-
Die Erfindung bezieht sich auf ein
Verfahren zum Nachweisen von Probensubstanzen, die durch ein analytisches
Trennverfahren, wie beispielsweise Flüssigkeitschromatografie oder
Kapillarelektrophorese, getrennt wurden.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Fluoreszenzspektrometrie und Absorptionsspektrometrie
sind bekannte Verfahren zum Nachweisen von Probensubstanzen, die
aus der Trennsäule
eines Flüssigkeitschromatografen
austreten.
-
Bei der Fluoreszenzspektrometrie
wird die zu analysierende Probe mit einem Anregungslicht bestrahlt, das
die Probe zur Emission von Fluoreszenzlicht bei charakteristischen
Wellenlängen
veranlasst. Das Fluoreszenzlicht wird durch einen geeigneten Detektor
gemessen, um Informationen über
die Probe abzuleiten, insbesondere über die Zusammensetzung der
Probe und die Mengen der in der Probe vorhandenen Einzelkomponenten. Üblicherweise
wird das Anregungslicht durch ein optisches Bauelement wie beispielsweise
ein Beugungsgitter oder ein Filter ausgewählt. Das emittierte Fluoreszenzlicht
wird üblicherweise
mittels eines zweiten Beugungsgitters oder Filters ausgewählt. Zum
Ausführen
einer Fluoreszenzmessung wird das Gitter auf der Anregungsseite
des Spektrometers auf eine feste Anregungswellenlänge eingestellt
und das Wellenlängenspektrum
des Fluoreszenzlichts mittels des Gitters auf der Emissionsseite
(Emissionsgitter) aufgezeichnet. Das Emissionsspektrum kann für eine Vielzahl
von Anregungswellenlängen
aufgezeichnet werden. Alternativ hierzu kann die Emissionswellenlänge fest
eingestellt bleiben und die Anregungswellenlänge durch entsprechendes Verstellen
des Anregungsgitters variiert werden.
-
Bei der Absorptionsspektrometrie
wird ein Lichtstrahl durch die Probe geschickt. Die Wellenlängen, bei denen
die Probe die Strahlung absorbiert, sind für die Probensubstanzen charakteristisch.
Die durch die Probe tretende Strahlung wird mittels eines Beugungselements,
wie beispielsweise eines Beugungsgitters, oder eines Filters spektrometrisch
analysiert. Das gebeugte Licht wird durch ein lichtempfindliches
Element, wie beispielsweise eine Fotodiode oder durch eine Matrix
von Fotodioden, nachgewiesen. Wenn eine Fotodiode verwendet wird,
wird das Beugungselement so bewegt, dass die Strahlen verschiedener
Wellenlängen
die Fotodiode erreichen können.
Wenn eine Matrix von Fotodioden verwendet wird, kann das Beugungselement
stationär
bleiben.
-
Die oben beschriebenen spektrometrischen
Verfahren ermöglichen
es, aus dem gemessenen Spektrum durch Vergleich mit bekannten Spektren
die Art einer Probensubstanz zu bestimmen. Wenn beispielsweise bei
der Flüssigkeitschromatografie
gewünscht
wird, die Menge einer bestimmten Probensubstanz zu bestimmen, misst
man die Probenkonzentration bei einer bestimmten Wellenlänge als
Funktion der Zeit, während die
Probensubstanzen aus der Trennsäule
austreten. Die entsprechende grafische Darstellung der Konzentration über die
Zeit stellt das Chromatogramm dar. Bestimmte Probensubstanzen erscheinen
als Peaks im Chromatogramm. Die Menge einer Probensubstanz entspricht
der Fläche
ihres Peaks im Chromatogramm. Die Genauigkeit dieser Messung hängt vom
Signal-Rausch-Verhältnis des
Chromatogramms ab. Im Folgenden werden die Messungen zur Bestimmung
der Mengen von Probensubstanzen als „Quantifizierungs"-Messungen und die
Messungen zur Bestimmung der Art einer Probensubstanz durch spektroskopische
Analyse als „Qualifizierungs"-Messungen bezeichnet.
-
Bekannte Verfahren und entsprechende
Detektoren zum Nachweisen von Probensubstanzen weisen bezüglich der
Quantifizierungs- und Qualifizierungsmessungen verschiedene Beschränkungen
auf. Bei den bekannten Detektoren mit einem einzelnen Nachweiselement,
wie beispielsweise einer Fotodiode oder einer Sekundärelektronenvervielfacherröhre (SEV),
die bei Fluoreszenzspektrometern häufig verwendet werden, ist es
nur möglich,
ein Chromatogramm bei einer bestimmten Nachweiswellenlänge aufzunehmen.
Wenn ein Spektrum aufgenommen werden soll, müssen die Konzentrationen der
Probensubstanzen über
einen längeren
Zeitraum praktisch konstant bleiben. Bei der Flüssigkeitschromatografie sind
derartige Bedingungen jedoch nur selten anzutreffen.
-
ÜBERBLICK ÜBER DIE
ERFINDUNG
-
Ausgehend vom Stand der Technik ist
es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweisen von
Probensubstanzen unter Verwendung eines einzelnen Nachweiselements
bereitzustellen, bei dem zusätzlich
zu den Quantifizierungsmessungen Qualifizierungsmessungen der Probensubstanzen
durchgeführt
werden können,
ohne dass es zu nennenswerten Einbußen der Quantifizierungsgenauigkeit
kommt.
-
Eine weitere Aufgabe besteht darin,
ein Verfahren zum Nachweisen von Substanzen bereitzustellen, die
aus der Trennsäule
eines Flüssigkeitschromatografen
austreten, mit welchem ein Chromatogramm der Substanzen sowie Spektren
der austretenden Substanzen gemessen werden können, ohne das chromatografische
Signal-Rausch-Verhältnis zu
verschlechtern.
-
Diese Aufgaben werden gemäß der Erfindung
durch ein Verfahren gelöst,
das in Anspruch 1 beschrieben wird.
-
Das Spektrometer in der US-Patentschrift
A-3 637 310 verwendet ein Verfahren zum Erfassen von Daten, bei
dem unter Verwendung einer Lichtquelle 4 und eines rotierenden Dispersionselements
7 (1; Spalte 1, Zeilen 56–57) Wellenlängenbereiche
nacheinander abgetastet werden. Aus diesen Wellenlängenabläufen können bei
einer vorbestimmten Wellenlänge
einzelne Messwerte gewonnen werden, um ein Chromatogramm zu erzeugen.
-
Durch Anwenden des Verfahrens der
Erfindung ist es möglich,
Quantifizierungsinformationen (z. B. chromatografische Daten) über die
Probe sowie Qualifizierungsinformationen (spektrale Daten) zu messen auch
wenn lediglich ein einzelnes Nachweiselement benutzt wird. Es ist
wichtig, dass, obwohl zwei unterschiedliche Messungen (d. h. Quantifizierung
und Qualifizierung) während
des Strömens
der Probe durch den Detektor durchgeführt werden, die Genauigkeit
der Qualifizierungsmessung durch das Durchführen der Qualifizierungsmessung
nicht beeinträchtigt
wird. Es ist ein weiterer Vorteil der Erfindung, dass es möglich ist, spektrale
(bei mehreren Wellenlängen)
Informationen über
die Probe bei maximalem Lichtstrom zu erhalten. Das Licht wird von
den Quantifizierungs- und Qualifizierungsmessungen gemeinsam genutzt,
ohne dass beim Umschalten der Wellenlänge Licht verloren geht.
-
Gemäß einer Weiterentwicklung der
Erfindung, die bei der Flüssigkeitschromatografie
besonders brauchbar ist, werden die Qualifizierungsmessungen als
Reaktion auf ein Auslösesignal
gestartet, welches anzeigt, dass die Probensubstanz in den Detektor
gelangt ist. Dieses Auslösesignal
kann aus den gemessenen Quantifizierungsinformationen abgeleitet
werden.
-
Bei einer bevorzugten Ausführungsart
der Erfindung werden die zum Ableiten von Quantifizierungs- und
Qualifizierungsinformationen eingestellten verschiedenen Wellenlängen mittels
eines rotierenden Gitters eingestellt, und die durch die Probe geleitete
Strahlung hat die Form von Lichtimpulsen, die mit der Einstellung der
Wellenlängen
synchronisiert sind.
-
KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Im Folgenden werden Ausführungsarten
der Erfindung unter Bezug auf die Zeichnungen genauer erläutert.
-
1 ist
eine schematische Abbildung eines Fluoreszenzspektrometers gemäß einer
ersten Ausführungsart
der Erfindung.
-
2 ist
eine grafische Darstellung eines Detektorsignals einer typischen
Probenanalyse der Flüssigkeitschromatografie
als Funktion der Zeit und der Wellenlänge, um ein schematisches Beispiel
des Verfahrens der Erfindung zu veranschaulichen.
-
3 ist
eine grafische Darstellung eines Detektorsignals als Funktion der
Zeit und der Wellenlänge, um
ein praktisches Beispiel der Erfindung zu veranschaulichen.
-
4 ist
eine Darstellung des Prinzips der Erfindung, bei der eine typische
Detektorsignalkurve als Funktion der Zeit sowie ein vergrößerter Ausschnitt
dieses Signalverlaufs dargestellt wird, der die Messpunkte sowohl
der Quantifizierungsmessung als auch Qualifizierungsmessung zeigt.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
1 zeigt
schematisch eine erste Ausführungsart
eines Fluoreszenzspektrometers gemäß einer ersten Ausführungsart
der Erfindung. Die Strahlung zum Anregen von Fluoreszenzlicht wird
durch eine Blitzlichtlampe 1, beispielsweise eine kolbenförmige Xenon-Blitzlichtlampe,
bereitgestellt. Eine an die Blitzlichtlampe 1 angeschlossene Auslöseeinheit
2 umfasst die Steuerelektronik für
die Blitzlichtlampe. Die Blitzlichtlampe wird gepulst betrieben,
wobei die Emission der Lichtimpulse durch die von einer Steuerung
3 bereitgestellten Steuersignale ausgelöst wird, welche mit der Auslöseeinheit
2 verbunden ist. Der zeitliche Verlauf dieser Steuersignale wird
im Folgenden erklärt.
Typische Werte der Blitzlichtfrequenz liegen bei der vorliegenden
Ausführungsart
beispielsweise im Bereich zwischen 10 und 500 Hz. Typische Werte
der Blitzlichtdauer liegen im Mikrosekundenbereich, beispielsweise
ca. zwischen 0,3 und 2 Mikrosekunden.
-
Das von der Blitzlichtlampe 1 emittierte
Licht trifft auf einen Kondenser 4, der den von der Blitzlichtlampe
kommenden Eintrittslichtkegel in einen konvergenten Lichtkegel 5
umwandelt. In der gezeigten Ausführungsart
besteht der Kondenser 4 aus drei Linsen 4a, 4b und 4c. Die drei
Linsen bestehen vorzugsweise aus Quarz, sodass für die Fluoreszenzanregung auch
Licht im ultravioletten Bereich verwendet werden kann. Als Alternative
zu den drei Linsen 4a–4c
könnte
eine einzige sphärische
oder asphärische
Linse oder ein sphärischer
oder asphärischer
Spiegel benutzt werden. Der konvergente Lichtstrahl 5 tritt durch
eine Apertur 6 und trifft anschließend auf einen Spiegel 7. Die
Aufgabe des Spiegels 7 besteht darin, den Strahlengang so zu falten,
dass das optische System platzsparend angeordnet werden kann. Wenn
die Größe des Spektrometers unwichtig
ist, könnte
der Spiegel weggelassen werden. Der durch den Spiegel 7 reflektierte
Strahl trifft auf ein fokussierendes Beugungsgitter 8. Das Gitter
8 ist bei dieser Ausführungsart
ein konkaves holografisches Gitter. Es wird auch als Anregungsgitter
bezeichnet werden.
-
Das Gitter 8 kann um eine Rotationsachse
9 gedreht werden, die senkrecht zur Papierebene steht. Zum Ausführen der
Drehung ist das Gitter mit einem Motor 10 gekoppelt. Eine Rotationsstellung
des Gitters ist durch das gestrichelte Gitter 8' veranschaulicht. Das Gitter kann um
360 Grad gedreht werden. Während des
Betriebs des Spektrometers rotiert das Gitter ständig um die Achse 9. Eine typische
Größenordnung
der Rotationsfrequenz liegt bei etwa 80 Hz. Mit der Rotationsachse
9 ist ein Positionsgeber 11 verbunden, der ein Signal bereitstellt,
welches der augenblicklichen Winkelstellung des Gitters 8 entspricht.
Dieses Signal wird über
eine Leitung 29 der Steuerung 3 zugeführt. Von diesem Signal leitet
die Steuerung 3 Steuersignale ab, die der Auslöseeinheit 2 zum Auslösen der
Emission von Lichtimpulsen aus der Blitzlichtlampe 1 zugeführt werden.
Die Blitzfrequenz der Blitzlichtlampe 1 kann üblicherweise auf die Rotationsfrequenz
des Gitters 8 eingestellt werden.
-
Das Gitter 8 lenkt den konvergenten
gebeugten Lichtstrahl 12 in eine Probenküvette 13, durch welche die
zu analysierende Probe strömt.
Die Probe gelangt durch ein Eintrittsrohr 14, das beispielsweise
mit der Trennsäule
eines Flüssigkeitschromatografen
verbunden ist, in die Küvette.
Die Probe verlässt
die Küvette
13 durch ein Austrittsrohr 15. Anstelle eines Flüssigkeitschromatografen könnte ein
Kapillarelektrophoresegerät mit
dem Eintrittsrohr 14 verbunden sein. In beiden Fällen strömen die verschiedenen – entweder
durch den chromatografischen oder durch den elektrophoretischen
Trennprozess – voneinander
getrennten Substanzen nacheinander durch die Küvette 13.
-
Das in die Küvette 13 eintretende Anregungslicht
12 regt die Probe an, um Fluoreszenzlicht zu emittieren. Das Fluoreszenzlicht
16 wird unter einem Winkel von 90 Grad bezüglich der Richtung des Anregungslichts
12 beobachtet. Der Kegel des Fluoreszenzlichts 16 trifft auf einen
zweiten Kondenser 17 auf, der aus drei Linsen 17a, 17b und 17c besteht.
Ebenso wie bei dem oben beschriebenen Kondenser 4 könnte anstelle
der Anordnung von drei Linsen eine einzige sphärische oder asphärische Linse
oder ein sphärischer
oder asphärischer
Spiegel benutzt werden. Der den Kondenser 17 verlassende Strahl
18 tritt durch die Apertur 19 und trifft dann auf ein zweites Beugungsgitter
20. Das Gitter 20 wird auch als Emissionsgitter bezeichnet werden.
-
Das Gitter 20 kann um eine Rotationsachse
21 gedreht werden, die senkrecht zur Papierebene steht. Das Gitter
20 ist mit einem Motor 22 gekoppelt, mittels dessen es gedreht werden
kann. Eine Rotationsstellung des Gitters 20 ist durch das gestrichelte
Gitter 20' veranschaulicht.
Ein mit der Achse 21 gekoppelter Positionsgeber 23 stellt ein Signal
bereit, das der augenblicklichen Winkelstellung des Gitters 20 entspricht.
Dieses Signal wird über
eine Leitung 24 der Steuerung 3 zugeführt. Von diesem Signal leitet
die Steuerung Steuersignale ab, welche der Auslöseeinheit 2 zugeführt werden.
Das Anregungsgitter 8 und das Emissionsgitter 20 sowie die zugehörigen Antriebsmotoren
und Stellungscodierer besitzen in der vorliegenden Ausführungsart
im Wesentlichen denselben Aufbau.
-
Die vom Emissionsgitter 20 kommende
gebeugte Strahlung 24 wird auf eine Apertur 25 fokussiert und fällt dann
auf eine Sekundärelektronenvervielfacherröhre 26,
welche ein elektrisches Ausgangssignal bereitstellt, das der Intensität der auf
den SEV 26 fallenden Strahlung 24 entspricht. Das Ausgangssignal
des SEV 26 wird einer Datenverarbeitungs- und -speichereinheit 27
zugeführt,
wo die Daten in einer im Folgenden genauer beschriebenen Weise verarbeitet
werden. Die Messung gemäß der Erfindung
liefert drei Ergebnisse:
- 1. ein Chromatogramm,
d. h. eine Darstellung der Menge von Probensubstanzen als Funktion
der Zeit;
- 2. Fluoreszenzspektren, d. h. Darstellungen der Intensität von Fluoreszenzlicht
als Funktion der Wellenlänge;
und
- 3. Fluoreszenzspektren wie in 2., jedoch zusätzlich als Funktion der Zeit.
-
Das Chromatogramm sowie die Fluoreszenzspektren
können
auf einer Anzeigeeinheit 28, wie beispielsweise einer Katodenstrahlröhre, dargestellt
und/oder durch einen Drucker ausgedruckt werden. Die Datenverarbeitungs-
und -speichereinheit 27 ermöglicht
es auch, die Chromatogramme und Fluoreszenzspektren zu speichern
und kann optional eine elektronische Bibliothek mit einer Sammlung
von Fluoreszenzspektren von verschiedenen Substanzen umfassen, um
die Identifizierung der Proben durch Vergleich mit den gemessenen
Fluoreszenzspektren zu erleichtern.
-
Als Alternative zum SEV 26 könnte eine
Lawinen-Fotodiode oder ein Detektor vom CCD-Typ (charge coupled
device, ladungsgekoppeltes Bauelement) oder ein Detektor vom Typ
der verstärkten
Fotodiodenmatrizen (microchannel plates) eingesetzt werden.
-
Im Folgenden werden einige Beispiele
für das
Verfahren der Erfindung erklärt,
die mit der in 1 gezeigten Vorrichtung
ausgeführt
werden können.
Im Folgenden wird angenommen, dass während der Messung entweder
das Anregungsgitter 8 oder das Emissionsgitter 20 stationär bleibt,
sodass entweder das in die Küvette
13 gelangende Anregungslicht 12 oder das auf die SEV-Röhre 26 fallende
Licht 24 eine feste Wellenlänge
aufweist.
-
Beim ersten Beispiel wird angenommen,
dass sich das Emissionsgitter 20 bei einer festen Winkelstellung
befindet, sodass das durch den SEV 26 empfangene Licht eine durch
einen Benutzer auswählbare
feste Wellenlänge
besitzt. Das Anregungsgitter 8 rotiert um seine Achse 9. Die Erzeugung
von Lichtimpulsen durch die Blitzlichtlampe 1 in Abhängigkeit
von der Winkelstellung des Gitters 8, welche durch den Positionsgeber
11 erfasst wird, wird durch die Steuerung 3 gesteuert. Dadurch ist
es möglich,
aufeinander folgende Lichtimpulse mit unterschiedlichen Wellenlängen zu
erzeugen. Gemäß einem
wichtigen Aspekt der Erfindung werden während des Durchströmens der
Probensubstanz durch die Strömungszelle
13 mehrere Messungen bei einer festen Wellenlänge durchgeführt, um
ein Chromatogramm abzuleiten, und weitere Messungen bei einer Vielzahl von
unterschiedlichen Wellenlängen
durchgeführt,
um ein Spektrum der Probensubstanz in der Strömungszelle abzuleiten. Das
wird dadurch erreicht, dass die Blitzlichtlampe immer dann ausgelöst wird,
wenn sich das Gitter bei einer der festen Wellenlänge entsprechenden
Winkelstellung befindet, bzw. wenn sich das Gitter bei Winkelstellungen
befindet, die den Wellenlängen
entsprechen, welche das Spektrum bilden.
-
Die zu verschiedenen Zeitpunkten
bei der festen Wellenlänge
erhaltenen Messwerte bilden ein Chromatogramm, und die während des
Durchströmens
einer Probensubstanz durch die Probenküvette erhaltenen Messwerte
bilden ein Spektrum dieser Probensubstanz. Das Chromatogramm wird üblicherweise über eine Zeitdauer
von mehreren Minuten aufgezeichnet und umfasst mehrere Peaks, wobei
der Zeitpunkt, an dem ein bestimmter Peak im Chromatogramm erscheint,
für die
diesem Peak entsprechende Substanz charakteristisch ist. Ein Spektrum
einer bestimmten Probensubstanz wird über einen kürzeren Zeitraum hinweg aufgezeichnet, der üblicherweise
im Sekundenbereich liegt oder kürzer
ist. Ein Spektrum wird während
eines chromatografischen Peaks aufgezeichnet. Die Erzeugung eines
Spektrums wird vorzugsweise durch das Erscheinen eines chromatografischen
Peaks ausgelöst,
d. h., wenn sich gerade eine Probensubstanz in der Strömungszelle
befindet. Es wäre
auch möglich,
spektrale Informationen während
der gesamten Aufzeichnung eines Chromatogramms aufzuzeichnen.
-
Um das obige Prinzip zu veranschaulichen,
wird im Folgenden eine typische zeitliche Folge von Messpunkten
aufgeführt.
Die 71 Messpunkte werden nacheinander erfasst, wobei zwischen den
aufeinander folgenden Messpunkten gleiche zeitliche Abstände liegen.
Die Messpunkte von ca. Nummer 30 bis ca. Nummer 50 werden aufgezeichnet,
wenn ein chromatografischer Peak erscheint, d. h., wenn eine Probensubstanz durch
die Küvette
strömt.
In der folgenden Tabelle sind die Nummern der Messpunkte und die
bei diesem Messpunkt eingestellte entsprechende Wellenlänge aufgeführt. Außerdem wird
in der letzten Spalte der Tabelle angezeigt, ob der Messpunkt zum
Erzeugen eines Chromatogramms oder zum Erzeugen eines Spektrums
verwendet wird. Im ersten Fall wird der Messpunkt als „Quantifizierungs"-Messpunkt (Zeit),
im zweiten Fall als „Qualifizierungs-"Messpunkt klassifiziert.
-
-
-
Die durch den SEV 26 bei den Quantifizierungsmesspunkten
gemessenen Intensitätswerte
werden zum Erstellen eines Chromatogramms verwendet, d. h. die Werte
bei den Punkten 1 bis 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 und 50
bis 71. Die Intensitätswerte
entsprechen den Konzentrationswerten der Probe in der Probenküvette. Das
Chromatogramm kann dazu verwendet werden, die Mengen von Probensubstanzen
zu bestimmen, indem die Bereiche der einzelnen Peaks im Chromatogramm
ermittelt werden. Aus diesem Grunde werden die Messpunkte als „Quantifizierungsmesspunkte" bezeichnet. Die
Intensitätswerte
bei den Messpunkten 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 und 49 werden
dazu verwendet, ein Spektrum der Probensubstanz zu erstellen, welche
dem Peak im Chromatogramm entspricht. Beim vorliegenden Beispiel
erhält
man ein Spektrum im Wellenlängenbereich
von 300–380
nm, wobei die Messpunkte einen Abstand von 10 nm voneinander aufweisen. Während der
chromatografische Peak durchläuft
(Messpunkte 30–50),
werden die Quantifizierungs- und Qualifizierungsmesspunkte abwechselnd
aufgezeichnet, sodass nach jedem Quantifizierungsmesspunkt (bei
310 nm) ein Qualifizierungsmesspunkt aufgezeichnet wird. Wie oben
bereits erläutert,
wird dies durch eine geeignete zeitliche Steuerung der Emission
der Lichtimpulse in Abhängigkeit
von der Winkelstellung des Gitters erreicht. Das Ergebnis der Messung
sind ein Chromatogramm und ein Spektrum, die durch die Einheiten
27 und 28 gespeichert und angezeigt werden können. Liegen im Chromatogramm
mehrere Peaks vor (entsprechend mehreren Probensubstanzen), so erhält man für jeden
Peak ein anderes Spektrum.
-
Um die Intensitätsänderung während eines chromatografischen
Peaks zu berücksichtigen,
kann eine Normalisierungsprozedur wie folgt ausgeführt werden:
Die Werte bei den Qualifizierungsmesspunkten werden normalisiert,
indem diese Werte jeweils durch die Werte bei dem Quantifizierungsmesspunkt
unmittelbar vor dem Qualifizierungsmesspunkt dividiert werden. Bei
diesem Beispiel erhält
man die folgenden normalisierten Qualifizierungswerte:
bei
300 nm: (Wert bei Punkt 33)/(Wert bei Punkt 32)
bei 310 nm:
(Wert bei Punkt 35)/(Wert bei Punkt 34)
bei 320 nm: (Wert bei
Punkt 37)/(Wert bei Punkt 36)
bei 330 nm: (Wert bei Punkt 39)/(Wert
bei Punkt 38)
bei 340 nm: (Wert bei Punkt 41)/(Wert bei Punkt
40)
bei 350 nm: (Wert bei Punkt 43)/(Wert bei Punkt 42)
bei
360 nm: (Wert bei Punkt 45)/(Wert bei Punkt 44)
bei 370 nm:
(Wert bei Punkt 47)/(Wert bei Punkt 46)
bei 380 nm: (Wert bei
Punkt 49)/(Wert bei Punkt 48)
-
Anstatt durch die Werte beim Quantifizierungsmesspunkt
unmittelbar vor dem Qualifizierungsmesspunkt zu dividieren, könnte man
auch durch den Wert beim Quantifizierungsmesspunkt unmittelbar nach
dem Qualifizierungsmesspunkt dividieren, oder man könnte den
Mittelwert der beiden Divisionen verwenden. Wenn die für das Aufnehmen
eines Spektrums im Vergleich zu Dauer des chromatografischen Peaks
sehr kurz ist, ist eine Normalisierung nicht erforderlich.
-
Bei dem oben beschriebenen Verfahren
der Erfindung sind die Messwerte in denjenigen Bereichen des Chromatogramms,
in denen keine Peaks vorkommen, d. h. im Untergrundrauschen, dieselben
wie bei Verfahren zum Aufzeichnen eines Chromatogramms nach dem
Stand der Technik. Im Bereich eines Probenpeaks gehen im Vergleich
zu den Verfahren nach dem Stand der Technik einige Werte verloren,
da sowohl Quantifizierung- als auch Qualifizierungsmesspunkte aufgezeichnet
werden, aber es hat sich gezeigt, dass sich dies auf die Reproduzierbarkeit
der Peakfläche
nur geringfügig
auswirkt. Die Quantifizierungsgenauigkeit ist etwa dieselbe wie
bei chromatografischen Messungen nach dem Stand der Technik, die
bei einer einzigen Wellenlänge
messen, während
der deutliche Vorteil entsteht, dass man spektrale Informationen
zur qualitativen Bewertung der Probe erhält.
-
Bei einem praktischen Beispiel der
Erfindung beträgt
der zeitliche Abstand zwischen aufeinander folgenden Messungen 12,5
Millisekunden, was einer Rotationsfrequenz des Gitters von 80 Hz
entspricht. Bei einer typischen HPLC-Analyse (high performance liquid
chromatography, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie)
beträgt
die kleinste Peakbreite (Zeitspanne bei der halben Höhe des chromatografischen
Peaks) etwa 1 Sekunde. Daher werden, wenn die Messung von Qualifizierungswerten
bei der halben Höhe
des chromatografischen Peaks beginnt, mindestens 80 Datenpunkte
gemessen. Wenn davon eine Hälfte
zur chromatografischen Messung (Quantifizierung) und eine Hälfte für die Messung
des Spektrums verwendet werden, stehen für die Messung des Spektrums
mindestens 40 Punkte zur Verfügung.
Beispielsweise kann man im Bereich von 300 nm bis 456 nm alle 4
nm einen Punkt messen, um ein Spektrum der Probe aufzunehmen. Die
Messung der Qualifizierungswerte kann auch eher als bei der halben
Höhe des
chromatografischen Peaks beginnen: Wenn die Messung des Spektrums
bei einem Viertel der Peakhöhe
beginnt, kann man bei einer Peakbreite von 1 Sekunde etwa 60 Werte
für die
Messung des Spektrums erhalten. Die Peakbreite der meisten chromatografischen
Peaks ist deutlich größer als
1 Sekunde, sodass eine große
Anzahl von chromatografischen und spektralen Messwerten erfasst
werden kann, wodurch eine genaue Quantifizierung sowie Qualifizierung
der Probe ermöglicht
wird.
-
Wie bereits erwähnt, beginnt die Aufzeichnung
von Qualifizierungsmesswerten (Spektrum) erst dann, wenn wirklich
ein Probenpeak im Chromatogramm erscheint. Der Auslösepunkt
für den
Beginn der Qualifizierungsmessung kann auf unterschiedliche Art
erzeugt werden.
-
Gemäß einer ersten Alternative
wird der Auslösepunkt
durch die Datenverarbeitungsund -speichereinheit 27 unter Verwendung
der chromatografischen Daten berechnet. Der Auslösepunkt kann erzeugt werden, wenn
die chromatografischen Messwerte größer als ein vorbestimmter Schwellwert
werden, wodurch angezeigt wird, dass die ansteigende Flanke eines
Peaks vorliegt.
-
Alternativ könnte ein Ableitungs-Schwellwert
verwendet werden, der intelligent ist und den Beginn eines Probenpeaks
erkennen kann. Der Auslösepunkt
wird erzeugt, wenn der Anstieg der chromatografischen Messkurve
größer als
ein vorbestimmter Wert wird.
-
Bei einer weiteren Ausführungsart
kann der Auslösezeitpunkt
einfach durch den Benutzer festgelegt werden.
-
Wenn die Retentionszeiten der Probenpeaks
ziemlich konstant sind, kann der Auslösepunkt für den Beginn der Erfassung
von Spektraldaten einfach durch eine Zeitwertetabelle erzeugt werden,
in der die Retentionszeiten für
die zu analysierenden Substanzen enthalten sind und die die Datenerfassung
jeweils zu diesen Zeitpunkten starten.
-
Die Verwendung eines Auslösesignals
zum Starten der Spektraldatenerfassung besitzt den Vorteil, dass
nur interessierende Messwerte aufgezeichnet werden, sodass der Umfang
der von der Datenverarbeitungseinheit zu verarbeitenden Daten auf
ein Minimum beschränkt
wird.
-
Im Folgenden werden einige Abwandlungen
des oben beschriebenen Verfahrens erläutert. Bei dem oben beschriebenen
Verfahren folgt nach einer Messung bei einer festen Wellenlänge (FIX)
zur Quantifizierung eine Messung bei einer Wellenlänge zur
Qualifizierung. Ein Beispiel der zeitlichen Folge der Messpunkte sähe dann
wie folgt aus: (..., FIX, 300 nm, FIX, 310 nm, FIX, 320 nm, FIX,
330 nm, FIX, 340 nm, FIX, ...).
-
Gemäß einer Alternative kann man
die Spektraldaten bei jeder Wellenlänge öfter als einmal messen. Auf
diese Weise wird eine verbesserte Datenfilterung und eine erhöhte Reproduzierbarkeit
erreicht. Eine mögliche
zeitliche Folge ist:
(..., FIX, 300 nm, FIX, 300 nm, FIX, 310
nm, FIX, 310 nm, FIX, 320 nm, ...).
-
Eine weitere und noch bessere Möglichkeit
ist:
(..., FIX, 300 nm, FIX, 310 nm, FIX, 320 nm, FIX, 330
nm, ..., FIX, 490 nm, FIX, 500 nm, FIX, 490 nm, FIX, 480 nm, FIX,
..., 320 nm, FIX, 310 nm, FIX, 300 nm). Den endgültigen spektralen Messwert
für eine
bestimmte Wellenlänge
erhält
man durch Bilden des Mittelwert aus mehreren Messwerten bei dieser
Wellenlänge.
Es ist klar, dass der interessierende Wellenlängenbereich zum Erzeugen eines
Spektrums (im letzten Beispiel: 300–500 nm) generell von dem zu
analysierenden Probenpeak abhängt.
-
Die Erfindung ist nicht auf Fluoreszenzmessungen
beschränkt,
sondern kann auch in Verbindung mit Absorptionsmessungen eingesetzt
werden. Bei Absorptionsmessungen wird der Lichtstrahl durch die
Probenküvette
geschickt und der die Küvette
verlassende Strahl durch ein Beugungselement, üblicherweise ein Gitter, spektral
abgetrennt. Die spektral abgetrennte Strahlung trifft dann auf einen
Detektor. Die Erfindung ist von besonderem Vorteil, wenn der Detektor
aus einem einzelnen lichtempfindlichen Element, zum Beispiel einer
einzelnen Fotodiode, besteht. In diesem Fall rotiert das im Strahlengang
vor dem Detektor angeordnete Beugungsgitter, und die Emission von
Lichtimpulsen aus einer Blitzlichtlampe wird bei bestimmten Winkelstellungen
des Gitters ausgelöst,
welche bestimmten durch den Detektor nachzuweisenden Wellenlängen entsprechen.
Ebenso wie bei den Ausführungsarten
der Erfindung bezüglich
Fluoreszenzmessungen wird eine feste Wellenlänge ausgewählt, bei der quantitative Messwerte
erfasst werden, um ein Chromatogramm (Quantifizierung) zu erstellen.
Außerdem
werden Messwerte bei einer Reihe verschiedener Wellenlängen erfasst,
um ein Absorptionsspektrum (Qualifizierung) zu erstellen.
-
2 ist
eine weitere Veranschaulichung eines Beispiels für das Verfahren der Erfindung. 2 zeigt schematisch für eine typische Probenanalyse
mittels Flüssigkeitschromatografie
das Detektorsignal als Funktion von Zeit und Wellenlänge. Die
horizontale Achse ist die Zeitachse, auf der die seit dem Einspritzen
der Probe in die Trennsäule
vergangene Zeit aufgetragen ist. Die vertikale Achse ist die Wellenlängenachse,
auf der die zum Nachweis verwendete Wellenlänge aufgetragen ist. Im Fall
eines Fluoreszenzspektrometers kann diese Wellenlänge entweder
die Emissions- oder die Anregungswellenlänge sein. Im Fall von Absorptionsmessungen
ist die Wellenlänge
die Absorptionswellenlänge.
Die Intensität
des Detektorsignals in der grafischen Darstellung von 2 wird durch unterschiedliche Graustufen veranschaulicht.
Die helleren Bereiche, wie beispielsweise Bereich 65, zeigen Bereiche
mit niedriger Intensität,
und die dunkleren Bereiche, wie beispielsweise Bereich 66, stellen
Bereiche mit hoher Intensität
dar. 2 entspricht einer dreidimensionalen
Darstellung der Intensität über der
Zeit und der Wellenlänge,
die auch als „Iso-Diagramm" bezeichnet wird.
-
Die in 2 mit „X" gekennzeichneten
Punkte entsprechen den Messpunkten, bei denen Messwerte gemäß dem Verfahren
der Erfindung erhalten wurden. Sämtliche
in der horizontalen Reihe 67 angeordneten Messpunkte wurden zu verschiedenen
Zeitpunkten bei einer festen Wellenlänge (in diesem Beispiel 420
nm) erhalten und stellen somit ein Chromatogramm dar. Die in den
schrägen
Reihen, wie beispielsweise Reihe 68, 69 oder 70, angeordneten Messpunkte
wurden bei unterschiedlichen Wellenlängen erhalten und stellen dementsprechend
ein Spektrum dar. Wie in 2 gezeigt
ist, liegen die Messpunkte Ausführung
den schrägen
Reihen 68 und 70 jeweils im Bereich von chromatografischen Peaks,
während
die Messpunkte auf der Reihe 69 in einem Bereich liegen, in der überhaupt
kein Messsignal von einer Probensubstanz vorliegt. Um die Datenmenge
zu reduzieren, könnten
daher die Messpunkte auf der Reihe 69 auch weggelassen werden. In
diesem Fall würde
man ein Auslösesignal
in der oben beschriebenen Weise verwenden, um erst dann mit dem
Aufnehmen von Spektraldaten zu beginnen, wenn ein chromatografischer
Peak vorliegt.
-
3 ist
eine grafische Darstellung ähnlich
der in 2, welche ein Beispiel eines
durch einen Peak ausgelösten
Spektrums zeigt. Das Auslösen
geschieht zum Zeitpunkt T. Ab diesem Zeitpunkt werden zusätzlich zu
den „chromatografischen" Daten (horizontale
Reihe) auch spektrale Daten (schräge Reihe) gemessen.
-
4 ist
eine weitere Veranschaulichung des Prinzips der Erfindung. Die untere
Hälfte
von 4 ist eine grafische Darstellung
des Detektorsignals über
die Zeit, während
die obere Hälfte
einen vergrößerten Ausschnitt
der Messkurve im Peakbereich zeigt. Der vergrößerte Ausschnitt zeigt die
einzelnen Messpunkte im Peakbereich, wobei A die Messpunkte bei
einer festen Wellenlänge
von 300 nm und B die Messpunkte bei verschiedenen Wellenlängen bezeichnet.
Die bei Messpunkten A erhaltenen Messwerte werden für die Quantifizierung,
d. h. zum Erstellen eines Chromatogramms, und die bei Messpunkten
B erhaltenen Messwerte für die
Qualifizierung, d. h. zum Erstellen eines Spektrums, verwendet.
Die Zeitabstände
der Messpunkte entsprechen einer Abtastrate von 80 Hz. Die Anzahl
der in 4 gezeigten Messpunkte entspricht
einem tatsächlichen
praktischen Beispiel, während 2 diesbezüglich nur schematisch ist,
da die Anzahl der in 2 gezeigten Messpunkte
(„X") kleiner als die
Anzahl von Messungen ist, die man in der Praxis gewöhnlich wählen würde.
-
Die Erfindung kann auch in Verbindung
mit einer in der Küvette
stillstehenden Probe angewendet werden. In diesem Fall wird die
Probe beispielsweise mit einer Spritze in die Küvette gefüllt. Das Verhältnis von Anregungsspektrum
zu Emissionsspektrum der ungekannten Probe in der Küvette kann
man in sehr kurzer Zeit erhalten. Auf diese Weise ist es möglich, eine
grafische Darstellung der Intensität als Funktion der Anregungswellenlänge sowie
der Emissionswellenlänge
zu erzeugen. Aus einer derartigen 3D-Kurve kann man Informationen über die
verschiedenen Probenkomponenten ableiten.
-
Es ist klar, dass die Erfindung nicht
auf die oben beschriebenen Beispiele beschränkt ist und dass an ihr zahlreiche
Abwandlungen vorgenommen werden können. Zum Beispiel kann die
Lichtquelle ein gepulster Laser oder eine andere Quelle sein, die
Strahlungsimpulse emittieren kann. Auch eine Dauerstrichlichtquelle (direct
current, DC) könnte
verwendet werden, aber dann geht das Licht, das während des
Umschaltens von einer Wellenlänge
zu einer anderen emittiert wird, normalerweise verloren. Wenn jedoch
Verfahren zum schnellen Schalten von Wellenlängen, z. B. akustisch durchstimmbare
Filter, eingesetzt werden, kann eine Dauerstrichlichtquelle ohne
weitere Nachteile verwendet werden. Anstelle eines Beugungsgitters
könnte
ein elektrisch oder akustisch durchstimmbares Filter oder Prisma
als Beugungselement verwendet werden. Die lichtempfindlichen Elemente
zum Empfangen der Strahlung von der Probenküvette können zum Beispiel Lawinen-Fotodioden,
CCD-Bauelemente, Diodenmatrizen oder verstärkte Fotodiodenmatrizen (microchannel plates)
sein. Die Erfindung kann in Verbindung mit Flüssigkeitschromatografie oder
Kapillarelektrophorese oder anderen analytischen Trennverfahren
verwendet werden, bei denen die Probensubstanzen in der zeitlichen
Aufeinanderfolge nachgewiesen werden.