DE69615671T2

DE69615671T2 - Beta-schleifenähnliche verbindungen und deren verwendung als protease-inhibitoren

Info

Publication number: DE69615671T2
Application number: DE69615671T
Authority: DE
Inventors: Michael Kahn
Original assignee: Molecumetics Ltd
Current assignee: Molecumetics Ltd
Priority date: 1995-03-24
Filing date: 1996-03-25
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2016-03-26
Also published as: ES2161354T3; JP2000319295A; WO1996030035A1; CA2215720A1; JP2004131511A; AU5372996A; CA2215695A1; JPH10508035A; AU713530B2; JPH10508034A; AU5371496A; DE69615671D1; AU712581B2; ATE206433T1; EP0817642A1; EP0815123B1; CA2215695C; JP4152900B2; EP0815123A1

Description

Technischer Bereich

Diese Erfindung betrifft allgemein β-Faltblatt-Mimetika und, genauer gesagt, β-Faltblatt- Mimetika zur Verwendung als Protease-Inhibitoren.

Hintergrund der Erfindung

Die β-Faltblatt-Konformation (auch als eine β-Strang-Konformation bezeichnet) ist eine Sekundärstsruktur, die in vielen Peptiden vorhanden ist. Die β-Faltblatt-Konformation ist fast vollständig ausgestreckt, mit axialen Abständen zwischen den angrenzenden Aminosäuren von ungefähr 3,5 Å. Das β-Faltblatt wird durch Wasserstoffbrücken zwischen NH- und CO- Gruppen in verschiedenen Polypeptidsträngen stabilisiert. Zusätzlich alternieren die Dipole der Peptidbindungen entlang der Stränge, was die intrisische Stabilität des β-Faltblatts bewirkt. Die angrenzenden Stränge in dem β-Faltblatt können in dieselbe Richtung (d. h. ein paralleles β-Faltblatt) oder in gegensätzliche Richtungen (d. h. ein antiparalleles β-Faltblatt) verlaufen. Obwohl die zwei Formen in den dihedralen Winkeln leicht differieren, sind beide sterisch bevorzugt. Die ausgestreckte Konformation der β-Faltblatt-Konformation führt dazu, daß die Aminosäureseitenketten auf alternierenden Seiten des β-Faltblatts vorstehen.
Die Wichtigkeit von β-Faltblättern in Peptiden und Proteinen ist gut etabliert (z. B., Richardson, Nature 268: 495-499, 1977; Halverson et al., J. Am. Chem Soc. 113: 6701-6704, 1991; Zhang, J. Biol. Che n. 266: 15591-15596, 1991; Madden et al., Nature 353: 321-325, 1991). Das β-Faltblatt ist bei einer Zahl von biologischen Erkennungsereignissen, einschließlich der Interaktion zwischen Proteasen und proteolytischen Substraten wichtig. Eine Protease-Aktivität wird als an vielen Erkrankungszuständen mit beteiligt betrachtet.
Cathepsin B ist eine lysosomale Cystein-Protease, die normalerweise bei Prozessieren von Proenzym und Protein-Turnover beteiligt ist. Ein erhöhter Spiegel an Aktivität wurde als an der Tumor-Metastase beteiligt vermutet (Sloane, B. F. et al., "Cathepsin B and its endogenous inhibitors: the role in tumor malignancy," Cancer Metastasis Rev. 9: 333-352, 1990), rhematoider Arthritis (Werb, Z. "Proteinases and matrix degradation," in Textbook of Rheumatology, Keller, W. N.; Harris, W. D., Ruddy, S.; Sledge, C. S., Eds., 1989, W. B. Saunder Co., Philodelphia, PA, pp. 300-321) und muskulärer Dystrophie (Katunuma N. & Kominami E., "Abnormal expression of lysosomal cysteine proteinases in muscle wasting diseases," Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 108: 1-20, 1987).
Calpaine sind cytosolische oder Membran-gebundene Ca++-aktivierte Proteasen, die für den Abbau von Cytoskelett-Proteinen in Antwort auf sich verändernde Kalzium-Spiegel innerhalb der Zelle verantwortlich sind. Sie tragen zum Gewebeabbau bei Arthritis und muskulärer Dystrophie bei (siehe Wang K. K. & Yuen P. W., "Calpain inhibition: an overview of its therapeutic potential," Trends Pharmacol. Sci, 15: 412-419, 1994).
Interleukin-konvertierendes Enzym (ICE) spaltet pro-IL-1 beta in IL-beta, einen Schlüsselmediator der Entzündung und daher können sich Inhibitoren von ICE unter Umständen bei der Behandlung von Arthritis als brauchbar erweisen (siehe, z. B., Miller B. E. et al., "Inhibition of mature IL-1 beta production in murine macrophages and a murine model of inflammation by WIN 67694, an inhibitor of IL-1 beta converting enzyme," J. Immunol. 154: 1331-1338, 1995). ICE oder ICE-ähnliche Proteasen können auch bei der Apoptose beteiligt sein (programmierter Zelltod) und daher Rollen spielen bei Krebs, AIDS, Alzheimer- Erkrankung und anderen Erkrankungen, in denen disregulierte Apoptose beteiligt ist (siehe Barr, P. J.; Tomei, L. D., "Apoptosis and its Role in Human Disease," Biotechnol. 12: 487-493, 1994).
HIV-Protease spielt eine Schlüsselrolle im Lebenszyklus von HIV, dem AIDS-Virus. In den finalen Schritten der viralen Reifung spaltet sie Polyproteinvorläufer zu den funktionellen Enzymen und strukturellen Proteinen des viralen Kerns. HIV-Protease-Inhibitoren wurden schnell als ein exzellentes therapeutisches Ziel für AIDS identifiziert (siehe Huff, J. R., "HIV protease: a novel chemotherapeutic target for AIDS," J. Med. Chem. 34: 2305-2314) und haben sich bereits als brauchbar für dessen Behandlung erwiesen, was durch die kürzlichen FDA-Zulassungen von Ritonavir, Crixivan und Saquinavir gestützt wurde.
Angiotensin-konvertierendes Enzym (ACE) ist Teil des Renin-Angiotensin-Systems, das eine zentrale Rolle bei der Regulation des Blutdrucks spielt. ACE spaltet Angiontensin-I zu dem Octapeptid Angiotensin-II, ein wirksames Pressormittel aufgrund seiner vacokonstriktiven Aktivität. Die Inhibierung von ACE hat sich bei der Behandlung von Bluthochdruck als therapeutisch brauchbar erwiesen (Williams. G. H., "Corlverting-enzyme inhibitors in the treatment of hypertension," N. Engl. J. Med. 319: 1517-1525, 1989).
Kollagenasen spalten Kollagen, den Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix (z. B. Bindegewebe, Haut, Blutgefäße). Erhöhte Kollagenase-Aktivität trägt zu Arthritis (Krane S. M. et al., "Mechanisms of matrix degradation in rheumatoid arthritis," Ann. N. Y. Acad. Sci. 580: 340-354, 1990), Tumormetastase (Flug M. & Kopf-Maier P., "The basement membrane and its involvement in carcinoma cell invasion," Acta Anat. Basel 152: 69-84, 1995) und anderen Erkrankungen bei, die den Abbau von Bindegewebe einschließen.
Trypsin-ähnliche Serinproteasen bilden eine große und hoch-spezifische Familie von Enzymen, die bei der Hämostase/Koagulation (Davie, E. W. and K. Fujikawa, "Basic machanisms in blood coagulation," Ann. Rev. 799-829, 1975) und Komplementaktivierung (Muller-Eberhard, H. J., "Complement," Ann. Rev. Biochem. 44: 697-724, 1975) beteiligt sind. Die Sequenzierung dieser Proteasen hat die Anwesenheit eines homologen Trypsin-ähnlichen Kerns mit Aminosäureinsertionen gezeigt, die die Spezifität modifizieren und die allgemein für die Interaktion mit einem anderen makromolekularen Komponenten verantwortlich sind (Magnusson et al., "Proteolysis and Physiological Regulation," Miami Winter Symposia 11: 203-239, 1976).
Thrombin, eine Trypsin-änliche Serinprotease, handelt, um eine begrenzte Proteolyse zur Verfügung zu stellen, sowohl bei der Erzeugung von Fibrin aus Fibrinogen und der Aktivierung des Blutplättchenrezeptors und spielt daher eine wichtige Rolle bei der Thrombose und Hämostase (Mann, K. G., "The assembly of blood clotting complexes on membranes," Trends Biochem. Sci. 12: 229-233, 1987). Thrombin zeigt eine bemerkenswerte Spezifität bei der Entfernung von Fibrinopeptiden A und B aus Fibrinogen durch die selektive Spaltung von nur zwei Arg-Gly-Bindungen der einhundert und einundachzig Arg- oder Lys- Xaa-Sequenzen in Fibrinogen (Blomback, H., Blood Clotting Enzymology, Seeger, W. H. (ed.), Academic Press, New York, 1967, pp. 143-215).
Viele signifikante Erkrankungszustände hängen mit abnormaler Hämostase zusammen, einschließlich akuten Coronar-Syndromen. Aspirin und Heparin werden häufig bei der Behandlung von Patienten mit akuten Coronar-Syndromen verwendet. Jedoch weisen diese Mittel verschiedene intrinsische Begrenzungen auf. Zum Beispiel, neigt Thrombose, die das Aufbrechen von arteriosklerotischen Plaques verkompliziert dazu, ein Thrombin-vermittelter, Blutplättchen-abhängiger Prozess zu sein, der relativ resistent gegenüber der Inhibierung durch Aspirin und Heparin ist (Fuster et al., "The pathogenesis of coronary arthery disease and the acute coronary syndromes," N. Engl. J. Med. 326: 242-50, 1992).
Thrombin-Inhibitoren verhindern die Bildung eines Thrombus an Stellen von vaskulärer Verletzung in vivo. Weiterhin, da Thrombin auch ein potenter Wachstumsfaktor ist der die Zellteilung von glatten Muskelzellen an Stellen von mechanischer Verletzung in den Coronar- Arterien initiiert, blockieren Inhibitoren diese proliferative Antwort der glatten Muskelzellen und reduzieren die Restenose. Thrombin-Inhibitoren würden auch die entzündliche Antwort in vaskulären Wandzellen induzieren (Harker et al., Am. J. Cardiol 75: 12B-16B, 1995).
Im Hinblick auf die durch das β-Faltblatt gespielte wichtige biologische Rolle besteht ein Bedarf im Stand der Technik an Verbindungen, die die intrinsische β-Faltblatt-Struktur eines natürlich auftretenden oder synthetischen Peptids, Proteins oder Moleküls stabilisieren können. Es besteht auch ein Bedarf im Stand der Technik zur Herstellung von stabilen β- Faltblatt-Strukturen, sowie die Verwendung von solchen stabilisierten Strukturen, um biologische Erkennungsvorgänge, die β-Faltblatt-Strukturen einschließen, zu bewirken oder zu modifizieren. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse und stellt weitere damit zusammenhängende Vorteile zur Verfügung.

Zusammenfassung der Erfindung

Kurz gesagt ist die vorliegende Erfindung auf β-Faltblatt-Mimetika gerichtet und, genauer gesagt, auf β-Faltblatt-Mimetika, die die β-Strangstruktur eines natürlichen oder synthetischen Peptids, Proteins oder Moleküls stabilisieren.
In einem Aspekt dieser Erfindung werden β-Faltblatt-Mimetika beschrieben, die ein bizyklisches Ringsystem enthalten, wobei das β-Faltblatt-Mimietikum die allgemeine Struktur (I):
aufweist und pharmazeutisch akzeptable Salze davon, in denen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Aminosäure-Seitenketten und Derivaten davon; A ausgewählt ist aus -C(=O)-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-, -C(=O) (CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;O- und -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;S-; B ausgewählt ist aus N und CH; C ausgewählt ist aus -C(=O)-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-, -O-, -S- -O-(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;- und -S(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;-; Y und Z stellen den Rest des Moleküls, wie weiter im Text angegeben, dar und jede zwei angrenzenden CH-Gruppen des bizyklischen Rings können eine Doppelbindung bilden; unter der Voraussetzung, daß (i) R&sub1; eine Aminosäure-Seitenkette- Gruppe oder ein Derivat davon anders als Wasserstoff ist, (ii) wenn R&sub1; Benzyl ist, sind R&sub2; und R&sub3; beide Wasserstoff, A ist -CH&sub2;CH&sub2;- und B ist CH, dann ist C nicht -CH&sub2;-, (iii) wenn R&sub1; Methyl ist, sind R&sub2; und R&sub3; beide Wasserstoff sind, A ist -CH&sub2;O- und B ist CH, dann ist C nicht -CH&sub2;- und (iv) wenn R&sub1; Benzyl ist, R&sub2; und R&sub3; beide Wasserstoff, A ist -CH&sub2;- und B ist CH, dann ist C nicht -S-.
In einer Ausführungsform von Struktur (I) oben, werden β-Faltblatt-Mimetika offenbart, die die folgende Struktur (II):
aufweisen, worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Aminosäure- Seitenketten-Gruppen und Derivaten davon; A ausgewählt ist aus -C(=O)-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;- und - C(=O) (CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-; B ausgewählt ist aus N und CH; C ausgewählt ist aus -C(=O)- und -(CH&sub2;)&sub1;&submin; &sub3;-; Y und Z den Rest des Moleküls darstellen, wie weiter im Text angegeben und das bizyklische Ringsystem gesättigt ist (d. h., enthält keine Doppelbindungen zwischen angrenzenden CH-Gruppen des bizyklischen Ringsystems).
In einer Ausführungsform der Struktur (II), in der B CH ist und R&sub3; Wasserstoff ist, werden β- Faltblatt-Mimetika offenbart, die die folgenden Strukturen (III), (IV) und (V) aufweisen:
worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Aminosäure-Seitenketten- Gruppen und Derivaten davon; n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist; p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und Y und Z den Rest des Moleküls darstellen.
In einer Ausführungsform der Struktur (11), in der B N ist und R&sub3; Wasserstoff ist, werden β- Faltblatt-Mimetika offenbart, die die folgenden Strukturen (VI), (VII) und (VIII) aufweisen:
worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Aminosäure-Seitenketten- Gruppen und Derivaten davon; n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist; p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist und Y und Z den Rest des Moleküls darstellen, wie weiter im Text angegeben.
In bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung, werden β-Faltblatt- Mimetika offenbart, die die folgenden Strukturen (IX), (X) und (XI) aufweisen:
worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Aminosäure-Seitenketten- Gruppen und Derivaten davon; n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist und Y und Z den Rest des Moleküls darstellen.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wird ein β- Faltblatt-Mimetikum der Struktur (X) oben offenbart, worin n 2 ist und das die folgende Struktur (Xa) aufweist:
worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Aminosäure-Seitenketten- Gruppen und Derivaten davon und Y und Z den Rest des Moleküls darstellen.
In einer anderen Ausführungsform der Struktur (I) oben werden β-Faltblatt-Mimetika offenbart, die die folgende Struktur (XII) aufweisen:
worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Aminosäure-Seitenketten- Gruppen und Derivaten davon; A ausgewählt ist aus -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;O- und -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;S-, C ausgewählt ist aus -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-, -O-, -S-, -O(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;- und -S(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;-; Y und Z den Rest des Moleküls darstellen, wie weiter im Text angegeben, und das bizyklische Ringsystem gesättigt ist.
In einer Ausführungsform der Struktur (XII), in der A -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;- ist, werden β-Faltblatt- Mimetika offenbart, die die folgende Struktur (XIII) aufweisen:
worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Aminosäure-Seitenketten- Gruppen und Derivaten davon; n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist; C ausgewählt ist aus - (CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-, -O-, -S-, -O(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;- und -S(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;- und Y und Z den Rest des Moleküls darstellen, wie weiter im Text angegeben.
In einer Ausführungsform der Struktur (XII), worin A -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;O- oder -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;S- ist, werden β-Faltblatt-Mimetika offenbart, die die folgenden Strukturen (XIV) und (XV) aufweisen:
worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig ausgewählt sind aus Aminosäure-Seitenketten-Gruppen und Derivaten davon; m eine ganze Zahl von 1 bis 2 ist; p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist und Y und Z den Rest des Moleküls darstellen, wie weiter im Text angegeben.
In einer Ausführungsform der Struktur (XII), in der C -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;- ist, werden β-Faltblatt- Mimetika offenbart, die die folgende Struktur (XVI) aufweisen:
worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einer Aminosäure- Seitenketten-Gruppe und Derivaten davon; p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; A ausgewählt ist aus -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;O- und -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;S- und Y und Z den Rest des Moleküls darstellen, wie weiter im Text angegeben.
In einer Ausführungsform der Struktur (XII), in der C -O- oder -S- ist, werden β-Faltblatt- Mimetika offenbart, die die folgenden Strukturen (XVII) und (XVIII) aufweisen:
worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Aminosäure-Seitenketten- Gruppen und Derivaten davon; p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist und Y und Z den Rest des Moleküls darstellen, wie weiter im Text angegeben.
In einer Ausführungsform der Struktur (XII), worin C -O(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;O- oder -S(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;- ist, werden β-Faltblatt-Mimetika offenbart, die die folgenden Strukturen (XIX) und (XX) aufweisen:
worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Aminosäure-Seitenketten- Gruppen und Derivaten davon; p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; m eine ganze Zahl von 1 bis 2 ist und Y und Z den Rest des Moleküls darstellen, wie weiter im Text angegeben.
In einem weiterem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden β-Faltblatt-modifizierte Peptide oder Proteine offenbart, in denen ein β-Faltblatt-Mimetikum dieser Erfindung kovalent an mindestens eine Aminosäure eines natürlich vorkommenden oder synthetischen Peptids oder Proteins angebracht ist. In dieser Ausführungsform stellen Y und/oder Z in den oben genannten Strukturen (I) bis (XX) eine oder mehrere Aminosäuren des Peptids oder Proteins dar. In einer verwandten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verleihung und/oder Stabilisierung einer β-Ealtblattstruktur eines natürlichen oder synthetischen Peptids oder Proteins beschrieben. Dieses Verfahren schließt ein kovalentes Anbringen von einem oder mehreren β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung innerhalb der an das Ende von einem Peptid oder Protein ein.
In noch einer weiteren Ausführungsform werden Verfahren zur Herstellung von Verbindungen zur Verwendung bei der Inhibierung einer Protease in einem warmblütigen Tier durch Verabreichung einer effektiven Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung an das Tier beschrieben. Proteasen schießen Serinproteasen, wie zum Beispiel Thrombin, Elastase und Faktor X als auch Asparagin-, Cystein- und Metalloproteasen ein.
Andere Aspekte dieser Erfindung werden nach Bezug auf die folgende genaue Beschreibung ersichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein Diagramm, das den Effekt von verschiedenen Konzentrationen der Struktur (20b) auf die Blutplättchen-Ablagerung in einem vaskulärem Graft zeigt.
Fig. 2 zeigt ein Diagramm, das eine Darstellung, die den Effekt von verschiedenen Konzentrationen der Struktur (39) auf die Blutplättchen-Ablagerung in einem vaskulärem Graft zeigt.
Fig. 3 zeigt ein Diagramm, das den Effekt von verschiedenen Konzentrationen der Struktur (29b) auf die Blutplättchen-Ablagerung in einem vaskulärem Graft zeigt.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Wie oben erwähnt, ist das β-Faltblatt eine wichtige strukturelle Komponente für viele biologische Erkennungsereignisse. Die β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung dienen dazu, die β-Faltblatt-Strukturen eines natürlichen oder synthetischen Peptids oder Moleküls zu verleihen und/oder zu stabilisieren, insbesondere in Bezug auf die Stabilität der Konformation. Zusätzlich sind die β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung resistenter gegenüber proteolytischem Abbau, was dazu führt, daß ein Peptid, Protein oder Molekül, das dasselbe enthält, resistenter gegenüber Abbau wird.
Die β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung werden im allgemeinen durch die Struktur (I) oben dargestellt, sowie durch die mehr spezifischen Ausführungsformen, die durch Strukturen (11) bis (XX) dargestellt sind, und weisen Stereochemien auf, die durch die Strukturen (I') bis (I"") unter dargestellt sind:
worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, A, B, C, Y und Z wie oben definiert sind. Mit anderen Worten sind alle Stereokonformationen der Struktur (I), sowie die spezifischen Ausführungsformen, die durch Strukturen (II) bis (XX) dargestellt sind, alle im Bereich dieser Erfindung eingeschlossen. Zum Beispiel können die β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung so konstruiert werden, um die dreidimensionale Konformation eines β-Faltblatts, das aus natürlich vorkommenden L- Aminosäuren, nachzuahmen, sowie die Struktur eines β-Faltblatts, das aus einer oder mehrerer D-Aminosäuren umfaßt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das β- Faltblatt-Mimetikum die Stereokonformation von Struktur (I') oder (I") auf.
Wie im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet kann der Begriff "Rest des Moleküls" (wie durch Y und Z in den Strukturen (I) bis (XX) oben dargestellt) jede chemische Gruppe sein. Zum Beispiel, wenn das β-Faltblatt-Mimetikum innerhalb der Länge eines Peptids oder Proteins lokalisiert ist, können Y und Z die Aminosäuren des Peptids oder Proteins darstellen. Alternativ, wenn zwei oder mehr β-Faltblatt-Mimetika miteinander verbunden sind, kann die Y-Gruppe eines ersten β-Faltblatt-Mimetikums ein zweites β- Faltblatt-Mimetikum darstellen, während anders herum die Z-Gruppe des zweiten β-Faltblatt- Mimetikums das erste β-Faltblatt-Mimetikum darstellt. Wenn das β-Faltblatt-Mimetikum an dem Ende eines Peptids oder Proteins lokalisiert ist oder wenn das β-Faltblatt-Mimetikum nicht mit einem Peptid oder Protein assoziiert ist, können Y und/oder Z eine geeignete terminierende Gruppe darstellen: Repräsentative terminierende Gruppen für die Z-Gruppe schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, -H, -OH, -R, -C(=O)R und -SO&sub2;R (worin R eine C1-C8 Aryl- oder Alkyl-Gruppe ist) oder können eine geeignete Schutzgruppe zur Proteinsynthese sein, sowie BOC, FMOC oder CBZ (d. h. Tert-Butyloxycarbonyl, 9- Fluorenylemethoxycarbonyl und Benzyloxycarbonyl). Ähnlich schließen repräsentative terminierende Gruppen für die Y-Gruppe ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, -H, -OH, -R, - NHOH, -NHNHR, -C(=O)OR, -C(=O)NHR, -CH&sub2;C&sub1;, -CF&sub3;, -C&sub2;F&sub5;, -C(=O)CH&sub2;N&sub2;&spplus;,
(worin R eine C1-C8 Alkyl- oder Aryl-Gruppe ist) oder eine heterozyklische Gruppe, wie zum Beispiel Pyridin, Pyran, Thiophan, Pyrrol, Furan, Thiophen, Thiazol, Benzthiazol, Oxazol, Benzoxazol, Imidazol und Benzimidazol.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "eine Aminosäure-Seitenketten-Gruppe" jede Aminosäure-Seitenketten-Gruppe, die in natürlich vorkommenden Proteinen auftritt, dar, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die natürlich vorkommenden Aminosäure- Seitenketten-Gruppen, die in Tabelle 1 unten angegeben sind. Andere natürlich auftretende Seitenketten-Gruppen dieser Erfindung schließen ein (sind jedoch nicht beschränkt auf) die Seitenketten-Gruppen von 3,5-Dibromtyrosin, 3,5-Dijodtyrosin, Hydroxylysin, Naphthylalanin, Thienylalanin, γ-Carboxyglutamat, Phosphotyrosin, Phosphoserin und glycosylierte Aminosäuren, wie zum Beispiel glycosyliertes Serin, Asparagin und Threonin.

Tabelle 1

Aminosäure-Seitenketten-Gruppe Aminosäure

-H Glycin
-CH&sub3; Alanin
-CH(CH&sub3;)&sub2; Valin
-CH&sub2;CH(CH&sub3;)&sub2; Leucin
-CH(CH&sub3;)CH&sub2;CH&sub3; Isoleucin
-(CH&sub2;)&sub4;NH&sub3;&spplus; Lysin
-(CH&sub2;)&sub3;NHC(NH&sub2;)NH&sub2;&spplus; Arginin
Histidin
-CH&sub2;COO&supmin; Asparaginsäure
-CH&sub2;CH&sub2;COO&supmin; Glutaminsäure
-CH&sub2;CONH&sub2; Asparagin
-CH&sub2;CH&sub2;CONH&sub2; Glutamin
Phenylalanin
Tyrosin
Tryptophan
-CH&sub2;SH Cystein
-CH&sub2;CH&sub2;SCH&sub3; Methionin
-CH&sub2;OH Serin
-CH(OH)CH&sub3; Threonin
Zusätzlich zu natürlich auftretenden Aminosäure-Seitenketten-Gruppen schließen die Aminosäure-Seitenkettengruppen der vorliegenden Erfindung auch verschiedene Derivate davon ein. Wie hier verwendet schließt ein "Derivat" einer Aminosäure-Seitenketten-Gruppe alle Modifikationen und/oder Variationen von natürlich auftretenden Aminosäure- Seitenketten-Gruppen ein. Zum Beispiel können die Seitenketten-Gruppen von Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin und Phenylalanin generell als Alkyl-, Aryl- oder Aralkyl-Gruppen niederer Kettenlänge klassifiziert werden. Derivate von Aminosäure-Seitenketten-Gruppen schließen andere gerade-kettige oder vezweigte, zyklische oder nicht zyklische, substituierte oder nicht- substituierte, gesättigte oder nicht-gesättigte Alkyl-, Aryl- oder Aralkyl-Gruppen niederer Kettenlänge ein.
Wie hier verwendet, enthalten "Alkyl-Gruppen niederer Kettenlänge" von 1-12 Kohlenstoffatome, "Aryl-Gruppen niederer Kettenlänge" von 6-12 Kohlenstoffatome und "Aralkyl-Gruppen niederer Kettenlänge" von 7-12 Kohlenstoffatome. Daher ist in einer Ausführungsform das Aminosäure-Seitenketten-Derivat ausgewählt aus einer C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkyl-, einer C&sub6;&submin;&sub1;&sub2;-Aryl- und einer C&sub7;&submin;&sub1;&sub2;-Aralkyl- und in einer weiter bevorzugten Ausführungsform von einer C&sub1;&submin;&sub7;-Alkyl-, einer C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;-Aryl- und einer C&sub7;&submin;&sub1;&sub1;-Aralkyl-Gruppe.
Aminosäure-Seitenketten-Derivate dieser Erfindung schließen weiterhin substituierte Derivate von Alkyl-, Aryl- und Aralkyl-Gruppen niedriger Kettenlänge ein, worin der Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe aus (jedoch nicht beschränkt auf) einer oder mehrerer der folgenden chemischen Gruppen: -OH, -OR, -COOH, -COOR, CONH&sub2;, NH&sub2; -NHR, -NRR, - SH, -SR, -SO&sub2;R, -SO&sub2;H-, -SOR und Halogen (einschließlich F, Cl, Br und J), wobei jedes Auftreten von R unabhängig voneinander ausgewählt ist aus einer Alkyl-, Aryl- oder Aralkyl- Gruppe niederer Kettenlänge. Darüber hinaus schließen zyklische Alkyl-, Aryl- und Aralkyl- Gruppen niederer Kettenlänge dieser Erfindung Naphthalin, sowie heterozyklische Verbindungen, wie zum Beispiel Thiophen, Pyrrol, Furan, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, 3-Pyrrolin, Pyrrolidin, Pyridin, Pyrimidin, Purin, Quinolin, Isoquinolin und Carbazol ein. Aminosäure-Seitenketten-Derivate schließen weiterhin Heteroalkyl-Derivate des Alkylteils, der Alkyl- und Aralkyl-Gruppen niederer Länge ein, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) Alkyl- und Aralkyl-Phosphonate und -Silane.
Bizyklische Lactame sind im Stand der Technik bekannt. Siehe, zum Beispiel, Columbo, L. et al., Tet. Lett. 36(4): 625-628, 1995; Baldwin, J. E. et al., Heterocycles 34(5): 903-906, 1992; und Slomczynska, U. et al., J. Org. Chem. 61: 1198-1204, 1996. Jedoch sind die bizyklischen Lactame der Erfindung nicht in diesen Referenzen beschrieben.
Wie oben erwähnt, dienen die β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung dazu, die β-Faltblatt- Struktur eines Proteins, Peptids oder Moleküls zu verleihen und/oder zu stabilisieren. Das β- Faltblatt-Mimetikum kann entweder an dem C-Terminus oder N-Terminus des Proteins, Peptids oder Moleküls positioniert sein oder es kann innerhalb des Proteins, Peptids oder Moleküls selber lokalisiert sein. Zusätzlich kann mehr als ein β-Faltblatt-Mimetikum der vorliegenden Erfindung in einem Protein, Peptid oder Molekül inkorporiert werden.
Die β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung können durch eine Zahl von Reaktionsschemata synthetisiert werden. Zum Beispiel können die verschiedenen Ausführungsformen der Struktur (I) gemäß den vorliegenden Reaktionsschemata (1) bis (17) synthetisiert werden.

Reaktionsschema (1)

Struktur (III) und die repräsentativen Verbindungen, die die Struktur (IIIa) aufweisen, können durch die folgenden Reaktionsschemata synthetisiert werden:

Reaktionsschema (2)

Struktur (IV) kann durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden:

Reaktionsschema (3)

Repräsentative Verbindungen der Struktur (V), die die Struktur (Va) aufweisen, können durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden, wobei Struktur (Ia) in Schema (3) eine repräsentative Struktur der Erfindung ist, die eine Doppelbindung in dem bizyklischen Ringsystem aufweist:
Zusätzlich können repräsentative Verbindungen der Struktur (V), die die Struktur (Vb), aufweisen, durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden, und wenn A von Struktur (II) -C(=O) (CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;- ist, kann eine verwandte Verbindung (unten als (IIa) bezeichnet) durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden:

Reaktionsschema (4)

Repräsentative Verbindungen der Struktur (VI), die die Strukturen (VIa) und (VIb) unten aufweisen, worin R&sub3; Wasserstoff ist, können durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden (siehe Holmes and Neel, Tet. Lett. 31: 5567-70, 1990).
Repräsentative Verbindungen von Struktur (II) in denen R&sub3; eine Aminosäure-Seitenketten- Gruppe oder ein Derivat davon ist, können ebenfalls gemäß dem oben angegebenen Schema (4) hergestellt werden.

Reaktionsschema (5)

Repräsentative Verbindungen der Struktur (VII), die die Struktur (VIIa) aufweisen, können durch das vorliegende Reaktionsschema synthetisiert werden:

Reaktionsschema (6)

Struktur (VIII) kann durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden:

Reaktionsschema (7)

Repräsentative Verbindungen der Struktur (IX), die die unten gezeigten Strukturen (IXa) und (IXb) aufweisen, können durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden:

Reaktionsschema (8)

Repräsentative Verbindungen der Struktur (X), die die Strukturen (Xb) und (Xc) aufweisen, können durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden (siehe Jungheim & Sigmund, J. Org. Chem. 52: 4007-4013, 1987):

Reaktionsschema (9)

Struktur (XI) kann durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden (siehe Perkin, ii Chem. Soc. Perk. Trans. 1: 155-164, 1984):

Reaktionsschema (10)

Struktur (XIII) kann durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden:

Reaktionsschema (11)

Die Strukturen (XIV) und (XV) können durch das folgenden Reaktionsschema synthetisiert werden:

Reaktionsschema (12)

Struktur (XVI) kann durch das folgenden Reaktionsschema synthetisiert werden:

Reaktionsschema (13)

Die Strukturen (XVII) und (XVIII) können durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden:

Reaktionsschema (14)

Die Strukturen (XIX) und (XX) können durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden:
Gemäß der Definition von Struktur (I) oben, kann das bizyklische Ringsystem angrenzende CH-Gruppen enthalten (d. h., das bizyklische Ringsystem kann zumindest teilweise durch eine -CH-CH-Gruppe gebildet werden). Verbindungen, in denen eine solche -CH-CH-Gruppe mit einem -C=C- ersetzt ist, sind ebenfalls innerhalb des Bereichs der Struktur (I) eingeschlossen (d. h., jede zwei angrenzende CH-Gruppen des bizyklischen Ring können zusammen eine Doppelbindung bilden). Es sollte bemerkt werden, daß R&sub1; gemäß der Definition von Struktur (I) eine Gruppe anders als Wasserstoff ist. Die Untersuchung von Struktur (I) zeigt, daß das bizyklische Ringsystem-Atom, an das R&sub1; gebunden ist, kein Teil einer Kohlenstoff- Kohlenstoff-Doppelbindung gemäß Struktur (I) der Erfindung sein kann. Jedoch können R&sub2; und R&sub3; Wasserstoff sein, daher können die bizyklischen Ringatome, an die R&sub2; und/oder R&sub3; gebunden sind, einen Teil einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in den Verbindungen der Struktur (I) bilden.
Reaktionsschemata (15), (16) und (17) verdeutlichen die Synthese-Methodologie zur Herstellung repräsentativer Verbindungen der Struktur (I), wobei das bizyklische Ringsystem teilweise durch eine -C=C-Gruppe gebildet wird. Reaktionsschema (15) Reaktionsschema (16) Reaktionsschema (17)
In β-Faltblatt-Mimetika der Erfindung weisen bevorzugte Y-Gruppen die Struktur:
auf, wobei eine bevorzugte Stereochemie ist:
Bevorzugte R&sub4;-Gruppen sind Organoamin-Gruppen, die von 2 bis 10 Kohlenstoffatome und mindestens ein Stickstoffatom aufweisen. Geeignete Organoamin-Gruppen weisen die chemische Formel C&sub2;&submin;&sub1;&sub0;H&sub4;&submin;&sub2;&sub0;N&sub1;&submin;&sub6;O&sub0;&submin;&sub2; auf und bevorzugterweise weisen sie die chemische Formel C&sub3;&submin;&sub7;H&sub7;&submin;&sub1;&sub4;N&sub1;&submin;&sub4;O&sub0;&submin;&sub1; auf. Beispielhafte Organoamin-Gruppen der Erfindung sind:
In der oben genannten Struktur ist R&sub5; ausgewählt aus (a) Alkyl von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls mit 1-4 von Halid, C&sub1;&submin;&sub5; Alkoxy und Nitro substituiert, (b) -C(=O)NH-C&sub1;&submin;&sub5;-alkyl, worin die Alkyl-Gruppe gegebenenfalls mit Halid oder C&sub1;&submin;&sub5;-alkoxy substituiert ist, (c) -C(=O)NH-C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;aralkyl, wobei die Aryl-Gruppe gegebenenfalls mit bis zu fünf Gruppen, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Nitro, Halid, -NH-(C=O)C&sub1;&submin; &sub5;alkyl, -NH-(C=O)C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;aryl, C&sub1;&submin;&sub5;alkyl und C&sub1;&submin;&sub5;alkoxy substituiert ist und (d) monozyklischem und bizyklischem Heteroaryl von 4 bis 11 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff und die Heteroatome aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel und worin der Heteroarylring gegebenenfalls mit bis zu vier von Halid, C&sub1;&submin;&sub5;alkyl, C&sub1;&submin;&sub5;alkoxy, -C(=O)NHC&sub1;&submin; &sub5;alkyl, -C(=O)NHC&sub6;&submin;&sub1;&sub0;aryl, Amino, -C(=O)OC&sub1;&submin;&sub5;alkyl und -C(=O)OC&sub6;&submin;&sub1;&sub0;aryl substituiert ist.
Bevorzugte R&sub5;-Gruppen sind:
worin R&sub6; Wasserstoff, Nitro, Halid, NH-C(=O)-C&sub1;&submin;&sub5;alkyl, NH-C(=O)-C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;aryl, C&sub1;&submin;&sub5;alkyl und C&sub1;&submin;&sub5;alkoxy ist;
-(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-X
worin X Halid ist;
worin E -O-, -NH- oder -S- ist und R&sub7; und R&sub8; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, C&sub1;&submin;&sub5;alkyl, -C(=O)OC&sub1;&submin;&sub5;alkyl, -C(=O)OC&sub6;&submin;&sub1;&sub0;aryl, -C(=O)NHC&sub1;&submin;&sub5;alkyl und C(=O)NHC&sub6;&submin;&sub1;&sub0;aryl; und
worin E und R&sub6; wie vorher definiert sind.
Die β-Faltblatt-Mimetika der vorliegenden Erfindung können in Standard-Peptid-Synthese- Protokollen verwendet werden, einschließlich automatisierter Festphasen-Peptidsynthese. Die Peptidsynthese ist ein schrittweiser Prozess, bei dem ein Peptid durch Verlängerung der Peptidkette durch die schrittweise Addition von einzelnen Aminosäuren gebildet wird. Die Aminosäuren werden in die Peptidkette durch die Bildung einer Peptid-(Amid)-Bindung angehängt. Die Peptid-Bindung wird durch Koppeln der Aminogruppe des Peptids an die Carboxylgruppe der Aminosäure gebildet. Das Peptid wird daher vom Carboxy-Terminus zum Amino-Terminus synthetisiert. Die einzelnen Schritte der Aminosäure-Addition werden im wesentlichen wiederholt, bis ein Peptid (oder Protein) der gewünschten Länge und Aminosäuresequenz synthetisiert ist.
Um Peptid- (oder Protein- oder Molekül-)Synthese, wie oben beschrieben, zu erreichen, sollte die Aminosäuregruppe der Aminosäure, die an das Peptid angefügt werden soll, nicht mit der Bildung der Peptid-Bindung zwischen der Aminosäure und dem Peptid (d. h. dem Koppeln der Carboxylgruppe der Aminosäure an die Aminogruppe des Peptids) interferieren. Um solch eine Interferenz zu vermeiden, werden die Aminogruppen der Aminosäuren, die in der Peptidsynthese verwendet werden, mit geeigneten Schutzgruppen geschützt. Typische Amino-Schutzgruppen schließen, zum Beispiel, BOC- und FMOC-Gruppen ein. Daher tragen in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die β-Faltblatt-Mimetika der vorliegenden Erfindung eine freie Carboxylsäuregruppe und eine geschützte Aminogruppe und sind daher für die Inkorporation in ein Peptid durch Standard-Synthese Techniken geeignet.
Die β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung weisen eine breite Verwendbarkeit in natürlich vorkommenden oder synthetischen Peptiden, Proteinen und Molekülen auf. Zum Beispiel weisen die β-Faltblatt-Mimetika, die hier offenbart werden, Aktivität als Inhibitoren der großen Familie von Trypsin-ähnlichen Serinproteasen auf, einschließlich denjenigen, die Arginin oder Lysin als einen P'-Substituenten bevorzugen. Diese Enzyme sind an der Blutgerinnung beteiligt und schließen ein (sind jedoch nicht beschränkt auf) Faktor VIIa, Faktor IXa, Faktor Xa, Thrombin, Kallikrein, Urokinase (die ebenfalls bei der Krebs- Metastase beteiligt ist) und Plasmin. Daher hat die Fähigkeit, diese Enzyme selektiv zu inhibieren, eine breite Anwendbarkeit bei therapeutischen Anwendungen, die cardiovaskuläre Erkrankung und Onkologie einschließen. In diesen Fällen kann das folgende β-Faltblatt- Mimetikum auf einen festen Träger (z. B. PAM-Harz) synthetisiert werden:
In den oben angegebenen β-Faltblatt-Mimetika ist ein L ein optionaler Linker.
Die β-Faltblatt-Mimetika können dann von dem festen Träger durch, zum Beispiel, Aminolyse abgespalten werden und als kompetitive Substrate gegen geeignete Mittel gescreent werden, wie zum Beispiel das chromogene Substrat BAPNA (Benzyoylargininparanitroanalid) (siehe Eichler und Houghten, Biochemistry 32: 11035- 11041, 1993). Alternativ kann durch Verwendung einer geeigneten Linker-Gruppe solch ein Screening durchgeführt werden, während die β-Faltblatt-Mimetika immer noch an den festen Träger angebracht sind.
Sobald ein Substrat durch die oben angegebene kinetische Analyse ausgewählt ist, kann das β-Faltblatt-Mimetikum durch Modifikationen des C-Terminus- gemeint ist durch Modifikation der Y-Gruppe- in einen Protease-Inhibitor überführt werden. Zum Beispiel kann die terminale Y-Gruppe mit -CH&sub2;Cl, -CF&sub3;, -H oder -C(O)NHR ersetzt werden. Geeignete R- Gruppen können unter der Verwendung einer Subrat-Bibiliothek ausgewählt werden oder durch Verwendung einer Bibliothek von Inhibitoren, die unter der Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von Wassermann und Ho (J. Org. Chem. 59: 4364-4366, 1994) erzeugt wurde.
Bibliotheken von Substanzen, die β-Strangtemplate enthalten, können hergestellt werden, um die optimale Sequenz für die Substrat-Erkennung oder Bindung zu bestimmen. Repräsentative Strategien, solche Bibliotheken zu verwenden, sind unten diskutiert.
Eine repräsentative β-Faltblatt-Mimetikum-Substrat-Bibliothek kann wie folgt konstruiert werden. Es sollte verstanden werden, daß das Folgende beispielhaft für die Methodologie ist, die dazu verwendet werden kann, eine β-Faltblatt-Mimetikum-Substrat-Bibliothek herzustellen und daß andere Bibliotheken auf eine analoge Weise hergestellt werden können.
In einem ersten Schritt kann eine Bibliothek des folgenden Typs:
R&sub1;, R&sub3;, R = Aminosäure-Seitenketten-Gruppen oder Derivate davon; Y = H, Ac, SO&sub2;R; und das umkreiste "P" stellt einen festen Träger dar.
auf einem festen Träger (PEGA-Harz, Meldal, M. Tetrahedron Lett. 33: 3077.80, 1992; kontrolliertes Porenglas, Singh et al., J. Med. Chem. 38: 217-19, 1995) konstruiert werden. Der feste Träger kann dann in einen Dialysebeutel (Bednarski et al., J. Am. Chem. Soc. 109: 1283-5, 1987) mit dem Emzym (z. B. einer Protease) in einem geeigneten Puffer plaziert werden. Der Beutel wird dann in einem Becherglas mit Überschußpuffer plaziert. Die enzymatische Reaktion wird als eine Funktion der Zeit durch HPLC überwacht und Materialien, die von dem Polymer abgespalten werden, werden durch MS/MS analysiert. Diese Strategie stellt Informationen in Bezug auf die besten Substrate für ein bestimmtes Enzym/Protease zur Verfügung.
Die Synthese des oben genannten β-Faltblatt-Mimetikums wird durch das retrosynthetische Verfahren, das als nächstes gezeigt ist, verdeutlicht:
Die Komplexität der erzeugten Bibliothek durch diese Technik ist (R&sub1;) (R&sub3;) (R) (Y). Unter der Annahme, daß R&sub1;, R&sub3; und R aus natürlich auftretenden Aminosäure-Seitenketten-Gruppen ausgewählt sind, n konstant ist und Y H, Ac oder -SO&sub2;R wie oben definiert ist, wird eine Bibliothek, die eine Größenordnung von 24.000 Mitgliedern aufweist [(20) (20) (20) (3)], erzeugt.
Nach Screenen der Bibliothek gegen eine Protease kann die Bibliothek dann zurückerhalten werden und mit einer zweiten Protease gescreent werden und so weiter.
Zusätzlich kann eine Bibliothek von Inhibitoren hergestellt werden und in einem Standardchromogenen Test gescreent werden. Zum Beispiel kann die Bibliothek wie folgt konstruiert werden, wobei das folgende Beispiel nur repräsentativ für die Inhibitor-Bibliotheken ist, die auf analoge Weise zu dem spezifischen Beispiel, das unten zur Verfügung gestellt wird, hergestellt werden können.
(Siehe Wassermann et al., J. Chem. 59: 4364-6, 1994)
Eine weitere alternative Strategie ist es, die Bibliothek über die Seitenketten-R-Gruppe zu verbinden, wie unten gezeigt.
Eine Bibliothek von Asparagin-Protease-Inhibitoren kann konstruiert werden, die die folgende beispielhafte Struktur aufweist und dann vom Harz abgespalten und gescreent werden:
Ähnlich kann für Metalloproteasen eine Bibliothek, die die unten gezeigte beispielhafte Struktur aufweist konstruiert werden und dann von dem Harz abgespalten werden, um eine Bibliothek von Hydroxamsäuren zur Verfügung zu stellen:
Die Aktivität der β-Faltblatt-Mimetika kann weiterhin unter Bezugnahme auf Tabelle 2 verdeutlicht werden, die biologisch aktive Peptide auflistet. Insbesondere sind die Peptide der Tabelle 2 dafür bekannt, biologische Aktivität als Substrate oder Inhibitoren aufzuweisen.

Tabelle 2

Biologisch aktive Proteaseinhibitoren

(a) (D) FPR (Thrombin)

Enzyme 40: 144-48, 1988

(b) (D) IEGR (Faktor X)

Handbook of Synthetic Substrates for the Coagulation and Fibronlytic Sysstems, H. C. Hemker, pp. 1-175, 1983, Martinus Nijhoff Publishers, The Hague.
Im Hinblick auf die oben angegebenen biologisch aktiven Peptide, können β-Faltblatt- Mimetika der vorliegenden Erfindung für eine oder mehrere Aminosäuren davon substituiert sein. Zum Beispiel können die folgenden β-Faltblatt-modifizierten Peptide synthetisiert werden:
Noch allgemeiner können die β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung synthetisiert werden, um durch die geeignete Auswahl der R&sub1;-, R&sub2;-, R&sub3;-, Y- und Z-Gruppen (sowie den A-, B- und C- Gruppen der Struktur (I) selber) jede Zahl von biologisch aktiven Peptiden nachzuahmen. Es wird weiter durch die Tabelle 3 verdeutlicht, die verschiedene Modifikationen offenbart, die an den β-Faltblatt-Mimetika der Struktur (I) gemacht werden können, um biologisch aktive Verbindungen zu ergeben. In Tabelle 3 sind R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt aus den Atomen und Gruppen, die unter der "R&sub2;/R&sub3;"-Spalte gezeigt sind. Tabelle 3 Modifikationen der Struktur (I), um biologisch aktive Verbindungen zu erhalten
Wenn die β-Faltblatt-Mimetika der vorliegenden Erfindung für eine oder mehrere Aminosäuren eines biologisch aktiven Peptids substituiert werden, kann die Struktur des erhaltenen β-Faltblatt-modifizierten Peptids (vor dem Abspalten von dem festen Träger, wie zum Beispiel PAM) durch das folgende Diagramm dargestellt werden, worin AA&sub1; bis AA&sub3; dieselbe oder unterschiedliche Aminosäuren darstellen:
Das genaue β-Faltblatt-Mimetikum kann durch jede einer Vielzahl von Techniken ausgewählt werden, einschließlich Computer-Modelling, randomisierten Techniken und/oder durch Verwendung von natürlichem Substrat-Auswahl-Tests. Das β-Faltblatt-Mimetikum kann ebenfalls durch Synthetisieren einer β-Faltblatt-Mimetika-Bibliothek erzeugt werden und Screening solcher Bibliotheksmitglieder um aktive Mitglieder zu identifizieren, wie oben offenbart.
Sobald das optimierte β-Faltblatt-Mimetikum ausgewählt ist, kann eine Modifikation der verschiedenen daran angebrachten Aminosäuren durchgeführt werden. Eine Serie von β- Faltblatt-modifizierten Peptiden, die eine Vielzahl von Aminosäuresubstitutionen aufweisen, werden dann von dem festen Träger abgespalten und getestet, um ein bevorzugtes Substrat zu identifizieren. Es sollte verstanden werden, daß die Erzeugung von solchen Substraten die Synthese und das Screening einer Zahl von β-Faltblatt-modifizierten Peptiden einschließen kann, wobei jedes β-Faltblatt-modifizierte Peptid eine Vielzahl von Aminosäuresubstitutionen in Kombination mit einer Vielzahl von β-Faltblatt-Mimetika aufweist. Zusätzlich sollte ebenfalls erkannt werden, daß im Anschluß an die Abspaltung der β-Faltblatt-modifizierten Peptide von dem festen Träger, die Z-Gruppe AA&sub3; und die Y-Gruppe AA&sub2; und AA&sub1; in dem oben angegebenen Diagramm ist. (Während dieses Diagramm zur Verdeutlichung dargestellt ist, können zusätzliche oder weniger Aminosäuren an das β-Faltblatt-Mimetikum angebracht werden, gemeint ist, AA&sub3; kann fehlen oder zusätzliche Aminosäuren daran angefügt werden; und AA&sub2; und/oder AA&sub1; können ausgelassen werden oder zusätzliche Aminosäuren können daran angebracht werden).
Sobald ein bevorzugtes Substrat durch die oben offenbarten Verfahren identifiziert ist, kann das Substrat leicht durch bekannte Techniken in einen Inhibitor überführt werden. Zum Beispiel kann die C-terminale Aminosäure (in diesem Falle AA&sub1;) durch Addition einer Zahl von Gruppen modifiziert werden, von denen bekannt ist, daß sie einem Substrat eine Inhibitor-Aktivität verleihen, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf)-CF&sub3; (ein bekannter reversibler Serinprotease-Inhibitor), -CH&sub2;Cl (ein bekannter irreversibler Serinprotease- Inhibitor), -CH&sub2;N&sub2;+ und -CH&sub2;S(CH&sub3;)&sub2;+ (bekannte Cysteinylprotease-Inhibitoren), -NHOH (ein bekannter Metalloprotease-Inhibitor),
(ein bekannter Cysteinylprotease-Inhibitor) und
R' = CH&sub2;CH(CH&sub3;)CH&sub2;CH&sub3; R = CH&sub2;CH(CH&sub3;)&sub2;
oder
(ein bekannter Aspartylprotease-Inhibitor).
Während die Brauchbarkeit der β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung im Hinblick auf bestimmte Ausführungsformen offenbart wurde, wird es verstanden werden, daß eine große Vielzahl und Typen von Verbindungen hergestellt werden können, die die β-Faltblatt- Mimetika der vorliegenden Erfindung einschließen. Zum Beispiel kann ein β-Faltblatt- Mimetikum dieser Erfindung für eine oder zwei Aminosäuren eines Peptids oder Proteins substituiert werden. Zusätzlich zu einer Verbesserung und/oder Modifikation der β-Faltblatt- Struktur eines Peptids oder Proteins, insbesondere im Hinblick auf die konformationelle Stabilität, können die β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung ebenfalls dazu dienen, proteolytischen Abbau zu verhindern. Dies ergibt den zusätzlichen Vorteil von Peptiden oder Proteinen, die gegenüber proteolytischem Abbau aufgrund der Inkorporation der β-Faltblatt- Mimetika dieser Erfindung weniger anfällig sind.
In einem anderen Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Lagerung oder Verabreichung hergestellt sind, die eine therapeutisch effektive Menge eines β-Faltblatt-Mimetikums oder Verbindung der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger umfassen. Antikoagulierende Therapie ist für die Behandlung und Vorbeugung einer Vielzahl von thrombotischen Zuständen indiziert, insbesondere Coronar-Arterien- und cerebrovaskuläre Erkrankung. Der in diesem Gebiet erfahrene Fachmann wird leicht die Umstände bemerken, die eine antikoagulierende Therapie erfordern.
Die "therapeutisch effektive Menge" einer Verbindung der vorliegenden Erfindung wird von der Verabreichungsweise abhängen, dem Typ von warmblütigen Tier das behandelt wird und den physikalischen Charakteristika des zu betrachtenden Tieres. Diese Faktoren und deren Beziehung, um diese Menge zu bestimmen, sind dem in der Medizin erfahrenen Fachmann gut bekannt. Diese Mengen und das Verfahren der Verabreichung können so zurechtgeschnitten werden, um eine optimale Effizienz zu erreichen, werden jedoch von solchen Faktoren wie Gewicht, Diät, begleitende Medikation und andere Faktoren abhängen, die die Fachleute in der Medizin, wie angegeben, erkennen werden.
Die "therapeutisch effektive Menge" der Verbindung der vorliegenden Erfindung kann in Abhängigkeit von den gewünschten Effekten und der therapeutischen Indikation einen breiten Bereich einnehmen. Typischerweise werden Dosierungen zwischen 0,01 mg/kg und 100 mg/kg Körpergewicht, bevorzugterweise zwischen 0,01 und 10 mg/kg Körpergewicht betragen.
"Pharmazeutisch akzeptierbare Träger" zur therapeutischen Verwendung sind in der Pharmazie gut bekannt und sind zum Beispiel in Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985) beschrieben. Zum Beispiel können sterile Kochsalzlösung und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung bei physiologischem pH verwendet werden. Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Farbstoffe und sogar Aromamittel können in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden sein. Zum Beispiel können Natriumbenzoat, Sorbinsäure und Ester von p-Hydroxybenzoesäure als Konservierungsmittel hinzugefügt werden. Zusätzlich können Antioxidantien und Haltemittel verwendet werden.
Die Thrombin-Inhibierung ist nicht nur in der antikoagulierenden Therapie von Individuen brauchbar, die thrombotische Zustände aufweisen, sondern ist brauchbar, wann immer die Inhibierung von Blutkoagulation benötigt wird, wie zum Beispiel, um die Koagulation von gelagertem Gesamtblut zu verhindern und die Koagulation in anderen biologischen Proben für Tests oder bei Lagerung zu verhindern. Daher können die Thrombin-Inhibitoren hinzugefügt werden zu oder mit jedem Medium in Kontakt gebracht werden, das Thrombin enthält oder in Verdacht steht Thrombin zu enthalten, und in dem es wünschenswert ist, daß die Blutkoagulation inhibiert wird (z. B., wenn das Blut des Säugers mit Materialen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus vaskulären Grafis, Stems, orthopädischen Prothesen, Herzprothesen und extrakorporalen Zirkulationssystemen in Kontakt gebracht wird).
Die Thrombin-Inhibitoren können mit geeigneten Anti-Koagulationsmitteln oder thrombolytischen Mitteln, wie zum Beispiel Plasminogenaktivatoren oder Streptokinase coverabreicht werden, um synergistische Effekte bei der Behandlung von verschiedenen vaskulären Pathologien zu erreichen. Zum Beispiel verstärken Thrombin-Inhibitoren die Effizienz von Plasminogen-Aktivator-vermittelter thrombolytischer Reperfusion. Thrombin- Inhibitoren können als erstes im Anschluß an die Thrombus-Bildung verabreicht werden und Gewebeplasminogen-Aktivator oder eine anderer Plasminogen-Aktivator wird danach verabreicht. Sie können ebenfalls mit Heparin, Aspirin oder Warfarin kombiniert werden.
Die Thrombin-Inhibitoren der Erfindung können in solchen oralen Formen, wie Tabletten, Kapseln (beides schließt verzögerte Freisetzungs- oder Zeit-verzögerte Formulierungen ein), Pillen, Pulver, Granulate, Elixiere, Tinkturen, Suspensionen, Sirupe und Emulsionen, verabreicht werden. Ähnlich können sie in intravenöser (Bolus oder Infusion), intraperitonealer, subkutaner oder intramuskulärer Form verabreicht werden, wobei alle Gebrauchsformen dem Fachmann in der Pharmazie gut bekannt sind. Eine effektive, jedoch nicht-toxische Menge der gewünschten Verbindung kann als ein anti-Aggregationsmittel oder zur Behandlung der Ansammlung von Fibrin im Auge angewendet werden. Die Verbindungen können intraokular oder topisch verabreicht werden, sowie oral oder parenteral.
Die Thrombin-Inhibitoren können in Form einer Depot-Injektion oder Implantatpräparation verabreicht werden, die auf solche Weise formuliert werden können, daß sie eine verzögerte Freisetzung des aktiven Inhaltsstoffs erlauben. Der aktive Inhaltsstoff kann in Pellets oder kleine Zylinder komprimiert werden und subkutan oder intramuskulär als Depot-Injektionen oder Implantate implantiert werden. Implantate können inerte Materialien, wie zum Beispiel bio-abbaubare Polymere oder synthetische Silikone, zum Beispiel Silastik, Silikongummi oder andere Polymere, die durch die Dow-Corning Corporation hergestellt werden, verwenden.
Die Thrombin-Inhibitoren können ebenfalls in der Form eines Liposomen-Zuführ-Systems verabreicht werden, wie zum Beispiel kleine unilamellare Vesikel, große unilamellare Vesikel und multilamellare Vesikel. Liposomen können aus einer Vielzahl von Phospholipiden, wie zum Beispiel Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen, gebildet werden.
Die Thrombin-Inhibitoren können ebenfalls durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern als individuelle Träger zugeführt werden, an die die Verbindungsmoleküle gekuppelt sind. Die Thrombin-Inhibitoren können ebenfalls mit löslichen Polymeren als zielgerichtete Wirkstoffträger gekoppelt werden. Solche Polymere können Polyvinylpyrrolidon, Pyran Co-Polymer, Polyhydroxy-propyl-methacrylamid-phenol, Polyhydroxyethyl-aspartarnid-phenol oder Polyethylenoxid-polylysin, substituiert mit Palmitoylresten einschließen. Weiterhin können die Thrombin-Inhibitoren an eine Klasse von bio-abbaubaren Polymeren gekoppelt sein, die beim Erhalt der kontrollierten Freisetzung des Wirkstoffs brauchbar sind, zum Beispiel, Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Co-Polymere von Milch- und Polyglycolsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhdroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate und kreuz-vernetzte oder amphipatische Block-Co-Polymere von Hydrogelen.
Die Dosis und das Verfahren zur Verabreichung kann so zugeschnitten werden, daß eine optimale Effizienz erhalten wird, wird jedoch von solchen Faktoren wie Gewicht, Diät, begleitende Medikation und andere Faktoren abhängen, die der Fachmann in der Medizin erkennen wird. Wenn die Verabreichung parenteral sein soll, wie z. B. intravenös auf einer täglichen Basis, können injizierbare pharmazeutische Zusammensetzungen in konventionellen Formen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind oder als Emulsionen hergestellt werden.
Für die orale Verabreichung von aktiven Verbindungen dieser Verbindung (z. B. Strukturen (47), (20b), (37), (39), (29a), (35), (45), (51), (29b), (41) und (13b)) geeignete Tabletten können wie folgt hergestellt werden:
Alles der aktiven Verbindung, Zellulose und ein Teil der Maisstärke werden gemischt und werden zu einer 10%-Maisstärke-Paste granuliert. Das erhaltene Granulat wird gesiebt, getrocknet und mit dem Rest der Maisstärke und dem Magnesiumstearat gemischt. Das erhaltene Granulat wird dann in Tabletten komprimiert, die jeweils 25,0, 50,0 und 100,0 mg des aktiven Inhaltsstoffs pro Tablette enthalten.
Eine intravenöse Dosierungsform der oben angegebenen aktiven Verbindungen kann wie folgt hergestellt werden:
Aktive Verbindung 0,5-10,0 mg
Natriumzitrat 5-50 mg
Zitronensäure 1-15 mg
Natriumchlorid 1-8 mg
Wasser zur Injektion q. s. auf 1 ml
(USP)
Unter Verwendung der oben angegebenen Mengen wird die aktive Verbindung bei Raumtemperatur in einer vorher hergestellten Lösung aus Natriumchlorid, Zitronensäure und Natriumzitrat in Wasser zur Injektion (USP, siehe Seite 1636 der United States Pharmacopoeia/National Formulary für 1995, veröffentlicht durch United States Pharmacopoeia Convention, Inc., Rockville, Maryland, Copyright 1994) gelöst.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind, wenn hergestellt und ausgewählt wie offenbart, als potente Inhibitoren von Thrombin in vitro und in vivo brauchbar. Als solche sind diese Verbindungen als in vitro-Diagnostik-Reagenzien brauchbar, um das Verklumpen von Blut zu verhindern und als in vivo pharmazeutische Mittel, um die Thrombose in Säugern zu verhindern, die in Verdacht stehen, einen durch abnormale Thrombose-charakterisierten Zustand aufzuweisen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind als in vitro-Diagnostik-Reagenzien zur Inhibierung von Verklumpung in Blut-führenden Röhren brauchbar. Die Verwendung von gestopften Teströhrchen, die ein Vakuum darin aufweisen, als ein Mittel, um Blut in das Röhrchen abzunehmen, das durch Venipunktion erhalten wurde, ist in der Medizin gut bekannt (Kasten, B. L. "Specimen Collection," Laboratory Test Handbook, 2nd Edition, Lexi- Comp Inc., Cleveland pp. 16-17, Edits. Jacobs, D. S. et al. 1990). Solche Vakuumröhren können frei von Gerinnungs-inhibierenden Zusatzstoffen sein, wobei sie in diesem Falle für die Isolierung von Säugerserum aus dem Blut brauchbar sind, sie können Verklumpungsinhibierende Inhaltsstoffe (wie zum Beispiel Heparinsalze, EDTA-Salze, Zitratsalze oder Oxalatsalze) enthalten, wobei sie in diesem Fall für die Isolierung von Säugerplasma aus dem Blut brauchbar sind. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind potente Inhibitoren von Faktor Xa oder Thrombin und können als solche in Blutsammelröhren inkorporiert werden, um ein Verklumpen des Säugerbluts, das in sie hineingezogen wird, zu vermeiden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden allein, in Kombination mit anderen Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder in Kombination mit anderen bekannten Inhibitoren der Gerinnung in den Blutsammelröhrchen verwendet. Die Menge, die zu solchen Röhrchen zugefügt wird, ist diejenige Menge, die ausreichend ist, um die Bildung eines Klümpchens zu verhindern, wenn das Säugerblut in das Röhrchen hineingezogen wird. Die Zugabe von den Verbindungen zu solchen Röhrchen kann durch gut bekannte Verfahren erreicht werden, zum Beispiel durch Einführung einer flüssigen Zusammensetzung davon, als eine feste Zusammensetzung davon oder einer flüssigen Zusammensetzung, die zu einem Feststoff lyophilisiert ist. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden zu Blutsammelröhrchen in solchen Menge hinzugefügt, daß, wenn mit 2 bis 10 ml Säugerblut kombiniert, die Konzentration solcher Verbindungen ausreichend sein wird, um die Klümpchenbildung zu verhindern. Typischerweise wird die benötigte Konzentration von ungefähr 1 bis 10.000 nM sein, wobei 10 bis 1.000 nM bevorzugt sind.
Die folgenden Beispiele werden zur Verdeutlichung angeboten.

BEISPIELE

Beispiel 1

Synthese von repräsentativem 3-Faltblatt-Mimetikum

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines repräsentativen β-Faltblatt-Mimetikums dieser Erfindung. Synthese von Struktur (1):
Phenylalaninbenzaldimin, Struktur (1), wurde wie folgt synthetisiert. Zu einem Gemisch von L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid (7,19 g, 33,3 mMol) und Benzaldehyd (3,4 ml, 33,5 mMol), bei Raumtemperatur gerührt in CH&sub2;Cl&sub2; (150 ml) wurde Triethylamin (7,0 ml, 50 mMol) hinzugefügt. Wasserfreies Magnesiumsulfat (2 g) wurde zu der erhaltenen Lösung hinzugefügt und das Gemisch wurde 14 Stunden gerührt, dann mit CH&sub2;Cl&sub2; durch ein 1 Inch- Kissen Celite filtriert. Das Filtrat wurde unter verringertem Druck auf circa die Hälfte seines Ausgangsvolumen konzentriert und dann mit einem gleichen Volumen von Hexanen verdünnt. Das Gemisch wurde zweimal mit gesättigtem wässrigem NaHCO&sub3;, H&sub2;O und Lauge extrahiert, dann über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und filtriert. Die Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergab 8,32 g (93% Ausbeute) von farblosem Öl. ¹H NMR-Analyse zeigte nahezu reines (> 95%) Phenylalaninbenzaldimin. Das Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Synthese von Struktur (2):
α-Allylphenylalaninbenzaldimin, Struktur (2), wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung von Diisopropylamin (4,3 ml, 33 mMol) gerührt in THF (150 ml) bei -78ºC wurde tropfenweise eine Lösung von n-Butyllithium (13 ml einer 2,5 M Hexanlösung, 33 mMol) hinzugefügt. Die erhaltenen Lösung wurde für 20 Minuten gerührt, dann wurde eine Lösung von Phenylalaninbenzaldimin (7,97 g, 29,8 mMol) in THF (30 ml) langsam hinzugefügt. Die erhaltene dunkelrot-orange Lösung wurde für 15 Minuten gerührt, dann wurde Allylbromid (3,1 ml, 36 mMol) hinzugefügt. Die blassgelbe Lösung wurde für 30 Minuten bei -78ºC gerührt, dann eine Erwärmung auf Raumtemperatur ermöglicht und für eine weitere Stunde gerührt. Gesättigtes wässriges Ammoniumchlorid wurde hinzugefügt und das Gemisch wurde in Ethylacetat gegossen. Die organische Phase wurde getrennt und mit Wasser und Lauge gewaschen, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergab 8,54 g eines viskosen gelben Öls. Die Reinigung durch Säulenchromatographie ergab 7,39 g (87%) von α-Allylphenylalaninbenzaldimin als ein viskoses farbloses Öl. Synthese von Struktur (3):
α-Allylphenylalaninhydrochlorid, Struktur (3), wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung von α-Allylphenylalaninbenzaldimin (5,94 g, 19,3 mMol) gerührt in Methanol (50 ml) wurde 5%-wässrige Hydrochlorsäure (10 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, dann unter Vakuum zu einem orange-braunen Karamell konzentriert. Das Rohprodukt wurde in CHCl&sub3; (10 ml) gelöst und die Lösung wurde auf Kochen erhitzt. Hexane (~150 ml) wurden hinzugefügt und die leicht trübe Mischung wurde abgekühlt. Die Flüssigkeit wurde von dem kristallisierten Feststoff abgegossen, dann wurde der Feststoff mit Hexanen gespült und gesammelt. Das Entfernen von restlichem Lösemittel unter Vakuum ergab 3,56 g (72%) von gereinigtem α-Allylphenylalaninhydrochlorid als einen weißen kristallinen Feststoff
¹H NMR (500 MHz, CDCL&sub3;) δ 8,86 (3 H, br s), 7,32-7,26 (5 H, m), 6,06 (1 H, dddd, J = 17,5, 10,5, 7,6, 7,3 Hz), 5,33 (1 H, d, J = 17,5 H&sub2;), 5,30 (1 H, d, J = 10,5 Hz), 3,70 (3 H, s), 3,41 (1 H, d, J = 14,1 Hz), 3,35 (1 H, d, J = 14,1 Hz), 2,98 (1 H, dd, J = 14,5, 7,3 Hz), 2,88 (1 H, dd, J = 14,5, 7,6 Hz). Synthese von Struktur (4):
N-tert-Butyloxycarbonyl-α-allylphenylalanin, Struktur (4), wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung von D,L-α-Allylphenylalaninhydrochlorid (565 mg, 2,21 mMol), gerührt in einem Gemisch von THF (15 ml) und Wasser (5 ml) wurde Di-tert-Butyldicarbonat hinzugefügt, gefolgt von der vorsichtigen Zugabe von festem Natriumbicarbonat in kleinen Portionen. Das erhaltene zwei-phasige Gemisch wurde für zwei Tage bei Raumtemperatur stark gerührt und dann mit Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Wasser und Lauge gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergab ein farbloses Öl, das durch Säulenchromatographie gereinigt wurde (5-10% EtOAc in Hexane-Gradientenelution), um 596 mg (86%) von N-tert-Butyloxycarbonyl-α-allylphenylalanin zu ergeben.
TLC Rf = 0,70 (Silica, 20% EtOAc in Hexanen); ¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) δ 7,26-7,21 (3 H, m), 7,05 (2 H, d, J = 6,1 Hz), 5,64 (1 H, dddd, J = 14,8, 7,6, 7,2 7,2 Hz), 5,33 (1 H, br s), 5,12-5,08 (2 H, m), 3,75 (3 H, s), 3,61 (1 H, d, J = 13,5 Hz), 3,21 (1 H, dd, J = 13,7, 7,2 Hz), 3,11 (1 H, d, J = 13,5 Hz), 2,59 (1 H, dd, J = 13,7, 7,6 Hz), 1,47 (9 H, s). Synthese der Struktur (5):
Ein Aldehyd der Struktur (5) wurde wie folgt synthetisiert. Ozon wurde durch eine Lösung von 2,10 g (6,57 mMol) der Struktur (4) Olefin, gerührt bei -78ºC in einem Gemisch von CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml) und Methanol (15 ml) geblasen, bis die Lösung eine deutliche blaue Farbe hatte. Die Lösung wurde für weitere 15 Minuten gerührt, dann wurde Dimethylsulfid langsam hinzugefügt. Die erhaltenen farblose Lösung wurde bei -78ºC 10 Minuten gerührt, dann ein Erwärmen auf Raumtemperatur ermöglicht und für 6 Stunden gerührt. Die Lösung wurde unter Vakuum auf 2,72 g eines viskosen blassgelben Öls konzentriert, das durch Säulenchromatographie gereinigt wurde (10% bis 20% EtOAc in Hexane-Gradientenelution), um 1,63 g von reinem Aldehyd als ein viskoses farbloses Öl zu ergeben.
TLC Rf = 0,3 (Silica, 20% EtOAc in Hexanen); ¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) δ 9,69 (1 H, br s), 7,30-7,25 (3 H, m,), 7,02 (2 H, M,), 5,56 (1 H, br s), 3,87 (1 H, d; J = 17,7 Hz,), 3,75 (3 H, s,), 3,63 (1 H, d, J = 13,2 Hz), 3,08 (1 H, d, J = 17,7 Hz), 2,98 (1 H, d, J = 13,2 Hz,), 1,46 (9 H, s,). Synthese von Struktur (6):
Ein Hydrazon der Struktur (6) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung des Aldehyds von Struktur (5) (1,62 g, 5,03 mMol), gerührt in THF (50 ml) bei Raumtemperatur wurde Hydrazinhydrat (0,32 ml, 6,5 mMol) hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt und dann unter Reflux für 3 Tage erhitzt. Der Lösung wurde ermöglicht, auf Raumtemperatur abzukühlen und dann unter Vakuum auf 1,59 g (105% Rohausbeute) an farblosem Schaum konzentriert. Das rohe Hydrazonprodukt, Struktur (6), wurde ohne Reinigung verwendet.
TLC Rf = 0,7 (50% EtOAc in Hexanen); ¹H NMR (500 MHz, CECl&sub3;) δ 8,55 (1 H, br s), 7,32- 7,26 (3 H, m), 7,17 (1 H, br s), 7,09 (2 H, m), 5,55 (1 H, br s), 3,45 (1 H, d, J = 17,7 Hz), 3,29 (1 H, d, J = 13,5 Hz), 2,90 (1 H, d, J = 13,5 Hz), 2,88 (1 H, dd, J = 17,7 1,3 Hz), 1,46 (9 H, s); MS (CI+, NH&sub3;) m/z 304,1 (M + H&spplus;). Synthese von Struktur (7):
Ein zyklisches Hydrazid der Struktur (7) wurde wie folgt synthetisiert. Das Rohhydrazon von Struktur (6) (55 mg, 0,18 mMol) und Platinoxid (5 mg, 0,02 mMol) wurden in Methanol aufgenommen und die Flasche wurde mit einem Dreiweg-Stopfkorken verschlossen, der an einen Gummiballon angebracht war. Die Flasche wurde dreimal mit Wasserstoffgas gespült, der Ballon mit Wasserstoff aufgeblasen und das Gemisch wurde kräftig unter einer Wasserstoffatmosphäre für 17 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde durch Celite mit Ethylacetat filtriert und das Filtrat wurde unter Vakuum auf einen weißen Schaum konzentriert. Die Reinigung des weißen Schaums durch Flash-Chromatographie ergab 44 mg des reinen zyklischen Hydrazids von Struktur (7) (80%).
¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) δ 7,34-7,28 (3 H, m), 7,21 (2 H, m), 6,95 (1 H, br s), 5,29 (1 H, br s), 3,91 (1 H, br s), 3,35 (1 H, d, J = 12,9 Hz), 3,00 (1 H, ddd, J = 13,9, 5,3, 5,0 Hz), 2,96 (1 H, d, J = 12,9 Hz), 2,67 (1 H, br m), 2,38 (1 H, br m), 2,30 (1 H, ddd, J = 13,9, 5,4, 5,0 Hz), 1,45 (9 H, s); MS (CI+, NH&sub3;) m/z 306,2 (M + H&spplus;). Synthese der Struktur (8):
Struktur (8) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung des zyklischen Hydrazids der Struktur (7) (4,07 g, 13,32 mMol), gerührt in Ethylacetat (200 ml) bei 90ºC wurde Formaldehyd (1,2 ml einer 37%-wässrigen Lösung) hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 15 Stunden auf Reflux erhitzt, es ihm dann ermöglicht, auf Raumtemperatur abzukühlen und dann unter Vakuum zu einem weißen Schaum konzentriert. Die Produkte wurden durch Säulenchromatographie (5%, dann 10% Aceton/Chloroform) getrennt, um 0,851 g des am wenigsten polaren Diastereomers des bizyklischen Esters Struktur (8b) und ein mehr-polares Diastereomer (8a) zu ergeben. Die unreinen Fraktionen wurden einer zweiten Chromatographie unterzogen, um eine reinere Struktur (8b) zu erhalten, 25% kombinierte Ausbeute.
¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) δ 7,27-7,21 (3 H, m), 7.09 (2 H, d, J = 6,5 Hz), 5,59 (1 H, br s), 4,52 (1 H, dd, J = 9,1, 3, 4 Hz), 4,21 (2 H, m), 3,40 (1 H, d, J = 12,5 Hz), 3,32 (1 H, d, J = 12,5 Hz), 3,10 (2 H, m), 2,79 (1 H, br m), 2,66 (1 H, br m), 2,79 (1 H, br m) 2,66 (1 H, br m), 2,54 (1 H, br m), 2,46 (1 H, m), 2,18 (1 H, m), 1,44 (9 H, s), 1,28 (3 H, t, J = 7,0 Hz); MS (CI+, NH&sub3;) 418,4 (M + H&spplus;). Synthese der Struktur (9b):
Die Struktur (9) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung des am wenigsten polaren Ethylesters (d. h. Struktur (8b)) (31 mg, 0,74 mMol)), gerührt in THF (1 ml) wurde wässriges Lithiumhydroxid (1 M, 0,15 ml) hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt, dann wurde die Reaktion mit 5%-wässriger Zitronensäure gestoppt. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert (2 x), dann wurden die kombinierten Extrakte mit Wasser und Lauge gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum zu einem farblosen Glas konzentriert. Die Rohsäure, Struktur (9b), wurde in den nachfolgenden Experimenten ohne weitere Reinigung verwendet. Synthese von Struktur (10b):
Struktur (10b) wurde wie folgt synthetisiert. Die rohe Säure der Struktur (10b) (30 mg, 0,074 mMol), HArg (PMC)pNA (41 mg, 0,074 mMol), und HOBt (15 mg, 0,098 mMol) wurden in THF (1 ml) gelöst, dann wurde Diisopropylethylamin (0,026 ml, 0,1 S mMol) hinzugefügt, gefolgt von EDC (16 mg, 0,084 mMol). Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt und mit 5%-wässriger Zitronensäure, gesättigten Natriumbicarbonat, Wasser und Lauge extrahiert. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum auf 54 mg von blassgelbem Glas konzentriert. Die Produkte wurden durch Säulenchromatographie getrennt, um 33 mg (50%) eines Gemisches von Diastereomeren des gekoppelten (d. h. geschützten) Produkts (Struktur 10b) zu ergeben. MS (Ci+, NH&sub3;) m/z 566,6 (M + H&spplus;). Synthese von Struktur (11b):
Ein β-Faltblatt-Mimetikum der Struktur (11b) wurde wie folgt synthetisiert. Eine Lösung von 0,25 ml von H&sub2;O, 0,125 ml von 1,2-Ethandithiol und 360 mg von Phenol in 5 ml TFA wurde hergestellt und das geschützte Produkt von Struktur (10b) (33 mg, 0,035 mMol) wurde in 2 ml dieser Lösung gelöst. Die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt, dann unter verringertem Druck konzentriert. Ether wurde zu dem Konzentrat hinzugefügt und das erhaltene Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt. Das Präzipitat wurde mit Ether trituriert und zwei weitere Male zentrifugiert, dann in einem Vakuum-Desiccator für 14 Stunden getrocknet. Das rohe Produkt (14 mg) wurde durch HPLC-Chromatographie gereinigt, um das β-Faltblatt-Mimetikum von Struktur (11b)-zu ergeben. MS (Ci+, NH&sub3;) m/z 954,8 (M + Na&spplus;). Synthese von Struktur (12b):
Struktur (12b) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung der Rohsäure von Struktur (9b) (24 mg, 0,026 mMol) und N-Methylmorpholin (0,008 ml), gerührt in THF (1 ml) bei -50ºC wurde zu Isobutylchloroformat hinzugefügt. Das erhaltene trübe Gemisch wurde für 10 Minuten gerührt, dann wurden 0,016 ml (0,14 mMol) N-Methylmorpholin hinzugefügt, gefolgt von einer Lösung von HArg(Mtr)CH&sub2;Cl (50 mg, 0,068 mMol) in THF (0,5 ml). Das Gemisch wurde für 20 Minuten bei -50ºC gehalten, dann wurde es ihm erlaubt, sich während einer Stunde auf Raumtemperatur zu erwärmen. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit 5%-wässriger Zitronensäure, gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat und Lauge extrahiert. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert, um 49 mg von farblosem Glas zu ergeben, Struktur (12). Trennung durch Säulenchromatographie ergab 12 mg eines weniger polaren Diastereomers und 16 mg eines mehr polaren Diastereomers.
¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) δ 7,93 (1 H, br s), 7,39-7,31 (3 H, m), 7,16 (2 H, d, J 0 6,9 Hz), 6,52 (1 H, s), 6,30 (1 H, br s), 5,27 (1 H, s), 4,74 81 H, dd, J 0 9,1, 6,9 Hz), 4,42 (1 H, br d, J = 6,8 Hz), 4,33 (1 H, d, J = 6,8 Hz), 3,82 (3 H, s), 3,28 (1 H, d, J = 13,3 Hz), 3,26-3,12 (4 H, m), 2,98 (1 H, d, J = 13,3 Hz), 2,69 (3 H, s), 2,60 (3 H, s), 2,59-2,33 (4 H, m), 2,25-2,10 83 H m), 2,11 (3 H, s), 1,77 (1 H, br m), 1,70-1,55 (3 H, br m), 1,32 (9 H, s). Struktur von (13b):
Ein β-Faltblatt-Mimetikum der Struktur (13b) wurde wie folgt synthetisiert. Das mehr polare Diastereomer der Struktur (12b) (16 mg, 0,021 mMol) wurde in 95% TFA/H&sub2;O (1 ml) gelöst und die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur für 6 Stunden gerührt, dann unter Vakuum auf 11 mg Rohmaterial konzentriert. Das Rohmaterial wurde mit Ether trituriert und das Präzipitat wurde zweimal mit Ether gewaschen und dann unter Hochvakuum 14 Stunden getrocknet. ¹H NMR-Analyse zeigte ein 1 : 1-Gemisch von vollständig entschütztem Produkt und Produkt, das die Mtr-Schutzgruppe enthielt. Das Gemisch wurde in 95% TFA/H&sub2;O gelöst und für zwei Tage gerührt und das Produkt wurde, wie oben beschrieben, erhalten. Reinigung des Produkts durch HPLC ergab 5 mg der reinen Verbindung der Struktur (13b). MS (EI+) m/z 477,9 (M&spplus;).

Beispiel 2

Synthese von repräsentativem β-Faltblatt-Mimetikums

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung. Synthese von Struktur (14):
N,O-Dimethylhydroxamat, Struktur (14), wurde wie folgt synthetisiert. Zu einem Gemisch von Boc-Ng-4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonyl-L-arginin (8,26 g, 14,38 mMol), N,O- Dimethylhydroxylaminhydrochlorid (2,78 g, 28,5 mMol) und 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (2,45 g 16,0 mMol), gerührt in THF (150 ml) bei Umgebungstemperatur wurde N,N- Diisopropylethylamin (7,5 ml, 43 mMol) hinzugefügt, gefolgt von festem EDC (3,01 g, 15,7 mMol). Die erhaltene Lösung wurde für 16 Stunden gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt (200 ml) und sequenziell mit 5%-wässriger Zitronensäure, gesättigtem Natriumbicarbonat, Wasser und Lauge extrahiert. Die organische Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Konzentration von dem Filtrat unter Vakuum ergab 7,412 g eines weißen Schaums.
¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;): δ 6,52 (1 H, s), 6,17 (1 H, br s), 5,49 (1 H, d, J = 8,8 Hz), 4,64 (1 H, br t), 3,82 (3 H, s), 3,72 (3H, s), 3,36 (1 H, br m), 3,18 (3H, s), 3,17 (1 H, br m), 2,69 (3H, s), 2,61 (3H, s), 2,12 (3H, 2), 1,85-1,55 (5 H, m), 1,41 (9 H, s); MS (FB+): m/z 530,5 (M + H&spplus;). Synthese von Struktur (15):
Struktur (15) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung des Argininamids (7,412 g, 13,99 mMol), gerührt in Dichlormethan (150 ml) bei Raumtemperatur wurde N,N- Diisopropylethylamin (2,9 ml, 17 mMol), gefolgt von Di-tert-Butyldicarbonat (3,5 ml, 175,4 mMol) und N,N-Dimethylaminopyridin (0,175 g, 1,43 mMol) hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wurde für 1,5 Stunden gerührt, dann in Wasser gegossen. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und mit zwei 100 ml Teilen von Dichlormethan extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit Lauge geschüttelt, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergab einen weißen Schaum, der durch Flash-Chromatographie gereinigt wurde, um 8,372 g eines weißen Schaums zu ergeben.
¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;): δ 979 (1 H, s), 8,30 (1 H, t, J = 4.96), 6,54 (1 H, s), 5,18 (1 H, d, J = 9, 16 Hz), 4,64 (1 H, m), 3,83 (3 H, s), 3,74 (3 H, s), 3,28 (2 H, dd, J = 12,6, 6,9 Hz), 3,18 (3 H, s), 2,70 (3 H, s), 2,62 (3 H, s), 2,14 (3 H, s), 173-150 (5 H, m), 1,48 (9H, s), 1,42 (9 H, s); MS (FB&spplus;) m/z 6306 (M + H&spplus;). Synthese von Struktur (16):
Das Arginal, Struktur (16) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung des Argininamids, Struktur (16), gerührt in Toluol bei -78ºC unter einer trockenen Argonatmosphäre, wurde ein Lösung von Diisobutylaluminiumhydrid in Toluol (1,0 M, 7,3 ml) tropfenweise über eine Zeitdauer von 15 Minuten hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wurde für 30 Minuten gerührt, dann wurde ein zweiter Teil von Diisobutylaluminiumhydrid (3,5 ml) hinzugefügt und das Rühren wurde für 15 Minuten fortgeführt. Methanol (3 ml) wurde tropfenweise hinzugefügt und die Lösung wurde bei -78ºC für 10 Minuten gerührt, und es ihr dann erlaubt, sich auf Raumtemperatur zu erwärmen. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt und mit 50 ml gesättigtem wässrigem Natriumkaliumchloridtartrat 2,5 Stunden gerührt. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und mit Ethylacetat (2 · 100 ml) extrahiert. Die Extrakte wurden mit der organischen Ausgangslösung kombiniert und mit Lauge geschüttelt, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergab einen weißen Schaum, der durch Flash-Chromatographie getrennt wurde, um 1,617 g des Aldehyds als einen weißen Schaum zu ergeben.
¹H NMR (500MHz, CDCl&sub3;): δ 9,82 (1 H, s), 9,47 (1 H, s), 8,35 (1 H, br t), 6,55 (1 H, s), 5,07 (1 H, d, J = 6,9 Hz), 4,18 (1 H, br m), 3,84 (3 H, s), 3,25 (2 H, m), 2,70 (3 H, s), 2,62 (3 H, s), 2,14 (3 H, s), 1,89 (1 H, m), 163-155 (4 H, m), 1,49 (9H, s), 1,44 (9 H, s); MS (FB+): m/z 571.6 (M + H&spplus;). Synthese von Struktur (17):
Hydroxybenzothiazol, Struktur (17), wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung von Benzothiazol (1,55 ml, 14 mMol), gerührt in wasserfreiem Ethylether (60 ml) bei -78ºC unter einer trockenen Argonatmosphäre wurde ein Lösung von N-Butyllithium (2,5 M in Hexan, 5,6 ml, 14 mMol) tropfenweise über eine Zeitdauer von 10 Minuten hinzugefügt. Die erhaltene orange Lösung wurde für 45 Minuten gerührt, dann wurde eine Lösung der Arginal- Struktur (16) (1,609 g, 2,819 mMol) in Diethylether (5 ml) langsam hinzugefügt. Die Lösung wurde für 1,5 Stunden gerührt, dann wurde gesättigte wässrige Ammoniumchloridlösung zugefügt und es wurde dem Gemisch erlaubt, sich auf Raumtemperatur zu erwärmen. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat (3 · 100 ml) extrahiert, die kombinierten Extrakte wurden mit Wasser und Lauge extrahiert, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergab ein gelbes Öl, das durch Flash- Chromatographie gereinigt wurde (30%, dann 40% Ethylacetat/Heaxane Eluent), um 1,22 g Ausbeute des Hydroxybenzothiazols (circa 2 : 1-Gemisch von Diastereomeren) als einen weißen Schaum zu ergeben.
Das Gemisch von Hydroxybenzothiazolen (1,003 g, 1,414 mMol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (12 ml) bei Raumtemperatur gerührt und Trifluoressigsäure (3 ml) wurde hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wurde für 1,5 Stunden gerührt, dann unter verringertem Druck konzentriert, um 1,22 g des Benzothiazolylarginol-Trifluoressigsäuresalzes als einen gelben Schaum zu ergeben.
MS (EI+): m/z 506,2 (M + H&spplus;). Synthese von Struktur (18b):
Die bizyklische Verbindung, Struktur (18b) wurde wie folgt synthetisiert. Die bizyklische Säure der Struktur (9b) aus Beispiel 1 (151 mg, 0,387 mMol) und HOBt-Hydrat (71 mg, 0,46 mMol) wurden in THF (5 ml) gelöst und Diisopropylethylamin (0,34 ml, 1,9 mMol) wurde hinzugefügt, gefolgt von EDC (89 mg, 0,46 mMol). Nach Rühren für 10 Minuten wurde eine Lösung des Benzothiazolylarginol-Trifluoressigsäuresalzes (Struktur (17) 273 mg, 0,372 mMol) in THF (1 ml) hinzugefügt, zusammen mit einer THF (0,5 ml)-Spülung. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 Stunden gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt und sequenziell mit 5%-wässriger Zitronensäure, gesättigtem wässrigem Bicarbonat, Wasser und Lauge extrahiert. Die organisch Lösung wurde wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum auf 297 mg eines gelben Glases konzentriert. ¹H NMR-Analyse zeigte ein Gemisch von vier diastereoisomeren Amiden, die Struktur (18b) einschlossen. MS (ES+): m/z 877 (M+). Synthese von Struktur (19b):
Struktur (19b) wurde wie folgt synthetisiert. Das ungereinigte Hydroxybenzothiazol (247 mg, 0,282 mMol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) gelöst und Dess-Martin-Perjodinan (241 mg, 0,588 mMol) wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 6 Stunden gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt und mit wässrigen 10% Natriumthiosulfat für 10 Minuten stark gerührt. Die organische Lösung wurde abgetrennt und mit gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat, Wasser und Lauge extrahiert, dann über wasserfreiem Natriumbicarbonat getrocknet und filtriert. Die Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergab 252 mg eines gelben Glases. ¹H NMR-Analyse zeigte ein Gemisch von zwei diastereomeren Ketobenzothiazolen, die Struktur (19b) einschlossen. Synthese von Struktur (20b):
Das Ketobenzothiazol, Struktur (20), wurde wie folgt synthetisiert. Ketobenzothiazol (19) (41 mg, 0,047 mMol) wurde in 95%-wässriger Trifluoressigsäure (0,95 ml) gelöst und Thioanisol (0,05 ml) wurde hinzugefügt. Die erhaltene dunkle Lösung wurde für 30 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann unter Vakuum auf ein dunkelbraunes Gummi konzentriert. Das Gummi wurde mit Diethylether trituriert und zentrifugiert. Die Lösung wurde entfernt und der verbleibende Feststoff wurde zwei weitere Male wie oben offenbart trituriert und gesammelt. Der gelbe Feststoff wurde in einem Vakuum-Desiccator für zwei Stunden getrocknet, dann durch HPLC gereinigt (Vydac-Reverse-Phase C-4-Säule (22 · 250 mm ID). Mobile Phase: A = 0,05% TFA in Wasser; B = 0,05% TFA in Acetonitril. Die Flußrate war 10,0 ml/min. Der verwendete Gradient war 8% B zu 22% B über 25 Minuten und danach isokratisch bei 22%. Der Peak von Interesse (Struktur (20b)) eluierte bei 42 Minuten, um 2,5 mg des entschützten Produkts, Struktur (20b) zu ergeben.
MS (ES+): 563,5 (M + H&spplus;).

Beispiel 3

Aktivität eines repräsentativen β-Faltblatt-Mimetikum als ein proteolytisches Substrat

Dieses Beispiel verdeutlicht die Fähigkeit eines repräsentativen β-Faltblatt-Mimetikums dieser Erfindung selektiv als ein Substrat für Thrombin und Faktor XII zu dienen. Das β- Faltblatt-Mimetikum der Struktur (11b) oben wurde gemäß dem in Beispiel 1 offenbarten Verfahren synthetisiert und in diesem Experiment ohne weitere Modifikation verwendet. Sowohl die Thrombin-Tests und Faktor XII-Tests dieses Experiment wurden bei 37ºC unter der Verwendung eines Hitachi UV/Vis-Spektrophotometers (Modell U-3000) durchgeführt. Struktur (11b) wurde in deionisiertem Wasser gelöst. Die Konzentration wurde aus der Absorption bei 342 nm bestimmt. Ein Extinktionskoeffizient von 8270 Litern/Mol/cm wurde verwendet. Die Rate der Struktur (11b)-Hydrolyse wurde aus der Veränderung der Absorption bei 405 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten für p-Nitroanilin von 9920 Litern/Mol/cm für Reaktionspuffer bestimmt. Anfängliche Geschwindigkeiten wurden aus dem anfänglichen linearen Teil der Reaktionsfortschrittskurve berechnet. Kinetische Parameter wurden durch ungewichtete nicht-lineare letzte-Quadrate unter Anpassung der einfachen Michaelis-Menten-Gleichung an die experimentellen Daten unter der Verwendung von GraFit (Version 3.0, Erithacus Sofware Limited) bestimmt.
Für den Thrombin-Test wurden Experimente in pH 8,4 Trispuffer (Tris, 0,05 M; NaCl, 0,15 M) durchgeführt. 6,4 NIH-Einheiten von Rinderthrombin (von Sigma) wurden in 10 ml Testpuffer gelöst, um eine 10 nM Thrombinlösung zu ergeben. In einer UV-Küvette wurden 130 bis 148 ul des Puffers und einer Thrombinlösung hinzugefügt, präinkubiert bei 37ºC für zwei Minuten und zuletzt wurden 2 bis 20 Mikroliter (um das finale Volumen auf 250 ul einzustellen) von 0,24 mM Struktur (11b) Lösung hinzugefügt, um die Reaktion zu starten. Die ersten zwei Minuten der Reaktionen wurden für die Anfangs- Geschwindigkeitsbestimmung aufgezeichnet. Acht Struktur (11b) - Konzentrationspunkte wurden gesammelt, um die kinetischen Parameter zu erhalten. kcat und KM wurden als jeweils 50 s&supmin;¹ und 3 uM berechnet. kcat/KM wurde als 1,67 · 10&sup7; M&supmin;¹ s&supmin;¹ gefunden.
Für den Faktor XII-Test wurde pH 8,0 Trispuffer (0,05 M Tris, 5 mM CaCl&sub2;, 0,15 M NaCl, 0,1% TWEEN 20, 0,1% BSA) verwendet. 10 ul von 20 uM menschlichem Faktor XIIa (FVIIa) und 22 uM menschlichem Gewebefaktor (TF) wurden in Testpuffer gebracht, um jeweils 160 mM FVIIa- und TF-Lösungen herzustellen. 40 bis 48 ul Puffer, 25 ul von FVIIa- und 25 ul TF-Lösung wurden zu einer Küvette zugefügt und bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert, dann wurden 2 bis 10 ul von 2,4 mMol Struktur (11b)-Lösung zu der Küvette hinzugefügt, um die Reaktion zu starten (finales Volumen war 100 ul). Die anfänglichen 3 Minuten der Reaktionsfortschrittkurven wurden aufgezeichnet. Fünf-Struktur (11b) - Konzentrationspunkte wurden gesammelt. Die anfänglichen Raten wurden linear letzt- Quadrat angepasst gegen die Konzentrationen von Struktur (11b) mit GraFit. Der kcat/KM wurde aus der Steigung berechnet und als 17.500 M&supmin;¹ s&supmin;¹ gefunden.
In sowohl dem Thrombin und Faktor VII-Test dieses Experiments wurde (D)FPR-PNA als eine Kontrolle laufen gelassen. Die Aktivität von Struktur (11b), verglichen zu der Kontrolle, war 0,76 und 1,38 für jeweils Thrombin und Faktor VII (Faktor VII: kcat/KM = 1,27 · 10&sup4; M&supmin;¹ s&supmin;¹ ¹; Thrombin: kcat/KM = 2,20 · 10&supmin;&sup7; M&supmin;¹ s&supmin;¹).

Beispiel 4

Aktivität eines repräsentativen β-Faltblatt-Mimetikums als ein Protease-Inhibitor

Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit eines repräsentativen β-Faltblatt-Mimetikums dieser Erfindung, als ein Protease-Inhibitor für Thrombin, Faktor VII, Faktor X, Urokinase, Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA), Protein C, Plasmin und Trypsin zu funktionieren. Das β-Faltblatt-Mimetikum von Struktur (13b) oben wurde unter Verwendung der wie in Beispiel 1 offenbarten Verfahren synthetisiert, und in diesem Experiment verwendet.
Alle Inhibierungstests dieses Experiments wurden bei Raumtemperatur in 96 Tüpfel- Mikroplatten unter der Verwendung eines Bio-Rad-Plattenlesegeräts (Modell 3550) durchgeführt. 0,29 mg von Struktur (13b) wurden in 200 ml von 0,02 N-Hydrochloridsäure deionisierter Wasserlösung gelöst. Diese Lösung (2,05 mM) diente als die Vorratslösung für alle Inhibierungstests. Die Hydrolyse von chromogenem Substrat wurde bei 405 nm verfolgt. Die Reaktionsfortschrittskurven wurden durch Lesen der Platten typischerweise 90 Mal mit 30-Sekunden- bis 2-Minuten-Intervallen aufgezeichnet. Die Anfangsraten wurden durch nicht-gewichtete nicht-lineare letzte-Quadrate Anpassungen an eine Reaktion erster Ordnung in GraFit bestimmt. Die bestimmten anfänglichen Geschwindigkeiten wurden dann nicht- linear letzt-Quadrat angepasst gegen die Konzentrationen der Struktur (13b), unter der Verwendung von GraFit, um die IC&sub5;&sub0; zu erhalten. Typischerweise wurden acht Struktur (13b) -Konzentrationspunkte für die IC&sub5;&sub0;-Bestimmung angewendet.
Für den Thrombin-Test wurde N-p-Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA (von Sigma) bei einer 0,5 mM Konzentration in 1% DMSO (v/v) pH 8,4 Trispuffer als Substrat verwendet. Von der Struktur (13b) Vorratslösung wurden zwei Verdünnungsschritte hergestellt. Zuerst eine 1: 2000- Verdünnung in 0,02 N-Hydrochlorlösung, dann eine 1: 100-Verdünnung in pH 8,4 Trispuffer. Die finale Verdünnung von Struktur (13b) diente als der erste Punkt (10 nM). Sieben sequenzielle Verdünnungen wurden von dem ersten Punkt mit einem Verdünnungsfaktor von 2 hergestellt. In jeden Reaktionstüpfel wurden 100 ul von 10 nM Thrombinlösung und 50 ul von Struktur (13b)-Lösung hinzugefügt. Das Gemisch des Enzyms und des Inhibitors wurde für 25 Minuten inkubiert, dann wurde 100 ul von 0,5 mM Substratlösung hinzugefügt, um die Reaktion zu starten. Die IC&sub5;&sub0; von Struktur (13b) gegen Thrombin wurde als 1,2 ± 0,2 nM gefunden.
In dem Faktor VII-Test, wurde S-2288 (von Pharmacia), D-Ile-Pro-Arg-pNA bei 20 uM in deionisiertem Wasser als Substrat verwendet. Von dem Vorrat von Struktur (13b) wurde eine 1: 100-Verdünnung in pH 8,0 Trispuffer hergestellt. Diese Verdünnung diente als der erste Punkt des Inhibitors (20 uM). Von diesem Konzentrationspunkt wurden 6 weitere sequenzielle Verdünnungen mit einem Verdünnungsfaktor von 2 hergestellt. 50 ul von 16 nM FVIIa- und TF-Komplex-Lösung und 40 ul von Inhibitorlösungen wurden in jeden Tüpfel hinzugefügt, die Mischungen wurden für 20 Minuten inkubiert, bevor 10 ul von 20 mM 5- 2288 hinzugefügt wurden. Die IC&sub5;&sub0; von Struktur (13b) gegen Faktor VII wurde als 140 ± 3 nM gefunden.
In dem Faktor X-Test sind Puffer und das Substrat dieselbe, wie für den Thrombin-Test verwendet. Eine 1: 100-Verdünnung wurde in pH 8,4 Trispuffer hergestellt, um als der erste Punkt zu dienen. Sieben Verdünnungen mit einem Verdünnungsfaktor von 2 wurden hergestellt. Das Test-Protokoll ist dasselbe wie für Thrombin, außer daß 25 nM von Rinder- Faktor Xa (von Sigma) in pH 8,4 Trispuffer, anstelle von Thrombin verwendet wurde. Die IC&sub5;&sub0; von Struktur (13b) gegen Faktor X wurde als 385 ± 17 nM gefunden.
In dem Urokinase-Test war der Puffer pH 8,8 0,05 M Tris und 0,05 M NaCl in deionisiertem Wasser. S-2444 (von Sigma), pyroGlu-Gly-Arg-pNA bei 0,5 mM in Wasser wurde als Substrat verwendet. Das selbe Verdünnungsverfahren, wie für Faktor VII und Faktor X wurde verwendet. Das Test-Protokoll ist dasselbe, wie für Thrombin, außer daß 18,5 nM von menschlicher Urokinase (von Sigma) verwendet wurden. Die IC&sub5;&sub0; wurde als 927 ± 138 nM gefunden.
Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA): Puffer, Substrat und das Verdünnungsschema von Struktur (13b) waren dieselben, wie für den Faktor VII-Test verwendet.
Aktiviertes Protein C (aPC): der Puffer war der selbe, wie in dem Thrombin-Test verwendet. 1,25 mM S-2366 in dem Testpuffer wurde als Substrat verwendet. Die Verdünnungen von Struktur (13b) waren dieselben, wie im Urokinase-Test.
Plasmin: Puffer (siehe Thrombin-Test); S-2551 (von Pharmacia), D-Val-Leu-Lys-pNA bei 1,25 mN in Testpuffer wurde als Substrat verwendet. Für Verdünnungen von Struktur (13b) (siehe Urokinase-Test).
In den. Trypsin-Test wurde pH 7, 8 Tris (0,10 M Tris und 0,02 M CaCl&sub2;) als der Puffer verwendet. BAPNA (von Sigma) wurde bei 1 mg/ml in 1% DMSO (v/v) deionisierter Wasserlösung als ein Substrat verwendet. Dieselben Verdünnungen von Struktur (13b) wurden hergestellt, wie die für den Faktor VII-Test. 40 ul von 50 ug/ml Rindertrypsin (von Sigma) und 20 ul der Struktur (13b)-Lösung wurden zu dem Reaktionstüpfel hinzugefügt, das Gemisch wurde für 5 Minuten inkubiert, bevor 40 ul von 1 mg/ml BAPNA hinzugefügt wurde, um die Reaktion zu starten. Die IC&sub5;&sub0; von Struktur (13b) gegen Trypsin wurde als 160 ± 8 nM gefunden.
In den oben genannten Tests wurde (D)FPR-CH&sub2;Cl ("PPACK") als eine Kontrolle laufen gelassen. Die Aktivität von Struktur (13b) im Vergleich zu der Kontrolle war verstärkt (siehe Tabelle 4). Tabelle 4
Mit Bezug auf die Prothrombinzeit (PT), diese wurde durch Inkubieren (30 Minuten bei 37ºC) von 100 ul an Kontrollplasma (von Sigma) mit 1-5 ul von Puffer (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, pH = 8,4) oder Testverbindung (d. h. PPACK) oder Struktur (13b) in Puffer bestimmt. Dann wurden 200 ul von vorgewärmtem (bei 37ºC für 10 Minuten) Thromboplastin mit Kalzium (von Sigma) schnell zu der Plasmaprobe hinzugefügt. Die benötigte Zeit, um Gerinnung zu bilden, wurde manuell mit einer Stoppuhr (siehe Tabelle 5) aufgenommen und wurde als vergleichbar mit PPACK gefunden. Tabelle 5

Beispiel 5

Dieses Beispiel verdeutlicht die Fähigkeit eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung, als ein Inhibitor für Thrombin, Faktor VII, Faktor X, Urokinase, Gewebe-Plasminogen-Aktivator, aktiviertes Protein C, Plasmin, Tryptase und Trypsin zu funktionieren. Das β-Faltblatt-Mimetikum der Struktur (20b) oben wurde gemäß den Verfahren, die in Beispiel 2 angegeben sind, synthetisiert und in diesem Experiment verwendet.
Alle Inhibierungstests wurden bei Raumtemperatur in 96 Tüpfel-Mikroplatten unter der Verwendung eines Bio-Rad-Mikroplattenlesegeräts (Modell 3550) durchgeführt. Eine 1 mM Lösung von Struktur (20b) in Wasser diente als die Vorratslösung für alle Inhibierungstests. Die Hydrolyse von chromogenen Substraten wurde bei 405 nm gemessen. Die Reaktionsfortschrittskurven wurden durch Lesen der Platten aufgezeichnet, typischerweise 60 Mal mit 30-Sekunden bis 2-Minuten-Intervallen. Anfangsraten wurden durch nicht- gewichtete nicht-lineare letzte-Quadrate Anpassung an eine Reaktion erster Ordnung in GraFit (Erithacus Sofware Limited, London, England) bestimmt. Die bestimmten Anfangsgeschwindigkeiten wurden dann nicht-linear letzte-Quadrate angepasst, gegen die Konzentrationen von Struktur (20b) unter der Verwendung von GraFit, um Ki zu erhalten. Das generelle Format dieser Tests ist: 100 ml einer Substratlösung und 100 ml von Struktur (20b)-Lösung wurden in einen Mikroplattentüpfel hinzugefügt, dann wurden 50 ml Enzymlösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beginnen. Typischerweise wurden acht Struktur (20b)-Konzentrationspunkte für die Ki-Bestimmung verwendet. Die Werte von Ki von Struktur (20b) gegen neun Serinproteasen sind in Tabelle 6 aufgestellt.
Thrombin: N-p-Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA (von Sigma) wurde bei 0,5 mM Konzentration in 1% DMSO (v/v) pH 8,0 Trispuffer (Tris, 50 mM, TWEEN 20, 0,1%, BSA, 0,1%, NaCl, 0,15 M, CaCl&sub2;, 5 mM) als Substrat verwendet. Aus Struktur (20b)-Vorratslösung wurden zwei Verdünnungsschritte hergestellt, zuerst 1: 100-Verdünnungen in Wasser, dann in 1 : 50- Verdünnung in dem pH 8,0 Trispuffer, um als der erste Punkt zu dienen (200 nM). Sieben anschließende Verdünnungen wurden von dem ersten Punkt für den Test gemacht.
Faktor VII: S-2288 (von Pharmacia), D-Ile-Pro-Arg-pNA wurde bei 2,05 mM in dem pH 8,0 Trispuffer (siehe Thrombin-Test) verwendet. Von dem Vorrat an Struktur (20b) wurde eine 1: 100-Verdünnung in dem Trispuffer hergestellt. Von diesem Konzentrationspunkt wurden sieben weitere Verdünnungen für den Test hergestellt.
Faktor X: Puffer und Substrat waren dieselben, wie für den Thrombin-Test verwendet. Eine 1: 100-Verdünnung wurde in dem pH 8,0 Trispuffer hergestellt, um als der erste Punkt zu dienen. Sieben weitere Verdünnungen von dem ersten wurden für den Test gemacht.
Urokinase: Puffer, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH = 8,8. S-2444 (von Sigma), pyroGlu-Gly- Arg-pNA bei 0,25 mM in Puffer wurde als Substrat verwendet. Eine 1 : 10-Verdünnung in Puffer wurde von dem Vorrat an Struktur (20b) als der erste Punkt hergestellt, dann wurden weitere sieben Verdünnungen von dem ersten Punkt für den Test hergestellt.
Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t = PA): Puffer, Substrat und das Verdünnungsschema von Struktur (20b) waren dieselben, wie für den Faktor VII-Test verwendet.
Aktiviertes Protein C (aPC): Der Puffer war derselbe, wie in dem Thrombin-Test verwendet. 1,25 mM S-2366 wurde in dem Testpuffer in dem Substrat verwendet. Die Verdünnungen von Struktur (20b) waren dieselben, wie im Urokinase-Test.
Plasmin: Puffer (siehe Thrombin-Test); S-2251 (von Pharmacia), D-Val-Leu-Lys-pNA bei 1,25 mM in Testpuffer wurde als Substrat verwendet. Für Verdünnungen von Struktur (20b) (siehe Urokinase-Test).
Tryptase: 0,1 M Tris, 0,2 M NaCl, 0,1 mg/ml Heparin, pH = 8,0 wurde als Puffer verwendet. 0,5 M S-2366 (von Pharmacia), L-pyroGlu-Pro-Arg-pNA in Puffer wurde als Substrat verwendet. Von dem 1 mM-Vorrat von Struktur (20b) wurde eine 10 mM Lösung in Wasser hergestellt, dann wurde eine 1 mM Lösung in Puffer aus der 10 mM Lösung hergestellt, um als der erste Konzentrationspunkt dienen. Von diesem Punkt wurden weitere sieben Verdünnungen für den Test hergestellt.
Trypsin: Puffer, Substrat und das Verdünnungsschema von Struktur (20b) waren dieselben, wie für Thrombin verwendet. Tabelle 6
Wie durch die in Tabelle 6 dargestellten Daten oben gezeigt, funktionierte die Struktur (20b) als ein guter Thrombin-Inhibitor, mit guter Spezifität gegenüber fibrinolytischen Enzymen.

Beispiel 6

Synthese von repräsentativem β-Faltblatt-Mimetikum

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines repräsentativen β-Faltblatt-Mimetikums dieser Erfindung, das folgende Struktur (21) aufweist:
Struktur (21) wurde wie folgt synthetisiert. Eine Lösung von 48 mg (0,895 mMol) Na-FMOC- Ne-Cbz-a-Ethanal-Lys-OMe [synthetisiert von Ne-Cbz-Lys-OMe durch dasselbe Verfahren, das für die Herstellung von Struktur (5) aus Phe-OMe verwendet wurde], 15,9 mg (0,0859 mMol) Cys-Oet.HCl und 13,2 ul (0,0945 mMol) TEA wurden in 0,43 ml CH&sub2;Cl&sub2; unter Ar für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Bis(bis(trimethylsilyl)amino)tin (II) (39,8 ul) wurde hinzugefügt und die Reaktion über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit 10 ml EtOAc verdünnt und jeweils mit 6 ml 10% Zitrat, Wasser und Lauge gewaschen. Die organische Phase wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und konzentriert. Der erhaltene Rest wurde durch Flash-Chromatographie auf Silikagel unter Verwendung von 40% EtOAc/Hexanen gereinigt, um nach Trocknen in vacuo 12,9 mg von farblosem Öl (23%) als ein Gemisch von Diastereomeren von ¹H NMR (CDCl&sub3;) zu ergeben. MS Es (+) m/z 658,2 (MH&spplus;, 30) 675,3 (M + Na&spplus;, 100), 696,1 (M + K&spplus;, 45).

Beispiel 7

Synthese von repräsentativem β-Faltblatt-Mimetikum

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung. Synthese von Struktur (22):
Struktur (22) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer gerührten Lösung von Cbz-Glu(OBn)- OH (5 g, 13,5 mMol) mit DMAP (270 mg) und Methanol (3 ml) in Dichlormethan (100 ml) wurde EDCI (3 g) bei 0ºC hinzugefügt. Nach Rühren bei 0ºC für 3 Stunden wurde die Lösung bei Raumtemperatur (rt) über Nacht gerührt. Nach Konzentration wurde der Rest in EtOAc (100 ml) und 1N-HCL (100 ml) aufgenommen. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und mit EtOAc (100 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit gesättigtem NaHCO&sub3; (100 ml), Lauge (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) durch ein kurzes Polster voh Silikagel passiert und konzentriert, um 4,95 g eines Öls (95%) zur Verfügung zu stellen. Das Produkt war rein genug, um für die nächste Reaktion ohne jede weitere Reaktion verwendet zu werden. ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 2,00 (m, 1H), 2,25 (m, 1H), 2,50 (m, 2H), 3,74 (s, 3H, OCH&sub3;), 4,42 (m, 1 H, CHNH), 5,10 und 5,11 (zwei s, 4H, CH&sub2;Ph), 5,40 (d, 1H, NH), 7,35 (s, 10 H, Phenyle); MS CI (Isobutan) m/z 386 (M + H&spplus;). Synthese von Struktur (23):
Struktur (23) wurde wie folgt synthetisiert: Zu einer gerührten Lösung von L-Glu-OH (4,41 g, 30 mMol) mit Triethylamin (8,4 ml, 60 mMol) in 1,4-Dioxan (40 ml) und H&sub2;O (20 ml) wurde Boc&sub2;O (7 g, 32 mMol) bei rt hinzugefügt. Nach Rühren für 1,5 Stunden wurde die Lösung mit 6N HCl (pH 2) angesäuert und mit EtOAc (3 · 100 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit H&sub2;O (100 ml), Lauge (50 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und konzentriert, um ein Öl zur Verfügung zu stellen (9,5 g). Ohne weitere Reinigung wurde das Öl in der nächsten Reaktion verwendet.
Ein Gemisch des oben angegebenen Öls (9,5 g) mit Paraformaldehyd (5 g) und p-TsOH H&sub2;O (400 mg) in 1,2-Dichlorethan (200 ml) wurde bei Reflux mit einem Dean-Stark-Kondensator für 6 Stunden erhitzt, der mit einem Molekularsieb 4A gefüllt war. Nach Zugabe von EtOAc (100 ml) und gesättigter NaHCO&sub3; (50 ml) wurde die Lösung mit gesättigtem NaHCO&sub3; (3 · 50 ml) extrahiert. Die kombinierten wässrigen Extrakte wurden mit 6N HCl (pH 2) angesäuert und mit EtOAc (3 · 100 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Lauge (100 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und konzentriert, um ein Öl zur Verfügung zu stellen. Das ungereinigte Öl wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan : EtOAc = 80 : 20 zu 70 : 30 zu 60 : 40) gereinigt, um ein Öl zur Verfügung zu stellen, (4,04 g, 52%), das sich langsam nach Stehenlassen verfestigte. Synthese von Struktur (24):
Struktur (24) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer gerührten Lösung von 1,1,1,3,3,3- Hexamethyldisilazan (2,1 ml, 10 mMol) in THF (10 ml) wurde n-BuLi (4 ml von 2,5 Min Hexan, 10 mMol) bei 0ºC hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wurde bei derselben Temperatur für 30 Minuten gerührt. Nach Kühlen auf -78ºC wurde zu dieser gerührten Lösung eine Lösung von Carboxylsäure (23) (1,02 g, 3,94 mMol) in THF (10 ml) hinzugefügt, gefolgt von Waschungen der Zugabenspritze mit 5 ml THF. Die erhaltene Lösung wurde für eine Stunde bei -78ºC gerührt und PhCH&sub2;Br (0,46 ml, 3,9 mMol) wurden zugefügt. Nach Rühren bei - 30ºC für drei Stunden wurde zu der Lösung 1N HCl (50 ml) hinzugefügt und die erhaltene Lösung wurde mit EtOAc (100 ml) extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Lauge (50 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und konzentriert, um ein Öl zur Verfügung zu stellen. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan : EtOAc = 80 : 20 zu 60 : 40 zu 50 : 50) gereinigt, um einen schaumigen Feststoff (1,35 g, 98%) zur Verfügung zu stellen: ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 1,55 und 1,63 (zwei s, 9H, Verhältnis 1,5 : 1 von Rotamer, OC(CH&sub3;)&sub3;), 2,2- 2,4 (m, 3 H, -CH&sub2;CH&sub2;-), 2,6-2,9 (Set von m, 1 H, -CH&sub2;CH&sub2;-), 2,04 (d, 1H, J = 13,5 Hz, - CH&sub2;Ph), 3,33 und 3,58 (zwei d, 1H, J = 13 Hz, Verhältnis 2 : 1, -CH&sub2;Ph), 4,03 (zwei d, 1H, J = 4 Hz, A von Abq, -NCH&sub2;O-), 4,96 (zwei d, 1H, J = 4 Hz, B von Abq, -NCH&sub2;O-); MS (ES-) M/Z 348 (M - H&spplus;). Synthese von Struktur (25):
Die Synthese von Struktur (25) wurde wie folgt durchgeführt. Zu einer gerührten Lösung von Carboxylsäure (24) (1,05 g, 3,0 mMol) in trockenem THF (5 ml) wurden 1,1'- Carbonyldiimidazol (500 mg, 3,1 mMol) bei Raumtemperatur hinzt gefügt. Die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Die Lös zng von Acylimidazol wurde für die nächste Reaktion ohne Reinigung verwendet.
In der Zwischenzeit wurde zu einer gerührten Lösung von 1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazan (1,6 ml, 7,5 mMol) in THF (5 ml) n-BuLi (3 ml einer 2,5 M Lösung n Hexan, 7,5 mMol) bei 0ºC hinzugefügt. Nach Rühren bei derselben Temperatur für 30 Minuten wurde die Lösung auf -78ºC abgekühlt. Zu der gerührten Lösung wurde eine Lösung von Cbz-Glu(OBn)-OMe (1,16 g, 3 mMol) in THF (5 ml) hinzugefügt, gefolgt von Waschungen der Zugabenspritze mit 2 ml THF. Die erhaltene Lösung wurde bei derselben Temperatur für 15 Minuten gerührt. Zu dieser gerührten Lösung wurde das oben angegebene Acylimidazol in 30 ml THF hinzugefügt. Nach Rühren für 30 Minuten bei -78ºC wurde zu dieser Lösung gesättigte NH&sub4;Cl (50 ml) hinzugefügt und mit EtOAc (2 · 75 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit gesättigtem NaHCO&sub3; (50 ml), Lauge (50 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), durch ein kurzes Kissten aus Silicagel passiert und konzentriert, um ein Öl zur Verfügung zu stellen. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt, (Hexan : EtOAc = 90 : 10 zu 80 : 20 zu 70 : 30 zu 60 : 40) um ein Öl zur Verfügung zu stellen (1,48 g, 69%): MS (ES+) m/z 734,4 (M + NHa&spplus;). Synthese von Struktur (26a):
Die Struktur (26a) wurde wie folgt synthetisiert. Eine gerührte Lösung des oben genannten Ausgangs-Ketoesters (25) (530 mg, 0,7 mMol) in EtOH/AcOH (10/l ml) wurde mit 10% Pd/C (ca. 100 mg) unter 20 atm Druck von H&sub2; für zwei Tage behandelt. Nach Filtration durch ein kurzes Kissen von Celite wurde das Filtrat konzentriert und in EtOAc (50 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit 1N HCl (30 ml), gesättigtem NaHCO&sub3; (30 ml), Lauge (30 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und konzentriert, um ein Öl zur Verfügung zu stellen. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan : EtOAc = 80 : 20 zu 60 : 40 zu 50 : 50 zu 20 : 80 zu 0 : 100) gereinigt, um einen schaumigen Feststoff (95 mg, 34%) zur Verfügung zu stellen. TLC (EtOAc) Rf 0,68; NMR (CDCl&sub3;) δ 1,38 (zwei s, 9 H, OC (CH&sub3;)&sub3;), 1,63 (s, 1 H), 1,75 (m, 2 H), 2,05 (m, 5 H), 2,1-2, 3 (Set von M, 1 H), 3,00 (d, 1 H, J = 14 Hz, CH&sub2;Ph), 3,21 (d, 1 H, J = 13,5 Hz CH&sub2;Ph), 3,74 (kollabiert zwei s, 4 H, OCH&sub3; und NCH), 4,53 (d, 1 H, J = 9,5 Hz), 5,01 (br, 1 H, NH); MS (ES+) m/z 403 (M + H&spplus;), 425 (M + Na&spplus;). Die Stereochemie wurde durch 2D-NMR ermittelt. Synthese von Struktur (27a):
Struktur (27a) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung von 28 mg (0,070 mMol) des bizyklischen Esters (26a), gerührt in 1 ml THF bei Raumtemperatur, wurden 0,14 ml 1,0 M wäßrige Lithiumhydroxidlösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 20 Stunden stark gerührt, und dann mit 5% wäßriger Zitronensäure (1 ml) gestoppt. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat (3 · 25 ml) extrahiert, dann wurden die kombinierten Extrakte mit Wasser und Lauge gewaschen und über wasserfreiem Naturiumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergaben 26 mg eines weißen Schaums, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Synthese von Struktur (28a)
Struktur (28a) wurde wie folgt synthetisiert. Die bizyklische Säure (27a) (26 mg, 0,067 mMol), Benzothiazolylargionl-Trifluoressigsäuresalz (Struktur (17) 61 mg, 0,083 mMol), EDC (21 mg, 0,11 mMol) und HOBt-Hydrat (16 mg, 0,10 mMol) wurden in THF (5 ml) gelöst und Diisopropylethylamin (0,34 ml, 1,9 mMol) wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 Stunden gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt und sequentiell mit 5% wäßriger Zitronensäure, gesättigtem wäßrigem Natriumbicarbonat, Wasser und Lauge extrahiert. Die organische Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und unter Vakuum auf 60 mg eines gelben Glases konzentriert. ¹H NMR Analyse zeigte ein Gemisch von vier diastereomeren Amiden. MS (ES+): m/z 898 (M + Na&spplus;). Synthese von Struktur (29a):
Ein β-Faltblatt-Mimetikum von Struktur (29a) wurde wie folgt synthetisiert. Das ungereinigte Hydrobenzothiazol (28a) (60 mg, 0,068 mMol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (2 ml) gelöst und Dess- Martin-Perjodinan (58 mg, 0,14 mMol) wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde für Raumtemperatur für sechs Stunden gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt und mit 10% wäßrigem Natriumthiosulfat 10 Minuten stark gerührt. Die organische Lösung wurde abgetrennt und mit gesättigtem wäßrigem Natriumbicarbonat, Wasser und Lauge extrahiert, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergab 42 mg von gelbem Glas. ¹H NMR Analyse zeigte ein Gemisch von zwei diastereomerem Ketobenzothiazolen.
Das Ketobenzothiazol (42 mg, 0,048 mMol) wurde in 95% wäßriger Trifluoressigsäure (0,95 ml) gelöst und Thioanisol (0,05 ml) wurde hinzugefügt. Die erhaltene dunkle Lösung wurde für 18 Stunden beim Raumtemperatur gerührt, dann unter Vakuum zu einem dunkelbraunen Gummi konzentriert. Das Gummi wurde mit Diethylether trituriert und zentritfugiert. Die Lösung wurde entfernt und der verbleibende Farbstoff wurde wie oben zwei weitere Male trituriert und gesammelt. Der gelbe Feststoff wurde in einem Vakuum-Desiccator für zwei Stunden getrocknet, dann durch HPLC gereinigt, um 1,4 mg des entschützten Produkts zu ergeben. MS (ES+): 562,4 (M + H&spplus;). HPLC: (tR = 21,17 Min.). Synthese von Struktur (26b):
Struktur (26b) wurde wie folgt synthetisiert. Eine gerührte Lösung des oben genannten Ausgangsketoesters (25) (615 mg, 0,86 mMol) in MeOH/(AcOH (10/1 ml) wurde mit 10% Pd/C (ca. 60 mg) unter 20 atm Druck von H&sub2; für drei Tage behandelt. Nach Filtration durch ein kurzes Kissen von Celite wurde das Filtrat konzentriert, um ein Öl zur Verfügung zu stellen. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan : EtOAc = 80 : 20 zu 60 : 40 zu 50 : 50 zu 0 : 100) gereinigt, um die mehr polare Fraktion zu sammeln (50 mg). Rf 0, 12 (Hexan : EtOAc = 60 : 40); MS (Es+) m/z 433 (M + H&spplus;).
Das oben genannte Öl wurde mit p-TsOH·H&sub2;O (5 mg) in 1,2-Dichlorethan (10 ml) bei Refluxtemperatur für zwei Tage behandelt. Nach Konzentration wurde das ölige Produkt durch präparative TLC (Hexan : EtOAc = 80 : 20 zu 60 : 40) gereinigt, um ein Öl zu ergeben (10 mg). TLC Rf 0,36 (Hexan : EtOAc = 60 : 40); ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 1,43 (s, 9 H), 1,66 (m, 3 H), 1,89 (m, 3 H), 2,14 (m, 1 H), 2,75 (m, 1 H); 2,98 (m, 1 H, CHN), 3,72 (s, 3 H, Me), 4,30 (m, 1 H), 5,59 (d, 1 H, NH), 7,1-7,3 (m, SH, Phenyl); MS CI (NH&sub3;) 403,2 (M + H&spplus;). Stereochemie wurde durch 2D-NMR zugewiesen. Synthese von Struktur (28b):
Struktur (28b) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung von 12 mg (0,030 mMol) des bizyklischen Esters (26b), gerührt in THF 1 ml bei Raumtemperatur, wurden 0,06 ml 1,0 M wäßrige Lithiumhydroxidlösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 24 Stunden stark gerührt, dann mit 5% wäßriger Zitronensäure (1 ml) gestoppt. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat (3 · 25 ml) extrahiert, dann wurden die vereinigten Extrakte mit Wasser und Lauge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergab 19 mg von weißem Schaum.
Der Schaum, Benzothiazolylarginol-Trifluoressigsäuresalz (30 mg, 0,041 mMol) EDC (10 mg, 0,052 mMol) und HOBt-Hydrat (9 mg, 0,059 mMol) wurden in THF gelöst (2 ml) und Diisopropylethylamin (0,026 ml, 0,15 mMol) wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Stunden gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt und sequenziell mit 50% wäßriger Zitronensäure, gestättigtem wäßrigem Natriumdicarbonat, Wasser und Lauge extrahiert. Die organische Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum auf 28 mg eines gelben Glases konzentriert. ¹H NMR Analyse zeigte ein Gemisch von 4 diastereomeren Amiden an. MS (ES+): m/z 898 (M + Na&spplus;). Synthese von Struktur (29b):
Struktur (29b) wurde wie folgt synthetisiert. Das unreine Hydroxybenzothiazol (28b) (28 mg) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (2 ml) gelöst und Dess-Martin-Perjodinan (29 mg, 0,071 mMol) wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt und mit 10% wäßrigem Natriumthiosulfat für zehn Minuten stark gerührt. Die organische Lösung wurde abgetrennt und mit gesättigtem wäßrigem Natriumbicarbonat Wasser und Lauge extrahiert, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Konzentration des Filtras unter Vakuum ergab 32 mg eines gelben Glases. ¹H NMR Analyse zeigte ein Gemisch von zwei diastereomerem Ketobenzothiazolen.
Das Ketobenzothiazol (32 mg) wurde in 95% wäßriger Trifluoressigsäure (0,95 ml) gelöst und Thioanisol (0,05 ml) wurde hinzugefügt. Die erhaltene dunkle Lösung wurde für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann unter Vakuum zu einem dunkelbraunen Gummi konzentriert. Das Gummi wurde mit Diethyleter trituriert und zentrifugiert. Die Lösung wurde entfernt und der verbleibende Feststoff wurde zwei weitere Male trituriert und gesammelt, wie oben angegeben. Der gelbe Feststoff wurde in einem Vakuum-Desiccator für zwei Stunden getrocknet, dann durch HPLC gereinigt, um 1,3 mg des entschützten Produkts zu ergeben. MS (FB+): 562,36 (M + H&spplus;); HPLC: tR = 21,51 Min. (Gradient 0 bis 90% 0,1% TFA in CH&sub3;CN/0,1% TFA in H&sub2;O über 40 Minuten).

Beispiel 8

Aktivität von repräsentativem β-Faltblatt-Mimetikum als ein Proteaseinhibitor

Dieses Beispiel verdeutlicht die Fähigkeit eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung, als ein Inhibitor für Thrombin, Faktor VII, Faktor X, Faktor XI und Trypsin zu funktionieren. Die β-Faltblatt-Mimetika der Strukturen (29a) und (2%) oben wurden gemäß den in Beispiel 7 offenbarten Verfahren synthetisiert und in diesem Experiment verwendet.
Die Proteinase-Inhibitor-Tests wurden wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt, außer wie unten beschrieben für Faktor XI. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.
Faktor XI. Derselbe Puffer wurde in diesem Test verwendet, wie in dem Thrombin-Test. Ein mM 5-2366 (von Pharmacia), L-pyroGlu-Pro-Arg-pNA-Lösung in Wasser wurde als Substrat verwendet. Von einer 1 mM Vorratslösung von Struktur (29a) oder (29b) in Wasser wurde eine 1 : 10 Verdünnung in Puffer gemacht. Von dieser 100 uM Lösung wurden sieben serielle 1 : 5 Verdünnungen in Puffer für den Test hergestellt. Tabelle 7

Beispiel 9

Aktivitäten von repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika als ein Protease-Inhibitor

Dieses Beispiel verdeutlicht die Fähigkeit von weiteren repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung, als ein Inhibitor für Thrombin, Faktor VII, Faktor X, Faktor XI, Tryptase, aPC, Plasmin, tPA, Urokinase und Trypsin zu funktionieren. Die β-Faltblatt-Mimetika von Strukturen (20) und (29b) oben wurden gemäß den jeweils in Beispielen 2 und 7 offenbarten Verfahren hergestellt und in diesem Experiment verwendet.
Die Proteinase-Inhibitor-Tests wurden wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt, außer für Faktor XI, wie in Beispiel 8 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8
*Selektivität ist das Verhältnis von Ki eines Enzyms zu dem Ki von Thrombin

Beispiel 10

Synthese von repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung. Synthese von Struktur (30):
Struktur (30) wurde wie folgt synthetisiert. n-Butyllithium (700 ul, 1,75 mMol, 2,5 M in Hexanen) wurde über 5 Minuten zu einer Lösung von Tris(methyltio)methan (256 ul, 1,95 mMol) in THF (1 ml) bei -78ºC hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 40 Minuten gerührt, dann mit einer Lösung von bis-Boc-argininal (Struktur (16) von Beispiel 2) (100 mg, 1,75 mMol) in 2 ml THF tropfenweise über eine Zeitdauer von 5 Minuten behandelt. Nach Rühren für 1,5 Stunden wurde die Reaktion mit gesättigter NH&sub4;Cl-Lösung gestoppt und es ihr erlaubt, sich auf Raumtemperatur zu erwärmen. Die Lagen wurden getrennt und die wäßrige Phase mit EtOAc (3x) extrahiert, gewaschen mit Lauge (1x), getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und konzentriert. Die Reinigung durch Flash-Chromatographie (EtOAc: Hexan 1 : 4) ergab 93 mg (73%) von dem Orthothiomethylester (Struktur (30)) und 8 mg von zurückgewonnenem Aldehyd (Struktur (16)). ¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;.) δ 9,80 (s, 1 H), 8,32 (t, J = 5,0 Hz, 1 H), 6,54 (s, 1 H), 5,23 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 4,0 (m, 1 H), 3,84 (s, 3 H), 3,64 (br s, 1 H), 3,38 (br s, 1 H), 3,31 (m, 2 H), 2,70 (s, 3 H), 2,62 (s, 3 H), 2,19 (s, 9 H), 2,14 (s, 3 H), 1,68-1,50 (m, 4 H), 1,49 (s, 9 H), 1,43 (s, 9 H). Synthese von Struktur (31):
Struktur (31) wurde wie folgt synthetisiert. Ein Gemisch von 77 mg (0,11 mMol) des Orthothiomethylesters (Struktur (30)), 117 mg (0,43 mMol) von Quecksilberchlorid und 39 mg (0,18 mMol) von Quecksilberoxid in 2,5 ml 12 : 1 Methanol/Wasser wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde durch Celite gefiltert und der Rest mit EtOAc (3x) gewaschen. Das Filtrat wurde mit Wasser verdünnt und mit EtOAc (3x) extrahiert. Die organische Phase wurde zweimal mit 85% NH&sub4;OAc/NH&sub4;Cl gewaschen, dann mit NH&sub4;Cl und getrocknet (NH&sub2;SO&sub4;). Das Lösemittel wurde in vacuo entfernt und der Rest durch Flash-Chromatographie (EtOAc/Hex, 1 : 3) gereinigt, um 48 mg (72%) der zwei Diastereomere von Struktur (31) in einem 1 : 2,7-Verhältnis zu ergeben. ¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) (hauptsächliches Diastereomer) δ 9,80 (s, 1 H), 8,33 (t, J = 5,0 Hz, 1 H), 4,66 (d, J = 10,5 Hz, 1 H), 4,08 (dd, J = 5,0, 2,0 Hz, 1 H), 3,97 (m, 1 H), 3,84 (s, 3 H), 3,77 (s, 3 H), 3,30 (m, 2 H), 3,06 (d, J = 5,0 Hz, 1 H), 2,70 (s, 3 H), 2,63 (s, 3 H), 2,14 (s, 3 H), 1,68-1,50 (m, 4 H), 1,49 (s, 9 H), 1,40 (s, 9 H); MS (Es+) m/z 631,5 (M + H&spplus;). Synthese von Struktur (32):
Struktur (32) wurde wie folgt synthetisiert. Eine Lösung von 32 mg des Methylesters (Struktur (31)) (0,051 mMol) in THF/Wasser (4 ml, 1 : 3) wurde mit 5 mg (0,119 mMol) von LiOH·H&sub2;O behandelt. Nach Rühren für 45 Minuten wurde die Reaktion mit 5% Zitronensäure verdünnt und mit Ethylacetat (3x) extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit Lauge gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und konzentriert, um 30 mg (96%) von Struktur (32) als einen weißen Feststoff zu ergeben. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet. ¹H NMR 500 MHz, CDCl&sub3;) δ 9,80 (br s, 1 H), 8,29 (br s, 1 H), 6,54 (s, 1 H), 5,62 (br s, 1 H), 4,08 (m, 1 H), 3,82 (s, 3 H), 3,27 (br s, 3 h), 2,69 (s, 3 H), 2,62 (s, 3 H), 2,13 (s, 3 H), 1,65-1,50 (m, 4 H), 1,48 (s, 9 H), 1,37 (s, 9 H); MS (Es-) m/z 615,5 (M - H&spplus;): Synthese von Struktur (33):
Struktur (33) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung der Verbindung von Struktur (32) (29 mg, 0,047 mMol), wurden HOBt (8 mg, 0,056 mMol) und EDC (11 mg, 0,056 mMol) in THF (5 ml), Phenethylamin (7 ml, 0,056 mMol) hinzugefügt, gefolgt von Diisopropylethylamin (12 uL, 0,071 mMol). Das Reaktionsgemisch wurde bei rt über Nacht gerührt und mit 5% Zitronensäure verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wäßrige Phase mit EtOAc (3x) extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit einer gesättigten Lösung von NaHCO&sub3; und Lauge gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und filtriert. Nach Konzentration wurde das Rohprodukt durch Chromatographie gereinigt (EtOAc/Hex, 1 : 1), um 26 mg (77%) von Struktur (33) über zwei Schritte zu ergeben. ¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) δ 9,84 (s, 1 H), 8,34 (t, J = 5 Hz, 1 H), 7,28 (m, 3 H), 7,21 (m, 2 H), 7,04 (m, 1 H), 6,55 (s, 1 H), 4,11 (dd, J = 5,0, 3,0 Hz, 2 H), 3,17 (m, 1 H), 2,81 (t, J = 7,5 Hz, 2 H), 2,71 (s, 3 H), 2,65 (s, 3 H), 2,14 (s, 3 H), 1,68-1,52 (m, 4 H), 1,49 (s, 9 H), 1,39 (s, 9 H); MS (FAB+) m/z 720,6 (M + H&spplus;) (FAB-) m/z 718,5 (M - H&spplus;). Synthese von Struktur (34)
Struktur (34) wurde wie folgt synthetisiert. Zu einer Lösung von Phenethylamid (Struktur (33), 25 mg, 0,035 mMol) in THF (5 ml) wurden 18 mg von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,093 mMol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei rt über Nacht gerührt, um einen Baselinienpunkt durch TLC zu ergeben. Die Lösung wurde in vacuo konzentriert und der Rest zweimal mit Ether gewaschen, wobei der Überschuß pTsOH entfernt wurde, um Struktur (34) als einen gelblich-weißen Feststoff zu ergeben, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde. ¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) war konsistent mit den erwarteten Produkten, jedoch war eine individuelle Peak-Zuordnung aufgrund von Verbreiterung schwierig. MS (ES+) m/z 520,4 (M + H&spplus;).
Struktur (34) wurde mit Struktur (9a) von Beispiel 1 (auf eine analoge Weise zu dem in Beispiel 2 für die Synthese von Struktur (18) beschriebenen Verfahren) reagiert, gefolgt von Oxidation und Entschützung (auf eine analoge Weise wie im Hinblick auf die Oxidation und Entschützung von jeweils Strukturen (18) und (19) beschrieben), um Struktur (35) zur Verfügung zu stellen, wie in Tabelle 9 unten angegeben.

Beispiel 11

Synthese von repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung. Synthese von Struktur (36):
Struktur (36) wurde auf eine analoge Weise zu Verbindung (34) synthetisiert, ausgehend von Benzylamin und Struktur (32). ¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) war konsistent mit dem erwarteten Produkt, jedoch war die individuelle Peak-Zuweisung aufgrund von Verbreiterung schwierig. MS (FAB+) m/z 506, 4 (M + H&spplus;).
Struktur (36) wurde mit Struktur (9a) von Beispiel 1 reagiert (auf eine analoge Weise zu dem in Beispiel 2 für die Synthese von Struktur (8) beschriebenen Verfahren), gefolgt von Oxidation und Entschützung (auf eine analoge Weise, wie im Hinblick auf die Oxidation und Entschützung von Strukturen (18) und (19) jeweils beschrieben), um Struktur (37), wie in Tabelle 9 unten angegeben, zur Verfügung zu stellen.

Beispiel 12

Synthese von repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung. Synthese von Struktur (38):
Struktur (38) wurde auf eine analoge Weise zu Struktur (34) synthetisiert, ausgehend von p- Chlorphenethylamin und Struktur (32). ¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) war mit dem erwarteten Produkt konsistent, eine individuelle Peak-Zuweisung war jedoch aufgrund von Verbreiterung schwierig. MS (ES+) m/z 554,5 (M + H&spplus;).
Struktur (38) wurde mit Struktur (9a) aus Beispiel 1 reagiert (auf eine analoge Weise zu dem in Beispiel 2 für die Synthese von Struktur (18) beschriebenen Verfahren), gefolgt von Oxidation und Entschützung (auf eine analoge Weise wie im Hinblick auf die Oxidation und Entschützung von jeweils Strukturen (18) und (19) beschrieben), um Struktur (39), wie in Tabelle 9 unten angegeben, zur Verfügung zu stellen.

Beispiel 13

Synthese von repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung. Synthese von Struktur (40):
Struktur (40) wurde auf eine analoge Weise zu Verbindung (34) unter der Verwendung von p- Methoxyphenethylamin und Struktur (32) synthetisiert. ¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) war mit dem erwarteten Produkt konsistent, jedoch war eine individuelle Peakzuweisung aufgrund von Verbreiterung schwierig. MS (ES+) m/z 550,5 (M + H&spplus;).
Struktur (40) wurde mit Struktur (9a) von Beispiel 1 reagiert (in einer analogen Weise zu dem in Beispiel 2 für die Synthese von Struktur (18) beschriebenen Verfahren), gefolgt von Oxidation und Entschützung (auf eine analoge Weise wie im Hinblick auf die Oxidation und Entschützung von jeweils Strukturen (18) und (19) beschrieben), um Struktur (41) wie in Tabelle 9 unten angegeben, zur Verfügung zu stellen.

Beispiel 14

Synthese von repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung. Synthese von Struktur (42):
Struktur (42) wurde wie folgt hergestellt. In eine 10 ml Rundbodenflasche wurden CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml), Methyl-2,3-dimethylaminopropionatdihydrochlorid (19,9 mg, 0,103 mMol, 1,5 eq) und Diisopropylethylamin (53 ml, 0,304 mMol, 4,4 eq) hinzugefügt. Diese Suspension wurde magnetisch bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt, wobei zu dieser Zeit die Verbindung von Struktur (30) (50 mg, 0,068 mMol, 1 eq), Quecksilber(II)chlorid (82,4 mg, 0,304 mMol, 4,4 eq) und Quecksilber(II)oxid (25,7 mg, 0,120 mMol, 1,7 eq) hinzugefügt wurden. Die erhaltene gelbe Suspension wurde für 16,5 Stunden gerührt, wobei die Suspension während dieser Zeit grau wurde. Die Reaktion wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml) verdünnt, gewaschen mit gesättigtem wäßrigem NH&sub4;Cl (5 ml), gesättigtem wässrigem NaCl (5 ml) und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die trübe Suspension wurde gefiltert und das Lösemittel in vacuo entfernt. Der weiße Feststoff wurde auf separativer Dünnschichtchromatographie gereinigt, um die Imidazolinstruktur (42) (25,3 mg, 52% Ausbeute) als einen klaren amorphen Feststoff herzustellen: Rf 0,11 (10% MeOH/CHCl&sub3;); ¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) δ 9,82 (s, 0,6 H, N'H Gemisch von Tautomeren), 9,78 (s, = ,4H, N"H), 8,35 (dd, J = 4,3, 11 Hz, ¹H, N-5), 6,54 (s, 1 H, ArH), 5,08 (d, J = 11 Hz, CHOH), 4,52 (m, 1 H, Imidazolin CH&sub2;), 4,38 (d, J = 21 Hz, 1 H), 3,8- 4,0 (m, 2 H), 3,86 (s, 3H, CO&sub2;CH&sub3;), 3,767 (s, 3 H, ArOCH&sub3;), 3,5-3,7 (m, 2 H, C-5 CH&sub2;), 3,16- 3,27 (m, C-5 CH&sub2;), 2,70 (s, 3H, ArCH&sub3;), 2,63 (s, 3 H, ArCH&sub3;), 2,14 (s, 3 H, ArCH&sub3;), 1,5-1,7 (m, 4 H, C-3 und C-4 CH2), 1,49 (s, 9 H, Boc), 1,46 (s, 9 H, Boc); IR (Film) 1725,56, 1685,68, 1618,36, 1545, 1207, 09, 1148,85 cm&supmin;¹; MS (ES+) M/e 699,4 (M + H&spplus;). Synthese von Struktur (43):
Struktur (43) wurde wie folgt synthetisiert. In einer 25 ml Rundbodenflasche wurden die Verbindung von Struktur (42) (230 mg, 0,33 mMol), CHCl&sub3; (5 ml) und MnO&sub2; (500 mg, 5,75 mMol, 17,4 eq) plaziert. Nach Rühren für fünf Stunden wurde die Suspension filtriert und der Feststoff mit Methanol gewaschen. Das Lösemittel wurde in vacuo entfernt und der Rest wurde in Ethylacetat (5 ml) und Methanol (1 ml) gelöst, und ein frischer Teil von MnO&sub2; (500 mg) wurde eingeführt und die Reaktion für 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff wurde filtriert und das Lösemittel in vacuo entfernt. Der Rest wurde über Säulenchromatographie auf Silikagel gereinigt, mit 1 : 1 Ethylacetat : Hexan, dann reinem Ethylacetat, dann 1 : 9 Methanol : Ethylacetat eluiert, um das gewünschte Produkt als einen amorphen Feststoff zu erhalten.: (Struktur (43), 190 mg, 83% Ausbeute) Rf 0,64 (70 : 30- Ethylacetat : Hexan); ¹H NMR (500 MHz, CDCl&sub3;) δ 10.70 (bs, 1 H, Imidazol NH), 9,70 (s, 1H), 8,28 (s, 1 H), 7,84 (s, 1 H), 6,54 (s, 1 H, ArH), 5,35 (m, 1 H, aH), 5,25 8s, 1 H, BocNH), 3,926 (s, 3 H), 3,840 (s, 3 H), 3,15-3,40 (m, 2H9, 2,682 (s, 3 H), 2,133 (s, 3 H), 1,52-1,70 (m, 4 H), 1,470 (s, 9 H), 1,424 (s, 9 h); IR (Film) 1724,68, 1619,03, 1277,72, 1151,93, 1120,61 Cm&supmin;¹; MS (ES+) m/e 695,2 (M + H&spplus;, 22), 717,2 (M + Na&spplus;, 100). Synthese von Struktur (44):
Struktur (44) wurde durch das selbe Verfahren synthetisiert, das dazu verwendet wurde, um Struktur (33) in Struktur (34) umzuwandeln. Das Produkt wurde in der Kopplung ohne weitere Reinigung verwendet.
Struktur (44) wurde mit Struktur (9a) aus Beispiel 1 reagiert (auf eine analoge Weise zu dem in Beispiel 2 für die Synthese von Struktur (18) beschriebenen Verfahren), gefolgt von Entschützung (auf eine analoge Weise wie im Hinblick auf die Entschützung von Struktur (19) jeweils beschrieben), um Struktur (45) wie in Tabelle 9 unten angegeben, zur Verfügung zu stellen. Bei der Herstellung von Struktur (45), wurde der Kopplungsschritt, anders als mit der analogen Hydroxyverbindung, mit der Carbonylverbindung von Struktur (44) durchgeführt.

Beispiel 15

Synthese von repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung. Synthese von Struktur (46):
Struktur (46) wurde auf eine analoge Weise zu Struktur (17) synthetisiert, ausgehend von Struktur (16) und Thiazol. Diese Verbindung wurde in dem Kopplungsschritt ohne weitere Reinigung verwendet.
Struktur (46) wurde mit Struktur (9a) von Beispiel 1 reagiert (auf eine analoge Weise zu dem in Beispiel 2 für die Synthese von Struktur (18) beschriebenen Verfahren), gefolgt von Oxidation und Entschützung (auf eine analoge Weise wie in Hinblick auf die Oxidation und Entschützung von jeweils Strukturen (18) und (19) beschrieben), um Struktur (47), wie in Tabelle 9 unten angegeben, zur Verfügung zu stellen.

Beispiel 16

Synthese von repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung. Synthese von Struktur (48):
Zu einer Lösung von α-Boc-β-Fmoc-2,3-Diaminopropionsäure (818 mg, 1,92 mMol); gerührt in THF (5 ml) bei -25ºC wurde 4-Methylmorpholin (0,23 ml, 2,1 mMol) hinzugefügt, gefolgt von Isobutylchlorformat (0,25 ml, 1,9 mMol). Die erhaltene Suspension wurde für fünf Minuten gerührt und dann mit der Hilfe von 5 ml THF filtriert. Das Filtrat wurde in einem Eis/Wasserbad abgekühlt, dann wurde Natriumborhydrid (152 mg, 0,40 mMol), gelöst in Wasser (2,5 ml), tropfenweise hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 50 Minuten gerührt, dann wurde Wasser (50 ml) hinzugefügt und das Gemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 50 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Lauge gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergab einen blaßgelben Feststoff, der durch Flash-Chromatographie (50% Ethylacetat/Hexane-Eluent) gereinigt wurde, um 596 mg des Alkohols als einen weißen Feststoff zu ergeben.
Der Alkohol (224 mg, 0,543 mMol) wurde in Methylenchlorid gelöst und Dess-Martin- Perjodinan (262 mg, 0,64 mMol) wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt, dann mit Ethylacetat (50 ml) verdünnt und nacheinander mit 10% wäßriger Na&sub2;S&sub2;O&sub3;, gesättigtem, wäßrigem NaHCO&sub3; und Laue extrahiert. Die organische Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum zu einem weißem Feststoff konzentriert. Die Reinigung des Feststoffs durch Flash-Chromatographie ergab 169 mg der Aldehydstruktur (48) als einen weißen Feststoff. Synthese von Struktur (49):
Struktur (49) wurde auf analoge Weise zu Struktur (17) synthetisiert, ausgehend von Struktur (48) und Benzothiazol. Diese Verbindung wurde als ein 1 : 1 Gemisch von Diastereomeren im Kopplungsschritt (unten beschrieben) ohne weitere Reinigung verwendet. MS (EI+): m/z 446,4 (M + H&spplus;). Synthese von Struktur (50):
Struktur (49) und die bizyklische Säurestruktur (9a) (27 mg, 0,069 mMol) und HOBt-Hydrat (71 mg, 0,46 mMol) wurden in THF (1 ml) gelöst und Diisopropylethylamin (0,0S9 ml, 0,34 mMol) wurde hinzugefügt, gefolgt von EDC (19 mg, 0,099 mMol). Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 20 Stunden gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt und nacheinander mit S% wässriger Zitronensäure, gesättigtem wäßrigem Natriumbicarbonat, Wasser und Lauge extrahiert. Die organische Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und unter Vakuum auf 61 mg eines gelben Schaums konzentriert. Die 1H NMR Analyse zeigte ein Gemisch von diastereomeren Amiden.
Der Schaum wurde in CH&sub3;CN gelöst und Diethylamin wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt, dann unter Vakuum auf einen gelben Schaum konzentriert. Der Schaum wurde mit Hexanen gespült und in DMF (0,5 ml) gelöst. In einer separaten Flasche wurden Carbonyldiimidazol (16 mg, 0,99 mMol) und Guanidinhydrochlorid (10 mg, 0,10 mMol) in DMF (1 ml) gelöst und Diisopropylethylamin (0,035 ml, 0,20 mMol) wurde hinzugefügt, gefolgt von DMAP (1 mg). Die Lösung wurde für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann wurde die Lösung des Amin hinzugefügt und das Rühren wurde für 16 Stunden fortgesetzt. Die Lösung wurde unter Vakuum konzentriert, dann wurde Wasser zu dem Rest hinzugefügt und das Gemisch wurde mit Ethylacetat (3 · 25 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Lauge gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die Konzentration des Filtrats unter Vakuum ergab 58 mg von Struktur (50) als einen gelben Schaum. MS (ES+): m/z 680,6 (M + H&spplus;).
Struktur (50) wurde oxidiert, um das entsprechende Keton von Struktur (51) zur Verfügung zu stellen.

Beispiel 17

Dieses Beispiel verdeutlicht die Fähigkeit von weiteren repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika dieser Erfindung, als ein Inhibitor für Thrombin, Faktor VII, Faktor X, Faktor XI, Tryptase, aPC, Plasmin, tPA, Urokinase-Thrombinthrombomodulin-Komplex und Trypsin zu funktionieren. Die β-Faltblatt-Mimetika der Strukturen, die in Tabelle 9 aufgelistet sind, wiesen die Inhibierungsaktivitäten auf, die in Tabelle 10 gezeigt sind.
Die Proteinase-Inhibitor-Tests wurden wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt. Der Test für Thrombin-Thrombomodulin-Komplex wurde wie für Thrombin durchgeführt, außer daß vor der Zugabe des Inhibitors und Substrats das Thrombin im 4 nM Thrombomodulin für 20 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert wurde. Tabelle 9 Strukturen synthetische Vorläufer und physikalische Daten für verschiedene Serinprotease- Inhibitoren
δ Die Stereochemie des Templats für B = CH ist (3R, 6R, 9S), außer wo angegeben (siehe Fußnote s).
&epsi; Templat-Stereochemie ist (3S, 6R, 9S).
*HPLC wurde auf einer Umkehrphase C-18 Säule unter Verwendung eins Gradienten von 0-90% Acetonitril/Wasser, 0,1% TFA durchgeführt.
(es folgt Tabelle 10) Tabelle 10 Ki (M) Inhibierungsaktivität von verschiedenen Verbindungen gegen Serinproteasen
a Thrombin-Thrombomodulin-Komplex, b aktiviertes Protein C, c Gewebeplasminogenaktivator, d IC50, eRinderplasma

Beispiel 18

Effekt von repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika auf Plättchenablagerung in einem vaskulären Graft

Der Effekt von Verbindungen der Erfindung auf die Plättchenablagerung in einem vaskulären Graft wurde gemäß dem Verfahren von Hanson et al. "Interruption of an acute plateletdependent thrombosis by synthetic antithrombin D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginyl chloromethylketone" Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 3148-3188, (1988) gemessen, außer daß die Verbindung proximal zu dem Shunt eingeführt wurde, wie beschrieben in Kelly et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89: 6040-6044 (1992). Die Ergebnisse sind jeweils in Figs. 1, 2 und 3 für Strukturen (20b), (39) und (29b) gezeigt.

Beispiel 19

Synthese von repräsentativen β-Faltblatt-Mimetika

Dieses Beispiel verdeutlicht die Synthese eines weiteren repräsentativen β-Faltblatt- Mimetikums dieser Erfindung, das die unten gezeigte Struktur aufzeigt.
Struktur (52) kann unter der Verwendung des folgenden Intermediats (53), anstelle von Intermediat (16) im Beispiel 2, synthetisiert werden:
Intermediat (53) kann durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden:
Alternativ kann Intermediat (53) durch das folgende Reaktionsschema synthetisiert werden:
Aus dem Voranstehenden wird es ersichtlich sein, daß spezifische Ausführungsformen dieser Erfindung hier zu den Zwecken der Verdeutlichung beschrieben wurden.

Claims

1. β-Faltblattmimetikum, das ein bizyklisches Ringsystem einschließt, wobei das β- Faltblattmimetikum die Struktur

aufweist, worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Aminosäure- Seitenkettengruppen und Derivaten davon; A ausgewählt ist aus -C(=O)-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-, - C(=O)(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;O- und -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;S-; B ausgewählt ist aus N und CH; C ausgewählt ist aus -C(=O)-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-, -O-, -S-, -O-(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;- und -S(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;-; Y NHC(R&sub4;)C(=O)R&sub5; ist, worin R&sub4; eine Organoamingmppe ist, die von 2 bis 10 Kohlenstoffatome und mindestens ein Stickstoffatom aufweist und R&sub5; ausgewählt ist aus (a) Alkyl von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert mit 1-4 von Halid, C&sub1;&submin; &sub5;Alkoxy und Nitro, (b)-C(=O)NH-C&sub1;&submin;&sub5;Alkyl, worin die Alkylgruppe gegebenenfalls mit Halid oder C&sub1;&submin;&sub5;Alkoxy substituiert ist, (c)-C(=O)NH-C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;Aralkyl, wo die Arylgruppe gegebenenfalls mit bis zu fünf Gruppen substituiert sein kann, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Nitro, Halid -NH- (C=O)C&sub1;&submin;&sub5;Alkyl, -NH-(C=O)C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;-Aryl, C&sub1;- &sub5;Alkyl und C&sub1;&submin;&sub5;Alkoxyl und (d) monozyklisches und bizyklisches Heteroaryl von 4 bis 11 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff und die Heteroatome aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel und worin der Heteroarylring gegebenenfalls mit bis zu 4 von Halid, C&sub1;&submin;&sub5;Alkyl, C&sub1;&submin;&sub5;Alkoxy, -C(=O)NHC&sub1;&submin;&sub5;Alkyl, -C(=O)NHC&sub6;&submin;&sub1;&sub0;Aryl, Amino, -C(=O)OC&sub1;&submin;&sub5;Alkyl und -C(=O)NHC&sub1;&submin;&sub5;Alkyl, -C(=O)NHC&sub6;&submin;&sub1;&sub0;Aryl, Amino, - C(=O)OC&sub1;&submin;&sub5;Alkyl und -C(=O)OC&sub6;&submin;&sub1;&sub0;Aryl substituiert ist; Z eine chemische Gruppe, ausgewählt aus einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Protein, einem beta- Faltblattmimetikum, einer terminierenden Gruppe oder einer Schutzgruppe ist; und jede zwei aneinander angrenzenden CH-Gmppen des bizyklischen Rings eine Doppelbindung bilden können; unter den Voraussetzungen, daß (i) R&sub1; eine Aminosäuren- Seitenkettengruppe oder ein Derivat davon verschieden von Wasserstoff ist, (ii) wenn R&sub1; Benzyl ist, R&sub2; und R&sub3; beide Wasserstoff sind, A -CH&sub2;CH&sub2;- ist und B CH ist, dann ist C nicht -CH&sub2;-, (iii) wenn R&sub1; Methyl ist, R&sub2; und R&sub3; beide Wasserstoff sind, A -CH&sub2;O- ist und B CH ist, dann ist C nicht -CH&sub2;-, und (iv) wenn R&sub1; Benzyl ist, R&sub2; und R&sub3; beide Wasserstoff sind, A -CH&sub2;- ist und B CH ist, dann ist C nicht -S-.

2. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 1, das die Struktur

aufweist, worin A ausgewählt ist aus -C(=O)-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;- und -C(=O)(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-; C ausgewählt ist aus -C(=O)- und -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3; und das bizyklische Ringsystem gesättigt ist.

3. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 2, das die Struktur

aufweist, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist und p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.

4. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 2, das die Struktur

aufweist, worin p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.

5. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 2, das die Struktur

aufweist, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.

6. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 2, das die Struktur

7. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 2, das die Struktur

aufweist, worin p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.

8. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 2, das die Struktur

aufweist, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.

9. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 2, das die Struktur:

10. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 2, mit der Struktur:

11. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 2, das die Struktur

aufweist, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.

12. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 11, worin n 2 ist und R&sub2; Wasserstoff ist.

13. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 12, mit der Struktur:

14. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 12, das die Struktur:

15. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 12, mit der Struktur:

16. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 12, mit der Struktur:

17. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 12, mit der Struktur:

18. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 2, das die Struktur:

19. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 12, mit der Struktur:

20. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 12, mit der Struktur:

21. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 12, mit der Struktur:

22. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 1, das die Struktur

aufweist, worin A ausgewählt ist aus -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;O- und -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;S-; C ausgewählt ist aus -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-, -O-, -S-, -O(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;- und -S(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;-, und das bizyklische Ringsystem gesättigt ist.

23. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 22, das die Struktur

aufweist, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.

24. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 22, das die Struktur

aufweist, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 2 ist; und p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.

25. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 22, das die Struktur

26. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 22, das die Struktur

aufweist, worin p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.

27. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 22, das die Struktur

aufweist, worin p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.

28. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 22, das die Struktur

aufweist, worin p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und m eine ganze Zahl von 1 bis 2 ist.

29. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 22, das die Struktur

30. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 22, das die Struktur

aufweist, worin p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.

31. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 30, worin A -CH&sub2;CH&sub2; ist, p 1 ist und R&sub2; und R&sub3; beide Wasserstoff sind.

32. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 31, mit der Struktur:

33. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 31, mit der Struktur:

34. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 31, mit der Struktur:

35. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 1, worin Y und Z jeweils mindestens eine Aminosäure sind.

36. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 35, worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, A, B und C wie in einem der Ansprüche 3 bis 14 und 16 bis 33 definiert vorliegen.

37. β-Faltblattmimetikum mit der Struktur:

worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt sind von Aminosäure-Seitenkettengruppen und Derivaten davon; A ausgewählt ist aus -C(=O)-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;, - C(=O)(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;O- und -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;S-; B ausgewählt ist aus N und CH; C ausgewählt ist aus -C(=O)-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-, -O-, -S-, -O-(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;- und -S(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;-; Y - NHC(R&sub4;)C(=O)R&sub5; ist, worin R&sub4; eine Organoamingruppe ist, die von 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und mindestens ein Stickstoffatom aufweist und R; ausgewählt ist aus (a) Alkyl von 1 bis ungefähr 12 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls mit 1-4 von Halid, C&sub1;&submin;&sub5;Alkoxy und Nitro substituiert sind, (b) -C(=O)NH-C&sub1;&submin;&sub5;Alkyl, worin die Alkylgruppe gegebenenfalls mit Halid oder C&sub1;&submin;&sub5;Alkoxy substituiert ist, (c) -C(=O)NH- C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;Aralkyl, wo die Arylgruppe gegebenenfalls mit bis zu fünf Gruppen unabhängig voneinander ausgewählt von Nitro, Halid NH- (C=O)C&sub1;&submin;&sub5;Alkyl, -NH-(C=O)C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;-Aryl, C&sub1;&submin;&sub5;Alkyl und C&sub1;&submin;&sub5;Alkoxyl substituiert sein kann, und (d) monozyklischem und bizyklischem Heteroaryl von 4 bis 11 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff und die Heteroatome aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel und worin Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel und worin der Heteroarylring gegebenfalls mit bis zu 4 von Halid, C&sub1;&submin;&sub5;Alkyl, C&sub1;&submin;&sub5;Alkoxy, -C(=O)NHC&sub1;&submin;&sub5;Alkyl, -C(=O)NHC&sub6;&submin;&sub1;&sub0;Aryl, Amino, -C(=O)OC&sub1;&submin;&sub5;Alkyl und -C(=O)NHC&sub1;&submin;&sub5;Alkyl, -C(=O)NHC&sub6;&submin;&sub1;&sub0;Aryl, Amino, - C(=O)OC&sub1;&submin;&sub5;Alkyl und -C(=O)OC&sub6;&submin;&sub1;&sub0;Aryl subsubstituiert sein kann; Z eine eine chemische Gruppe, ausgewählt aus einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Protein, einem β- Faltblattmimetikum, einer terminierenden Gruppe oder einer Schutzgruppe ist; und jede zwei angrenzenden CH-Gruppen des bizyklischen Rings eine der Verbindung bilden können; unter den Voraussetzungen, daß (i) R&sub1; eine Aminosäure-Seitenkettengruppe oder Derivat davon ist, die anders als Wasserstoff ist, (ii) wenn R&sub1; Benzyl ist, R&sub2; und R&sub3; beide Wasserstoff sind, A -CH&sub2;CH&sub2;- ist und B CH ist, dann ist C nicht -CH&sub2;-, (iii) wenn R&sub1; Methyl ist, R&sub2; und R&sub3; beide Wasserstoff sind, A -CH&sub2;O- ist und B CH ist, dann ist C nicht -CH&sub2;- und (iv) wenn R&sub1; Benzyl ist, R&sub2; und R&sub3; beide Wasserstoff sind, A -CH&sub2;- ist und B CH ist, dann ist C nicht -S-, zur Verwendung in einem Verfahren zur Inhibierung einer Protease in einem warmblütigen Tier, umfassend Verabreichung einer wirksamen Menge des β-Faltblattmimetikums zu dem Tier.

38. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 37, worin die Protease eine Serin-Protease ist.

39. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 38, worin die Serin-Protease ausgewählt ist aus Thrombin, Elastase und Faktor X.

40. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 38, worin die Serin-Protease Thrombin ist.

41. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 37, worin das β-Faltblattmimetikum das β- Faltblattmimetikum nach Anspruch 13 ist.

42. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 37, worin das β-Faltblattmimetikum das β- Faltblattmimetikum nach Anspruch 17 ist.

43. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 37, worin das β-Faltblattmimetikum das β- Faltblattmimetikum nach Anspruch 32 ist.

44. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 37, worin das β-Faltblattmimetikum das β- Faltblattmimetikum nach Anspruch 33 ist.

45. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 37, worin das β-Faltblattmimetikum das β- Faltblattmimetikum nach Anspruch 34 ist.

46. β-Faltblattmimetikum nach Anspruch 37, worin die Protease ausgewählt ist aus einer Asparagin-, Cystein- und Metalloprotease.