu rekombinierten Expressionsvektoren gehören synthetische oder von cDNA abgeleitete DNA-Fragmente, welche IL-17R, Homologe oder bioäquivalente Analoga kodieren, welche operabel mit geeigneten Transkriptions- oder Translationsregulierungselementen, welche aus Säugetier-, Mikroben-, Viren- oder Insektengenen ab geleitet sind, verknüpft sind. Zu solchen Regulierungselementen gehören eine Transkriptionspromotor, eine optionale Operatorsequenz zur Steuerung der Transkription, eine Sequenz, welche geeignete mRNA-Ribosombindungsstellen kodiert und Sequenzen, welche den Abschluss der Transkription und Translation, wie unten detailliert beschrieben, steuern. Die Fähigkeit, sich in einem Wirt zu replizieren, welche normalerweise durch eine Replikationsquelle ermöglicht wird, und ein Auswahlgen zur Vereinfachung der Erkennung von Transformanten können zusätzlich eingefügt werden.
DNA-Regionen sind operabel verknüpft, wenn sie funktional miteinander verbunden sind. Zum Beispiel wird die DNA für ein Signalpeptid (Sekretionsleiter) operabel mit einer DNA für ein Polypeptid geknüpft, wenn sie als ein Vorläufer exprimiert ist, welcher an der Sekretion des Polypeptides beteiligt ist; ein Promotor wird operabel mit einer Kodierungssequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz steuert; oder eine Ribosombindungsstelle wird operabel mit einer Kodierungssequenz verknüpft, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation zulässt. Im Allgemeinen bedeutet operabel verknüpft benachbart und im Falle von Sekretionsleitern benachbart und im Leserahmen. DNA-Sequenzen, welche IL-17R oder Homologe kodieren, welche in einem Mikroorganismus exprimiert werden sollen, enthalten vorzugsweise keine Intronen, welche die Transkription von DNA in mRNA vorzeitig beenden könnten.
Nützliche Expressionsvektoren für eine bakterielle Verwendung können einen wählbaren Marker und eine bakterielle Replikationsquelle, abgeleitet aus handelsüblichen Plasmiden, welche genetische Elemente des gut bekannten Klon-Vektors pBR322 (ATCC 37017) aufweisen, umfassen. Zu solchen kommerziellen Vektoren gehören zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322-„Hauptketten"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und einer zu exprimierenden strukturellen Sequenz kombiniert. E. coli wird normalerweise mit Hilfe von Derivaten von pBR322, einem aus einer E. coli-Spezies abgeleiteten Plasmid (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977) transformiert. PBR322 enthält Gene für Ampizillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt so einfache Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen bereit.
Zu üblicherweise in rekombinierten mikrobiellen Expressionsvektoren verwendeten Promotoren gehören das β-Lactamase-(Penicillinase) und Lactose-Promotor-System (Chang et al., Nature 275: 615, 1978 und Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), das Tryptophan(trp)-Promotor-System (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980 und EP-A 36 776) und der tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 412, 1982.) Ein besonders nützliches bakterielles Expressionssystem verwendet den Phagen-λ-P_L-Promotor und den thermolabilen cI857ts-Repressor. Zu den von der American Type Culture Collection erhältlichen Plasmidvektoren, welche Derivate des λ-P_L-Promotors beinhalten, gehören das Plasmid pHUB2, resident im E. coli-Bakterienstamm JMB9 (ATCC 37092) und pPLc28, resident in E. coli RR1 (ATCC 53082).
Zu geeigneten Promotorsequenzen in Hefevektoren gehören die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzemann et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere Glykolyseenzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968 und Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978) wie Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-Phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in Hefeexpression sind ferner in R. Hitzeman et al., EP A 73 657 beschrieben.
Bevorzugte Hefevektoren können mit Hilfe von DNA-Sequenzen aus pBR322 zur Auswahl und Replikation in E. coli (Amp^r Gen und Replikationsquelle) und Hefe-DNA-Sequenzen, einschließlich einem Glukose-unterdrückenden ADH2-Promotor und α-Faktor-Sekretionsleiter, zusammengestellt werden. Der ADH2-Promotor wurde von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300: 724, 1982) beschrieben. Der Hefe-α-Faktor-Leiter, welcher die Sekretion hete rologer Proteine lenkt, kann zwischen den Promotor und das zu exprimierende Strukturgen eingefügt werden. Siehe z. B. Kurjan et al. Cell 30: 933, 1982 und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. Die Leitersequenz kann so modifiziert werden, dass sie nahe ihrem 3'-Ende eine oder mehrere nützliche Restriktionsstellen zur Vereinfachung der Verschmelzung der Leitersequenz an fremde Gene beinhaltet.
Die Transkriptions- und Translationssteuerungssequenzen in Expressionsvektoren, die bei der Transformierung von Wirbeltierzellen verwendet werden sollen, können durch Virusquellen bereitgestellt werden. Zum Beispiel werden häufig verwendete Promotoren und Enhancer aus Polyoma, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und dem humanen Zytomegalovirus abgeleitet. Die aus dem SV40-Virusgenom abgeleiteten DNA-Sequenzen, zum Beispiel die SV40-Quelle, früher oder später Promoter, Enhancer, Spleiß und Polyadenylationsstellen, können verwendet werden, um die anderen genetischen Elemente bereitzustellen, die für die Exprimierung einer heterologen DNA-Sequenz notwendig sind. Die frühen und späten Promoter sind besonders nützlich, weil man beide leicht als ein Fragment aus dem Virus erhält, welches auch die SV40-Virus-Replikationsquelle (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978) beinhaltet. Es können auch kleinere oder größere SV40-Fragmente verwendet werden, vorausgesetzt die etwa 250-bp-Sequenz, welche sich von der Hind-III-Stelle in Richtung der BglI-Stelle erstreckt, welche sich in der Virus-Replikationsquelle befindet, ist integriert. Ferner können die Virus-Genom-Promotor-, Steuerungs- und/oder Signalsequenzen verwendet werden, vorausgesetzt solche Steuerungssequenzen sind mit der ausgewählten Wirtszelle kompatibel. Exemplarische Vektoren können wie von Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) offenbart erzeugt werden.
Ein nützliches System für eine stabile Spitzenexpression von Säugetier-Rezeptor-cDNAs in murinen C127-Brustepithelzellen kann im wesentlichen wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) beschrieben hergestellt werden. Ein bevorzugter eukaryotischer Vektor für die Expression von IL-17R-DNA wird als pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991) bezeichnet und beinhaltet Regulierungs sequenzen, welche aus SV40, dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) und dem Epstein-Barr-Virus (EBV) abgeleitet sind. Zu weiteren bevorzugten Vektoren gehören pDC409 und pDC410, welche aus pDC406 abgeleitet sind. pDC410 wurde durch Substituierung der EBV-Replikationsquelle mit Sequenzen, welche das große SV40-T-Antigen kodieren, aus pDC406 abgeleitet. pDC409 unterscheidet sich von pDC406 darin, dass eine BglII-Restriktionsstelle außerhalb der multiplen Klonstelle entfernt wurde, wodurch die BglII-Stelle innerhalb der multiplen Klonstelle einzigartig wurde.
Eine nützliche Zelllinie, welche die Episomreplikation von Expressionsvektoren wie pDC406 und pDC409, welche die EBV-Replikationsquelle enthalten, zulässt, ist CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). Die CV-1/EBNA-Zelllinie wurde durch Transfektion der CV-1-Zelllinie mit einem Gen, welches das Epstein-Barr-Virus-Nuklearantigen-1 (EBNA-1) kodiert, abgeleitet und exprimiert konstitutiv EBNA-1, angetrieben vom humanen CMV Immediate-Early Enhancer/Promotor.
Wirtszellen
Transformierte Wirtszellen sind Zellen, welche mit Expressionsvektoren, die mit Hilfe von DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt wurden und die Sequenzen beinhalten, welche die Proteine der vorliegenden Erfindung beinhalten, transformiert oder transfiziert wurden. Transformierte Wirtszellen können das gewünschte Protein (IL-17R oder Homologe davon) exprimieren, aber zum Zwecke des Klonens oder Erweiterns der erfinderischen DNA transformierte Wirtszellen müssen das Protein nicht exprimieren. Exprimierte Proteine werden, abhängig von der ausgewählten DNA, vorzugsweise in Kulturüberstand abgeschieden, können aber auch in der Zellmembran abgelagert werden.
Zu geeigneten Wirtszellen für die Exprimierung von Virusproteinen gehören Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen unter Kontrolle geeigneter Promotoren. Zu Prokaryoten gehören gramnegative oder grampositive Organismen, zum Beispiel E. coli oder Bacillus spp. Zu höheren eukaryotischen Zellen gehören etab lierte Zelllinien mit Säugetierursprung, wie unten beschrieben. Zellfreie Translationssysteme könnten auch eingesetzt werden, um mit Hilfe von RNAs, welche aus den hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet sind, Virusproteine zu erzeugen. Geeignete Klon- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit Bakterien-, Pilz-, Hefe- und Säugetierzellwirten werden von Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985) beschrieben, deren relevante Offenbarung durch Bezugnahme hierin eingefügt ist.
Prokaryotische Expressionswirte können zur Exprimierung von IL-17R oder Homologen verwendet werden, welche keine extensive proteolytische und Disulfid-Verarbeitung erfordern. Prokaryotische Expressionsvektoren enthalten im Allgemeinen einen oder mehrere phänotypische, wählbare Marker, zum Beispiel ein Gen, welches Proteine kodiert, die eine Antibiotikaresistenz hervorrufen oder eine autotrophe Anforderung bereitstellen, sowie eine durch den Wirt erkannte Replikationsquelle, um die Erweiterung innerhalb des Wirtes sicherzustellen. Zu geeigneten prokaryotischen Wirten für die Transformation gehören E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies innerhalb der Genera Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl je nach Wahl auch andere eingesetzt werden können.
Rekombiniertes IL-17R kann auch in Hefewirten exprimiert werden, vorzugsweise aus der Saccharomyces-Spezies wie S. cerevisiae. Hefe anderer Genera, wie Pichia oder Kluyveromyces kann auch eingesetzt werden. Hefevektoren beinhalten im Allgemeinen eine Replikationsquelle aus dem 2 μ-Hefeplasmid oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), einen Promotor, eine DNA, welche das Virusprotein kodiert, Sequenzen für die Polyadenylierungs- und Transkriptionsbeendigung und ein Auswahlgen. Vorzugsweise enthalten Hefevektoren eine Replikationsquelle und einen wählbaren Marker, welche sowohl die Transformation von Hefe als auch von E. coli, z. B. das Ampizillinresistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae trp1-Gen, zulassen, welches einen Auswahlmarker für einen mutierten Bakterienstamm der Hefe bereitstellt, welchem die Fähigkeit, in Tryptophan zu wachsen, fehlt, sowie einen Promotor, der aus einem hochexprimierten Hefegen abgeleitet ist, um die Transkription einer Struktursequenz stromabwärts zu induzieren. Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefewirtszellengenom stellt dann eine effektive Umgebung zur Erkennung der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit.
Geeignete Hefetransformationsprotokolle sind dem Fachmann bekannt; ein exemplarisches Verfahren wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978, beschrieben, wobei für Trp⁺ Transformanten in einem selektiven Medium bestehend aus 0,67% Hefe-Stickstoffbasis, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glukose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil ausgewählt werden. Durch Vektoren, welche den ADH2-Promotor aufweisen, transformierte Wirtsbakterienstämme können zur Exprimierung in einem Vollmedium bestehend aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glukose ergänzt mit 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil gezüchtet werden. Derepression des ADH2-Promoters entsteht mit dem Verbrauch der Medienglukose. Grobe Hefeüberstände werden durch Filtration entnommen und vor einer weiteren Reinigung bei 4°C aufbewahrt.
Um rekombiniertes Protein zu exprimieren können verschiedene Säugetier- oder Insektenzellkultursysteme verwendet werden. Baculovirus-Systeme zur Herstellung heterologer Proteine in Insektenzellen werden von Luckow and Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988) überprüft. Zu Beispielen geeigneter Säugetier-Wirtszelllinien gehören die COS-7-Linien von Affennierenzellen, beschrieben von Gluzman (Cell 23: 175, 1981) und andere Zelllinien, die zur Exprimierung eines geeigneten Vektors, einschließlich zum Beispiel CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478), L-Zellen, C127, 3T3, CHO Chinesische Hamster Eierstock (Chinese Hamster Ovary), HeLa- und BHK-Zelllinien, in der Lage sind. Säugetierexpressionsvektoren können nicht-transkribierte Elemente wie eine Replikationsquelle, einen geeigneten Promotor und einen mit dem zu exprimierenden Gen verknüpften Verstärker (Enhancer) sowie weitere 5'- oder 3'-flankierende, nicht-transkribierte Sequenzen und 5'- und 3'-nicht-translatierte Sequenzen wie notwendige Ribosombindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleißspender und Akzeptorstellen und Transkriptionsabschlusssequenzen umfassen.
Reinigung von Rezeptoren für IL-17
Gereinigtes IL-17R, Homologe oder Analoga werden durch das Kultivieren geeigneter Wirts-/Vektorsysteme hergestellt, um die rekombinierten Translationsprodukte der DNAs der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, welche dann aus Kulturmedien oder Zellenextrakten herausgefiltert werden. Zum Beispiel können Überstände von Systemen, welche rekombiniertes Protein in Kulturmedien abscheiden, zuerst mit Hilfe eines handelsüblichen Proteinkonzentrationsfilters, zum Beispiel einer Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationseinheit, konzentriert werden.
Nach dem Konzentrierungsschritt kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix aufgetragen werden. Eine geeignete Affinitätsmatrix kann zum Beispiel ein Gegenstrukturprotein oder Lektin oder ein an eine geeignete Trägersubstanz gebundenes Antikörpermolekül umfassen. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauschharz verwendet werden, zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat, welches Diethylaminoethyl(DEAE)-Seitengruppen aufweist. Die Matrizen können Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere üblicherweise bei der Proteinreinigung eingesetzte Arten sein. Alternativ dazu kann ein Kationenaustausch vorgenommen werden. Zu geeigneten Kationenaustauschern gehören verschiedene unlösliche Matrizen, welche Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen aufweisen. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt. Die Gelfiltrationschromatographie stellt ein weiteres Mittel zur Reinigung der erfinderischen Proteine dar.
Die Affinitätschromatographie ist ein besonders bevorzugtes Verfahren der Reinigung von IL-17R und Homologen davon. Zum Beispiel kann ein als ein Fusionsprotein exprimiertes IL-17R, welches eine Immunglobulin-Fc-Region aufweist, mit Hilfe der Protein-A- oder Protein-G-Affinitätschromatographie gereinigt werden. Darüber hinaus kann ein IL-17R-Protein, welches eine oligomerisierende Zipper-Domäne aufweist, auf einem Harz gereinigt werden, welches einen für die oligomerisierende Zipper-Domäne spezifischen Antikörper aufweist. Ferner können monoklonale Antikörper gegen das IL-17R-Protein bei der Affinitätschromatographie reinigung von Nutzen sein, indem in der Technik gut bekannte Verfahren eingesetzt werden. Außerdem kann ein Ligand (d. h. IL-17 oder HVS-13) verwendet werden, um eine Affinitätsmatrix für die Affinitätsreinigung von IL-17R herzustellen.
Abschließend können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie(RP-HPLC)-Schritte durchgeführt werden, welche hydrophobe RP-HPLC-Medien, z. B. Silica-Gel, welches Methyl- oder andere aliphatische Seitengruppen aufweist, verwenden, um eine IL-17R-Zusammensetzung weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorangehenden Reinigungsschritte können, in verschiedenen Kombinationen, außerdem eingesetzt werden, um ein homogenes rekombiniertes Protein bereitzustellen.
In Bakterienkultur hergestelltes rekombiniertes Protein wird normalerweise durch Anfangsextraktion aus Zellpellets, gefolgt von einem oder mehreren Konzentrations-, Aussalz-, Ionenaustausch- oder Größenausschluss-Chromatographieschritten isoliert. Schließlich kann bei abschließenden Reinigungsschritten die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) eingesetzt werden. Bei der Exprimierung von rekombiniertem Virusprotein verwendete Mikroorganismenzellen können durch jedes zweckmäßige Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich dem Gefrier-Auftau-Zyklus, Beschallung, mechanischer Aufbrechung oder der Verwendung von Zellauflösungsmitteln.
Die Fermentierung von Hefe, welche das erfinderische Protein als ein abgeschiedenes Protein exprimiert, vereinfacht die Reinigung in hohem Maße. Abgeschiedenes rekombiniertes Protein, welches durch eine großtechnische Fermentierung entsteht, kann mit Verfahren analog zu den von Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984) offenbarten gereinigt werden. Diese Literaturstelle beschreibt zwei sequentielle, Umkehrphasen-HPCL-Schritte zur Reinigung von rekombiniertem humanem GM-CSF auf einer präparativen HPCL-Säule.
In rekombinierter Kultur synthetisiertes Protein ist gekennzeichnet durch die Gegenwart von Zellkomponenten, einschließlich Proteinen, in solchen Mengen und mit den Eigenschaften, welche von den zur Wiederherstellung des erfinderischen Proteins aus der Kultur durchgeführten Reinigungsschritten abhängen. Diese Komponenten stammen gewöhnlich aus Hefe-, prokaryotischem oder nicht-humanem, höher-eukaryotischem Ursprung und liegen vorzugsweise in harmlosen Kontaminantenmengen im Bereich von weniger als etwa 1 Gew.-% vor. Ferner ermöglicht die rekombinierte Zellkultur die Herstellung der erfinderischen Proteine frei von anderen Proteinen, welche normalerweise mit den Proteinen verbunden sein können, wie sie in der Natur in den Ursprungsspezies vorkommen.
Verabreichung von IL-17R-Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren der Verwendung therapeutischer Zusammensetzungen, welche eine effektive Menge eines Proteins und eines geeigneten Verdünnungsmittels und Trägers aufweisen, und Verfahren zur Regulierung einer Immunreaktion bereit. Weiters wird die Verwendung von IL-17R oder Homologen in Verbindung mit löslichen Zytokinrezeptoren oder Zytokinen sowie weiteren immunregulatorischen Molekülen betrachtet. Darüber hinaus ist auch die DNA, welche lösliches IL-17R kodiert, von Nutzen; ein zu transplantierendes Gewebe oder Organ kann mittels jedes in der Technik bekannten Verfahrens mit der DNA transfiziert werden. Das Organ oder Gewebe exprimiert so lösliches IL-17R, welches in dem lokalisierten Bereich des Transplantats agiert, um die Abstoßung des Transplantats zu unterdrücken. Ähnliche Verfahren, welche die Applikation solcher DNAs an die Stelle des Transplantats umfassen zeigen auch Effizienz bei der Verbesserung der Wirkung gegen die Transplantatabstoßung.
Für den therapeutischen Einsatz wird einem Patienten, bevorzugt einem Menschen, zur Behandlung in einer der Indikation angemessenen Art und Weise gereinigtes Protein verabreicht. So können zum Beispiel IL-17R-Proteinzusammensetzungen, die zur Regulierung der Immunfunktion verabreicht werden, durch Bolus-Injektion, kontinuierliche Infusion, verzögerte Freisetzung aus Implantaten oder andere geeignete Verfahren gegeben werden. Normalerweise wird ein therapeutisches Agens in Form einer Zusammensetzung, welche gereinigtes IL-17R in Verbindung mit physiologisch akzeptablen Trägern, Arzneiträgern oder Verdünnungsmitteln aufweist, verabreicht. Solche Träger sind in den angewandten Dosierungen und Konzentrationen nicht-toxisch für die Empfänger.
Normalerweise bedingt die Herstellung solcher Proteinzusammensetzungen die Kombination des erfinderischen Proteins mit Puffern, Antioxidanzien wie Ascorbinsäure, Polypeptiden mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten einschließlich Glukose, Saccharose oder Dextrine, Chelatbildnern wie EDTA, Glutathion und anderen Stabilisatoren und Arzneiträgern. Neutrale Puffersalzlösung oder Salzlösung gemischt mit artgenössischem Serumalbumin sind exemplarische geeignete Verdünnungsmittel. Vorzugsweise wird das Produkt mit geeigneten Arzneiträgerlösungen (z. B. Saccharose) als Lösungsmittel als ein Lyophilisat formuliert. Geeignete Dosierungen können in Versuchen bestimmt werden. Die Menge und Häufigkeit der Verabreichung hängt natürlich von solchen Faktoren wie der Art und Schwere der behandelten Indikation, der gewünschten Reaktion, dem Zustand des Patienten usw. ab.
Rezeptoren für IL-17R (CTLA-8) können zum Zweck der Verhinderung der T-Zellen-Proliferation oder zur Verhinderung der T-Zellen-Aktivierung verabreicht werden. Lösliches IL-17R ist daher wahrscheinlich von Nutzen, um Organ- oder Transplantatabstoßung, Autoimmunerkrankungen, Allergien oder Asthma zu verhindern oder zu behandeln. Die erfinderischen Rezeptorproteine sind außerdem von Nutzen für die Verhinderung oder Behandlung von Entzündungserkrankungen, bei denen aktivierte T-Zellen eine Rolle spielen. Ähnlich stimulieren HVS13 und Homologe davon die B-Zellen-Proliferation und Immunglobulinsekretion; so sind Rezeptoren, welche HVS13 oder CTLA-8 binden in vivo von Nutzen, um die B-Zellen-Proliferation oder Immunglobulinsekretion zu verhindern. Rezeptoren für CTLA-8 sind außerdem von Nutzen bei der Verhinderung der Bindung von HVS13 oder CTLA-8 an Zellen, welche IL-17R exprimieren.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung. Der Fachmann wird erkennen, dass es Variationen der in den Beispielen ent haltenen Erfindung geben kann, besonders angesichts der Lehren der verschiedenen hierin zitierten Literaturstellen, deren Offenbarungen durch Bezugnahme eingeführt sind.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel beschreibt die Identifizierung von Zellen, welche einen Rezeptor (oder eine Gegenstruktur) für HVS13/mCTLA8 exprimieren. Es wurde ein chimäres Protein (HVS13 und Fc des Typs II), bestehend aus einer Fc-Region eines humanen Immunglobulins (SEQ ID NR. 4), gefolgt von den Aminosäuren 19 bis 151 von HVS13 (SEQ ID NR. 8) hergestellt. Ein murines CTLA8/Fc (mCTLA8/Fc) wurde durch das Verschmelzen der Aminosäuren 22 bis 150 von mCTLA8 (SEQ ID NR. 6) mit der Fc-Region von humanem IgG1 erzeugt. Ein Kontroll-Fc-Protein wurde durch ein ähnliches Verfahren hergestellt. Die HVS13/Fc- und mCTLA-8-Proteine wurden exprimiert und mittels Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Zellquellen verwendet.
Zellen (1 × 10⁶) wurden auf Eis für 30 Minuten in 100 μl FACS-Puffer (PBS, 1% FCS und 0,1% NaN3), welcher 2% normales Ziegenserum und 2% normales Kaninchenserum zum Blockieren einer nichtspezifischen Bindung enthielt, vorinkubiert. 100 μl HVS13/Fc-, mCTLA-8/Fc- oder Kontroll/Fc-Protein wurden zu 5 μl/ml hinzugefügt und auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit Biotin-markiertem Anti-Human-IgG (Fc-spezifisch) gefärbt, gefolgt von PE-konjugiertem Streptavidin (Becton Dickson & Co, Mountain View, CA) in 100 μl FACS-Puffer. Dann wurden die Zellen gewaschen und mittels eines FACScan (Becton Dickson) analysiert. Ein Minimum von 5.000 Zellen wurde für jede Probe analysiert. Mehr als ein Dutzend Zelllinien wurden untersucht und man fand heraus, dass sowohl HVS13/Fc- als auch CTLA8/Fc-Fusionsproteine spezifisch an die murine Thymom-Zelllinie EL4 gebunden wurden. Diese Zellen wurden nicht an das Kontroll/Fc-Protein gebunden.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel beschreibt das Klonen des Gens, welches IL-17R kodiert. Nach der Identifizierung einer Quelle für die HVS13-Gegenstruktur, wurde mit einem autoradiographischen Objektträger-Bindungsverfahren (Gearing et al., EMBO J. 8: 3667, 1989) eine EL4-Säugetier-Expressionsbibliothek durchsucht. CV1/EBNA-Zellen wurden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), welches 10 Vol.-/Vol.-% fötales Kalbsserum (FCS) enthält, bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 10% CO2 gezüchtet und zweimal wöchentlich passiert. Sub-konfluierende CV1/EBNA-Zellmolekularschichten auf Fibronectin-behandelten Kammerslides (Labtek) wurden durch ein Chloroquin-mediiertes DEA-Dextran-Verfahren mit Plasmid-DNAs abgeleitet aus Mischtransformanten (2.000 Transformanten pro Pool) aus einer murinen EL4-cDNA-Bibliothek transfiziert.
Die mit den murinen EL4-cDNA-Pools transfizierten CV1/EBNA-Zellen wurden zwei Tage nach der Transfektion mittels [¹²⁵I]-markierter Ziegen-Anti-Human-IgG-Bindungs- und Objektträger-Autoradiographie auf eine HVS13/Fc-Bindung untersucht. Transfizierte Zellmolekularschichten wurden mit Bindungsmedium (RPMI 1640 mit 1% Rinderserumalbumin und 50 mg/ml fettfreier Trockenmilch) gewaschen und dann für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 1 μg/ml HVS13/Fc inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit ¹²⁵I-markiertem Ziegen-Anti-Human-IgG (New England nuclear, Cambridge, MA) inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit Bindungsmedium und dreimal mit PBS gewaschen und für 30 Minuten in PBS mit 2,5% Gluteraldehyd fixiert, zwei weitere Male mit PBS gewaschen und luftgetrocknet. Die Kammerslides wurden dann in lichtempfindliche Kodak-GTNB-2-Emulsion getaucht und vor dem Entwickeln für 3 Tage bei 4°C belichtet.
Vierzig Pools mit jeweils etwa 2.000 cDNAs wurden in CV1/EBNA-Zellen transfiziert. Bei zwei cDNA-Pools fand man heraus, dass sie die Bindung an HVS13/Fc-Protein übertrugen. Diese Pools wurden in Pools mit 100 cDNAs zergliedert und anschließend in einzelne Klone. Zwei einzelne cDNA-Klone wurde isoliert. Diese Klone wurden in CV1/EBNA transfiziert um zu bestimmen, ob das kodierte Protein so die Bindung sowohl an HVS13/Fc und mCTLA8/Fc überträgt. Sowohl HVS/Fc als auch mCTLA8/Fc wurden an CV1/EBNA-Zellen gebunden, welche mit der geklonten cDNA transfiziert waren, aber nicht an Zellen, welche mit einem leeren Vektor transfiziert worden waren. Das Kontroll/Fc wurde an keines von beiden gebunden.
Bei der Sequenzierung dieser Klone fand man heraus, dass sie einen 3,2-kb- und 1,7-kb-Einschluss, welcher von der gleichen mRNA abgeleitet war, enthielten. Der 3,2-kb-Klon enthielt einen offenen Leserahmen von 2595 bp, umgeben von 120 bp an der 5'-nichtkodierenden Sequenz und 573 bp der 3'-nichtkodierenden Sequenz. Es gab keine Rahmen-internen Stopp-Kodons stromaufwärts von dem vorhergesagten Initiator-Methionin, welchem ein Purin-Rest (Guanin) an der –3-Position vorangeht, dem wichtigsten Indikator einer guten Translationsinitiierungsstelle (Kozak, Mol. Cell. Biol. 9: 5134, 1989). Er besitzt außerdem ein Guanin an der +4-Position, wodurch er für die Translationsinitiierung optimal ist. Der offene Leserahmen ist für die Kodierung eines Transmembranproteins aus 864 Aminosäuren vom Typ I vorgesehen. Das Nukleotid und die vorhergesagte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR. 1 und 2 dargestellt.
Die Computeranalyse zeigte, dass das Protein ein N-terminales-Signalpeptid mit einer Spaltstelle zwischen Aminosäure 31 und 32 besitzt. Dem Signalpeptid folgen eine extrazelluläre 291-Aminosäurendomäne, eine transmembrane 21-Aminosäurendomäne und ein 521-Aminosäuren-Zytoplasmaschwanz. In der extrazellulären Domäne des Proteins gibt es acht potentielle N-gebundene Glycosylierungsstellen. Das vorgegebene Molekulargewicht für dieses Protein ist 97,8 Kilodalton mit einem geschätzten isoelektrischen Punkt von 4,85. Der Vergleich der Nukleotid- wie auch der Aminosäuresequenzen mit der GenBank- oder der EMBL-Datenbank ergab keine signifikante Homologie mit bekannten Nukleotid- und Proteinsequenzen.
Um die Zell- und Gewebsverteilung von IL-17R-mRNA zu bestimmen, wurde Poly-(A)⁺-RNA abgeleitet aus verschiedenen murinen Zelllinien oder -geweben mit der Northern-Blot-Analyse mit Hilfe der IL-17R-cDNA als Probe untersucht. Filter, welche Poly-(A)⁺-RNA (2 μg pro Spur) aus verschiedenen Geweben beinhalten, wurden von Clontech (Palo Alto, CA) erworben. Polyadenylierte RNA aus verschiedenen Zellen oder Zelllinien wurde isoliert, auf ein 1% Agarose-Formaldehydgel fraktioniert (2 μg pro Spur) und auf eine Hybond-Nylonmembran (Amersham) aufgetragen. Die Filter wurden mit einer Gegensinn-RNA-Riboprobe, welche der Kodierungsregion von IL-17R-cDNA entspricht, getestet. Die Hybridisierung wurde bei 63°C durchgeführt, gefolgt von drei Waschungen in 0,2% × SSC, 0,1% SDS bei 68°C. Die Blots wurden für 8 bis 48 Std. –70°C ausgesetzt.
Die IL-17R-Probe hybridisierte zu einer einzelnen mRNA-Spezies mit etwa 3,7 kb in allen Geweben. Bei den überprüften Geweben wurden starke Hybridisierungssignale in Milz und Niere beobachtet. Moderate Signale wurden in Lunge und Leber beobachtet, und schwächere Signale in Gehirn, Herz, Skelettmuskulatur und Hoden. mRNAs ähnlicher Größe wurden in den folgenden Zellen und Zelllinien entdeckt: fötale Leberepithelzellen (D11), Fibroblasten (3T3), Rattendarmepithelzellen (1CE6), Milz-B-Zellen, Muskelzellen (BB4), Mastzellen (H7), dreifachnegative Thymuszellen (TN), Vor-B-Zellen (70Z/3), T-Zellen-Hybridome (EL4) und T-Zellen-Klone 7C2 und D10. Bei sämtlichen getesteten Zelllinien fand man heraus, dass sie IL-17R-mRNA exprimieren, was auf eine ubiquitäre Exprimierung der IL-17R-Meldung schließen lässt.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Konstruktes zur Exprimierung eines löslichen IL-17R/Flag^®-Proteins, welches IL-17R/Flag genannt wird. IL-17R/Flag^® beinhaltet eine Leitsequenz und die Region des IL-17R von Aminosäure 1 bis Aminosäure 322 (SEQ ID NR. 1) sowie das Octapeptid, welches Flag^® (SEQ ID NR. 3) genannt wird. Das Konstrukt wird im wesentlichen wie für andere lösliche Konstrukte beschrieben durch Ligieren eines DNA-Fragmentes hergestellt, welches die Aminosäuren 1 bis einschließlich 322 von SEQ ID NR. 1 (wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt) in einen geeigneten Expressionsvektor, welcher eine geeignete Leitsequenz enthält, kodiert. Das so entstehende DNA-Konstrukt wird in eine geeignete Zelllinie wie zum Beispiel die Affennieren-Zelllinie CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) transfiziert. IL-17R/Flag^® kann mit Hilfe einer Flag^®-Antikörper-Affinitätssäule gereinigt und mit Hilfe jedes der hierin beschriebenen Verfahren auf biologische Aktivität analysiert werden.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines IL-17R-DNA-Konstruktes zum Exprimieren eines IL-17R/Fc-Fusionsproteins. Eine lösliche Form von IL-17R, verschmolzen mit der Fc-Region von humanem IgG1, wurde folgendermaßen im Säugetier-Expressionsvektor pDC409 hergestellt: ein Paar Oligonukleotidprimere mit einer Sinnsequenz und einer Gegensinnsequenz von IL-17R wurden synthetisiert. Der Sinnprimer beinhaltete eine Sal-I-Stelle am 5'-Terminus der cDNA und der Gegensinnprimer beinhaltete eine Bgl-II-Stelle und das IL-17R, abgeschnitten gerade vor der transmembranen Region und einem Stopp-Kodon. Ein 980-bp-DNA-Fragment wurde aus IL-17R-cDNA amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit Sal I und Bgl II geschnitten und in einer Dreiwege-Ligation mit einem Fragment verwendet, welches die humane IgG1-Region trägt, die mit Bgl II und Not I in ein Plasmid (pDC409; siehe USSN 08/235,397) geschnitten ist, welches zuvor mit Sal I und Not I geschnitten worden war. Der kodierte Einschluss beinhaltete die Nukleotide, welche die Aminosäuresequenz der Reste 1 bis 322 von IL-17R (SEQ ID NR. 1) kodiert. Die Sequenz wurde durch Sequenzierung der gesamten Region bestätigt.
Die IL-17R/Fc-Expressionsplasmide wurden in CV-1/EBNA-Zellen transfiziert und eine Woche lang wurden Überstände gesammelt. Die CTLA-8/Fc-Fusionsproteine wurden wie unten beschrieben auf einer Protein-A-Sepharosesäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gereinigt. Die Proteinkonzentration wurde durch eine Enzymgebundene Immunadsorptionsuntersuchung spezifisch für die konstante Domäne von humanem IgG1 und durch die BCA-Analyse (Pharmacia) bestimmt, und die Reinheit wurde durch die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoreseanalyse gefolgt von einer Silberfärbung des Gels bestätigt.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung von IL-17R-Fusionsproteinen. Das IL-17R/Fc-Fusionsprotein wird mit herkömmlichen Verfahren mit Hilfe der Protein-A- oder Protein-G-Chromatographie gereinigt. Etwa ein Liter Kulturüberstand, welcher IL-17R/Fc-Fusionsprotein enthält, wird durch Filterung von Säugetierzellenüberständen (z. B. in einem 0,45 m Filter) und das Auftragen des Filtrates auf eine Protein-A/G-Antikörper-Affinitätssäule (Schleicher und Schuell, Keene, NH) bei 4°C mit einer Fließrate von 80 ml/h für eine 1,5 cm × 12,0 cm Säule gereinigt. Die Säule wird mit 0,5 M NaCl in PBS gewaschen, bis im Waschpuffer kein freies Protein mehr nachgewiesen wird. Abschließend wird die Säule mit PBS gewaschen. Gebundenes Fusionsprotein wird mit 25 mM Citratpuffer, pH 2,8 aus der Säule eluiert und mit 500 mM Hepespuffer, pH 9,1 auf pH 7 gebracht.
Ein IL-17R-Fusionsprotein, welches Flag^® aufweist, kann auch mit Hilfe eines Antikörpers nachgewiesen und/oder gereinigt werden, welcher Flag^® bindet, wie dies im wesentlichen in Hopp et. al., Bio/Technology 6: 1204, (1988) beschrieben ist. Die biologische Aktivität wird durch die Verhinderung der CTLA-8-Aktivität in einer biologischen Untersuchung gemessen, welche die kostimulierende Wirkung von CTLA-8, zum Beispiel wie in den hierin enthaltenen Beispielen beschrieben, quantifiziert.
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen IL-17R. Präparate aus gereinigtem rekombiniertem IL-17R, zum Beispiel, oder transfizierte Zellen, welche hohe Levels IL-17R exprimieren, werden dazu eingesetzt, monoklonale Antikörper gegen IL-17R mit Hilfe herkömmlicher Verfahren, wie die in US-Patentschrift 4,411,993 offenbarten, zu erzeugen. Solche Antikörper sind wahrscheinlich von Nutzen bei der Störung der IL-17R-Bindung an CTLA-8, als Komponenten von Diagnose- oder Forschungsuntersuchungen für IL-17R oder bei der Affinitätsreinigung von IL-17R.
Um Nager zu immunisieren wird IL-17R-Immunogen in einem Adjuvans (wie komplettes oder inkomplettes Freund's Adjuvans, Alaun oder ein anderes Adjuvans, wie Ribi-Adjuvans R700 (Ribi, Hamilton, MT)) emulgiert und in Mengen in einem Bereich von 10–100 μg subkutan in einen ausgewählten Nager, zum Beispiel BALB/c-Mäuse oder Lewis-Ratten injiziert. Zehn Tage oder drei Wochen später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem Immunogen geboosted und danach periodisch nach einem wöchentlichen, zweiwöchentlichen oder dreiwöchentlichen Immunisierungszeitplan. Serumproben werden periodisch durch Retroorbital-Blutung oder Schwanzspitzen-Exzision zum Test mit dem Dot-Blot-Assay (Antibody-Sandwich), ELISA (Enzym-gebundende Immunsorbens-Untersuchung), Immunpräzipitation oder andere geeignete Untersuchungen, einschließlich der FACS-Analyse, entnommen. Nach dem Nachweis eines geeigneten Antikörper-Titers erhalten positive Tiere eine intravenöse Injektion von Antigen in Salzlösung. Drei bis vier Tage später werden die Tiere getötet, Splenozyten entnommen und mit einer murinen Myelomzelllinie (z. B. NS1 oder vorzugsweise Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]) verschmolzen. Mit diesem Verfahren hergestellte Hybridomzelllinien werden in einen Selektivnährboden (zum Beispiel einen, welcher Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin oder HAT aufweist) in Mehrfach-Mikrotiterplatten pipettiert, um die Proliferation von nicht verschmolzenen Zellen, Myelom-Myelom-Hybriden und Splenozyten-Splenozyten-Hybriden zu verhindern.
Die so erzeugten Hybridomklone können mit ELISA auf die Reaktivität mit IL-17R getestet werden, zum Beispiel durch Adaptationen der von Engvall et al., Immunochen. 8: 871 (1971) und in US-Patentschrift 4,703,004 offenbarten Verfahren. Ein bevorzugtes Testverfahren ist das von Beckman et al., J. Immunol. 144: 4212 (1990) beschriebene Antikörper-Einfangverfahren. Positive Klone werden dann in die peritonealen Höhlen syngenetischer Nager injiziert, um Aszites mit hohen Konzentrationen (> 1 mg/ml) von monoklonalem Anti-IL-17R-Antikörper zu erzeugen. Der so entstehende monoklonale Antikörper kann durch Ammoniumsulfat-Präzipitation gefolgt von Gelexklusions-Chromotographie gereinigt werden. Alternativ dazu kann auch die Affinitätschromatography auf Grundlage der Bindung des Antikörpers an das Protein A oder Protein G verwendet werden sowie die Affinitätschromatographie auf Grundlage der Bindung an das IL-17R-Protein.
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel veranschaulicht die Fähigkeit von IL-17R, die proliferative Reaktion von T-Zellen auf Mitogene zu verhindern. Lymphoidorgane wurden aseptisch entnommen und Zellsuspension hergestellt. Milz- und Lymphknoten-T-Zellen wurden aus der Zellsuspension isoliert. Die Reinheit der so entstehenden Milz-T-Zellen-Präparate war routinemäßig > 95% CD3⁺ und < 1% sIgM⁺. Gereinigte murine Milz-T-Zellen (2 × 10⁵/Well) wurden entweder mit 1% PHA oder 1 μg/ml Con A kultiviert und ein lösliches IL-17R in den Versuch getitert. Die Proliferation wurde nach 3 Tagen durch die Zugabe von 1 μCi[³H]-Thymidin bestimmt. Die Abscheidung von Zytokinen (Interleukin-2) wurde für murine T-Zellen bestimmt, die für 24 Stunden mit 1 μg/ml Con A in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 μg/ml IL-17R-Fc oder in Gegenwart eines Kontroll-Fc-Proteins kultiviert wurden. Die IL-2-Produktion wurde mit ELISA gemessen und die Ergebnisse in ng/ml hergestelltes IL-2 ausgedrückt.
Lösliches IL-17R/Fc verhinderte die Mitogen-induzierte Proliferation von gereinigten murinen Milz-T-Zellen in einer Dosis-abhängigen Art und Weise erheblich, während ein Kontroll-Fc keine Wirkung auf die murine T-Zellen-Proliferation hatte. Eine vollständige Verhinderung der Mitogen-induzierten Proliferation wurde bei einer Konzentration von löslichem IL-17R/Fc von 10 μg/ml beobachtet. Die Analyse der IL-2-Produktion durch Milz-T-Zellen, aktiviert mit Con A in Gegenwart oder Abwesenheit von IL-17R/Fc in der Kultur enthüllte, dass die Zugabe von IL-17R/Fc zur T-Zellen-Kultur die IL-2-Produktion auf Levels verhinderte, die 8–9-Fach geringer sind, als die in Kulturen beobachteten, welche das Medium allein oder das Medium plus ein Kontroll-Fc-Protein enthielten. Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, als gereinigte humane T-Zellen verwendet wurden.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel legt die Isolierung einer DNA, welche humanes IL-17R kodiert, durch speziesübergreifende Hybridisierung dar. Eine humane periphere Blutlymphozytenbibliothek wurde hergestellt und im wesentlichen wie in USSN 08/249,189 beschrieben mittels muriner IL-17R-DNA unter moderat hochstrengen Bedingungen überprüft. Man erhielt mehrere Klone unterschiedlicher Länge. Die Sequenzierungsdaten zeigten, dass das humane IL-17R auf der Nukleotidebene zu etwa 76% identisch mit dem murinen IL-17R war. Das Nukleotid und die vorausgesagte Aminosäuresequenz von humanem IL-17R ist in SEQ ID NR 10 und 11 gezeigt. Ein Plasmid (pGEMBL), welcher DNA enthält, die den humanen IL-17-Rezeptor (pGEMBL-HuIL-17R genannt) in E. coli DH10 kodiert, wurde am 5. Juni 1995 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852-1776, USA zu den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt, und ihm wurde die Zugangsnummer 69834 zugeordnet.
Das humane IL-17R besitzt viele gemeinsame Merkmale mit dem murinen IL-17R. Die Computeranalyse hat gezeigt, dass das Protein ein N-terminales-Signalpeptid mit einer Spaltstelle zwischen den Aminosäuren 27 und 28 besitzt. Dem Signalpeptid folgen eine extrazelluläre 293-Aminosäurendomäne, eine transmembrane 21-Aminosäurendomäne und ein 525-Aminosäuren-Zytoplasmaschwanz. Lösliches IL-17R umfasst das Signalpeptid und die extrazelluläre Domäne (Reste 1 bis 320 von SEQ ID NR. 1) oder ein Fragment davon. Alternativ dazu kann das ursprüngliche Signalpeptid mit einem anderen Signalpeptid ausgetauscht werden. Ein Fc-Fusionsprotein von Typ I (wobei DNA, welche die Fc-Region eines Immunglobulinmoleküls kodiert mit DNA, welche das IL-17R unmittelbar zuvor und anstelle der DNA kodiert, welche die transmembrane Region des IL-17R kodiert, verschmolzen ist) wurde im wesentlichen wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Ein lösliches hIL-17R-Protein kann auch im wesentlichen wie in Beispiel 3 expri miert werden oder durch jedes andere Verfahren der Herstellung und Exprimierung der extrazellulären Domäne von IL-17R oder einem Fragment davon.
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel legt die Lokalisierung und Feinkartierung des murinen IL-17R-Gens dar. Eine Tafel mit DNA-Proben aus einer interspezifischen Kreuzung, welche für über 900 genetische Marker über das gesamte Genom hinweg charakterisiert worden ist, wurde analysiert. Die genetischen Marker beinhalteten in dieser Kartierungsspanne zwischen 50 und 80 Zenti-Morgan auf jedem Mausautosom und dem X-Chromosom (Chr) (Saunders and Seldin, Genomics 8: 524, 1990; Watson et al., Mammalian Genome 2: 158, 1992).
Zu Beginn wurde DNA von zwei Elternmäusen [C3H/HeJ-gld und (C3H/HeJ-gld × Mus spretus) F1] mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen digeriert und mit der IL-17R-cDNA-Probe hybridisiert, um die Restriktionsfragmentlängenvarianten (RFLVs) zu bestimmen und so die Haplotypenanalyse zu ermöglichen. Es wurden informative Bgl1 RFLVs nachgewiesen: C3H/HeJ-gld, 10,0 kb; Mus spretus, 7,8 kb und 2,2 kb). Bei jeder der zurückgekreuzten Mäuse wurden entweder das C3H/HeJ-gld-Elternband oder alle drei Bänder (beide Mus spretus-Bänder und eine Halbintensitäts-C3H/HEJ-gld-Band) beobachtet, was anzeigt, dass ein einzelner Lokus erkannt wurde.
Der Vergleich der Haplotypenverteilung der IL-17R-RFLVs zeigte, dass dieses Gen in 111 der 114 meiotischen Ereignisse, welche mit dem Raf1-Gen-Lokus auf Maus-Chr. 6 untersucht wurden, kosegregierte. Die beste Genordnung (Bishop, Genet. Epidemiol. 2: 349, 1985) ± die Standardabweichung (Green, in Genetics and Probability in Animal Breeding Experiments. E. Green, ed., Macmillan, New York, S. 77–113, 1981) betrug: (Zentromer) RafI – 2.6 cM ± 1.5 cM – IL-17R – 2.5 cM ± 1.5 cM – Cd4.
BEISPIEL 10
Dieses Beispiel demonstriert, dass lösliches IL-17R die Abstoßung von Organtransplantaten in vivo unterdrückt. Herzen neonataler C57BL/6 (H-2^b) Mäuse (weniger als 24 Stunden alt) wurden im wesentlichen wie in US-Patentschrift Nr. 5,492,888, ausgegeben am 20. Februar 1996, beschrieben (unter Verwendung des Verfahrens von Fulmer et al., Am. J. Anat. 113: 273, 1963, wie von Trager et al., Transplantation 47: 587, 1989 und Van Buren et al., Transplant. Proc. 15: 2967, 1983 beschrieben angepasst) in die Ohrmuscheln von erwachsenen BALB/c (H-2^d)-Empfängern transplantiert. Die Überlebensrate der transplantierten Herzen wurde durch visuelle Überprüfung der Transplantate auf pulsierende Aktivität bewertet, die durch die Untersuchung der Ohr-Herz-Transplantate bei anästhesierten Empfängern unter einem Präpariermikroskop mit weich reflektiertem Licht beginnend an Tag 5 oder 6 nach der Transplantation bestimmt wurde. Die Zeit der Transplantatabstoßung wurde als der Tag nach der Transplantation definiert, an dem die Kontraktionsaktivität aufhörte.
In einem Experimentsatz wurden neonatale Herzen entfernt, zur Beseitigung überschüssigen Blutes mit steriler PBS gespült und in vorbereiteten Ohrmuscheln platziert. Die Empfängermäuse erhielten i. p. an den Tagen 0 bis einschließlich 3 nach der Transplantation entweder lösliches murines IL-17R/Fc (100 μg in 200 μl; siehe Beispiel 4 hierin) oder Ratten-IgG als eine Kontrolle. In einem zweiten Experimentsatz wurde den Empfängermäusen an den Tagen 0, 1 und 2 IL-17R oder humanes IgG injiziert; die Injektionsmenge und der Injektionsweg waren die gleichen wie zuvor. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1: Wirkungen von löslichem murinem IL-17R (smuIL-17R) auf die Überlebensrate neovaskularisierter, heterotoper Herzallotransplantate
Tabelle 1 zeigt, dass die Herzallotransplantate bei einzelnen Kontrollmäusen behandelt mit Ratten-IgG etwa 13 Tage überlebten. Erhielten die Allotransplantatempfänger bis zu vier tägliche Injektionen lösliches IL-17R, war das Überleben der Transplantate mit einer mittleren Überlebenszeit von 20 Tagen verlängert, was in etwa sieben Tage länger ist als die Überlebenszeit identischer Transplantate bei Kontrollmäusen. Wurde durch Einkapselung des löslichen IL-17R in Alginatperlen eine verlängerte Freisetzung von IL-17R erreicht, konnte beobachtet werden, dass eine einzige Verabreichung von 100 μg löslichem IL-17R die Transplantatüberlebenszeit auf im Großen und Ganzen die Art verlängerte, wie dies zuvor mit löslichem IL-17R in Lösung beobachtet wurde. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass lösliches IL-17R die Abstoßung von verpflanztem Gewebe unterdrückt.
BEISPIEL 11
Dieses Beispiel demonstriert, dass DNA, welche lösliches IL-17R kodiert, bei der Unterdrückung der Abstoßung von Organtransplantaten in vivo von Nutzen sein wird. Herzen neonataler C57BL/6 (H-2^b) Mäuse wurden, wie in Beispiel 10 oben beschrieben, in die Ohrmuscheln von erwachsenen BALB/c (H-2^d)-Empfängern transplantiert, außer dass den Herzen 15 μl PBS, welche entweder IL-17R/Fc-kodierende DNA (pDC409-IL17R; Beispiel 4) oder Kontroll-DNA (leeres pDC409) mit einer Konzentration von etwa 1 mg/ml enthielt, in eine Herzkammer injiziert wurde. Es wurde eine Kanüle Nr. 30 verwendet und es wurde darauf geachtet, die Verletzungen am Herz zu minimieren. Die transfizierten Herzen wurden dann in BALB/c-Empfänger transplantiert und die Uberlebensrate der Transplantate wie zuvor beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2: Wirkungen der Exprimierung von löslichem murinem IL-17R durch Herzzellen auf das Überleben neovaskularisierter heterotoper Herzallotransplantate
Tabelle 2 zeigt, dass Herzallotransplantate bei einzelnen Kontrollmäusen, denen ein Herz transfiziert mit einem leeren Vektor transplantiert worden war, etwa 15 Tage überlebten. Wurden die transplantierten Herzen mit DNA transfiziert, welche lösliches IL-17R kodiert, war die Überlebenszeit des Transplantates verlängert. Bei drei der fünf Mäuse in dieser Gruppe überlebten die Transplantate durchschnittliche etwa 24 Tage, neun Tage länger als die Überlebenszeit identischer Transplantate bei Kontrollmäusen. Die den beiden anderen Mäusen verpflanzten Transplantate pulsierten noch immer (d. h. sie waren nicht abgestoßen worden), und dass mehr als 60 Tage nach der Transplantation, und waren offensichtlich von den Empfängern angenommen worden. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Transfizieren von zu transplantierenden Geweben mit DNA, welche lösliches IL-17R kodiert, die Wirkung gegen die Abstoßung dieser Gewebe durch den Empfänger verbessert.
SEQUENZLISTE

Claims

Isolierte oder rekombinierte DNA ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA, die ein Protein kodiert, welches eine Aminosäuresequenz aus den Aminosäuren 1 bis einschließlich 322 der SEQ ID Nr. 2 enthält; (b) DNA, die ein Protein kodiert, welches eine Aminosäuresequenz aus den Aminosäuren 1 bis einschließlich 320 der SEQ ID Nr. 10 enthält; und (c) DNA, die unter stringenten Bedingungen zur Hybridisierung mit der DNA aus (a) oder (b) fähig ist, und welche IL-17R kodiert, das IL-17 bindet; und (d) DNA, die ein Fragment eines Proteins kodiert, welches von der DNA aus (a), (b) oder (c) kodiert wird, wobei das Fragment IL-17 bindet.
Isoliertes oder rekombiniertes Oligonukleotid, welches ein Fragment einer DNA nach Anspruch 1 ist, welches aus der Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden von mindestens etwa 17 Nukleotiden in der Länge, Oligonukleotiden von mindestens etwa 25 Nukleotiden in der Länge und Oligonukleotiden von mindestens etwa 30 Nukleotiden in der Länge ausgewählt ist.
Isolierte oder rekombinierte DNA ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz aus den Aminosäuren 1 bis einschließlich 322 der SEQ ID Nr. 2 kodiert; (b) DNA, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz aus den Aminosäuren 1 bis einschließlich 320 der SEQ ID Nr. 10 kodiert; (c) DNA-Moleküle, die Proteine kodieren, welche in der Aminosäuresequenz zu mindestens etwa 70% mit den Proteinen aus (a) oder (b) identisch sind, und welche IL-17 binden; und (d) DNA-Moleküle, die Fragmente von Proteinen kodieren, welche von der DNA aus (a), (b) oder (c) kodiert werden, wobei die Fragmente IL-17 binden.
Rekombinierter Expressionsvektor, welcher eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3 enthält.
Rekombinierter Expressionsvektor nach Anspruch 4, welcher ein lösliches IL-17R exprimiert.
Wirtszelle, welche mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 4 oder 5 transformiert oder transfiziert wird.
Verfahren zur Herstellung eines IL-17R-Proteins, welches das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 6 unter Bedingungen umfasst, welche die Expression und Gewinnung des IL-17R fördern.
Isoliertes und gereinigtes Interleukin-17-Rezeptor (IL-17R)-Protein, das IL-17 bindet, welches aus der Gruppe bestehend aus Folgendem ausgewählt ist: (a) Protein, das eine Aminosäuresequenz aus den Aminosäuren 1 bis einschließlich 322 der SEQ ID Nr. 2 enthält; (b) Protein, das eine Aminosäuresequenz aus den Aminosäuren 1 bis einschließlich 320 der SEQ ID Nr. 10 enthält; (c) Protein kodiert von einem DNA-Molekül, welches zur Hybridisierung zu einer DNA fähig ist, welche unter stringenten Bedingungen ein Protein aus (a) oder (b) kodiert, und welche IL-17 bindet; und (d) Fragment eines Proteins aus (a), (b) oder (c), welches IL-17 bindet.
Isoliertes und gereinigtes IL-17R-Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Protein mit einer Aminosäuresequenz aus den Aminosäuren 1 bis einschließlich 322 der SEQ ID Nr. 2; (b) Protein mit einer Aminosäuresequenz aus den Aminosäuren 1 bis einschließlich 320 der SEQ ID Nr. 10; (c) Protein mit einer Aminosäuresequenz, die mit den Aminosäuresequenzen der Proteine aus (a) oder (b) zu mindestens etwa 70% identisch ist, und welches IL-17 bindet; und (d) Fragmente der Proteine aus (a), (b) oder (c), welche IL-17 binden.
Isoliertes und gereinigtes IL-17R nach Anspruch 8 oder 9, welches lösliches IL-17R enthält.
Zusammensetzung, welche ein IL-17R-Protein nach Anspruch 8, 9 oder 10 und ein geeignetes Verdünnungsmittel oder einen geeigneten Träger enthält.
IL-17R-Protein nach Anspruch 8, 9 oder 10, oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 11 zur Verwendung bei der Regulierung einer Immun- oder Entzündungsreaktion bei einem Säuger.
Versuch zur Erkennung von IL-17, IL-17R, des Zusammenspiels von IL-17 und IL-17R, oder von Antagonisten oder Mimetika des Zusammenspiels, welcher ein IL-17R-Protein nach Anspruch 8, 9 oder 10, oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 11 und ein Erkennungsreagens aufweist.
Mit IL-17R immunreaktiver Antikörper.
Antikörper nach Anspruch 14, welcher ein monoklonaler Antikörper ist.
Protein oder Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Verwendung bei der Unterdrückung der Abstoßung eines transplantierten Organs oder transplantierten Gewebes bei einem Transplantatempfänger.
Verwendung eines IL-17R-Proteins nach Anspruch 8, 9 oder 10 bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die Unterdrückung der Abstoßung eines transplantierten Organs oder transplantierten Gewebes bei einem Transplantatempfänger.
Verwendung einer DNA, welche ein lösliches IL-17R nach Anspruch 1 oder 3 kodiert, bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die Unterdrückung der Abstoßung eines transplantierten Organs oder transplantierten Gewebes bei einem Transplantatempfänger.
Verwendung einer DNA, welche ein lösliches IL-17R nach Anspruch 1 oder 3 oder ein IL-17R-Protein nach Anspruch 8, 9 oder 10 kodiert, bei der Herstellung einer Zusammensetzung oder von Zusammensetzungen für die separate, simultane oder sequentielle Verabreichung für die Unterdrückung der Abstoßung eines transplantierten Organs oder transplantierten Gewebes bei einem Transplantatempfänger.