DE69616434T2

DE69616434T2 - Behälter für Mehrfachproben

Info

Publication number: DE69616434T2
Application number: DE69616434T
Authority: DE
Inventors: Klaus W. Berndt
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 2002-06-27
Anticipated expiration: 2016-06-27
Also published as: JPH0923875A; AU706915B2; US5891739A; DE69616434D1; AU5613096A; CA2179365A1; CA2179365C; JP2803811B2; SG63656A1; EP0751216A1; EP0751216B1; BR9602888A

Description

Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf einen Behälter für Mehrfachproben zum Reduzieren der Nachweisweiszeit (TTD) von biologischer Aktivität in Blutkulturen und für Mykobakterien in Körperfluida.

HINTERGRUND BESCHREIBUNG

Das Vorhandensein von biologisch aktiven Agenzien, wie Bakterien in einem Patientenkörperfluidum, insbesondere Blut, wird allgemein unter Verwenden von Blutkulturfläschchen bestimmt. Eine geringe Menge von Blut wird durch ein umhüllendes Kautschukseptum in ein steriles Fläschchen eingespritzt, das ein Kulturmedium enthält, und das Fläschchen wird dann bei 37ºC inkubiert und in bezug auf Mikroorganismuswachstum kontrolliert.
Eine der verwendeten Techniken zum Nachweisen des Vorhandenseins von Mikroorganismen schließt visuelle Prüfung ein. Allgemein, visuelle Prüfung umfaßt Kontrollieren der Trübung oder eventueller Farbänderungen der flüssigen Suspension von Blut- und Kulturmedium. Bekannte instrumentelle Verfahren weisen Änderungen in dem Kohlendioxidgehalt der Kulturflaschen nach, welches ein metabolisches Nebenprodukt von Bakterienwachstum ist. Kontrollieren des Kohlendioxidgehalts kann durchgeführt werden durch gut in der Technik etablierte Verfahren, wie radiochemische oder Infrarot Absorption bei einer Kohlendioxidspektralinie. Bis jetzt haben diese Verfahren invasive Verfahren erfordert, die zu dem gut bekannten Problem von Kreuzkontamination zwischen verschiedenen Fläschchenen führen. Es ist auch vorgeschlagen worden, Mikrooranismuswachstum in verschließbaren Behältern durch Kontrollieren positiver und/oder negativer Druckänderungen nachzuweisen.
Kürzlich sind nicht invasive Verfahren entwickelt worden, die chemische Sensoren, angeordnet innerhalb des Fläschchens, einschließen. Die Sensoren reagieren auf Änderungen in der Kohlendioxidkonzentration durch Ändern ihrer Farbe oder durch Ändern ihrer Fluoreszenzintensität. In bekannten automatisierten nicht-invasiven Blutkultursystemen sind individuelle Lichtquellen, spektrale Anregungs-/Emissionsfilter und Photodetektoren benachbart zu jedem Fläschchen angeordnet. Dieses führt zu Ortsempfindlichkeitsvariationen von einem Fläschchen zu dem nächsten. Zusätzliche Probleme werden durch die Alterungswirkungen der Lichtquellen, Filter und Photodetektoren erzeugt. Aufgrund der Tatsache, daß die meisten bekannten Blutkultursensoren nur ein mäßiges Kontrastverhältnis in dem gemessenen Photostrom während Bakterienwachstum erzeugen, werden umfangreiche und Zeit verbrauchende Kalibrierungsverfahren und hochentwickelte Nachweisalgorithmen verlangt, diese Systeme zu betreiben. Zusätzlich werden flexible elektrische Kabel verlangt, die einzelnen Quellen und Detektoren mit dem Rest des Instruments zu verbinden. Bei der großen Zahl von Lichtquellen, typischerweise 240 oder mehr, kann Aufrechterhaltung sehr mühsam und teuer werden, wenn individuelle Quellen beginnen, zu versagen.
Der Nachteil von auf Intensität basierenden Sensoranordnungen kann überwunden werden durch Verwenden von fluoreszierenden Sensoren, die ihre Lebensdauer ändern. In diesem Fall wird Intensitätsmessung durch Zeitparametermessung ersetzt, und Intensitätsänderungen haben keine Auswirkung auf das Sensorausgabesignal. Viele chemischen Sensormaterialien sind bekannt, die ihre Fluoreszenzlebensdauer mit Ändern von Sauerstoffkonzentration, pH, Kohlendioxidkonzentration oder anderen chemischen Parametern ändern.
Die Änderung in der Sensorfluoreszenzlebensdauer wird gewöhnlich kontrolliert durch Anwenden des gut bekannten Phasenverschiebungsverfahrens. Bei diesem Verfahren ist das Anregungslicht Intensitätmodulierte Fluoreszenzemission, die zu einer Intensität-modulierten Fluoreszenzemission führt, die relativ zu der Anregungsphase phasenverschoben ist. Der Phasenverschiebungswinkel θ hängt von der Fluoreszenzlebensdauer τ gemäß der Gleichung ab:
tanθ = ωτ (1)
wobei ω = 2πf die zirkuläre Lichtmodulationsfrequenz ist.
Eine Prüfung von Gleichung (1) zeigt, daß das Phasenverschiebungsverfahren maximale Auflösung dθ/dτ unter der Bedingung ωτ = 1 erlaubt. Unglücklicherweise haben beinahe alle bekannten pH oder Kohlendioxid-empfindlichen Flurophore Verzögerungszeiten im Bereich von 5 ns bis 500 ps. In anderen Worten, Lichtmodulationsfrequenzen f = 1/2πr im Bereich von 32 MHz bis 320 MHz würden verlangt.
Es ist möglich, Lichtintensitätsmodulation bei derartigen hohen Frequenzen durchzuführen, aber das verlangt Akusto-optische oder elektro-optische Modulatoren, die nur in Kombination mit Lasern wirksam sind. Ferner würde Nachweisen des modulierten Fluoreszenzlichts Hochgeschwindigkeits- Hochempfindlichkeits-Photodetektoren, wie Mikrokanal-Platten Photoelektronenvervielfacher erfordern, die ziemlich teuer sind. Folglich basieren alle kommerziellen automatisierten Blutkultursysteme auf Intensität kontrollieren, und keines von ihnen verwendet Zeit-aufgelöste fluoreszierende Kohlendioxidsensoren.
Selbst wenn es möglich sein würde, auf Fluoreszenzlebensdauer basierende Sensoren bei niedrigen Kosten zu betreiben, würden alle Proben-bezogenen Artefakte verbleiben. Insbesondere muß die sogenannte "Blut-Hintergrundswirkung" erwähnt werden, die eine kontinuierliche aber unvorhersehbare Änderung in der Fluoreszenzintensität und/oder Lebensdauer aufgrund des Metabolismus des Bluts selbst ist. Weil die Bluthintergrundswirkung von dem Donor, dem Wachstumsmedium, dem Blutvolumen und anderen Faktoren abhängen kann, ist es sehr schwierig oder unmöglich, zwischen Blut verwandten und Organismus verwandten Fluoreszenzänderungen zu unterscheiden. Folglich müssen die Nachweisalgorithmen "robust" sein, was zu einer relativ langen Nachweiszeit führt.
US-A-3 715 280 bezieht sich auf eine Minitestschale, die eine Anordnung von offen-getoppten Testbereichen von gleichem Volumen bildet, in das die Mikroorganismen getrennt eingeführt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Probenbehälter zur Verfügung gestellt, umfassend:
einen optisch transparenten Behälter zum Enthalten einer Probe und eines Kulturmediums,
einen Block innerhalb des optisch transparenten Behälters, wobei der Block eine Vielheit von Durchgangslöchern, getrennt durch eine Vielheit von Innenwänden und angeordnet in einem Muster, hat, eine Deckplatte mit einem kautschukartigem Septum, das in den Block gedrückt wird, so daß kein Gasaustausch zwischen dem Inneren des Behälters und dem Äußeren des Behälters auftritt, wobei der Block in den optisch transparenten Behälter an einer Stelle gedrückt wird, wo eine Spalte zwischen der unteren Seite des Blocks und der Innenbodenoberfläche des optisch transparenten Behälters zurückbleibt, und wobei die Deckplatte in den Block an einer Stelle gedrückt wird, so daß eine Spalte zwischen der Deckplatte und der oberen Seite des Blocks zurückbleibt, und
sterilisiertes Kulturgas mit einem Sub-Atmosphärendruckspiegel.
Der Probenbehälter ist geeignet für ein Verfahren, das umfaßt Einführen einer Standardmenge von Probe, wie Blut und ein Wachstumsmedium, in einen verschließbaren Behälter und Mischen der Probe mit dem Wachstumsmedium innerhalb des Behälters. Der Behälter ist entworfen, so daß durch Wirken auf den Behälter von der Außenseite die flüssige Probe innerhalb des Behälters in eine Anzahl von Teilproben geteilt wird, wobei jede Teilprobe ihren eigenen Kopfraum und ihr eigenes Abtastmittel hat. Die Anzahl von Teilproben, N, wird gewählt, größer als die Anzahl von primären Mikroorganismen zu sein, die erwartet in der Probe zu der Zeit, wo sie in den Behälter eingeführt wurde.
Im Vergleich zu einem Standardblutkulturbehälter ist die Anzahl von Mikroorganismen, die notwendig ist, eine typische Änderung in Gaskonzentration oder in anderen Parametern in einer Teilprobe zu erzeugen, Nfach reduziert, wenn das Volumen Nfach reduziert ist. Als eine Konsequenz werden weniger Mikroorganismen in einer Teilprobe benötigt, eine meßbare Änderung in einem Sensorausgabesignal zu erzeugen. Deshalb wird eine erste Reduzierung der Nachweiszeit erzielt.
Gemäß der gegenwärtigen Erfindung werden alle Teilproben in einer Raumanordnung angeordnet, die linear, zirkulär, rechtwinklig, hexagonal, statistisch verteilt sein kann oder andere Formen haben kann. Die Sensorsignale aller Teilproben werden miteinander verglichen, entweder visuell oder mittels eines Instruments. Mikroorganismuswachstum in einer oder mehr als einer Teilprobe erzeugt eine Änderung in dem Sensorsignal relativ zu Teilproben, die nicht Mikroorganismen enthalten. Eine Vollprobe wird dann als positiv angesehen, wenn mindestens eine Teilprobe ein Sensorsignal erzeugt, das unterschiedlich von den Signalen ist, erzeugt von ihren Nachbarn. Auf diese Weise wird Messung von Sensorsignal gegen Zeit in Messung von Sensorsignal gegen Abstand übertragen.
Alle die Teilproben, die nicht Mikroorganismen enthalten, wirken als "Vergleichsprobe", d. h. sie zeigen alle die Artefakte, die durch das Instrument, Probenalterung und Temperaturvariationen in dem Instrument erzeugt werden. Insbesondere zeigen die Vergleichsproben die sogenannte "Blut- Hintergrundswirkung". Aufgrund der Tatsache, daß in einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung nur Raumdifferenzen in den Sensorsignalen Mikroorganismuswachstum anzeigen, werden alle die Artefakte ausgestrichen, und eine beträchtlich verbesserte Sensorsignalauflösung wird praktisch. Deshalb wird eine zweite Reduzierung der Nachweiszeit ("TTD") erhalten.
Beide TTDS Reduktionen liefern eine wesentliche Verbesserung über existierende, auf Wachstum basierende Systeme. Beispielsweise kann eine TTD von 72 Stunden auf 12 Stunden verkürzt werden. Im Falle von Mykobakterien (TB) kann eine TTD von 35 Tagen auf 5 Tage verkürzt werden.
In einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist es nicht notwendig, Messungen der Sensorsignale gegen Abstand bei regelmäßigen Zeitintervallen durchzuführen. Deshalb haben Brüche beim Erwerben von Daten aufgrund von Türöffflungen zum Zwecke des Beladens und Entladens von Proben keine negative Wirkung. Wie zuvor erwähnt, wird die Wirkung von Temperaturfluktuationen aufgrund von Türöffnungen auch ausgestrichen, und es wird viel leichter, sogenannte "verzögerte" Fläschchen auf positives Verhalten zu prüfen, weil positives Verhalten ein permanentes Intensität-gegen-Abstand Muster erzeugt, das zu irgendeiner Zeit herausgelesen werden kann.
Es ist auch möglich, jede Teilprobe mit mindestens zwei verschiedenen Abtastmittel auszustatten, was Mikroorganismusidentifizierung zusätzlich zum Nachweis durch Analysieren verschiedener Sensordaten erlaubt.
Diese und andere Aspekte, Merkmale und Vorteile der gegenwärtigen Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung, genommen in Verbindung mit den Begleitzeichnungen, offenkundig.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt einen Plot, der berechnete TTD für Bakterien gegen die Zahl von Reihen von Teilproben unter der. Annahme eines quadratischen Formats einer zweidimensionalen Anordnung darstellt,
Fig. 2 zeigt einen Plot, der berechnete TTD für Bakterien gegen die Anzahl von Organismen darstellt, die zum Durchführen von Nachweis verlangt werden,
Fig. 3 zeigt einen Plot, der berechnete TTD für Bakterien gegen die Anzahl von Organismen darstellt, die benötigt werden, Nachweis durchzuführen, wobei die Reduzierung in TTD, erzielt durch Teilen der Probe in 40 · 40 Teilproben, in Betracht gezogen wird,
Fig. 4 zeigt einen Plot, der berechnete TTD für Mykobakterien gegen die Zahl von Reihen von Teilproben unter der Annahme eines quadratischen Formats der zweidimensionalen Anordnung darstellt,
Fig. 5 zeigt einen Plot, der berechnete TTD für Mykobakterien gegen die Zahl von Organismen darstellt, die zum Durchführen von Nachweis verlangt werden,
Fig. 6 zeigt berechnete TTD für Mykobakterien gegen die Zahl von Organismen, die zum Durchführen von Nachweis verlangt werden, wobei die Reduzierung an TTD, erzielt durch Teilen der Probe in 40 · 40 Teilproben, in Betracht gezogen wird,
Fig. 7 zeigt berechnete TTD für Mykobakterien gegen die Zahl von Mikroorganismen, die zum Durchführen von Nachweis verlangt werden, wobei die Reduzierung an TTD, erzielt durch Teilen der Probe in 10 · 10 Teilproben, in Betracht gezogen wird.
Fig. 8 zeigt einen Querschnitt eines leeren Probenbehälters gemäß der gegenwärtigen Erfindung,
Fig. 9 zeigt einen Querschnitt eines Probenbehälters während des Verfahrens des Einspritzens der Probe,
Fig. 10 zeigt einen Querschnitt eines Probenbehälters nach Einspritzen der Probe und Anwenden einer Außenkraft zum Teilen der Probe;
Fig. 11A zeigt einen Querschnitt eines leeren Probenbehälters mit einem fluoreszierenden chemischen Sensor,
Fig. 11B zeigt eine Bodenansicht des in Fig. 1 IA gezeigten Behälters, nachdem er beimpft und inkubiert ist,
Fig. 12A zeigt einen Querschnitt eines leeren Probenbehälters, entworfen für gestreute Photonenmigration,
Fig. 12B zeigt eine Bodenansicht des in Fig. 12A gezeigten Behälters, nachdem er beimpft und inkubiert worden ist,
Fig. 13 zeigt eine Vorrichtung zum Nachweisen von Mikroorganismen gemäß der gegenwärtigen Erfindung,
Fig. 14 zeigt ein experimentelles Ergebnis, das die Reduzierung an TTD aufgrund eines kleineren Probenvolumens veranschaulicht,
Fig. 15 zeigt ein experimentelles Ergebnis, das die Reduzierung an TTD durch Vergleichen der Sensorsignale mit zwei Teilproben veranschaulicht,
Fig. 16 zeigt eine alternative Ausführungsform eines Probenbehälters gemäß der vorliegenden Erfindung,
Fig. 17 zeigt den alternativen Probenbehälter während des Verfahrens des Einspritzens der Probe, und
Fig. 18 zeigt den alternierenden Probenbehälter nach Einspritzen der Probe und Anwenden einer Außenkraft zum Teilen der Probe.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Standardmenge von Probe, wie Blut und Wachstumsmedium, in einen verschließbaren Behälter eingeführt und gründlich zusammengemischt. Wenn die Probe eine geringe Anzahl von Mikroorganismen, Ko, unmittelbar nach Beimpfen umfaßt, dann ist die Zahl von Mikroorganismen K(t) zu einem späteren Zeitpunkt t gegeben durch die Gleichung
K(t) = Koexp(In2t/td)(2)
wobei td die Verdopplungszeit der besonderen in der Probe vorhandenen Mikroorganismenart ist.
Üblicherweise wird eine bestimmte Minimumkonzentration von Mikroorganismen pro Einheitsvolumen, Cmin, in dem Behälter zum Erzeugen einer nachweisbaren Änderung in dem Sensorausgabesignal verlangt. Die Minimumkonzentration Cmin bezieht sich auf eine Minimumzahl von Mikroorganismen Kmin über die Gleichung
Kmin = Cmin V&sub0; (3)
wobei V&sub0; das Volumen des gesamten Behälters ist.
In einer Vorrichtung gemäß der gegenwärtigen Erfindung ist das Probenvolumen V&sub0; in N getrennte Untereinheiten vom Wert V geteilt durch Wirken auf den Probenbehälter von der Außenseite. Das Volumen V ist
V = V&sub0;/N (4)
Durch Kombinieren von Gleichungen (2) bis (4) erhalten wir die Nachweiszeit TTD, die für eine Mikroorganismuspopulation in einer Untereinheit von Volumen V zum Erzielen der Minimumkonzentration Cmin verlangt wird
Beim Ableiten von Gleichung (5) haben wir angenommen, daß nur ein einzelner Mikroorganismus in der Untereinheit nach Beimpfung vorhanden war, d. h. wir haben K&sub0; = 1 gesetzt. Auch haben wir die sogenannte "lag Phase" vernachlässigt, d. h. ein bestimmtes Zeitintervall, das der Mikroorganismus üblicherweise benötigt, Vervielfachen nach Beimpfung zu beginnen.
Unter der Annahme eines Behälters von quadratischem Format mit n Reihen und n Kolonnen von Untereinheiten erhalten wir mit
N = n² (6)
für die Zeit zum Nachweis eines Behälters gemäß der vorliegenden Erfindung
Fig. 1 beschreibt eine Familie von Plots, die die Nachweiszeit TTD gegen die Zahl von Reihen gemäß Gleichung (7) zeigt. Die verschiedenen Kurven entsprechen verschiedenen Arten von Mikroorganismen mit typischen TTD Werten von 120, 96, 72, 48, 24 und 12 Stunden, gemessen in gebräuchlichen auf Wachstum basierenden Kulturinstrumenten. Diese TTD Werte entsprechen n = 1, d. h. einer Reihe und einer Kolonne in Fig. 1.
Wie aus Fig. 1 gesehen werden kann, kann der gebräuchliche TTD Wert beträchtlich durch Teilen eines Probenbehälters gemäß der gegenwärtigen Erfindung in eine Anzahl von Untereinheiten reduziert werden. Diese Zeitersparnisse sind für lange TTD Werte entschiedener. Eine gebräuchliche TTD von 120 Stunden würde auf 56 Stunden unter Verwenden eines Probenbehälters mit 40 Reihen und 40 Kolonnen reduziert werden. In anderen Worten die TTD würde um 64 Stunden oder 2,66 Tage reduziert werden. Die Zeitersparnisse würden nur 6 Stunden für eine gebräuchliche TTD von 12 Stunden sein.
Fig. 2 veranschaulicht einen zweiten Vorteil, erhalten durch Verwenden eines Probenbehälters gemäß der gegenwärtigen Erfindung. Dieses ist eine Reduzierung in der Anzahl von Organismen, verlangt für Nachweis, aufgrund einer erhöhten Sensorsignalauflösung. Wegen der beinahe vollständigen Löschung von gebräuchlicherweise erfahrenen Artefakten erscheint es durchführbar, die benötigte Anzahl von Organismen um eine oder zwei Größenordnungen zu reduzieren. Fig. 2 beschreibt Plots, die die erwartete Wirkung auf die TTD zeigen, wenn eine gebräuchliche Anzahl Kmin = 10&sup6; herunter auf 10&sup5; oder sogar 10&sup4; reduziert werden könnte.
Fig. 3 zeigt die kombinierten Wirkungen des Teilens der Probe in 40 · 40 Untereinheiten und des Verringerns der Zahl von benötigten Organismen. Wie aus dieser Figur gesehen werden kann, kann eine gebräuchliche TTD von 120 Stunden auf 16 Stunden verkürzt werden, entsprechend einer Zeitersparnis von 104 Stunden oder 4,33 Tagen. Eine gebräuchliche TTD von 12 Stunden kann auf 2 Stunden verkürzt werden. Es muß betont werden, daß Fig. 1, 2 und 3 berechnete TTD Werte zeigen. Aufgrund der Tatsache, daß eine zweite Komponente, die zu der Gesamt TTD, d. h. der lag Phase, beiträgt, in der Analyse vernachlässigt worden ist, werden die tatsächlichen Zeitersparnisse für schnell wachsende Mikroorganismen geringer als die berechneten sein.
Fig. 4 beschreibt eine Familie von Plots, die die Nachweiszeit TTD für Mykobakterien gegen die Zahl von Reihen n gemäß Gleichung (7) zeigt. Die verschiedenen Kurven entsprechen verschiedenen Arten von Moykobakterien mit typischen TTD Werten von 35, 28, 21, 14 und 7 Tagen, gemessen in herkömmlichen, Wachstum basierenden TB Kulturinstrumenten. Wiederum entsprechen diese TTD Werte n = 1, d. h. einer Reihe und einer Kolonne in Fig. 4.
Wie aus Fig. 4 gesehen werden kann, kann der gebräuchliche TTD Wert beträchtlich durch Teilen eines Probenbehälters in eine Anzahl von Untereinheiten reduziert werden. Wie im Falle von Bakterien sind die Zeitersparnisse entschiedener für lange TTD Werte. Eine gebräuchliche TTD von 35 Tagen würde auf 16 Tage reduziert werden bei Verwenden eines Probenbehälters mit 40 Reihen und 40 Kolonnen. In anderen Worten die TTD würde um 19 Tage reduziert sein. Die Zeitersparnisse würden 4 Tage für eine gebräuchliche TTD von 7 Tagen sein.
Fig. 5 veranschaulicht den zweiten Vorteil eines Probenbehälters gemäß der gegenwärtigen Erfindung für Mykobakterien, d. h. eine Reduzierung in der Zahl von für Nachweis benötigten Organismen. Fig. 5 beschreibt Plots, die die erwartete Wirkung auf die TTD zeigen, wenn eine gebräuchliche Zahl Kmin = 10&sup6; herunter auf 10&sup5; oder sogar auf 10&sup4; reduziert werden könnte.
Fig. 6 zeigt die kombinierten Wirkungen des Teilens der Probe in 40 · 40 Untereinheiten und Verringerns der Zahl der benötigten Organismen. Wie aus Fig. 6 gesehen werden kann, kann eine gebräuchliche TTD von 35 Tagen auf 5 Tage verkürzt werden, einer Zeitersparnis von 30 Tagen entsprechend. Eine gebräuchliche TTD von 7 Tagen kann auf einen Tag verkürzt werden. Wiederum muß betont werden, daß Fig. 4, 5 und 6 berechnete TTD Werte zeigen, und daß die tatsächlichen Zeitersparnisse geringer als die berechneten sein können.
Fig. 7 entspricht Fig. 6, aber zeigt die erwarteten Reduzierungen in den TTD für einen quadratischen Probenbehälter mit nur 10 · 10 Untereinheiten. Selbst mit einer derartig geringen Anzahl von Reihen kann eine typische TTD von 35 Tagen auf nur 12 Tage reduziert werden.
Eine Querschnittsansicht eines Probenbehälters 1, der die gleichen Prinzipien und Konzepte der Erfindung verkörpert, ist in Fig. 8 gezeigt. Ein Proben- und Kulturmedium werden in einen optisch transparenten Behälter 2 mit einem elastischen Block 3 eingeführt. Block 3 paßt fest in Behälter 2 und umfaßt eine Vielheit von Durchgangslöchern 5, die durch Innenwände 4 getrennt sind und in einem regelmäßigem Muster angeordnet sind. Block 3 kann aus Kautschuk, Weichkunststoff oder anderen elastischen Materialien hergestellt sein.
Eine Deckplatte 6 mit einem kautschukartigem Septum 7 wird in das obere Teil von Block 3 in einer derartigen Weise gedrückt, daß kein Gasaustausch zwischen dem Inneren von Behälter 2 und der Außenseitenumgebung stattfinden kann. Block 3 wird in Behälter 2 nur so weit gedrückt, daß eine schmale Spalte 15 zwischen einer unteren Oberfläche 20 von Block 3 und einer Innenbodenoberfläche 8 von Behälter 2 zurückbleibt. Deckplatte 6 wird in Block 3 nur so weit gedrückt, daß eine schmale Spalte 25 zwischen einer unteren Oberfläche von Deckplatte 6 und einer oberen Oberfläche 30 von Block 3 zurückbleibt. Der verschlossene Behälter 2 wird mit einem Kulturgas mit einem Sub- Atmosphärendruckspiegel gefüllt und wird sterilisiert.
Fig. 9 zeigt Behälter 2 während des Verfahrens des Beimpfens dieses mit einem Kulturmedium und/oder einer Mikroorganismusprobe. Beimpfung wird unter Verwenden einer Spritze 10, die Kautschukseptum 7 durchdringt, durchgeführt. Während des Impfverfahrens wird Behälter 2 in einer horizontalen Orientierung gehalten, und wegen der zuvor genannten Spalten 15 und 25 werden das Kulturmedium und Probenmischung gleichmäßig auf der inneren Bodenoberfläche 8 von Behälter 2 verteilt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Außenkraft dann auf Deckplatte 6 nach Beimpfen der Mikroorganismusprobe angewendet. Aufgrund der Außenkraft bewegt sich Deckplatte 6 zu einer oberen Oberfläche 30 von Block 3, und Block 3 bewegt sich zu einer Innenbodenoberfläche 8 vom Behälter 2. Als ein Ergebnis wird die flüssige Probe in Durchgangslöcher 5 von Block 3 gedrückt und bildet eine Vielheit von getrennten Teilproben, die ihre eigenen Kopfräume haben. Fig. 10 zeigt Probenbehälter 1 nach Anwenden der Außenkraft, wobei Deckplatte 6 und Block 3 an Ort und Stelle mittels eines einfachen Sperrmechanismus, umfassend einen halb-starren Rahmen 11 und ein oder zwei Clips 12, gehalten werden.
Fig. 11A veranschaulicht einen Probenbehälter 100 mit einem fluoreszierenden chemischen Sensor 113, gleichmäßig auf einer Innenbodenoberfläche 108 eines Behälters 102 angeordnet. Um einen Probenbehälter 100 nach Mikroorganismuswachstum abzufragen, wird die Bodenoberfläche 108 von Behälter 102 mit einem Anregungslicht angestrahlt und durch eine CCD Kamera kontrolliert.
Fig. 11B beschriebt eine Bodenansicht eines Beiheften Probenbehälters 100, wie durch die CCD Kamera gesehen. Ein regelmäßiges Muster von Teilproben 105 zeigt drei Proben 110, 111, 112, eine erhöhte Fluoreszenzintensität emittierend, relativ zu ihren Nachbarn. In diesen drei Teilproben 110, 111 und 112 sind Mikroorganismen vorhanden. Alle die anderen Teilproben enthalten nicht Mikroorganismen und wirken als "Vergleichsproben", die alle die Artefakte zeigen, die durch das Instrument und Probenaltern erzeugt werden. Beispielsweise die sogenannte "Blut-Hintergrund Wirkung" und die Wirkungen von Herstellungsbezogenen Los-zu-Los Variationen in dem fluoreszierenden chemischen Sensor. Aufgrund der Tatsache, daß in einer Vorrichtung gemäß der gegenwärtigen Erfindung nur Raumunterschiede in der Fluoreszenzintensität Bakterienwachstum zeigen, werden alle Artefakte herausgestrichen und beträchtlich verbesserte Fluoreszenzintensitätsauflösung wird praktisch. Alles dieses führt zu einer zweiten Reduzierung der TTD.
Ein Probenbehälter gemäß der gegenwärtigen Erfindung ist nicht auf die Verwendung von fluoreszierenden chemischen Sensoren beschränkt. Fig. 12 zeigt ein Beispiel, wo gestreute Photonenmigration verwendet wird, eine Vielheit von Blutproben nach dem Vorhandensein von Bakterien abzufragen. In diesem Fall enthält Probenbehälter 200 nicht irgendeinen Sensor. Deckplatte 206 ist optisch transparent, und Probenbehälter 200 wird von oben mit Licht in dem roten Spektralbereich angestrahlt. Fig. 12B beschreibt eine Bodenansicht eines angeimpften Probenbehälters 200, wie durch eine CCD Kamera gesehen. Das regelmäßige Muster von Teilproben zeigt drei Proben 210, 211 und 212, eine verringerte Intensität von rotem Licht emittierend, relativ zu ihren Nachbarn. In diesen drei Teilproben sind Mikroorganismen vorhanden.
Der vierte dunkle Fleck 215 am Zentrum der Anordnung wird durch opakes Kautschukseptum 207 in Deckplatte 206 erzeugt. Dieser Zentrumsflecken ist in allen Probenbehältern vorhanden, entworfen zum Verwenden von gestreuter Photonenmigration. Der Ort dieses Fleckens in der zweidimensionalen Anordnung von Teilproben ist gut definiert und deshalb kann dieser Flecken von dem Analyseverfahren ausgeschlossen werden durch Anwenden entsprechender Software Messungen.
Es muß betont werden, daß ein Probenbehälter gemäß der vorliegenden Erfindung Kompensieren von beinahe allen Instrument-, Sensor- - und Proben-verwandten Artefakten aufgrund der vielen Teil- "Referenzproben", die verwendet werden, erlaubt. Als ein Beispiel derartiger Artefakte werden wir Türöffnungen zum Zwecke des Beladens und Entladens von Probenbehältern diskutieren.
In gebräuchlichen Blutkultur- und TB Instrumenten stellen Türöffnungen ein ernsthaftes Problem dar. Als eine Konsequenz des Türöffnens entkommt warme Luft aus dem Inneren, welches zu einer Haupttemperaturänderung innerhalb des Instruments führt. Diese Haupttemperaturänderung wiederum wirkt auf die Probenbehälter und erzeugt eine mehr oder weniger entschiedene Temperaturänderung bei dem chemischen Sensor innerhalb der Probenbehälter.
Die meisten Sensoren reagieren auf Temperaturänderungen mit einer Variation in dem Ausgabesignal. Es ist deshalb notwendig, das Verfahren von Datenerwerb für das gesamte Instrument während des Türöffnens und für ein bestimmtes Zeitintervall nach dem Türöffnen zu unterbrechen. Dieses Zeitintervall ist von der Ordnung von 0,5 bis 1 Stunde in Abhängigkeit von dem bestimmten Instrument- und Sensordesign. Unterbrechen der Datenerwerbssequenz führt zu Schwierigkeiten beim Anwenden empfindlicher Nachweisalgorithmen in bezug auf das Vorhandensein von Mikroorganismen. Insgesamt wird die TTD zunehmen, und die Wahrscheinlichkeit für Irrtümer beim Nachweisen des Vorhandenseins oder Fehlens von Mikroorganismen wird sich auch erhöhen.
Im Unterschied zu gebräuchlichen Instrumenten haben Türöffnungen beinahe keine Wirkung in einem Instrument gemäß der Erfindung. Eine Türöffnung wird auch eine mehr oder weniger entschiedene Temperaturänderung in einem Probenbehälter gemäß der gegenwärtigen Erfindung erzeugen, jedoch wird dieses zu einer mehr oder weniger homogenen Temperaturänderung über die gesamte Anordnung von Teilproben führen. Weil eine homogene Temperaturänderung aufgrund des Bestehens der Teil- "Referenzproben" kompensiert wird, in denen die Teilsensoren auf die Temperaturänderung in der gleichen Weise reagieren wie die Teilsensoren es in Untereinheiten tun, die Mikroorganismuswachstum zeigen, treten keine Probleme auf.
Irgendeine homogene Temperaturänderung wird immer geringe "räumliche Frequenzen" zeigen, d. h. die räumliche Temperaturverteilung über die Anordnung von Teilproben variiert langsam mit dem Abstand. Im Unterschied dazu: Mikroorganismuswachstum in isolierten Teilproben wird immer hohe "räumliche Frequenzen" erzeugen, d. h. das Sensorsignal wird sich von einer Untereinheit zu der nächsten ändern. Deshalb können Temperaturbezogene Artefakte eliminiert werden durch Anwenden des Verfahrens von räumlichen Frequenzfiltern, welches gut bekannt im Bereich von elektronischem Bildverarbeiten ist. In anderen Worten, das durch die CCD Kamera erzeugte Bild wird in bezug auf Intensitätsänderungen geprüft, die über einen charakteristischen Abstand in der Ordnung des Durchmessers einer Teilprobe auftreten. Sensorsignaländerungen, die über große Abstände auftreten, sind ausgeschlossen. Auf diese Weise wird eine Hochsensorsignalauflösung praktisch, die zu einer TTD Reduzierung führt. Ähnliche Betrachtungen gelten für alle anderen zuvor genannten Artefakte.
Fig. 13 veranschaulicht schematisch eine Vorrichtung 300 zum Nachweisen von Mikroorganismen gemäß der gegenwärtigen Erfindung. Ein Probenbehälter 100, umfassend einen fluoreszierenden chemischen Sensor 113, ist gezeigt, als horizontal auf einer Einfassung 314 ruhend, mit hoch streuenden Innenoberflächen 320. Fluoreszenzsensor 113 in Behälter 100 wird mit einem Anregungslicht mittels einer Reihe von Anregungslichtquellen 315 angestrahlt, wobei Anregungsfilter 316 zwischen Quellen 315 und Sensor 113 angeordnet sind. Aufgrund der Tatsache, daß hoch streuende Innenoberflächen 320 vorhanden sind, empfängt Sensor 113 eine beinahe gleichmäßig verteilte Anregungsintensität.
Der gesamte durch Sensor 113 bedeckte Bereich und umfassend die Anordnung von Teilsensoren wird auf einer intensivierten CCD Kamera 319 mittels eines optischen Systems 317 abgebildet. Ein Emissionsfilter 318 ist zwischen optischen Systemen 317 und CCD Kamera 319 angeordnet. Die intensivierte CCD Kamera 319 ist gebildet aus einer üblichen CCD Kamera und einem Bildverstärker, vorzugsweise fasergekoppelt an das CCD Ziel. Die optoelektronische Nachweisempfindlichkeit der CCD Kamera wird wesentlich erhöht durch den Bildverstärker, der zu einem verbesserten Signal-zu-Rausch Verhältnis führt, sehr hohe Fluoreszenzintensitätsauflösung erlaubend.
Gemäß der gegenwärtigen Erfindung sind alle Teilproben in einer räumlichen Anordnung angeordnet, die linear, zirkulär, rechtwinklig, hexagonal, statistisch verteilt sein kann oder andere Formen haben kann. Die Sensorrsignale aller Teilproben werden miteinander verglichen, entweder visuell oder mittels eines Instruments mit Mikroorganismuswachstum in einer oder mehr als einer Teilprobe, eine Änderung in einem Sensorsignal erzeugend, relativ zu Teilproben, die nicht Mikroorganismen enthalten. Eine Gesamtprobe wird als positiv angesehen, wenn mindestens eine Teilprobe ein Sensorsignal erzeugt, das unterschiedlich von den Signalen, erzeugt durch ihre Nachbarn, ist. Auf diese Weise wird Messung von Sensorsignal gegen Zeit in Messung von Sensorsignal gegen Abstand übertragen.
In einer Vorrichtung gemäß der gegenwärtigen Erfindung ist es nicht notwendig, Messungen der Sensorsignale gegen Abstand bei regelmäßigen Zeitintervallen durchzuführen. Deshalb wird es viel leichter, sogenannte "verzögerte" Proben auf positives Verhalten zu untersuchen. Tatsächlich erzeugt eine Probe, die positiv vor Ankommen an dem Blutkulturinstrument wurde, ein permanentes Intensität-gegen- Abstandsmuster, das zu irgendeiner Zeit herausgelesen werden kann.
Das Konzept der gegenwärtigen Erfindung ist nicht auf chemische Sensoren beschränkt, die auf Fluoreszenz, Absorption, Kalorimetrie oder gestreuter Photonenmigration basieren. Das Konzept des Teilens der Gesamtprobe in Teilproben, wobei die Gesamtzahl von Teilproben größer als die Zahl von erwarteten Mikroorganismen in der Gesamtprobe ist, und Vergleichens der Sensorsignale der Teilproben miteinander, kann auch angewendet werden, wenn andere Mikroorganismusabtastmechanismen verwendet werden. Es würde möglich sein, beispielsweise alle Teilproben mit einem Paar von Elektroden auszurüsten und die Impedanz zu kontrollieren. Bei bekannten Impedanzkontrollgeräten erzeugen Artefakte wie Elektrodenpolarisation und Temperaturänderungen sehr ernste Nachweisprobleme, welches einer der Gründe ist, warum Impedanzkontrollieren nicht weit verbreitete Anwendung gefunden hat.
In einer Impedanzkontrollvorrichtung gemäß der gegenwärtigen Erfindung werden alle Artefakte wegen der Existenz so vieler Referenzzellen herausgelöscht. In einer realen Lebenssituation in einem Hospital sind keine Referenzproben für herkömmliches Impedanzkontrollieren verfügbar, weil der Patient entweder krank oder gesund ist. In einer Vorrichtung gemäß der gegenwärtigen Erfindung wird eine ausreichende Zahl von Referenzproben erzeugt durch Teilen der Gesamtprobe in eine Anzahl von Teilproben, die größer ist als die Anzahl von Organismen. In anderen Worten, in allen verwendeten Verteilungen werden die existierenden Organismen einige Teilprobenkammern besetzen, und es wird einige geben, die nicht irgendeinen Organismus aufnehmen.
Es ist auch möglich, jede Teilprobe mit mindestens zwei verschiedenen Abtastmitteln auszurüsten, was erlaubt, daß Mikroorganismusidentifizierung durchgeführt wird zusätzlich zu Nachweis durch Analysieren der verschiedenen Sensordaten. Es ist festgestellt worden, daß jede Mikroorganismusspezies unterschiedliche Signal-zu-Zeit Muster erzeugt. Deshalb kann Organismusidentifizierung für die positiven Teilproben erzielt werden durch Vergleichen der Muster, erworben über mindestens zwei verschiedene Abtastmittel, mit einer Datenbasis. Eine derartige Datenbasis kann durch Impfen bekannter Mikroorganismen in "gesähten Kulturen" und Speichern der Signal-zu-Zeit Muster erzeugt werden.
Fig. 14 zeigt ein experimentelles Ergebnis, das die Reduzierung an TTD aufgrund eines kleineren Probenvolumens veranschaulicht. In diesem Fall war eine gleiche Zahl von Organismen in ein Standardblutkulturfläschchen von 86 ml Volumen geimpft worden und in ein viel kleineres Fläschchen von nur 1 ml Volumen. Wie aus dieser Figur gesehen werden kann, ist die TTD von annähernd 35 Stunden in der Standardfläschchen herunter auf 25 Stunden in dem kleineren Fläschchen reduziert worden.
Fig. 15 zeigt ein experimentelles Ergebnis, das die Reduzierung an TTD veranschaulicht, durch Vergleichen der Sensorsignale von zwei Teilproben. Hier wird die positive Teilprobe von Fig. 14 mit einer negativen Teilprobe von 1 ml Volumen verglichen: Nach annähernd 12 Stunden ist eine klare Differenzierung sichtbar zwischen den zwei Sensorsignalen. In anderen Worten, die ursprüngliche TTD für das Standardfläschchen, 35 Stunden, ist auf 12 Stunden reduziert worden. Mit V&sub0; = 86 ml und V = 1 ml ergibt Gleichung (4) N = 86, und Gleichung (6) ergibt n = 86 = 9,3 für wirksame Zahl von Reihen. Basierend auf Fig. 1 wird erwartet, daß das Volumenteilen eine TTD von 35 Stunden auf annähernd 24 Stunden reduziert. Letztendlich gibt Fig. 2 an, daß eine TTD von 24 Stunden erwartet wird, auf annähernd 15,8 Sunden aufgrund der erhöhten Sensorsignalauflösung reduziert zu wurden. Deshalb ist die beobachtete Reduzierung an TTD in sehr guter Übereinstimmung mit jener berechneten.
Nachdem eine oder mehrere Teilproben positiv geworden sind, besteht ein Verlangen danach, Probenmaterial zu extrahieren, um aufeinanderfolgende Post-Nachweisstufen durchzuführen, wie antimikrobielles Suszeptibilitätstesten. Probenextraktion wird leichter gemacht durch Modifizieren von Deckplatte 6 in die in Fig. 8, 10. 11 und 12 gezeigten Ausführungsformen. In der in Fig. 16 gezeigten Ausführung 400 ist die Deckplatte eine Beschichtvorrichtung. Die untere Schicht 450 ist aus einem elastischen oder Kunststoffmaterial hergestellt, und die obere Schicht 451 ist aus einem formstabilen Material hergestellt, und beide Schichten sind zusammen verbunden durch ein selbstklebendes Material. Die obere Schicht 451 wirkt als ein Stabilisator und hat eine geringe Öffnung für jedes der Durchgangslöcher in Block 403. Dieses ermöglicht einem, in jede Teilprobe mit einer Spritze einzudringen.
In dem Probenbehälter 400, gezeigt in Fig. 16, ist der optisch transparente Behälter 402 aus einem formstabilen Kunststoffmaterial hergestellt. Ein fluoreszierender chemischer Sensor 413 ist an dem Innenboden angeordnet, und der Behälter ist mit einer ersten Serie von Klammern 452 ausgerüstet, obere Schicht 451 in ihrer Anfangsposition halten.
Fig. 17 zeigt den Probenbehälter 400 während des Verfahrens des Einspritzens einer Probe, und Fig. 18 beschreibt den gleichen Behälter nach Einspritzen der Probe und Anwenden einer Außenkraft zum Teilen der Probe. In Fig. 18 kann eine zweite Serie von Klammern 453 gesehen werden, die obere Schicht 451 in ihrer Endposition halten. Aufgrund der Tatsache, daß viele fluoreszierende Sensoren elastische Materialien, wie Silikonkautschuk, umfassen, muß Block 403 in der in Fig. 18 gezeigten Ausführungsform nicht flexibel sein.
Die folgende Tabelle 1 zeigt vorläufige Ergebnisse, erhalten unter Verwenden eines Probenbehälters und Vorrichtung gemäß der gegenwärtigen Erfindung. Die Tabelle listet die beobachtete Nachweiszeit (TTD) in Stunden für Proben, kontrolliert auf einem herkömmlichen automatisierten Blutkulturinstrument, und bei einer Probe und Vorrichtung gemäß der Erfindung auf. Tabelle 1

Claims

1. Probenbehälter (1), umfassend

einen optisch transparenten Behälter (2) zum Enthalten einer Probe und eines Kulturmediums,

einen Block (3) innerhalb des optisch transparenten Behälters (2), wobei der Block (3) eine Vielheit von Durchgangslöchern (5), getrennt durch eine Vielheit von Innenwänden (4) und angeordnet in einem Muster, hat,

eine Deckplatte (6) mit einem kautschukartigen Septum (7), das in den Block (3) gedrückt wird, so daß kein Gasaustausch zwischen dem Inneren des Behälters (2) und dem Äußeren des Behälters (2) auftritt, wobei der Block (3) in den optisch transparenten Behälter (2) an einer Stelle gedrückt wird, wo eine Spalte (15) zwischen der unteren Seite des Blocks (3) und der Innenbodenoberfläche des optisch transparenten Behälters (2) zurückbleibt, und die Deckplatte (6) wird in den Block (3) zu einer Stelle gedrückt, so daß eine Spalte (25) zwischen der Deckplatte (6) und der oberen Seite des Blocks (3) zurückbleibt, und

sterilisiertes Kulturgas mit einem Sub-Atmosphärendruck-Spiegel.

2. Behälter nach Anspruch 1, wobei der Block (3) aus einem elastischen Material gemacht ist.

3. Behälter (100) nach Anspruch 1, ferner umfassend einen chemischen Sensor (113), gleichmäßig angeordnet auf einer Innenbodenoberfläche des optisch transparenten Behälters (102), wobei Sensor (113) den Probenbehälter (102) nach Mikroorganismuswachstum abfragt, wenn durch ein Anregungslicht beleuchtet und durch eine CCD Kamera überwacht.

4. Behälter nach Anspruch 1, wobei die Deckplatte (206) optisch transparent ist, und der optisch transparente Behälter (202) wird von oben mit Licht in einem roten Spektralbereich beleuchtet, und eine CCD Kamera an dem Boden des optisch transparenten Behälters (202) wird verwendet, das Muster von Teilproben (210, 211, 212) zu identifizieren, die verringerte Intensität von rotem Licht relativ zu ihren Nachbarn zeigend, wodurch angezeigt wird, daß Mikroorganismen vorhanden sind.

5. Behälter nach Anspruch 3, wobei Nachweis des Sensors auf Fluoreszenz beruht.

6. Behälter nach Anspruch 3, wobei Nachweis des Sensors auf Absorption beruht.

7. Behälter nach Anspruch 3, wobei Nachweis des Sensors auf Kolorimetrie beruht.

8. Behälter nach Anspruch 3, wobei Nachweis des Sensors auf Strenphotonenmigration beruht.

9. Behälter nach Anspruch 1, wobei jedes der Löcher ein Paar von Elektroden, fähig zum Überwachen der Impedanz von Probe in dem entsprechenden Loch, einschließt.