DE69620627T2

DE69620627T2 - Polyfluoralkyl-tryptiphan tripeptid thrombin hemmer

Info

Publication number: DE69620627T2
Application number: DE69620627T
Authority: DE
Inventors: Robert James Broersma; Joseph Paul Burkhart; Joy Antony Malikayl; Norton Paul Peet
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-10-02
Filing date: 1996-09-06
Publication date: 2002-10-17
Anticipated expiration: 2016-09-07
Also published as: IL123597A; HUP9901290A3; HUP9901290A2; CA2233698C; EP0863916B1; AU700312B2; ES2171717T3; DE69620627D1; WO1997012904A1; IL123597A0; CN1198748A; CA2233698A1; NO981468L; EP0863916A1; ATE215963T1; AU7015496A; DK0863916T3; TW339335B; HK1015797A1; AR003756A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Antikoagulantien sind nützliche therapeutische Mittel bei der pharmakologischen Behandlung von beispielsweise akuter tiefer Venenthrombose, Lungenembolie, akutem Arterienverschluß der Extremitäten durch Embolie, Herzinfarkt, Hirnschlag, Restenosis und disseminierter intravaskulärer Gerinnung. Die prophylaktische Verabreichung von Gerinnungshemmern kann vermutlich ein Rezidiv der Embolie bei Patienten mit rheumatischen oder arteriosklerotischen Herzkrankheiten verhindern und kann bestimmte thromboembolische Komplikationen in der Chirurgie verhindern. Die Verabreichung von Gerinnungshemmern ist auch bei der Behandlung von Herzgefäß- und Hirngefäßinsuffizienz angezeigt. Eine arterielle Thrombose, insbesondere von Arterien, die zum Herzmuskel und zum Gehirn führen, führt in den meisten Fällen zum Tod.
Ein gebräuchliches Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe von thrombotischen Erkrankungen ist die Hemmung der Thrombinaktivität oder der Thrombinbildung, wodurch die Gerinselbildung verhindert wird. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß das Tripeptid (D)-Phe-Pro-Arg ein katalytischer Thrombinstellenhemmer ist. Darüber hinaus beschreibt das Patent US-A-5391705 polyfluorierte Tripeptide, die sowohl Thrombin als auch Trypsin hemmen. Ähnlich beschreibt die WO 94/25051 Thrombinhemmer, bei denen Arginin durch Aminocyclohexyl-Abschnitte ersetzt ist.
Aus dem Stand der Technik ist jedoch kein Vorschlag ersichtlich, bei dem das Tripeptid seine Antithrombinaktivität beibehält, wenn Tryptophan an der P&sub1;-Position der Enzymerkennungsstelle für Arginin substituiert wird.
Zusätzlich offenbart die GB-A-2287027 das polyfluorierte Tripeptid Phe-Pro-Arg als ein Hemmer für sowohl Thrombin als auch Trypsin.
Von den Anmeldern wurde gefunden, daß wenn Tryptophan für Arginin oder für Derivate von Arginin an der P&sub1;-Position eines bekannten Pentafluorethyl-substituierten Tripeptid substituiert wird, nicht nur die Antithrombinaktivität beobachtet wird, sondern daß auch ein hochselektiver Hemmer für Thrombin gegenüber anderen Proteasen wie z. B. Trypsin erhalten wird. Diese neue Klasse von Verbindungen kann eine nützliche Alternative für eine Zusatztherapie zu bereits bekannten Thrombinhemmern sein, und sie ist nützlich, die Koagulierung von gelagertem Vollblut zu verhindern und die Koagulierung bei anderen biologischen Proben für Testung oder Lagerung zu verhindern.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen der Formeln
oder
worin
A Phenyl oder Cyclohexyl ist;
B ist eine Gruppe der Formel
X ist -CF&sub3;, -CF&sub2;CF&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCH&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCOOR&sub1;, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCONHR&sub1;, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCH&sub2;OR&sub1; oder -CF&sub2;(CH&sub2;)vCH=CH&sub2;;
R ist H oder -CH&sub3;; R&sub1; ist H oder C&sub1;-C&sub6;-Alkyl;
n ist null oder eins; t ist die ganze Zahl 2, 3 oder 4;
v ist die ganze Zahl 1, 2 oder 3;
oder ein Stereoisomeres oder ein Gemisch davon, ein Hydrat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon; und deren Verwendung als Thrombinhemmer, die nützlich sind bei der Behandlung oder Verhütung von Herzkranz- und Hirngefäßerkrankungen, tiefer Venenthrombose, Lungenembolie, Hirnschlag (thrombotisch oder im Ursprung embolisch), Herzinfarkt, instabiler oder hartnäckiger Angina, einer Angioplastik folgender koronarer Thrombose, Restenose, Verhinderung der Roagulierung von Gesamtblut und ähnlichem.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In dieser Erfindung bedeuten:
a) diese Bezeichnung " " eine Bindung, die vorwärts aus der Ebene der Seite heraussteht;
b) die Bezeichnung " " ist eine Bindung, die rückwärts aus der Ebene der Seite heraussteht;
c) die Bezeichnung " " oder die Bezeichnung "(D, L)" bezieht sich auf eine Bindung, für die die Stereochemie nicht bezeichnet ist.
Der Begriff "C&sub1;-C&sub6;-Alkyl" bezieht sich auf einen gesättigten Kohlenwasserstoffrest mit geradkettiger verzweigter oder cyclischer Konfigurierung mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Eingeschlossen in diesem Umfang des Begriffes sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sek-Butyl, Tertiärbutyl, n-Pentyl, n-Hexyl, Cyclohexyl und ähnliche.
Der Begriff "Stereoisomeres" ist ein allgemeiner Begriff für alle Isomeren, die sich nur in der Orientierung ihrer Atome im Raum unterscheiden. Er schließt Spiegelbildisomere (Enantiomere), geometrische Isomere (cis/trans) und Isomere von Verbindungen ein, die mehr als ein chirales Zentrum haben und die nicht Spiegelbilder von einem anderen sind (Diastereoisomere).
Der Begriff "Hydrat" bedeutet, daß das Keton der erfindungsgemäßen Erfindungen als Dihydroxymethylengruppe existieren kann.
Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbares Salz" wird auf ein beliebiges nicht toxisches organisches oder anorganisches Salz einer Verbindung der Formel (I) oder (IA) verwendet. Anorganische Säuren, die geeignete Salze bilden, schließen ein Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefel- und Phosphorsäure sowie saure Metallsalze, wie Natriummonohydrogenorthophosphat und Kaliumhydrogensulfat. Organische Säuren, die geeignete Salze bilden, schließen ein die Mono-, Di- und Tricarbonsäuren ein. Beispiele für solche Säuren sind Essig-, Trifluoressig-, Glycol-, Milch-, Brenztrauben-, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar-, Malein-, Wein-, Citronen-, Ascorbin-, Äpfel-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl-, 2-Phenoxybenzoe- und Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure und 2-Hydroxyethansulfonsäure. Derartige Salze können entweder in der hydratisierten oder im wesentlichen wasserfreien Form existieren.
Die folgenden üblichen Abkürzungen der Aminosäuren und der Amino- und Carboxy-terminalen Gruppen, wie in Tabelle 1 aufgeführt, werden in dieser Beschreibung verwendet:

Tabelle 1

Gly (oder G) - Glycin
Ala (oder A) - Alanin
Val (oder V) - Valin
Leu (oder L) - Leucin
Ile (oder I) - Isoleucin
Pro (oder P) - Prolin
Phe (oder F) - Phenylalanin
Trp (oder W) - Tryptophan
Ser (oder S) - Serin
Met (oder M) - Methionin
Thr (oder T) - Threonin
Cys (oder C) - Cystein
Tyr (oder Y) - Tyrosin
Gln (oder Q) - Glutamin
Asn (oder N) - Asparagin
Asp (oder D) - Aspartinsäure
Glu (oder E) - Glutaminsäure
Lys (oder K) - Lysin
Arg (oder R) - Arginin
His (oder H) - Histidin
Cha - Cyclohexylalanin
Phg - Phenylglycin
Chg - Cyclohexylglycin
Tic - Tetrahydroisochinolin-Carbonsäure
Pip - Pipecolinsäure
Orn - Ornithin
Boc - tert-Butyloxycarbonyl
Bzl - Benzyl
Cbz - Carbobenzyloxy
Ac - Acetyl
Suc - Succinyl
PAM - Phenylacetamidomethyl
Die natürlichen Aminosäuren mit Ausnahme von Glycin enthalten ein chirales Kohlenstoffatom. Wenn nichts anderes speziell angegeben ist, sind die bevorzugten Verbindungen die optisch aktiven Aminosäuren der L-Konfiguration, mit Ausnahme, wie angezeigt, ist es bevorzugt, daß der P&sub3;-Teil für beispielsweise den Phe-, Cha-, Phg- oder Chg-Teil in Formel I in deren D-Konfiguration auftritt.
Betreffs der Verbindungen der Formeln I und IA kann der P&sub1;-α-Aminosäurerest (Tryptophan) in seiner D- oder L-Konfiguration auftreten oder als Gemisch davon, und der P&sub2;-α-Aminosäurerest (Prolin) ist vorzugsweise in seiner L-Konfiguration. In ähnlicher Weise ist der α-Aminosäurrest des P&sub3;-Teiles, (d. h. Phenylalanin, Cyclohexylalanin usw.) vorzugsweise in seiner D-Konfiguration mit den bevorzugten Resten Phe oder Cha und dem am meisten bevorzugten Substituenten Phe. Im Falle der Verbindungen der Formel IA ist der P&sub3;-Teil (Substituent "B") das, was als "TIC"-Derivat oder "TIC-ähnliches" Derivat bezeichnet wird (der Ausdruck "TIC" ist abgeleitet von Tetrahydroisochinolin-Carbonsäure). In solchen Fällen entspricht der dicyclische TIC-Teil, der mit dem P&sub3;-Stickstoffatom und dem P&sub3;- α-Kohlenstoff gebildet wird, den Formeln
worin (2a) und (2b) einen 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolinteil repräsentieren, (2'a) und (2'b) repräsentieren einen 1,2,3,4- Decahydroisochinolinteil, und (2c) und (2'c) repräsentieren 2,3-Dihydro-1H-isoindolyl- und Octahydro-1H-isoindolylteile. Zur Bequemlichkeit werden die Teile nachfolgend auch als "TIC- ähnliche Modifikationen" bezeichnet.
Im allgemeinen können die Verbindungen der Formeln (I) und (IA) unter Verwendung von chemischen Standardreaktionen hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel können Verbindungen der Formel (I), worin X die Bedeutung -CF&sub2;CF&sub3; hat, gemäß Schema A hergestellt werden. Die Ausgangsmaterialien, Reagenzien, Techniken und Verfahrensabläufe, wie sie im Schema A verwendet werden, sind bekannt und sie können von den Fachleuten auf diesem Gebiet beurteilt werden. Schema A
Aus Schema A ist eine allgemeine Synthese zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) zu entnehmen, worin X die Bedeutung -CF&sub2;CF&sub3; hat, A und n haben die zuvor genannte Bedeutung und Tg ist eine N-Schutzgruppe, die eine geeignete Schutzgruppe ist, einschließlich tert-Butyloxycarbonyl (Boc), Carbobenzyloxy (Cbz), tert-Butyldimethylsilyl (TBDMS), tert- Butyldiphenylsilyl (TBDPS) und ähnliche, wobei tert-Butyloxycarbonyl (Boc) bevorzugt ist.
In Schema A, Stufe A, wird der geschützte Aminosäureester 3 in das geschützte Pentafluorethylketon 4 unter Bildung des Nebenproduktes 5 umgewandelt. Beispielsweise wird der geschützte Aminosäureester 3 mit 3 bis 6 molaren Äquivalenten Pentafluorethyllithium umgesetzt, das in situ aus Pentafluormethyliodid und dem Methyllithium/Litiumbromid-Komplex erzeugt werden kann, wie analog von Gassman P. G., O'Reilly N. J., J. Org. Chem. 52, 2481-2490 (1987) offenbart. Diese Reaktion kann bequem in einem geeigneten wasserfreien Lösungsmittel durchgeführt werden, wie Diethylether oder in einem wasserfreien Lösungsmittelgemisch, wie Diethylether/Toluol (9 : 1). Die Reaktion wird bei Temperaturen von -30ºC bis -80ºC durchgeführt, wobei eine Temperatur von -50ºC bis -65ºC bevorzugt ist. Das geschützte Pentafluorethylketon 4 kann aus der Reaktionszone durch Extraktion und Verdampfung isoliert werden, wie dies aus dem Stand der Technik bekannt ist. Das Produkt kann gereinigt werden durch Techniken, die ebenfalls bekannt sind, wie Chromatografie und Umkristallisation.
Alternativ dazu kann das geschützte Pentafluorethylketon 4 durch Umwandlung eines geschützten Hydroxamates analog 3 unter Verwendung einer Reaktion hergestellt werden, wie sie von M. R. Angelastro, J. P. Burkhard, P. Bey, N. P. Peet, Tetrahedron Letters, 33, 3265-3268 (1992) beschrieben wurde.
In Schema A, Stufe B wird der α-Aminoteil des geschützten Pentafluorethylketon 4 entschützt, während die Aminosäuren- Seitenkettenfunktionalität von 4 unter Bedingungen geschützt bleibt, die aus dem Stand der Technik bekannt sind wie von T. H. Green "Protection Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Kapitel 7 (1981) beschrieben, um das α-Amin- geschützte Pentafluorethylketon 6 bereitzustellen. Zum Beispiel kann das Bis-Boc-geschützte Pentafluorethylketon 4 mit einer geeigneten Säure, z. B. Salzsäure, in Gegenwart eines etherischen Lösungsmittels, wie Dioxan und ähnlichen, in Kontakt gebracht werden, um zu dem α-Amin-entschützten Pentafluorethylketon 6 zu gelangen. Das Produkt 6 kann nach bekannten Verfahren isoliert und gereinigt werden.
In Schema A, Stufe c wird das α-Amin-entschützte Pentafluorethylketon 6 mit einer Verbindung der Formel
gekoppelt, worin alle Substituenten die zuvor genannte Bedeutung haben, nach Standardpeptidkopplungstechniken. Zum Beispiel können bei einer üblichen Peptidsynthese die Peptide verlängert werden durch Entschützung des α-Amins des N-terminalen Restes und Ankopplung der nächsten geeigneten N- geschützten Aminosäure über eine Peptidbindung unter Einsatz der beschriebenen Verfahren. Diese Entschützungs- und Kopplungsprozedur wird wiederholt, bis die gewünschte Sequenz erhalten wird. Die Kopplung kann mit den am Aufbau beteiligten Aminosäuren schrittweise durchgeführt werden oder durch Kondensation von Fragmenten oder durch eine Kombination beider Verfahren oder durch Festphasen-Peptidsynthese nach der Methode, die ursprünglich von Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154 beschrieben wurde, wobei diese Offenbarung durch Bezugnahme hier eingeschlossen wird. Wenn die Annäherung über eine Festphasensynthese erfolgt, wird die C-terminale Carbonsäure an einen unlöslichen Träger (üblicherweise Polystyrol) angebracht. Diese unlöslichen Träger bilden eine Bindung, die gegenüber den Verlängerungsbedingungen stabil ist, sich jedoch später leicht abspalten läßt. Beispiele für solche Träger sind: Chlor- oder Brommethylharz, Hydroxymethylharz und Aminomethylharz. Viele dieser Harze sind kommerziell erhältlich, wobei die gewünschten C-terminalen Aminosäuren bereits eingeschlossen sind.
Zusätzlich zu dem zuvor ausgeführten sind Peptitsynthesen beschrieben in Stewart und Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Aufl. Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meierhofer, Udenfriend, Hersg., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol 1, 2, 3, 5 und 9, Academic Press, New York, 1980-1987; Bodanszky, "Peptide Chemistry: A Practical Textbook", Springer-Verlag, New York (1988); und Bodanszky, et al. "The Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, New York (1984), wobei diese Literaturstellen durch Bezugnahme hier eingeschlossen werden.
Die Kopplung zwischen zwei Aminosäuren, einer Aminosäure und einem Peptid oder zwei Peptidfragmenten kann unter Verwendung von Standardkopplungsverfahren durchgeführt werden, wie der Azid-Methode, der Kohlensäure-Carbonsäureanhydrid (Isobutylchlorformiat)-Mischmethode, der Carbodiimid (Dicyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid oder wasserlösliches Carbodümid)-Methode, der Methode mit aktivem Ester (p- Nitrophenylester, N-Hydroxysuccinimidoester), der Woodward- Reagenz K-Methode, der Carbonyldiimidazol-Methode, der Methode mit einem Phosphorreagenz wie BOP-Cl oder Oxydationsreduktionen. Einige dieser Methoden (insbesondere die Carbodiimid- Methode) kann verstärkt werden durch Zugabe von 1-Hydroxybenzotriazol. Diese Kopplungsreaktionen können entweder in Lösung (flüssige Phase) oder als Festphasentechniken durchgeführt werden.
Die funktionellen Gruppen der am Aufbau beteiligten Aminosäuren müssen allgemein während der Kopplungsreaktion geschützt werden, um die Bildung von unerwünschten Bindungen zu vermeiden. Die zu verwendenden Schutzgruppen sind aufgeführt in Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, New York (1981) und "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 3, Academic Press, New York (1981), wobei diese Veröffentlichungen durch Bezugnahme hier eingeschlossen werden.
Die α-Carboxygruppe des C-terminalen Restes wird üblicherweise durch einen Ester geschützt, der abgespalten werden kann, um zu der Carbonsäure zu gelangen. Zu Schutzgruppen, die verwendet werden können, gehören: 1) Alkylester wie Methyl und t-Butyl, 2) Arylester wie Benzyl und substituiertes Benzyl oder 3) Ester, die unter Behandlung mit schwachen Basen oder schwachen Reduktionsmitteln abgespalten werden können, wie Trichlorethyl- und Phenacylester.
Die α-Aminogruppe jeder Aminosäure, die an die wachsende Peptidkette anzukoppeln ist, muß geschützt werden. Es können beliebige Schutzgruppen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden. Zu Beispielen dieser Schutzgruppen gehören: 1) solche vom Acyltyp, wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl und p-Toluolsulfonyl; 2) vom Typ aromatischer Carbamate, wie Benzyloxycarbonyl (Cbz oder Z) und substituierte Benzyloxycarbonyle, 1-(p-Biphenyl)-1-methylethoxycarbonyl und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc); 3) vom Typ aliphatischer Carbamate, wie tert-Butyloxycarbonyl (Boc), Ethoxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl; 4) vom Typ cyclischer Alkylcarbamate, wie Cyclopentyloxycarbonyl und Adamantyloxycarbonyl; 5) vom Alkyltyp, wie Triphenylmethyl und Benzyl; 6) Trialkylsilane wie Trimethylsilan; und 7) vom Thiol enthaltenden Typ, wie Phenylthiocarbonyl und Dithiasuccinoyl. Die bevorzugte α-Aminoschutzgruppe ist entweder Boc, Cbz oder Fmoc, vorzugsweise Boc. Viele Aminosäurederivate die in geeigneter Weise für die Peptidsynthese geschützt sind, sind kommerziell erhältlich.
Die α-Aminogruppenschutzgruppe des neu angefügten Aminosäurerestes wird vor der Kopplung der nächsten Aminosäure abgespalten. Bedingungen für die Abspaltung derartiger Schutzgruppen sind beschrieben in Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", Kapitel 7, John Wiley & Sons, New York (1981). Wenn die Gruppe Boc verwendet wird, sind die Methoden der Wahl Trifluoressigsäure, rein oder in Dichlormethan oder HCl in Dioxan oder Ethylacetat. Das erhaltene Amoniumsalz wird anschließend entweder vor der Kopplung oder in situ mit basischen Lösungen neutralisiert, wie wässrigen Puffern oder tertiären Aminen in Dichlormethan oder Dimethylformamid. Wenn die Gruppe Fmoc verwendet wird, sind die Reagenzien der Wahl Piperidin oder substituiertes Piperidin in Dimethylformamid, jedoch kann ein beliebiges sekundäres Amin oder eine wäßrige basische Lösung verwendet werden. Die Entschützung wird bei einer Temperatur zwischen 0ºC und Raumtemperatur durchgeführt.
Viele der Aminosäuren mit Seitenkettenfunktionalitäten müssen während der Herstellung des Peptids geschützt werden unter Verwendung einer beliebigen der oben beschriebenen Gruppen. Für den Fachmann auf diesem Gebiet ist klar, daß die Auswahl und die Verwendung entsprechender Schutzgruppen für diese Seitenkettenfunktionalitäten von der Aminosäure und von dem Vorhandensein anderer Schutzgruppen in dem Peptid abhängt. Die Auswahl derartiger Schutzgruppen ist wichtig, damit sie nicht während der Entschützung und Kopplung der α-Aminogruppe entfernt werden müssen.
Wenn zum Beispiel Boc als α-Aminoschutzgruppe verwendet wird, kann ein Benzyl (Bn)Ether verwendet werden, um die Hydroxy enthaltenden Seitenketten der Aminosäuren, wie Tyr, Ser oder Thr zu schützen.
Wenn man mit einer Festphasensynthese arbeitet, wird das Peptid von dem Harz üblicherweise gleichzeitig mit der Schutzgruppenentfernung abgespalten. Wenn der Boc-Schutzplan in der Synthese verwendet wird, ist die Behandlung mit wasserfreier HF, die Additive wie Dimethylsulfoxid, Anisol, Thioanisol oder p-Kresol enthält, bei 0ºC die bevorzugte Methode für die Abspaltung des Peptids von dem Harz. Die Abspaltung des Peptids kann auch durch andere saure Reagenzien bewirkt werden, wie Trifluormethansulfonsäure/Trifluoressigsäure-Mischungen. Wenn der Fmoc-Schutzplan verwendet wird, wird die N-terminale Fmoc-Gruppe mit zuvor bereits beschriebenen Reagenzien abgespalten. Die anderen Schutzgruppen und das Peptid werden von dem Harz unter Verwendung einer Lösung von Trifluoressigsäure und verschiedenen Additiven wie Anisol usw. abgespalten.
In Schema A, Stufe c wird ein geeignetes geschütztes Dipeptid der Struktur 6a in einem geeigneten organischen Lösungsmittel unter einer inerten Atmosphäre wie Stickstoff gelöst. Ethylacetat ist das bevorzugte Lösungsmittel für diese Kopplungsreaktion. Die Lösung wird anschließend mit 1 bis 4 Äquivalenten eines geeigneten Amins behandelt. Beispiele für geeignete Amine sind tertiäre organische Amine wie Tri(Niederalkyl)amine, zur Beispiel Triethylamin; oder aromatische Amine wie Picoline, Collidine und Pyridin. Wenn Pyridine, Picoline oder Collidine eingesetzt werden, können sie in hohem Überschuß verwendet werden und wirken daher auch als Reaktionslösungsmittel. Insbesondere geeignet für die Kopplungsreaktion ist N-Methylmorpholin (NMM). Die Lösung wird anschließend auf etwa -20ºC abgekühlt und ein Äquivalent Isobutylchlorformiat wird zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird etwa 10 bis 30 Minuten gerührt, und 1 bis 1,1 Äquivalente des α-Amin-geschützten Pentafluorethylketons 6 wird dem Reaktionsgemisch zugegeben. Das Gemisch wird für 30 Minuten bis 2 Stunden bei etwa -20ºC gerührt, dann läßt man es sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührt für 1 bis 3 Stunden. Das gekoppelte Produkt der Struktur 7 wird anschließend isoliert und nach bekannten Verfahren gereinigt, wie extraktive Techniken und Schnellchromatografie.
Zum Beispiel wird das Reaktionsgemisch mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Methylenchlorid verdünnt, mit Wasser gespült, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wird durch Schnellchromatografie über Silicagel mit einem geeigneten Eluierungsmittel gereinigt, wie Ethylacetat/Hexan, um zu dem gekoppelten Produkt der Struktur 7 zu gelangen.
In Schema A, Stufe d werden die α-Aminschutzgruppe (Pg) und die Schutzgruppe an der P&sub1; Aminosäure-Seitenkettenfunktionalität (Pg) an dem gekoppelten Produkt 7 unter Bedingungen entfernt, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie beschrieben bei Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", Kapitel 7, John Wiley & Sons, New York (1981), um zu dem entschützten Tripeptid 8 zu gelangen. Wenn beispielsweise beide Pg's an dem gekoppelten Produkt 7 ein tert-Butylcarbamat (Boc) sind, wird die Verbindung in Trifluoressigsäure gelöst, für mehrere Minuten gerührt und anschließend unter Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wird dann in Et&sub2;O gelöst und mit Hexan gefällt, um zu dem entschützten Tripeptid 8 zu gelangen.
Methoden für die Entschützung von Tryptophanverbindungen sind aus dem Stand der Technik bekannt, siehe Franzen et al., J. Chem. Soc. 1699-1700 (1984).
In Schema A, Stufe e unterliegt das entschützte Tripeptid 8 einer Decarboxylierungsreaktion, um die Verbindung der Formel (I) zu erhalten. Zum Beispiel wird das entschützte Tripeptid 8 in einem geeigneten chlorierten Kohlenwasserstofflösungsmittel, wie Kohlenstofftetrachlorid, Ethylenchlorid, Methylenchlorid, Chloroform, 1,2,4-Trichlorbenzol oder o-Dichlorbenzol gelöst und für einen Zeitraum, der ausreichend ist, die Decarboxylierung zu vollenden, z. B. von 24 bis 72 Stunden gerührt. Das Produkt (I) kann nach bekannten Verfahren des Standes der Technik isoliert werden.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen, worin X die Bedeutung X' hat, wobei X' die Bedeutung -CF&sub3;, -CF&sub2;CF&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCH&sub3;, CF&sub2;(CH&sub2;)tC(O)NHR, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCH&sub2;OR oder -CF&sub2;(CH&sub2;)vCH=CH&sub2; hat, nach Verfahren hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie in US-A-5391705 (veröffentlicht 21.02.1995) offenbart. Im wesentlichen läuft die Synthese der fluorierten Alkyltripeptide der Formeln (I) und (IA) nach einer modifizierten Dakin-West-Reaktion ab eines 2- Phenyl-5(4H)-oxazolons und der Anhydride oder Säurehalogenide von Trifluoressigsäure, Pentafluorpropionsäure oder Difluorpentansäure (in Abhängigkeit von dem gewünschten X'-Teiles), um die erforderlichen Polyfluoralkylketon-Aminosäurederivate zu erhalten, die Schlüsselzwischenprodukte darstellen. Weitere Reaktionen erlauben dann die Umwandlung dieser Aminosäureanalogen zu den gewünschten Peptiden der Formeln (I) und (IA). Ein allgemeiner Syntheseablauf für die Herstellung der erfindungsgemäßen Erfindungen, worin X die Bedeutung -CF&sub3;, -CF&sub2;CF&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCH&sub3;, CF&sub2;(CH&sub2;)tC(O)NHR, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCH&sub2;OR oder -CF&sub2;(CH&sub2;)vCH=CH&sub2; hat, ist in Schema B aufgeführt. In Schema B sind die Ausgangsmaterialien und Reagenzien, soweit in dieser Anmeldung nichts anderes angegeben ist, bekannt und dem Fachmann auf diesem Gebiet zur Verfügung. Schema B SCHEMA B (Fortsetzung) Schema B (Fortsetzung)
Schema B stellt einen allgemeinen Syntheseablauf zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung dar, wo X' die Bedeutung -CF&sub3;, -CF&sub2;CF&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCH&sub3;, CF&sub2;(CH&sub2;)tC(O)NHR, - CF&sub2;(CH&sub2;)tCH&sub2;OR oder -CF&sub2;(CH&sub2;)vCH=CH&sub2; hat. Alle in Schema B gezeigten Substituenten haben die zuvor genannte Definition, wenn nichts anderes angegeben ist.
In Schema B, Stufe a wird δ-K-Tryptophan 9 nach bekannten Standard-N-Schutztechniken, die dem Fachmann aus dem Stand der Technik geläufig sind, Nageschützt, um zu Nα-R-Nδ-Benzyloxycarbonyltryptophan 10 zu gelangen, worin K eine geeignete Schutzgruppe ist, einschließlich Carbobenzyloxy (Cbz), tert-Butyldimethylsilyl (TBDMS), tert-Butyldiphenylsilyl (TBDPS) und ähnliche, wobei Carbobenzyloxy (Cbz) bevorzugt ist.
Zum Beispiel wird das δ-Cbz-L-Tryptophan 9 unter Verwendung von Benzoylchlorid und Schotten-Baumann-Standardbedingungen Nageschützt. Speziell wird eine Lösung von Benzoylchlorid in einem etherischen Lösungsmittel wie Diethylether gleichzeitig mit Natriumhydroxid zu einer Lösung von δ-Cbz-L- Tryptophan 9 in Natriumhydroxid über einen Zeitraum von etwa 0,5 bis 1 Stunde gegeben, während die Reaktionstemperatur zwischen 0ºC und 5ºC gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird anschließend für etwa 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, mit einem etherischen Lösungsmittel wie Diethylether extrahiert und auf etwa einen pH-Wert von 1 gesäuert unter Verwendung konzentrierter Salzsäure. Zusätzliches Wasser wird anschließend hinzugegeben und das Gemisch für ungefähr 48 Stunden stehengelassen. Die Feststoffe werden gesammelt und nach bekannten Verfahren des Standes der Technik gereinigt, um zu Nα-Benzoyl-Nδ-benzyloxycarbonyltrypthophan 10 zu gelangen.
In Schema B, Stufe b wird Nα-Benzoyl-Nδ-benzyloxycarbonyltrypthophan 10 cyclisiert, um zu 2-Phenyl-5-(4H)-oxazolon 11 zu gelangen.
Beispielsweise wird eine Trübe von Nα-Benzoyl-Nδ-benzyloxycarbonyltrypthophan 10 in einem geeigneten organischem Lösungsmittel wie Methylenchlorid mit etwa 0,1 bis 1,0 molaren Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid in Kontakt gebracht. Das Reaktionsgemisch wird anschließend für etwa 2 bis 5 Stunden gerührt, und das erhaltene ausgefällte Dicyclohexylharnstoff- Nebenprodukt wird abfiltriert und mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Methylenchlord gewaschen. Das Filtrat wird anschließend konzentriert und mit einem geeigneten etherischen Lösungsmittel verdünnt wie Diethylether, und das Verfahren wird gegebenenfalls wiederholt. Das cyclisierte Produkt 2-Phenyl-5-(4H)-oxazolon 11 wird anschließend isoliert und nach Verfahren gereinigt, die für den Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie Fällung und Kristallisation.
In Schema B, Stufe c wird das 2-Phenyl-5-(4H)-oxazolon 11 acycliert nach entsprechenden Acyclierungs-Standardverfahren, um zu der entsprechenden O-Acylverbindung der Struktur 12 zu gelangen.
Zum Beispiel wird ein geeignetes tertiäres Amin wie Triethylamin zu einer Lösung von 2-Phenyl-5-(4H)-oxazolon 11 in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran oder Tetrahydrofuran/Heptan-Gemischen bei einer Temperatur im Bereich von etwa -10ºC bis etwa 10ºC unter Inertatmosphäre, vorzugsweise Stickstoff, gegeben. Eine Lösung von einem geeigneten Acylhalogenid oder dem entsprechenden geeigneten Anhydrid, wie α,α-Difluorpentenoylchlorid, Trifluoressigsäureanhydrid, Pentafluorpropionsäureanhydrid und ähnlichen, in einem geeigneten Lösungsmittel wie Heptan wird langsam zu dem Reaktionsgemisch gegeben, während die Reaktionstemperatur zwischen etwa -10ºC und 10ºC gehalten wird. Nach etwa 30 bis 60 Minuten läßt man das Reaktionsgemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührt für etwa weitere 30 Minuten. Das Triethylaminhydrochloridsalz wird durch aus dem Stand der Technik bekannte Extraktionsverfahren wie Filtration entfernt, und das Filtrat wird aufkonzentriert, um zu der entsprechenden O-Acylverbindung der Struktur 12 zu gelangen.
In Schema B, Stufe d wird die entsprechende O-Acylverbindung der Struktur 12 gegebenenfalls mit einem Acylierungskatalysator umgesetzt, um zu der entsprechenden C-Acylverbindung der Struktur 13 zu gelangen.
Beispielsweise wird die entsprechende O-Acylverbindung der Struktur 12 in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran gelöst und mit einem Acylierungskatalysator, wie Dialkylaminopyridin, vorzugsweise 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) in Kontakt gebracht. Das Reaktionsgemisch wird anschließend für etwa 2 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um die C-Acylverbindung der Struktur 13 herzustellen, die ohne weitere Isolierung oder Reinigung verwendet wird.
In Schema B, Stufe e wird die C-Acylverbindung der Struktur 13 mit einem Decarboxylierungsmittel, wie Oxalsäure, Bernsteinsäure und ähnlichen decarboxyliert, wobei Oxalsäure bevorzugt ist, um die gewünschten decarboxylierten fluorierten Verbindungen der Struktur 14 als Gemische der Ketone und deren hydratisierten Formen herzustellen.
Zum Beispiel wird eine Lösung, die 1 bis 5 molare Äquivalente trockener Oxalsäure in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran enthält, dem Reaktionsgemisch von Schema B, Stufe d zugegeben, das die C-Acylverbindung der Struktur 13 enthält, und wird 16 bis 32 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend aufkonzentiert und mit einer geeigneten Säure wie Salzsäure behandelt und mit Ethylacetat extrahiert. Die Schichten werden getrennt und die organische Schicht wird mit einer geeigneten Base, wie Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat oder Natriumhydroxid gewaschen, gegebenenfalls mit Salzlösung gewaschen, mit einem geeigneten Trocknungsmittel wie Magnesiumsulfat getrocknet und aufkonzentriert. Das decarboxylierte Produkt 14 wird anschließend isoliert und nach dem für den Fachmann aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, wie Fällung und Kristallisation gereinigt.
In Schema B, Stufe f wird das decarboxylierte, fluorierte Produkt der Struktur 14 mit einem geeigneten Reduktionsmittel behandelt, um den Alkohol der Struktur 15 zu ergeben.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß diese Reduktion zu einem Derivat führt, das ein Gemisch von Stereoisomeren ist.
Geeignete Reduktionsmittel sind aus dem Stand der Technik bekannt, und dazu gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Lithiumtri-t-butyloxyaluminohydrid, Kaliumborhydrid, Lithiumtri-sek-butylborhydrid, Lithiumborhydrid, Natriumborhydrid und Lithiumtriethylborhydrid, wobei Natriumborhydrid bevorzugt ist.
Zum Beispiel wird das decarboxylierte, fluorierte Produkt der Struktur 14 mit einem molaren Überschuß eines geeigneten Reduktionsmittels in Kontakt gebracht. Die Reaktion wird in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel für Hydridreduktionen sind aus dem Stand der Technik bekannt, wie Toluol, Diethylether, Methyl-t-butylether, Tetrahydrofuran (THF) und Tetrahydrofuran/Ethanol-Gemische. Die Reaktion wird bei einer Temperatur im Bereich von -78ºC bis etwa 10ºC durchgeführt. Das reduzierte Produkt, der Alkohol der Struktur 15, kann aus der Reaktionszone durch Extraktion isoliert werden und anschließend nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden, wie Chromatografie und Umkristallisation.
In Schema B, Stufe g wird der Alkohol der Struktur 15 mit einem geeigneten Entschützungsmittel in Kontakt gebracht, wie konzentrierter Salzsäure, und auf etwa 100 bis 110ºC erhitzt, um den entschützten Alkohol der Struktur 16 zu erhalten.
Zum Beispiel wird eine Lösung des Alkohols der Struktur 15 in 6 N wäßriger Salzsäure auf Rückflußtemperatur erhitzt (etwa 110ºC) für etwa 15 bis 20 Stunden. Das Reaktionsgemisch wird anschließend abgekühlt, und die Benzoesäurekristalle werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird mit Diethylether extrahiert und die Schichten getrennt. Die wäßrige Schicht wird mit Aktivkohle behandelt und erhitzt. Sie wird anschließend filtriert, aufkonzentriert und getrocknet, um zu dem entschützten Alkoholprodukt der Struktur 16 zu gelangen.
In dem speziellen Fall, wo es gewünscht ist, Verbindungen herzustellen, worin X die Bedeutung -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub2;CH&sub3; hat, würden die zur Herstellung der Verbindungen der Struktur 12 verwendeten Säureanhydrid- oder Acylhalogenid-Reaktionsteilnehmer den Teil -CF&sub2;CH&sub2;CH=CH&sub2; tragen. Dementsprechend würde der Alkohol der Struktur 15 ebenfalls den Teil -CF&sub2;CH&sub2;CH=CH&sub2; tragen, der mit einem Alkylen-reduzierenden Mittel vor der Entschützung in Kontakt gebracht werden kann, um zu dem entschützten Alkohol der Struktur 16 zu gelangen. Ein entsprechendes Alkylen-Reduktionsmittel schließt Diboran, Diisoalkylboran, Boran/tertiäre Aminkomplexe und Wasserstoff in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators ein. Das bevorzugteste Alkylen-Reduktionsmittel ist Wasserstoff in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators. Zu Beispielen von Hydrierungskatalysatoren gehören Platin, Palladium, Rhodium, Ruthenium und Nickel. Sowohl die Metalle als fein verteilte disperse Feststoffe oder adsorbiert an inerten Trägern, wie Kohlenstoff oder Aluminiumoxid, als auch bestimmte lösliche Komplexe dieser Metalle zeigen katalytische Aktivität.
Zum Beispiel wird der Alkohol der Struktur 15, worin X die Bedeutung -CF&sub2;CH&sub2;CH=CH&sub2; hat, in einem geeigneten Alkohol wie Isopropanol gelöst und in einer geeigneten Säure wie Salzsäure. Die Lösung wird anschließend mit einem Alkylen-Reduktionsmittel wie Palladiumdihydroxid, adsorbiert an einem inerten Rohlenstoffträger, behandelt und unter Zufuhr von Wasserstoffgas (40 bis 60 psi) für etwa 20 bis 30 Stunden geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und aufkonzentriert, um zu einem Nα-Benzoyl-difluoralkohol-Hydrochlorid zu gelangen. Das Nα-Benzoyl-difluoralkohol-Hydrochlorid wird anschließend mit einem entsprechenden Entschützungsmittel wie Salzsäure in Kontakt gebracht und auf Rückflußtemperatur erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert, und das Filtrat wird mit Diethylether extrahiert und die Schichten getrennt. Die wäßrige Schicht wird mit Aktivkohle behandelt, erhitzt, filtriert und aufkonzentriert, um zu dem entsprechenden geschützten Alkohol der Struktur 16 zu gelangen.
In dem speziellen Fall, wo X die Bedeutung -CF&sub2;(CH&sub2;)tCH&sub3; hat, wobei t die ganzen Zahlen 3 oder 4 darstellt, werden die entsprechenden Olefine (z. B. -CF&sub2;CH&sub2;CH=CH-CH&sub3; oder -CF&sub2;CH&sub2;CH=CHCH&sub2;CH&sub3;) reduziert. Für die Herstellung dieses letztgenannten Olefintyps können die Ausgangshalogenide oder Anhydride nach Methoden hergestellt werden, die von R. W. Lang et al., Tetrahedron Letters, 29, 3291 (1988) beschrieben wurden.
In Schema B, Stufe h wird der entsprechende entschützte Alkohol der Struktur 16 mit einer Verbindung 6a nach Standardpeptidkopplungstechniken gekoppelt wie in Schema A, Stufe c oben, um zu dem Tripeptidalkohol der Struktur 17 zu gelangen.
In Schema B, Stufe i wird der Tripeptidalkohol der Struktur 17 mit einem entsprechenden Oxidationsmittel behandelt, um zu dem N-terminalen geschützten Tripeptid der Struktur 18 zu gelangen.
Zum Beispiel wird ein entsprechender Tripeptidalkohol der Struktur 17 mit einem entsprechenden Oxidatiensmittel, wie dem Dess-Martin-Periodinan, einem Chromiumanhydrid-Pyridinkomplex, Pyridiniumdichromat oder einem Dimethylsulfoxidkomplex, wie DMSO-(COCl)&sub2; (Swern-Bedingungen) umgesetzt, um zu dem N-terminalen geschützten Tripeptid der Struktur 18 unter Verwendung von Standardoxidationstechniken, die dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt sind, zu gelangen. Zu Standardoxidationstechniken gehören Verfahren, wie das Swern-Oxidationsverfahren Synthesis, 165 (1981); Verwendung von Dess-Martin-Periodinan, Dess Martin, J. Org. Chem. 48, 4155 (1983); und das Jones-Oxidationsverfahren (siehe US-A-5391705); wobei das Swern-Oxidationsverfahren am bevorzugtesten ist. Zum Beispiel werden etwa 1,5 Äquivalente Oxalylchlorid in einem geeigneten wasserfreien organischem Lösungsmittel wie Methylenchlorid gelöst und auf eine Temperatur von etwa -55ºC bis etwa -78ºC abgekühlt. Zu dieser Lösung werden etwa 3 bis etwa 8 Äquivalente Methylsulfoxid tropfenweise zugegeben, wobei die Temperatur bei etwa -55ºC oder darunter gehalten wird. Ein Äquivalent des Tripeptidalkohols der Struktur 17 wird in einer geeigneten Menge eines wasserfreien organischen Lösungsmittels wie Methylenchlorid gelöst und langsam unter Rühren dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Nachdem die Zugabe beendet ist, wird das Reaktionsgemisch etwa 30 Minuten bei einer Temperatur von etwa -55ºC bis etwa -78ºC gerührt, und ein Überschuß einer geeigneten organischen Base wie Triethylamin oder N-Methylmorpholin wird zugegeben, und man läßt das Reaktionsgemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen. Das oxidierte Produkt, das N- terminale geschützte Tripeptid der Struktur 18, wird anschließend isoliert und nach für den Fachmann aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt, wie Extraktionstechniken, Fällung, Kristallisation und Chromatografie.
In Schema B, Stufe j wird das N-terminale geschützte Tripeptid der Struktur 18 entschützt nach Verfahren, die in Schema B, Stufe g angegeben sind, um zu der gewünschten Verbindung der Formel (I) zu gelangen. In dem speziellen Fall, wo X die Bedeutung -CF&sub2;(CH&sub2;)tCOOR&sub1; hat, kann das Verfahren zur Herstellung der notwendigen Zwischenprodukte (entsprechend den Verbindungen der Struktur 16, jedoch wobei der gewünschte X- Teil -CF&sub2;(CH&sub2;)tCOOR&sub1; ist) nach den Reaktionen von Schema C durchgeführt werden. SCHEMA C
Das Zwischenprodukt 19 wurde offenbart von D. Ranganathan et al., J. Chem. Res. Synop., 3, 78 (1983) an D. Ranganathan et al., J. Org. Chem. 45, 1185 (1980). Das Reaktionsmittel 20 kann hergestellt werden durch Reaktion von Bromdifluorethylacetat [siehe R. H. Abeles und C. P. Govardham, Archives of Biochemistry and Biophysics, 280, 137 (1990)] mit dem geeigneten Aldehyd unter Reformatsky-Bedingungen zu den entsprechenden Difluoralkoholen. Der Difluoralkohol 20 und das Zwischenprodukt der Struktur 19 wird anschließend mit Kaliumcarbonat in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran nach für den Fachmann aus dem Stand der Technik bekannten Bedingungen kondensiert, um das Nitroalkohol-Zwischenprodukt der Struktur 21 zu bilden. Das Nitroalkohol-Zwischenprodukt der Struktur 21 wird anschließend durch katalytische Hydrierung reduziert, um das Zwischenprodukt der Struktur 22 zu erhalten. Das Zwischenprodukt der Struktur 22, das in der Struktur 16 inkorporiert ist, wird anschließend wie in Schema B, Stufen h, i und j beschrieben behandelt, um zu der gewünschten Verbindung der Formel (I) zu gelangen, worin X die Bedeutung -CF&sub2;(CH&sub2;)tCOOR&sub1; hat.
Alternativ dazu können die Mesylierungs-, Eliminierungs- und Hydrierungsreaktionen mit den Verbindungen der Strukturen 19 und 20 nach bekannten Standardverfahren bewirkt werden, wie beschrieben von Sham et al., Biochem. an Biophys. Res. Co mm. 175, 914 (1991) und US-A-5391705, um zu dem Zwischenprodukt der Struktur 22 zu kommen.
Das α,α-Difluorpentenoylchlorid-Zwischenprodukt 12a, das für die Herstellung der O-Acylverbindung der Struktur 12 erforderlich ist, wenn X die Bedeutung -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub2;CH&sub3; hat, kann wie erläutert im Patent US-A-5391705 erhalten werden und ist in Schema D dargestellt. Die Reagenzien, Ausgangsmaterialien und Techniken, die bei diesem Verfahren verwendet werden, sind für den Fachmann auf diesem Gebiet leicht erhältlich. SCHEMA D
In Schema D, Stufe a wird 2,2-Difluor-4-pentensäure 12c durch Hydrolyse von Ethyl-α,α-difluorpentenoat 12b (US-A- 5391705, veröffentlicht 21. Februar 1995) durch Techniken und Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie basische Hydrolyse, hergestellt.
Zum Beispiel werden etwa 1,0 bis 1,5 molare Äquivalente einer geeigneten Base wie Lithiumhydroxid zu einer Lösung von Ethyl-α,α-difluorpentenoat 12b, das auch als Ethyl-2,2-difluor-4-pentenoat (US-A-4847401, veröffentlicht 11. Juli 1989) bekannt ist, in Wasser bei einer Temperatur von etwa -10ºC bis etwa 10ºC zugegeben. Das Reaktionsgemisch läßt man sich auf Raumtemperatur erwärmen in einem Zeitraum von etwa 2 bis 4 Stunden. Anschließend wird es auf etwa 40ºC bis etwa 55ºC für weitere 2 bis 4 Stunden erwärmt. Ethanol und Wasser werden aus dem Reaktionsgemisch entfernt, und 2,2-Difluor-4-pentensäure 12c kann aus der Reaktionszone durch Extraktion isoliert werden und anschließend nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden. In Schema D, Stufe b wird 2,2- Difluor-4-pentensäure 12c mit einem geeigneten Chlorierungsmittel in Kontakt gebracht, um 2,2-Difluor-4-pentenoylchlorid 12a zu erhalten.
Ein geeignetes Chlorierungsmittel ist eines, das eine Hydroxygruppe in eine Chlorgruppe umwandelt und keinen Abbau des Ausgangsmaterials oder des Produktes hervorruft. Zu geeigneten Chlorierungsmitteln gehören Phosphortrichlorid, Thionylchlorid, Oxalylchlorid und ähnliche.
Zum Beispiel wird 2,2-Difluor-4-pentensäure 12c mit etwa 1,0 bis 1,5 molaren Äquivalenten eines geeigneten Chlorierungsmitteln in Kontakt gebracht. Die Reaktion wird in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt, wie Dichlormethan, Toluol oder Dimethylformamid. Die Reaktion wird bei einer Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 35ºC durchgeführt und braucht allgemein etwa 4 bis 24 Stunden. Das Produkt, 2,2- Difluor-4-pentenoylchlorid 12a kann durch fraktionierte Destillation isoliert werden und nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden, wie Chromatographie.
Für die Herstellung von Verbindungen der Formel (IA), worin X die Bedeutung -CF&sub2;CF&sub3; hat und alle restlichen Substituenten die zuvor genannte Bedeutung haben, kann das Schema E verwendet werden. SCHEMA E
Schema E zeigt einen allgemeinen Syntheseablauf für die Herstellung von Verbindungen der Formel (IA), worin X die Bedeutung -CF&sub2;CF&sub3; hat und alle restlichen Substituenten die vorgenannte Bedeutung haben.
In Schema E, Stufe a wird das α-Amin-entschützte Pentafluorethylketon 6, hergestellt in Schema A, mit Pg-T-C(O)Pro- OH gekoppelt, worin T ein TIC-ähnlicher Teil ist, wie oben definiert und abgebildet als (2a), (2b), (2c), (2'a), (2'b) und (2'c), um das gekoppelte Produkt 23 zu bilden. Die TIC- ähnlichen Teile sind offenbart in US-A-5391705, veröffentlicht 21. Februar 1995 und von Shuman et al., J. Med. Chem. 36, 314- 319 (1993), wobei das Patent und die Literaturstelle hier einbezogen werden. Die Kopplungsreaktion wird in einer Weise durchgeführt, die direkt analog dem Verfahren ist, das zuvor in Schema A, Stufe c beschrieben wurde.
In Schema E, Stufe b wird das gekoppelte Produkt 23 entschützt oder von der Festphase abgespalten unter Bedingungen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie zuvor in Schema A, Stufe b und e beschrieben, um zu einem Tripeptid der Formel (IA) zu gelangen.
Für die Herstellung von Verbindungen der Formel (IA), worin alle Substituenten die zuvor genannte Bedeutung haben, kann Schema F verwendet werden. SCHEMA F
Schema F stellt die Herstellung von Verbindungen der Formel (IA) dar, worin alle Substituenten die zuvor genannt Bedeutung haben.
Im Schema F, Stufe a wird der α-Amin-entschützte Alkohol 16, der im Schema B hergestellt wurde, mit Pg-T-C(O)Pro-OH gekoppelt, wobei T ein TIC-ähnlicher Teil ist, wie oben definiert und abgebildet als (2a), (2b), (2c), (2'a), (2'b) und (2'c), um das gekoppelte Produkt 24 zu bilden. Die Kopplungsreaktion wird in einer Weise durchgeführt, die direkt analog zu den zuvor in Schema A, Stufe c beschriebenen Verfahren ist.
In Schema F, Stufe b wird das gekoppelte Produkt 24 nach Verfahren oxidiert, wie sie in Schema D, Stufe i dargestellt sind, um zu dem N-geschützten Tripeptid der Struktur 25 zu gelangen.
In Schema F, Stufe c wird das N-geschützte Tripeptid der Struktur 25 nach Verfahren entschützt, wie sie in Schema 8, Stufe j dargestellt sind, um zu der gewünschten Verbindung der Formel (IA) zu gelangen.
Die N-methylierten α-Aminosäuren können hergestellt werden, wie im Schema G beschrieben und allgemein bei Pitzele, B. S. et al. in J. Med. Chem. 37, 888-896 (1994) beschrieben, die hier unter Bezugnahme eingeschlossen werden. Alle Substituenten haben die zuvor genannte Bedeutung, wenn zuvor nichts anderes angegeben ist. Die Reagenzien und Ausgangsmaterialien sind für den Fachmann auf diesem Gebiet leicht erhältlich. Schema G
Im Schema G, Stufe a wird eine α-Aminosäure der Struktur 26, worin W eine geeignete α-Carboxy-Schutzgruppe ist wie ein Methylester oder ein Festphasenharz; mit Pg in einer Weise gekoppelt, wie analog zu den in Schema A, Stufe c beschriebenen Verfahren, um zu dem gekoppelten Produkt zu gelangen.
In Schema G, Stufe b wird das gekoppelte Produkt entschützt oder von der Festphase abgespalten unter Bedingungen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, um zu der Säure der Struktur 27 zu gelangen. Zum Beispiel wird, wenn W eine Methyl- oder Ethylgruppe der Struktur 26 ist, die Verbindung in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Ethanol gelöst und mit annähernd dem gleichen Volumen Wasser behandelt. Zu dieser Lösung werden unter Rühren 1 bis 2 Äquivalente Lithiumhydroxid zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird für 1 bis 6 Stunden gerührt. Die erhaltene Säure wird anschließend isoliert und nach bekannten Verfahren gereinigt. Zum Beispiel wird das organische Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, und die verbleibende wäßrige Lösung wird mit verdünnter Salzsäure angesäuert. Die wäßrige Phase wird anschließend mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte werden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand kann dann durch Schnellchromatographie über Silicagel mit einem geeigneten Eluierungsmittel wie Methanol/Chloroform gereinigt werden, um zu der Säure der Struktur 27 zu gelangen.
In Schema G, Stufe c wird die Säure 27 N-methyliert, um zu der N-geschützten N-methylierten Verbindung der Struktur 28 zu kommen. Zum Beispiel wird die Säure 27 in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran gelöst, auf etwa 0ºC abgekühlt und mit überschüssigem Methyliodid behandelt. Dann werden 1 bis 3 Äquivalente Natriumhydrid zu der Lösung zugegeben, die für etwa 10 Minuten bei 0ºC gerührt wird und dann auf Raumtemperatur erwärmt und für 24 bis 48 Stunden gerührt wird. Das Produkt wird anschließend isoliert nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, wie Extraktionsmethoden. Zum Beispiel wird verdünnte wäßrige Salzsäure zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte werden dann vereinigt, mit 5% Natriumthiosulfat, und Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, über ein Kissen aus Silicagel filtriert und unter Vakuum aufkonzentriert, um zu der N-geschützten, N- methylierten Verbindung 28 zu gelangen.
Alternativ dazu kann die N-geschützte, N-methylierte Verbindung 28 nach der Verfahrensweise hergestellt werden, wie sie in Schema E, Stufen d und e beschrieben sind, ausgehend von der Säure der Struktur 27.
In Schema G, Stufe d wird die Säure 27 cyclisiert, um das von der Struktur 27a beschriebene Oxazolidin bereitzustellen. Zum Beispiel wird die Säure 27 in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Benzol gelöst und mit einem Überschuß an Paraformaldehyd behandelt. Dazu werden etwa 0,2 bis 0,4 Äquivalente p-Toluolsulfonsäure gegeben, und das Reaktionsgemisch wird am Rückfluß für etwa 23 Stunden erhitzt mit kontinuierlicher Entfernung von Wasser unter Verwendung einer Dean-Stark- Falle. Das Reaktionsgemisch läßt man anschließend auf Raumtemperatur abkühlen, und das Produkt wird isoliert und gereinigt nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren. Zum Beispiel wird das gekühlte Reaktionsgemisch unter Vakuum aufkonzentriert, der Rückstand in einem geeigneten organischem Lösungsmittel wie Ethylacetat aufgenommen, mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat gespült, die organische Phase über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wird dann durch Schnellchromatographie über Silicagel mit einem geeigneten Eluierungsmittel wie Ethylacetat/Hexan gereinigt, um zu dem Oxazolidin 27a zu gelangen.
In Schema G, Stufe e wird das Oxazolidin 27a unter Bedingungen reduziert, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, um zu der N-geschützten, N-methylierten Verbindung 28 zu gelangen. Zum Beispiel wird das Oxazolidin 27a in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Chloroform gelöst und mit überschüssiger Trifluoressigsäure behandelt. Zu der Lösung wird ein Überschuß an Triethylsilan unter Rühren bei Raumtemperatur gegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 1 bis 7 Tage gerührt und anschließend unter Vakuum aufkonzentriert, um die N-geschützte, N-methylierte Verbindung 28 zu erhalten.
Die folgenden Beispiele zeigen typische Synthesen, wie sie in den Schemata A bis G beschrieben sind. Diese Beispiele dienen nur zur Erläuterung und sind nicht dafür gegeben, den Schutzumfang der vorliegenden Verbindung in irgend einer Weise einzuschränken. Die NMR-Spektren wurden bei 75 MHz für ¹³C aufgezeichnet, 282 MHz für ¹&sup9;F und 300 MHz für ¹H; das ¹&sup9;F-NMR- Signal wird in ppm aus CFCl&sub3; angegeben. MS- und HRMS-Daten wurden bei 70 eV aufgezeichnet unter Verwendung einer computerisierten Höchstwertangleichung mit Perfluorkerosin als HRMS- Referenz. Die TLC-Analysen wurden mit Merck DC-F&sub2;&sub5;&sub4; oder Analtech GHLS-Silicagelplatten durchgeführt unter Visualisierung durch Alkalipermanganat und UV-Strahlung. Die Schnellchromatografie wurde mit Merck Silicagel 60 (0,040 bis 0,063 mm) durchgeführt. CF&sub3;CF&sub2;Li wurde wie von Gassmann & O'Reilly, J. Org. Chem. 52, 2481-2490 (1987) beschrieben erzeugt unter Verwendung von CF&sub3;CF&sub2;I, erhalten von Richmond Chemical Company. Die Entschützung der Tryptophanverbindungen arbeitete mit Verfahren, analog denen, die zuvor von Franzen et al. J. Chem. Soc. 1699-1700 (1984) beschrieben wurde.
Die folgenden hier verwendeten Begriffe haben die angegebene Bedeutung: "g" sind Gramm; "mmol" sind Millimol; "ml" sind Milliliter; "bp" ist der Siedepunkt; "mp" ist der Schmelzpunkt; "ºC" sind Grad Celsius; "mm Hg" sind Millimeter Quecksilbersäule; "ul" sind Mikroliter; "ug" sind Mikrogramm; und "uM" sind Mikromol. Beispiel 1 Herstellung von 1H-Indol-1-carbonsäure, 3-[2-[[(1,1-dimethylenoxy)carbonyl]amino-4,4,5,5,5-pentafluor-3-oxopentyl]-, 1,1- dimethylethylester, (S)-, (C); und Carbaminsäure, [3,3,4,4,4- pentafluor-1-(1H-indol-3-ylmethl)-2-oxobutyl]-, 1,1-dimethylethylester, (S)-, (D).
Schema A, Stufe a; zu einer gerührten Lösung von Boc- Trp(Boc)-OCH&sub3; (Franzen et al., J. Chem. Soc. 1699-1700 (1984) (7,15 g, 17,08 mmol) in wasserfreiem Et&sub2;O (60 ml) unter Stickstoffatmosphäre und gekühlt auf -60ºC (Innenthermometer) wird kondensiertes CF&sub3;CF&sub2;I (6,85 ml, 58,09 mmol) gegeben. Es wird MeLi·LiBr (37,6 ml einer 1,5 M Lösung im Et&sub2;O, 56,36 mmol) mit einer Geschwindigkeit zugegeben, so daß die innere Reaktionstemperatur zwischen -52ºC und -62ºC gehalten wird. Nach Beendigung der Zugabe wird das Reaktionsgemisch bei -55ºC bis -60ºC für eine Stunde gerührt. Durch Zugabe von Isopropanol (4,31 ml, 56,3 mmol) mit einer Geschwindigkeit, daß die innere Reaktionstemperatur weniger als -55ºC beträgt, wird die Reaktionsmischung abgeschreckt. Man läßt das Reaktionsgemisch sich auf -35ºC erwärmen und gießt es in 10% KHSO&sub4; (100 ml). Die Schichten werden getrennt, die organische Schicht mit 10% wäßriger KHSO&sub4; (50 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration und Aufkonzentrierung erhält man die Rohprodukte C und D. Nach Schnellchromatographie (7,5 · 19 cm Silicagelsäule) unter Eluierung bei einem Gradienten (15 bis 25%) von EtOAC in Hexan erhält man die Verbindung C (5,43 g, 63%) als einen gelben Schaum und die Verbindung D (1,50 g, 22%) als einen fahlgelben Feststoff.
Für Verbindung C:
TLC Rf 0,37 (25 : 75 EtOAc : Hexan); ¹H-NMR (CDCl&sub3;, 3 Tage, nur Keton, Haupt-Rotamer) δ 8,14 (br d, 1H, J = 7,9 Hz, H&sub7;), 7,50 (ddd, 1H, J = 0,8, 1,1, 7,8 Hz, H&sub4;), 7,42 (br s, 1H, H&sub2;), 7,35 (ddd, J = 1,3, 7,4, 8,4 Hz, H&sub6;), 7,27 (dt, J = 1.0, 7.8 Hz, H&sub5;), 5,15-5,05 (m, 1H, CH), 4,99 (br d, 1H, J = 7,6 Hz, NH), 3,36 (dd, 1H, 4,7, 15,0 Hz, 1/2 CH&sub2;), 3,04 (dd, 1H, J = 7,5, 15,0 Hz, 1/2 CH&sub2;), 1,67 (s, 9H, Nin-BOC), 1,38 (s, 9H, BOC); ¹&sup9;F-NMR (CDCl&sub3;, 3 Tage, nur Keton, 1 Haupt-Rotamer) δ -82.06 (s, CF&sub3;), - 120,85 und -122,48 (pr d, J = 297 Hz, CF&sub2;); MS (CI, NH&sub3;) m/z (relative Intensität) 524 (100, M + NH&sub4;&spplus;), 507 (3, M+), 468 (30), 412 (17), 230 (32), 130 (54).
Analyse. (C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub7;F&sub5;N&sub2;O&sub3;·0,34 H&sub2;O) C,H,N.
Für Verbindung D:
mp = 135-141ºC; TLC Rf 0,15 (25 : 75 EtOAc : Hexan) ¹H-NMR (DMSO-d&sub6; + D&sub2;O, nur Hydrat-Spezies vorhanden) δ 7,44-7,50 (m, 1H), 7,32-7,26 (m, 1H), 7,06-6,90 (m 3H), 4,15-4,08 (m, 0,3H, CH des Rotameren A), 3,98-3,91 (m, 0,7H, CH des Rotameren B), 3,16 (dd, 0,3H, J = 1,8, 14,2 Hz, 1/2 CH&sub2; des Rotameren A), 3,12 (dd, 0,7H, J = 1,6, 14,5 Hz, 1/2 CH&sub2; des Rotameren B), 2,75 (dd, 0.7H, J = 11,7, 14,6 Hz, 1/2 CH&sub2; des Rotameren B), 2,58 (dd, 0,3H, J = 11,9, 14,2 Hz, 1/2 CH&sub2; des Rotameren A), 1,10 (s, 6,3H, Boc des Rotameren B), 0,67 (s, 2,7H, Boc des Rotameren A) ¹&sup9;F-NMR (DMSO-d&sub6; + D2O, nur Hydrat-Spezies vorhanden) δ - 77,54 (s, CF&sub3; des Rotameren B), -77,63 (s, CF&sub3; des Rotameren A), -121,46 und -123,59 (pr d, J = 276 Hz, CF&sub2; des Rotameren B), -121,46 und -123,35 (pr d, J = 276 Hz, CF&sub2; des Rotameren A); MS (CI, NH&sub3;) m/z (relative Intensität) 424 (37, M + NH&sub4;&spplus;), 368(100), 130(40);
Analyse (C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub9;F&sub5;N&sub2;O&sub3;·0,34H&sub2;O) C,H,N. Beispiel 2 Herstellung von 1H-Indol-1-carbonsäure, 3-(2-amino-4,4,5,5,5- pentafluor-3-oxonentyl)-1,1-dimethylethylester, Monohydrochlorid, (S)-.
Schema A, Stufe b; langsam werden 4,0 N Salzsäure in Dioxan (5,0 ml) zu einer gerührten Lösung der Verbindung C von Beispiel 1 (1,04 g, 2,00 mmol) in Dioxan (2,4 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. Nach einer Stunde wird die erhaltene Suspension über ein Saugfilter gezogen und der gesammelte Feststoff mit Et&sub2;O (3 · 10 ml) gewaschen. Der hellweiße Feststoff wird unter hohem Vakuum über KOH-Pellets getrocknet, wobei man 195 mg (22%) der Titelverbindung als ein Gemisch von Keton und Hydrat (Verhältnis 2 : 3) erhält. Wegen der Instabilität der Titelverbindung wird die Titelverbindung unmittelbar in der nächsten Stufe eingesetzt. Die Verdünnung der kombinierten Filtrate von oben und Kühlung führt zu einer zusätzlichen Menge Titelverbindung (571 mg, 64%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 8,79 (br s), 7,99 (br d, 1H, J = 6,6 Hz), 7,88- 7,66 (m), 7,51 (d, 0,4H, J = 7,4 Hz, Ar-H des Ketons), 7,41 (d, 0,6H, J = 7,4 Hz, Ar-H des Hydrats), 7,28-7,12 (m, 2H), 6,48 (br s, Hydrat OH), 5,10-4,96 (m, 0,4H, CH des Ketons), 3,75-3,93 (m, 0,6H, CH des Ketons), 3,63-3,10 (m, 2H, CH&sub2;), 1,55 (s, 9H, Boc); ¹&sup9;F-NMR (CDCl&sub3;) δ -79,48 (s, CF&sub3; des Hydrats), -81,77 (s, CF&sub3; des Ketons), -119,56 und -122,40 (pr d, J = 297 Hz, CF&sub2; des Ketons), -123,38 (br s, CF&sub2; des Hydrats); MS (CI, NH&sub3;) m/z (relative Intensität) 424 (21, M + NH&sub4;&spplus;), 407 (42, MH+), 387 (100). Beispiel 3 Herstellung von L-Proliamid,N-[(1,1-dimethylethoxy)carbonyl]- N-methyl-D-phenylalanyl-N-[1-[[1-[(1,1-dimethylethoxy)carbony- 1]-1H-indol-3-yl]methyl]-3,3,4,4,4-pentafluor-2-oxobutyl]-, (S)-.
Schema A, Stufe c; zu einer gerührten Lösung von N-Boc-N- methyl-D-Phe-L-Pro-OH (Veber et al., WO-A-94/25051, veröffentlicht 10. November 1994) (0,15 g, 0,41 mmol) in EtOAc (3 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre und gekühlt auf -18ºC wird N-Methylmorpholin (45 ul, 0,41 mmol) zugegeben, gefolgt von Isobutylchlorformiat (53 ul, 0,41 mmol). Nach 15 Minuten wird weiteres N-Methylmorpholin (45 ul, 0,41 mmol) zugegeben, gefolgt von dem Produkt von Beispiel 2 (0,18 g, 0,41 mmol). Das Reaktionsgemisch wird bei -15 bis -20ºC für 4 Stunden gerührt, mit EtOAc (50 ml) verdünnt und mit 10% wäßriger Citronensäure (2 · 25 ml), halbgesättigtem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat (2 · 15 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen.
Nach Trocknung über Magnesiumsulfat, gefolgt von einer Filtration und Aufkonzentrierung erhält man das Rohprodukt. Die Schnellchromatographie (2,5 · 12 cm Silicagelsäule) unter Eluierung mit EtOAc-Hexan (45 : 55) ergibt die Titelverbindung (0,16 g, 52%, Gemisch von Keton und Hydrat) als fahlgelben Schaum.
TLC Rf 0,34 (45 : 55 EtOAc : Hexan); ¹&sup9;F-NMR (CDCl&sub3;) δ -79,27 (s, CF&sub3; des Hydrats), -82,09 (s, CF&sub3; des Ketons), -122,81 und - 124,74 (pr d, J = 275 Hz, CF&sub2; des Hydrats, -121,75 bis -121,90 (m, CF&sub2; des Ketons), Verhältnis von Keton zu Hydrat etwa 2 : 3; MS (CI, NH&sub3;) m/z (relative Intensität) 782 (30, M + NH&sub4;&spplus;), 765 (45, MH+), 209 (92), 122 (100);
HRMS C&sub3;&sub8;H&sub4;&sub6;F&sub5;N&sub4;O&sub7; (MH+) berechnet 765,3287, erhalten 765,3281. Beispiel 4 Herstellung von L-Prolinamid, N-methyl-D-phenylalanyl-N-[1-[(1- carboxy-1H-indol-3-yl)methyl]-3,3,4,4,4-pentafluor-2-oxobuty- 1]-, (S)-. Mono(trifluoracetat)
Schema A, Stufe d; zu dem Produkt von Beispiel 3 (150 mg, 0,2 mmol) unter Stickstoffatmosphäre wurden CF&sub3;CO&sub2; (2 ml) zugegeben, und die erhaltene Lösung 3 Minuten gerührt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand in Et&sub2;O (3 ml) gelöst und 20 ml Hexan langsam unter Verwirbelung hinzugegeben. Die Saugfiltration unter Stickstoffatmosphäre führte zur Titelverbindung (117 mg, 82%) als einen hellweißen Feststoff. Die Titelverbindung ist instabil gegenüber Decarboxylierung.
¹H-NMR (CDCl&sub3;) nur NCH&sub3;-Signal δ 2,44 (s, 3H, NCH&sub3;); ¹&sup9;F-NMR (CDCl&sub3;) δ -82,11 (s, CF&sub3; des Ketons), -121,60 bis -122,91 (m, CF&sub2; des Ketons); MS (FAB, MNBA) m/z (relative Intensität) 609,2 (MH+, 46), 565,2 (MH-CO&sub2;&spplus;, 81), 448,2 (6), 404,2 (38), 134,1 (100). Beispiel 5 Herstellung von L-Prolinamid, N-methyl-D-phenylalanyl-N- [3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1H-indol-3-ylmethyl)-2-oxobutyl]-, Mono(trifluoracetat)
Schema A, Stufe e; das Produkt von Beispiel 4 (82 mg, 0,1 mmol) wird in CHCl&sub3; gelöst und für 48 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand in CH&sub2;Cl&sub2;-Hexan gelöst und anschließend aufkonzentriert, um zu der Titelverbindung (76 mg, 100%, 1 : 1 Gemisch von DLL und DLD Diastereomeren) als hellgelben Feststoff zu führen.
TLC Rf 0,66 (5 : 95 Et&sub3;N : CH&sub3;CN); TLC Rf 0,12 (5 : 95 Et&sub3;N : EtOAc); ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 9,69 (s, 0,5H, Nin-H von DLL Diast.), 9,26 (s, 0,5H, Nin-H von DLD DiaSt.) 8,18 (br d, 0,5H, J = 6,4 Hz, DLD Diast.), 7,61-7,02 (m), 5,11 (dd, 0,5H, J = 5,8, 11,8 Hz, CH von Trp Von DLD DiaSt.), 5,04 (dt, 0,5H, J = 3,6, 10,9 Hz, CH von Trp von DLL Diast.), 4,54 (dd, 0,5H, J = 2,0, 7,7 Hz, CH of Pro of DLD diast.), 4.42 (dd, 0,5H, J = 1,9, 7,8 Hz, CH von Pro von DLL Diast), 4,03 (dd, 0,5H, J = 4.2, 11.2 Hz, CH von Phe von DLD Diast.), 3,97 (dd, 0,5H, J = 4,4, 11,3 Hz, CH von Phe von DLL Diast.), 3,5-2,9 (m), 2,23 (s, 1,5H, NCH&sub3; von DLD Diast), 2,10-1,90 (m), 1,93 (s, 1,5H, NCH&sub3; von DLL Diast.), 1,70-1,65 (m), 1,50-1,22 (m); ¹&sup9;F NMR (CDCl&sub3;) δ -82,11 (s, CF&sub3; von DLL Diast.), -82,34 (s, CF&sub3; of DLD Diast.), -120,22 und -123,5 (pr d, J = 294 Hz, CF&sub2; von DLD Diast.), -121,92 (s, CF&sub2; von DLL Diast.), Verhältnis von DLD zu DLL = 1 : 1, MS (CI NH&sub3;) m/z (relative Intensität) 565 (MH+, 100), 547 (39), 436 (15), 276 (12), 259(8);
HRMS C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub0;F&sub5;N&sub4;O&sub3; (MH+) berechnet 565, 2238, gefunden 565, 2253. Beispiel 6 Herstellung von 2-Pyrrolidincarboxamid, N-[3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1H-indol-3-ylmethyl)-2-oxobutyl]1-[(1,2,3,4-tetrahydro-3-isochinolyl)carbonyl]-, [2S-[1(S*),2R*]]-, Mono(trifluoracetat

a) Herstellung von Boc-D-3-Tiq-Pro-Trp(Boc)-CF&sub2;CF&sub3;

Schema E, Stufe a; eine gerührte Lösung von Boc-D-3-Tiq- Pro-OH) Neises et al., US-A-5391705) (0,15 g, 0,41 mmol) in EtOAc (3 ml) wird unter Stickstoffatmosphäre und gekühlt auf -18ºC mit N-Methylmorpholin (45 ul, 0,41 mmol) in Kontakt gebracht, gefolgt von Isobutylchlorformiat (53 gl, 0,41 mmol) und mit dem Produkt von Beispiel 2 (0,18 g, 0,41 mmol) gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 3 gekoppelt, um zu der Titelverbindung zu gelangen.

b) Herstellung von D-3-Tig-Pro-Trp(COOH)-CF&sub2;CF&sub3;, Mono(trifluoracetat).

Schema E, Stufe b; das Produkt von Beispiel 6(a) (150 mg, 0,2 mmol) wird gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 4 entschützt mit CF&sub3;CO&sub2;H (2 ml), Et&sub2;O (3 ml) und Hexan (20 ml), um zu der Titelverbindung zu gelangen.

c) Herstellung von 2-Pyrrolidincarboxamid, N-[3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1H-indol-3-ylmethyl)-2-oxobutyl]1-[(1,2,3,4-tetrahydro-3-isochinolyl)carbonyl]-, [2S-[1(S*),2R*]]-, Mono(trifluoracetat)

Schema A, Stufe e; das Produkt von Beispiel 6(b) (82 mg, 0,1 mmol) wird in der gemäß Beispiel 5 beschriebenen Weise decarboxyliert mit CHCl&sub3; (2 ml) und CH&sub2;Cl&sub2;-Hexan, um zu der Titelverbindung zu gelangen. Beispiel 7 Herstellung von 2-Pyrrolidincarboxamid, N-[3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1H-indol-3-ylmethyl)-2-oxobutyl]-1-[(1,2,3,4-tetrahydro- 1-isochinolyl)carbonyl]-, [2S-[1(S*)-,2R*]]-, Mono(trifluoracetat

a) Herstellung von Boc-D-1-Tiq-Pro-Trp(Boc)-CF&sub2;CF&sub3;

Schema E, Stufe a; eine gerührte Lösung von Boc-D-1-Tiq- Pro-OH (Neises et al., US-A-5391705) (0,15 g, 0,41 mmol) in EtOAc (3 ml) wird unter Stickstoffatmosphäre und gekühlt auf - 18ºC mit N-Methylmorpholin (45 ul, 0,41 mmol) in Kontakt gebracht, gefolgt von Isobutylchlorformiat (53 ul, 0,41 mmol), und mit dem Produkt von Beispiel 2 (0,18 g, 0,41 mmol) in analoger Weise wie in Beispiel 3 beschrieben gekoppelt, um zu der Titelverbindung zu gelangen.

b) Herstellung von D-1-Tiq-Pro-Trt(COOH)-CF&sub2;CF&sub3;, Mono(trifluoracetat)

Schema E, Stufe b; das Produkt von Beispiel 7(a) 150 mg, 0,2 mmol) wird in ähnlicher Weise wie im Beispiel 4 beschrieben entschützt mit CF&sub3;CO&sub2;H (2 ml), Et&sub2;O (3 ml) und Hexan (20 ml), um zu der Titelverbindung zu gelangen.

c) Herstellung von 2-Pyrrolidincarboxamid, N-[3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1H-indol-3-ylmethyl)-2-oxobutyl]-1-[(1,2,3,4-tetrahydro-3-isochinolyl)carbonyl]-, [2S-[1(S*),2R*]]-, Mono(trifluoracetat)

Schema A, Stufe e; das Produkt von Beispiel 7(b) (82 mg, 0,1 mmol) wird decarboxyliert in der in Beispiel 5 beschriebenen Weise mit CHCl&sub3; (2 ml) und CH&sub2;Cl&sub2;-Hexan, um zu der Titelverbindung zu gelangen. Beispiel 8 Herstellung von L-Prolinamid, 3-cyclohexyl-N-methyl-D-alanyl-N- [3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1H-indol-3-ylmethyl)-2-oxobutyl]-, Mono(trifluoracetat)

a) Herstellung von N-Boc-N-methyl-D-Cha-OH

Schema G, Stufe c; Boc-D-Cha-OH (10,8 g, 40 mmol) wurden in THF (200 ml) gelöst und die Lösung auf 0ºC abgekühlt. Natriumhydrid (4,8 g, 120 mmol, 60% Dispersion in Öl) wurde in Portionen über eine Stunde zugegeben und für 20 Minuten gerührt. Anschließend wurde Methyliodid (19,7 ml, 316 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch bei 0ºC für 3 Stunden und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0ºC zurückgekühlt, und langsam wurde Wasser (100 ml) zugegeben. Nach Aufkonzentrierung unter Entfernung Von THF wurde das Gemisch mit Diethylether gewaschen (2 · 150 ml). Nach Zugabe von 6 N HCl auf einen pH-Wert von etwa 3 zu der wäßrigen Schicht wurde mit Ethylacetat (4 · 100 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit 5 % Natriumthiosulfat (100 ml), Salzlösung (100 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Aufkonzentrierung unter Vakuum erhielt man die Titelverbindung.

b) Herstellung von N-Boc-N-methyl-D-Cha-Pro-OCH&sub3;

Schema A, Stufe c; HCl·Pro-OCH&sub3; (0,33 g, 2,0 mmol) wurde in DMF (20 ml) gelöst und die Lösung auf 0ºC abgekühlt. Triethylamin (0,31 ml, 2,2 mmol) wurde zugegeben, und es wurde für 10 Minuten gerührt. Anschließend wurde das Produkt von Beispiel 8(a) (2,0 mmol, gelöst in 100 ml THF) zugegeben, gefolgt von der Zugabe von HOBt·1H&sub2;O (0,27 g, 2,0 mmol) und EDC (0,40 g, 2,1 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde bei 0ºC für 3 Stunden gerührt und anschließend bei Raumtemperatur über Nacht. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter Vakuum aufkonzentriert und der Rückstand in 1 N HCl (100 ml) aufgenommen und mit Ethylacetat extrahiert (3 · 100 ml). Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit wäßrigem Natriumhydrogencarbonat gespült (100 ml), mit Salzlösung gespült (100 ml), über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, durch ein kurzes Kissen aus Silicagel gegeben und unter Vakuum aufkonzentriert. Die Reinigung des Rückstandes durch Schnellchromatografie führte zu der Titelverbindung.

c) Herstellung von N-Boc-N-methyl-D-Cha-Pro-OH

Schema G, Stufe b; das Produkt von Beispiel 8(b) (4,0 g, 10,2 mmol) wurde in THF (100 ml) und Wasser (50 ml) gelöst. Es wurde Lithiumhydroxid-Monohydrat (900 mg, 21,5 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Aufkonzentrierung zur Entfernung von THF wurde anschließend der Rückstand mit Diethylether (2 · 100 ml) gewaschen und die wäßrige Schicht mit 6 N HCl auf etwa pH 3 angesäuert. Anschließend wurde die angesäuerte wäßrige Schicht mit Ethylacetat extrahiert (3 · 100 ml). Nach Vereinigung der organischen Extrakte, Trocknung über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Aufkonzentrierung des Filtrats unter Vakuum erhielt man die Titelverbindung.

d) Herstellung von N-Boc-N-methyl-D-Cha-L-Pro-Tru(Boc)-CF&sub2;CF&sub3;

Schema A, Stufe c; eine gerührte Lösung des Produktes von Beispiel 8(c) (0,16 g, 0,41 mmol) wurde in EtOAc (3 ml) unter Stickstoffatmosphäre und gekühlt auf -18ºC mit N-Methylmorpholin (45 ul, 0,41 mmol) in Kontakt gebracht, gefolgt von Isobutylchlorformiat (53 ul, 0,41 mmol) und an das Produkt von Beispiel 2 (0,18 g, 0,41 mmol) in der im Beispiel 3 beschriebenen Verfahrensweise gekoppelt, um zu der Titelverbindung zu gelangen.

e) Herstellung von N-Methyl-D-Cha-L-Pro-Trp(COOH)-CF&sub2;CF&sub3;, Mono(trifluoracetat)

Schema A, Stufe d; das Produkt von Beispiel 8(d) 154 mg, 2,0 mmol) wurde entschützt in einer Weise, die in Beispiel 4 beschrieben wurde, mit CF&sub3;CO&sub2;H (2 ml), Et&sub2;O (3 ml) und Hexan (20 ml), um zu der Titelverbindung zu gelangen.

f) Herstellung von L-Prolinamid, 3-cyclohexyl-N-methyl-D-alanyl-N-[3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1H-indol-3-ylmethyl)-2-oxobuty- 1]-, Mono(trifluoracetat)

Schema A, Stufe e; das Produkt von Beispiel 8(e) (73 mg, 0,1 mmol) wurde in der im Beispiel 5 beschriebenen Weise decarboxyliert mit CHCl&sub3; (2 ml) und CH&sub2;Cl&sub2;-Hexan, um zu der Titelverbindung zu gelangen.
In weiteren Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung von Thrombin bei einem Patienten, der dies benötigt, oder zur Behandlung oder Verhütung eines Thrombinzustandes bei einem Patienten, der daran leidet, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Formeln (I) oder (IA). Der Begriff "Thrombinzustand" bezieht sich auf Erkrankungen oder Zustände, gekennzeichnet durch Thrombus- oder Embolusbildung und schließt ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt, Herzkranzgefäß- und Hirngefäßerkrankungen, tiefe Venenthrombose, Lungenembolie, Hirnschlag (thrombotischen oder embolischen Ursprungs), Herzinfarkt, instabile oder refraktäre Angina, Koronarthrombose nach Angioplastik, Restenose und ähnliche. Die auf diesem Gebiet erfahrenen Fachleute werden leicht die Umstände erkennen, die Thrombinhemmer und/oder eine Antikoagulanztherapie benötigen.
Verbindungen der Formeln (I) und (IA), wie besonders für die Behandlung von Thrombinzuständen bevorzugt sind, schließen die in den folgenden Tabellen 5 und 6 aufgeführten Verbindungen ein. Am bevorzugtesten für die Behandlung von Thrombinzuständen ist die Verbindung L-Prolinamid, N-methyl-D-phenylalanyl-N-[3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1H-indol-3-ylmethyl)-2-oxobuty- 1]-, Mono(trifluoracetat).
Der hier verwendete Begriff "Patient" bezieht sich auf ein warmblütiges Lebewesen, wie einen Säuger und erfaßt Guineaschweine, Hunde, Katzen, Ratten, Mäuse, Pferde, Rinder, Schafe und Menschen, die Beispiele für Säuger sind, die unter die Bedeutung dieses Begriffes fallen.
Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge, die nach kontinuierlicher Infusion oder nach Einfach- oder Mehrfachverabreichung an den Patienten wirksam ist und wodurch eine Verringerung der Größe des Thrombus oder Embolus auftritt oder eine Verringerung im Umfang des mit Thrombinzuständen verbundenen Schadens, was zu einem verbesserten Ergebnis führt und/oder einer Verzögerung oder Verhinderung des Krankheitsfortschritts im Vergleich mit dem zu erwartenden Ergebnis ohne die Behandlung. Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" bedeutet nicht notwendigerweise eine vollständige Eliminierung oder Heilung dieser Krankheit. Bei der Bestimmung der therapeutisch wirksamen Menge oder Dosis ist eine Anzahl von Faktoren durch den behandelnden Arzt zu betrachten, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt die Art des Säugers; dessen Größe, Alter und allgemeiner Gesundheitszustand; die speziell in Betracht zu ziehende Krankheit; der Grad oder die Einbeziehung in oder die Heftigkeit der Krankheit; die Reaktion des einzelnen Patienten; die speziell verabreichte Verbindung; die Art der Verabreichung; die Merkmale der Bioverfügbarkeit der verabreichten Zubereitung; der gewählte Dosierungsablauf; die Verwendung begleitender Medikation; und andere relevante Umstände. Eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formeln (I) oder (IA) kann von etwa 25 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag (mg/- kg/Tag) bis etwa 200 mg/kg/Tag liegen. Bevorzugte Mengen sind zu erwarten in einer Variation von etwa 40 bis etwa 70 mg/kg/- Tag. Bei intravenöser Verabreichung werden die bevorzugtesten Dosierungen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 20 mg/kg/Minute während einer konstanten Infusionsgeschwindigkeit liegen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind selektive Hemmer von Thrombin. Es wird vermutet, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen ihre pharmakologischen Wirkungen über die Hemmung des Enzyms Thrombin ausüben und dadurch Thrombinzustände verzögern oder verhindern, einschließlich von Herzkranz- und Hirngefäßerkrankungen, tiefer venöser Thrombose, Lungenembolie, Hirnschlag (thrombotischen oder embolischen Ursprungs) Herzinfarkt, instabile oder refraktäre Angina, Herzkranzgefäßthrombose nach Angioplastik, Restenose und ähnlichem. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht so zu verstehen, daß sie auf irgend eine besondere Theorie beschränkt ist oder auf ein vorgeschlagenen Mechanismus, um ihre Wirksamkeit bei der endgültigen Applikation zu erläutern.
Bei der Durchführung der Behandlung eines Patienten, der an einem oben beschriebenen Krankheitszustand leitet, kann eine Verbindung der Formel (I) in einer beliebigen Form verabreicht werden oder in einer modifizierten Form, die die Verbindung in wirksamen Mengen bioverfügbar macht, einschließlich der oralen und parenteralen Routen. Zum Beispiel können Verbindungen der Formel (I) oral, subcutan, intramuskulär, intravenös, transdermal, intranasal, rektal, topisch und auf ähnliche Weise verabreicht werden. Die orale oder intravenöse Verabreichung ist im allgemeinen bevorzugt. Der Fachmann auf dem Gebiet der Herstellung von Formulierungen kann leicht die entsprechend richtige Form und die Art der Verabreichung auswählen in Abhängigkeit von den speziellen Merkmalen der für den zu behandelnden Krankheitszustand ausgewählten Verbindung, dem Stadium der Krankheit und anderen relevanten Umständen. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., Mack Publ. Co. (1990).
Die Verbindungen können verabreicht werden allein oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Hilfsstoffen der Art, und des Verhältnisses, die durch die Löslichkeit und die chemischen Eigenschaften der ausgewählten Verbindung bestimmt werden, des gewählten Verabreichungsweges und pharmazeutischer Standardpraxis. Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die selbst wirksam sind, können verabreicht und formuliert werden in Form ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze, wie zum Beispiel der Säureadditionssalze, um die Stabilität, eine bequeme Kristallisation, eine erhöhte Löslichkeit und ähnliches auszunutzen.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Formeln (I) oder (IA) im Gemisch oder in anderer Assoziation mit einem oder mehreren inerten Trägern umfaßt. Diese Zusammensetzungen sind nützlich zum Beispiel als Teststandards, als bequemes Mittel zur Schüttgutlieferung oder wann immer eine Hemmung der Blutkoagulation erforderlich ist, wie zur Verhinderung der Koagulation von gelagertem Gesamtblut und zur Verhinderung der Koagulation bei anderen biologischen Proben für Testung oder Lagerung. Somit können die Thrombinhemmer mit einem beliebigen Medium in Kontakt gebracht werden oder diesem zugesetzt werden, das Thrombin enthält oder von dem man erwartet, daß es Thrombin enthalten wird, und bei dem es gewünscht wird, daß die Blutkoagulierung gehemmt wird, z. B. wenn das Säugerblut mit dem Material in Kontakt gebracht wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Gefäßimplantaten, Stents, orthopädischen Prothesen, Herzprothesen und extrakorporalen Zirkulationssystemen.
Eine antikoagulierende Menge einer Verbindung der Formeln (I) oder (IA) ist eine Menge, die das Blut im flüssigen Zustand hält. Antikoagulierende Mengen einer Verbindung der Formeln (I) oder (IA) variieren im allgemeinen von etwa 45 uM bis etwa 1000 uM. Bevorzugte Antikoagulanzmengen einer Verbindung der Formeln (I) oder (IA) liegen bei etwa 90 uM bis etwa 300 uM. Inerte Träger können ein beliebiges Material sein, das mit einer Verbindung der Formeln (I) oder (IA) nicht abgebaut oder auf andere Weise kovalent umgesetzt wird. Beispiele für geeignete inerte Träger sind Wasser, wäßrige Puffer, wie solche, die im allgemeinen nützlich für die Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatografie (HPLC) sind; organische Lösungsmittel wie Acetonitril, Ethylacetat, Hexan und ähnliche; und pharmazeutisch annehmbare Träger oder Hilfsstoffe.
Bevorzugter betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formeln (I) oder (IA) im Gemisch oder in anderer Assoziierung mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Hilfsstoffen umfassen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden nach bekannten Verfahren auf diesem Gebiet hergestellt. Der Träger oder Hilfsstoff kann ein festes, halbfestes oder flüssiges Material sein, das als Vehikel oder Medium für den aktiven Bestandteil dienen kann. Geeignete Träger oder Hilfsstoffe sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann für die orale, parenterale oder topische Verwendung angepaßt werden und kann dem Patienten in Form von Tabletten, Kapseln, Zäpfchen, als Lösung, als Suspensionen oder ähnliches verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können oral zum Beispiel mit einem inerten Verbindungsmittel oder mit einem eßbaren Träger verabreicht werden. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen werden oder zu Tabletten verpreßt werden. Zum Zwecke der oralen therapeutischen Verabreichungen können die Verbindungen in eine Transportsubstanz aufgenommen werden und in Form von Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupi, Waffeln, Kaugummi und ähnlichen verwendet werden. Diese Präparationen sollten wenigstens 4% der erfindungsgemäßen Verbindung - des aktiven Bestandteils - enthalten, können jedoch variieren in Abhängigkeit von der besonderen Form und können üblicherweise zwischen 4 bis etwa 70% des Gewichtes der Einheit enthalten. Die Menge der in den Zusammensetzungen vorhandenen Verbindungen ist so, daß eine geeignete Dosierung erreicht wird. Bevorzugte Zusammensetzungen und Präparationen nach der vorliegenden Erfindung werden so hergestellt, daß eine orale Einheitsdosierung zwischen 5,0 bis 300 Milligramm einer Verbindung der Erfindung enthält.
Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und ähnliche können weiterhin ein oder mehrere der folgenden Begleitstoffe enthalten: Bindemittel wie mikrokristalline Cellulose, Tragacanth-Gummi oder Gelatine; Transportstoffe wie Stärke oder Lactose, Verteilungsmittel wie Algininsäure, Primogel, Maisstärke und ähnliche; Gleitmittel wie Magnesiumstearat oder Sterotex; Gleitstoffe wie kolloidales Siliciumdioxid; und Süßungsmittel wie Saccharose oder Saccharin können zugegeben werden oder ein Geschmacksstoff wie Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangengeschmack. Wenn die Dosierungseinheit eine Kapsel ist kann sie zusätzlich zu dem Material des oben genannten Typs einen flüssigen Träger wie Polyethylenglycol oder ein fettes Öl enthalten. Andere Dosiseinheiten können verschiedene andere Materialien enthalten, die die physische Form der Dosiseinheit modifizieren, zum Beispiel als Überzüge. Ein Sirup kann zusätzlich zu den gegebenen Verbindungen Zucker als Süßungsmittel und verschiedene Schutzmittel, Farbstoffe und Geschmacksstoffe enthalten. Die zur Herstellung dieser verschiedenen Zusammensetzungen verwendeten Materialien sollten pharmazeutisch rein sein und in den eingesetzten Mengen nicht toxisch.
Für die Zwecke der parenteralen therapeutischen Verabreichung können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in eine Lösung oder Suspension eingebracht werden. Diese Präparationen sollten wenigstens 0,1% einer Verbindung der Erfindung erhalten, können jedoch zwischen 0,1 und 50 Gewichts-% davon variieren. Die Menge der erfindungsgemäßen Verbindung, die in solchen Zusammensetzungen vorhanden ist, liegt im Bereich einer geeigneten Dosierung. Bevorzugte Zusammensetzungen und Präparationen nach der vorliegenden Erfindung werden so hergestellt, daß eine parenterale Dosiseinheit zwischen 5,0 bis 100 Milligramm der erfindungsgemäßen Verbindung enthält.
Die Verbindungen der Formeln (I) oder (IA) der Erfindung können auch topisch verabreicht werden. Wenn dies erfolgt, so kann der Träger in geeigneter Weise eine Lösung, eine Salbe oder ein Gel als Basis enthalten. Die Basis kann zum Beispiel einen oder mehrere der folgenden Stoffe umfassen: Rohvaseline, Lanolin, Polyethylenglycole, Bienenwachs, Mineralöl, Verdünnungsmittel wie Wasser und Alkohol und Emulgatoren und Stabilisatoren. Topische Formulierungen können eine Konzentration der Verbindung der Formeln (I) oder (IA) oder dessen pharmazeutisches Salz von etwa 0,1 bis etwa 10% Gewicht pro Volumen enthalten.
Die Lösungen oder Suspensionen können auch einen oder mehrere der folgenden Begleitstoffe enthalten: Sterile Verdünnungsmittel wie Wasser für die Injektion, Salzlösung, fixierte öle, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel wie Benzylalkohol oder Methylparaben; Antioxidationsmittel wie Ascorbinsäure oder Natriumdisulfit; Chelatisierungsmittel wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer wie Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel für die Einstellung der Tonizität wie Natriumchlorid oder Dextrose. Die parenterale Präparation kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrfachdosisröhrchen aus Glas oder Plastik eingeschlossen sein.

In vitro-Hemmunpstest

Die Verbindungen der Erfindung sind hochselektive Thrombinhemmer gegenüber anderen Serinproteasen wie Trypsin. Zum Beispiel kann die Thrombinhemmungsaktivität der Verbindungen der Formeln (I) und (IA) unter Verwendung des spektrofotometrischen Tests demonstriert werden nach der Verfahrensweise von Tuppy et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 329, 5. 278 (1962), bei dem die Freisetzung von p-Nitroanilin durch Messung der Absorptionserhöhung bei 405 nm (&epsi; = 10800 M&supmin;¹cm&supmin;¹) bestimmt wird. Thrombin wird aus Humanplasma erhalten, erhältlich von Sigma Chemical Co, wobei die Aktivität in NIH-Einheiten ausgedrückt wird. Ein Röhrchen enthält 290 Einheiten (spezifische Aktivität = 3000 Einheiten pro mg Protein) als lyophilisiertes Pulver, das mit 1 ml Wasser rekonstituiert wird. Das Substrat ist das chromophore Peptid Sarcosyl-Prolin- Arginin-p-Nitroanilid (KM = 0,9 mM), der Puffer ist 0,1 M Tris, pH 7,4 (Endvolumen 1 ml) und der Test wird bei einer Temperatur von etwa 30ºC mit 0,029 NIH-Einheiten des erforderlichen Enzyms pro Test durchgeführt. Die kinetische Charakterisierung des unmittelbaren Inhibitors erfolgt mittels Dixon-Plot, woraus die Charakterisierung von langsam und/oder knapp bindenden Hemmern eine Datenanalysentechnik erfordert, über die von Willams und Morison berichtet wurde. Die kinetische Charakterisierung der zeitabhängigen Inhibitoren erfolgt mittels eines Kitz&Wilson-Plot, Kitz, R und Wilson I. B., J. Biol. Chem., 237, 3245-3249 (1962).
Die Trypsin-Inhibierungsaktivität der Verbindungen der Formeln (I) und (IA) kann unter Verwendung des spektrofotometrischen Tests demonstriert werden nach dem Verfahren von Tuppy et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 329, S. 278 (1962), der unmittelbar zuvor beschrieben wurde. Trypsin wird erhalten aus Schweinepankreas, erhältlich von Sigma Chemical Co, wobei die Aktivität in Sigmaeinheiten ausgedrückt wird. Die spezifische Aktivität der Trypsinquelle beträgt 15900 Sigmaeinheiten pro mg Protein, wobei eine Einheit definiert ist als die Menge des Enzyms, die eine Erhöhung der Absorption bei 253 nm von 0,001 pro Minute als Ergebnis der Hydrolyse von Benzoyl-Arginin-Ethylester bei pH 7,6 und bei 25ºC ergibt. Das Substrat ist das Peptid Benzoyl-Arginin-p-Nitroanilid (KM = 1,7 mM), der Puffer ist 0,05 M Tris, 0,05 M CaCl&sub2;, pH 7,8 (Endvolumen 1 ml) und der Test wird bei einer Temperatur von 30ºC mit 8 Sigmaeinheiten des erforderlichen Enzyms pro Test durchgeführt. Die kinetische Charakterisierung des unmittelbaren Inhibitors erfolgt mittels des Dixon-Plots, wobei die Charakterisierung der langsam und/oder knapp bindenden Inhibitoren mittels der Datenanalysentechnik von Willams und Morison erfolgte. Die kinetische Charakterisierung der zeitabhängigen Inhibitoren erfolgte mittels eines Kitz & Wilson-Plots.
Tabelle 2 stellt die Fähigkeit der ausgewählten erfindungsgemäßen Verbindung zur selektiven Hemmung von Thrombin gegenüber Trypsin dar. "TFA" bedeutet in diesem Zusammenhang Trifluoressigsäure. Tabelle 2

Bestimmung der Antikoagulanzaktivität

Eingesetzte Tiere im Experiment waren männliche Sprague-Dawley-Ratten (200-450 g), geliefert von Harlan Sprague Dawley Inc. (Indianapolis, IN 46229).
Koagulierungstest. Die Bestimmungen der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) wurde durchgeführt unter Verwendung der Reagenzien und Methoden von Dade Diagnostics, Inc. (Aguada, Puerto Rico 00602). Alle Gerinnungszeiten wurden halbautomatisch unter Verwendung eines Gerätes MLA-Electra 750, MLA, Inc. (Pleasantville, NY 10570) gemessen. Die erforderliche Zeit zur Verdopplung der Gerinnungszeit (ID&sub2;) wurde unter Verwendung einer einfachen linearen Regression gerechnet. Tabelle 3 erläutert die Antikoagulierungsaktivität einer ausgewählten Verbindung dieser Erfindung.

Tabelle 3

Verbindung ID&sub2; (uM)

TFA·HNMe-D-Phe-L-Pro-D,L-Trp-CF&sub2;CF&sub3; 44,9

In vivo-Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) in Rattenplasma

Die aktivierten partiellen Thromboplastinzeitmessungen (aPTT) erfolgten im Rattenplasma bei verschiedenen Zeiten nach Injizierung der Tiere mit TFA·HNMe-D-Phe-L-Pro-D,L-Trp-CF&sub2;CF&sub3;. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (200-450 g), geliefert von Harlan Sprague Dawley Inc. (Indianapolis, IN 46229) wurden bei diesen Studien verwendet. Die Ergebnisse von den Dosierungen 5 mg/kg, i.v., 10 mg/kg, i.v. und 30 mg/kg, i.v. sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4 Wirkung von TFA·HNMe-D-Phe-L-Pro-D,L-Trp-CF&sub2;CF&sub3; auf aPTT bei Ratten (n = 2)
*i.v. = intravenös; i.p. = intraperitoneal. aPTT = aktivierte partielle Thromboplastinzeit.
Die bevorzugten Verbindungen der Erfindung (I) und (IA), die von besonderem Interesse sind, sind die in den Tabellen 5 und 6 aufgeführten Verbindungen. Tabelle 5 offenbart die bevorzugten Verbindungen der Formel (I). Tabelle 5 Verbindungen der Formel I
In ähnlicher Weise offenbart Tabelle 6 die bevorzugten Verbindungen der Formel (IA). Tabelle 6 Verbindungen der Formel IA
Während die Erfindung in Verbindung mit speziellen Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte klar sein, daß weitere Modifikationen möglich sind und die vorliegende Anmeldung beliebige Variationen, Verwendungen oder Adaptionen der folgenden Erfindung abdeckt. Die Erfindung erfaßt daher auch solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, wie sie sich aus der üblichen Praxis des Standes der Technik ergeben und wie sie auf die wesentlichen Merkmale der zuvor beschriebenen Merkmale angewandt werden können und wie sie im Umfang der nachfolgenden Patentansprüche enthalten sind.

Claims

1. Verbindung der Formel

oder

worin

A Phenyl oder Cyclohexyl ist;

B ist eine Gruppe der Forme

X ist -CF&sub3;, -CF&sub2;CF&sub3;, -CF&sub2;CF&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCH&sub3;, -CF&sub2;(OH&sub2;)tCOOR&sub1;, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCONHR&sub1;, -CF&sub2;(CH&sub2;)tCH&sub2;OR&sub1; oder -CF&sub2;(CH&sub2;)vCH=CH&sub2;;

R ist H oder -CH&sub3;;

R&sub1; ist H oder C&sub1;-C&sub6;-Alkyl;

n ist null oder eins;

t ist die ganze Zahl 2, 3 oder 4;

v ist die ganze Zahl 1, 2 oder 3;

oder ein Stereoisomeres oder ein Gemisch davon, ein Hydrat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin X aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -CF&sub3;, -CF&sub2;CF&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub2;CH&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub2;CO&sub2;CH&sub2;CH&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub2;CONHCH&sub3; und -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub4;CONHCH&sub3; besteht.

3. Verbindung nach Anspruch 2 mit der Strukturformel I, worin A Phenyl ist, n ist eins, und R ist -CH&sub3;.

4. Verbindung nach Anspruch 2 mit der Strukturformel I, worin A Cyclohexyl ist, und n ist eins.

5. Verbindung nach Anspruch 1 mit der Strukturformel IA, worin X aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -CF&sub3;, -CF&sub2;CF&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub2;CH&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub2;CO&sub2;CH&sub2;CH&sub3;, -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub2;CONHCH&sub3; und -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub4;CONHCH&sub3; besteht.

6. Verbindung nach Anspruch 5 mit der Strukturformel IA, worin B

ist.

7. Verbindung nach Anspruch 5 mit der Strukturformel IA, worin B

ist.

8. Verbindung nach Anspruch 3, worin X -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub2;CH&sub3; ist.

9. Verbindung nach Anspruch 4, worin X -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub2;CH&sub3; ist.

10. Verbindung nach Anspruch 5, worin X -CF&sub2;(CH&sub2;)&sub2;CH&sub3; ist.

11. Verbindung nach Anspruch 3, worin X -CF&sub2;CF&sub3; ist.

12. Verbindung nach Anspruch 4, worin X -CF&sub2;CF&sub3; ist.

13. Verbindung nach Anspruch 5, worin X -CF&sub2;CF&sub3; ist.

14. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Verbindung L-Prolinamid, N-Methyl-D-phenylalanyl-N-[3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1H-indol-3-ylmethyl)-2-oxobutyl]-mono(trifluoracetat) ist.

15. Zusammensetzung, die eine Verbindung von Anspruch 1 und einen Träger umfaßt.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung von Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

17. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Verwendung als Medikament.

18. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Thrombin bei einem Patienten, der dies benötigt.

19. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines an einem Thrombin-Zustand leidenden Patienten.

20. Verwendung nach Anspruch 19, worin der Thrombin-Zustand eine tiefe Venenthrombose ist.

21. Verwendung nach Anspruch 19, worin der Thrombin-Zustand eine einer Angioplastik folgende Koronarthrombose ist.

22. Verwendung nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Thrombin im Blut.

23. Verwendung nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung einer Thrombusbildung im Blut.