DE69625981T2

DE69625981T2 - Verfahren zum Entfernen von Zellen aus Fermentationsbrühe

Info

Publication number: DE69625981T2
Application number: DE69625981T
Authority: DE
Inventors: Toshiya Tanabe; Tohru Nakamura
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1995-10-13
Filing date: 1996-10-11
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2016-10-12
Also published as: DE69625981D1; EP0768374B1; US5814513A; EP0768374A1; BR9605094A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entfernung von Zellen, insbesondere der Gattung Escherichia, aus einer Fermentationsbrühe.
Stand der Technik
In den vergangenen Jahren ist die Technologie der fermentativen Herstellung unter Einsatz rekombinanter Stämme fortgeschritten, und Escherichia coli (im folgenden als "E. coli" abgekürzt), der leicht genetisch manipuliert werden kann, ist häufig zu diesem Zweck eingesetzt worden. Wenn das gewünschte Produkt am Ende der Fermentation aus den Zellen ausgeschieden wird, werden die Zellen üblicherweise durch Membranabtrennung oder Zentrifugation nach Sterilisation entfernt, und die erhaltene zellfreie Lösung wird den nachfolgenden Behandlungsstufenunterzogen. Wenn das gewünschte Produkt im Innern der Zelle vorliegt, werden die Zellen durch Einfrieren oder unter Einsatz eines Homogenisators, einer Mühle oder dergleichen lysiert, und dann werden die Zellen und der Zellabfall durch Membranseparation oder Zentrifugation entfernt.
Im allgemeinen kann die Membranabtrennung im. Vergleich zur Zentrifugation die Zellen vollständig entfernen, wobei eine klare zellfreie Lösung erhalten wird. Wenn jedoch die Durchgangsrate in der Membran gering ist, ist eine große Vorrichtung erforderlich. Die Membran zum Entfernen von Zellen ist im allgemeinen eine Mikrofiltrationsmembran (im folgenden als "MF" abgekürzt), eine Ultrafiltrationsmembran (im folgenden als "UF" abgekürzt) oder dergleichen. Im Fall einer Fermentationsbrühe, die durch. Kultivieren von E.-coli-Stämmen erhalten wird, sind diese Membranen jedoch dahingehend problematisch, daß die Durchgangsrate auch nach dem Mahlen gering ist.
Es ist bekannt, daß das Erhitzen der Fermentationsbrühe als Vorbehandlung zum Verbessern der Durchgangsrate bei der Zellentfernung aus der Fermentationsbrühe durch eine Membran effektiv ist. Beispielsweise beschreibt die offengelegte Japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 91,196/1982, daß wenn Zellen und hoch molekulare Substanzen durch eine Ultrafiltrationsmembran abgetrennt werden, die Membrandurchgangsrate durch Hitzebehandlung einer Inosin- oder Guanosin-Fermentationsbrühe mit einem pH von 5,5 bis 9,0 bei 90 bis 110°C verbessert wird. Außerdem beschreibt die offengelegte Japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 78,588/1985, daß die Ultrafiltrationsmembrandurchgangsrate durch Erhitzen der Aminosäurefermentationsbrühe bei 50 bis 100°C verbessert wird.
Wenn Zellen aus einer E.-coli-Fermentationsbrühe durch eine Membran entfernt werden, ist jedoch, wie vorstehend erwähnt, die Durchgangsrate extrem gering, was eine Membranbehandlungsvorrichtung im großen Maßstab erfordert. Es ist auch möglich, die Durchgangsrate durch eines der vorstehend genannten Verfahren zu verbessern, welche die pH-Einstellung und die Hitzebehandlung der Fermentationsbrühe umfassen. Dieses Verfahren ist jedoch für eine E.-coli-Fermentationsbrühe nicht sehr effektiv. Außerdem verursacht die Hitzebehandlung manchmal eine Verfärbung der Fermentationsbrühe oder die Bildung kleiner Mengen von Nebenprodukten als Verunreinigungen. Außerdem kann dieses Verfahren nicht eingesetzt werden, wenn das gewünschte Produkt thermisch instabil ist.
Es besteht deshalb ein Bedarf nach einem Verfahren, bei dem, wenn Zellen, Zellbruchstücke oder gelöste hoch molekulare Verunreinigungen durch eine Membran bei der Behandlung einer Fermentationsbrühe, erhalten durch Kultivieren eines Mikro organismus der Gattung Escherichia, entfernt werden, die Membrandurchgangsrate durch Vorbehandlung unter milden Bedingungen verbessert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem Substanzen, welche die Membran beschädigen, vorher behandelt werden, und die Membrandurchgangsrate verbessert wird, wenn die Zellen durch die Membran entfernt werden, wodurch die Behandlungszeit verringert wird und die Größe der Vorrichtung minimiert wird.
Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Entfernen von Zellen, Zellbruchstücken oder gelösten hoch molekularen Verunreinigungen aus einer Fermentationsbrühe, erhalten durch Kultivieren eines Mikroorganismus der Gattung Escherichia, durch die Verwendung einer Membran zur Abtrennung der Zellen usw. bereit, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Polyethylenimin (im folgenden als "PEI" abgekürzt) zu der Fermentationsbrühe gegeben wird und das Gemisch dann durch die Membran filtriert wird, um die Zellen usw. abzutrennen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Änderung der Membrandurchgangsrate bei der UF-Filtratiun einer Lysinfermentationsrühe gegen die Zeit und die Menge an zugegebenem PEI zeigt.
2 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Änderung der Membrandurchgangsrate bei der MF-Filtration einer Leucinfermentationsbrühe gegen die Zeit und die Menge an zugegebenem PEI zeigt.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Der Mikroorganismus der Gattung Escherichia, der in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, kann ein Wildtypstamm oder eine Mutante sein. Ein rekombinanter Stamm, der durch Zellfusion oder genetische Manipulation erhalten wird, kann ebenfalls eingesetzt werden. Ein Beispiel eines Mikroorganismus der Gattung Escherichia ist Escherichia coli. Das gewünschte Produkt, das durch diesen Mikroorganismus hergestellt wird, kann ein Produkt sein, das eine UF-Membran aller eine MF-Membran, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, permeiert. Beispiele umfassen Aminosäuren, wie Lysin, Glutaminsäure, Isoleucin, Valin und Leucin, Nucleinsäuren, wie Inosin und Guanosin, organische Säuren, wie Milchsäure und Äpfelsäure, und Vitamine.
Die Fermentationsbrühe, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, kann durch Kultivieren des vorstehend genannten Mikroorganismus in einem geeigneten Medium hergestellt werden. Das Medium ist nicht besonders eingeschränkt, und es kann ein gewöhnliches Medium sein, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und gegebenenfalls organische Nährstoffe enthält. Die Fermentation kann durch das Verfahren, das in der Internationalen Veröffentlichung W095/16042, EP-A-685,555 oder in der offengelegten Japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 047,397/1996 beschrieben wird, unter geeigneten Bedingungen für das Wachstum des Mikroorganismus durchgeführt werden.
Es kann jegliche Kohlenstoffquelle eingesetzt werden, solange sie für den Mikroorganismus verwertbar ist. Spezifische Beispiele der Kohlenstoffquelle umfassen Saccharide, wie Glucose, Fructose, Saccharose und Maltose, organische Säuren, wie Fumarsäure, Citronensäure, Essigsäure und Propionsäure, und Salze davon.
Es kann jegliche Stickstoffquelle eingesetzt werden, solange sie von dem Mikroorganismus verwertet werden kann. Spezifische Beispiele der Stickstoffquelle umfassen Ammoniumsalze anorganischer Säuren, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, Ammoniumsalze organischer Säuren, wie Ammoniumfumarat und Ammoniumcitrat, Salpetersäuresalze, wie Natriumnitrat und Kaliumnitrat, organische Stickstoffverbindungen, wie Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt und Maismaische, und ein Gemisch davon.
Eine Nährstoffquelle, die bei einer üblichen Fermentation eingesetzt wird, kann nach Bedarf eingesetzt werden. Beispiele der Nährstoffquelle umfassen anorganische Salze, Spurenmetallsalze und Vitamine.
Im allgemeinen kann PEI in der Form einer wässerigen Lösung erhalten werden. Wenn PEI jedoch zu einer E.-coli-Fermentationsbrühe gegeben wird, ist es ratsam, eine wässerige Lösung, welche 1 bis 50 PEI enthält, zuzugeben, wodurch die Erhöhung der Viskosität der wässerigen PEI-Lösung kontrolliert wird und die Verdünnung der Fermentationsbrühe verhindert wird. Im Hinblick auf die Zugabe von PEI kann eine vorbestimmte Menge einer 10%igen wässerigen PEI-Lösung zugegeben werden, während die Fermentationsbrühe gerührt wird, wenn die Fermentation vollständig abgelaufen ist. Das Zugabeverfahren ist jedoch nicht besonders eingeschränkt, solange ein gleichförmiges Gemisch erhalten werden kann.
Die Menge an zugegebenem PEI ist zweckmäßigerweise zwischen 0,0005- und 0,5 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 0,001 und 0,05 Gew.-%, bezogen auf die E.-coli-Fermentationsbrühe.
Das zuzugebende PEI kann wasserlöslich sein, und dessen mittleres Molekulargewicht ist nicht besonders eingeschränkt. PEI mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 10.000 bis 100.000 ist leicht zu erhalten und zu behandeln.
Wenn die Membrantrennung nach der Zugabe von PEI durchgeführt wird, kann die Membrandurchgangsrate verbessert werden. Außerdem kann, wenn der pH-Wert der E.-coli-Fermentationsbrühe nach der Zugabe von PEI auf 3 bis 9, vorzugsweise 4 bis 7 eingestellt wird, die Membrandurchgangsrate stärker verbessert werden. Wenn der pH-Wert der Fermentationsbrühe nach der Zugabe von PEI etwa neutral ist, besteht kein Bedarf an einer erneuten Einstellung des pH-Wertes. Wenn jedoch der pH-Wert auf den vorstehend genannten Bereich eingestellt wird, kann manchmal eine höhere Membrandurchgangsrate erzielt werden. Somit kann die erneute Einstellung des pH-Wertes nach Bedarf durchgeführt werden.
Ein übliches Mittel zum Einstellen des pH-Wertes kann eingesetzt werden, um den pH-Wert einzustellen. Beispiele davon umfassen Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, und Alkaliverbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Ammoniak.
Die Fermentationsbrühe kann vor oder nach der Zugabe von PEI hitzebehandelt werden. Eine geeignete Hitzebehandlungstemperatur ist zwischen 50 und 130°C, und eine geeignete Hitzebehandlungsdauer ist zwischen 10 und 20 Minuten. Diese Hitzebehandlung kann die Effizienz des Mischens von PEI und die Durchgangsrate. verbessern.
Die einzusetzende Membran kann MF oder OF sein. Eine flache Membran, eine hohe Fasermembran, eine röhrenförmige Membran oder eine Spiralmembran kann eingesetzt werden. Das Material der Membran kann ein organisches Material, wie Polysulfon, Polyolefin, Polyvinylidendifluorid oder Teflon, oder ein anorganisches Material, wie Keramik, sein. Im Fall von OF ist eine Membran mit einem Ausschlußmolekulargewicht von 1.000 bis 500.000 geeignet. Im Fall von MF ist eine Membran mit einem Porendurchmesser von 0,05 bis 1 μm geeignet.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele eingehender veranschaulicht.
Es wurde ein Test für die Membranpermeation in Beispiel 1 und Beispiel 2 durchgeführt, indem zwei PTTK-Membranen (UF-Membranen, hergestellt von Millipore, USA, Ausschlußmolekulargewicht 30.000) auf ein Minitanmodul, hergestellt von Millipore, aufgebaut wurden. Im Hinblick auf PEI wurde eine 10%ige wässerige Lösung, erhalten durch Verdünnen einer 50%igen PEI-Lösung mit einem mittleren Molekulargewicht von 50.000 (hergestellt von Sigma) mit reinem Wasser, eingesetzt.
Beispiel 1
L-Lysin wurde durch das in den Beispielen der Internationalen Veröffentlichung Nr. W095/16042 beschriebene Verfahren unter Einsatz des Stammes B-399/RSFD80 durch Einführen des Plasmids RSFD80 in den E.-coli-Stamm B-399 hergestellt. Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 37°C während 48 Stunden unter Einsatz eines Mediums mit der folgenden Zusammensetzung unter Rühren des Gemisches bei 114 bis 116 Umdrehungen pro Minute durchgeführt.
Zusammensetzung des Mediums für die Herstellung von L-Lysin:

A: (NH₄)₂SO₄ 16 g/Liter

KH₂PO₄ 1 g/Liter

MgSO₄·7H₂p 1 g/Liter

FeSO₄·7H₂O 1 g/Liter

MnSO₄·5H₂O 0,01 g/Liter

Hefeextrakt (Difco) 2 g/Liter

L-Methion 0,5 g/Liter
Der pH-Wert wurde mit KOH auf 7,0 eingestellt, und das Gemisch wurde 10 Minuten bei 115°C autoklaviert (16/20 Volumen).
B: 20% Glucose (welche 10 Minuten bei 115°C autoklaviert wurde) (4/20 Volumen).
C: CaCO₃ nach der Japanischen Pharmacopeia (welches mit trockener Hitze 2 Tage bei 180°C sterilisiert wurde) (30 g/Liter).
(A und B wurden bei einem Verhältnis von 4 : 1 gemischt, und C wurde in einer Menge von 30 g/Liter zugegeben. Antibiotika (100 μg/ml Streptomycin und 5 μg/ml Kanamycin) wurden zu dem Gemisch gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde als Medium für die Herstellung von L-Lysin eingesetzt.)
Nach Beendigung der Fermentation war die Konzentration an L-Lysin 9,2 g/Liter, berechnet als Lysinhydrochlorid.
Zu jeweils 300 ml der so erhaltenen Lysinfermentationsbrühe wurde die vorstehend genannte 10%ige PEI-Lösung in einer Menge von 0,32 g, 0,91 g oder 1,6 g gegeben. Das Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 4,0 mit 98%iger Schwefelsäure eingestellt und 20 Minuten bei 60°C unter Rühren erwärmt. Die Konzentrationen an PEI in der Fermentationsbrühe nach der Zugabe von PEI in den vorstehend genannten Mengen waren etwa 100 ppm, 300 ppm bzw. 500 ppm.
Die so behandelten Fermentationsbrühen wurden in den Tests für die Membranpermeation eingesetzt. Der Test für die Membranpermeation wurde dadurch durchgeführt, daß jede der vorstehend behandelten Fermentationsbrühen in das vorstehend genannte UF-Modul bei einer Geschwindigkeit von 1.000 ml/min unter Beibehalten der Temperatur der Fermentationsbrühe bei 50°C gegeben wurde und sie durch die Membran bei einem mittleren Druck von 0,9 kg-f/cm² permeiert wurde. Die Änderung der Permeationsrate wurde über die Permeationszeit von 30 Minuten gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Aus 1 geht hervor, daß im Fall der E.-coli-Fermentations- brühe die Membrandurchgangsrate bei der Anfangsstufe der Zellentfernung (innerhalb 5 Minuten nach Beginn) abrupt abnahm und später allmählich stabil wurde. Die Permeationsrate nach 30 Minuten war bei Zugabe von PEI höchstens viermal höher als diejenige ohne Zugabe von PEI. Die Verbesserung der Permeationsrate wurde bei Zugabe von 100 ppm PEI deutlich beobachtet, und die Permeationsrate in diesem Fall war zweimal so hoch wie diejenige ohne Zugabe von PEI.
Beispiel 2
L-Isoleucin wurde unter Einsatz des Stammes E. coli AJ12919, beschrieben in EP-A-685,555 oder in der offengelegten Japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 047,397/1996, hergestellt. Der Stamm RJ12919 wurde auf ein Kulturmedium ausgestrichen, das 1% Bactotrypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 1,5% Agar, 100 μg/ml Streptomycin und 100 μg/ml Ampicillin enthielt, und es wurde 18 bis 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurden 300 ml eines Fermentationsmediums (enthaltend 4% Glucose, 1,6% Ammoniumsulfat, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Magnesiumsulfat-7-hydrat, 0,001% Eisen (II)-Sulfat-7-hydrat, 0,001 Mangansulfat-5-hydrat, 0,2% Hefeextrakt und 3% Calciumcarbonat, pH 7,0) unter Einsatz einer Platinöse mit einem Teil der Brühe angeimpft, und die Kultivierung wurde 16 Stunden bei 37°C mit Belüftung bei 300 ml/min und Rühren bei 400 Umdrehungen pro Minute durchgeführt, wobei eine Impfkulturbrühe erhalten wurde. Ein Fermentationsmedium, das 6% Glucose, 1,6% Ammoniumsulfat, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Magnesiumsulfat-7-hydrat, 0,001 Eisen (II)-Sulfat-7-hydrat, 0,001 Mangansulfat-5-hydrat und 0,2% Hefeextrakt (pH 7,0) enthielt, wurde mit der Impfkulturbrühe angeimpft. Glucose wurde in einer geeigneten Menge bei 37°C unter Belüftung mit 300 ml/min unter Kontrollieren der Umdrehungszahl zugegeben, so daß die Konzentration an aufgelöstem Sauerstoff in dem Medium 5% oder mehr erreichte. Das Gemisch wurde 23 Stunden kultiviert, während der pH-Wert mit Ammoniakgas bei etwa 7,0 gehalten wurde. Nach dem vollständigen Ablauf der Fermentation war die Konzentration an angehäuftem L-Isoleucin 37 g/Liter.
Die so erhaltene L-Isoleucinfermentationsbrühe wurde 10 Minuten bei 120°C nach Ablauf der Fermentation erhitzt, und der pH-Wert wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf 4,0 eingestellt. Zu 300 ml der so behandelten Fermentationsbrühe wurde 0,3 g einer 10%igen PEI-Lösung gegeben, und das Gemisch wurde 20 Minuten auf 60°C erwärmt. Eine Fermentationsbrühe, die 20 Minuten bei 60°C ohne Zugabe von PEI erwärmt wurde., wurde als Kontrolle eingesetzt. Der Test für die Membranpermeation wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Tabelle 1 zeigt, daß die Membranpermeationsrate mit der Zugabe von 100 ppm PEI im Fall der Isoleucinfermentationsbrühe erhöht wurde.
Beispiel 3
Der E.-coli-Stamm FERM-P 5274, der gegen β-2-Thienylalanin resistent ist und die Fähigkeit hat, L-Leucin herzustellen (offenbart in der offengelegten Japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 34,397/1987), wurde einer Mutationsbehandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanigin unterzogen. Unter den mutierten Stämmen wurde ein Stamm, der gegen 4-Azaleucin resistent war, isoliert, wobei ein Stamm mit erhöhter Fähigkeit zur Herstellung von L-Leucin erhalten wurde.
Der so erhaltene Stamm wurde 72 Stunden bei 31°C unter Rühren in einem Medium (enthaltend 5 g/dl Glucose, (NH₄)₂SO₄ 2,5 g/dl, KH₂PO₄ 0,2 g/dl, MgSO₄·7H₂O 0,1 g/dl, Hefeextrakt 0,05 g/dl, Thiaminhydrochlorid 1 mg/l, FeSO₄·7H₂O 1 mg/dl, MnSO₄·4H₂O 1 mg/dl, CaCO₃ 2,5 g/dl, pH 7,0),kultiviert. Nach Beendigung der Fermentation war die Konzentration an angehäuftem L-Leucin 3,1 g/dl.
Die vorstehend genannte 10%ige PEI-Lösung wurde zu jeweils 300 ml der so erhaltenen Fermentationsbrühe gegeben, wobei eine Fermentationsbrühe mit einer PEI-Konzentration von 0, 200 bzw. 1.000 ppm erhalten wurde. Die so erhaltene Brühe wurde mit 98%iger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und 30 Minuten bei 60°C unter Rühren erwärmt.
Die so behandelten Brühen wurden für den Membranpermeationstest eingesetzt. Der Membranpermeationstest wurde durchgeführt, indem jede der vorstehend behandelten Brühen in ein Pencil-Type-PSP-003-Modul (Porendurchmesser: 0,3 μm, Membranfläche: 150 cm²) hergestellt von Asahi Chemical Industry Co. Ltd., bei einer Geschwindigkeit von 600 ml/min und einem Eingangsdruck von 1,0 kg-f/cm² gegeben wurde. Die Änderung der Permeationsrate wurde über 60 Minuten gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Aus Tabelle 2 geht hervor, daß die Membranpermeationsrate mit Zugabe von PEI im Fall der L-Leucinfermentationsbrühe erhöht wurde.
Wie vorstehend gezeigt kann durch die vorliegende Erfindung die Membranpermeationsrate der Fermentationsbrühe ohne Einsatz einer großen Vorrichtung verbessert werden. Außerdem ist es möglich, die Effizienz des Verfahrens zur Entfernung von Zellen aus einer Fermentationsbrühe durch Membranentfernung zu verbessern und die Größe der Membrantrennungsvorrichtung zur Entfernung der Zellen zu minimieren.

Claims

Verfahren zum Entfernen von Zellen aus einer Fermentationsbrühe, erhalten durch Kultivieren eines Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört, unter Einsatz einer Membran zur Abtrennung der Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß Polyethylenimin zu der Fermentationsbrühe gegeben wird und das Gemisch dann durch die Membran filtriert wird, um die Zellen abzutrennen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der pH-Wert der Fermentationsbrühe auf 3 bis 7 eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die eingesetzte Membran eine Ultrafiltrationsmembran oder eine Mikrofiltrationsmembran ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Menge des zugegebenen Polyethylenimins zwischen 0,0005 und 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Fermentationsbrühe, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Fermentationsbrühe auf 50 bis 130°C vor und/oder nach der Zugabe von Polyethylenimin erhitzt wird.