DE69621597T2

DE69621597T2 - Adsorbens für tumornekrosefaktor alpha, methode zur entfernung durch adsorption und adsorptionsvorrichtung unter verwendung des adsorbens

Info

Publication number: DE69621597T2
Application number: DE69621597T
Authority: DE
Inventors: Takashi Asahi; Fumiyasu Hirai; Nobutaka Tani
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1995-02-16
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 2003-01-16
Anticipated expiration: 2016-02-10
Also published as: WO1996025228A1; CA2213079C; CA2213079A1; EP0810027B1; JP3901216B2; EP0810027A4; EP0810027A1; DE69621597D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Adsorbens für Tumomekrosefaktor-α (nachstehend als "TNF-α" bezeichnet), ein Verfahren zur Adsorption und Entfernung von TNF-α unter Verwendung des Adsorbens und einen Adsorber für TNF-α unter Verwendung des Adsorbens.
Mit Septikämie ist ein Zustand gemeint, bei dem eine allgemeine entzündliche Reaktion infolge einer Infektion irgendwo im Körper auftritt. Wenn dieses Entzündungssymptom fortschreitet, tritt ein Schocksyndrom (septischer Schock) und eine organische Erkrankung (Organversagen) auf, und ferner treten bei dem Patienten schwere Beschwerden auf, wie ein multiples Organversagen.
Typische Stoffe, die ausgehend von einer Infektion auf diese Weise eine Entzündung hervorrufen, sind verschiedene Cytokinarten und aktivierte Komplemente, die in Gegenwart eines Endotoxins auf der Oberfläche eines Gram-negativen Bakteriums produziert werden; und TNF-α wird als das Wichtigste angesehen, da sich bei solchen Cytokinen der Blutspiegel von TNF-α zuerst erhöht und TNF-α die Produktion anderer Cytokine fördert.
Septikämie kann durch ein Gram-positives Bakterium sowie durch ein Gram- negatives Bakterium verursacht werden. In diesem Fall nimmt man an, daß die Septikämie durch ein Cytokin wie TNF-α oder ähnliche verursacht wird, dessen Produktion durch verschiedene Stimulationen infolge von lokalen Infektionen ausgelöst wird, selbst wenn das Endotoxin nicht vorhanden ist. Wenn der Blutspiegel von TNF-α bei einer Septikämie hoch bleibt, ist auch die Prognose schlecht; und der Spiegel von TNF-α spiegelt den Grad einer schweren Erkrankung gut wieder ("Shucyu Ciryo" 6(2) (1994), 115-123).
Als herkömmliche Therapie für eine solche Septikämie gibt es eine Therapie, bei der ein Antibiotikum als Infektionsmaßnahme verabreicht wird oder eine Therapie, bei der γ- Globulin verabreicht wird, um eine Resistenz gegen die Infektion hervorzurufen. Dennoch ist die Sterberate noch hoch. So ist es vom medizinischen Standpunkt aus wünschenswert, TNF- α aus einer Körperflüssigkeit zu entfernen, da dieser als das wichtigste Cytokin angesehen wird, das eine Entzündung hervorruft.
Es ist bekannt, daß sich der Blutspiegel von TNF-α bei anderen Erkrankungen als Septikämie wie IBD (entzündliche Darmerkrankung), SLE (systemischer Lupus erythematodes), Kawasaki-Syndrom und ähnliche erhöht, bei denen eine Immunstörung als Ursache der Erkrankung angenommen wird; und es ist ferner bekannt, daß die Konzentration von TNF-α in der Gelenkflüssigkeit im Fall von RA (rheumatoide Arthritis) ansteigt ("Nippon Rinsho" 48 (1990), 304-311, unregelmäßig erscheinend). Demgemäß wird für diese Erkrankungen eine Therapie zur Entfernung von TNF-α aus einer Körperflüssigkeit in Betracht gezogen.
Die ungeprüfte Japanische Patentveröffentlichung Nr. 211900/1994, EP-A-0 592 989 (eine Anmeldung von B. Braun Melsungen Aktiengesellschaft) offenbart ein Adsorbens zur Entfernung von TNF-α aus einer Körperflüssigkeit, das einen porösen Träger umfaßt, an den ein Polyanion-Polymer kovalent gebunden ist, und in dem Beispiel davon wird ein porösen Träger verwendet, an den ein Dextransulfat gebunden ist.
Jedoch ist von den Erfindern der vorliegenden Erfindung nachgewiesen worden, daß in dem in der ungeprüften Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 211900/1994 beschriebenen porösen Träger, an den ein Dextransulfat kovalent gebunden ist, die Wechselwirkung zwischen TNF-α und dem Dextransulfat schwach ist und daß, wenn eine TNF-α enthaltende Flüssigkeit auf eine Säule aufgetragen wird, welche mit dem porösen Träger beladen ist, an den Dextransulfat gebunden ist, TNF-α nicht adsorbiert wird und nur später aus der Säule eluiert wird.
EP-A-0 321 703 betrifft ein Adsorbens für das Amyloidserumprotein, umfassend einen wasserunlöslichen Träger und eine darauf immobilisierte Verbindung, die eine anionische funktionelle Gruppe, eine polyanionische Verbindung mit mehr als einer anionischen funktionellen Gruppe, Anilin oder ein Anilinderivat ist oder einen wasserunlöslichen Träger mit einer Gruppe der Formel NR¹R², wobei R¹ und R² die angegebene Bedeutung haben.
EP-A-0 306 617 betrifft ein Autoantikörper-Adsorbens und eine Vorrichtung zur Entfernung von Autoantikörpern, umfassend bzw. verwendend ein wasserunlösliches poröses Material mit einer darauf immobilisierten Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe.
In ähnlicher Weise wurde auch nachgewiesen, daß bevorzugte Ergebnisse nicht erhalten werden können, wenn ein sulfoniertes Polysaccharid wie Heparin oder Chondroitinsulfat anstelle des Dextransulfats, ein Polypeptid wie Polyglutaminsäure oder Polyasparaginsäure und eine Nucleinsäure und ferner Polyacrylsäure und Polyvinylsulfat verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wurde vollendet, um die Nachteile des herkömmlichen Adsorbens, umfassend einen porösen Träger, an den ein Polyanion-Polymer gebunden ist, wie vorstehend erwähnt, zu verbessern und ein Adsorbens zu erhalten, das TNF-α aus einer Körperflüssigkeit, besonders Blut, Plasma oder Serum, selektiv adsorbieren und entfernen kann.
Die Erfindung betrifft ein Adsorbens für TNF-α, wobei auf einem wasserunlöslichen Träger eine Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I) immobilisiert ist:
wobei X eine Sulfonsäuregruppe ist; A eine Substituentengruppe ist, ausgenommen für die Sulfonsäuregruppe; n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist, und im Fall, daß n mindestens 2 ist, die Gruppen A, deren Anzahl n ist, gleich sind oder unterschiedlich voneinander sind; wobei die Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I) mindestens zwei funktionelle Gruppen der Formel (I) in einem Molekül aufweist (Anspruch 1);
ein Adsorbens nach Anspruch 1, wobei die Verbindung mit mindestens zwei funktionellen Gruppen der Formel (I) in einem Molekül Polystyrolsulfonsäure ist (Anspruch 2);
ein Adsorbens nach Anspruch 1 oder 2, wobei der wasserunlösliche Träger hydrophil ist (Anspruch 3);
ein Adsorbens nach Anspruch 3, wobei der wasserunlösliche Träger eine Hydroxylgruppe aufweist (Anspruch 4);
ein Adsorbens nach Anspruch 1 bis 4, wobei der wasserunlösliche Träger porös ist (Anspruch 5);
ein Verfahren zur Adsorption und Entfernung von TNF-α, umfassend das Inkontaktbringen des Adsorbens nach Anspruch 1 mit einer Körperflüssigkeit, die TNF-α enthält (Anspruch 6);
einen Adsorber zur Adsorption von TNF-α, wobei ein Gefäß mit einem Einlaß und einem Auslaß für eine Körperflüssigkeit, ausgestattet mit einer Vorrichtung, die verhindert, daß das Adsorbens aus dem Gefäß fließt, mit dem Adsorbens nach Anspruch 1 bis 5 beladen ist (Anspruch 7);
und die Verwendung einer Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I):
wobei X eine Sulfonsäuregruppe ist; A eine Substituentengruppe ist, ausgenommen für die Sulfonsäuregruppe; n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist, und im Fall, daß n mindestens 2 ist, die Gruppen A, deren Anzahl n ist, gleich sind oder sich voneinander unterscheiden; wobei die Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I) mindestens zwei funktionelle Gruppen der Formel (I) in einem Molekül aufweist, wobei die Verbindung auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisiert ist, zur Herstellung eines Adsorbens für eine neue und erfinderische Adsorption von TNF-α (Anspruch 8).
Erfindungsgemäß bedeutet eine Körperflüssigkeit Blut, Plasma, Serum, Ascitesflüssigkeit, Lymphe, Synovialflüssigkeit, eine fraktionierte Komponente, die aus diesen Flüssigkeiten erhalten wurde, oder eine flüssige Komponente aus anderen Teilen des lebenden Körpers.
TNF-α ist ein einfaches Protein mit einem Molekulargewicht von 17 kDa, das 157 Aminosäuren umfaßt und üblicherweise ein Trimer bildet. Demgemäß beträgt das Molekulargewicht des Trimers etwa 51.000.
Fig. 1 ist eine schematische Querschnittszeichnung eines Beispiels des erfindungsgemäßen Adsorbers zur Adsorption von TNF-α.
Fig. 2 ist eine Grafik, welche das Ergebnis der Untersuchung der Beziehung zwischen der Durchflußrate und dem Druckabfall ΔP unter Verwendung von drei Arten von wasserunlöslichen Trägern zeigt.
Fig. 3 ist eine Grafik, die die Änderung der Konzentration von TNF-α und eines Proteins in der Elutionsflüssigkeit zeigt, wenn TNF-α enthaltendes Serum in Beispiel 2 durch den Adsorber zur Adsorption von TNF-α geleitet wurde, wobei die Säule mit Cellulosekügelchen CK-A3 beladen ist, auf welchen Polystyrolsulfonsäure immobilisiert ist.
Fig. 4 ist eine Grafik, die die Änderung der Konzentration von TNF-α und eines Proteins in der Elutionsflüssigkeit zeigt, wenn TNF-α enthaltendes Serum in Vergleichsbeispiel 3 durch den Adsorber zur Adsorption von TNF-α geleitet wurde, wobei die Säule mit CELLULOFINE GC-700 m beladen ist, worauf Natriumdextransulfat immobilisiert ist.
Eine erfindungsgemäß verwendete Verbindung, die auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisiert ist und eine funktionelle Gruppe der Formel (I) aufweist:
wobei X eine Sulfonsäuregruppe ist; A eine Substituentengruppe ist, ausgenommen für die Sulfonsäuregruppe; n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist, und im Fall, daß n mindestens 2 ist, die Gruppen A, deren Anzahl n ist, gleich oder voneinander verschieden sind; wobei die Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I) mindestens zwei funktionelle Gruppen der Formel (I) in einem Molekül aufweist, wie vorstehend erwähnt; ist eine Verbindung, die einen Benzolring aufweist, an den eine Sulfonsäuregruppe gebunden ist, wobei in den verbleibenden vier Positionen des Benzolrings Wasserstoffatome oder die Substituentengruppen, ausgenommen für die Sulfonsäuregruppe, gebunden sein können. An einem Teil der vier Positionen des Benzolrings kann auch die Substituentengruppe, ausgenommen für die Sulfonsäuregruppe, gebunden sein. Wenn mindestens zwei der vorstehend erwähnten Substituentengruppen vorhanden sind, können diese gleich oder voneinander verschieden sein.
Die Sulfonsäuregruppe ist eine funktionelle Gruppe, die bei einem pH-Wert, der etwa neutral ist, negativ geladen ist. Die Gruppe ist eine starke Säure und ist daher erfindungsgemäß besonders nützlich.
Die Substituentengruppe (A), die an den Benzolring der Formel (I) gebunden ist, ist nicht begrenzt, solange wie sie eine andere Substituentengruppe als eine Sulfonsäuregruppe ist, und kann ein Alkylrest wie eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe oder ein aromatischer Rest wie eine Phenylgruppe und eine Gruppe, die kein Kohlenstoffatom enthält, wie eine Nitrogruppe oder eine Hydroxylgruppe sein.
Konkrete Beispiele für die Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I) sind funktionelle Gruppen der Formel (II):
wobei X wie vorstehend definiert ist, wie zum Beispiel Sulfobenzoesäure, Benzoldisulfonsäure, Aminobenzolsulfonsäure (Sulfanilsäure), Phenolsulfonsäure und ähnliche, welche jedoch nicht darauf begrenzt sind.
Konkrete Beispiele für die Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I) sind funktionelle Gruppen der Formel (III):
wobei X und A wie vorstehend definiert sind, und wenn mindestens zwei Gruppen A gebunden sind, können sie gleich oder voneinander verschieden sein, wie zum Beispiel Aminohydroxybenzolsulfonsäure, Chlormethylnitrobenzolsulfonsäure und ähnliche, welche jedoch nicht darauf begrenzt sind.
Die Verbindung mit der funktionellen Gruppe der Formel (I) ist eine Verbindung mit mindestens zwei funktionellen Gruppen in einem Molekül. Diese Verbindung weist eine hohe Affinität für TNF-α auf, und viele funktionelle Gruppen können in einfacher Weise in ein Einheitsvolumen eines festen Stoffes eingeführt werden. Insbesondere wird eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von mindestens 1000 stärker bevorzugt, da sie eine hohe Affinität für TNF-α aufweist und viele funktionelle Gruppen in einfacher Weise in ein Einheitsvolumen eines festen Stoffes eingeführt werden können.
Die funktionellen Gruppen können gleich oder voneinander verschieden sein.
Als konkrete Beispiele einer solchen Verbindung mit mindestens zwei funktionellen Gruppen in einem Molekül können zum Beispiel Polystyrolsulfonsäure, Polystyrolphosphorsäure und ähnliche erwähnt werden, die jedoch nicht darauf begrenzt sind. Von diesen wird Polystyrolsulfonsäure bevorzugt, da sie eine Sulfonsäuregruppe aufweist, die eine starke Säure ist.
Als erfindungsgemäß verwendeter wasserunlöslicher Träger können zum Beispiel ein anorganischer Träger wie Glaskügelchen oder ein Silicagel, ein wasserunlöslicher Träger, umfassend ein synthetisches Polymer wie Polyvinylalkohol, ein verseiftes Ethylenvinylacetat- Copolymer, Poly(meta)acrylat wie Polymethylmethacrylat, Poly(meta)acrylsäure, Polyacrylamid, Polystyrol, Polyacrylsäure gepfropftes Polyethylen oder Polyacrylamid-gepfropftes Polyethylen; ein organischer Träger, umfassend ein Polysaccharid, wie kristalline Cellulose, Cellulose, Agarose, Dextran oder Chitosan; und ferner ein zusammengesetzter Träger, der aus einer Kombination der vorstehend erwähnten Verbindungen erhalten wird, wie ein organischer-organischer Träger und ein organischer-anorganischer Träger, erwähnt werden, die jedoch nicht darauf begrenzt sind.
Diese Träger können allein oder in einer willkürlichen Kombination von zwei oder mehreren Arten davon verwendet werden. Von diesen wird ein hydrophiler Träger bevorzugt, da die unspezifische Adsorption relativ gering ist und die selektive Adsorption von TNF-α gut ist.
Der vorstehend erwähnte hydrophile Träger ist ein Träger, der einen Benetzungswinkel von höchstens 60º mit Wasser aufweist. Ein solcher Benetzungswinkel liegt bei einer Verbindung vor, die den Träger bildet, der in Form einer flachen Platte hergestellt wird. Beispiele solcher Träger schließen Träger ein, umfassend ein Polysaccharid wie Cellulose, Chitosan, Agarose, Dextran oder ähnliche; ein hydrophiles synthetisches Polymer wie Poly- (vinylalkohol), ein verseiftes Ethylenvinylacetat-Copolymer, Polyacrylamid, Poly(acrylsäure), Poly(methacrylsäure), Poly(acrylsäure)-gepfropftes Polyethylen, Poly(acrylamid)-gepfropftes Polyethylen oder ähnliche; und Glas.
Im Hinblick auf das Adsorptionsvermögen und die Selektivität ist von den vorstehend erwähnten wasserunlöslichen Trägern ein hydrophiler Träger mit einer Hydroxylgruppe besonders geeignet. Von diesen ist ein poröses Cellulosegel der für den erfindungsgemäß verwendeten Träger am meisten bevorzugte Träger, da er die folgenden überlegenen
Punkte aufweist:
1) Der Träger aus dem porösen Cellulosegel wird kaum zerstört oder bildet feinverteilte Teilchen durch die Einwirkung einer Bewegung oder ähnlichem, da er eine relativ hohe mechanische Festigkeit und Zähigkeit aufweist. Der Träger wird weder komprimiert noch verstopft, wenn eine Säule damit beladen wird und eine Körperflüssigkeit durch die Säule in einer hohen Durchflußrate hindurch geleitet wird. Ferner verändert sich die Porenstruktur durch eine Hochdruckdampfsterilisation kaum.
2) Der Träger ist hydrophil, da das Gel aus Cellulose besteht. Es sind viele Hydroxylgruppen für die Bindung eines Liganden verfügbar, und die unspezifische Adsorption ist gering.
3) Falls das Porositätsvolumen vergrößert wird, kann ein Adsorptionsvolumen wie bei einem weichen Gel erhalten werden, da die Festigkeit relativ hoch ist.
4) Die Sicherheit ist im Vergleich zu einem synthetischen makromolekularen Gel oder etwas ähnlichem hoch.
Das erfindungsgemäße Adsorbens kann TNF-α nur auf der Außenfläche adsorbieren; um jedoch mehr TNF-α zu adsorbieren, sind vorzugsweise sehr viele Poren mit einer geeigneten Größe vorhanden, d. h. das Adsorbens ist porös. Um TNF-α (Molekulargewicht des Trimers: etwa 51.000) wirksam zu adsorbieren, wird bevorzugt, daß TNF-α in die Poren mit einer ausreichend hohen Wahrscheinlichkeit eindringen kann, während das Eindringen anderer Proteine so gering wie möglich ist.
Obwohl eine Quecksilber-Durchlässigkeitsmessung am häufigsten zur Messung der Porengröße in dem erfindungsgemäß verwendeten porösen, wasserunlöslichen Träger verwendet wird, kann die Quecksilber-Durchlässigkeitsmessung nicht so oft angewendet werden, da sich die Struktur des Träger beim Trocknen verändert. Demgemäß ist es geeignet, das Molekulargewicht an der Ausschlußgrenze als Maßeinheit für die Porengröße der Pore zu verwenden.
Der Begriff "Molekulargewicht an der Ausschlußgrenze" bezieht sich auf das Mindestmolekulargewicht des Moleküls, bei dem das Molekül bei einer Gelpermeationschromatographie nicht in eine Pore eindringen kann (d. h. das Molekül wird ausgeschlossen) (vgl. Hiroyuki Hatano und Toshihiko Hanal, "Experimental High Performance Liquid Chromatography", Kagaku Dojin Co., Ltd.).
Im allgemeinen ist das Molekulargewicht an der Ausschlußgrenze für ein globuläres Protein, Dextran, Polyethylenglykol oder dergleichen ausführlich untersucht worden, und bei dem erfindungsgemäß verwendeten Träger ist es geeignet, einen Wert zu verwenden, der unter Verwendung eines globulären Proteins erhalten wurde.
Wenn ein Träger mit einem Molekulargewicht an der Ausschlußgrenze von weniger als 5 · 10&sup4; verwendet wird, ist die Menge des adsorbierten und entfernten TNF-α gering und die Anwendbarkeit wird verringert, da das Molekulargewicht eines trimeren TNF-α etwa 51.000 beträgt. Demgemäß beträgt das bevorzugte Molekulargewicht an der Ausschlußgrenze des verwendeten Trägers für TNF-α mindestens 5 · 10&sup4;. Es treten keine Probleme auf, solange Plasma oder Serum als Körperflüssigkeit verwendet wird, auch wenn das Molekulargewicht an der Ausschlußgrenze mehr als 5 · 10&sup6; beträgt. Falls jedoch Blut als Körperflüssigkeit verwendet wird, besteht die Tendenz, daß sich der Grad der Adhäsion von Blutplättchen erhöht, wenn das Molekulargewicht an der Ausschlußgrenze mehr als 5 · 10&sup6; beträgt. Demgemäß, falls das erfindungsgemäße Adsorbens für ein Homokatharsis-System durch direkte Hämoperfusion (DHP) verwendet wird, kann dessen Wirksamkeit nicht notwendigerweise gezeigt werden. Andererseits, falls das Molekulargewicht an der Ausschlußgrenze höchstens 5 · 10&sup6; beträgt, werden insbesondere durch eine Verwendung keine ernsthaften Schwierigkeiten verursacht. Folglich ist es wünschenswert, daß das Molekulargewicht an der Ausschlußgrenze höchstens 5 · 10&sup6; beträgt, um das Adsorbens bei vielen Anwendungen verwenden zu können.
Im Hinblick auf das Adsorptionsvermögen pro Einheitsvolumen des Adsorbens wird bevorzugt, daß das Adsorbens viele Poren auf seiner Oberfläche aufweist, und es wird bevorzugt, daß das Porenvolumen mindestens 20% und die wirksame Oberfläche mindestens 3 m²/g beträgt. Die Form des Trägers kann beliebig sein, wie Granula, Fasern oder Hohlkörper.
Ferner wird bevorzugt, daß eine funktionelle Gruppe auf der Trägeroberfläche vorhanden ist, welche zur Immobilisierung eines Liganden verwendet werden kann. Als repräsentative Beispiele für solche funktionellen Gruppen können zum Beispiel eine Hydroxylgruppe, Aminogruppe, Aldehydgruppe, Carboxylgruppe, Thiolgruppe, Silanolgruppe, Amidgruppe, Epoxygruppe, Halogengruppe, Succinylimidgruppe, wasserfreie Säuregruppe und ähnliche erwähnt werden.
Als wasserunlöslicher Träger, der erfindungsgemäß verwendet werden soll, kann jeder harte Träger und weiche Träger verwendet werden. Es ist wichtig, daß eine Säule durch den Träger nicht verstopft wird, wenn sie mit dem Träger beladen wird, und daß eine Flüssigkeit hindurch fließen kann, um den Träger als Adsorbens für eine extrakorporale Kreislaufbehandlung zu verwenden. Da eine ausreichende mechanische Festigkeit erforderlich ist, um die vorstehenden Anforderungen zu erfüllen, wird stärker bevorzugt, daß der Träger ein harter Träger ist. Der Begriff "harter Träger" bedeutet, daß wenn ein Gel zum Beispiel ein granuliertes Gel ist, wie in dem nachstehend erwähnten Referenzbeispiel 1 gezeigt ist, der Träger eine lineare Beziehung zwischen einem Druckabfall ΔP und einer Durchflußrate von bis zu 0,3 kg/cm Druckabfall aufweist, wenn eine zylindrische Säule gleichmäßig mit dem Gel beladen ist und eine wäßrige Flüssigkeit durch die Säule hindurch geleitet wird.
Das erfindungsgemäße Adsorbens kann erhalten werden durch die Immobilisierung der Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I) auf dem wasserunlöslichen Träger; und als Immobilisierungsverfahren können verschiedene bekannte Verfahren angewendet werden, welche nicht besonders begrenzt sind. Als repräsentative Verfahren können zum Beispiel erwähnt werden:
1) ein Verfahren, bei dem eine Verbindung, welche die Gruppe X nicht enthält, auf einem festen Stoff (dem wasserunlöslichen Träger) immobilisiert wird und dann die Gruppe X eingeführt wird; und
2) ein Verfahren, bei dem eine Verbindung, welche die Gruppe X enthält, auf dem festen Stoff oder etwas ähnlichem immobilisiert wird.
Als Verfahren zur Immobilisierung dieser Verbindungen auf dem festen Stoff bei den Verfahren 1) und 2) können ein Verfahren mittels physikalischer Adsorption, ein Verfahren mittels Ionenbindung, ein Verfahren mittels kovalenter Bindung oder ein ähnliches Verfahren und sonst ein Verfahren angewendet werden. Da es wichtig ist, daß die Verbindung mit der Sulfonsäuregruppe bei der Lagerung des Adsorbens nicht freigesetzt wird, wird das Verfahren mittels kovalenter Bindung bevorzugt, das in der Lage ist, eine feste Immobilisierung zu bewirken.
Als repräsentatives Beispiel für das Verfahren zur Einführung von X bei Verfahren 1) kann ein Verfahren zur Einführung der Sulfonsäuregruppe durch die Behandlung mit konzentrierter Schwefelsäure oder Chlorsulfonsäure erwähnt werden.
Andererseits, wenn die Verbindung mit mindestens zwei funktionellen Gruppen der Formel (I) in einem Molekül immobilisiert wird, kann 3) außer den vorstehenden Verfahren 1) und 2) ein Verfahren zur Pfropfpolymerisierung auf dem festen Stoff erwähnt werden.
Die Menge der Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I), die auf dem wasserunlöslichen Träger immobilisiert ist, kann als Menge der Sulfonsäuregruppe durch Titration gemessen werden. Für die immobilisierte Menge wird bevorzugt, falls der wasserunlösliche Träger zum Beispiel granulär ist, daß sie mindestens 0,01 mmol pro 1 ml des Sedimentationsvolumens beträgt. Falls sie geringer ist, verringert sich die Menge an TNF-α, die adsorbiert werden kann, außerordentlich, und das so erhaltene Adsorbens ist praktisch nicht verwendbar.
Es gibt verschiedene Arten von Verfahren zur Adsorption und Entfernung von TNF-α in einer Körperflüssigkeit durch das Inkontaktbringen einer Körperflüssigkeit mit dem Adsorbens, wobei die Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I) auf dem wasserunlöslichen Träger immobilisiert ist. Ein repräsentatives Verfahren ist zum Beispiel ein Verfahren, umfassend die Entfernung einer Körperflüssigkeit, die Lagerung davon in einem Beutel, das Vermischen mit dem Adsorbens zur Adsorption und Entfernung von TNF-α und die Filtration des Adsorbens, um die Körperflüssigkeit zu erhalten, aus der TNF-α entfernt ist; ein Verfahren, umfassend das Beladen eines Gefäßes mit einem Einlaß und einem Auslaß für eine Körperflüssigkeit, ausgestattet mit einem Filter im Auslaß, vorzugsweise im Auslaß und im Einlaß, durch den eine Körperflüssigkeit, aber nicht das Adsorbens hindurch fließen kann, mit dem Adsorbens und das Hindurchfließenlassen der Körperflüssigkeit; sowie ähnliche Verfahren. Es kann ein beliebiges Verfahren angewendet werden. Die Durchführung ist jedoch im Hinblick auf das letztere Verfahren einfach, und TNF-α kann wirksam geradlinig aus einer Körperflüssigkeit eines Patienten durch Einbeziehung des letzteren Verfahrens in den extrakorporalen Kreislauf entfernt werden. Demgemäß ist das erfindungsgemäße Adsorbens für dieses Verfahren geeignet.
Falls eine Säule mit dem Adsorbens, das verwendet werden soll, beladen wird, kann ein beliebiges Adsorbens verwendet werden, es sei denn, es ist ein feines Pulver; und es wird bevorzugt, daß die Verteilung der Teilchengröße eng ist, solange Plasma oder Serum als Körperflüssigkeit verwendet wird. Es wird jedoch bevorzugt, daß das Adsorbens ausreichend Zwischenräume aufweist, die eine im Blut enthaltene Zelle frei passieren kann, wenn Blut hindurch geleitet wird. Wenn das Adsorbens zum Beispiel granulär ist, wird ein feines Pulver nicht bevorzugt, wie vorstehend erwähnt, wobei ein Teilchen mit einer Teilchengröße von mindestens 100 um bevorzugt wird. Ferner wird ein Adsorbens bevorzugt, bei dem ein Teilchen mit einer zu großen oder einer zu kleinen Teilchengröße entfernt ist; und ein Adsorbens, bei dem die durchschnittliche Teilchengröße im Bereich von 100 um bis 1000 um liegt und die Verteilung der Teilchengröße eng ist, wird stärker bevorzugt. Wenn das Adsorbens eine Faser oder ein Hohlkörper ist, wird bevorzugt, daß der Innendurchmesser mindestens 5 um beträgt. Falls das Adsorbens eine Faser, aber kein Hohlkörper ist, wird bevorzugt, daß der Durchmesser mindestens 1 um beträgt.
Um eine unspezifische Adsorption eines Blutkörperchens beim Hindurchfließen von Blut durch das erfindungsgemäße Adsorbens zu verhindern, kann das Adsorbens mit einem Polymer beschichtet werden, das eine ausgezeichnete Blutverträglichkeit aufweist, zum Beispiel ein Polymer von Hydroxyethyl(meta)acrylat. Eine solche Beschichtung kann vorgenommen werden, um zu verhindern, daß sich feine Teilchen des Adsorbens bilden.
Nachstehend wird ein Adsorber für TNF-α, umfassend das erfindungsgemäße Adsorbens, unter Bezugnahme auf Fig. 1 erläutert, die eine schematische Querschnittszeichung eines erfindungsgemäßen Beispiels ist.
In Fig. 1 bedeuten: 1 = ein Einlaß für eine Körperflüssigkeit; 2 = ein Auslaß für eine Körperflüssigkeit; 3 = ein erfindungsgemäßes Adsorbens für TNF-α; 4 und 5 = ein Filter, der verhindert, daß das Adsorbens ausfließt, wobei die Körperflüssigkeit und in der Körperflüssigkeit enthaltene Komponenten hindurchlaufen können, aber das Adsorbens für TNF-α nicht; 6 = eine Säule; und 7 = ein Adsorber für TNF-α.
Besonders im Hinblick auf die Form und das Material des Behälters des vorstehenden Adsorber für TNF-α gibt es keine Begrenzung. Beispiele des Behälters schließen eine zylindrische Säule mit einem Fassungsvolumen von 150 bis 400 ml und einem Durchmesser von 4 bis 10 cm ein.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele ausführlich veranschaulicht, wobei die Erfindung jedoch nicht auf die folgenden Beispiele begrenzt ist.

Referenzbeispiel 1

Zylindrische Säulen aus Glas (wobei die Säule einen Innendurchmesser von 9 mm und eine Länge von 150 mm aufweist), ausgestattet mit Filtern mit einer Porengröße von 15 um an beiden Enden, wurden jeweils gleichmäßig mit einem Agarosegel (Biogel A-5m, hergestellt von BIO-RAD, mit einer Teilchengröße von 50 bis 100 Mesh), einem Vinylpolymergel (TOYOPEARL HW-65, hergestellt von TOSOH Corporation, mit einer Teilchengröße von 50 bis 100 um) oder einem Cellulosegel (CELLULOFINE GC-700 m, hergestellt von CHISSO CORPORATION, mit einer Teilchengröße von 45 bis 105 um) beladen. Dann wurden jeweils die Beziehungen zwischen der Durchflußrate und dem Druckabfall ΔP bestimmt, indem Wasser durch jede Säule mit einer Schlauchpumpe gepumpt wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.
Wie in Fig. 2 gezeigt, ist erkennbar, daß sich die Durchflußrate im Fall von TOYOPEARL HW-65 und CELLULOFINE GC-700 m jeweils praktisch proportional erhöht, so wie der Druck zunimmt. Andererseits ist erkennbar, daß Biogel A-5m eine Kompaktheit bewirkt und daß sich die Durchflußrate nicht erhöht, wenn der Druck zunimmt.
Erfindungsgemäß, wie im ersten Fall, ist das Gel, wobei die Beziehung zwischen dem Druckabfall ΔP und der Durchflußrate eine lineare Beziehung bis zu 0,3 kg/cm² ist, definiert als ein hartes Gel.

Beispiel 1

Herstellung des Adsorbens:

In einem Reaktionsgefäß wurden 100 ml Cellulosekügelchen CK-A3 (hergestellt von CHISSO CORPORATION, Molekulargewicht an der Ausschlußgrenze für ein globulares Protein = 5 · 10&sup7;), 100 ml Wasser, 50 ml 2 N Natriumhydroxid und 20 ml Epichlorhydrin gemischt und 2 Stunden bei 40ºC umgesetzt, um epoxidierte Cellulosekügelchen CK-A3 zu erhalten. In einem Reaktionsgefäß wurden 100 ml der so erhaltenen epoxidierten Cellulosekügelchen CK-A3, 100 ml Wasser und 10 ml 28%iges Ammoniakwasser gemischt und bei Raumtemperatur über Nacht umgesetzt, um aminierte Cellulosekügelchen CK-A3 zu erhalten.
Andererseits wurden 10 g Poly(natriumstyrolsulfonat) (durchschnittliches Molekulargewicht = 7 · 10&sup4;), 1 ml Thionylchlorid und 250 ml Toluol in einem Reaktionsgefäß gemischt und bei Raumtemperatur 8 Stunden umgesetzt, um teilweise chloriertes Poly- (natriumstyrolsulfonat) zu erhalten.
In einem Reaktionsgefäß wurden 10 g des so erhaltenen chlorierten Poly(natriumstyrolsulfonats), 100 ml der aminierten Cellulosekügelchen CK-A3 und 100 ml Wasser vermischt und bei Raumtemperatur über Nacht umgesetzt, um Poly(natriumstyrolsulfonat)- immobilisierte Cellulosekügelchen CK-A3 zu erhalten. Durch ein Titrationsverfahren wurde bestätigt, daß das Poly(natriumstyrolsulfonat), enthaltend etwa 30 mmol der Sulfonsäuregruppe pro 1 ml Sedimentationsvolumen, immobilisiert war.

Beurteilung des Adsorbens:

Die so erhaltenen Poly(natriumstyrolsulfonat)-immobilisierten Cellulosekügelchen CK-A3 wurden mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Diese Kügelchen (0,5 ml) wurden in ein Teströhrchen eingebracht, und die überschüssige physiologische Salzlösung wurde entfernt. Dazu wurden 3 ml menschliches Serum, enthaltend etwa 20 ng/ml TNF-α, zugegeben und 2 Stunden bei 37ºC geschüttelt. Die Konzentration von TNF-α im Überstand wurde durch ein ELISA-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse der Analyse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Vergleichsbeispiel 1

Cellulosekügelchen CK-A3 wurden mit physiologischer Salzlösung äquilibriert. Diese Kügelchen (0,5 ml) wurden in ein Teströhrchen eingebracht, und die überschüssige physiologische Salzlösung wurde entfernt. Dazu wurden 3 ml menschliches Serum, enthaltend etwa 20 ng/ml TNF-α, zugegeben und 2 Stunden bei 37ºC geschüttelt. Die Konzentration von TNF-α im Überstand wurde durch ein ELISA-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Vergleichsbeispiel 2

Herstellung des Adsorbens:

In einem Reaktionsgefäß wurden 100 ml Cellulosekügelchen CK-A3, 100 ml Wasser, 50 ml 2 N Natriumhydroxid und 20 ml Epichlorhydrin gemischt und 2 Stunden bei 40ºC umgesetzt, um epoxidierte Cellulosekügelchen CK-A3 zu erhalten. 6 g Natriumdextransulfat und 100 ml Wasser (die Konzentration des Natriumdextransulfats betrug etwa 2,5%) wurden zu 100 ml der erhaltenen epoxidierten Cellulosekügelchen CK-A3 zugegeben, das Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 11 eingestellt und 16 Stunden bei 45ºC geschüttelt. Dann wurde das so erhaltene Gel abfiltriert und mit Wasser gewaschen, um mit Natriumdextransulfat immobilisierte Cellulosekügelchen CK-A3 zu erhalten. Durch ein Titrationsverfahren wurde bestätigt, daß das Natriumdextransulfat, enthaltend etwa 30 mmol der Sulfatgruppe pro 1 ml Sedimentationsvolumen, immobilisiert war.

Beurteilung des Adsorbens:

Die so erhaltenen mit Natriumdextransulfat immobilisierten Cellulosekügelchen CK-A3 wurden mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Diese Kügelchen (0,5 ml) wurden in ein Teströhrchen eingebracht, und die überschüssige physiologische Salzlösung wurde entfernt. Dazu wurden 3 ml menschliches Serum, enthaltend etwa 20 ng/ml TNF-α, zugegeben und 2 Stunden bei 37ºC geschüttelt. Die Konzentration von TNF-α im Überstand wurde durch ein ELISA-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse der Analyse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Konzentration von TNF-α im Überstand

Beispiel 1 16 ng/ml
Vergleichsbeispiel 1 21 ng/ml
Vergleichsbeispiel 2 21 ng/ml
In einfacher Weise wurde festgestellt, daß die Konzentration von TNF-α in Beispiel 1 im Vergleich zur derjenigen in Vergleichsbeispiel 1 abnahm und daß TNF-α in einer Körperflüssigkeit unter Verwendung des erfindungsgemäßen Adsorbens wirksam adsorbiert und entfernt werden kann. Im Gegensatz dazu wurde anhand von Vergleichsbeispiel 2 festgestellt, daß TNF-α nicht durch ein Adsorbens adsorbiert werden kann, wobei eine Verbindung mit ausschließlich X-Gruppen, und zwar Natriumdextransulfat, immobilisiert ist, und daß die Gruppe X, die an einen Benzolring gebunden ist, notwendig ist.

Beispiel 2

Eine Säule (hergestellt von BIO-RAD, wobei die Säule einen Innendurchmesser von 10 mm und eine Länge von 100 mm aufwies) wurde mit 2 ml der in Beispiel 1 erhaltenen mit Poly(natriumstyrolsulfonat) immobilisierten Cellulosekügelchen CK-A3 beladen und mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Dann wurden 5,3 ml menschliches Serum, enthaltend etwa 20 ng/ml TNF-α, in einer Durchflußrate von 0,33 ml/min und anschließend 5 ml physiologische Salzlösung in der gleichen Durchflußrate hindurchgeleitet. Während dieses Prozesses wurde der so erhaltene Eluent vom Auslaß der Säule gesammelt, wobei zuerst 16mal 0,33 ml jeder Fraktion gesammelt wurden, anschließend wurde zweimal 1 ml jeder Fraktion gesammelt, und schließlich wurden einmal 3 ml einer Fraktion gesammelt. Die Konzentration von TNF-α in jeder Fraktion wurde durch ein ELISA-Verfahren gemessen, und die Konzentration des Proteins wurde unter Verwendung des BCA-Proteinassay-Reagens (hergestellt von PIERCE) ebenfalls gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.
Die Konzentration von TNF-α oder des Proteins in jeder Fraktion in Fig. 3 ist in Prozent angegeben, wobei die Konzentration von TNF-α oder des Proteins in dem eingespritzten Serum 100 ist.

Vergleichsbeispiel 3

Herstellung des Adsorbens:

In einem Reaktionsgefäß wurden 100 ml CELLULOFINE GC-700 m (hergestellt von CHISSO CORPORATION, Molekulargewicht an der Ausschlußgrenze für ein globuläres Protein = 4 · 10&sup5;), 100 ml Wasser, 50 ml 2 N Natriumhydroxid und 20 ml Epichlorhydrin gemischt und 2 Stunden bei 40ºC umgesetzt, um epoxidiertes CELLULOFINE GC-700 m zu erhalten. 6 g Natriumdextransulfat und 100 ml Wasser (die Konzentration des Natriumdextransulfats betrug etwa 2,5%) wurden zu 100 ml des erhaltenen epoxidierten CELLULOFINE GC-700 m zugegeben, das Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 11 eingestellt und 16 Stunden bei 45ºC geschüttelt. Dann wurde das so erhaltene Gel abfiltriert und mit Wasser gewaschen, um mit Natriumdextransulfat immobilisiertes CELLULOFINE GC-700 m zu erhalten. Durch ein Titrationsverfahren wurde bestätigt, daß das Natriumdextransulfat, enthaltend etwa 30 mmol der Sulfatgruppe pro 1 ml Sedimentationsvolumen, immobilisiert war.

Beurteilung des Adsorbens:

Eine Säule (hergestellt von BIO-RAD) wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 mit 2 ml des erhaltenen mit Natriumdextransulfat immobilisierten CELLULOFINE GC- 700 m beladen und mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Dann wurden 5,3 ml menschliches Serum, enthaltend etwa 20 ng/ml TNF-α, in einer Durchflußrate von 0,33 ml/min und anschließend 5 ml physiologische Salzlösung in der gleichen Durchflußrate hindurchgeleitet. Während dieses Prozesses wurde der so erhaltene Eluent in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 vom Auslaß der Säule gesammelt; und die Konzentration von TNF-α in jeder Fraktion wurde durch ein ELISA-Verfahren gemessen, und die Konzentration des Proteins wurde ebenfalls gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.
Die Konzentration von TNF-α oder des Proteins in jeder Fraktion in Fig. 4 ist in Prozent angegeben, wobei die Konzentration von TNF-α oder des Proteins in dem eingespritzten Serum 100 ist.
Es scheint, daß TNF-α offensichtlich adsorbiert wird, da die erste Elution von TNF-α im Vergleich zu derjenigen des Proteins in Vergleichsbeispiel 3 langsam ist, wie in Fig. 4 gezeigt ist. Es wurde jedoch festgestellt, daß die Konzentration von TNF-α im Eluent beim Hindurchlaufen des Serums diejenige des Proteins im Serum übersteigt und daß beim anschließenden Hindurchleiten von physiologischer Salzlösung mehr TNF-α als Protein eluiert wird. Es ist schließlich erkennbar, daß praktisch die gesamte Menge an TNF-α eluiert wird, wenn das Protein mit TNF-α im Bereich der Grafik verglichen wird.
Und zwar wurde festgestellt, daß TNF-α in Vergleichsbeispiel 3 praktisch nicht adsorbiert wird und daß das Adsorbens hiervon eigentlich nicht verwendet werden kann.
Andererseits wurde festgestellt, daß sich die Konzentration von TNF-α in Fig. 3 im Eluent kaum erhöht und daß TNF-α sicher adsorbiert und entfernt werden kann.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Adsorbens zur Adsorption und Entfernung von TNF-α in einer Körperflüssigkeit kann TNF-α wirksam adsorbiert und entfernt werden, verglichen mit einem herkömmlichen Adsorbens.
Auch kann TNF-α unter Verwendung des erfindungsgemäßen Adsorbers, der mit dem erfindungsgemäßen Adsorbens zur Adsorption und Entfernung von TNF-α in einer Körperflüssigkeit beladen ist, fortlaufend adsorbiert und entfernt werden.

Claims

1. Adsorbens für Tumornekrosefaktor-α, wobei auf einem wasserunlöslichen Träger eine Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I):

immobilisiert ist, X eine Sulfonsäuregruppe ist, A eine Substituentengruppe ist, ausgenommen für die Sulfonsäuregruppe, n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und im Fall, daß n mindestens 2 ist, die Gruppen A, deren Anzahl n ist, gleich sind oder unterschiedlich voneinander sind, wobei die Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I) mindestens zwei funktionelle Gruppen der Formel (I) in einem Molekül hat.

2. Adsorbens nach Anspruch 1, wobei die Verbindung mit mindestens zwei funktionellen Gruppen der Formel (I) in einem Molekül Polystyrolsulfonsäure ist.

3. Adsorbens nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der wasserunlösliche Träger hydrophil ist.

4. Adsorbens nach Anspruch 3, wobei der wasserunlösliche Träger eine Hydroxylgruppe hat.

5. Adsorbens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der wasserunlösliche Träger porös ist.

6. Verfahren zur Adsorption und Entfernung von Tumornekrosefaktor-α umfassend das Inkontaktbringen des Adsorbens nach Anspruch 1 mit einer Körperflüssigkeit, die den Tumornekrosefaktor-α enthält.

7. Adsorber zur Adsorption von Tumornekrosefaktor-α, wobei ein Gefäß mit einem Einlaß und einem Auslaß für eine Körperflüssigkeit, ausgestattet mit einer Vorrichtung, die verhindert, daß das Adsorbens aus dem Gefäß fließt, mit dem Adsorbens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 beladen ist.

8. Verwendung einer Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I):

wobei X eine Sulfonsäuregruppe ist, A eine Substituentengruppe ist, ausgenommen für die Sulfonsäuregruppe, n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und im Fall, daß n mindestens 2 ist, die Gruppen A, deren Anzahl n ist, gleich sind oder sich voneinander unterscheiden, wobei die Verbindung mit einer funktionellen Gruppe der Formel (I) mindestens zwei funktionelle Gruppen der Formel (I) in einem Molekül hat, wobei die Verbindung auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisiert ist, für die Herstellung eines Adsorbens für eine neue und erfinderische Adsorption von Tumornekrosefaktor-α.