DE69621765T2

DE69621765T2 - Kombiniertes Verfahren von Fermentations-und mikrobieller Transformations-Reaktion

Info

Publication number: DE69621765T2
Application number: DE69621765T
Authority: DE
Inventors: Shinobu Oda
Original assignee: Kansai Paint Co Ltd
Current assignee: Kansai Paint Co Ltd
Priority date: 1995-09-07
Filing date: 1996-09-04
Publication date: 2003-03-06
Anticipated expiration: 2016-09-05
Also published as: EP0789079A3; EP0789079B1; EP0789079A2; DE69621765D1; US5780275A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein kombiniertes Verfahren einer Fermentation und einer mikrobiellen Umwandlungsreaktion, in dem eine wasserlösliche organische Säure, ein wasserlöslicher Alkohol oder Acetylcoenzym A, die/der/das fermentativ aus einem Saccharid, wie z. B. Glucose, produziert wird, einer mikrobiellen Veresterungsreaktion unterworfen wird.
Seit einigen Jahren wird die Herstellung von Substanzen durch mikrobielle Umwandlung in der ganzen Welt erforscht. Als Anwendung einer solchen mikrobiellen Umwandlung sind eine ganze Reihe von Verfahren zur Estersynthese durch Umkehrreaktionen hydrolytischer Enzyme, wie z. B. Lipasen und Esterasen, vorgeschlagen worden, insbesondere zu Zwecken einer optischen Trennung [T. Sugai und H. Ohta, Agric. Biol. Chem., 55, 293 (1991); H. Kakeya, et al., Agric. Biol. Chem., 55, 1877 (1991); T. Sugai und H. Ohta, Agric. Biol. Chem., 54, 3337 (1990)]. Damit Veresterungsreaktionen, die durch solche Enzyme katalysiert werden, effizient ablaufen gelassen werden, ist es notwendig, die Wassermenge, die im Reaktionssystem vorliegt, zu verringern. Dementsprechend werden diese Enzymreaktionen im Allgemeinen in organischen Lösungsmitteln durchgeführt.
Dabei sind im Handel verfügbare Lipasen und Esterasen nicht nur teuer, sondern haben auch den Nachteil, dass es unmöglich ist, die tertiäre Hydroxylgruppe zu verestern, dass es schwierig ist, Carbonsäuren mit hoher sterischer Hinderung zu verestern, z. B. α,β-ungesättigte Carbonsäuren und Carbonsäuren mit einem substituierten aromatischen Ring, und dass eine optische Auftrennung bei der Veresterung einer primären Hydroxylgruppe mit relativ guter Symmetrie schwierig ist. Wenn darüber hinaus eine organische Säure mit niedrigem Molekulargewicht oder ein Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht, die zur Veresterung verwendet werden, dem Reaktionssystem in hohen Konzentrationen zugesetzt werden, kann das Reaktionssystem einen pH-Abfall zeigen oder an einer Inaktivierung der Lipase oder Esterase, die darin vorliegen, leiden. Dementsprechend ist es sehr schwierig, Ester in hohen Konzentrationen zu synthetisieren [B. Cambou und A. M. Klibanov, Biotechnol. Bioeng., 26, 1449 (1984)].
Um die oben beschriebenen Nachteile von solchen im Handel verfügbaren Lipasen und Esterasen zu überwinden, wurde ein umfangreiches Durchmustern nach Mikroorganismen, die fähig sind, eine neue Lipase oder Esterase zu produzieren, und nach mikrobiellen Umwandlungsprozessen, die solche Mikroorganismen direkt als Biokatalysatoren verwenden, durchgeführt. Da allerdings Mikroorganismen im Allgemeinen in organischen Lösungsmitteln zerstört werden oder unfähig sind, zu wachsen, ist es schwierig, solche Veresterungsreaktionen in stabiler Weise ablaufen zu lassen.
Darüber hinaus ist auch die Bildung von Estern durch Alkohol-Acetyltransferase bekannt. Allerdings wurde die Aufmerksamkeit lediglich auf die Bildung von wohlriechenden Estern (Isoamylacetat) in Sake gerichtet und es wurden keine Untersuchungen im Hinblick auf eine Synthese nützlicher Ester beschrieben.
Dagegen können Grenzflächen-Bioreaktoren, in denen ein Mikroorganismus, der an einen hydrophilen Träger gebunden ist, welcher Nährstoffe und Wasser enthält, und der an der Grenzfläche mit einem hydrophoben organischen Lösungsmittel, das im Wesentlichen keine Toxizität zu dem Mikroorganismus aufweist, wächst, als Biokatalysator verwendet werden, auf fast alle Mikroorganismentypen und mikrobiellen Reaktionen angewendet werden. So ermöglichen sie es, dass Veresterungsreaktionen sehr effizient ablaufen [S. Oda und H. Ohta, Biosci. Biotech. Biochem., 56, 2041 (1992); S. Oda, et al., J. Ferment. Bioeng., 78, 149 (1994); Japanische Offenlegungsschrift Nr. 344896/'93]. Allerdings kann Toxizität, die von hydrophilen toxischen Substanzen stammt, in Grenzflächen-Bioreaktoren nicht vermieden werden, so dass es schwierig ist, organische Säuren und Alkohole mit niedrigem Molekulargewicht dem Reaktionssystem in hohen Konzentrationn zuzusetzen. [S. Oda und H. Ohta, Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1515 (1992)].
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensive Untersuchungen im Hinblick auf die Lösungen der oben beschriebenen verschiedenen Probleme des Standes der Technik durchgeführt. Als Resultat haben sie nun gefunden, dass diese durch Kombination einer Fermentation mit einer mikrobiellen Veresterungsreaktion durch wirksame Ausnutzung eines großen Vorteils eines Grenzflächen-Bioreaktors (nämlich seine Fähigkeit, Mikroorganismen in organischen Lösungsmitteln zu kultivieren) und der Fermentationsaktivität von Mikroorganismen gelöst werden können, d. h. indem fermentativ eine wasserlösliche organische Säure, ein wasserlöslicher Alkohol oder Acetylcoenzym A als Vorstufe davon produziert werden, während die wasserlösliche organische Säure, der wasserlösliche Alkohol oder Acetylcoenzym A sukzessive einer mikrobiellen Veresterungsreaktion mit einem wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Alkohol oder einer wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen organischen Säure unterworfen wird und während gegegebenenfalls der wasserunlösliche oder schwach wasserlösliche Alkohol oder die wasserunlösliche oder schwach wasserlösliche organische Säure, die für die mikrobielle Veresterungsreaktion verwendet werden, in situ durch mikrobielle Oxidation eines Alkohols oder durch mikrobielle Reduktion oder Oxidation eines Aldehyds produziert wird. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Feststellung vollendet.
Somit wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein kombiniertes Verfahren zur Fermentation und mikrobiellen Umwandlung bereitgestellt, umfassend Anheften eines Mikroorganismus, der Fermentationsaktivität zur Bildung organischer Säure, Fermentationsaktivität zur Bildung von Alkohol oder Fermentationsaktivität zur Bildung von Acetylcoenzym A hat, und der die Fähigkeit hat, eine Lipase, eine Esterase oder eine Alkohol-Acetyltransferase zu produzieren, an einen hydrophilen immobilisierenden Träger und Inkontaktbringen eines hydrophoben organischen Lösungsmittels, das mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen (im Folgenden kollektiv als "kaum wasserlöslich" bezeichnet) Alkoholen, organischen Säuren und Aldehyden, mit dem Mikroorganismus auf dem Träger in Gegenwart eines wässrigen Mediums, das ein Saccharid enthält, welches als Nährstoff für den Mikroorganismus und als Fermentationsmaterial dient, so dass der Mikroorganismus an der Kontaktgrenzfläche wächst, wodurch eine wasserlösliche organische Säure, ein wasserlöslicher Alkohol oder Acetylcoenzym A (im Folgenden als "Acetyl-CoA" abgekürzt) aus dem Fermentationsmaterial durch Wirkung des gewachsenen Mikroorganismus fermentativ produziert wird und dieses Fermentationsprodukt gleichzeitig einer mikrobiellen Veresterungsreaktion mit dem kaum wasserlöslichen Alkohol oder der kaum wasserlöslichen organischen Säure, der/die in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, mit der kaum wasserlöslichen Säure, die durch mikrobielle Oxidation des kaum wasserlöslichen Alkohols, welcher in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, produziert wird, oder mit dem kaum wasserlöslichen Alkohol oder der kaum wasserlöslichen organischen Säure, der/die durch mikrobielle Reduktion oder Oxidation des Aldehyds, der in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, produziert wird, unterworfen wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung produziert das Mikroorganismenwachstum an der Feststoff-Flüssigkeits-Grenzfläche zwischen dem Träger und dem hydrophoben organischen Lösungsmittel in einem Grenzflächen-Bioreaktor fermentativ eine wasserlösliche organische Säure mit niedrigem Molekulargewicht, einen wasserlöslichen Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht oder Acetyl-CoA durch Verwendung eines Fermentationsmaterials, das ein hydrophiles Saccharid, wie z. B. Glucose, Stärke oder Saccharose, umfasst. Durch die enzymatische Wirkung der Lipase, Esterase oder Alkohol- Acetyltransferase, die von dem Mikroorganismus besessen wird, wird das resultierende Fermentationsprodukt mit dem kaum wasserlöslichen Alkohol oder der kaum wasserlöslichen organischen Säure, die/der in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, oder mit dem kaum wasserlöslichen Alkohol oder der kaum wasserlöslichen organischen Säure, der/die in situ durch mikrobielle Oxidation des kaum wasserlöslichen Alkohols, welcher im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, oder durch mikrobielle Reduktion oder Oxidation des Aldehyds, welcher im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, produziert werden, so dass eine große Menge des Veresterungsproduktes im hydrophoben organischen Lösungsmittel akkumuliert wird. In diesem Fall wird die wasserlösliche organische Säure mit niedrigem Molekulargewicht, der wasserlösliche Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht oder Acetyl-CoA, hergestellt durch Fermentation organischer Säure, Alkohol-Fermentation oder Acetyl-CoA-Fermentation, sukzessive einer Veresterungsreaktion unterworfen, bevor eine Konzentration im Träger erreicht ist, bei der Toxizität und Hemmung der Rückkopplung erreicht werden. Folglich weist das Fermentationsprodukt keine Toxizität für den Mikroorganismus auf. Auf der Basis des Phänomens der Toxizitätsverringerung an der Feststoff-Flüssigkeit- Grenzfläche, das einen großen Vorteil eines Grenzflächen- Bioreaktors darstellt, kann die Zugabekonzentration des kaum wasserlöslichen Alkohols, der kaum wasserlöslichen Säure oder des kaum wasserlöslichen Aldehyds, der/die in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, und/oder die Akkumulationskonzentration des kaum wasserlöslichen Alkohols oder der kaum wasserlöslichen organischen Säure, der/die durch die mikrobielle Umwandlungsreaktion produziert wird, im Vergleich zum Stand der Technik deutlich erhöht werden. Darüber hinaus kann auf der Basis des oben beschriebenen Phänomens der Toxizitätsverringerung der Ester, der durch die Veresterung produziert wird, bei geeigneter Konzentration akkumuliert werden, die weit über der des Standes der Technik liegt.
Wenn eine wasserlösliche organische Säure durch Fermentation produziert wird, bewirkt die oben beschriebene mikrobielle Veresterungsreaktion, dass diese organische Säure mit dem kaum wasserlöslichen Alkohol, der im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, oder dem kaum wasserlöslichen Alkohol, der durch mikrobielle Reduktion des kaum wasserlöslichen Aldehyds, welcher im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, produziert wird, verestert wird. Wenn durch die Fermentation ein wasserlöslicher Alkohol produziert wird, bewirkt die oben beschriebene mikrobielle Veresterungsreaktion, dass dieser Alkohol mit der kaum wasserlöslichen organischen Säure, welche in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, oder mit der kaum wasserlöslichen organischen Säure, die durch mikrobielle Oxidation des kaum wasserlöslichen Alkohols oder Aldehyds, welcher im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, produziert wird, verestert wird.
Wenn andererseits durch die Fermentation Acetyl-CoA produziert wird, dient das Acetyl-CoA als Acetyldonor zur Veresterung des kaum wasserlöslichen Alkohols, welcher in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, oder des kaum wasserlöslichen Alkohols, der durch mikrobielle Reduktion des kaum wasserlöslichen Aldehyds, welcher im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, hergestellt wird.
Somit besteht ein erstes Merkmal der vorliegenden Erfindung in der Ausnutzung des Wachstums eines Mikroorganismus in einem organischen Lösungsmittel entsprechend einem Vorteil des Grenzflächen-Bioreaktors, wobei der Mikroorganismus eine wasserlösliche organische Säure, einen wasserlöslichen Alkohol oder Acetyl-CoA produzieren gelassen wird und dieses Fermentationsprodukt gleichzeitig sukzessive einer Veresterungsreaktion durch Wirkung des Mikroorganismus unterzogen wird. Auf dem Gebiet der Biotechnologie waren Fermentation und mikrobielle Umwandlung herkömmlicherweise völlig unterschiedliche Forschungs- und Anwendungsgebiete, und daher haben sich Forschung oder Anwendung auf jedem Gebiet völlig unabhängig entwickelt. Folglich wurde kein Versuch unternommen, um die Fermentation mit einer mikrobiellen Umwandlung zu kombinieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung, bei der eine wasserlösliche organische Säure, ein wasserlöslicher Alkohol oder Acetyl-CoA durch Fermentation produziert wird und dieses Fermentationsprodukt gleichzeitig sukzessive einer Veresterungsreaktion unterzogen wird, kann allerdings die Kombination von Fermentation mit mikrobiellen Veresterungsreaktionen in einem für Mikroorganismen günstigen Zustand erreicht werden.
Ein zweites Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die wasserlösliche organische Säure, der wasserlösliche Alkohol oder Acetyl-CoA, die zur Veresterung verwendet werden, daran gehindert werden können, Toxizität für den Mikroorganismus oder Feedback-Hemmung (bzw. Rückkopplungshemmung) zu entwickeln. Wasserlösliche organische Säuren, wasserlösliche Alkohole und Acetyl-CoA entwickeln eine starke Toxizität für Mikroorganismen oder starke Feedback-Hemmung (bzw. Rückkopplungshemmung). Wenn sie mikrobiellen Reaktionssystemen gemäß dem Stand der Technik zugesetzt werden, müssen ihre Zusatzkonzentrationen demnach niedrig gehalten werden. Dies resultiert unvermeidlich in einer niedrigen Reaktionsgeschwindigkeit und einer geringen Ausbeute. Darüber hinaus sind im Handel verfügbare Acetyl-CoA-Salze so teuer, dass es praktisch unmöglich ist, sie als Acetyldonoren einzusetzen. In der vorliegenden Erfindung wird allerdings die wasserlösliche organische Säure, der wasserlösliche Alkohol oder das Acetyl- CoA, die/der/das durch Fermentation produziert wird, sukzessive einer Veresterungsreaktion unterworfen, bevor eine Konzentration erreicht ist, bei der Toxizität für den Mikroorganismus oder eine Feedback-Hemmung entwickelt wird. Folglich weisen die wasserlösliche organische Säure, der wasserlösliche Alkohol oder Acetyl-CoA das Problem einer Toxizitätsentwicklung oder der Entwicklung einer Feedback- Hemmung nicht auf, was es möglich macht, die Fermentation und die Veresterungsreaktion (wie auch die mikrobielle Reduktions- oder Oxidationsreaktion) in stabiler Weise fortzusetzen.
Ein drittes Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Zugabekonzentration des kaum wasserlöslichen Alkohols oder der kaum wasserlöslichen organischen Säure, der/die im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist und zur Veresterung verwendet wird, oder des kaum wasserlöslichen Alkohols oder Aldehyds, welcher im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist und für eine mikrobielle Reduktions- oder Oxidationsreaktion verwendet wird, oder die Akkumulationskonzentration des Umwandlungsproduktes aufgrund des Toxizitätsverringerungsphänomens im Grenzflächen-Reaktor hochgehalten werden kann. Die Zugabekonzentration des Ausgangsmaterials ist bei der Verbesserung der Produktivität und Ausbeute und darüber hinaus bei der Trennung und Reinigung des Produktes ein sehr wichtiger Faktor und kann daher wesentlich zu einer Verringerung der Produktionskosten beitragen.
Ein viertes Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass es, da der wasserunlösliche Ester, der gebildet wird, spontan zur Reaktionslösungsmittelschicht des Grenzflächen-Bioreaktors wandert, möglich ist, die Toxizität des Esters zu vermeiden und eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichts in Richtung Veresterung, eine Verbesserung der Reaktionsgeschwindigkeit und dergleichen zu erreichen. Wenn der kaum wasserlösliche Alkohol, die kaum wasserlösliche organische Säure oder der Aldehyd, der/die als Substrat verwendet wird, hoch toxisch ist, kann ein derartiges Substrat nach dem chargenweisen Zusatzverfahren allmählich in geringen Konzentrationen zugesetzt werden. Die Akkumulation einer hohen Konzentration des resultierenden Esters im Reaktionslösungsmittel trägt zusammen mit dem dritten Merkmal stark zu einer Verringerung der Produktionskosten bei.
Ein fünftes Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass, wenn die Konzentration des hydrophilen Saccharids erhöht wird, um eine effiziente Fermentationsherstellung zu erreichen, Nebenreaktionen (z. B. mikrobielle Oxidationsreaktionen), die durch den wachsenden Mikroorganismus induziert wurden und parallel mit der Veresterungsreaktion fortschreiten, wirksam unterdrückt werden können. Es ist bekannt, dass die Aktivität von Alkoholdehydrogenase, die mikrobielle Oxidationsreaktionen katalysiert, im Allgemeinen durch hohe Saccharidkonzentrationen (z. B. an Glucose) gehemmt wird [U. Lutstrof und R. Magnet, Arch. Biochem. Biophys., 126, 933 (1968); B. S. Yadav, et al., J. Ferment. Technol., 57, 244 (1979)]. Wenn hohe Konzentrationen an Sacchariden in der vorliegenden Erfindung zum Zweck der Erhöhung der Fermentationsaktivität verwendet werden, werden demnach mikrobielle Oxidationsreaktionen als Nebenreaktionen zur gleichen Zeit unterdrückt, was in einer deutlichen Verbesserung der Ausbeute an produziertem Ester resultiert. Wenn andererseits eine organische Säure durch mikrobielle Oxidation eines kaum wasserlöslichen Alkohols oder Aldehyds produziert wird, kann die Produktion eines Esters durch Aufrechterhaltung der Glucosekonzentration bei 2 bis 3% effizient erreicht werden.
Der Grenzflächen-Bioreaktor, der im kombinierten Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, kann einer sein, der per se bekannt ist. Was das Material, die Größe und die Form der hydrophilen immobilisierenden Träger, die verwendet werden, die Reaktionslösungsmittel, die verwendet werden können, und dergleichen angeht, so kann z. B. auf die japanische Offenlegungsschrift Nr. 91878/93 verwiesen werden.
Spezifische Beispiele für die hydrophilen immobilisierenden Träger umfassen plattenartige Strukturen aus natürlichen Polymeren, wie z. B. Alginat, Carageenan, Stärkematrix, Agar und Cellulosematerialien (z. B. Filterpads); synthetischen Polymeren, wie z. B. Polyvinylalkohol, Urethanpolymeren, Polyacrylamid und Polyacrylsäure; und aus anorganischen porösen Materialien, z. B. Schaumglasplatten. Wenn es beabsichtigt ist, die Träger zu regenerieren und wiederholt zu verwenden, so werden vorzugsweise plattenartige Strukturen aus einem gelartigen synthetischen Polymeren oder einem anorganischen porösen Material verwendet. Um diesen Festigkeit zu verleihen, ist es darüber hinaus vorteilhaft, eine zähe poröse Platte (z. B. ein Filterpad oder eine Schaumglasplatte) oder eine Platte oder einen Stab aus stainless steel oder dergleichen als Gerüst für die Träger einzusetzen.
Das hydrophobe organische Lösungsmittel, das als Reaktionslösungsmittel verwendet wird, sollte vorzugsweise eines sein, das im Wesentlichen keine Toxizität für die immobilisierten mikrobiellen Zellen hat. Spezifische Beispiele dafür umfassen n-Paraffine oder flüssige Paraffine, die durch Kohlenwasserstoffe der Methanreihen mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, z. B. Hexan, Heptan, Octan, Nonan und Decan typisiert werden; Isoparaffine, z. B. Isooctan; n- Alkylbenzole mit einer aliphatischen Kette aus 5 bis 15 Kohlenstoffatomen, z. B. Pentylbenzol, Hexylbenzol, Heptylbenzol und Octylbenzol; Isoalkylbenzole, wie z. B. Cumol; alicyclische Kohlenwasserstoffe, wie Cyclohexan; aliphatische Ether, wie Dihexylether; aromatische Ester, wie z. B. Dibutylphthalat; aliphatische Ester, wie z. B. Ethyldecanoat; und Siliconöle, wie z. B. Polydimethylsiloxan.
Das verwendete Reaktionslösungsmittel ist nicht auf ein einzelnes Lösungsmittel beschränkt, sondern kann ein gemischtes Lösungsmittelsystem sein, das zwei oder mehrere Lösungsmittel umfasst, die im Hinblick auf die Löslichkeit der Ausgangsmaterialien und das Produkt, ihre Toxizität für Mikroorganismen oder dergleichen ausgewählt sind.
Ein spezifisches Beispiel für den Grenzflächen-Bioreaktor ist einer, der ein Reaktionslösungsmittel, das ein Paraffin umfasst, und immobilisierende Träger, die Polyvinylalkohole-beschichtete Filterpads, die in einen Reaktionstank gepackt sind, so dass sie in horizontaler oder vertikaler Position angeordnet sind, umfassen, verwendet.
Alternativ kann die Kombination von Fermentation und mikrobiellen Umwandlungsreaktionen in der vorliegenden Erfindung auch entsprechend einem wässrigen/organischen Zweiphasensystem-Reaktionsverfahren erreicht werden [M. D. Hocknull und M. D. Lilly, Appl. Microbiol. Biotechnol., 33, 148 (1990)], das ein flüssiges Medium anstelle der hydrophilen immobilisierenden Träger des Grenzflächen-Bioreaktors verwendet. In diesem Fall werden allerdings die Resultate, die mit dem Grenzflächen-Bioreaktor erhalten werden, nicht übertroffen, da die Toxizität des organischen Lösungsmittels und des kaum wasserlöslichen Alkohols, der organischen Säure oder des Aldehyds, die zur Veresterung verwendet werden, auftritt.
Was die Zuführung von Sauerstoff für das mikrobielle Wachstum angeht, so ist es, wenn der Mikroorganismus eine Fermentation zu organischer Säure oder eine Fermentation zu Alkohol durchführen gelassen wird, eher wünschenswert, den Mikroorganismus ohne Sauerstoffzufuhr (d. h. unter anaeroben Bedingungen) wachsen zu lassen und auch die Reaktion durchzuführen. Da allerdings der Mikroorganismus im Allgemeinen den Sauerstoff, der während des Wachstumsprozesses im Reaktionslösungsmittel vorliegt, verbraucht, ist es nicht notwendigerweise erforderlich, das Reaktionslösungsmittel einer Behandlung, z. B. einer Entlüftung oder einem Ersatz mit Stickstoff, zu unterwerfen. Wenn dagegen der Mikroorganismus Acetyl-CoA produzieren gelassen wird, ist es vorteilhaft, Acetyl-CoA fermentativ unter aeroben Bedingungen zu produzieren. Zu diesem Zweck ist der Grenzflächen-Bioreaktor besonders effektiv.
Was Nährstoffe angeht, die für das mikrobielle Wachstum notwendig sind, ist es, da eine wasserlösliche organische Säure, ein wasserlöslicher Alkohol oder Acetyl-CoA durch Fermentation produziert werden müssen, essentiell, dass das wässrige Medium ein Ausgangsmaterial zur fermentativen Herstellung der wasserlöslichen Säure, des wasserlöslichen Alkohols oder von Acetyl-CoA enthält. Verwendbare Fermentationsmaterialien umfassen z. B. Saccharide, z. B. Glucose, Stärke und Saccharose. Zusätzlich zu dem Substrat, das für die fermentative Produktion einer wasserlöslichen organischen Säure, eines wasserlöslichen Alkohols oder Acetyl- CoA verwendet wird, können die Nährstoffe gängige Kulturmediumskomponenten enthalten, wie sie z. B. in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 91878/'93 beschrieben werden. Beispielsweise besteht ein typisches wässriges Medium (oder Kulturmedium) aus 2 bis 5 Gew.-% Glucose, 3 Gew.-% Pepton, 3 Gew.-% Malzextrakt, 3 Gew.-% Hefeextrakt, 0,1 Gew.-% Magnesiumsulfat (MgSO&sub4;·7H&sub2;O) und 1 Liter destilliertem Wasser (pH 6,0).
Im Allgemeinen ist die verwendete Konzentration des Saccharids (z. B. Glucose) als Fermentationsmaterial im wässrigen Medium im Bereich von etwa 3 bis 5 Gew.-%, da übermäßig hohe Konzentrationen davon das mikrobielle Wachstum, die Enzymaktivität und die Fermentationsaktivität hemmen können. Wenn allerdings die Konzentration des Saccharids im wässrigen Medium erhöht ist, können in bestimmten Fällen mikrobielle Oxidationsreaktionen gehemmt werden. Dementsprechend muss dies beachtet werden, wenn die mikrobielle Oxidationsreaktion eines Alkohols oder Aldehyds, der im hydrophoben organischen Lösungsmittel gelöst ist, verwendet wird. Genauer ausgedrückt, wenn Glucose verwendet wird, ist es wünschenswert, ihre Konzentration bei 2 bis 3 Gew.-% zu halten. Andererseits ist dieses Phänomen dahingehend wichtig, dass, wenn das erfindungsgemäße Verfahren ohne Ausnutzung einer solchen mikrobiellen Oxidationsreaktion durchgeführt wird, unerwünschte Oxidationsreaktionen unterdrückt werden können. Wenn z. B. die Konzentration des Saccharids auf etwa 3 Gew.-% oder höher gesteigert wird, können oft unerwünschte Nebenreaktionen (z. B. die oxidative Zersetzungsreaktion von kaum wasserlöslichem Alkohol oder kaum wasserlöslicher organischer Säure, die im Reaktionslösungsmittel enthalten ist) deutlich unterdrückt werden, was zu einer erheblichen Verbesserung bei der Ausbeute an Ester führt. Dementsprechend ist es wünschenswert, in besonderen Fällen die optimale Zugabekonzentration des Saccharids experimentell zu bestimmen.
Wenn eine organische Säure, die durch mikrobielle Oxidation des Alkohols oder des Aldehyds, der in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel gelöst ist, für eine Veresterungsreaktion mit dem Fermentationsprodukt verwendet wird, können hohe Konzentrationen des Saccharids (z. B. Glucose), das als Fermentationsmaterial verwendet wird, die Alkoholdehydrogenase oder Aldehyddehydrogenase hemmen. Entsprechend wird das Saccharid, das im wässrigen Medium enthalten ist, wünschenswerterweise bei einer solchen Konzentration gehalten, dass es die Aktivität der Alkoholdehydrogenase oder der Aldehyddehydrogenase nicht hemmt.
Die organischen Säuren, die durch Fermentation der vorstehend genannten Saccharide in der vorliegenden Erfindung zur Säure hergestellt werden, umfassen z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Buttersäure und Aminosäuren. Die Alkohole, die durch alkoholische Fermentation der vorstehend genannten Saccharide in der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, umfassen z. B. niedrigere Alkohole, wie Ethanol, Propanol und Butanol; und Diole, wie Butandiol. Erfindungsgemäß werden diese Fermentationsprodukte und Acetyl-CoA einer mikrobiellen Veresterungsreaktion mit einem kaum wasserlöslichen Alkohol oder einer kaum wasserlöslichen organischen Säure, wie sie unten beschrieben werden, oder mit einem kaum wasserlöslichen Alkohol oder einer kaum wasserlöslichen organischen Säure, hergestellt durch mikrobielle Reduktion oder Oxidation eines kaum wasserlöslichen Alkohols oder Aldehyds, unterworfen. Bei dem kaum wasserlöslichen Alkohol oder der kaum wasserlöslichen organischen Säure, die im Reaktionslösungsmittel enthalten ist und zur Veresterungsreaktion verwendet wird, sind keine besonderen Beschränkungen auferlegt. Verwendbare Beispiele dafür umfassen Alkanole mit mittlerer Kette, z. B. 1-Octanol und 1-Decanol; langkettige Alkanole, wie 1-Octadecanol; Terpenalkohole, wie Citronellol, Menthol und Geraniol; aromatische Alkohole, wie z. B. Phenylpropanol und Phenylbutanol; Alkansäuren, wie z. B. Octansäure und Decansäure; aromatische Säuren, wie z. B. 2- Hydroxy-4-phenylbutansäure; und Terpensäuren, wie z. B. Citronellsäure und Geraniumsäure.
In ähnlicher Weise besteht keine besondere Beschränkung bei dem kaum wasserlöslichen Alkohol und dem kaum wasserlöslichen Aldehyd, der im Reaktionslösungsmittel enthalten ist und für die mikrobielle Reduktion oder Oxidation verwendet wird, solange er in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel, das als Reaktionslösungsmittel verwendet wird, löslich ist. Verwendbare Beispiele für den kaum wasserlöslichen Alkohol umfassen die oben aufgezählten Alkohole, und verwendbare Beispiele für den kaum wasserlöslichen Aldehyd umfassen Alkanale, z. B. Octanal und Decanal; Terpenaldehyde, wie z. B. Citronellal und Geranylaldehyd; und aromatische Aldehyde, wie z. B. Phenylpropanal und Phenylbutanal.
Auf der Basis des Phänomens der Toxizitätsverringerung im Grenzflächen-Bioreaktor kann die Zusatzmenge des kaum wasserlöslichen Alkohols, der kaum wasserlöslichen organischen Säure oder des kaum wasserlöslichen Aldehyds so bestimmt werden, dass eine hohe Konzentration erreicht wird. Allerdings wird die Zugabemenge auch durch die Spezies des Mikroorganismus und die Polarität der Ausgangsmaterialien beeinflusst. Da Terpenalkohole (z. B. Citronellol) und mittelkettige Alkanole (z. B. 1-Octanol) speziell eine Schädigung der Wege zur Herstellung von wasserlöslichen Alkoholen, organischen Säuren und Acetyl-CoA verursachen, kann ihre Toxizität selbst mit Hilfe des Grenzflächen- Bioreaktors nicht wesentlich vermieden werden. In Abhängigkeit von der Mikroorganismusspezies können sie in einer Konzentration, die mit 1 bis 4% niedrig ist, zugesetzt werden. In einem solchen Fall kann dieses Problem durch Zusatz des Terpenalkohols oder des Alkanols, der/das als Ausgangsmaterial verwendet wird, nach dem Verfahren des sukzessiven Zusatzes (oder des Verfahrens der chargenweise Zugabe) gelöst werden.
Sogar organische Säuren und Alkohole mit relativ hoher Löslichkeit in Wasser können als Substrate zur Veresterung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, dass ihre Zusatzkonzentration im Reaktionslösungsmittel ausreichend niedrig gehalten wird und sie nach dem Verfahren der chargenweisen Zugabe allmählich zugesetzt werden.
Wenn ein kaum wasserlöslicher Alkohol oder eine kaum wasserlösliche organische Säure, der/die durch mikrobielle Oxidation eines kaum wasserlöslichen Alkohols oder durch mikrobielle Reduktion oder Oxidation eines kaum wasserlöslichen Aldehyds produziert wird, zum Zwecke der Veresterung im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann die Verwendung einer mikrobiellen Reduktion oder Oxidation entsprechend der wasserlöslichen organischen Säure, dem wasserlöslichen Alkohol oder Acetyl-CoA, hergestellt durch Fermentation, ausgewählt werden. Genauer ausgedrückt, wenn eine wasserlösliche organische Säure oder Acetyl-CoA als Resultat der Fermentation akkumuliert wird, ist es vorteilhaft, einen Alkohol durch mikrobielle Reduktion eines Aldehyds zu produzieren. Wenn dagegen ein wasserlöslicher Alkohol durch Fermentation produziert wird, ist es vorteilhaft, eine kaum wasserlösliche organische Säure durch mikrobielle Oxidation eines kaum wasserlöslichen Alkohols herzustellen. Obgleich es hinreichend möglich ist, einen Aldehyd mikrobiell zu einer organischen Säure zu oxidieren, kann die Reduktionsreaktion in einem solchen Fall schneller ablaufen.
Bei der Spezies des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismus besteht keine besondere Beschränkung, vorausgesetzt, dass er die Aktivität zur Herstellung einer wasserlöslichen organischen Säure, eines wasserlöslichen Alkohols oder Acetyl-CoA durch Fermentation eines Saccharids (d. h. Fermentationsaktivität zur Bildung einer organischen Säure, Fermentationsaktivität zur Bildung eines Alkohols oder Fermentationsaktivität zur Bildung von Acetyl-CoA), die Fähigkeit, eine Lipase, eine Esterase oder eine Alkohol-Acetyltransferase zu bilden und, wenn geeignet, die Fähigkeit, einen kaum wasserlöslichen Aldehyd, der im Reaktionslösungsmittel des Grenzflächen-Bioreaktors gelöst ist, zu reduzieren oder einen darin gelösten kaum wasserlöslichen Alkohol oder Aldehyd zu oxidieren, besitzt. Verwendbare Mikroorganismen umfassen z. B. Bakterien der Gattung Propionibacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Pseudomonas und Bacillus; Hefen der Gattung Issatchenkia, Hansenula, Candida, Saccharomyces, Kluyberomyces und Pichia; und Schimmelpilze der Gattung Rhizopus, Aspergillus und Penicillium. Spezifischer umfassen sie z. B. Propionibacterium shermanii, Acetobacter aceti, Lactobacillus brevis, Pseudomonas fluorescens, Hansenula saturnus, Hansenula anomala, Candida utilis, Issatchenkia terricola, Bacillus subtilis subsp. niger, Saccharomyces cerevisiae, Pichia heedii, Pichia quercuum, Rhizopus delemar, Aspergillus terreus und Penicillium notaum. Insbesondere wenn Mikroorganismen, die fähig sind, eine Lipase oder Esterase mit ausgezeichneter Stereoselektivität zu produzieren (z. B. Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas, Candida und Aspergillus), verwendet werden, läuft die mikrobielle Veresterungsreaktion in Abhängigkeit vom Typ des Alkohols oder der organischen Säure, der/die im Reaktionslösungsmittel enthalten ist, stereoselektiv ab.
Ein solcher Mikroorganismus kann an den oben beschriebenen hydrophilen immobilisierenden Träger angeheftet werden, z. B. indem der hydrophile immobilisierende Träger mit einem wässrigen Medium (oder Kulturmedium), das Nährstoffe einschließlich des oben beschriebenen Saccharids als essentielle Komponente enthält, imprägniert wird, dieser mit dem gewünschten Mikroorganismus geimpft wird und der Mikroorganismus unter optimalen Bedingungen für etwa 0 bis 5 Tage kultiviert wird.
Der hydrophile immobilisierende Träger, der den Mikroorganismus in der oben beschriebenen Art angeheftet hat, wird mit einem wässrigen Medium, das Nährstoffe enthält, zugeführt, und, wenn notwendig, mit einem hydrophoben Lösungsmittel in Kontakt gebracht, das darin einen kaum wasserlöslichen Alkohol, eine kaum wasserlösliche organische Säure oder einen kaum wasserlöslichen Aldehyd gelöst hat, entsprechend den Eigenschaften des Mikroorganismus in Kontakt gebracht wird. Danach wird die Kultivierung fortgesetzt, bis der resultierende Ester vollständig akkumuliert ist. Die dafür angewendete Kultivierungstemperatur kann eine Temperatur sein, die für den verwendeten Mikroorganismus günstig ist (z. B. eine optimale Temperatur zwischen etwa 20ºC und etwa 40ºC).
Der Ester, der in hohen Konzentrationen im Reaktionslösungsmittel akkumuliert ist, kann nach einer der gängigen Trennungs- und Reinigungstechniken isoliert werden, welche z. B. einen Schritt, der eine Konzentrierung durch Abdestillieren des Reaktionslösungsmittels beinhaltet, und ein Verfahren zur Abtrennung durch Adsorbieren des resultierenden Esters an einem Adsorbens, wie z. B. Silicagel oder Aluminiumoxid, umfassen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. Allerdings sollen diese Beispiele den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken.

BEISPIEL 1

200 ml Agarplattenmedium (pH 6,0), bestehend aus 5 g Pepton, 3 g Hefeextrakt, 3 g Malzextrakt, 1 g Magnesiumsulfat, 40 g Glucose, 20 g Agar und 1 Liter destilliertem Wasser, wurden in eine Petrischale gegossen, die aus Glas bestand und einen Durchmesser von 21 cm hatte. Unter Verwendung eines Conradi-Stabs wurde dieses Agarmedium mit 2 ml einer 1-Tag-Kultur von Hansenula saturnus IFO 0809 beimpft. Nachdem der Mikroorganismus über Nacht in Standkultur gewachsen war, wurden 70 ml einer 2%igen Citronellollösung in Decan über das Agarmedium gegeben, dann wurde über 5 Tage ein Fermentations-Transformations-Test durchgeführt. Als Resultat der Gaschromatographie-Analyse der Decanschicht wurde eine Akkumulation von Citronellylacetat in der Decanschicht ab einem Tag nach Beginn der Reaktion festgestellt; ihre Akkumulationskonzentration erreichte am 5. Tag 18 g/l.

BEISPIEL 2

Die inneren Poren von Filterpads (6 cm · 13 cm), die mit einem 10%igen Polyvinylalkoholgel (ENTV-500; hergestellt von Kansai Paint Co., Ltd.) überzogen waren, wurden mit einem flüssigen Medium gefüllt, das dieselbe Zusammensetzung wie in Beispiel 1 beschrieben hatte. Dreizehn plattenartige Träger, die wie oben hergestellt waren, wurden mit einer Ein-Tag-Kultur von Pichia heedii IFO 10019, die einen Tag lang wachsen gelassen worden war, beimpft und dann in einen Edelstahltank gepackt, der ein inneres Fassungsvermögen von 3 Litern hatte, indem sie in vertikaler Position an einem Edelstahlrahmen fixiert wurden.
Ein Liter einer 3%igen Geraniollösung in Undecan wurde eingeführt und das Ganze 5 Tage lang unter Rühren mit einem Magnetrührer, der am Boden des Reaktors angeordnet war, umgesetzt. Als Resultat einer Gaschromatographieanalyse der Undecanschicht wurde eine deutliche Akkumulation von Geranylacetat in der Decanschicht ab einem Tag nach Beginn der Reaktion festgestellt; seine Akkumulationskonzentration erreichte 26 g/l am fünften Tag.

BEISPIEL 3

Ein Agarplattenmedium, das dieselbe Zusammensetzung wie in Beispiel 1 beschrieben hatte, wurde in eine Petrischale aus Glas mit einem Durchmesser von 21 cm gegossen. Unter Verwendung eines Conradi-Stabs wurde dieses Agarmedium mit 2 ml einer Ein-Tag-Kultur von Issatchenkia terricola IFO 0933 beimpft. Nachdem die Mikroorganismen über Nacht in Standkultur wachsen gelassen worden waren, wurden 70 ml einer 2%igen Decansäurelösung in Decan über das Agarmedium gegeben und dann wurde ein Fermentations-Transformations- Test über 5 Tage durchgeführt. Als Resultat einer Gaschromatographie-Analyse der Decanschicht wurde eine Akkumulation von Ethyldecanoat in der Decanschicht ab einem Tag nach Beginn der Reaktion festgestellt; seine Akkumulationskonzentration erreichte am fünften Tag 9 g/l.

BEISPIEL 4

Ein Agarplattenmedium mit derselben Zusammensetzung wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde in eine Petrischale aus Glas mit einem Durchmesser von 21 cm gegossen. Unter Verwendung eines Conradi-Stabs wurde dieses Agarmedium mit 2 ml einer Ein-Tag-Kultur von Bacillus subtilis subsp. niger IFO 3108 beimpft. Nachdem der Mikroorganismus über Nacht in Standkultur wachsen gelassen worden war, wurden 70 ml einer 1%igen Menthollösung in Decan über das Agarmedium gegeben und es wurde ein Fermentations-Transformations-Test für fünf Tage durchgeführt. Als Resultat einer Gaschromatographieanalyse der Decanschicht wurde eine Akkumulation von Ethyldecanoat in der Decanschicht ab einem Tag nach Beginn der Reaktion festgestellt; seine Akkumulationskonzentration erreichte am fünften Tag 6 g/l.

BEISPIEL 5

200 ml Agarplattenmedium (pH 6,0), bestehend aus 5 g Pepton, 3 g Malzextrakt, 1 g Magnesiumsulfat, 40 g Glucose, 20 g Agar und 1 Liter destilliertem Wasser wurde in eine Petrischale aus Glas mit einem Durchmesser von 21 cm gegossen. Unter Verwendung eines Conradi-Stabs wurde dieses Agarmedium mit 2 ml einer Ein-Tag-Kultur von Hansenula saturnus IFO 0809 beimpft. Nachdem der Mikroorganismus über Nacht in Standkultur wachsen gelassen worden war, wurden 70 ml einer 2%igen Citronellallösung in Decan über das Agarmedium gegeben, und es wurde ein Fermentations- Transformations-Test für fünf Tage in Schüttelkultur durchgeführt. Als Resultat einer Gaschromatographie-Analyse der Decanschicht wurde die mikrobielle Veresterungsreaktion von Citronellol, das durch mikrobielle Reduktion von Citronellal gebildet worden war, mit Essigsäure, die durch Essigsäure-Fermentation gebildet worden war, beobachtet; ab einem Tag nach Beginn der Reaktion wurde eine Akkumulation von Citronellylacetat in der Decanschicht festgestellt. Als Folge des Fermentations-Transformations-Tests, der über fünf Tage durchgeführt wurde, erreichte die Akkumulationskonzentration von Citronellylacetat in der Decanschicht 19 g/l.

BEISPIEL 6

Die inneren Poren von Filterpads (6 cm · 13 cm), die mit einem 10%igen Polyvinylalkoholgel (ENTV 500; hergestellt von Kansai Paint Co., Ltd.) überzogen waren, wurden mit einem flüssigen Medium gefüllt, das dieselbe Zusammensetzung wie in Beispiel 5 beschrieben hatte. Dreizehn plattenartige Träger, die wie oben hergestellt worden waren, wurden mit einer Ein-Tag-Kultur von Pichia guercuum IFO 0949, die einen Tag lang wachsen gelassen worden war, beimpft und dann in einen Edelstahltank mit einem inneren Fassungsvermögen von 3 Liter gepackt, indem sie an einem Edelstahlrahmen in vertikaler Position befestigt wurden.
Ein Liter einer 3%igen Geranylaldehydlösung in Undecan wurde eingeführt und 5 Tage unter Rühren mit einem Magnetrührer, der am Boden des Reaktors angeordnet war, umgesetzt. Als Resultat einer Gaschromatographie-Analyse der Undecanschicht wurde die mikrobielle Veresterungsreaktion von Geraniol, das durch mikrobielle Reduktion von Geranylaldehyd gebildet worden war, mit Essigsäure, die durch Essigsäure-Fermentation gebildet worden war, beobachtet. Die Akkumulationskonzentration an Geranylacetat in der Undecanschicht erreichte am fünften Tag 28 g/l.

BEISPIEL 7

Ein Agarplattenmedium, das dieselbe Zusammensetzung wie in Beispiel 5 beschrieben hatte, wurde in eine Petrischale aus Glas mit einem Durchmesser von 21 cm gegossen. Unter Verwendung eines Conradi-Stabs wurde dieses Agarmedium mit 2 ml einer Ein-Tag-Kultur von Issatchenkia terricola IFO 0933 beimpft. Nachdem der Mikroorganismus über Nacht in Standkultur wachsen gelassen worden war, wurden 70 ml einer 3%igen Decanollösung in Decan über das Agarmedium gegeben und es wurde ein Fermentations-Transformations-Test für fünf Tage durchgeführt. Als Resultat einer Gaschromatographie-Analyse der Decanschicht wurde eine Akkumulation von Ethyldecanoat, das das Veresterungsprodukt von Decansäure, die durch mikrobielle Oxidation von Decanol gebildet worden ware, mit Ethanol, der durch Ethanol- Fermentation gebildet worden war, ist, festgestellt; seine Akkumulationskonzentration erreichte am fünften Tag 10 g/l.

Claims

1. Kombiniertes Verfahren zur Fermentation und mikrobiellen Umwandlung, umfassend

- Anheften eines Mikroorganismus, der Fermentationsaktivität zur Bildung organischer Säure, Fermentationsaktivität zur Bildung von Alkohol, Fermentationsaktivität zur Bildung von Acetylcoenzym A hat und der die Fähigkeit hat, eine Lipase, eine Esterase oder eine Alkohol-Acetyltransferase zu produzieren, an einen hydrophilen, immobilisierenden Träger und

- Inkontaktbringen eines hydrophoben organischen Lösungsmittels, das mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Alkoholen, organischen Säuren und Aldehyden, umfasst, mit dem Mikroorganismus auf dem Träger in Gegenwart eines wässrigen Mediums, das ein Saccharid enthält, welches als Nährstoff für den Mikroorganismus und als Fermentationsmaterial dient, so dass der Mikroorganismus an der Kontaktgrenzfläche wächst, wodurch eine wasserlösliche Säure, ein wasserlöslicher Alkohol oder Acetylcoenzym A aus dem Fermentationsmaterial durch Wirkung des gewachsenen Mikroorganismus fermentativ produziert wird und dieses Fermentationsprodukt gleichzeitig einer mikrobiellen Veresterungsreaktion mit dem wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Alkohol oder der wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen organischen Säure, welcher/welche in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, mit einer wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen organischen Säure, die durch mikrobielle Oxidation des wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Alkohols, welcher in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, produziert wird, oder mit einem wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Alkohol oder einer wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen organischen Säure, der/die durch mikrobielle Reduktion oder Oxidation des Aldehyds, welcher in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, produziert wird, unterworfen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus aus der Gruppe bestehend aus Propionibacterium shermanii, Acetobacter aceti, Lactobacillus brevis, Pseudomonas fluorescens, 1 Hansenula saturnus, Hansenula anomala, Pichia heedii, Pichia quercuum, Candida utilis, Issatchenkia terricola, Bacillus subtilis subsp. niger, Saccharomyces cerevisiae, Rhizopus delemar, Aspergillus terreus und Penicillin notaum ausgewählt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Saccharid, das als Fermentationsmaterial dient, aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Stärke und Saccharose ausgewählt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hydrophobe organische Lösungsmittel aus der Gruppe bestehend aus n-Paraffinen, flüssigen Paraffinen, Isoparaffinen, n-Alkylbenzolen, Isoalkylbenzolen, alizyklischen Kohlenwasserstoffen und aliphatischen Ethern ausgewählt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der wasserunlösliche oder schwach wasserlösliche Alkohol aus der Gruppe bestehend aus langkettigen oder mittelkettigen Alkanolen, Terpenalkoholen und aromatischen Alkoholen ausgewählt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wasserunlösliche oder schwach wasserlösliche organische Säure aus der Gruppe bestehend aus Alkansäuren, aromatischen Säuren und Terpensäuren ausgewählt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der wasserunlösliche oder schwach wasserlösliche Aldehyd aus der Gruppe bestehend aus Alkanalen, Terpenaldehyden und aromatischen Aldehyden ausgewählt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die fermentativ produzierte wasserlösliche organische Säure Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Buttersäure oder eine Aminosäure ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der fermentativ produzierte wasserlösliche Alkohol Ethanol, Propanol, Butanol oder Butandiol ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mikrobielle Veresterungsreaktion die Veresterungsreaktion der fermentativ produzierten wasserlöslichen organischen Säure mit dem wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Alkohol, welcher im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, oder mit dem wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Alkohol, der durch mikrobielle Reduktion des Aldehyds, welcher im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, produziert wird, ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mikrobielle Veresterungsreaktion die Veresterungsreaktion des fermentativ produzierten wasserlöslichen Alkohols mit der wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen organischen Säure, welche im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, oder mit der wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen organischen Säure, die durch mikrobielle Oxidation des wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Alkohols, welcher im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, oder durch mikrobielle Oxidation des wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Aldehyds, welcher im hydrophoben organischen Losungsmittel enthalten ist, produziert wird, ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mikrobielle Veresterungsreaktion die Veresterungsreaktion des fermentativ produzierten Acetylcoenzym A mit dem wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Alkohol, welcher im hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, oder mit dem wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Alkohol, der durch mikrobielle Reduktion des wasserunlöslichen oder schwach wasserlöslichen Aldehyds, welcher in dem hydrophoben organischen Lösungsmittel enthalten ist, produziert wird, ist.