DE69619973T2

DE69619973T2 - Verwendung von beta-d-galactopyranosyl-d-xylosen zur herstellung von zusammensetzungen und lösungen, die zur bewertung der intestinalen lactoseaktivität bestimmt sind, und herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE69619973T2
Application number: DE69619973T
Authority: DE
Inventors: Juan Jose Aragon Reyes; Francisco Javier Canada Vicinay; Alfonso Fernandez-Mayoralas Alvarez; Rosa Lopez Alvarez; Manuel Martin Lomas; Daniel Villanueva Torregroza
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Autonoma de Madrid
Priority date: 1995-11-08
Filing date: 1996-11-08
Publication date: 2002-11-07
Anticipated expiration: 2016-11-09
Also published as: ES2100131A1; KR19980701287A; US5994092A; WO1997017464A1; ES2176505T3; JP2000106898A; SK100197A3; ES2100131B1; HUP9801439A3; PT819764E; DE69619973D1; JPH10512457A; MX9705109A; NO973159D0; CN1177984A; HUP9801439A2; CZ252797A3; EA000684B1; NO973159L; BR9607092A

Description

Die Defizienz oder geringe Aktivität intestinaler Lactase, die sich aus einer unzureichenden oder sogar bei Null liegenden Kapazität für den Verdau von Lactose ergibt, ist selten im Hinblick auf einen kongenitalen metabolischen Fehler, obwohl es sich um ein häufiges Syndrom bei menschlichen Erwachsenen handelt. Bei einem grösseren Teil von Säugetieren existiert eine akute Abnahme der Lactaseaktivität vom Moment des Abstillens an. Bei Menschen mit Vorfahren, die von einem substantiellen Verbrauch von Milch oder milchähnlichen Produkten über einen langen Zeitraum abhängig waren, ist diese Abnahme weniger häufig. Andererseits ist die Defizienz oder geringe Aktivität der intestinalen Lactase häufig bei Babys, die gestillt werden.
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der blutfreien Überprüfungsverfahren der intestinalen Lactaseaktivität.
Die Bestimmung der intestinalen Lactaseaktivität ist wichtig für die Pediatrie und Gastroenterologie und kann direkt durchgeführt werden, ausgehend von einer mukosen Probe, oder indirekt, ausgehend vom Niveau der Glucose im Blut oder von verbrauchtem Wasserstoff nach Verabreichung einer Dosis an ein Individuum.
Die konventionelle direkte Bestimmung weist den Nachteil auf, dass sie eine komplexe und teure Methode ist, da sie spezifische Instrumente benötigt, sowie hochspezialisiertes Personal für die Technik der Extraktion der Probe, die einer darauffolgenden Analyse unterzogen werden muss, abgesehen davon, dass sie unangenehm und nicht ganz ungefährlich für das Individuum ist.
Die indirekte Bestimmung weist den Nachteil auf, dass es sich um ein Verfahren handelt, bei dem Blut involviert ist, was die Extraktion von Blut durch eine spezialisierte Person erfordert, bevor die Probe analysiert werden kann, abgesehen davon, dass das Verfahren komplex und fehleranfällig ist, und zwar aufgrund der Existenz der Glucose, die sich aus dem Verdau von anderen Lebensmitteln ergibt, die von dem Individuum aufgenommen werden, und durch endogene Glucose, die mobilisiert worden sein kann.
Andere Verfahren für die Bestimmung der intestinalen Lactase basieren auf der Tatsache, dass spezifische Disaccharide, basierend auf ihrer Affinität zu der Lactase, als Substrat der Lactase wirken können und durch die Wirkung des Enzyms in spezifische Monosaccharide transformiert werden, die einfach durch den Verdauungstrakt absorbiert und über den Urin eliminiert werden.
So basieren die in den ES-PSen 478 590 und 482 073 offenbarten Verfahren auf einer in vivo-Überprüfung durch orale Verabreichung von 3-O-Methyllactose und der Analyse der 3-O-Methyl-D-glucose im Urin. Jedoch weisen diese Verfahren den Nachteil auf, dass sie die Verwendung eines chromatografischen Verfahrens für den Nachweis von 3-O- Methyl-D-glucose im Urin benötigen, was komplexe und teure Ausrüstungen und Analysevorrichtungen erfordert.
Andererseits offenbart ES-PS 9 001 680 die Herstellung des Disaccharids 4-O-β-Galactopyranosyl-D-xylose der Formel (I):
für die Überprüfung der intestinalen Lactaseaktivität. Dieses Disaccharid wird oral verabreicht, es wirkt als Substrat für die intestinale Lactase und zerfällt im Intestinaltrakt zu Xylose und Galactose, wobei die Xylose absorbiert und dann mit dem Urin eliminiert wird, wo sie direkt durch einfache colorimetrische Verfahren überprüft werden kann. Das Disaccharid der ES-PS 9 001 680 weist den Nachteil auf, dass es trotz einer sehr ähnlichen Struktur zu derjenigen von Lactose eine erhöhte Affinität für die Lactase aufweist. Dies legt nahe, dass nur ein Teil der verdauten 4-O-β-Galactopyranosyl-D-xylose, basierend auf der enzymatischen Aktivität der Lactase, hydrolysiert wird und dass daher ein nicht-verdauter Teil in Xylose und Galactose mit den Fäkalien eliminiert wird. Dies legt einen relativ substantiellen Fehlerbereich nahe, im Hinblick darauf, dass niedrige oder sogar nicht- existierende Werte der Xylose im analysierten Urin sowohl von einer defizienten oder bei Null liegenden intestinalen Lactaseaktivität herrühren können, als auch von einer defizienten Hydrolysierung des Disaccharids aufgrund des Fehlens einer Affinität zu der Lactase. Um diesen Fehlerbereich zu verbessern ist es notwendig, dass das Individuum eine substantielle Menge an Disacchariden verdaut, was wiederum zu Verdauungsproblemen, wie z. B. Durchfall und den korrespondierenden unangenehmen Begleiterscheinungen für das Individuum führen kann.
ES-PS 9 001 680 offenbart auch ein Verfahren zur Herstellung der 4-O-β-Galactopyranosyl-D-xylose, das im wesentlichen eine Synthese umfasst, ausgehend von einem Benzyl-β-D-xylopyranosid, worauf Arbeitsabläufe folgen, die eine selektive Schutzreaktion, eine Glykosylierung und eine Entfernung der Schutzgruppen betreffen. Sowohl die Anzahl der Reaktionsstufen, die Verwendung von teuren Reaktionsmitteln, wie z. B. Silbertriflat in der Glycosylierungsreaktion, und die Verwendung von chromatografischen Säulen bei der Reinigung von Intermediaten und dem Endprodukt erzeugen Kosten und stellen Schwierigkeiten für die Durchführung des Verfahrens in einem industriellen Umfang dar.
Andererseits offenbaren Gorin et al. in "The Synthesis of β-Galacto- and β-Gluco-pyranosyl disaccharides by 'Sporobolomyces Singularis'", Can. J. Chem. 42 (1964), 2307-2319, die Synthese einer Vielzahl von Disacchariden, unter denen sich 2-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose und 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose befinden, durch ein rein experimentelles Verfahren. In dieser Veröffentlichung wird der Schluss gezogen, dass die Produkte, die sich aus der Übertragung von Galactosyl ergeben, bei der Verwendung verschiedener Akzeptoren, im wesentlichen mehr auf der Substitution der sekundären Hydroxylgruppen als der primären Hydroxylgruppen basieren, wobei die minimale Anforderung an die Struktur für die Reaktion mit einem Akzeptor das Hydroxyl, benachbart zu der substituierten Hydroxylgruppe, zu sein scheint. In dieser Veröffentlichung wird jedoch keine Verwendung der diversen synthetisierten Disaccharide offenbart.
Um die Nachteile des früher beschriebenen Standes der Technik zu lösen, ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, β-D-Galactopyranosyl-D-xylosen, insbesondere 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose, zusammen mit
2-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose der allgemeinen Formel (II):
und 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose der allgemeinen Formel (III):
für die Herstellung von Zusammensetzung und Lösungen zu verwenden, die für eine blutfreie und verlässliche Überprüfung von intestinaler Lactase verwendet werden.
Andererseits ist es eine andere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das die Herstellung von β-D- Galactopyranosyl-D-xylosen ermöglicht, deren Verwendung beansprucht wird, zusammen mit anderen β-D- Galactopyranosyl-D-xylosen, durch ein vereinfachtes Verfahren gegenüber konventionellen Verfahren dieser Art für Disaccharide.
Die β-D-Galactopyranosyl-D-xylosen, d. h. die 2-O-β-D- Galactopyranosyl-D-xylose und die 3-O-β-D- Galactopyranosyl-D-xylose, deren Verwendung beansprucht wird, weisen eine Affinität für die Lactase auf, die gegenüber den konventionell verwendeten Disacchariden bei dieser Art von Überprüfungen deutlich erhöht ist, was überraschend ist, im Hinblick auf die Tatsache, dass beide Verbindungen der Lactose gegenüber strukturell weniger verwandt sind als die vorher verwendeten Verbindungen, wie z. B. 4-O-β-Galactopyranosyl-D-xylose, von denen sie sich strukturell durch verschiedene Hydroxylgruppen, jeweils benachbart zur glykosidischen Bindung im Molekül, unterscheiden.
Die Disaccharide der Formeln (II) und (III) können in Zusammensetzungen und Lösungen enthalten sein, die selbst konventionell sind, individuell oder zusammen und vermischt mit einer Quantität konventioneller Disaccharide der Formel (I) und mit geringeren Quantitäten an Lactose. Solche Zusammensetzungen und Lösungen können Mengen an Bestandteilen enthalten, die selbst konventionell sind, pharmazeutisch akzeptabel, von mindestens einem ausgewählten Additiv unter den Stabilisatoren, Schutzmitteln, Geschmacksverstärkern, Lactose, gelbildenden Mitteln, fluidbildenden Mitteln und Konservierungsmitteln. Die Lösungen können Wasser, wässrige oder Salzlösungen sein, die selbst konventionell sind.
Es wurde beobachtet, dass, wenn eine Mischung der drei Disaccharide (I), (II) und (III) verwendet wird, die Überprüfung der intestinalen Lactaseaktivität durch die im eliminierten Urin vorliegende Xylose deutlich gegenüber der möglichen Überprüfung erhöht ist, wenn nur das Disaccharid (I) verabreicht wird, was deutlich die überraschende Wirkung, die der Erfindung innewohnt, demonstriert.
Das Verfahren gemäss der Erfindung beinhaltet die Möglichkeit zur Herstellung von β-D-Galactopyranosyl-D- xylose, was die vorher angegebenen Disaccharide (I), (II) und (III) beinhaltet, und umfasst die folgenden Stufen: Umsetzung einer D-Xylose und eines Substrats von β-D- Galactopyranosid in Gegenwart von einem β-Galactosidaseenzym gemäss dem Reaktionsschema
wobei die Konzentration der D-Xylose 2 bis 20 mal über der des β-D-Galactopyranosids liegt, in einem wässrigen Medium, auf einen pH von 5,0 bis 9,0 gepuffert und bei einer Temperatur zwischen 4 und 37ºC; Deaktivierung der β-Galactosidase durch Erwärmung auf 100ºC, wenn der Maximalertrag der Bildung von nachgewiesenen Disacchariden durch eine Dünnschichtchromatografie oder durch eine Aktivkohlesäule erreicht wird (normalerweise nach 4 bis 8 Stunden), und Isolierung der gebildeten Disaccharide durch Filtration in einer gepackten Säule mit einem Verdünnungsmittel, ausgewählt aus Wasser oder Wasser/Alkohol, wodurch eine Mischung aus Disacchariden (I), (II) und (III) erhalten wird, die in Zusammensetzungen oder Lösungen als Mischungen der drei Disaccharide oder als Mischung, nach korrespondierender Isolation eines der Disaccharide (II) oder (III) mit dem Disaccharid (I) eingesetzt werden kann.
In einer Ausführungsform des Verfahrens ist das verwendete β-D-Galactopyranosid O-Nitrophenyl, β-D-Galactopyranosid, während es sich bei einer anderen Ausführungsform um Lactose handelt.
Andererseits kann die β-Galactosidase z. B. diejenige von Escherichia coli sein, z. B. kommerziell vermarktet von der spanischen Firma Sigma-Aldrich Quimica, S. A.
Das Verfahren kann in Gegenwart von Co-Lösungsmitteln, die in Wasser mischbar sind, durchgeführt werden, wie z. B. Acetonitril, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid.
Die für die Isolierung der Disaccharide verwendeten Filtrationssäulen können mit SephadexTM G-10 oder BiogelTM P2 oder mit Aktivkohle gepackt sein.
Die Disaccharide (II) und (III) können als solche auch über andere konventionelle Verfahren erhalten werden, wie z. B. die von Gorin et al. offenbarten "The Synthesis of β-Galacto and β-Gluco-pyranosyl disaccharides by Sporobolomyces Singularis, Can. J. Chem. 42(1964), 2307-2319.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR:

Die einzige Figur ist eine grafische Darstellung der Entwicklung der (a) Hydrolyse in vivo einer Mischung von β-D-Galactopyranosyl-D-xylose (I), (II) und (III) als Prozentzahl der über Urin eliminierten Xylose und (b) der intestinalen Lactaseaktivität (nm/min/mg Protein) während des Wachstums von Ratten, wie in den Beispielen beschrieben.

AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG:

Die folgenden Beispiele beschreiben mit illustrativem, jedoch nicht begrenzendem Charakter, relevante Aspekte der Erfindung.

BEISPIEL 1

Herstellung einer Mischung von 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D- xylose (Disaccharid (I)), 2-O-β-D-Galactopyranosyl-D- xylose (Disaccharid (II)) und 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D- xylose (Disaccharid (III)):

Zu einer Lösung aus O-Nitrophenyl-β-galactopyranosid (4 g, 50 mM) und Xylose (20 g, 500 nM) in gepuffertem Wasser (0,05 M KH&sub2;PO&sub4;, 1 mM MgCl&sub2;, 5 mM Mercaptoethanol, 265 ml, pH 7,0) wurde β-Galactosidase von E. coli von Sigma (1,5 mg, 560 U) zugefügt und die Mischung wurde für 5 Stunden und 45 Minuten bei 25ºC inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit wurde die Mischung für 10 Minuten auf 100ºC erwärmt, konzentriert und der resultierende Rest wurde in eine Säule aus Aktivkohle unter Verwendung eines Gradienten von Wasser-Ethanol 1 : 0 → 85 : 15 eingeführt. Zunächst wurden die Monosaccharide Xylose und Galactose eluiert und darauffolgend die Mischung der Disaccharide (I), (II) und (III), wobei 2 g der Mischung der Disaccharide erhalten wurde (50% in bezug auf die Äquivalente des anfänglichen O-Nitrophenyl-β- galactopyranosids) in einem Verhältnis (I) : (II) : (III) von 8,6 : 1,4 : 1,0.
Von den unterschiedlichen Funktionen, die die Disaccharide (I), (II) und (III) umfassen, wurden einige abgetrennt, wobei alle rein waren, die dann verwendet wurden, um sie durch NMR zu charakterisieren. Das ¹H-NMR-Spektrum (300 MHz, D&sub2;O), gemessen mit einem Varian XL-300- Spektrometer, der Fraktionen mit dem Disaccharid (I) war identisch zu dem vorher hergestellten Produkt.
Zur Lösung der Aufgabe einer Charakterisierung und klaren Bestimmung der Regiochemie der in den Disacchariden (II) und (III) gebildeten Bindung wurden die in diesen Verbindungen angereicherten Fraktionen acetyliert und die resultierenden Produkte wurden durch eine halbpräparative HPLC isoliert (normale Phasensäule SiO&sub2;, Ethylhexan-Acetat 1 : 1, Nachweis durch Brechungsindex. Darauffolgend wurde das ¹H-NMR-Spektrum (300 MHz, CDCl&sub3;) von jedem der erhaltenen Derivate aufgenommen.
- Acetyliertes Derivat von 2-O-β-D-Galactopyranosyl-O- D-xylopyranose.
- Acetyliertes Derivat von 2-O-β-D-Galactopyranosyl-β- D-xylopyranose.
- Acetyliertes Derivat von 3-O-β-D-Galactopyranosyl-O- D-xylopyranose.
- Acetyliertes Derivat von 3-O-β-D-Galactopyranosyl-β- D-xylopyranose.
Das Verhältnis der in der chromatografischen Säule erhaltenen Disaccharide (I), (II) und (III) wurde durch Gaschromatografie mit einem Chromatographen bestimmt, der mit einem Flammionisierungsdetektor ausgerüstet war, sowie mit einer Kapillarsäule SE-54 (stationäre Phase: 5% Diphenyl und 95% Dimethylpolysiloxan, 15 m lang, 0,15 mm innerer Durchmesser und um-Dicke). In der Analyse wurde ein Stickstofffluss von 1 ml/min verwendet. Die verwendeten Temperaturprogramme waren die folgenden: anfängliche Temperatur 160ºC; anfängliche Zeit: 2 Minuten; Temperaturanstieg: 5ºC/min. Endtemperatur: 250ºC. Die Proben wurden nach Trimethylsilylierung durch das folgende Protokoll analysiert: Ein Aliquot (10 ul) wurde auf 100ºC für 10 Minuten erwärmt, woraufhin Pyridin (25 ul) zugefügt wurde, das als innere Referenz Benzyl-β-xylopyranosid (10 mM) und N-Trimethylsilylimidazol (25 ul) enthielt, woraufhin das Erwärmen bei 60ºC 30 Minuten fortgesetzt wurde. Die Retentionszeiten der Peaks, die den unterschiedlichen Disacchariden zuzuordnen waren, waren die folgenden:
- Benzyl-β-xylopyranosid (innere Referenz): 12,04 min
- Disaccharid (I): 20,35 und 20,50 min
- Disaccharid (II) 18,46 und 19,50 min
- Disaccharid (III) 18,30 min

BEISPIEL 2

Kinetischer Test der in vitro-Hydrolysierung:

Die Disaccharide (I), (II) und (III) und Lactose wurden gemäss dem Verfahren von A. Rivera-Sagredo, F. J. Cañada, O. Nieto, J. Jiménez-Barbero und M. Martin-Lomas, Eur. J. Biochem., 209 (1992), 415-422, hydrolysiert, mit einer intestinalen Lactase von Schaf bei pH 6,0 mit den folgenden Ergebnissen im Hinblick auf die Konstanten von Michaelis (Km) und maximalen Raten (Vmax):
Es kann beobachtet werden, dass die Michaelis-Konstanten der Disaccharide (II) und (III) deutlich niedriger waren als die des Disaccharids (I), wobei die Km des Disaccharids (III) sogar niedriger war als die von Lactose, was die ungewöhnliche Affinität der Disaccharide (II) und (III) für Lactase deutlich macht.

BEISPIEL 3

Eliminierung von Xylose in Urin nach oraler Verabreichung einer Mischung der Disaccharide (I), (II) und (III):

Eine Mischung der Disaccharide (I), (II) und (III) (in einem Verhältnis von 8,6 : 1,4 : 1,0), hergestellt gemäss dem Verfahren von Beispiel 1, wurde verwendet, um die Aktivität von intestinaler Lactase zu überprüfen. Hierfür wurde eine Gruppe von 17 gestillten Sprague-Dawley-Ratten aus demselben Wurf und mit einem Alter von 12 Tagen jeweils ohne Essen während 6 Stunden, getrennt von ihrer Mutter, gehalten. Nach Ablauf dieser Zeit wurde der Basalurin von jedem Tier durch vesikalen transabdominalen Druck gesammelt und sofort wurden 18,2 mg der verdünnten Disaccharidmischung in 0,3 ml destilliertem Wasser jeder Ratte unter Verwendung eines intragastrischen Stiletts verabreicht. Von diesem Moment an wurde Urin während der folgenden 5 Stunden gesammelt, wobei in demselben die eliminierte Xylose durch colorimetrische Analyse, basierend auf der Fluorglucinol-Reaktion unter Verwendung des Basalurins als Ziel, gemessen wurde. Direkt nach dem Sammeln des Urins wurden 3 der Tiere, bei denen die Lactaseaktivität in der intestinal mucosen Membran direkt bestimmt wurde, geopfert. Hiervor wurde ein Bereich des Dünndarms getrocknet und gewaschen, die mucose Membran wurde durch Kratzen mit einem Glas gesammelt und homogenisiert, die Lactaseaktivität wurde spektrofotometrisch in dem homogenisierten Produkt gemessen. Die verbliebenen Tiere wurden wieder zur Mutter zurückgebracht und das Experiment wurde mit ihnen unter ähnlichen Bedingungen nach 15, 18, 21, 24 und 30 Tagen wiederholt, woraufhin der Wurf ausgelöscht wurde. Die resultierenden durchschnittlichen Werte des Experiments wurden in die Figur eingefügt, worin die Hydrolyse der Disaccharid (I)-, (II)- und (III)-Mischung in vivo und die intestinale Lactaseaktivität während des Wachstums der Ratten wiedergegeben ist. Um dies zu erreichen, ist die Eliminierung der Xylose (%) [Kurve (a)] zusammen mit der Lactaseaktivität (nm/min/mg Protein) [Kurve (b)] gegen das Alter (in Tagen) aufgetragen. Die Ergebnisse dieses Experiments geben folgendes an: (1) dass die Gegenwart von Xylose im Urin nachgewiesen wird, resultierend aus der Hydrolyse der verabreichten Disaccharide durch Wirkung der intestinalen Lactate, und (2) dass der Verlauf der Eliminierung von Xylose in Urin, sich ergebend aus der oralen Verabreichung, parallel zu der bekannten physiologischen Modifizierung der intestinalen Lactaseaktivität verläuft, die während der Dauer der Entwicklung eines Individuums abnimmt. Dieses Experiment demonstriert, dass das Verfahren für die in vivo- Überprüfung der intestinalen Lactaseaktivität geeignet ist, wobei das Verfahren für die Überprüfung dieser Aktivität in blutfreier Weise mit diagnostischen Zielen verwendet wird, und eine besondere Anwendbarkeit bei gestillten Individuen aufweist, bei denen ein Auftreten einer Defizienz des Enzyms vermutet wird.

BEISPIEL 4

Eine Gruppe von gestillten Sprague-Dawley-Ratten desselben Wurfs und mit einem Alter von 15 Tagen wurde ohne Essen für 4 Stunden in Stoffwechselboxen bei 30ºC gehalten. Jeder von ihnen wurden 18,2 g des Disaccharids (I) in 0,5 ml destilliertem Wasser verabreicht. Urin wurde von den Tieren gesammelt, wobei die Blase transabdominal nach 5 Stunden gedrückt wurde. Die über den Urin eliminierte Xylose über diesen Zeitverlauf wurde spektroskopisch überprüft. Die Eliminierung der Xylose lag bei 21%, d. h. bei weniger als der Hälfte im Vergleich mit dem Ergebnis der Mischung der Produkte (I), (II) und (III) nach 15 Tagen.
Durch Vergleich der Daten aus diesem Beispiel mit denjenigen des Beispiels 3 wird klar, dass die in vivo- Affinitäten der Disaccharide (II) und (III) so hoch sind, dass sie sogar die schlechteste Affinität des Disaccharids (I) kompensieren, wenn die drei Disaccharide in einer Mischung verabreicht werden, in der das Disaccharid (I) vorherrscht.

Claims

1. Verwendung von 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose mit mindestens 2-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose oder 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose für die Herstellung einer Zusammensetzung oder einer Lösung für die Bestimmung intestinaler Lactase.

2. Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung eine pharmazeutisch akzeptable Menge mindestens eines Additivs umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Stabilisatoren, Schutzstoffen, Geschmacksverstärkern, Lactose, gelbildenden Mitteln, fluidbildenden Mitteln und Konservierungsmitteln.

3. Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei die Lösung eine wässrige Lösung ist.

4. Verwendung gemäss Anspruch 1 oder 3, wobei die Lösung eine wässrige Salzlösung ist.

5. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1, 3 oder 4, wobei die Lösung weiterhin eine pharmazeutisch akzeptable Menge mindestens eines Additivs enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Stabilisatoren, Schutzstoffen, Geschmacksverstärkern, Lactose und Konservierungsmitteln.

6. Enzymatisches Verfahren für die Herstellung einer Mischung aus 2-O-, 3-O- und 4-O-β-D-Galactopyranosyl- D-xylosedisacchariden, wobei das Verfahren folgendes beinhaltet:

(a) Umsetzung einer D-Xylose und eines D-Galactopyranosid-Substrats in Gegenwart eines β-Galactosidase-Enzyms in einer Konzentration des D-Xylose/β-Galactopyranosid-Substrats von 2-20 : 1, in einem wässrigen Medium, gepuffert auf einen pH zwischen 5 und 9 und bei einer Temperatur zwischen 4 und 37ºC;

(b) Deaktivierung des β-Galactosidase-Enzyms durch Erwärmung auf 100ºC, wenn der maximale Ertrag der Bildung der Disaccharide auf der Grundlage einer Dünnschichtchromatografie erreicht ist;

(c) Isolierung der durch Filtration gebildeten Disaccharide in einer gepackten Säule mit einem Elutionsmittel, ausgewählt aus Wasser und Mischungen aus Wasser und Alkohol.

7. Verfahren gemäss Anspruch 6, wobei das β-Galactopyranosid-Substrat α-Nitrophenyl-β- galactopyranosid ist.

8. Verfahren gemäss Anspruch 6, wobei das β-Galactopyranosid-Substrat Lactose ist.

9. Verfahren gemäss Anspruch 6, wobei das β-Galactosidaseenzym β-D-Galactosidase von E. coli ist.

10. Verfahren gemäss Anspruch 6, wobei das Verfahren in Gegenwart von mindestens einem Co-Lösungsmittel durchgeführt wird, das mit Wasser mischbar ist.

11. Verfahren gemäss Anspruch 10, wobei das Co- Lösungsmittel ausgewählt ist aus Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Mischungen daraus.

12. Verfahren gemäss Anspruch 6, wobei die gepackten Säulen mit SEPHADEX G-10 oder BIOGEL P-2 gepackt sind.

13. Verfahren gemäss Anspruch 6, wobei die gepackten Säulen mit Aktivkohlenstoff gepackt sind.

14. Verfahren gemäss Anspruch 6, wobei die Disaccharide eine Mischung aus 2-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose, 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose und 4-O-β-D- Galactopyranosyl-D-xylose sind.

15. Verfahren gemäss Anspruch 6 oder 14, wobei mindestens eine der Verbindungen 2-O-β-D-Galactopyranosyl-D- xylose, 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose und 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-xylose aus den Disacchariden isoliert wird.