DE69628921T2

DE69628921T2 - Verfahren zur modulation der t-zell-überlebensrate durch von bcl-xl protein-spiegels

Info

Publication number: DE69628921T2
Application number: DE69628921T
Authority: DE
Inventors: H. Carl JUNE; B. Craig THOMPSON
Original assignee: Arch Development Corp; US Department of Navy
Current assignee: Arch Development Corp; US Department of Navy
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2016-05-03
Also published as: JPH11504814A; DE69628921D1; JP2008101003A; ATE393634T1; CA2220012A1; CA2220012C; EP0826043B1; WO1996034956A1; ATE244305T1; AU5673496A; EP0826043A1

Description

Förderung durch die Regierung
Die hierin beschriebene Arbeit wurde zum Teil durch NIH-Förderung PO1 AI35294 und NMRDC-Förderung 61153N AE.4120.001.1402 unterstützt. Die US-Regierung kann daher bestimmte Rechte an der Endung haben.
Hintergrund der Erfindung
Die Steuerung des Überlebens peripherer T-Zellen ist für die Aufrechterhaltung eines wirksamen peripheren Immunrepertoires entscheidend. Einige Aspekte des Überlebens von T-Zellen scheinen mit dem Status der T-Zell-Aktivierung verbunden zu sein. T-Zell-Aktivierung wird durch die Beteiligung des T-Zell-Rezeptor/CD3-Komplexes (TCR/CD3) über ein Peptid-Antigen ausgelöst, das an ein Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Molekül auf der Oberfläche einer Antigen präsentierenden Zelle gebunden ist (Schwanz, R. H. (1990) Science 248, 1349). Dies ist nur das erste Signal zur T-Zell-Aktivierung, zur vollständigen Aktivierung sind weitere Rezeptor-Ligand Interaktionen zwischen APCs und T-Zellen notwendig. Zum Beispiel kann TCR-Stimulation bei Abwesenheit anderer molekularer Interaktionen einen Anergiestatus induzieren, so dass die Zellen auf vollständige Aktivierungssignale bei Restimulation nicht reagieren können (Schwanz, R. H. (1990) Science 248, 1349; Harding, F. A., McArthur, J. G., Gross, J. A., Raulet, D. H. and Allison, J. P. (1992) Nature 356, 607). Alternativ wurde gezeigt, dass T-Zellen durch programmierten Zelltod (PCD) sterben, wenn sie durch TCR-Beteiligung allein aktiviert werden (Webb, S., Morris, C. und Sprent, J. (1990) Cell 63, 1249; Kawabe, Y. und Ochi, A. (1991) Nature 349, 245; Kabelitz, D. und Wesselborg, S. (1992) Int. Immunol. 4, 1381; Groux, H., Monte, D., Plouvier, B., Capron, A. und Ameisen, J-C. (1993) Eur. J. Immunol. 23, 1623).
Es gibt zahlreiche Rezeptor-Ligand Interaktionen, die zwischen der T-Zelle und der APC stattfinden. Viele Interaktionen sind adhäsiver Natur und verstärken den Kontakt zwischen den beiden Zellen ((Springer, T. A., Dustin, M. L., Kishimoto, T. K. und Marlin, S. D. (1987) Annul. Rev. Immunol. 5, 223), während andere Interaktionen zusätzliche Aktivierungssignale auf die T-Zelle übertragen (Bierer, B. E. und Burakoff, S. J. (1991) Adv. Cancer Res. 56, 49). Es wurde gezeigt, dass CD28, ein Oberflächen-Glycoprotein, das auf 80% der peripheren T-Zellen beim Menschen vorhanden ist, ein wichtiger costimulierender Rezeptor ist (June, C. H., Bluestone, J. A., Nadler, L. M. und Thompson, C. B. (1994) Immunol. Today 15, 321; Linsley, P. S., Ledbetter, J. A. (1993) Annu. Rev. Immunol. 11, 191). Ein costimulierendes Signal wird durch CD28 übertragen, wenn T-Zellen auf eine Antigen präsentierende Zelle treffen, die einen der CD28-Liganden B7-1 oder B7-2 exprimiert.
Es wurde gezeigt, dass Costimulation von T-Zellen zahlreiche Aspekte der T-Zell-Aktivierung betrifft (June, C. H., Bluestone, J. A., Nadler, L. M. und Thompson, C. B. (1994) Immunol. Today 15, 321). Costimulation senkt die Konzentration von anti-CD3, er benötigt wird, um eine proliferative Reaktion in der Kultur auszulösen (Gimmi, C. D., Freeman, G. J., Gribben, J. G., Sugita, K., Freedman, A. S., Morimoto, C. und Nadler, L. M. (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6575). CD28-Costimulation verstärkt auch durch transkriptionale und post-transkriptionale Regulation der Genexpression die Produktion von Lymphokinen durch T-Helferzellen erheblich (Lindsten, T., June, C. H., Ledbetter, J. A., Stella, G. und Thompson, C. B. (1989) Science 244, 339; Fraser, J. D., Irving, B. A., Crabtree, G. R. und Weiss, A. (1991) Science 251, 313), und kann das zytolytische Potential von zytotoxischen T-Zellen aktivieren. Hemmung der CD28-Costimulation in vivo kann die Abstoßungsreaktion von Heterotransplantaten blockieren, und die Abstoßung von Homotransplantaten wird signifikant verzögert (Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S. und Bluestone, J. A. (1992) Science 257, 789; Turka, L. A., Linsley, P. S., Lin, H., Brady, W., Leiden, J. M., Wei, R-Q., Gibson, M. L., Zheng, X-G., Mydral, S., Gordon, D., Bailey, T., Bolling, S. F. und Thompson, C. B. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89, 11102). Zusätzlich erleichtert die Transfektion von B7 in eine Tumorzelllinie die Erkennung und Prävention von Tumorwachstum (Chen, L., Ashe, S., Brady, W. A., Hellstrom, I., Hellstrom, K. E., Ledbetter, J. A., McGowan, P. und Linsley, P. S. (1992) Cell 71, 1093; Townsend, S. E. und Allison, J. P. (1993) Science 259, 368).
Bisher war relativ wenig darüber bekannt, wie das Überleben peripherer T-Zellen gesteuert wird. Untersuchungen legen nahe, dass Mitogen-Aktivierung der T-Zellen ihre Widerstandskraft gegen den programmierten Zelltod (PCD) verstärkt, der durch Behandlung mit Mitteln wie Bestrahlung ausgelöst wurde (Schrek, R. und Stefani, S. (1964) J. Nat. Cancer Inst. 32, 507; Lowenthal, J. W. und Harris, A. W. (1985) J. Immunol. 135, 1119; Stewart, C. C., Stevenson, A. P. und Habbersett, R. C. (1988) J. Radiat. Biol. 53, 77). Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass die Zellaktivierung durch den TCR allein die Anfälligkeit der T-Zellen, einem PCD zu unterliegen, erhöht (Kabelitz, D. und Wesselborg, S. (1992) Int. Immunol 4, 1381; Groux, H., Monte, D., Plouvier, B., Capron, A. und Ameisen, J-C (1993) Eur. J. Immunol. 23, 1623).
Kürzlich wurden mehrere Gene identifiziert, die bei der Kontrolle des Überlebens von T-Zellen eine Rolle zu spielen scheinen. Das Überleben von ruhenden Lymphocyten in der Maus hängt von der Expression des bcl-2-Gens ab (Nakayama, K-I., Nakayama, K., Negishi, I., Kuida, K., Shinkai, Y., Louie, M. C., Fields, L. E., Lucas, P. J., Stewart, V., Alt, F. W. und Loh, D. Y. (1993) Science 261, 1584). Tiere, denen es am bcl-2-Gen mangelt, haben T-Zellen mit einer erhöhten Anfälligkeit, einem PCD zu unterliegen, wenn sie in Kultur genommen werden. Tiere mit einem Bcl-2-Mangel bekommen innerhalb der ersten Lebenswochen eine schwere Lymphopenie (Veis, D. J., Sorenson, C. M., Shutter, J. R. und Korsmeyer, S. J. (1993a) Cell 75, 229). Im Gegensatz dazu sind Tiere mit Mutationen im Fas-Zelloberflächenrezeptor nicht in der Lage, die Immunzellen zu beseitigen, die im Zuge einer Immunantwort erzeugt werden (Watanabe-Fukunaga, R., Brannan, C. L, Copeland, N. G., Jenkins, NA. und Nagata, S. (1992) Nature 356, 314). Tiere mit Fas-Mangel entwickeln schließlich eine schwere Autoimmunkrankheit. Diese Daten legen nahe, dass das Überleben von T-Zellen möglicherweise ebenso streng wie die T-Zell-Proliferation reguliert ist.
Unangemessene Regulierung des T-Zell-Todes kann zu Störungen des Immunsystems führen (z. B. Immunschwäche oder Autoimmunität). Darüber hinaus führt die Infektion von T-Zellen mit bestimmten infektiösen Mikroorganismen zur Abtötung der T-Zellen. Besonders die Infektion von T-Zellen mit dem menschlichen Immunschwäche-Virus (HIV) führt zum durch programmierten Zelltod ausgelösten Tod der Zellen (Gougon, M.-L. und Montagnier, L. (1993) Science 260, 1269). Es werden daher Verfahren zur Steuerung des T-Zell-Todes und besonders zur Hemmung eines solchen Todes benötigt.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung liefert in vitro Verfahren und Anwendungen zur Modulation des Überlebens von T-Zellen und besonders zum Schutz einer T-Zelle vor Zelltod. Die Verfahren der Erfindung basieren, zumindest zum Teil, auf der Entdeckung, dass T-Zell-Costimulation (z. B. durch CD28) zu einer erhöhten Produktion des Proteins bcl-X_L in der T-Zelle führt und das Überleben von T-Zellen erhöht. Darüber hinaus führt die verstärkte Produktion des bcl-X_L-Proteins in T-Zellen auf anderen Wegen (z. B. Transfektion eines bcl-X_L-Gens in die T-Zellen) ebenso zu einem erhöhten Überleben von T-Zellen. Demzufolge ist, um eine T-Zelle vor dem Tod zu schützen, nach den Verfahren der Erfindung der Anteil des bcl-X_L-Proteins in der T-Zelle erhöht, so dass das Überleben von T-Zellen verbessert ist.
Das Überleben von T-Zellen kann dadurch verbessert werden, dass die T-Zelle mit einem Agens in Kontakt gebracht wird, das den bcl-X_L-Proteinspiegel erhöht. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der bcl-X_L-Proteinspiegel in einer T-Zelle erhöht, indem eine Nucleinsäure in die T-Zelle eingebracht wird, die ein bcl-X_L-Protein codiert. Bcl-X_L-Proteinspiegel in einer T-Zelle können erhöht werden, indem die T-Zelle mit einem Agens in Kontakt gebracht wird, das intrazellulär wirkt, um die endogenen bcl-X_L-Proteinspiegel zu erhöhen. Ein anderes Agens, das den bcl-X_L-Proteinspiegel erhöhen kann, ist ein Agens, das mit einem Molekül an der Oberfläche der T-Zelle in Wechselwirkung tritt. Die Anwendung der Erfindung kann zur Behandlung von Störungen oder Zuständen eingesetzt werden, die mit erhöhtem oder unangemessenem T-Zelltod verbunden sind, wie etwa Infektion der T-Zellen mit HIV. Das Verfahren kann auch zur Verbesserung des Überlebens von T-Zellen nützlich sein, um auf diese Weise eine Immunantwort zu stimulieren, um zum Beispiel die Eliminierung eines pathogenen Mikroorganismus zu beschleunigen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist eine grafische Darstellung der prozentualen Lebensfähigkeit von CD28⁺-T-Zellen an den Tagen 1, 2, 3, 4 und 5 nach der Inkubation der T-Zellen über 12 Stunden im Medium allein (offene Quadrate), in Anwesenheit von anti-CD3 (dunkle Rauten) oder in Anwesenheit von anti-CD3 und anti-CD28 (dunkle Quadrate) vor γ-Bestrahlung (Tafel B) oder unbehandelt (Tafel A).
2A–D sind grafische Darstellungen der prozentualen Lebensfähigkeit von CD28⁺-T-Zellen an den Tagen 1, 2, 3, 4 und 5 nach der Inkubation der T-Zellen über 12 Stunden mit anti-CD3 allein (Tafeln A und B) oder mit anti-CD3 und anti-CD28 (Tafeln C und D), die anschließend vor γ-Bestrahlung (Tafeln B und D) oder unbehandelt (Tafeln A und C) entweder in ihrem konditionierten Medium belassen wurden (offene Quadrate), gewaschen und in frischem Medium resuspendiert wurden (offene Rauten) oder gewaschen und in frischem Medium resuspendiert wurden, das mit 200 U/ml rIL-2 ergänzt war (dunkle Quadrate).
Tafeln B, C und D der 3 stellen Northern-Blots dar, die die Rate der bcl-X-, bcl-2- beziehungsweise HLA-Expression in T-Zellen zeigen, die in Medium allein inkubiert wurden (MED), über 1, 6 oder 12 Stunden in der Anwesenheit von anti-CD3-Antikörper (αCD3) inkubiert oder über 1, 6 oder 12 Stunden in der Anwesenheit von anti-CD3 und anti-CD28 (αCD3 + αCD28) inkubiert wurden. Tafel A zeigt Ethidiumbromid-Färbung eines Aliquots jeder RNA-Probe nach Elektrophorese auf einem nicht-denaturierenden Agarose-Gel.
3 E ist eine Fotografie eines Western-Blots, die die Menge an bcl-X_L- und bcl-X_S-Protein in T-Zellen zeigt, die allein (o) oder mit anti-CD3 (αCD3) über 6 oder 12 Stunden oder mit anti-CD3 und anti-CD28 (αCD3 + αCD28) über 6 oder 12 Stunden inkubiert wurden.
4 ist eine Fotografie eines Western-Blots, die die Menge an bcl-X_L- und bcl-2-Protein in T-Zellen zeigt, die allein (o) oder mit anti-CD3 (αCD3) über 6, 12 oder 24 Stunden oder mit anti-CD3 und anti-CD28 (αCD3 + αCD28) über 6, 12 oder 24 Stunden inkubiert wurden.
5 ist eine Fotografie eines Western-Blots, die die Menge an bcl-X_L-Protein in T-Zellen zeigt, die über 24 Stunden in Medium allein (Medium) oder in der Anwesenheit von anti-CD28 (αCD28), anti-CD3 (αCD3), anti-CD3 + anti-CD28 (αCD3/αCD28) oder anti-CD3 + IL-2 (100 Einheiten/ml) (αCD3/IL-2) inkubiert wurden.
6 ist eine Fotografie eines Western-Blots, die die Menge an bcl-X_L-Protein in T-Zellen zeigt, die in Medium allein (ruhend) oder über 24, 48, 72, 96 oder 120 Stunden in Anwesenheit von anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern inkubiert wurden. Die untere Tafel zeigt die Lebensfähigkeit der T-Zellen in Prozent, die in Medium allein (ruhend) inkubiert oder über 24, 48, 72, 96 oder 120 Stunden in der Anwesenheit von anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern inkubiert wurden, worauf die Zugabe von anti-Fas-Antikörper über weitere 24 Stunden folgte.
7A–B sind grafische Darstellungen der Überlebensrate in Frozent von Jurkat-Clonen, die mit einem bcl-X_L-Expressionsplasmid (bcl-X_L-Clone 1, 2 und 3) oder einem Kontrollplasmid (Neo-Clone 1, 2 und 3) transfiziert wurden, nach 0, 12, 24, 48 und 72 Stunden Behandlung mit anti-Fas-Antikörper (αFas, Tafel A) oder anti-CD3-Antikörper (αCD3), Tafel B).
Tafel C der 7 ist eine Fotografie eines Western-Blots, die die Menge an bcl-X_L-Protein in den Jurkat-Clonen zeigt, die mit einem bcl-X_L-Expressionsplasmid (bcl-X_L-Clone 1, 2 und 3) oder dem Kontrollplasmid (Neo-Clone 1,2 und 3) transfiziert wurden.
Tafel D der 7 ist eine grafische Darstellung der Überlebensrate in Prozent von CTLL-2-Zell-Clonen, die mit einem bcl-X_L-Expressionsplasmid transfiziert (CTLL-2- bcl-X_L-Clone 1 und 2) oder nicht transfiziert wurden (CTLL-2), 0, 12, 24, 36 und 48 Stunden nach Entfernung von IL-2.
Tafel E der 7 ist eine Fotografie eines Western-Blots, die die Menge an bcl-X_L-Protein in den CTLL-2-Zell-Clonen zeigt, die mit einem bcl-X_L-Expressionsplasmid transfiziert (CTLL-2-bcl-X_L-Clone 1 und 2) oder nicht transfiziert wurden (CTLL-2).
8 ist eine Fotografie eines Western-Blots, die die Menge an bcl-X_L-Protein in Lymphknotenzellen der Maus zeigt, die über 24 Stunden in Medium allein, in der Anwesenheit von anti-CD3, in der Anwesenheit von anti-CD3 und anti CD28 und in Anwesenheit von anti-CD und CTLA4Ig inkubiert wurden.
9 ist eine grafische Darstellung der Lebensfähigkeit in Prozent von Jurkat-Zellen, die mit einem bcl-X_L-Expressionsvektor (Virusverdünnung gegen bcl-X_L-Mittelwert) oder mit einem Kontrollvektor (Virusverdünnung gegen neo-Mittelwert) transfiziert und mit unterschiedlichen Mengen HIV infiziert wurden.
Tafeln A–D der 10 sind grafische Darstellungen des Prozentsatzes der Zellen, die Apoptose durchgemacht haben (% Apoptose), und des Prozentsatzes der Zellen die bcl-X-Protein (% bcl-x) exprimieren in PBMC von Kontrollen und HIV-infizieren Individuen, die über 0, 24, 48 oder 72 Stunden mit PWM (Tafeln A und B) oder mit anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern (CD/CD28, Tafeln C und D) behandelt wurden.
Genaue Beschreibung
Die vorliegende Endung liefert in vitro-Verfahren und Anwendungen zur Modulation des Überlebens von T-Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die T-Zelle vor dem Tod geschützt. Die Verfahren der Erfindung zum Schutz einer T-Zelle vor Zelltod beinhalten, dass die T-Zelle mit mindestens einem Agens in Kontakt gebracht wird, das den bcl-X_L-Proteinspiegel ansteigen lässt, so dass das Überleben der T-Zelle verbessert wird. In einer Ausführungsform dieses in vitro-Verfahrens oder der Anwendung ist das Agens, das den bcl-X_L-Proteinspiegel erhöht, eine Nucleinsäure, die ein bcl-X_L-Protein codiert, das bei Einführung in die T-Zelle exprimiert wird. Bcl-X_L-Proteinspiegel können in einer T-Zelle erhöht werden, indem die T-Zelle mit mindestens einem Agens in Kontakt gebracht wird, das die Produktion des bcl-X_L-Proteins, z. B. vom endogenen bcl-X_L-Gen, erhöht. Das mindestens eine Agens, das den bcl-X_L-Proteinspiegel erhöht, kann ein Agens enthalten, das mit einem Molekül an der Oberfläche einer T-Zelle, wie etwa CD28, in Wechselwirkung tritt. Die T-Zelle kann darüber hinaus mit einem Agens in Kontakt gebracht werden, das der T-Zelle ein erstes Aktivierungssignal übermittelt. Das mindestens eine Agens kann ein Agens sein, das intrazellulär wirkt, um den bcl-X_L-Proteinspiegel zu erhöhen. T-Zellen, in denen der Spiegel des bcl-X_L-Proteins entsprechend des Verfahrens der Erfindung moduliert wird, können T-Zellen sein, die in einem Individuum vorhanden sind, oder T-Zellen, die ex vivo in Kultur genommen wurden. Die beschriebenen Verfahren können nützlich sein, Immunantworten zu modulieren, z. B. Immunantworten zu verstärken oder zu unterdrücken. Auf diese Weise können die beschriebenen Verfahren zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten haben, wie etwa die Stimulation einer Immunantwort (zum Beispiel zur Bekämpfung einer Infektion) oder die Stimulation des Überlebens von T-Zellen, deren Lebenszeit herabgesetzt ist (zum Beispiel als Reaktion auf eine Infektion, wie etwa einer Infektion mit einem menschlichen Immunschwäche-Virus).
Es wurde schon zuvor beobachtet, dass bcl-X_L in der Lage ist, die Murine IL-3-abhängige Prolymphocyten-Zelllinie FL5.12 vor Apoptose zu schützen, die durch Verlust von IL-3 ausgelöst wird (Boise, H. B. et al. (1993) Cell 74, 597 und PTC-Patentanmeldung WO 95/00642). Weil Apoptose ein wichtiger Mechanismus zur Regulierung von negativer und positiver Selektion von T-Zellen während der Ontogenese ist, analysierten die Autoren den bcl-X_L-mRNA-Spiegel in T-Zellen. Weder Thymocyten noch ruhende T-Zellen oder T-Zellen, die mit PMA und Ionomycin aktiviert worden waren, enthielten bcl-X_L-mRNA. Thymocyten und aktivierte T-Zellen enthielten jedoch bcl-X_S-mRNA, eine andere Spleiß-Form des bcl-X-Gens, das ein Protein bcl-X_S codiert, von dem gezeigt wurde, dass es Apoptose begünstigt (Boise, H. B. et al., vorstehend, und PCT-Patentanmeldung WO 95/00642). Diese Ergebnisse legen daher nahe, dass die Steuerung des durch Apoptose ausgelösten Zelltodes während der T-Zell-Ontogenese zumindest zum Teil durch die Steuerung des bcl-X_S-Proteinspiegels statt durch die Steuerung des bcl-X_L-Proteinspiegels vermittelt wird.
Die vorliegende Endung beruht zumindest zum Teil auf der Entdeckung, dass Transfektion von T-Zellen mit einer Nucleinsäure, die menschliches bcl-X_L-Protein codiert, in der Weise, dass der bcl-X_L-Proteinspiegel in der T-Zelle erhöht wird, zum Schutz der T-Zelle vor Zelltod führt. T-Zellen, die in dieser Weise modifiziert wurden, waren vor dem durch verschiedene Stimuli wie etwa γ-Bestrahlung, T-Zell-Rezeptor-Querverknüpfung, Fas-Querverknüpfung und Verlust von Wachstumsfaktoren ausgelösten Zelltod geschützt. Es ist daher ein Gegenstand der Erfindung, Proteinspiegel von bcl-X_L in einer T-Zelle zu modulieren, indem die T-Zelle mit einem Agens in Kontakt gebracht wird, das bcl-X_L-Proteinspiegel in der Weise moduliert, dass die T-Zellen vor Zelltod geschützt sind oder alternativ anfälliger für den Zelltod werden. Die beschriebenen Verfahren können therapeutisch nützlich bei Zuständen sein, bei denen es wünschenswert ist, das Überleben von wenigstens einigen der T-Zellen eines Individuums zu verlängern, wie etwa von T-Zellen, die an der Bekämpfung einer Infektion beteiligt sind.
1. Verfahren zum Schutz einer T-Zelle vor Zelltod
Das in vitro-Verfahren oder die Anwendung der Endung betrifft den "Schutz einer T-Zelle vor Zelltod". Der Ausdruck "T-Zelle" ist ein Fachbegriff und soll Thymocyten, unreife T-Lymphocyten, reife Lymphocyten, ruhende T-Lymphocyten oder aktivierte T-Lymphocyten umfassen. Eine T-Zelle kann eine T-Helfer-(Th) Zelle sein, z. B. eine T-Helfer 1 (Th1)- oder eine T-Helfer 2 (Th2)-Zelle. Die T-Zelle kann eine CD4+-T-Zelle, CD8+-T-Zelle CD4+CD8+-T-Zelle, CD4-CD8–-T-Zelle oder jede andere Zusammenstellung von T-Zellen sein. Der Ausdruck "Schutz einer T-Zelle vor Zelltod" soll die Hemmung oder mindestens die Verzögerung des Auftretens von Zelltod in einer T-Zelle einschließen. Zelltod soll den durch jeden Mechanismus eintretenden Zelltod umfassen. Zelltod kann der programmierte Zelltod (PCD) sein, der auch "Apoptose" genannt wird. Der Tod einer T-Zelle durch Apoptose ist durch Abläufe gekennzeichnet, die Kondensation des nukleären Heterochromatins, Zellschrumpfung, cytoplasmatische Kondensation und in einem späteren Stadium der Apoptose durch Endonuclease vermittelte Spaltung der DNA der T-Zelle in einzelne Fragmente umschließen. Bei elektrophoretischer Analyse der DNA einer Zelle, in der Apoptose stattgefunden hat, erscheint eine charakteristische "Leiter" diskreter DNA-Fragmente.
Wie beschrieben, können die Verfahren eine T-Zelle vor Zelltod schützen, der auf natürliche Weise eintritt, oder vor Zelltod, der auf ein ausgelöstes Signal in der Zelle zurückgeht. Apoptose ist zum Beispiel gewöhnlich auf die Induktion eines bestimmten Signals in der Zelle zurückzuführen. So kann Zelltod durch Querverknüpfung des T-Zell-Rezeptors in Abwesenheit eines costimulierenden Signals verursacht werden. Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass Querverknüpfung des T-Zell-Rezeptors entweder durch einen polyclonalen Aktivator, etwa einen anti-CD3-Antikörper, oder alternativ durch ein Antigen auf einer Antigen präsentierenden Zelle in Abwesenheit eines costimulativen Signals (z. B. in Abwesenheit eines Signals durch CD28/CTLA4) zu T-Zell-Anergie oder zum Tod der T-Zelle führt.
Das beschriebene Verfahren kann auch ermöglichen, eine T-Zelle vor Zelltod zu schützen, der auf Wachstumsfaktormangel zurückgeht. Zum Beispiel benötigen T-Zellen typischerweise IL-2 zur Proliferation, und das Fehlen von IL-2 führt zum Zelltod. Daher wird die Erhöhung des bcl-X_L-Proteinspiegels in der T-Zelle nach den Verfahren der Erfindung eine normalerweise IL-2-abhängige T-Zelle in Abwesenheit von IL-2 vor Zelltod schützen (d. h. die Erfindung liefert T-Zellen, die bei Abwesenheit von IL-2 überleben können). Die beschriebenen Verfahren können T-Zellen vor Zelltod schützen, der auf das Fehlen von anderen Wachstumsfaktoren, Zytokinen oder Lymphokinen zurückgeht, die normalerweise für das Überleben von T-Zellen notwendig sind. Beispiele solcher Faktoren umschließen Interleukine, koloniestimulierende Faktoren und Interferone.
Das beschriebene Verfahren kann ermöglichen, eine T-Zelle vor Zelltod zu schützen, der auf die Querverknüpfung von Fas- oder Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR) zurück geht. Es ist gezeigt worden, dass Querverknüpfung des Fas-Rezeptors auf einer T-Zelle zum apoptotischen Zelltod der T-Zelle führt. Die Fas- und TNFR-Proteine weisen bemerkenswerte Homologien auf, und es ist möglich, das sie zu einer umfangreichen Familie von Proteinen gehören, die Zelltod durch Querverknüpfung auslösen. Daher kann das beschriebene Verfahren nützlich sein, T-Zellen vor Zelltod zu schützen, der auf Querverknüpfung jedes Rezeptors, der zu dieser Familie gehört, zurückzuführen ist.
Das beschriebene Verfahren könnte auch ein Mittel liefern, T-Zellen vor Zelltod zu schützen, der durch den Kontakt mit bestimmten Hormonen wie Glucocorticoide, zum Beispiel Dexamethason, ausgelöst wird. Darüber hinaus kann Zelltod auch als Folge von Stress auftreten, von dem bekannt ist, dass er erhöhte Glucocorticoidspiegel in einem Individuum auslöst. Daher kann das beschriebene Verfahren auch Schutz vor dem Tod von T-Zellen liefern, der darauf zurück geht, dass ein Individuum Stress ausgesetzt ist.
Darüber hinaus kann das Verfahren ermöglichen, T-Zellen vor dem durch DNA schädigende Agenzien ausgelösten Zelltod zu schützen.
T-Zellen unterliegen auch während der T-Zell-Ontogenese dem Zelltod. Der Prozess von Proliferation und Differenzierung von T-Zellen ist streng reguliert und umschließt sowohl positive als auch negative Selektion von T-Zellen. Verfahren zur Beeinflussung des Überlebens von T-Zellen während dieses Prozesses liegen gleichfalls innerhalb des Rahmens der Erfindung.
Tod von T-Zellen kann auch auf die Aktivität eines Apoptose auslösenden Proteins in der T-Zelle wie etwa bcl-X_S, Bad, p53, c-myc oder Interleukin-1β konvertierendes Enzym (ICE) zurückzuführen sein (Savill, J. (1994) Eur. J. Clin. Investigat. 24, 715). Daher umschließen Verfahren im Rahmen der Endung Verfahren zum Schutz gegen Zelltod, der mit diesen Proteinen verbunden ist.
1.2 Verfahren zum Schutz einer T-Zelle vor Zelltod, die das Einführen einer ein bcl-X_L-Protein codierenden Nucleinsäure in die T-Zelle beinhalten
In einer Ausführungsform der Erfindung ist eine T-Zelle dadurch vor Zelltod geschützt, dass in die Zelle in vitro eine Nucleinsäure eingebracht wird, die ein bcl-X_L-Protein codiert, so dass der bcl-X_L-Proteinspiegel in der T-Zelle erhöht wird. Das Nucleinsäuremolekül, das ein bcl-X_L-Protein codiert, liegt in einer Form vor, die die Expression des Gens in der T-Zelle erlaubt, so dass bcl-X_L-Protein in der Zelle produziert wird.
1.2.1 Bcl-X_L-Protein codierende Nucleinsäuren oder modifizierte Formen hiervon
Der Ausdruck "bcl-X_L codierendes Nucleinsäuremolekül" soll jedes Nucleinsäuremolekül umschließen, das in ein bcl-X_L-Protein transkribiert und translatiert wird, nachdem das Nucleinsäuremolekül in eine T-Zelle eingebracht wurde (z. B. kann das Molekül darüber hinaus geeignete Kontrollelemente zur Regulierung der Expression von bcl-X_L enthalten). Das bcl-X_L codierende Nucleinsäuremolekül kann aus der codierenden Region des zugehörigen bcl-X_L-Gens allein bestehen, oder es kann alternativ nicht codierende Regionen wie etwa nicht translatierte 5' oder 3'-Regionen, Introns, Fragmente hiervon oder andere Sequenzen enthalten.
Das bcl-X_L-Protein wird vom bcl-X-Gen codiert. Als eine Folge unterschiedlicher Spleißung produziert das bcl-X-Gen zwei unterschiedliche mRNA-Moleküle, von denen eines das bcl-X_L (für die lange Form von bcl-X)-Protein codiert, und das andere codiert das kürzere Protein bcl-X_S (für die kurze (engt.: short) Form von bcl-X). Das bcl-X_S-Protein unterscheidet sich durch das Fehlen eines Stranges aus 63 Aminosäuren vom bcl-X_L-Protein. Diese Deletion geht auf das Spleißen des zweiten in bcl-X_L anwesenden codierenden Exons auf einen mehr proximalen 5'-Spleißdonor innnerhalb des ersten codierenden Exons zurück. Es ist daher vorzuziehen, anstatt eines das bcl-X-Gen enthaltenden genomischen Fragments, das sowohl zur Produktion von bcl-X_L- als auch von bcl-X_S-Proteinen führen kann, die bcl-X_L-cDNA zur Expression von bcl-X_L in T-Zellen zu verwenden.
Zur Behandlung menschlicher Zellen ist die bcl-X_L codierende Nucleinsäure bevorzugt menschlichen Ursprungs; Nucleinsäuren von anderen Tierarten sind jedoch gleichfalls in die Endung eingeschlossen. Darüber hinaus können bcl-X_L-Nucleinsäuren über Artgrenzen hinweg verwendet werden, solange das von der Nucleinsäure codierte Protein T-Zellen vor Zelltod schützt, wenn die Nucleinsäure in die T-Zelle eingebracht worden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die bcl-X_L-Protein codierende Nucleinsäure die menschliche c-DNA (SEQ. ID. NR: 1). Bcl-X_L-Protein codierende Nucleinsäuren, die im Rahmen der Endung liegen, sind in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 95/00642 und in nachstehenden Referenzen offengelegt: Boise et al. (1993) Cell 74, 597; und Fang et al. (1994) J. Immunol. 153, 4388. Darüber hinaus werden die Nucleotidsequenz der menschlichen bcl-X_L-cDNA und die Aminosäuresequenz des menschlichen bcl-X_L-Proteins in der SEQ ID Nr: 1 bzw. 2 aufgeführt. Das Nucleinsäuremolekül kann das bcl-X_L-Protein in voller Länge codieren, oder die Nukleinsäure kann alternativ ein Peptidfragment von bcl-X_L codieren, das ausreicht, einer T-Zelle Schutz vor Zelltod zu gewährleisten, wenn sie in eine T-Zelle eingebracht wird. Die Nucleinsäure kann das natürliche bcl-X_L oder ein Fragment hiervon oder eine modifizierte Form des bcl-X_L-Proteins oder eines Fragments hiervon codieren. Modifizierte Formen des natürlichen bcl-X_L-Proteins, die innerhalb des Rahmens der Erfindung liegen, werden nachstehend beschrieben.
Das Verfahren der Endung soll die Verwendung von Fragmenten, Mutanten oder Varianten (z. B. modifizierte Formen) des bcl-X_L-Proteins, die die Fähigkeit zum Schutz der T-Zellen vor Zelltod bewahren, einschließen. Der Ausdruck "Form des bcl-X_L-Proteins" soll ein Protein kennzeichnen, das eine signifikante Homologie mit dem natürlichen bcl-X_L-Protein aufweist und in der Lage ist, eine T-Zelle vor Zelltod zu schützen. Der Ausdruck "Form des bcl-X_L-Proteins" soll das Protein Bcl-2 nicht einschließen. Die hierin verwendeten Ausdrücke "biologisch aktives bcl-X_L-Protein" oder "biologisch aktive Form eines bcl-X_L-Proteins" oder "funktionell aktive Form eines bcl-X_L-Proteins" sollen Formen des bcl-X_L-Proteins einschließen, die in der Lage sind, eine T-Zelle vor Zelltod zu schützen. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann solche Formen des bcl-X_L-Proteins auswählen, denen die Fähigkeit zugrunde liegt, T-Zellen vor Zelltod durch Einbringen einer das bcl-X_L-Protein codierenden Nucleinsäure in die T-Zelle zu schützen. Die Fähigkeit einer spezifischen Form von bcl-X_L, T-Zellen vor Zelltod zu schützen, kann bestimmt werden, zum Beispiel durch Transfektion einer die spezifische Form von bcl-X_L codierenden Nucleinsäure in eine T-Zelle in der Weise, dass das bcl-X_L-Protein in den 7-Zellen unter Bedingungen synthetisiert wird, die normalerweise den Zelltod der T-Zelle auslösen würden. Die Form des bcl-X_L-Proteins hat eine schützende Wirkung in T-Zellen gegen Zelltod, wenn in einer T-Zell-Population, die modifiziert wurde, um eine Form des bcl-X_L-Proteins zu exprimieren, eine geringere Zelltod-Rate eintritt als in einer T-Zell-Population, die nicht modifiziert wurde, um eine Form von bcl-X_L-Protein bei der Auslösung von Zelltod zu exprimieren. Zelltod kann auf zahlreiche Weisen beobachtet werden. Das Ausmaß von Zelltod in einer Population von Zellen kann zum Beispiel durch Zählen der Anzahl der T-Zellen in beiden Populationen mittels eines Hämozytometers oder eines Coulter-Zählgeräts bestimmt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung des Ausmaßes von Zelltod in einer Population von T-Zellen verwendet Propidiumjodid-Ausschlußverfahren. Propidiumjodid-Ausschlußverfahren können durchgeführt werden, indem die T-Zellen mit Propidiumjodid inkubiert werden, einem Farbstoff, der vorwiegend von toten Zellen absorbiert und von lebenden Zellen ausgeschlossen wird. Das Ausmaß von Zelltod wird dann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse (FACS) bestimmt, wie in Beispiel 6 der vorliegenden Patentanmeldung beschrieben. Weitere Farbstoffe, die verwendet werden können, umschließen Acridinorange und Hoechst 33342. Andere Verfahren zur Messung des Ausmaßes von Zelltod in einer T-Zell-Population umschließen zahlreiche Verfahren der Endmarkierung von gespaltener DNA (Gavrieli, Y. et al. (1992) J. Cell Biol. 119, 493). Ein anderes Verfahren zur Messung des Ausmaßes von Zelltod in einer T-Zell-Population umschließt elektrophoretische Analyse der Nucleinsäure der T-Zellen. In diesem Verfahren wird die Nucleinsäure der T-Zellen, die in einer gereinigten oder nicht gereinigten Form vorliegen kann, einer Gel-Elektrophorese unterzogen, der die Anfärbung des Gels mit Ethidiumbromid und die Sichtbarmachung der Nucleinsäure unter ultraviolettem Licht folgt. Die Nucleinsäure einer T-Zell-Population, in der wenigstens einige der T-Zellen einer Apoptose unterlagen, zeigen die Erscheinung einer "Leiter", d. h. eine Population von diskreten DNA-Fragmenten. Im Gegensatz dazu zeigt die DNA von T-Zellen, die keiner Apoptose unterlagen, eine einzelne Bande mit hohem Molekulargewicht.
Zahlreiche Untersuchungen können angewendet werden, eine Form des bcl-X_L-Proteins auf seine Fähigkeit, eine T-Zelle vor Zelltod zu schützen, zu überprüfen. Diese Untersuchungen umschließen Untersuchungen, bei denen in einer T-Zell-Population Apoptose ausgelöst wird, indem die T-Zell-Population mit spezifischen Agenzien in Kontakt gebracht wird. Solche Agenzien umschließen Agenzien, die eine Querverknüpfung des T-Zell-Rezeptors bewirken, wie etwa ein anti-CD3-Antikörper, Agenzien, die die Querverknüpfung von Fas- oder des TNF-Rezeptors bewirken, und Glucocorticoide. Alternativ kann Zelltod bei T-Zellen durch Wachstumsfaktormangel wie etwa IL-2-Mangel ausgelöst werden. Diese Untersuchungen werden durch die Beschreibung hindurch beschrieben, besonders in den Beispielen 6 und 7.
Die Produktion von bcl-X_L-Fragmenten in der T-Zelle kann erreicht werden, indem ein Fragment der Nucleinsäure, die das bcl-X_L-Proteinfragment codiert, in die T-Zelle eingebracht wird. Die Nucleinsäure kann eine cDNA sein, oder es kann alternativ ein genomisches DNA-Fragment sein. Mutanten von bcl-X_L können hergestellt werden, indem zum Beispiel Modifikationen der Nucleotidbasenpaare (z. B. Substitutionen, Deletionen, Additionen) in ein das bcl-X_L-Protein codierendes Nucleinsäuremolekül (z. B. eine bcl-X_L-cDNA) mit Hilfe von Standardverfahren eingebracht werden, wie etwa ortsgerichtete Mutagenese oder durch Polymerase-Kettenreaktion vermittelte Mutagenese. Bevorzugte Modifikationen von bcl-X_L umschließen jene, die die Halbwertszeit des bcl-X_L-Proteins in der T-Zelle modifizieren. Es kann daher wünschenswert sein, eine Form des bcl-X_L-Proteins in die T-Zelle einzubringen, die eine sehr kurze Halbwertszeit hat, wohingegen es in anderen Verfahren wünschenswert sein kann, eine Form von bcl-X_L in die T-Zelle einzubringen, die eine lange Halbwertszeit aufweist.
Das bcl-X_L-Protein kann modifiziert werden, um Interaktion mit dem "Bax"-Protein zu erleichtern und um Interaktion mit dem "Bad"-Protein zu hemmen oder herabzusetzen. Es ist gezeigt worden, dass die schützende Wirkung von bcl-X_L gegen Apoptose in Zellen durch ein Heterodimer vermittelt werden kann, das aus einem bcl-X_L-Protein und einem anderen Protein, "Bax" genannt, zusammengesetzt ist. Weitere Daten weisen jedoch darauf hin, dass ein "Bad" genanntes Protein ebenfalls mit bcl-X_L in Wechselwirkung treten kann und dass ein Heterodimer, das aus bcl-X_L und Bad zusammengesetzt ist, die schützende Wirkung von bcl-X_L gegen Zelltod inaktivieren kann (Yang, E. et al. (1995) Cell 80, 285). Darüber hinaus ist ebenfalls gezeigt worden, dass Bad in der Lage ist, das Bax-Protein aus dem Bax/bcl-X_L-Heterodimer zu verdrängen, um ein bcl-X_L/Bad-Heterodimer zu bilden. Daher kann eine T- Zelle vor Zelltod geschützt werden, indem eine ein bcl-X_L-Protein codierende Nucleinsäure in die T-Zelle eingebracht wird, die auf die Weise modifiziert ist, dass die Bindung der modifizierten Form von bcl-X_L an Bad gehemmt oder wenigstens herabgesetzt ist, wohingegen die Bindung der modifizierten Form von bcl-X_L an Bax, verglichen mit dem Wildtyp des bcl-X_L-Proteins, nicht signifikant beeinflusst wird. Die Modifikation des bcl-X_L-Proteins kann die Substitution von mindestens einer Aminosäure von bcl-X_L einschließen, die in den Bcl-2-Homologie (BH)-Domänen 1 oder 2 ("BH1" bzw. "BH2") lokalisiert ist. BH1 ist zwischen den Aminosäuren 129 und 148 des menschlichen bcl-X_L-Proteins lokalisiert (SEQ. ID. NR: 2), und BH2 ist zwischen den Aminosäuren 180 und 191 des menschlichen bcl-X_L-Proteins lokalisiert (SEQ. ID. NR: 2) (Yang, E. et al. (1995) Cell 80, 285).
Darüber hinaus wird es Fachleuten auf diesem Gebiet offensichtlich sein, dass Änderungen in der primären Aminosäuresequenz von bcl-X_L vermutlich toleriert werden, ohne die Fähigkeit des bcl-X_L-Moleküls, T-Zellen vor Zelltod zu schützen, signifikant zu verschlechtern. Demzufolge sind mutierte Formen von bcl-X_L, die im Vergleich zu der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz eines bcl-X_L-Moleküls Aminosäure-Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen aufweisen, aber noch die funktionelle Aktivität der natürlichen Form von bcl-X_L, wie hierin beschreiben, behalten haben, ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen. Um die funktionellen Eigenschaften von bcl-X_L zu behalten, werden bevorzugt konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren Aminosäureresten vorgenommen. Eine "konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, in der der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest ersetzt wird, der eine ähnliche Seitenkette hat. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind auf dem Fachgebiet definiert, einschließlich basischer Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), saurer Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladener polarer Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolarer Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), β-verzweigter Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischer Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin).
1.2.2 Regulatorische Sequenzen zur Expression von bcl-X_L codierender Nucleinsäure in T-Zellen
Um ein bcl-X_L codierendes Nucleinsäuremolekül in einer T-Zelle so zu exprimieren, dass der bcl-X_L-Proteinspiegel in der T-Zelle erhöht wird (um dadurch die T-Zelle vor Zelltod zu schützen), muss die Nucleinsäure mit Regulationselementen funktionell verbunden sein. "Funktionell verbunden" bedeutet, dass die bcl-X_L codierende Nucleotidsequenz mit mindestens einer regulatorischen Sequenz auf eine Weise verbunden ist, die Expression der Nucleotidsequenz in der T-Zelle ermöglicht. Regulatorische Sequenzen sollen Expression des gewünschten Proteins in einer geeigneten T-Zelle steuern. Dem zufolge umschließt der Ausdruck "regulatorische Sequenz" Promotoren, Enhancer und andere Kontrollelemente für die Expression. Solche regulatorischen Sequenzen sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und weiterhin von Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben worden.
Diese Regulationselemente umschließen jene, die für Transkription und Translation der bcl-X_L codierenden Nucleinsäure benötigt werden, und können Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale und Sequenzen, die für den Transport des Moleküls zur geeigneten zellulären Kompartiment, das bevorzugt die äußere Mitochondrienmembran ist, benötigt werden, einschließen (Gonzales-Garcia, M. et al. (1994) Development 120, 3033). Wenn die Nucleinsäure eine cDNA in einem rekombinanten Expressionsvektor ist, werden die regulatorischen Funktionen, die für Transkription und/oder Translation der cDNA zuständig sind, oft von viralen Sequenzen bereit gestellt. Beispiele gewöhnlich verwendeter viraler Promotoren umschließen jene, die von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalievirus und Affenvirus 40 und retroviralen LTRs abstammen.
Regulatorische Sequenzen, die mit der cDNA verbunden sind, können so ausgewählt werden, dass sie eine konstitutive oder induzierbare Transkription ermöglichen. Induzierbare Transkription kann zum Beispiel durch die Verwendung eines induzierbaren Enhancers reicht werden. Auf diese Weise ist in einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung das eine Form von bcl-X_L codierende Nucleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines induzierbaren Kontrollelements, so dass die Expression dieser Form von bcl-X_L auf an oder aus geschaltet werden kann (oder intermediäre Stufen dazwischen), indem ein Agens verwendet wird, das das induzierbare Kontrollelement beeinflusst (z. B. kann Expression moduliert werden, indem die Konzentration des induzierenden Agens in Anwesenheit der T-Zellen moduliert wird). Dies erlaubt das An- oder Ausschalten der schützenden Wirkung von bcl-X_L gegen den Zelltod der T-Zellen. Es kann in der Tat wünschenswert sein, das Überleben von T-Zellen nur unter bestimmten Bedingungen zu fördern oder nur für einen bestimmten Zeitraum. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, an der Stelle einer Infektion in einem Individuum die Immunreaktion zu verstärken, um das infektiöse Agens in einem begrenzten Zeitraum zu vernichten. Nach Entfernung des infektiösen Agens kann es jedoch wünschenswert sein, die T-Zellen zu entfernen. Auf diese Weise kann die Expression von bcl-X_L in den T-Zellen, die an der Stelle der Infektion lokalisiert sind, durch das induzierbare Kontrollelement stimuliert werden, indem die T-Zellen mit dem induzierenden Agens in Kontakt gebracht werden. Darauf kann, nach der Überwindung der Infektion, das induzierende Agens entfernt werden, um die Produktion von bcl-X_L-Protein in den T-Zellen zu stoppen.
Induzierbare Regulationssysteme zur Verwendung in Säugerzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt, zum Beispiel Systeme, in denen Genexpression durch Schwermetallionen (Mayo et al. (1982) Cell 29, 99–108; Brinster et al. (1982) Nature 296, 39–42; Searle et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 1480–1489), Hitzeschock (Nouer et al. (1991) in Heat Shock Response, Hrsg. Nouer, L., CRC, Boca Raton, FL, S. 167–220), Hormone (Lee et al. (1981) Nature 294, 228-232; Hynes et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2038–2042; Klock et al. (1987) Nature 329, 734–736; Israel & Kaufman (1989) Nucl. Acids Res. 17, 2589–2604) oder Tetracyclin (Gossen, M. und Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547–5551) reguliert wird. Weitere Systeme, die induzierbare Genexpression ermöglichen, die durch Zusammenbringen der T-Zellen mit spezifischen induzierenden Agenzien steuerbar sind, werden in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung Nr. WO 94/18317 und der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung Nr. WO 93/23431 beschrieben.
Induzierbare Kontrollelemente können in allen T-Zellen funktionieren oder alternativ nur in einer spezifischen Unterart von T-Zellen wie etwa in CD4+-T-Zellen, CD8+-T-Zellen, T-Helfer-1- (Th1), T-Helfer-2- (Th2) Zellen. Induzierbare Kontrollelemente können auch so ausgewählt werden, dass sie durch ein Agens in einem Typ von T-Zellen (wie etwa CD4+-T- Zellen), aber durch ein anderes Agens in einem anderen Typ von T-Zellen (wie etwa CD8+-T-Zellen) reguliert werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Nucleinsäuremolekül, das das bcl-X_L-Protein codiert, unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen, die die Expression des Nucleinsäuremoleküls konstitutiv steuern. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden T-Zellen eines Individuums, die mit HIV infiziert sind, in der Weise modifiziert, dass sie ein bcl-X_L-Protein konstitutiv exprimieren, so dass die T-Zellen des Individuums konstitutiv vor Zelltod geschützt sind. Regulationselemente, die die konstitutive Expression von Nukleinsäuremolekülen steuern, an die sie funktionell gebunden sind, sind bevorzugt virale Promotoren. Beispiele von gewöhnlich verwendeten vitalen Promotoren umschließen jene, die von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalievierus und Affenvirus 40 und retroviralen LTRs abstammen. Alternativ können T-Zell-spezifische Enhancer verwendet werden, z. B. T-Zell-Rezeptor-Enhancer (vgl. z. B. Winoto und Baltimore (1989) EMBOJ. 8, 729–733).
Das funktionell mit Regulationselementen verbundene, bcl-X_L-Protein codierende Nucleinsäuremolekül wird typischerweise in einem Vektor transportiert. Beispiele von Vektoren umschließen Plasmide, Viren oder andere Nucleinsäuremoleküle, die zum Beispiel Sequenzen umfassen, die für Selektion und Amplifizierung des Nucleinsäuremoleküls in Bakterien notwendig sind. Daher wird ein Nucleinsäuremolekül, das eine ein bcl-X_L-Protein codierende Nucleotidsequenz umfasst, die funktionell mit regulatorischen Kontrollelementen verbunden ist, hierin auch als " bcl-X_L-Expressionsvektor" bezeichnet. Auf Vektoren, z. B. virale Vektoren, wird nachstehend genauer eingegangen.
1.2.3. Verfahren zum Einbringen eines ein bcl-X_L-Protein codierenden Nucleinsäuremoleküls in eine T-Zelle
Das Nucleinsäuremolekül, das ein bcl-X_L-Protein codiert, kann durch verschiedene Verfahren, die typischerweise als Transfektion bezeichnet werden, in die T-Zelle eingebracht werden. Die Ausdrücke "Transfektion" oder "transfiziert mit" beziehen sich auf das Einbringen fremder Nucleinsäure in eine Säugerzelle und sollen eine Reihe von Techniken umfassen, die zum Einbringen von Nucleinsäuren in Säugerzellen nützlich sind, einschließlich Elektroporation, Calcium-Phosphat-Fällung, DEAE-Dextran-Behandlung, Lipofektion, Mikroinjektion und virale Infektion. Geeignete Verfahren zur Transfektion von Säugerzellen können bei Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989) und in anderen Laborhandbüchern eingesehen werden.
Das Nukleinsäuremolekül, das ein bcl-X_L-Protein codiert, kann mit Hilfe eines viralen Vektors in die T-Zelle eingebracht werden. Solche viralen Vektoren umschließen zum Beispiel rekombinantes Retroviren, Adenovirus, Adeno-anoziiertes Virus und Herpes simplex Virus-1. Retrovirus Vektoren und Adeno-anoziiertes Virus-Vektoren werden allgemein als das rekombinante Genübertragungssystem der Wahl für den Transfer von fremden Genen in vivo, besonders in menschliche Zellen, angesehen. Alternativ können solche Vektoren auch zum Einbringen fremder Gene ex vivo in T-Zellen verwendet werden. Diese Vektoren ermöglichen eine wirksame Übertragung von Genen in T-Zellen, und die transfizierten Nucleinsäuren werden stabil in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert. Es ist eine wesentliche Vorbedingung bei der Verwendung von Retroviren, die Sicherheit ihrer Verwendung zu überprüfen, besonders im Hinblick auf die Möglichkeit der Ausbreitung eines Wildtyp-Virus in der Zellpopulation. Die Entwicklung von speziellen Zelllinien ("Verpackungszelles" genannt), die nur Retroviren mit Replikationsdefekt erzeugen, hat die Nützlichkeit von Retroviren in der Gentherapie erhöht, und defekte Retroviren sind für den Einsatz zum Gentransfer in der Gentherapie gut charakterisiert (für einen Überblick vgl. Miller, A. D. (1990) Blood 76, 271). Auf diese Weise kann ein rekombinantes Retrovirus konstruiert werden, in dem ein Teil der retroviralen Codierungssequenz (gag, pol, env) durch Nucleinsäure ersetzt worden ist, die ein bcl-X_L-Protein der Erfindung codiert, wobei die Replikation des Rettrovirus fehlerhaft wird. Das Retrovirus mit Replikationsdefekt wird darauf in Virionen verpackt, die verwendet werden können, die Zielzelle durch die Verwendung eines Helfervirus mit Standardtechniken zu infizieren. Protokolle zur Herstellung rekombinanter Retroviren und zur Infektion von Zellen in vitro oder in vivo mit solchen Viren können in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) Greene Publishing Associates (1989), Abschnitte 9.10–9.14 und in anderen Standard-Laborhandbüchern nachgeschlagen werden. Beispiele geeigneter Retroviren umschließen pLJ, pZIP, pWE und pEM, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind. Beispiele geeigneter Viruslinien für die Verpackung zur Herstellung von sowohl ökotropen als auch amphotropen retroviralen Systemen umschließen ΨCrip, ΨCre, Ψ2 und ΨAm.
Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass es möglich ist, das Infektionsspektrum der Retroviren und damit der auf Retroviren basierenden Vektoren zu begrenzen, indem die viralen Verpackungsproteine an der Oberfläche der viralen Partikel modifiziert werden (vgl. zum Beispiel die PCT-Veröffentlichungen WO 93/25234 und WO 94/06920). Strategien zur Modifizierung des Infektionsspektrums von retroviralen Vektoren umschließen zum Beispiel: Kopplung von Antikörpern, die spezifisch für Antigene der Zelloberfläche sind, an das virale env-Protein (Roux et al. (1989) PNAS 86, 9079–9083; Julan et al. (1992) J. Gen. Virol. 73, 3251–3255; und Goud et al. (1983) Virology 163, 251–254); oder Kopplung von Liganden der Zelloberflächenrezeptoren an die viralen env-Proteine (Neda et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 14143–14146). Die Kopplung kann entweder in der Form einer chemischen Querverknüpfung mit einem Protein oder anderen Einheiten (z. B. Lactose, um das env-Protein in ein Asialoglycoprotein zu verwandeln) oder durch die Erzeugung eines Fusionsproteins (z. B. Einzelketten-Antikörper/env-Fusionsproteine) erfolgen. Wie beschrieben, können auf diese Weise virale Partikel, die ein eine Form von bcl-X_L codierendes Nucleinsäuremolekül beinhalten, zum Beispiel nach den vorstehend beschriebenen Verfahren in der Weise modifiziert werden, dass sie spezifisch auf Unterarten von T-Zellen abziehen. Zum Beispiel können die viralen Partikel mit Antikörpern gegen Oberflächenmoleküle überzogen werden, die spezifisch für bestimmte Arten von T-Zellen sind. Insbesondere ist es möglich, selektiv auf CD4+-T-Zellen zu zielen, indem die viralen Partikel mit Antikörpern verbunden werden, die das CD4-Molekül auf der T-Zelle erkennen. Auf diese Weise wird die Infektion von CD4+-T-Zellen bevorzugt gegenüber der Infektion von CD8+-T-Zellen eintreten. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, wenn es erwünscht ist, nur spezifische Unterarten von T-Zellen gegen Zelltod zu schützen. Darüber hinaus kann es in speziellen Ausführungsformen, in denen das Verfahren der Erfindung in vivo eingesetzt wird, wünschenswert sein, das Einbringen des Nucleinsäuremoleküls, das ein bcl-X_L-Protein codiert, in T-Zellen oder spezifische Unterarten zu begrenzen.
Zusätzliche retrovirale Systeme zum Einbringen und Exprimieren eines Nukleinsäuremoleküls, das ein bcl-X_L-Protein codiert, in T-Zellen, einschließlich primärer T-Zellen, werden von Kasid, A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 473; Morecki, S. et al. (1991) Cancer Immunol. Immunother. 32, 342; Culver, K. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3155; und Finer, M. H. et al. (1994) Blood 83, 43 beschrieben.
Ein anderes virales Genübertragungssystem, das für die vorliegende Erfindung nützlich ist, benutzt Vektoren, die von Adenoviren stammen. Das Genom eines Adenovirus kann in der Weise manipuliert werden, dass es ein Genprodukt von Interesse codiert und exprimiert, im Bezug auf seine Fähigkeit aber, sich im Rahmen eines normalen, lytischen viralen Kreislaufs zu replizieren, inaktiviert ist. Vgl. zum Beispiel Berkner et al. (1988) BioTechniques 6, 616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252, 431–434; und Rosenfeld et al. (1992) Cell 68, 143–155. Geeignete Adenovirus-Vektoren, die von dem Adenovirusstamm Ad Typ 5 dl324 oder anderen Stämmen von Adenoviren (z. B. Ad2, Ad3, Ad7 etc.) abstammen, sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Rekombinante Adenoviren können unter bestimmten Umständen vorteilhaft sein, weil sie nicht in der Lage sind, sich nicht teilende Zellen zu infizieren. Darüber hinaus ist der Viruspartikel relativ stabil und lässt sich reinigen und konzentrieren und kann, wie vorstehend, modifiziert werden, um das Spektrum der Infektiösität zu beeinflussen. Zusätzlich wird die übertragene adenovirale DNA (und darin enthaltene fremde DNA) nicht in das Genom einer Wirtszelle integriert, sondern bleibt episomal, womit mögliche Probleme vermieden werden, die als Folge Insertions-Mutagenese in Situationen auftreten können, in denen übertragene DNA in das Genom der Wirtszelle aufgenommen wird (z. B. retrovirale DNA). Darüber hinaus ist die Aufnahmekapazität des adenoviralen Genoms für fremde DNA verglichen mit anderen Genübertragungsvektoren groß (bis zu 8 Kilobasen) (Berkner et al. vorstehend; Haj-Ahmand und Graham (1986) J. Virol. 57, 267). Den meisten adenoviralen Vektoren mit Replikationsdefekten, die zur Zeit in Benutzung sind und daher von der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, fehlen alle oder Teile der viralen E1- und E3-Gene, haben aber bis zu 80% des adenoviralen genetischen Materials behalten (vgl. z. B. Jones et al. (1979) Cell 16, 683; Berkner et al., vorstehend; und Graham et al. in Methods in Molecular Biolology, E. J. Murray, Hrsg. (Humana, Clifton, NJ, 1991) Bd. 7. S. 109–127). Die Expression des inserierten Nucleinsäuremoleküls, das ein bcl-X_L-Protein codiert, kann unter der Kontrolle von zum Beispiel dem E1A-Promotor, dem späten Hauptpromotor (MLP) und anoziierten Leadersequenzen, dem E3-Promotor oder exogen zugegebenen Promotorsequenzen stehen.
Noch ein anderes virales Vektorsystem, das für die in vivo-Übertragung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein bcl-X_L-Protein codiert, nützlich ist, ist das adeno-assoziierte Virus (AAV). Das adeno-assoziierte Virus ist ein natürlich vorkommendes defektes Virus, das ein anderes Virus wie etwa ein Adenovirus oder ein Herpesvirus als Helfervirus zur wirksamen Replikation und für einen produktiven Lebenszyklus benötigt (Für einen Überblick vgl. Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158, 97–129). Dies ist auch eines der wenigen Viren, das seine DNA in sich nicht teilende Zellen integrieren kann und eine hohe Frequenz stabiler Integration aufweist (vgl. zum Beispiel Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7, 349–356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63, 3822-3828; und McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62, 1963–1973). Vektoren, die nur 300 Basenpaare von AAV enthalten, können verpackt werden und können sich integrieren. Der Raum für fremde DNA ist auf etwa 4,5 Kb begrenzt. Ein AAV-Vektor wie jener, der von Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 3251–3260 beschrieben wird, kann verwendet werden, DNA in Zellen einzuführen. Eine Reihe verschiedener Nukleinsäuren konnten unter Verwendung von AAV-Vektoren in unterschiedliche Zelltypen übertragen werden (vgl. zum Beispiel Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6466–6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4, 2072–2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2, 32–39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51, 611–619; und Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 3781–3790). Andere virale Vektorsysteme, die Anwendung in der Gentherapie finden können, stammen vom Herpesvirus, Vaccinia-Virus und verschiedenen RNA-Viren.
Zusätzlich zu der ein bcl-X_L-Protein codierenden Sequenz kann ein Expressionsvektor ein Gen enthalten, das einen selektierbaren Marker codiert. Bevorzugte selektierbare Marker umschließen jene, die Resistenz gegen Wirkstoffe wie G418, Hygromycin und Methotrexat übertragen. Selektierbare Marker können in den selben Vektor (z. B. Plasmid) eingebracht werden wie das Nukleinsäuremolekül, das ein bcl-X_L-Protein codiert, oder sie können in einen seperaten Vektor (z. B. Plasmid) eingebracht werden.
Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül, das ein bcl-X_L-Protein codiert, durch ein Zellübertragungsvehikel in eine Zelle transportiert und übertragen werden. Solche Vehikel umschließen zum Beispiel kationische Liposomen (Lipofectin) oder derivatisierte (z. B. Antikörper-konjugierte) Polylysin-Konjugate, Gramicidin S, künstliche virale Hüllen. Diese Vehikel können eine ein bcl-X_L-Protein codierende Nukleinsäure, die von einem Vektor, z. B. einem Plasmid oder viraler DNA, getragen wird, übertragen. In einer besonderen Ausführungsform wird ein wirkungsvolle Genexpression in primären T-Lymphocyten, besonders in CD3+-, CD4+- und CD8+-T-Zellen erreicht, indem eine adeno-assoziierte virale Plasmid-DNA, mit kationischen Liposomen komplexiert verwendet wird, wie von Philip, R et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 2411 beschrieben wird.
Das Nukleinsäuremolekül, das ein bcl-X_L-Protein codiert, kann in der Form eines löslichen molekularen Komplexes in eine bestimmte Zelle übertragen werden. Der Komplex beinhaltet die Nukleinsäure reversibel an einen Carrier gebunden, der aus einem Agens zur Bindung an Nukleinsäure und einem zellspezifischen Bindungsagens besteht, das an ein Oberflächenmolekül der spezifischen Zelle bindet, und ist von einer solchen Größe ist, dass er im weiteren Verlauf von der Zelle aufgenommen werden kann. Solche Komplexe werden im US-Patent Nr. 5.166.320 beschrieben.
Die Nukleinsäure, die ein bcl-X_L-Protein codiert, kann auch durch Partikel-Bombardement in T-Zellen eingebracht werden, wie von Yang, N.-S. and Sun, W. H. (1995) Nature Medicine 1, 481 beschrieben wird.
1.1. Verfahren mit Agenzien, die den bcl-X_L-Proteinspiegel erhöhen
Das beschriebene Verfahren betrifft die Verbesserung des Überlebens einer T-Zelle, indem die T-Zelle mit mindestens einem Agens in Kontakt gebracht wird, das den bcl-X_L-Proteinspiegel in der T-Zelle erhöht. Das mindestens eine Agens, das mit der T-Zelle in Wechselwirkung tritt, um den bcl-X_L-Proteinspiegel zu erhöhen, kann ein oder mehrere Agenzien einschließen, die mit Molekülen an der Oberfläche der T-Zelle in Wechselwirkung treten, wie etwa den T-Zell-Rezeptor und CD28. Das mindestens eine Agens, das den bcl-X_L- Proteinspiegel in der T-Zelle erhöht, kann ein Agens sein, das intrazellulär wirkt, zum Beispiel durch Erhöhung der Expression des bcl-X-Gens. Der Ausdruck "ein Agens, das intrazellulär wirkt, um den bcl-X_L-Proteinspiegel in der T-Zelle zu erhöhen" soll Agenzien einschließen, die nicht an einen Oberflächenrezeptor der T-Zelle binden, sondern statt dessen ein intrazelluläres Signal (z. B. einen zweiten Boten) nachahmen oder auslösen, das durch die von der Querverknüpfung eines Rezeptors auf der T-Zelle umgeformt wird und eine Erhöhung des bcl-X_L-Proteinspiegels in der T-Zelle bewirkt. Das Agens kann die Produktion des bcl-X_L-Proteins in der T-Zelle durch verschiedene Mechanismen stimulieren, etwa durch Erhöhen der Transkriptionsrate des bcl-X_L-Gens, Stabilisierung der bcl-X_L-mRNA oder durch Erhöhung der Translation der bcl-X_L-mRNA. Der bcl-X_L-Proteinspiegel kann selektiv erhöht werden, d. h. ohne gleichzeitige Erhöhung des bcl-X_S-Proteinspiegels.
Der Ausdruck "stimulieren der Expression des endogenen Gens" soll ein Bewirken der Expression des bcl-X-Gens in einer Zelle, so dass der Spiegel des bcl-X_L-Proteins, das von dem Gen codiert wird, in der Zelle erhöht wird, einschließen. Der Ausdruck "stimulieren der Transkription" soll ein Bewirken der Transkription, so dass die Menge an transkribierter mRNA erhöht wird, einschließen. Mit dem Ausdruck "endogenes bcl-X-Gen" soll das bcl-X-Gen, das natürlicherweise in der T-Zelle vorkommt, gemeint sein, im Gegensatz zu einem "exogenen bcl-X-Gen", das in die T-Zelle eingebracht worden ist.
Eine T-Zelle kann mit mindestens einem Agens in Kontakt gebracht werden, das zu einer Erhöhung des bcl-X_L-Proteinspiegels in der T-Zelle und zum Schutz der T-Zelle vor Zelltod führt. Überleben einer T-Zelle kann dadurch verbessert werden, dass die T-Zelle mit einer Kombination von Agenzien in Kontakt gebracht wird, die die T-Zelle stimulieren. Eine bevorzugte Kombination von Agenzien ist eine Kombination von Agenzien, die Agenzien enthalten, die die T-Zelle aktivieren und der T-Zelle ein costimulierendes Molekül bieten. Zum Beispiel kann das Überleben von T-Zellen verbessert werden, wenn die T-Zelle mit einem ersten Agens, das der T-Zelle ein primäres aktivierendes Signal liefert und einem zweiten Agens, das der T-Zelle ein costimulierendes Signal liefert in Kontakt gebracht wird. Eine sehr bevorzugte Kombination umschließt ein Agens, das den T-Zell-Rezeptor stimuliert, und ein Agens, das der T-Zelle ein costimulierendes Signal liefert, so dass der bcl-X_L-Proteinspiegel in der T-Zelle erhöht wird.
Der Ausdruck "primäres Aktivierungssignal" soll Signale umschließen, die typischerweise durch den T-Zell-Rezeptor (TCR)/CD3-Komplex ausgelöst werden und die Aktivierung der T-Zellen auslösen. Aktivierung einer T-Zelle soll Modifikationen einer T-Zelle einschließen, so dass die T-Zelle nach dem Erhalt eines zweiten Signals wie etwa eines costimulierenden Signals, veranlasst wird, zu proliferieren und sich zu differenzieren. Das primäre Aktivierungssignal kann von einem Agens geliefert werden, das mit dem T-Zell-Rezeptor oder dem mit dem T-Zell-Rezeptor verbundenen CD3-Komplex in Kontakt tritt. Das Agens kann ein gegen CD3 reaktiver Antikörper sein, wie etwa der monoclonale Antikörper OKT3 (erhältlich bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD; Nr. CRL 8001). Das stimulierende Agens kann ein Agens sein, das den CD2-Komplex auf T-Zellen stimuliert, wie etwa eine Kombination von Antikörpern, z. B. T11.3 + T11.1 oder T11.3 + T11.2 (Vgl. z. B. Meuer, S. C. et al. (1984) Cell 36, 897–906). Das primäre Aktivierungssignal kann durch ein Antigen auf einer Antigen präsentierenden Zelle geliefert werden. Auf diese Weise ist es möglich, das Überleben von spezifischen T-Zell-Clonen in einer T-Zell-Population selektiv zu stimulieren, indem die T-Zellen mit einem oder mehreren Antigen auf einer oder mehreres Antigen präsentierenden Zellen und optional mit einem zweiten Agens, das ein costimulierendes Signal liefert, in Kontakt gebracht werden.
Die T-Zellen können mit einer Kombination von Agenzien stimuliert werden, die sowohl ein primäres Aktivierungssignal als auch ein costimulierendes Signal in der T-Zelle stimulieren. Der Ausdruck "costimulierendes Agens" soll Agenzien einschließen, die ein costimulierendes Signal für T-Zellen in der Weise liefern, dass eine T-Zelle, die ein primäres Aktivierungssignal erhalten hat (z. B. eine aktivierte T-Zelle), stimuliert wird, zu proliferieren oder Zytokine zu sekretieren, wie etwa IL-2, IL-4 oder Interferon-γ. Das costimulierende Agens kann mit CD28- oder CTLA4-Molekülen an der Oberfläche der T-Zellen in Wechselwirkung treten. Das costimulierende Signal kann ein Ligand von CD28 oder CTLA4 sein, wie etwa ein B-Lymphocyten-Antigen B7-1 oder B7-2. Der Ausdruck "stimulierende Form eines natürlichen Liganden von CD28" soll die Moleküle B7-1 und B7-2, Fragmente hiervon oder Modifikationen hiervon einschließen, die in der Lage sind, costimulierende Signale an die T-Zelle zu liefern. Stimulierende Formen von natürlichen Liganden von CD28 können identifiziert werden, indem sie zum Beispiel mit aktivierten T-Zellen mit einer Form eines natürlichen Liganden von CD28 in Kontakt gebracht werden und ein standardisierter T-Zell-Proliferationstest durchgeführt wird. Somit ist eine stimulierende Form eines natürlichen Liganden von CD28 in der Lage, die Proliferation von T-Zellen zu stimulieren. Stimulierende Formen von natürlichen Liganden von CD28/CTLA4 werden zum Beispiel in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/03408 beschrieben.
Andere Agenzien, die verwendet werden können, um T-Zellen vor Zelltod zu schützen, umschließen Agenzien, die einen oder mehrere intrazelluläre Signal-Transduktionspfade, die an der T-Zell-Aktivierung und/oder-Costimulation beteiligt sind, in der Weise stimulieren, dass der bcl-X_L-Proteinspiegel in der T-Zelle erhöht wird. Das stimulierende Agens kann ein Calciumionophor sein, wie etwa Ionomycin oder A23187. Alternativ kann das stimulierende Agens ein Agens sein, das Protein-Kinase C stimuliert, wie etwa ein Phorbolester. Ein bevorzugter Phorbolester ist Phorbol-12,13-dibutyrat. T-Zellen können mit einer Kombination aus einem Calcium-Ionophor und einem Phorbolester in Kontakt gebracht werden. Das stimulierende Agens kann auch ein Agens sein, das Protein-Tyrosinkinasen aktiviert. Ein bevorzugtes Agens, das Protein-Tyrosinkinasen stimuliert, ist Pervanadat (O'Shea, J. J. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10306).
Andere Agenzien, die zur Stimulierung des Überlebens von T-Zellen eingesetzt werden können, umschließen Agenzien wie etwa polyclonale Aktivatoren, die in der Lage sind, den bcl-X_L-Proteinspiegel zu erhöhen. Polyclonale Aktivatoren umschließen Agenzien, die an Glycoproteine binden, die auf der Plasmamembran von T-Zellen exprimiert werden, und umschließen Lectine wie etwa Phytohämaglutinin (PHA), Concanavalin (Con A) und Kermesbeeren-Mitogen (PWM).
Super-Antigene, die in der Lage sind, den bcl-X_L-Proteinspiegel in T-Zellen zu erhöhen, liegen ebenso innerhalb des Rahmens der Erfindung. Der hierin verwendete Ausdruck "Super-Antigen" soll bakterielle Enterotoxine oder andere bakterielle Proteine einschließen, die in der Lage sind, Proliferation von T-Zellen zu stimulieren. Super-Antigene umschließen staphylococcale Enterotoxine (SE) wie etwa SEA, SEB, SEC, SED und SEE. Super-Antigene können auch viralen Ursprungs sein, wie etwa die retroviralen Super-Antigene.
Noch andere Agenzien, die eingesetzt werden können, die T-Zell-Überlebensrate zu stimulieren, umschließen Lymphokine, die allein oder in Kombination mit einem anderen Agens den bcl-X_L-Proteinspiegel in der T-Zelle erhöhen. Auf diese Weise können T-Zellen mit einer Kombination aus einem Agens, das den T-Zellen ein primäres Aktivierungssignal liefert (z. B. ein anti-CD3-Antikörper), und einer wirksamen Menge IL-2 in Kontakt gebracht werden, so dass der bcl-X_L-Proteinspiegel in der T-Zelle erhöht wird.
Zusätzliche Agenzien, die entweder allein oder in Kombination mit anderen Agenzien in der Lage sind, T-Zelltod durch Erhöhung des bcl-X_L-Proteinspiegels in der T-Zelle zu verhindern, können identifiziert werden, indem die T-Zellen mit dem Agens allein oder zusammen mit einem anderen Agens in Kontakt gebracht werden und der bcl-X_L-Proteinspiegel zum Beispiel mit der Western-Blot Analyse beobachtet wird, wie hierin beschrieben.
Die Agenzien innerhalb des Rahmens der Erfindung können in Lösung oder an eine feste Oberfläche gebunden verwendet werden. Die feste Oberfläche kann zum Beispiel die Oberfläche einer Gewebekulturschale oder ein Kügelchen sein. Abhängig von der Natur des stimulierenden Agens kann die Bindung an die feste Oberfläche mit Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Zum Beispiel können Proteine chemisch mit Hilfe von käuflich zu erwerbenden Querverknüpfungsreagenzien (Pierce, Rockford IL) mit der Zelloberfläche querverknüpft werden oder auf Plastikmaterial durch Inkubation über Nacht bei 4°C immobilisiert werden. Wenn mehrere Agenzien zur Erhöhung des bcl-X_L-Proteinspiegels in T-Zellen verwendet werden, können einige Agenzien in Lösung vorliegen und einige Agenzien können an eine feste Unterlage gebunden sein. Die T-Zellen werden mit einer Kombination aus Festphasen-gebundenem anti-CD3-Antikörper und löslichem anti-CD28-Antikörper in Kontakt gebracht.
Agenzien, die intrazellulär wirken, um den bcl-X_L-Proteinspiegel zu erhöhen, können mit Hilfe von Standardtests zum Nachweis des bcl-X_L-Proteinspiegels in der T-Zelle identifiziert werden. Zum Beispiel können T-Zellen in Anwesenheit oder in Abwesenheit eines zu testenden Agens inkubiert werden, und die Menge des bcl-X_L-Proteins, das zu verschiedenen Zeiten von der Zelle produziert wird, kann mit der Western-Blot Analyse bestimmt werden, wie hierin und in dem Abschnitt der Beispiele in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung Nr. WO 95/00642 beschrieben, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Auf diese Weise umschließen bevorzugte Agenzien zur Durchführung des Verfahrens der Endung jene, die einen signifikanten Anstieg des bcl-X_L-Proteinspiegels auslösen, was durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen wird.
Zusätzlich können Agenzien, die verwendet werden können, den bcl-X_L-Proteinspiegel in T-Zellen zu erhöhen, durch Analyse der regulatorischen Region des bcl-X_L-Gens identifiziert werden, um DNA-Sequenzen zu finden, die die Transkription des Gens durch spezifische Agenzien regulieren. Zum Beispiel können transkriptionale Aktivatoren verwendet werden, die spezifisch an diese Sequenzen binden, um die bd-X-Gen-Expression zu stimulieren. Es kann dann durch Western-Blot-Analyse bestätigt werden, dass diese Agenzien den bcl-X_L-Proteinspiegel in der Zelle erhöhen.
Das Agens kann selektiv oder wenigstens bevorzugt auf T-Zellen wirken, um den bcl-X_L-Proteinspiegel zu erhöhen. Auf diese Weise führt die Verabreichung des Agens an ein Individuum nur in T-Zellen oder wenigstens bevorzugt in T-Zellen zur Erhöhung des bcl-X_L-Proteinspiegels. T-Zell-spezifische Agenzien können identifiziert werden, indem verschiedene Zelltypen in vitro mit dem Agens in Kontakt gebracht werden und der bcl-X_L-Proteinspiegel in den Zellen durch Western-Blot-Analyse gemessen wird. Bevorzugte Agenzien sind daher jene, die nur in T-Zellen oder wenigstens bevorzugt in T-Zellen zur Erhöhung des bcl-X_L-Proteinspiegels führen.
Das Agens, das intrazellulär wirkt, um den bcl-X_L-Proteinspiegel zu erhöhen, kann ein Agens sein, das eine relativ kurze Halbwertszeit hat. Ein solches Agens erlaubt eine bessere Kontrolle der Wirkung dieses Agens. Besonders kann ein solches Agens ein kurze, mittlere oder lange Stimulation des Zell-Überlebens der T-Zelle erlauben. Es ist vorzuziehen, das Überleben von T-Zellen nur vorübergehend zu erhöhen, zum Beispiel unter Bedingungen, in denen das Agens eingesetzt wird, um eine Immunreaktion am Ort einer Infektion zu verstärken. Eine Immunreaktion wird zumindest teilweise durch die Steuerung der Halbwertszeit der T-Zelle gesteuert. Fehlen des T-Zelltodes kann unter bestimmten Bedingungen schließlich zu zerstörerischen Wirkungen führen. Das Agens, das intrazellulär wirkt, um den bcl-X_L-Proteinspiegel zu erhöhen, kann jedoch auch eine lange Halbwertszeit haben, so dass weniger Verabreichungen des Agens an das Individuum notwendig sind, um eine längere schützende Wirkung gegen T-Zelltod zu erzielen.
1.3. Verfahren zum Schutz einer T-Zelle vor Zelltod durch Einbringen eines Proteins in die T-Zelle
T-Zellen können durch ein Verfahren vor Zelltod geschützt werden, in dem die T-Zelle mit einem bcl-X_L-Protein in einer Form in Kontakt gebracht wird, die für die Aufnahme durch die T-Zelle geeignet ist. So kann ein bcl-X_L-Protein mit herkömmlichen Techniken wie etwa in einem bakteriellen Expressionssystem in vitro synthetisiert werden und der T-Zelle in einem geeigneten Vehikel übertragen werden. Geeignete Vehikel umschließen Liposomen, die für modifiziert werden können, um auf spezifische Zellen abzuzielen, besonders T-Zellen oder eine selektive Unterart von T-Zellen.
Bcl-X_L-Protein kann in vitro hergestellt werden, indem ein Nukleinsäuremolekül, das bcl-X_L oder eine biologisch aktive Form von bcl-X_L codiert, in verschiedenen Expressionsvektoren inseriert wird, die wiederum die Synthese des zugehörigen Proteins in einer Reihe von Wirten steuern, besonders in eukaryotischen Zellen wie etwa Säuger- oder Insektenzellkulturen, aber auch in prokaryotischen Zellen wie E.coli. Expressionsvektoren im Rahmen der Erfindung umfassen eine Nucleinsäure, wie hierin beschrieben, und einen funktionell mit der Nucleinsäure verbundenen Promotor. Solche Expressionsvektoren können verwendet werden, um Wirtszellen zu transfizieren, um auf diese Weise das von der Nucleinsäure codierte Protein, wie hierin beschrieben, zu produzieren. Ein Expressionsvektor der Erfindung, wie hierin beschrieben, umschließt typischerweise Nucleotidsequenzen, die ein bcl-X_L-Protein codieren, funktionell verbunden mit mindestens einer regulatorischen Sequenz. Regulatorische Sequenzen sind vorstehend beschrieben worden. Es sollte deutlich sein, dass die Zusammenstellung des Expressionsvektors von solchen Faktoren wie der Wahl der zu transfizierenden Wirtszelle und/oder dem Typ und/oder der Menge des Proteins, das exprimiert werden soll, abhängt.
Ein Expressionsvektor der Erfindung kann verwendet werden, um entweder prokaryotische oder eukaryotische Zellen zu transfizieren (z. B. Säuger-, Insekten- oder Hefezellen), um auf diese Weise Proteine, die von Nucleotidsequenzen des Vektors codiert werden, herzustellen. Expression in Prokaryoten wird in den meisten Fällen in E.coli mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren haben, durchgeführt. Bestimmte Expressionsvektoren von E. coli (so genannte Fusionsvektoren) wurden entwickelt, um eine Anzahl von Aminosäureresten an das exprimierte, rekombinante Protein anzufügen, gewöhnlich an das Amino-Ende des exprimierten Proteins. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise drei Zwecken: 1) die Expression rekombinanter Proteine zu erhöhen; 2) die Löslichkeit des rekombinanten Zielproteins zu erhöhen; und 3) durch Fungieren als ein Ligand bei Affinitäts-Reinigungsverfahren bei der Reinigung des rekombinanten Zielproteins zu helfen. Beispiele von Fusions-Expressionsvektoren umschließen pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australien) und pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), die die Fusion von Glutathion-S-Transferase beziehungsweise Maltose-E-Bindungsprotein an das rekombinante Zielprotein bewirken. Dem zu Folge kann ein Nucleinsäuremolekül, das ein bcl-X_L-Protein codiert, in einem prokaryotischen Fusionsvektor mit zusätzlichen Codierungssequenzen verbunden werden, um die Expression, Löslichkeit oder Reinigung des Fusionsproteins zu unterstützen. Oft wird in Fusions-Expressionsvektoren eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindungsstelle zwischen der Fusionseinheit und dem rekombinanten Zielprotein eingefügt, um die Trennung des rekombinanten Zielproteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre verwandten Erkennungssequenzen umschließen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Induzierbare nicht-Fusions-Expressionsvektoren umschließen pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69, 301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califomia (1990) 60–89). Ziel-Genexpression vom pTrc-Vektor4 beruht auf der Transkription der RNA-Polymerase des Wirtes vom Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Ziel-Genexpression vom pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription vom T7 gn10-lac 0-Fusionspromotor, vermittelt durch eine coexprimierte virale-RNA-Polymerase (T7 gn1). Diese virale Polymerase wird von den Wirtszellstämmen BL21(DE3) oder HMS174(DE3) von einem verweilenden λ-Prophagen gebildet, der T7-gn1 unter der transkriptionalen Kontrolle des lacUV 5-Promotors beherbergt.
Eine Strategie zur Maximierung der Expression eines bcl-X_L-Proteins in E.coli ist, das Protein in einem Wirtsbakterium mit einer verminderten Kapazität zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins zu exprimieren (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119–128). Eine andere Strategie würde sein, die Nucleotidsequenz des Nucleinsäuremoleküls, das das in einen Expressionsvektor zu inserierende bcl-X_L-Protein codiert, zu ändern, so dass die individuellen Codons für jede Aminosäure jene wären, die bevorzugt in stark exprimierten E. coli-Proteinen gebraucht werden (Wada et al. (1992) Nuc. Acids Res. 20, 2111–2118). Solche Änderungen der Nucleinsäuresequenzen sind in der Erfindung eingeschlossen und können mit Standard-DNA-Synthesetechniken durchgeführt werden.
Alternativ kann ein bcl-X_L-Protein in einer eukaryotischen Wirtszelle exprimiert werden, etwa einer Säugerzelle (z. B. Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder NSO-Zellen), Insektenzellen (z. B. mit Hilfe eines Baculovirus-Vektors) oder Hefezellen. Andere geeignete Wirtszellen können bei Goeddel, (1990), vorstehend, gefunden werden oder sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Eukaryotische Expression eines bcl-X_L-Proteins kann vor prokaryotischer bevorzugt sein, weil die Expression eukaryotischer Proteine in eukaryotischen Zellen zu teilweiser oder vollständiger Glycolysierung und/oder Ausbildung von wichtigen Disulfidbrücken innerhalb von oder zwischen den Ketten eines rekombinanten Proteins führen kann. Bei Expression in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen für die Expressionsvektoren oft von viralem Material geliefert. Zum Beispiel stammen gewöhnlich verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalievirus und Affenvirus 40. Um ein bcl-X_L-Protein in Säugerzellen zu exprimieren, werden im Allgemeinen COS-Zellen (Gluzman, Y., (1981) Cell 23, 175–182) in Verbindung mit solchen Promotoren wie pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329, 840) zur vorübergehenden Amplifikation/Expression verwendet, während CHO-Zellen (dh fr^– Chinese Hamster Ovary, dh fr^–-Ovarzellen des chinesischen Hamsters) mit Vektoren wie etwa pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6, 187–195) zur stabilen Amplifizierung/Expression in Säugerzellen verwendet werden. Eine bevorzugte Zelllinie zur Produktion von rekombinantem Protein ist die NSO-Myelom-Zelllinie, zu erwerben von ECACC (Katalog #85110503) und beschrieben von Galfre, G. und Milstein, C. (1981) Methods in Enzymology 73(13), 3–46; und Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures, Academic Press, N.Y., N.Y). Beispiele von Vektoren für die Expression von rekombinanten Proteinen in Hefe (z. B S. cerivisae) umschließen pYepSecl (Baldari et al. (1987) Embo J. 6, 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, (1982) Cell 30, 933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54, 113–123), und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Baculovirus-Vektoren für die Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (SF 9-Zellen) umschließen die pAc-Serien (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3, 2156–2165) und die pVL-Serien (Lucklow, V. A. und Summers, M. D., (1989) Virology 170, 31–39).
Vektor-DNA kann in prokaryotische Zellen oder eukaryotische Zellen mit Hilfe von gebräuchlichen Transformations- und Transfektionstechniken wie etwa dem Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitationsverfahren, der DEAE-Dextran-vermittelten Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation eingebracht werden. Geeignete Verfahren zur Transformation von Wirtszellen können bei Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) und in anderen Laborhandbüchern nachgeschlagen werden.
Es ist bekannt, dass bei der stabilen Transfektion von Säugerzellen, abhängig vom Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik, nur ein kleiner Teil der Zellen DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten erkennen und selektieren zu können, wird allgemein ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z. B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszelle übertragen. Bevorzugte selektierbare Marker umschließen jene, die Resistenz gegen Wirkstoffe wie etwa G418, Hygromycin und Methotrexat aufweisen. Nucleinsäure, die einen selektierbaren Marker codiert, kann auf dem gleichen Plasmid wie das interessierende Gen in die Wirtszelle eingebracht werden, oder sie kann auf einem separaten Plasmid eingebracht werden. Zellen, die das interessierende Gen enthalten, können mit Hilfe von Wirkstoff-Selektion erkannt werden (z. B. Zellen, die das Gen für den selektierbaren Marker aufgenommen haben, können überleben, während die anderen Zellen absterben). Die überlebenden Zellen können dann auf die Produktion von bcl-X_L-Proteinen, zum Beispiel durch Immunfällung aus dem Zellüberstand mit einem anti-bcl-X_L-Antikörper untersucht werden.
Bcl-X_L-Proteine, die mit rekombinanter Technik hergestellt wurden, können aus einem das Protein enthaltenden Gemisch aus Zellen und Medium sekretiert und isoliert werden. Zur Sekretion von bcl-X_L-Protein wird eine DNA-Sequenz, die ein geeignetes Signalpeptid codiert, mit dem 5'-Ende der bcl-X_L codierenden Nucleotidsequenz verbunden, so dass bcl-X_L-Protein an das Signalpeptid gebunden ist, das die Zelle zur Sekretion des Proteins veranlasst. Alternativ kann das Protein im Cytoplasma zurück gehalten werden, und die Zellen können geerntet, lysiert und das Protein isoliert werden. Eine Zellkultur umschließt typischerweise Wirtszellen, Medien und andere Nebenprodukte. Geeignete Medien zur Zellkultur sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Protein kann aus Zellkulturmedium, Wirtszellen oder beiden mit Hilfe von Techniken isoliert werden, die auf dem Fachgebiet der Proteinreinigung bekannt sind.
Das mit rekombinanten Verfahren hergestellte bcl-X_L-Protein kann dann in einen geeigneten pharmazeutischen Trägerstoff auf solche Weise zur Verabreichung an ein Individuum verpackt werden, dass bcl-X_L-Protein in die T-Zellen des Individuums eingebracht wird, was zum Schutz der T-Zellen gegen Zelltod führt. Geeignete Trägerstoffe zur Verabreichung an ein Individuum werden hierin beschrieben. Zur Übertragung des rekombinanten bcl-X_L-Proteins in T-Zellen in vivo oder ex vivo wird das rekombinante Protein bevorzugt in Liposomen verpackt. Es können jedoch auch andere Trägersysteme verwendet werden.
Das Überleben von T-Zellen wird durch die Senkung der Proteinspiegel der Antagonisten von bcl-X_L wie etwa der Proteine bcl-X_S oder Bad erhöht. Senken der Proteinspiegel der bcl-X_L-Antagonisten kann erreicht werden, indem die T-Zellen mit mindestens einem Agens in Kontakt gebracht werden, das die Expression der die Antagonisten codierenden Gene senkt, oder indem eine Nucleinsäure oder andere Verbindung in die T-Zelle eingebracht wird, die die Spiegel der biologisch aktiven Antagonisten senkt. Verfahren zur Herabregulierung von bcl-X_S- und Bad-Proteinspiegel können von den hierin beschriebenen Verfahren zur Herabregulierung der bcl-X_L-Proteinspiegel abgeleitet werden.
Um T-Zelltod zu reduzieren, können alle vorstehend beschriebenen Verfahren kombiniert werden.
2. Pharmazeutische Zusammenstellungen
Die Erfindung betrifft in vitro Verfahren und Anwendungen zum Schutz einer T-Zelle vor Zelltod durch Erhöhung der bcl-X_L-Proteinspiegel in der T-Zelle. Erhöhung des bcl-X_L-Spiegels in einer T-Zelle kann durch Erhöhen des endogenen bcl-X_L-Proteinspiegels oder durch Einbringen einer Nucleinsäure, die ein bcl-X_L-Protein codiert, oder durch eine Kombination beider Verfahren erreicht werden. Der endogene bcl-X_L-Proteinspiegel kann erhöht werden, indem man die T-Zelle mit einem Agens in Kontakt bringt, das intrazellulär wirkt. Die Verfahren der Endung können in vivo, ex vivo oder in einer Kombination von beiden durchgeführt werden. Zur Durchführung der Verfahren der Erfindung ex vivo wird dem Individuum eine Population von T-Zellen entnommen, in vitro mit einem Agens in Kontakt gebracht, das die bcl-X_L-Proteinspiegel erhöht oder senkt und, wenn erwünscht, dem Individuum wieder verabreicht (diese Ausführungsform wird nachstehend genauer beschrieben). Der bcl-X_L-Proteinspiegel kann mit Hilfe der Western-Blot-Analyse beobachtet werden, wie hierin beschrieben.
Zur Anwendung der Endung in vivo werden die Agenzien den Individuen in einer biologisch verträglichen, zur pharmazeutischen Verabreichung in vivo geeigneten Form verabreicht. Mit "biologisch verträglicher, zur Verabreichung in vivo geeigneter Form" ist eine Form des zu verabreichenden Agens gemeint, bei der alle toxischen Wirkungen durch die therapeutischen Wirkungen des Agens aufgewogen werden. Zu verabreichende Agenzien umschließen Nucleinsäuremoleküle, die bcl-X_L-Proteine codieren, oder Agenzien, die intrazellulär wirken, um bcl-X_L-Proteinspiegel zu erhöhen oder zu senken, und Agenzien, die ein induzierbares Kontrollelement regulieren, das funktionell mit einem ein bcl-X_L-Protein codierenden Nucleinsäuremolekül verbunden ist, oder funktionell mit einem Nucleinsäuremolekül verbunden ist, das bcl-X_L-Antisense-Nucleinsäuremoleküle codiert.
Der Ausdruck "Individuum" soll lebende Organismen einschließen, bei denen eine Immunantwort ausgelöst werden kann, z. B. Säuger. Beispiele solcher Individuen umschließen Menschen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten und transgene Arten hiervon. Zum Beispiel umschließen Tiere innerhalb des Rahmens der Erfindung Tiere von landwirtschaftlichem Interesse wie etwa Vieh und Geflügel. Alternativ können die Verfahren auch bei Pflanzen angewendet werden.
Verabreichung einer therapeutisch aktiven Menge eines Agens der vorliegenden Erfindung ist als eine Menge definiert, die in Dosierungen und über Zeiträume wirksam und notwendig ist, um das gewünschte Ergebnis zu erreichen. Zum Beispiel kann eine therapeutisch aktive Menge eines Agens auf Grund von Faktoren wie Krankheitsstatus, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums und der Fähigkeit des Agens, eine erwünschte Reaktion im Individuum hervorzurufen, variieren. Dosierungsschemata können angepasst werden, um die optimale therapeutische Reaktion zu bekommen. Zum Beispiel können zahlreiche unterteilte Dosen täglich verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional reduziert werden, so wie es durch die Dringlichkeit der therapeutischen Situation angezeigt wird.
Das Agens kann in einer gebräuchlichen Weise verabreicht werden, wie etwa durch Injektion (subkutan, intravenös etc.), orale Verabreichung, Inhalation, transdermale Applikation oder rektale Verabreichung. Abhängig von der Art der Verabreichung kann das Agens mit einem Material überzogen werden, das es vor den Auswirkungen von Enzymen, Säuren und anderen natürlichen Bedingungen schützt, die das Agens inaktivieren können.
Wenn ein Agens auf anderem Weg als durch parenterale Verabreichung verabreicht werden soll, kann es notwendig sein, das Agens mit einem Material zu überziehen oder gleichzeitig zu verabreichen, das seine Inaktivierung verhindert. Zum Beispiel kann ein Expressionsplasmid, das ein ein bcl-X_L-Protein codierendes Nucleinsäuremolekül enthält, einem Individuum in einem geeigneten Trägerstoff oder einer Verdünnungsmittel zusammen mit Enzymhemmern oder in einem geeigneten Trägerstoff wie Liposomen verabreicht werden. Pharmazeutisch verträgliche Verdünnungsmittel umschließen Kochsalzlösung und wässrige Pufferlösungen. Enzymhemmer umschließen Pankreastrypsin-Hemmer, Diisopropylfluorphosphat (DEP) und Trasylol. Liposomen umschließen sowohl Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen als auch herkömmliche Liposomen (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7, 27). Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglycolen und Gemischen hieraus und in Öl hergestellt werden. Unter normalen Bedingungen von Lagerung und Gebrauch können diese Erzeugnisse ein Konservierungsmittel enthalten, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Arzneimittel, die zur Anwendung als Injektion geeignet sind, umschließen sterile wässrige Lösungen (soweit sie wasserlöslich sind) oder Dispersionen und sterile Puder zur Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen für den direkten Gebrauch. In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein, und sie muss in dem Maße flüssig sein, dass leichte Injizierbarkeit besteht. Sie muss unter den Bedingungen von Herstellung und Lagerung stabil sein und muss gegen die kontaminierenden Einflüsse von Mikroorganismen wie etwa Bakterien und Pilze geschützt sein. Der Trägerstoff kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmittel sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen) und geeignete Gemische hiervon enthält. Die richtige Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Hüllstoffes wie etwa Lecithin, durch das Erhalten der erforderlichen Partikelgröße im Falle der Dispersion und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Substanzen erreicht werden. Schutz vor der Aktivität von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungizide Agenzien, zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol; Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen erreicht werden. In vielen Fällen wird es vorteilhaft sein, isotonische Agenzien, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole wie etwa Manit, Sorbit, Kochsalz in die Zusammensetzung mit einzuschließen. Verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch Einschluss eines Agens in die Zusammensetzung erreicht werden, die die Absorption verzögert, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem das Agens in der erforderlichen Menge zusammen mit einem oder einer Kombination der vorstehend aufgezählten Inhaltstoffe, soweit sie erforderlich sind, in ein geeignetes Lösungsmittel gegeben und dann eine gefilterte Sterilisation durchgeführt wird. Dispersionen werden im Allgemeinen hergestellt, indem das Agens zu einem sterilen Trägerstoff gegeben wird, der ein Dispersionsmedium als Basis und die erforderlichen anderen Zusätze aus der Gruppe der vorstehend aufgezählten enthält. Im Fall der sterilen Puder zur Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung was zu einem Puder des aktiven Inhaltstoffs (z. B. Peptid) plus zusätzlich erwünschter Inhaltstoffe aus einer zuvor steril gefilterten Lösung führt.
Wenn das Agens auf geeignete Weise geschützt ist, wie vorstehend beschrieben, kann es oral verabreicht werden, zum Beispiel mit einem inerten Verdünnungsmittel oder einem assimilierbaren, essbaren Trägerstoff. Der hierin verwendete Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher Trägerstoff" umschließt alle möglichen Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Hüllstoffe, antibakteriellen und fungiziden Agenzien, isotonische und absorptionsverzögernde Agenzien und dergleichen. Der Gebrauch solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Soweit keine Unverträglichkeit mit dem Agens besteht, ist die Verwendung jedes gebräuchlichen Mediums oder Agens in den Arzneimitteln eingeschlossen. Ergänzende aktive Stoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingeschlossen sein.
Es ist besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in Form von Dosierungseinheiten zu formulieren, um die Verabreichung und die Vereinheitlichung der Dosierung zu erleichtern. Hierin verwendete Dosierungseinheiten betreffen physikalisch diskrete Einheiten, die sich als Einheitsdosierungen für die zu behandelnden Säugerindividuen eignen; jede Einheit besteht aus einer Verbindung einer zuvor festgelegten Menge der aktiven Substanz, die berechnet wurde, die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen, mit dem erforderlichen pharmazeutischen Trägerstoff. Die Spezifizierung der Dosierungseinheitsformen der Erfindung sind vorgegeben durch und direkt abhängig von (a) den einmaligen Eigenschaften des Agens und der besonderen therapeutischen Wirkung, die erreicht werden sollen und (b) den Begrenzungen, die mit der Art der Verarbeitung eines solchen Agens für die Behandlung von Sensitivität von Individuen einhergeht.
3. Anwendungsformen für die Verfahren der Erfindung
Die Erfindung betrifft in vitro-Verfahren und Anwendungen zum Schutz einer T-Zelle vor Zelltod, indem der bcl-X_L-Proteinspiegel in der T-Zelle erhöht wird. Diese Verfahren können entweder in vivo oder ex vivo durchgeführt werden. Bei der Anwendung ex vivo können einem Individuum periphere mononukleäre Blutzellen entnommen werden und durch Dichtegradientenzentrifugation, z. B. Ficoll/Hypaque, gewonnen werden. In einer besonderen Ausführungsform werden die gereinigten peripheren Blutzellen darauf mit einem Agens in Kontakt gebracht, das den bcl-X_L-Proteinspiegel moduliert. In anderen Ausführungsformen des Verfahrens werden die mononukleären peripheren Blutzellen weiter in speziellen Zelltypen angereichert, bevor sie mit dem Agens, das den bcl-X_L-Proteinspiegel moduliert, in Kontakt gebracht werden. Monocyten können zum Beispiel durch Adhäsion auf Plastik verringert werden. Falls erwünscht, kann die CD4+-T-Zell-Population durch Separation von den verbleibenden Monocyten, B-Zellen, NK-Zellen und CD8+-Zellen mit Hilfe von monoclonalem Antikörper (mAb) und anti-Maus-Ig überzogenen magnetischen kügelchen unter Verwendung von kommerziell erhältlichen mAbs (wie etwa anti-CD 14 (Mo2)-, anti-CD11b (Mol)-, antiCD20 (B1)-, anti-CD16 (3G8)- und anti-CD8 (7PT 3F9)-mAbs) weiter angereichert werden. Das Verfahren der Erfindung kann auch bei Untergruppen von CD4⁺-Zellen verwendet werden, wie etwa CD4⁺CD45RA⁺ (naive CD4⁺-T-Zellen)- und CD4⁺CD45RO⁺ (Gedächtnis-T-Zellen)-T-Zell-Untergruppen. Diese können, wie vorstehen beschrieben, mit der zusätzlichen Verwendung von anti-CD45RO-Antikörper (UCHLI) zur Herstellung der CD4⁺CD45RA⁺-Zellen und der Zugabe von anti-CD45RA-Antikörper (2H4) zur Herstellung der CD4⁺CD45RO⁺-T-Zellen hergestellt werden.
Die Wirksamkeit der Reinigung kann mit dem Durchflusscytometrieverfahren (Coulter, EPICS Elite) unter Verwendung von anti-CD3-, anti-CD4-, anti-CD-8-, anti-CD14-mAbs oder zusätzlichen Antikörpern, die spezifische Untereinheiten von T-Zellen erkennen, gefolgt von Fluoresceinisothiocyanat-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-Immunglobulin (Fisher, Pittsburgh, PA) oder anderen sekundären Antikörpern analysiert werden.
Der Typ der ex vivo verwendeten Zellpopulation hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Art des Agens, das zur Modulation des bcl-X_L-Proteinspiegels verwendet wird, der Art des Vehikels, das verwendet wird, um das Agens der T-Zelle zu übertragen und der Unterart der T-Zellen, in denen die Erhöhung des bcl-X_L-Proteinspiegels erwünscht ist. Wenn ein Agens jedoch eine Unterart von T-Zellen spezifisch beeinflusst (z. B. durch Verwendung eines Übertragungsvehikels, das nur auf eine spezifische Unterart von T-Zellen abzielt), ist die Reinigung der spezifischen Unterart von T-Zellen nicht notwendig. Vehikel, die ein Abzielen des Agens auf spezifische Unterarten von T-Zellen erlauben, umschließen Liposomen oder rekombinante virale Partikel, an die Moleküle gebunden sind, die spezifisch den gewünschten Zelltyp erkennen. Solche Moleküle umschließen Antikörper gegen Oberflächenmoleküle oder Liganden für Rezeptoren. Wenn nur auf eine selektive Unterart von T-Zellen abgezielt werden soll, z. B. CD4+-T-Zellen, und das verwendete Agens ist nicht in der Lage, selektiv auf diese Unterart von T-Zellen abzuzielen, kann es notwendig sein, die spezifische Unterart von T-Zellen zu isolieren, bevor die Zellen mit dem Agens in Kontakt gebracht werden.
Die peripheren Blutzellen oder gereinigte Unterarten hiervon, wie etwa T-Zellen, die einem Individuum entnommen wurden, werden dann in vitro bei Anwesenheit des Agens, das den bcl-X_L-Proteinspiegel in T-Zellen moduliert, inkubiert. Die Menge des Agens hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie etwa der Art des Agens, der erwünschten Wirkung und der Zellpopulation, die mit dem Agens in Kontakt gebracht wird. Die geeignete Menge des Agens, die der Zellpopulation zugegeben werden soll, kann durch die Durchführung von Untersuchungen bestimmt werden, bei denen der Zellkultur verschiedene Dosen des Agens zugegeben werden und die Menge an bcl-X_L-Protein zu verschiedenen Zeitpunkten mittels Western-Blot-Analyse ermittelt wird, wie hierin beschrieben. Wenn eine heterologe Zellpopulation mit dem Agens in Kontakt gebracht wird, kann es notwendig sein, zunächst die Unterart von T-Zellen, in denen bcl-X_L-Protein moduliert werden soll, zu isolieren, bevor die Zellen der Western-Blot-Analyse unterworfen werden. Spezifische Unterarten von T-Zellen können aus einer Zellpopulation durch negative Selektion, wie vorstehend beschrieben, isoliert werden, oder es kann alternativ eine spezifische Unterart von T-Zellen unter Verwendung von FACS isoliert werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden die aus einem Individuum isolierten T-Zellen mit einem Agens in Kontakt gebracht, das den bcl-X_L-Proteinspiegel moduliert und weiterhin in vitro kultiviert, um die T-Zellpopulation zu vermehren (d. h. die Anzahl der T-Zellen in der Population zu erhöhen). In vitro-Vermehrung einer Population von T-Zellen, die einem Individuum entnommen wurden, kann, wie in der veröffentlichten PTC-Patentanmeldung Nr. WO 94/29436 beschrieben, durchgeführt werden, deren Inhalt durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist.
Nach der Modulation der bcl-X_L-Proteinspiegel in den T-Zellen oder Unterarten von ihnen können die Zellen dem Individuum wieder verabreicht werden. Die Zellen können zunächst gereinigt werden, um alle Agenzien aus dem Kulturmedium, die dem Individuum nicht verabreicht werden sollen, zu entfernen. Die Reinigung kann zum Beispiel durch Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation durchgeführt werden.
Das Agens, das bcl-X_L-Proteinspiegel in T-Zellen moduliert, kann einem Individuum in einem physiologisch verträglichen Vehikel und in einer Menge verabreicht werden, die ausreicht, die erwünschte therapeutische Wirkung zu erlangen. Das Agens wird örtlich oder systemisch verabreicht, abhängig von der Art des Zustandes, der mit dem Verfahren der Endung zu behandeln ist. Geeignete Vehikel zur Verabreichung des Agens und Verabreichungsarten werden in Abschnitt 3 der vorliegenden Beschreibung behandelt.
3.1 Anwendung des Verfahrens der Erfindung auf Zustände, bei denen Schutz vor T-Zelltod vorteilhaft ist.
Die in vitro-Verfahren und Anwendungen der Erfindung sind bei der Bewahrung von T-Zellen vor dem Zelltod nützlich. Nach den Verfahren oder der Anwendung der Erfindung kann Zelltod in allen T-Zellen verhindert werden oder Zelltod kann alternativ selektiv in einer spezifischen Unterart von T-Zellen verhindert werden. Darüber hinaus können T-Zellen über einen ausgedehnten Zeitraum vor Zelltod geschützt werden oder alternativ über einen kurzen Zeitraum. Örtlich vorhandene T-Zellen oder systemisch vorhandene T-Zellen (z. B. im peripheren Blut) können vor Zelltod geschützt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das in vitro-Verfahren oder die Anwendung der Endung eingesetzt, um Zelltod von CD4+-T-Zellen eines HIV-infizierten Individuums zu verhindern und T-Zellen vor HIV-Infektion zu schützen. Während einer HIV-Infektion infiziert und tötet das Virus CD4+-T-Zellen. Auf diese Weise verringert sich die Anzahl der CD4+-T-Zellen im Individuum fortschreitend auf Zahlen, die nicht ausreichend sind, das Individuum vor der Infektion von Mikroorganismen zu schützen. Es ist beobachtet worden, dass T-Zellen, in denen der bcl-X_L-Proteinspiegel erhöht war, signifikanten Schutz gegen HIV-Infektion aufwiesen, was durch erhöhte Lebensfähigkeit der T-Zellen gemessen wurde (vgl. Beispiel 9). Daher schützt das Erhöhen des bcl-X_L-Proteinspiegels in T-Zellen die T-Zellen vor Zelltod, der durch HIV ausgelöst wird. Überexpression von bcl-X_L-Protein in T-Zellen liefert daher ein wirksames Verfahren, die Anzahl von CD4+-T-Zellen in einem HIV-infizierten Individuum aufrecht zu erhalten. Darüber hinaus kann das in vitro-Verfahren oder die Anwendung der Erfindung zu erhöhten Zahlen von CD4+-T-Zellen in einem HIV-infizierten Individuum führen und/oder zu einer reduzierten Rate der T-Zell-Abnahme in einem HIV-infizierten Individuum.
Das in vitro-Verfahren oder die Anwendung der Erfindung stellt Verfahren zur Verfügung, die Vermehrung einer T-Zellpopulation eines Individuums erlauben, das eine T-Zell-anoriierte Störung aufweist, wie etwa eine Infektion mit HIV oder einem anderen infektiösen Agens, die T-Zellen anfällig für Zelltod macht. Das Verfahren stellt daher ein Verfahren zur Vermehrung der Zellen in vitro zur Verfügung. Die vermehrte T-Zellpopulation kann dann dem Individuum wieder zurück verabreicht werden. Die T-Zellen können mit einer Kombination von Agenzien stimuliert werden, die den T-Zellen ein primäres Aktivierungssignal liefern, und einem Agens, das den T-Zellen ein costimulierendes Signal liefert. Die T-Zellen können mit einer Kombination aus einem Agens, das mit CD28 auf der T-Zelle in Wechselwirkung tritt, und einem Agens, das die T-Zellen durch den T-Zell-Rezeptor stimuliert, kultiviert werden, so dass der bcl-X_L-Proteinspiegel erhöht wird und die Zellen vor Zelltod geschützt sind.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung zur Verhinderung von Zelltod in einem HIV-infizierten Individuum werden dem Individuum periphere Blutzellen entnommen, in vitro modifiziert, um die Menge von bcl-X_L-Protein in den CD4+ T-Zellen zu erhöhen und dem Individuum zurück verabreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die CD4+-T-Zellen des Individuums in der Weise modifiziert, dass sie einen erhöhten bcl-X_L-Proteinspiegel aufweisen, indem ein ein bcl-X_L-Protein codierendes Nucleinsäuremolekül in die T-Zellen eingebracht wird. Das bcl-X_L-Protein codierende Nucleinsäuremolekül kann innerhalb eines viralen Vektors liegen, der mit Verfahren wie der Infektion der Zellen mit dem viralen Partikel in die T-Zellen eingebracht wird. Die CD4+-T- Zellen können vor der Rück-Verabreichung in das Individuum in Kultur weiter vermehrt werden. In dieser Weise gestattet die Anwendung, wie beschrieben, die Wiederbesiedlung des Immunsystems eines mit HIV infizierten Individuums mit CD4+-T-Zellen und macht diese CD4+-T-Zellen gleichzeitig resistent gegen Infektion durch das Virus.
Es ist ebenso möglich, die CD4+-T-Zellen eines mit HIV infizierten Individuums vor Zelltod zu schützen, indem ein Agens verwendet wird, das den bcl-X_L-Proteinspiegel in den CD4+-T-Zellen des Individuums erhöht. Das Agens kann ein ein bcl-X_L-Protein codierendes Nucleinsäuremolekül sein, das in einem physiologisch verträglichen Vehikel enthalten ist. Das Vehikel kann weiterhin so beschaffen sein, dass es die Nucleinsäure spezifisch zu CD4+-T-Zellen bringt. Alternativ ist das Agens ein Agens, das intrazellulär wirkt, um bcl-X_L-Proteinspiegel in CD4+-T-Zellen zu erhöhen.
In einer anderen Ausführungsform werden die T-Zellen eines mit HIV infizierten Individuums durch Kombination der vorstehend beschriebenen in vivo- und ex vivo-Verfahren vor Zelltod geschützt. Die Anwendung kann auch beinhalten, die CD4+-T-Zellen des Individuums in vivo und/oder ex vivo mit mehreren Agenzien in Kontakt zu bringen, die den bcl-X_L-Proteinspiegel erhöhen. Zum Beispiel wird eine ein bcl-X_L-Protein codierende Nucleinsäure in die T-Zellen eingebracht, und die T-Zellen werden darauf mit einem Agens in Kontakt gebracht, das intrazellulär wirkt, um den endogenen bcl-X_L-Proteinspiegel zu erhöhen.
Alternativ wird die Anwendung zur Verstärkung einer Immunreaktion beschrieben, mit der eine Infektion schneller bekämpft werden soll. Auf diese Weise können aktivierte T-Zellen vor Zelltod geschützt werden, indem sie mit einem Agens in Kontakt gebracht werden, das den bcl-X_L-Proteinspiegel in den T-Zellen erhöht, so dass sie vor Zelltod geschützt sind. Schutz von CD4+-T-Zellen vor Zelltod nach Aktivierung der T-Zelle wird der T-Helferzelle gestatten, einer größeren Anzahl von Effektorzellen "Hilfe" zu leisten, als den T-Helferzellen normalerweise möglich wäre. In ähnlicher Weise wird eine CD8+-T-Zelle, die eine verlängerte Lebensspanne hat, in der Lage sein, eine größere Anzahl von Zielzellen zu lysieren als eine CD8+-T-Zelle mit einer normalen Lebenszeit. Anwendungen im Rahmen der Erfindung sind Verfahren zur Behandlung systemischer Infektionen und örtlicher Infektionen.
Das Agens kann daher systemisch oder örtlich verabreicht werden. Die Beschreibung stellt dar, dass das Agens, das den bcl-X_L-Proteinspiegel in T-Zellen erhöht, ein Agens sein kann, das intrazellulär wirkt, um den bcl-X_L-Proteinspiegel zu erhöhen. Das Agens kann ein Agens sein, das eine kurze Halbwertszeit hat, so dass die Lebensspanne der aktivierten T-Zelle nicht länger als notwendig verlängert wird (z. B. wird die aktivierte T-Zelle eine T-Gedächtniszelle oder stirbt nach Überwindung der Infektion).
Die nachstehende Endung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert, die nicht als weitere Begrenzung gedacht sind. Die Inhalte aller Referenzen, schwebender Patentanmeldungen und veröffentlichter Patente, die in dieser Patentanmeldung zitiert werden, sind hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlossen.
Beispiele
Beispiel 1: Aktivierung verbessert das Überleben von T-Zellen nach γ-Bestahlung
Um die Wirkungen von T-Zell-Aktivierungswegen auf das T-Zell-Überleben zu untersuchen, wurden ruhende T-Zellen durch negative Selektion, wie vorstehend beschrieben, aus menschlichem peripherem Blut isoliert (June, C. H. et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 4472-4481). Kurz gesagt wurden die Zellen einem Cocktail aus Antikörpern ausgesetzt, um alle Zellen außer ruhenden CD28-positiven T-Zellen zu entfernen. Die Zellen wurden in RPMI 1640 kultiviert, ergänzt mit fötalem Kälberserum (10%), L-Glutamin (2 mM), Penicillin/Steptomycin (100 U/ml, 100 μg/ml) und Hepes (20 mM). Vor Aktivierung oder Bestrahlung konnten die Zellen über Nacht ruhen.
CD28+-T-Zellen wurden in Medium allein kultiviert oder durch Querverknüpfung des TCR/CD3-Komplexes in Anwesenheit oder Abwesenheit von Costimulation, ausgelöst von einem CD28-spezifischen monoclonalen Antikörper, über 12 Stunden stimuliert. Querverknüpfung des T-Zell-Rezeptors wurde unter Verwendung von Platten-immobilisiertem anti-CD3 (G19.4 [mit 1 μg/ml]) durchgeführt, und die Costimulation der T- Zellen wurde mit löslichem Antikörper gegen CD28 (monoclonaler Antikörper (mAB) 9.3) mit 1 μg/ml durchgeführt. Zellen aus jeder dieser Gruppen wurden dann in Gruppen aufgeteilt. Eine Gruppe wurde ohne weitere Manipulationen kultiviert, während die anderen Gruppen mit 15 Gy γ-Strahlung aus einem Cäsiumquellen-γ-Strahler (J. L. Shepherd Inc.) bestrahlt wurden. Nach der Bestrahlung wurden die Zellen mit 100.000 Zellen pro Vertiefung in Kulturschalen mit 96 Vertiefungen (Costar) ausgebracht, und Lebensfähigkeit und Gesamtzellzahl wurden mit Trypanblau-Ausschlussverfahren und Propidiumjodid-Ausschlussverfahren untersucht.
Für das Propidiumjodid-Ausschlussverfahren wurden zwei getrennte Proben mit 2 × 10⁵ Zellen pelletiert und in 0,5 ml PBS, ergänzt mit 1% BSA und 0,01% Natriumazid, resuspendiert. Darauf wurden zwei ml Propidiumjodid (0,5 mg/ml) zu den Zellen zugegeben, und die Proben wurden dann mit FACS unter Verwendung einer FACSort- und Lysis II-Software analysiert. Prozent Überlebensfähigkeit wurde durch Teilen der Anzahl der Zellen, die Propidiumjodid ausschlossen (lebensfähig), durch die Gesamtzellzahl ermittelt. Eigenschaften der lebenden Zellen zur Vorwärtslichtstreuung wurden benutzt, um Zellreste von der Analyse zu entfernen.
Die Ergebnisse werden in 1 grafisch dargestellt. Alle drei Zellpopulationen behielten während der viertägigen Kulturperiode hohe Lebensfähigkeit (1, Tafel A). Das Überleben von ruhenden und aktivierten T-Zellen nach γ-Bestrahlung wurde ebenfalls untersucht (1, Tafel B). Durch γ-Bestrahlung ausgelöste Apoptose benötigt keine spezifische Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Ligand und kann daher als ein Werkzeug für Untersuchungen angesehen werden, wie Zellaktivierung das Zell-Überleben beeinflusst, ohne dass bestimmte Rezeptorspiegel berücksichtigt werden müssen. Die in diesen Untersuchungen eingesetzte Dosis (15 Gy) ist ausreichend, tödliche DNA-Beschädigungen in nahezu allen Zellen der Population auszulösen. Daher kann die Rate, mit der die Zellen in den nachfolgenden Tagen sterben, als Maß für ihre Fähigkeit verwendet werden, einem PCD als Reaktion auf DNA-Beschädigung zu widerstehen.
Tafel B der 1 zeigt, dass nach der Bestrahlung die Lebensfähigkeit von ruhenden T-Zellen viel schneller abnimmt, als in jeder Population stimulierter Lymphocyten. Vier Tage nach der Bestrahlung waren T-Zellen in jeder aktivierten Population mit höherer statistischer Wahrscheinlichkeit am Leben als in der ruhenden Population (p < 0,02). Zellen, die durch den CD28-Rezeptor costimuliert worden waren, zeigten gegenüber Zellen, die mit anti-CD3 allein stimuliert worden waren, eine leichte, aber reproduzierbare Erhöhung des Überlebens. Die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen in anti-CD3-stimulierten und anti-CD3 + anti-CD28-stimulierten Zellen war nicht das Ergebnis nachfolgender Zellproliferation, denn Zellzählungen, die parallel zu den Untersuchungen der Lebensfähigkeit durchgeführt wurden, zeigten, dass sich die absolute Anzahl der Zellen nicht veränderte. Darüber hinaus waren alle Zellen in den aktivierten Populationen innerhalb des Zellzyklus entweder im späten G1- oder G2-Stadium fixiert. Der Zelltod folgte in allen drei Populationen klassischen Apoptose-Mustern, wobei sich die Zellen zuerst einkerbten, worauf Kernkondensation und DNA-Fragmentierung folgten.
Damit zeigt dieses Beispiel, dass Aktivierung von T-Zellen ihre Überlebensrate nach γ-Bestrahlung verbessert.
Beispiel 2: CD28-Costimulation erhöht die Überlebensrate von anti-CD3-aktivierten T-Zellen
Ein Unterschied zwischen Zellen, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von CD28-Costimulation stimuliert werden, ist der Gehalt an Lymphokinen, die von diesen Zellen produziert werden (Lindsten, T. et al. (1989) Science 244, 339–343). Vorangegangene Untersuchungen hatten nahegelegt, dass Wachstumsfaktoren in einer Reihe von Zelltypen eine wichtige Rolle in der extrinsischen Regulierung des Überlebens von Zellen spielen (Groux, H. et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23, 1623–1629); Nunez, G. et al. (1990) J. Immunol. 144, 3602–3610). Um zu bestimmen, ob Wachstumsfaktoren für die schützende Wirkung der Costimulation verantwortlich waren, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
CD28+-T-Zellen wurden in Anwesenheit von CD3-Antikörper in Anwesenheit oder Abwesenheit von Costimulation mit einem anti-CD28 monoclonalen Antikörper über 12 Stunden in Kultur genommen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Zellen wurden dann entweder in ihrem konditionierten Medium gelassen, gewaschen und in frischem Medium resuspendiert oder gewaschen und in frischem Medium resuspendiert, das mit 200 U/ml rekombinantem IL-2 (rIL-2) (Boehringer-Mannheim) ergänzt war. Aliquots aus jeder Gruppe wurden dann unmanipuliert gelassen oder 15 Gy von γ-Bestrahlung unterworfen. Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Propidiumjodid-Ausschlussverfahren täglich über 4 Tage nach der Manipulation bestimmt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Ergebnisse werden in 2 grafisch dargestellt. Tafel A der 2 zeigt, dass T-Zellen, die durch den TRC/CD3-Komplex allein aktiviert worden waren, in der Kultur nach der Aktivierung eine hohe Lebensfähigkeit behielten. Jedoch das Entfernen des konditionierten Mediums durch Waschen der stimulierten Zellen verringerte die Fähigkeit der Zellen, in der Kultur zu überleben, erheblich. Diese reduzierte Fähigkeit zum Überleben in der in vitro-Kultur kann durch Zugabe von IL-2 vollständig umgekehrt werden. Wenn anti-CD-stimulierte Zellen mit 15 Gy γ-Strahlen bestrahlt wurden (2, Tafel B), führte das Entfernen von konditioniertem Medium nach Stimulation über Nacht zu einer starken Reduktion der Lebensfähigkeit der Zellen, die durch die Zugabe von IL-2 umgekehrt wurde. Dies zeigt, dass Überleben von Antigen-Rezeptor-aktivierten Zellen primär durch die Spiegel extrinsischer Wachstumsfaktoren bestimmt wird. Die Fähigkeit aktivierter T-Zellen, in Kultur zu überleben, beruht daher auf ihrer autokrinen Fähigkeit, Wachstumsfaktoren wie IL-2 zu produzieren. Diese Daten bestätigen, dass IL-2 ein extrinsischer Regulator der T-Zell-Überlebensrate ist.
Im Unterschied zu diesen Ergebnissen mit T-Zellen, die durch den TCR/CD3-Komplex allein stimuliert wurden, unterscheiden sich T-Zellen, die mit einer Kombination aus anti-CD3 + anti-CD28 stimuliert wurden, nicht in ihrem Überleben, weder wenn sie von endogen produzierten Lymphokinen rein gewaschen wurden, noch wenn weiteres IL-2 in die Kulturüberstände zugegeben wurde (2, Tafeln C und D).
Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen, dass CD28-vermittelte Costimulation nicht nur die Produktion extrinsischer Mediatoren für das Überleben der Zelle beeinflusst, sondern auch eine Rolle bei der Regulierung der intrinsischen Empfänglichkeit der Zellen, einen PCD zu erleiden, spielt (im nachstehenden Beispiel weitergehend untersucht).
Beispiel 3: Expression von bcl-2- und bcl-X-mRNA während T-Zell-Aktivierung
Um die Rolle von CD28 bei der Regulierung der Expression von Genen herauszufinden, die mit dem intrinsischen Widerstand der T-Zellen gegen PCD zu tun haben, wurde der Spiegel der Expression von bcl-X und bcl-2 in ruhenden menschlichen T-Zellen und T-Zellen, die durch Querverknüpfung des TCR-Antigen-Rezeptor-Komplexes aktiviert wurden, in Anwesenheit oder Abwesenheit von anti-CD28 untersucht.
RNA wurde aus CD28+-T-Zellen, die in Medium allein kultiviert wurden, oder nach der Stimulation mit anti-CD3 oder anti-CD28 über 1, 6 und 12 Stunden isoliert und durch Northern-Blot Hybridisierung analysiert. RNA wurde aus den T-Zellen durch Zentrifugation durch Guanidium/CsCl₂-Gradienten isoliert, wie bereits beschrieben (June, C. H. et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 4472-4481). Gleiche Mengen mRNA (erhalten durch Ethidiumbromid-Färbung von ribosomaler 28 S-RNA, elektrophoretisch aufgetrennt auf nicht denaturierenden Agarose-Gels) wurden auf denaturierende Agarose/Formaldehyd-Gele geladen und nach Größe getrennt. Die Gele wurden auf Nitrocellulose (Schleicher und Schuell) übertragen und im Vakuum über 2 Stunden bei 80°C gebacken. Die Blots wurden bei 42°C über 6 Stunden in Stark-Lösung (50% Formamid, 5 × SSC (1 × SSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), 1 × Denhardt-Lösung, 25 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,5, 250 μg Torula-RNA pro ml) prähybridisiert und in Stark-Lösung mit 10% Dextransulfat und ³²P-markierten, nick-translatierten Sonden (1 × 10⁶ DpM/ml) über Nacht bei 42°C hybridisiert. Die Blots wurden mit Sonden, die für menschliche bcl-X_L-cDNA und murine bcl-2-cDNA spezifisch sind (S. Korsmeyer), nacheinander sondiert und gestripped.
Die Ergebnisse der Northern-Blot-Hybridisierung werden in 3, Tafel A dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass weder bcl-X- noch bcl-2-mRNA in nachweisbaren Mengen in ruhenden T-Zellen exprimiert werden. Die Expression sowohl von bcl-2- als auch von bcl-X-mRNA wird jedoch innerhalb von 6 Stunden nach T-Zell-Aktivierung ausgelöst. CD28-Costimulation hatte keine signifikante Auswirkung auf die Expression von bcl-2-mRNA. Im Gegensatz dazu verstärkte CD28-Costimulation die Expression von bcl-X-mRNA. Zellen, die mit anti-CD3 und anti-CD28 stimuliert worden waren, behielten die Expression von bcl-X auf hohem Niveau über 48 Stunden bei, bevor die Spiegel zu sinken begannen. Ein drittes Mifglied der bcl-2-Familie, von dem man annimmt, dass es eine negative Rolle bei der Regulierung der Funktion von bcl-2 spielt, ist das Gen bax. Costimulation hatte auch keinen Einfluss auf bax-mRNA-Spiegel.
Alternativ kann der Einsatz der beiden Spleiß-Donoren am 5'-Ende im ersten Exon von bcl-X zwei unterschiedliche mRNA-Arten ergeben. bcl-X_L erhält die vollständige Codierungsregion von Exon 1 und bewirkt Erhöhung des Zell-Überlebens. Im Gegensatz dazu ergibt der Einsatz einer stromaufwärts gelegenen Spleiß-Donorstelle innerhalb des Exons 1 die bcl-X_S-mRNA, die eine Deletion von 189 Bp innerhalb der Codierungsregion von Exon 1 enthält. Das bcl-X_S-Protein wirkt als ein dominanter negativer Regulator sowohl von bcl-2- als auch von bcl-X_L-Funktionen (Boise, L. H. et al. (1993) Cell 74, 597–608). Weil sich die bcl-X_S- und bcl-X_L-mRNAs nur um 189 Bp unterscheiden, wurde RNase-Schutz durchgeführt, um zu bestimmen, welche bcl-X-mRNA durch T-Zell-Aktivierung und Costimulation induziert wurde.
Untersuchungen zum RNase-Schutz wurden an RNA durchgeführt, die aus T-Zellen isoliert wurde, die entweder ruhten oder über 6 oder 12 Stunden mit anti-CD3 oder anti-CD3 und anti-CD28 stimuliert worden waren. Die RNase-Schutz-Analyse (RPA) wurde nach den Anleitungen eines käuflich zu erwerbenden Kits (Ambion) durchgeführt. 3 μg T-Zell-RNA wurden an eine radiomarkierte Ribosonde hybridisiert, die durch Schneiden der bcl-X_L-cDNA in einem pBluescript SK+-Plasmid mit AccI und in vitro-Erzeugen von Transkripten vom T3-Promotor mit Hilfe eines Kits von Promega erzeugt wurden. Die Ribosonde mit 336 Nukleotiden wurde mittels Gel-Elektrophorese gereinigt, extrahiert und an T-Zell-RNA über 16 Stunden bei 42°C hybridisiert, bevor sie zu einem Cocktail aus RNaseA und RNaseT1 zugegeben wurde. Schutz der Sonde durch bcl-X_L-mRNA ergab ein Fragment aus 264 Nucleotiden, während Hybridisierung an den bcl-X_S-Boten ein Fragment aus 163 Nukleotiden der radiomarkierten Sonde ergab. Die Schutz-Produkte wurden auf 5% Acrylamid/7M Harnstoff-Sequenzierungsgel getrennt. Endmarkiertes pBluescript SKII+, mit HpaII gespalten, wurde als Marker verwendet. Die Gele wurden getrocknet und einem XAR-5-Film (Kodak) ausgesetzt.
Die Ergebnisse der RNase-Schutz-Untersuchung werden in 3, Tafel B dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Haupt-bcl-X-mRNA, die durch CD28-Costimulation herauf geregelt wird, bcl-X_L ist. Eine geringe Induktion ist auch bei den bcl-X_S-Spiegeln zu erkennen.
Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen daher, dass Costimulation von aktivierten T-Zellen durch CD28 einen signifikanten Anstieg von bcl-X_L-mRNA zur Folge hat.
Beispiel 4: T-Zellen zeigen konstitutive Expression von bcl-2-Protein
Da bereits berichtet worden war, dass die Spiegel von bcl-2-mRNA nicht gut mit den Spiegeln von Bcl-2-Protein überein stimmen (Cheq-Dechamps, C. M. et al. (1993) Blood 81, 293–298), wurde die Menge an Bcl-2-Protein in aktivierten, mit anti-CD28 costimulierten oder nicht costimulierten T-Zellen bestimmt.
Für dieses Beispiel wurden CD28+-T-Zellen, wie vorstehend angegeben, über 0, 6, 12 oder 24 Stunden mit anti-CD3- oder anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern kultiviert, und der bcl-2-Proteinspiegel wurde durch Immunfällung und Western-Blot-Analysen bestimmt. Zu jedem Zeitpunkt wurden aus jeder der einzelnen Kulturbedingungen 4 × 10⁷ Zellen isoliert und in 1,0 ml NET-N (100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris, pH-Wert 8,0, 0,2% NP-40) lysiert. Kerne und Zellreste wurden in einer Mikrozentrifuge über 2 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dann über 30 min mit 50 ml Pansorbin (Calbiochem) vorgeklärt. Nach der Entfernung des Pansorbin durch Zentrifugation wurde der Überstand in zwei gleiche Volumina (450 ml) aufgeteilt, denen entweder 1 μl anti-bcl-X-Kaninchenserum (vgl. Beispiel 5) oder 2,5 μg anti-Bcl-2-monoclonaler 6C8 vom Hamster (Hockenbery, D. et al. (1990) Nature 348, 334–336) zugegeben wurde. Die Lysate wurden bei 4°C über 1 Stunde geschüttelt, bevor 25 μl Protein A-Agarose (Gibco BRL) über weitere 30 min zugegeben wurden. Die Immunfällungen wurden pelletiert und zweimal mit NET-N und einmal mit NET gewaschen. Einhundert μLiter 2 × SDS-Ladungspufferlösung wurde dem Pellet zugegeben, das schockgefroren und bei –20°C gehalten wurde, bis die Gel-Elektrophorese durchgeführt wurde.
Die Immunfällungen wurden gekocht und der SDS-PAGE-Analyse mit 15% Gelen unterworfen. Die Gele wurden mittels Elektroblotting unter Verwendung des BioRad-Transferapparats bei 200 mA über 3 Stunden auf Nitrocellulose übertragen. Die Blots wurden über Nacht bei 4°C in 5% Magermilch/0,2% Tween 20 blockiert und mit gereinigtem 6C8 mAb (1 : 200) in der vorstehend beschriebenen Blockierungslösung hybridisiert. Die Western-Blots wurden mit Hilfe des ELC-Systems (Amersham) mit Hyperfilm (Amersham) entwickelt.
Die Ergebnisse des Western-Blots sind in 4 dargestellt. Man kann sehen, dass ruhende T-Zellen des peripheren Blutes hohe Bcl-2-Proteinspiegel exprimierten. Darüber hinaus unterscheiden sich die Bcl-2-Proteinspiegel nicht signifikant in den ersten 24 Stunden nach der TCR/CD3-Rezeptor-Querverknüpfung mit einem anti-CD3-Antikörper. Costimulation durch den CD28-Rezeptor schien ebenfalls keine Auswirkung auf die Bcl-2-Proteinspiegel zu haben.
Dieses Beispiel zeigt, dass ruhende T-Zellen bcl-2-Protein exprimieren und dass Stimulation der T-Zellen durch den T-Zell-Rezeptor mit oder ohne Costimulation den bcl-2-Proteinspiegel nicht erhöht.
Beispiel 5: CD28-Costimulation verstärkt Expression von bcl-X_L-Protein
In diesem Beispiel wurde der bcl-X_L-Proteinspiegel in ruhenden T-Zellen oder T-Zellen, die durch den T-Zell-Rezeptor in Anwesenheit oder Abwesenheit von Costimulation durch CD28 aktiviert worden waren, analysiert.
Der bcl-X_L-Proteinspiegel wurde in der in Beispiel 4 beschriebenen Untersuchung parallel zu der Bestimmung der Bcl-2-Proteinspiegel bestimmt. Tatsächlich wurde der Überstand nach Vorklärung in zwei gleiche Volumina (450 ml) aufgeteilt, und 1 μl anti-bcl-X-Kaninchenserum wurde zu einem dieser Aliquots zugegeben. Die Proteinspiegel wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben, mit Hilfe des monoclonalen anti-bcl-X-Antikörpers 2A1 (Verdünnung 1 : 10) bestimmt.
Polyclonale und monoclonale Antikörper gegen bcl-X wurden auf folgende Weise hergestellt. Der offene Leserahmen von bcl-X_S wurde durch PCR mit den Primern (5'-GGA GAT ATA CAT ATG TCT CAG AGC AAC CGG GAG CTG GTG-3' und 5'-CGG GAT CCC GTC ATT TCC GAC TGA AGA GTG AGC CCA GCA G-3') amplifiziert und in die NdeI- und BamHI-Stellen von pET-3b (Novagen) cloniert. Rekombinantes Protein wurde in BL21-Zellen durch Induktion mit 0.4 mM IPTG hergestellt. Dieses Protein wurde in der unlöslichen Fraktion einer Lyse der Bakterien aufgefunden und zum Teil auf diese Weise gereinigt. Die unlösliche Fraktion wurde mit 2M Harnstoff gewaschen und in 6M Guanidin-HCl gelöst. Das Protein wurde durch eine Stufendialyse durch 3M und 1M Guanidin-HCl, gefolgt von Dialyse gegen PBS, pH-Wert 8,3, mit 500 mM KCl renaturiert. Die Proteinkonzentration wurde durch den Bradford-Test mit einem käuflich zu erwerbenden Kit (BioRad) bestimmt, und die Proteinreinheit wurde mit SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung ermittelt.
Zur Herstellung von polyclonalen Antikörpern von Kaninchen wurde 1 μl des rekombinanten Proteins in vollständiger FreundscherAdjuvants-Lösung (CFA) suspendiert und subkutan an vielen Stellen auf dem Kaninchenrücken injiziert. Die Immunreaktion der Tiere wurde mit 200 μg Protein in unvollständiger FreundscherAdjuvants-Lösung verstärkt. Die Seren wurden mittels Western-Blot-Analyse gegen rekombinantes Potein und auf spezifische Immunfällung unter Verwendung von in vitro translatierten Proteinen und transfizierten Zelllinien durchmustert.
Zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern wurden BALB/C-Mäuse mit rekombinantem bcl-X_S in Polyacrylamid-Gel, emulgiert in CFA, immunisiert, das subkutan in die Hinterpfoten und intraperitoneal injiziert wurde. Die Immunreaktion der Mäuse wurde zweimal in Intervallen von 30 Tagen mit einem Gemisch aus löslichem und in Acrylamid gebettetem, Gel-gebundenem Protein, emulgiert in unvollständiger FreundscherAdjuvants-Lösung, verstärkt. Drei Tage nach der letzten Verstärkung wurden Milz- und Lymphknotenzellen geerntet und mit P3X63-Ag8.653-Myelomzellen unter Verwendung von Standardtechniken fusioniert (Kearney, J. F. (1984) In Fundamental Immunology, W. E. Paul, Hrsg., Raven Press, NY, 751–766). Vierzehn Tage nach der Fusion wurden die Hybridom-Überstände mittels ELISA-Test in Vertiefungen, die mit rekombinantem bcl-X_S zu 5 μg/ml in Borat-gepufferter Kochsalzlösung (pH-Wert 8,4) bedeckt waren, auf Aktivität untersucht. Hybridom-Überstände, die im ELISA-Test positiv waren, wurden mittels Western-Blot-Analyse gegen FL5.12, transfiziert mit bcl-X_L oder bcl-2, durchmustert. Positive Hybridom-Linien wurden durch Begrenzung der Verdünnung cloniert, wiederum durchmustert und dann Pristan-sensibilisierten BALB/c-Mäusen zur Ascites-Herstellung injiziert.
Die Ergebnisse der Western-Blot Analyse, die bcl-X Proteinspiegel zeigt, sind in 4 dargestellt. Bcl-X-Proteinspiegel veränderten sich signifikant mit dem Spiegel der T-Zell-Aktivierung. In ruhenden T-Zellen des peripheren Blutes wurden keine nachweisbaren Produkte des bcl-X-Proteins gefunden. Das Protein, das mit den Antikörpern der Western-Blot-Analyse erkannt wurde, gehört zu bcl-X_L und nicht zu bcl-X_S, denn sowohl in vitro-translatiertes bcl-X_L als auch bcl-X_L-Protein, das in Zellen synthetisiert worden war, die mit der zugehörigen cDNA transfiziert worden waren, haben eine Größe von etwa 29 kDa, während bcl-X_S-Protein etwa 21 kDa groß ist (Boise, L. H. et al. (1993) Cell 74, 597–608).
4 zeigt darüber hinaus, dass anti-CD3-Stimulation von ruhenden T-Zellen die Expression von nachweisbarem bcl-X_L-Protein auslöst, das zum ersten Mal 6 Stunden nach der Stimulation beobachtet wurde und sich in der Zelle während der 24-stündigen Periode der Analyse ansammelte. Darüber hinaus verstärkte CD28-Costimulation von anti-CD3-stimulierten Zellen signifikant die Expression von bcl-X_L-Protein. Zu keinem Zeitpunkt wurde bcl-X_S-Protein beobachtet.
In einem anderen Beispiel wurden ruhende T-Zellen über 24 Stunden mit Medium allein, anti-CD28, anti-CD3, anti-CD3 und anti-CD28 oder anti-CD3 und IL-2 (100 U/ml) aktiviert. Cytoplasmatische Extrakte wurden, wie beschrieben hergestellt, und durch SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse mit einem polyclonalen bcl-X-Serum untersucht.
Die Ergebnisse, die in 5 dargestellt sind, zeigen, dass sowohl ruhende T-Zellen als auch T-Zellen, die mit CD28 inkubiert wurden, kein bcl-X_L-Protein exprimierten. CD28-Costimulation von anti-CD3-stimulierten Zellen verstärkten jedoch die Expression von bcl-X_L-Protein signifikant (4 und 5). Die Expressionsspiegel von bcl-X_L in anti-CD3 + anti-CD28-stimulierten Zellen waren nach 24 Stunden ähnlich wie jene, die in stabilen Transfektanten erhalten wurden, in denen bcl-X_L unter Kontrolle der langen terminalen Wiederholungssequenz des Fokus-bildenden Milz-Virus exprimiert wird (letzte Linie in 5).
CD28-Costimulation führte zur Verstärkung der Akkumulation von bcl-X_L-Protein, die zuerst 6 Stunden nach der Stimulation und kontinuierlich in den folgenden 24 Stunden des Kulturzeitraumes zu beobachten war (4 und 5). Im Gegensatz dazu erhöhte die Behandlung der Zellen mit anti-CD3 und IL-2 (100 Units/ml) die bcl-X_L-Expression nicht über die Spiegel hinaus, die in mit anti-CD3 allein behandelten T-Zellen beobachtet worden waren (5). Darüber hinaus ließ die Behandlung von anti-CD3-aktivierten T-Zellen mit monoclonalen Antikörpern gegen CD2, CD5, CD11a, CD18 oder MHC Klasse 1 die bcl-X_L-Spiegel nicht über jene von Zellen steigen, die mit anti-CD3 allein behandelt worden waren.
Diese Ergebnisse zeigen, dass ruhende T-Zellen bcl-X_L-Protein nicht exprimieren, T-Zellen, die mit anti-CD3 aktiviert werden, exprimieren bcl-X_L-Protein, und T-Zellen, die mit anti-CD3 aktiviert und mit anti-CD28 costimuliert werden, exprimieren signifikant mehr bcl-X_L-Protein.
Beispiel 6: bcl-X_L verhindert Fas- und anti-CD3-induzierten PCD in Jurkat-T-Zellen
Querverknüpfung von Fas auf T-Zelllinien führt zu der schnellen Induktion von Apoptose. Normale T-Zellen werden jedoch nicht für den Zelltod als Folge von Fas-Querverknüpfung anfällig, solange sie nicht über ausgedehnte Zeiträume aktiviert wurden (Klas et al. (1993) Int. Immunol. 5, 625–630). Zellen werden schnell angeregt, hohe Fas-Spiegel an der Zelloberfläche zu produzieren, wenn sie über 24 Stunden mit anti-CD3 + anti-CD28 aktiviert werden. Fas-Spiegel bleiben dann in Kultur über die nächsten Tage konstant. Abgesehen davon tritt die Fähigkeit der Fas-Querverknüpfung, Apoptose auszulösen, erst 72 Stunden nach der Stimulation auf und wird in Kultur in den nächsten Tagen zunehmend wirkungsvoller. Dieses Beispiel zeigt, dass der bcl-X_L-Proteinspiegel in T-Zellen, die mit anti-CD3 und anti-CD28 stimuliert wurden, mit dem Widerstand gegen Fas-induzierten Zelltod korreliert.
T-Zellen wurden mit Medium allein oder anti-CD3 und anti-CD28 über einen Zeitraum von 120 Stunden aktiviert. Cytoplasmatische Lysate wurden hergestellt und mit Western-Blot-Analyse, mit dem polyclonalen anti-bcl-X_L-Antikörper präpariert, analysiert, wie vorstehend beschrieben. Zur gleichen Zeit wurden anti-CD3- und anti-CD28-stimulierte T-Zellen mit 0,5 μg/ml CH-11 anti-Fas-monoclonalem Antikörper (Panvera) oder einer Isotyp-Kontrolle (IgM) über 24 Stunden in jedem 24-Stunden-Interval des Zeitraumes von 120 Stunden behandelt. Die Lebensfähigkeit wurde durch das Propidiumjodid-Ausschlussverfahren untersucht, wie vorstehend beschrieben. Fas-Oberflächenexpression wurde durch Anfärben mit CH-11 über 30 Minuten, gefolgt von FITC-konjugiertem anti-Maus IgM (Sigma) über 30 Minuten. Angefärbte Zellen wurden mittels Durchflusscytometrie (FACSort, Becton-Dickinson) unter Verwendung von Lysis II-Software analysiert.
Bcl-X_L-Proteinspiegel und Lebensfähigkeit von T-Zellen mit Querverknüpfung mit anti-Fas-Antikörper werden in 6 gezeigt. Nach anti-CD3 +anti-CD28-Costimulation lag das Maximum der bcl-X_L-Protein-Expression zwischen 24 und 48 Stunden und verringerte sich danach zunehmend. Wie in der unteren Hälfte der Figur dargestellt, sind Zellen, die über 24 oder 48 Stunden mit anti-CD3 und anti-CD28 behandelt wurden und dann eine Fas-Querverknüpfung eingingen, vollständig gegen Zelltod resistent. Wenn die T-Zellen jedoch mit anti-Fas-Antikörper zu späteren Zeitpunkten nach Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 eine Querverknüpfung eingingen, nahm die Lebensfähigkeit der Zellen ab. Auf diese Weise korreliert die Anwesenheit von bcl-X_L-Protein mit dem Schutz der T-Zelle vor Fas-induziertem Zelltod.
Um weiter zu zeigen, dass bcl-X_L-Protein Resistenz gegen durch Fas-Querverknüpfung induzierten Zelltod auslöst, wurden Jurkat-T-Zellen mit einem bcl-X_L-codierenden Expressionsvektor transfiziert und die Lebensfähigkeit der Zellen nach Zugabe von anti-Fas-Antikörper bestimmt.
Jurkat-Zellen wurden in Medium, wie vorstehend beschrieben, gehalten und mit pSFFVNeo-bcl-X_L (Boise, L. H. et al. (1993) Cell 74, 597–608) oder mit pSFFVNeo durch Elektroporation mit einem Gen-Pulser (BioRad) mit 250 V und 960 μF transfiziert. Die Transfektanten wurden mit G418 (Sigma) zu 1 mg/ml selektiert, und mehrere unabhängige Clone wurden durch Begrenzung der Verdünnung isoliert. Western-Blot-Analyse zeigte, dass hohe bcl-X_L-Proteinspiegel in Clonen vorhanden sind, die mit dem bcl-X_L-Expressionsvektor transfiziert worden waren, und dass Clone, die mit dem Kontrollvektor (Neo-Clone) transfiziert worden waren, kein bcl-X_L-Protein exprimieren (7, Tafel C). Die bcl-X_L-Spiegel in den bcl-X_L-Transfektanten waren den Spiegeln vergleichbar, die in T-Zellen 24 Stunden nach anti-CD3 + anti-CD28-Costimulation exprimiert wurden (vgl. 5, zum Beispiel). Fas-Expression auf den Clonen wurde durch Anfärbung nachgewiesen, wie vorstehend beschrieben.
Drei bcl-X_L- und drei Neo-Clone, die vergleichbare Mengen an Fas an ihrer Oberfläche exprimierten, wurden in Medium mit 2,5 × 10⁵ Zellen/ml inkubiert, mit 10 ng/ml Fas-Antikörper oder einer zum Isotyp passenden Kontrolle behandelt, und die Lebensfähigkeit wurde über die Zeit mit dem Propidiumjodid-Ausschlussverfahren untersucht. Die Lebensfähigkeit der Jurkat-Zell-Clone in Prozent wird in 7, Tafel A dargestellt. Die Graphik zeigt, dass Fas in allen drei Kontroll-Transfektanten schnellen Zelltod auslöst (weniger als 10% Lebensfähigkeit in 48 Stunden), während die drei bcl-X_L-Transfektanten eine Lebensfähigkeit von mehr als 60% während der Dauer des Experiments behalten. Weder die neo- noch die bcl-X_L-Transfektanten zeigen Verluste der Lebensfähigkeit, wenn kein Antikörper oder ein zum Isotyp passender Kontroll-mAb (IgM) verwendet wurde. Daher blockiert bcl-X_L wesentlich Fas-induzierten Zelltod in Jurkat-Zellen.
Von anti-CD3-Querverknüpfung ist auch berichtet worden, dass sie Apoptose in T-Zell-Clonen und T-Zelllinien auslöst (Shi, Y. et al. (1989) Nature 339, 625–626); Ucker, D. S. et al. (1989) J. Immunol. 143, 3461–3469). Um die Fähigkeit von bcl-X_L, TCR-induzierten Zelltod zu verhindern, zu untersuchen, wurden die Jurkat-Transfektanten mit anti-CD3 stimuliert und ihre Überlebensrate überwacht. Anti-CD3-induzierter Zelltod wurde mit 1 μg/ml Platten-gebundenem anti-CD3 (OKT3) durchgeführt und die Lebensfähigkeit täglich mit dem Propidiumjodid-Ausschlussverfahren untersucht.
Die Ergebnisse sind in 7, Tafel B grafisch dargestellt. Nach 84 Stunden führte die Behandlung mit anti-CD3 zu 30–60% Zelltod in den Kulturen der Neo-Clone. Im Gegensatz dazu wurde anti-CD3-induzierter Zelltod nahezu vollständig durch die Anwesenheit von bcl-X_L verhindert (7, Tafel B).
Das bcl-X_L-Protein ist daher in der Lage, T-Zellen vor von Fas- und T-Zell-Rezeptor-Querverknüpfung induziertem Zelltod zu schützen.
Beispiel 7: bcl-X_L, kann unabhängig von IL-2 wirken, um das T-Zell-Überleben zu verbessern
Basierend auf der Untersuchung der Wirkung von II-2 auf das Überleben von T-Zellen, die durch Querverknüpfung des TCR/CD3-Komplexes aktiviert wurden, scheint IL-2 als Überlebensfaktor bei der Erhaltung der Lebensfähigkeit von Antigen-aktivierten T-Zellen wirken zu können. Obwohl es den Anschein hat, dass CD28-Costimulation zum Überleben von T-Zellen führt, das unabhängig von den Spiegeln der Wachstumsfaktoren im Überstand ist, ist es schwierig herauszufinden, ob die verbesserte Überlebensrate von CD28-stimulierten Zellen nicht vielmehr das Ergebnis der hohen IL-2-Spiegel war, die durch die CD28-Costimulation produziert wurden. Die hohen IL-2-Spiegel, die in CD28-costimulierten Zellen produziert werden, machen es unmöglich, die Wirkungen von Lymphokinen durch serielles Waschen vollständig auszuschließen. Die hohen Lymphokin-Spiegel, die in CD28-costimulierten Zellen produziert werden, könnten die Zellen möglicherweise auf autokrine Art, sogar in Abwesenheit von nachweisbarer Akkumulation von Lymphokinen in kultivierten Überständen beeinflussen. Dieses Beispiel zeigt, dass bcl-X_L-Protein in der Lage ist, eine IL-2-abhängige T-Zelllinie vor dem Zelltod zu schützen, wenn IL-2 entfernt wird.
CTLL-2 ist eine T-Zelllinie, deren Überleben und Proliferation in Kultur von IL-2 abhängig ist (Gillis, S. und Smith, K. A. (1977) Nature 268, 154–156). Diese Zellen können nicht induziert werden, ihr eigenes IL-2 zu sekretieren, und werden in Biotests auf IL-2 häufig verwendet. CTLL-2-Zellen wurden in Wachstumsmedium, wie vorstehend beschrieben, mit dem Zusatz von β-Mercaptoethanol (50 μM) und rekombinantem IL-2 (100 Units/ml) (Nunez, G. et al. (1990) J. Immunol. 144, 3602–3610) gehalten. Die Zellen wurden mit dem Expressionsvektor pSFFVNeo-bcl-X_L (Boise, L. H. et al. (1993) Cell 74, 597–608) durch Elektroporation mit einem Gen-Pulser (BioRad) bei 250 V und 960 μF transfiziert. Die Transfektanten wurden mit 250 μg/ml G418 selektiert, und bcl-X_L-positive Clone wurden mit Western-Blot-Analyse identifiziert. CTLL-2-Zellen (2,5 × 10⁶) wurden in 50 ml NET-N lysiert, und die Kerne und Zellreste wurden, wie vorstehend beschrieben, entfernt. Fünfzig μl 2 × SDS-Ladungspufferlösung wurden zu dem Überstand zugegeben, und SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben.
Zwei bcl-X_L-Clone, die hohe bcl-X_L-Proteinspiegel exprimierten (7, Tafel E), wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, in Kultur in Abwesenheit von IL-2 zu überleben. Diese Clone exprimierten bcl-X_L in Spiegeln, die denen von anti-CD3 + anti-CD28-aktivierten T-Zellen ähnlich waren. Die bcl-X_L exprimierenden Zellen wurden einen Tag vor dem Entzug zu 3 × 10⁵ Zellen/ml in frisches Medium gegeben. Die Zellen wurden dann dreimal in frischem Medium ohne IL-2 gewaschen und im selben Medium resuspendiert. Lebensfähigkeit wurde mit Propidiumjodid-Ausschlussverfahren an den angegebenen Tagen untersucht. Die Ergebnisse werden grafisch in 7, Tafel D dargestellt. Beide bcl-X_L-transfizierten Clone hatten im Vergleich mit der elterlichen Zelllinie ihre Überleben in Abwesenheit von IL-2 verbessert (7, Tafel D). Daher kann bcl-X_L in Abwesenheit von IL-2 bewirken, so dass die T-Zell-Überlebensrate verbessert wird. Diese Clone wurden auch auf durch Bestrahlung induzierten Tod in Tests, die ähnlich denen in 2 gezeigten waren, untersucht. Clone, die bcl-X_L exprimierten, zeigten signifikanten Schutz vor durch Bestrahlung induzierten Tod, wenn sie mit Kontrollzellen entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit von IL-2 verglichen wurden.
Auf diese Weise zeigt dieses Beispiel, dass bcl-X_L-Protein T-Zellen vor Zelltod schützt, der durch Fehlen von IL-2 induziert wird.
Beispiel 8: Expression von bcl-X_L über CD28-Costimulation wird evolutionär bewahrt
Um zu bestimmen, ob die Fähigkeit der CD28-Costimulation, die bcl-X_L-Expression zu regulieren, zwischen Maus und Mensch bewahrt worden ist, wurden Zellen, die aus murinen Lymphknoten isoliert wurden, mit löslichem anti-CD3 aktiviert, und die bcl-X_L-Expression wurde untersucht.
Lymphknoten wurden von C57BL/6-Mäusen (Jackson Laboratories) geerntet, und einzelne Zellsuspensionen wurden durch Passage durch ein Nylonnetz hergestellt. 2 × 10⁶ Zellen/ml wurden in vollständigem Medium kultiviert, das aus DMEM (GIBCO BRL) bestand, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 U/ml), 10 mM HEPES, 50 mM β-ME und 0.1 mM nicht essentiellen Aminosäuren. Lösliches anti-CD3 (145-2C11, 10 μg/ml von J. Bluestone) wurde allein oder in Kombination mit anti-CD28 (10 μg/ml) oder CTLA4Ig (100 μg/ml, von Repligen) zugegeben. Die Kulturen wurden über 24 Stunden bei 37°C, 7% CO₂ inkubiert und für die Western-Blot-Analyse geerntet. Murine Lymphocyten (5 × 10⁶) wurden in 50 μl NET-N lysiert, und die Kerne und Zellreste wurden entfernt, wie vorstehend beschrieben. 50 μl 2 × SDS-Ladungspufferlösung wurde zum Überstand hinzugegeben, und SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Für Untersuchungen zur Lebensfähigkeit wurden die Zellen, wie vorstehend beschrieben, behandelt. Die Lebensfähigkeit von T-Zellen nach Aktivierung wurde mit dem Propidiumjodid-Ausschlussverfahren auf Thy-1-positive Zellen untersucht.
Die Ergebnisse, dargestellt in 8, zeigen, dass ruhende murine T-Zellen kein nachweisbares bcl-X_L exprimieren, wie es auch bei menschlichen T-Zellen der Fall ist ( 8, Linie 1). Behandlung mit löslichem anti-CD3 über 24 Stunden induzierte bcl-X_L-Expression, wenn Hilfszellen anwesend sind, um ein costimulierendes Signal zu liefern. Dieser bcl-X_L-Spiegel war erhöht, wenn dieses costimulierende Signal durch die Zugabe von anti-CD28 verstärkt wurde. Im Kontrast dazu ist die Fähigkeit von löslichem anti-CD3, bcl-X_L-Expression in Anwesenheit von Hilfszellen zu verstärken, nahezu vollständig gehemmt, wenn CTLA4Ig zugegeben wird, ein Reagenz, das CD28-Costimulation verhindert, indem die CD28-Liganden B7-1 und B7-2 kompetitiv gehemmt werden, mit CD28 in Wechselwirkung zu treten. Diese Daten zeigen, dass in T-Zellen der Maus bcl-X_L-Expression auch während der Zellaktivierung induziert wird. Darüber hinaus ist die Induktion von bcl-X_L-Expression bei einer submitogenen Dosis von anti-CD3 nahezu vollständig von einer CD28-Costimulation abhängig. Dieses Expressionsmuster zeigt, dass bcl-X_L eine Rolle für das Überleben von aktivierten T-Zellen der Maus spielt. Übereinstimmend mit dieser Möglichkeit betrug die Lebensfähigkeit von Thy-1-positiven Zellen aus der nicht getrennten Lymphknoten-Zellpopulation, die mit anti-CD3 allein stimuliert wurde, 62% nach 72 Stunden. Im Gegensatz dazu verstärkt die Zugabe von anti-CD28 die Lebensfähigkeit der Thy-1-positiven Zellen auf 88%. Anders herum wird die Lebensfähigkeit der aktivierten T-Zellen durch Blockieren der CD28/B7-vermittelten Costimulation in den Lymphknotenzellen mit CTLA4Ig auf 20% nach 72 Stunden reduziert.
Dieses Beispiel zeigt somit, dass bcl-X_L in T-Zellen der Maus die gleichen Expressionsmuster wie in menschlichen T-Zellen aufweist, d. h. bcl-X_L-Protein ist in ruhenden T-Zellen nicht vorhanden, bcl-X_L-Protein wird in T-Zellen exprimiert, die durch Querverknüpfung des T-Zell-Rezeptors aktiviert sind, und der bcl-X_L-Proteinspiegel wird durch Costimulation mit CD28 weiter erhöht.
Beispiel 9: bcl-X_L-Expression kann HIV-1-induzierten Zelltod verhindern
Um zu untersuchen, ob bcl-X_L-Expression T-Zellen vor HIV-1-induziertem Zelltod schützt, wurden die vorstehend beschriebenen, mit pSFFVNeo-bcl-X_L (bcl-X_L) oder mit dem Vektor allein (Neo) transfizierten Jurkat-Zellclone mit HIV infiziert, und die Lebensfähigkeit wurde bestimmt.
Drei Jurkat-Zellclone, die mit dem bcl-X_L-Expressionsvektor transfiziert waren, und drei Jurkat-Zellclone, die mit dem Kontrollvektor transfiziert waren, wurden mit verschiedenen Verdünnungen der zellfreien Virusstammlösung des HIV-RF-Isolats infiziert. Am 12. Tag nach Infektion wurde der Zelltod durch einen Tetrazolium/Formazan-Test quantifiziert (vgl. Shearman, M. S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1470–1474; Hansen, M. B. et al. (1989) J. Immun. Methods 119, 203–210).
Die mittlere Lebensfähigkeit der drei Zelllinen ist in 9 grafisch dargestellt. Kontroll-Jurkat-Zellen hatten eine hohe Zelltod-Rate, wenn sie mit der Virusstammlösung in Verdünnungen von 1 : 4 bis 1 : 256 infiziert waren. Im Gegensatz dazu zeigten die transfizierten Jurkat-Zellen, die das bcl-X_L-Gen exprimierten, bei den gleichen Virusverdünnungen keinerlei Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit.
Um zu untersuchen, ob die schützende Wirkung von bcl-X_L-Expression auf Resistenz gegen HIV-1-Infektion oder auf eine spezifischere Wirkung auf die Induktion von Zelltod zurückzuführen ist, wurde die Virusmenge im Überstand der infizierten Zellen am 7. Tag nach Infektion mit Hilfe des Verfahrens von Spearman und Karber quantifiziert. Das Spearman-Karber-Verfahren wird von Richman, D. B., Johnson V. A., Mayrs V. L. (1993) In vitro evaluation of experimental agents for anti-HIV activity. Current Protocols in Immunology ch. 12.9, Colligan J. E. et al., Hrsg. Greene and Wiley, Interscience NY, beschrieben.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. Im Vergleich zu den Kontrollzellen gab es eine etwa vierfache Abnahme der Virusmenge in den Überständen der bcl-X_L-exprimierenden Zellen. Tabelle 1 Anzahl von HIV-Partikeln in den Überständen von Zellen, die mit bcl-X_L oder dem Vektor allein transfiziert waren

Zellinie TCID50

N1.7 2048

N1.8 2048

N1.22 676

BclX.8 512

BclX.10 294

BclX.13 512
Die Ergebnisse dieser Beispiele zeigen, dass bcl-X_L-Protein T-Zellen vor HIV-induziertem Zelltod schützt. Diese Wirkung kann hilfreich sein, den Abbau von CD4-Zellen während einer HIV-Infektion zu verhindern. Die vorliegenden Ergebnisse legen auch nahe, dass es ein Mechanismus des übermäßigen Zelltods bei Patienten mit HIV-Infektion sein könnte, dass bestimmte Formen der T-Zell-Aktivierung in diesen Patienten nicht in der Lage sind, bcl-X_L-Expression in solchen Höhen zu induzieren, die denen von nicht infizierten Individuen vergleichbar sind. Daher könnte ein Mittel der Therapie von HIV-Infektion sein, die Induktion von bcl-X_L-Expression durch Zellaktivierung und -Vermehrung ex vivo oder durch Induktion der CD28-Signaltransduktion in vivo wieder herzustellen. Alternativ kann die Induktion von bcl-X_L-Expression durch Stimulation mit einem Agens erreicht werden, das ein anderes ist, als das Agens, welches CD28 stimuliert. Diese Daten zeigen, dass die Fähigkeit von CD28, die bcl-X_L-Expression zu erhöhen, von klinischem Nutzen bei Immunschwäche-Zuständen ist, bei denen übermäßiger Tod lymphatischer Zellen auftritt, besonders bei HIV-Infektion, wo programmierter Zelltod in T-Zellen des peripheren Bluts und in T-Zellen der Lymphknoten auftritt.
Beispiel 10: Anti-CD3- und anti-CD28-Stimulation von PBMC aus HIV-infizierten Individuen führen zu einer Erhöhung des bcl-X_L-Proteinspiegels, der ausreicht, die Zellen vor Zelltod zu schützen
Dieses Beispiel zeigt, dass Stimulation von PBMC oder Lymphocyten von HIV-infizierten Individuen mit anti-CD3 und anti-CD28 zu einem Anstieg von bcl-X_L-Proteinspiegeln führt, der ausreichend ist, um die Zellen gegen Apoptose zu schützen.
Progression zu klinischer Immunschwächezuständen bei asymptomatischen HIV-infizierten Individuen ist durch einen graduellen, aber fortschreitenden Verlust von CD4+-T-Zellen gekennzeichnet. Während die Mechanismen, denen die Abnahme der CD4+-T-Zellen in HIV-infizierten Patienten zugrunde liegt, zur Zeit nicht bekannt sind, legen neue Beobachtungen nahe, dass diese Zellen als Antwort auf Aktivierungssignale abnormal empfindlich für Apoptose sind. Die Rollen der vor Apoptose schützenden Proteine bcl-2 und bcl-x für die HIV-Erkrankung wurden in nicht stimulierten, Kermesbeeren-Mitogen (PWM)-stimulierten und anti-CD3 plus anti-CD28 stimulierten Proben von HIV-infizierten asymptomatischen Individuen untersucht.
PBMC wurden aus HIV-infizierten Individuen auf folgende Weise gewonnen. Mit Heparin versetzte Blutproben wurden durch Venenpunktion von HIV-infizierten (n = 25) und HIV-negativen Kontrollen (n = 15) gewonnen, die ihre Zustimmung erklärt hatten. Die Patienten wurden in Patienten in asymptomatischem frühem- und mittlerem Stadium eingeteilt (>50 und 200–500 CD4-Zellen/mm³), basierend auf dem Walter Reed Staging-System (Redfield, R. R. et al. (1986) New Engl. J. Med. 314, 131–132). Die Proben wurden sofort verarbeitet. Frisch isolierte mononukleäre Zellen wurden aus dem Leukocytenfilm des Blutes gewonnen, das 1 : 1 mit steriler HBSS (BioWhittaker, Wakersvile MD) verdünnt und über Ficoll-Hypaque zentrifugiert worden war. Die Lebensfähigkeit der Proben lag allgemein über 95%. Soweit nicht anders angegeben, wurden PBMC über 48 Stunden mit 1 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640, ergänzt mit 10% FCS (T-Zell-Medium) in Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen kultiviert. Die Stimulation der Zellen mit PWM (Sigma Chemical Company, St. Louis MO) wurde mit 10 μg/ml durchgeführt. Stimulation der Zellen durch CD3 allein oder durch CD28 wurde mit anti-CD3- oder einer Kombination aus anti-CD3 und anti-CD28-mAbs in Querverknüpfung mit Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörper, gebunden an magnetische Kügelchen (Dynal, Great Neck, NY) durchgeführt, wie von Weng, N.-P. et al. (1995) PNAS USA 92, 11091–11094) beschrieben. Jurkat-Zellen, die entweder mit einer pSFFNeo- bcl-X_L- oder pSFFVNeo-Konstruktion, wie hierin beschrieben, transfiziert worden waren, wurden in T-Zell-Medium gehalten, das 1 mg/ml G418 (Sigma Chemical Company) enthielt und dienten als positive Kontrolle für bcl-x-Färbung.
Die Menge an bcl-X- und bcl-2-Protein in den Zellen wurde durch ein Verfahren bestimmt, das Einzelzell-Detektion von bcl-X erlaubte, basierend auf intrazellulärer Färbung und Durchflusscytometrie, die auf folgende Weise durchgeführt wurde. PBMC wurden geerntet, und 1 × 10⁶ Zellen wurden in PBS gewaschen und in 1% Paraformaldehyd-Lösung (pH-Wert 7,2) über 30 Minuten bei Zimmertemperatur fixiert. Die Proben wurden in PBS gewaschen, dann in PBS + 0.05% Triton-X 100 über 5 Minuten resuspendiert, um die Zellen permeabel zu machen. Nach einer Waschung in PBS wurden die Proben in 100 μl PBS, die 20% menschliches AB-Typ-Serum (Sigma Chemical Company) und 1 μg/ml monoclonalen anti-bcl-X-Antikörper 7B2 (Craig Thompson, Universität von Chicago) oder 1 μg/ml des anti-bcl-2-mAb 6C8 vom Hamster (PharMingen, Inc., San Diego, CA) enthielt, über 1 h bei 4°C resuspendiert. Zum Isotyp passende IgG-mAbs dienten als Kontrolle für Proben, die mit anti-bcl-x und anti-bcl-2 gefärbt waren. Nach Inkubation mit den primären Antikörpern wurden die Proben in PBS + 0.05 Triton-X 100 gewaschen und in 100 μl PBS + 0.05% Ziegen-F(ab)₂-anti-Maus (H + L) resuspendiert. FITC (Gibco Life Technologies) wurde über 30 min bei 4°C zugegeben. Die mit anti-Bcl-2 gefärbten Proben wurden mit 20 μg/ml FITC-anti-Hamster IgG-Cocktail (PharMingen) über 30 min bei 4°C inkubiert. Schließlich wurden die Proben in PBS gewaschen und mittels Durchflusscytometrie 2 bis 48 Stunden nach Färbung analysiert. Innerhalb dieses Zeitrahmens gab es keine Anzeichen für Abnahmen im Prozentsatz der Zellen, die sich auf bcl-x färbten, noch Änderungen in den mittleren Fluoreszenzintensitäten.
Obwohl mit dieser Untersuchung bcl-x-Spiegel (d. h. bcl-xL und bcl-xS) gemessen werden, anstatt spezifisch bcl-xL-Spiegel, wurde durch Immunfällungsexperimente gezeigt, dass die Mehrheit des unter diesen Bedingungen gemessenen bcl-x-Proteins zu bcl-xL gehört.
Die Ergebnisse zeigen, dass, während die mittlere Fluoreszenzintensität und der Prozentsatz an Zellen, die sich auf bcl-x färben, in nicht stimulierten PBMC von HIV-infizierten Proben sich nicht von Spiegeln unterschieden, die in nicht HIV-infizierten Kontrollen beobachtet wurden, war die bcl-X-Expression in PBMC von HIV-infizierten Individuen niedriger als in nicht infizierten Kontrollen nach Aktivierung mit PWM und anti-CD3 plus anti-CD28. Dieser bcl-X-Proteinspiegel ist jedoch ausreichend, die Zellen vor Zelltod zu schützen. Dies wurde gezeigt, indem z. B. die Menge an bcl-X-Protein und die Apoptose-Rate in PBMC von HIV-infizierten Individuen und nicht HIV-infizierten Kontrollindividuen nach Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 oder mit PWM über unterschiedliche Zeiten verglichen wurden, wie vorstehend beschrieben.
Apoptose in PBMC wurde durch Markieren von DNA-Einzelstrang-Bruchstücken mit dUTP, katalysiert von TdT, gemessen (Li, X. et al. (1995) Cytometry 20, 172–180). Ein Durchflusscytometrie-Test wurde verwendet, um apoptotische Zellen in PBMC-Kulturen zu quantifizieren, die entweder mit PWM oder anti-CD3 plus anti-CD28 stimuliert waren. Diese Untersuchung wurde wie folgt durchgeführt. PBMC wurden geerntet, Lebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Ausschlußverfahren ermittelt, und 1 × 10⁶ Zellen wurden in 1% Formaldehyd (pH-Wert 7,4)-Lösung über 10 min auf Eis fixiert. Die Proben wurden in HBSS gewaschen, und die Zellpellets wurden in 70% Ethanol resuspendiert und bei –20°C über 2h bis 3 Tage gelagert. Nach einmaligem Waschen in HBSS wurden die Proben in 50 μl eines terminalen Desoxynucleotidyl-Transferase (TdT)-Reaktionsgemisches (0.1 M Cacodylsäure, 1 mM CoCl₂, 0,1 mM Dithiothreit and 50 μl BSA), das 0.5 nM Biotin, 16-dUTP (Boehringer, Indianapolis IN) und 10 Einheiten TdT (Boehringer) enthielt, über 30 min bei 37°C resuspendiert. Nach Waschen in HBSS wurden 2,5 μg/ml FITC-Avidin (Gibco Life Technologies, Gaithersburg, MD) zu einer Färbelösung zugegeben (4 × SSC, 0.1% Triton X-100 and 5% Magermilchpulver), und die Proben wurden über 15 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Jurkat-Zellen, die über 24 h mit 0.5 μg/ml menschlichem anti-Fas-Antikörper (Upstate Biotechnology Inc. Lake Placid NY) behandelt wurden, dienten als eine positive Kontrolle für den Test, während Proben, denen TdT fehlte, als negative Kontrollen dienten. Die Proben wurden durch cytofluorometrische Analyse unter Verwendung eines ELITE-ESP (Coulter Inc., Kindal FL)-Durchflusscytometers analysiert. Fünf- bis Zehntausend Zellen wurden unter Verwendung der Parameter log 90°C-Streuung gegen log FIFC-Intensität ausgezählt. Apoptotische Zellen wurden als FITC-positive Zellen mit einem niedrigen Vorwärtswinkel und einer niedrigen 90°C-Streuung definiert. Die Lebensfähigkeit, basierend auf Trypanblau-Ausschlussverfahren, bestätigte die Zuverlässigkeit der auf TdT basierenden Untersuchung.
Um die Kinetik der bcl-x-Induktion in Relation zur Apoptose zu messen, die in PWM- und anti-CD3- plus anti-CD28-stimulierten Proben auftritt, wurden drei HIV-infizierte und drei HIV-negative Kontrollen nach Kultur über 0 h, 24 h, 48 h und 72 h untersucht. Die Ergebnisse, präsentiert als die mittleren Prozentsätze, werden in 10, Tafeln A–D dargestellt. In Kontrollproben, die mit PWM behandelt wurden, stieg die bcl-x-Expression zwischen 24 und 48 h an, während die Apoptose-Raten niedrig blieben. In Kontrollproben, die mit anti-CD3 plus anti-CD28 behandelt wurden, stiegen bcl-x-Spiegel dramatisch, während nur niedrige Apoptose-Raten sichtbar waren (10, Tafel A). In diesen HIV-negativen Kontrollen traten Blasttransformation und ein Anwachsen der Zellzahl unter beiden Kulturbedingungen auf, ein Zeichen für die Proliferation der Zellen. Die PWM-stimulierten Kulturen von HIV-infizierten Patienten wiesen hohe Apoptose-Raten nach 48 Stunden mit einem Maximum von 40% vor dem Absinken auf (10, Tafel B). PWM-stimulierte PBMC von HIV-infizierten Individuen exprimierten nur geringe Mengen bcl-x zwischen 0 und 48 h. Interessanterweise wurde ein leichter Anstieg in der Fraktion der bcl-x-exprimierenden Zellen zwischen 48 und 72 h beobachtet, der vielleicht eine Anreicherung in den Zellen widerspiegelt, die mehr als 48 h überlebten (10, Tafel B). Im Vergleich mit HIV-negativen Kontrollen war in PBMC von HIV-infizierten Patienten, die mit anti-CD3 plus anti-CD28 kultiviert wurden, die bcl-x-Expression niedriger und ihre Induktion war verzögert (10 Tafel D). Apoptose-Raten waren in den anti-CD3- plus anti-CD28-stimulierten Kulturen niedrig, obgleich sie jene, die bei HIV-negativen Kontrollen beobachtet wurden, übertrafen (10, Tafeln C und D). Während in PBMC von HIV-infizierten Patienten, die mit PWM kultiviert wurden, nur geringe Proliferation beobachtet wurde, wurden in anti-CD3 plus anti-CD28-Kulturen ansteigende Zellzahlen und Zellgrößen beobachtet.
Apoptose und bcl-x-Induktion wurden in HIV-negativen Kontrollen (n = 5) und HIV-infizierten Individuen (n = 20) nach 48 h in Kultur weiter untersucht. Die Proben wurden in Medium allein, mit PWM oder anti-CD3 plus anti-CD28 kultiviert, wie vorstehend beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angeführt. Unter HIV-negativen Kontrollen waren Apoptose-Raten als Folge der verschiedenen Stimuli ähnlich. Die Apoptose-Raten stiegen als Antwort auf Behandlung mit PWM leicht über die Basislinie und fielen als Antwort auf anti-CD3 plus anti-CD28 ein wenig ab. In den selben Proben stieg die bcl-x-Produktion in den PWM-behandelten Kulturen leicht und in den anti-CD3 plus anti-CD28-behandelten Kulturen dramatisch an. Im Gegensatz dazu wurden beachtliche Anstiege der Apoptose-Rate über die Basisraten hinaus bei PBMC von HIV-infizierten Individuen nach 48 h in Kultur mit PWM beobachtet. Anstiege der Apoptose-Rate bei PBMC von HIV-infizierten Patienten, die mit anti-CD3 plus anti-CD28 kultiviert wurden, wurden nicht beobachtet.
Tabelle 2 Prozentsätze von Apoptose und Bcl-X-Induktion
Zusammenfassend wurden, während die bcl-x-Expression in stimulierten, nicht infizieren Proben dramatisch anstieg, in stimulierten HIV-infizierten Proben verzögerte und herabgesetzte Antworten beobachtet. Zusätzlich zeigte intrazelluläre Färbung von bcl-x in Einzelzellen eine starke umgekehrte Korrelation zwischen PWM-induzierter bcl-x-Expression und Apoptose (r = 0,695; p = 0,005). Ein ähnliche Korrelation wurde in PBMC, die mit anti-CD3 und anti-CD28 stimuliert wurden, nicht beobachtet, was nahe legt, dass Costimulation schützende Spiegel von bcl-x-Induktion zur Folge hat. Die Ergebnisse wurden auch erhalten, wenn Lymphocyten statt PBMC verwendet wurden, d. h. Lymphocyten von HIV-infizierten Individuen, die mit anti-CD3 plus anti-CD28 stimuliert wurden, zeigten im Vergleich eine niedrigere bcl-x-Expression als Lymphocyten von nicht infizierten Individuen. Verzögerte und verringerte bcl-x-Expression ließ sich nicht auf einen verringerten Prozentsatz von CD3+CD28+ Zellen in den untersuchten Proben zurückführen, denn verringerte bcl-x-Expression wurde in CD28+-HIV-infizierten, mit PWM stimulierten Untergruppen festgestellt. Darüber hinaus ist niedrige bcl-x-Expression nicht auf reduzierte Aktivierung der Lymphocyten zurückzuführen, denn PWM-Stimulation induzierte die Expression von CD69, einem frühen Aktivierungsmarker, in HIV-infizieren Patienten.
Daher haben Lymphocyten von HIV-infizierten Individuen nach Stimulation mit anti-CD3 plus anti-CD28 einen niedrigeren bcl-xL-Proteinspiegel als Lymphocyten von nicht HIV-infizierten Individuen; dieser Spiegel liegt aber oberhalb des Schwellenwertes für bcl-xL-Protein, der notwendig ist, die Zellen vor Zelltod zu schützen.
Äquivalente
Fachleute des Gebietes werden erkennen oder in der Lage sein, zu überprüfen, dass allein mit dem Einsatz von Routine-Verfahren viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung möglich sind. Solche Äquivalente sollen in den nachstehenden Ansprüchen eingeschlossen sein.

Claims

In-vitro-Verfahren zur Hemmung von Zelltod in einer von einem Virus befallenen T-Zelle durch Erhöhung des bcl-X_L-Proteinspiegels in der T-Zelle, umfassend das Einführen eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Gen umfasst, das ein menschliches bcl-X_L-Protein codiert und mit mindestens einer regulatorischen Sequenz funktionell verknüpft ist, in vitro in eine T-Zelle, wobei die mindestens eine regulatorische Sequenz eine induzierbare Expression des bcl-X_L-Proteins in der T-Zelle ermöglicht, so dass der T-Zelltod in der von einem Virus befallenen T-Zelle gehemmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die T-Zelle mit HIV infiziert ist.
Verwendung einer T-Zelle für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung von Zelltod in der T-Zelle, wobei, nachdem in die T-Zelle, die mit einem Virus infiziert ist und von einem Patienten erhalten wurde, ein Nucleinsäuremolekül in vitro eingeführt wurde, das ein Gen umfasst, das ein bcl-X_L-Protein codiert, das mit mindestens einer regulatorischen Sequenz funktionell verknüpft ist, die eine induzierbare Expression des bcl-X_L-Proteins in der T-Zelle ermöglicht, die T-Zelle wieder in den Patienten eingeführt werden soll.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Virus HIV ist.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die T-Zelle eine Säuger-T-Zelle ist.