DE69604491T3

DE69604491T3 - Methode zur verbesserung der eigenschaften von mehlteig, sowie zusammensetzung zur teigverbesserung und verbesserte nahrungsmittel

Info

Publication number: DE69604491T3
Application number: DE69604491T
Authority: DE
Inventors: Joern Borch Soe; Charlotte Horsmans Poulsen; Pernille Bak H Strup
Original assignee: Danisco AS
Current assignee: International N&H Denmark ApS
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 2008-09-25
Anticipated expiration: 2016-06-05
Also published as: DE69604491D1; CA2224203A1; AU699331B2; EP0833563B2; US7931924B2; ZA964617B; JPH11506338A; DK0833563T3; ATE185048T1; AU699331C; ES2136409T5; CA2224203C; US6726942B2; WO1996039851A1; DK0833563T4; PL184045B1; JP3039685B2; NZ309735A; BR9608493A; PL323744A1

Description

Die Erfindung betrifft die Bereitstellung von Mehlteigen, die verbesserte rheologische Eigenschaften aufweisen, und von Mehlspeiseprodukten, die verbesserte Qualitätseigenschaften aufweisen, und es stellt eine Maltose oxidierende, Oxidoreduktase enthaltende Zusammensetzung zur Verfügung, die in der Lage ist, solche verbesserten Eigenschaften auf Teige und Lebensmittelfertigprodukte, die daraus hergestellt sind, wenn sie als eine Komponente zu den Teigen hinzugegeben wird, zu übertragen und ein Verfahren zur Herstellung von verbesserten Teigen und Mehlspeiseprodukten.
Technischer Hintergrund und Stand der Technik
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Bereitstellung von Mehlteigen, die verbesserte rheologische Eigenschaften haben und zur Bereitstellung von Fertigback- oder Trockenwaren, die aus solchen Teigen hergestellt sind, die eine verbesserte Eßqualität und texturisierte und dimensionale Eigenschaften haben.
In diesem Zusammenhang ist auch die "Stärke" oder "Schwäche" des Teigs ein wichtiger Aspekt bei der Herstellung von mehlhaltigen Fertigprodukten aus Teig, einschließlich Backen. Die "Stärke" oder "Schwäche" eines Teigs wird primär durch den Proteingehalt bestimmt, und inbesondere ist der Gehalt und die Qualität des Glutenproteins hierbei ein wichtiger Faktor. Mehle mit einem geringen Proteingehalt werden im allgemeinen als "schwach" charakterisiert. Die kohäsive, elastische gummiartige Masse, die durch Mischen von Wasser und schwachem Mehl gebildet wird, ist normalerweise stark dehnbar, wenn sie einer Dehnung unterzogen wird, wird aber nicht in ihre ursprünglichen Dimensionen zurückkehren, wenn die Dehnung zurückgenommen wird.
Mehle mit einem hohen Proteingehalt werden im allgemeinen als "starke" Mehle bezeichnet und die Masse, die durch Mischen eines solchen Mehls mit Nasser gebildet wird, weist eine geringere Elastizität auf als eine Masse, die aus weichem Mehl gebildet wurde, und eine Dehnung, die auf die Mischung angewendet wird, wird ohne Schaden in einem größeren Ausmaß wiederhergestellt als in dem Falle, wenn die Teigmasse aus weichem Mehl gebildet wurde. Starkes Mehl wird im allgemeinen in den meisten Backzusam menhängen aufgrund seiner überlegenen rheologischen und Handhabungseigenschaften des Teigs und der überlegenen Bildungs- und Strukturqualitäten des fertigen Back- oder Trockenprodukts, welchen aus dem starken Mehlteig hergestellt wurde, bevorzugt.
Teige, die aus starken Mehlen hergestellt werden, sind im allgemeinen stabiler. Stabilität des Teigs ist eines der wichtigsten Eigenschaften von Mehlteigen. Gemäß dem Verfahren 36-01 A der Amerikanischen Vereinigung der Getreidechemiker (AACC) wird der Begriff "Stabilität" als "der Bereich an Knetzeit, bei dem eine positive Reaktion erhalten wird und die Eigenschaft eines gerundeten Teigs, bei dem er ein Abflachen unter seinem eigenen Gewicht über einen bestimmten Zeitraum widersteht" definiert. Gemäß dem gleichen Verfahren ist der Begriff "Reaktion" als "die Reaktion des Teigs zu einem bekannten und spezifischen Stimulus, Substanz oder bestimmten Satz an Bedingungen, welche normalerweise durch Backen in Vergleich mit einer Kontrolle bestimmt werden" definiert.
Innerhalb der Back- und Mühlenindustrie ist es bekannt, Teig"konditionierer" zu verwenden, um den Teig zu stärken. Solche Teigkonditionierer sind normalerweise unspezifische, oxidierende Agenzien wie z. B. Jodate, Peroxide, Ascorbinsäure, K-bromate oder Azodicarbonamide und sie werden dem Teig zugesetzt, um die Backleistungen des Mehls zu verbessern, um einen Teig zu erhalten, der eine verbesserte Dehnbarkeit aufweist und damit eine gewünschte Stärke und Stabilität hat. Der Mechanismus, auf dem dieser Effekt von oxidierenden Agenzien beruht, ist der, daß die Mehlproteine, insbesondere das Gluten, Thiolgruppen enthält, welche, wenn sie oxidiert werden, Disulphidbindungen ausbilden, so daß das Protein eine stabilere Matrix ausbildet, was zu einer besseren Teigqualität und zu Verbesserungen des Volumens und der Krümelstruktur des Backprodukts führt.
Zusätzlich zu der obigen Nützlichkeit von Ascorbinsäure/Ascorbat als Teigkonditionierer aufgrund ihrer oxidierenden Fähigkeit, können diese Komponenten auch als Substrat für eine Oxidoreduktase, Ascorbatoxidase wirken, was in der EP 0 682 116 A1 offenbart ist. In Anwesenheit eines ihrer Substrate können diese Enzyme Ascorbinsäure/Ascorbat zu Dehydroascorbinsäure und H₂O₂ umwandeln. Dieser Stand der Technik regt aber nicht an, daß eine Ascorbinsäureoxidase in Anwesenheit von Ascorbinsäure/Ascorbat einen teigkonditionierenden Effekt aufweisen kann, aber anzunehmenderweise ist dies der Fall.
Gegen die Verwendung von verschiedenen zur Zeit erhältlichen Oxidationsmitteln werden allerdings entweder Einwendungen durch den Verbraucher gemacht oder sie werden nicht durch die Genehmigungsbehörden erlaubt, und entsprechend wurde daher versucht, Alternativen zu diesen herkömmlichen Mehl- und Teigadditiven zu finden, und der Stand der Technik hat u. a. die Verwendung von Glucoseoxidase für diesen Zweck angeregt.
Demgemäß offenbart die US 2,783,150 die Zugabe von Glucoseoxidase zu Mehl, um die Teigstärke, Struktur und Aussehen des gebackenen Brots zu verbessern.
CA 2,012,723 offenbart brotverbessernde Zusammensetzungen, umfassend zellulolytische Enzyme wie Xylanasen und Glucoseoxidasen, wobei die letzteren zugegeben wurde, um bestimmte unvorteilhafte Effekte der zellulolytischen Enzyme zu reduzieren (erniedrigte Teigstärke und Klebrigkeit), und es ist offenbart, daß die Zugabe von Glucose zu dem Teig notwendig ist, um eine ausreichende Glucoseoxidaseaktivität zu erzielen.
JP-A-92-084848 regt die Verwendung einer brotverbessernden Zusammensetzung, umfassend Glucoseoxidase und Lipase, an.
EP-B1-321 811 offenbart die Verwendung einer Enzymzusammensetzung, umfassend Sulfhydryloxidase und Glucoseoxidase, um die rheologischen Eigenschaften des Teigs zu verbessern. Es wird in diesem Dokument des Standes der Technik erwähnt, daß die Verwendung von Glucoseoxidase allein nicht erfolgreich war.
In EP-B1-338 452 ist eine Enzymzusammensetzung zur Verbesserung der Teigstabilität, umfassend eine Mischung von Zellulase/Hemizellulase, Glucoseoxidase und fakultativ Sulfhydryloxidase offenbart.
Die Verwendung von Glucoseoxidase als ein teigverbessernder Zusatz hat allerdings die Begrenzung darin, daß das Enzym die Anwesenheit von ausreichenden Mengen an Glucose als Substrat benötigt, um in dem Teigsystem wirksam zu sein, und im allgemeinen ist der Glucosegehalt im Getreidemehl niedrig. Daher ist die Abwesenheit von Glucose in Teigen oder ein niedriger Gehalt davon in Teigen ein limitierender Faktor für die Wirksamkeit der Glucoseoxidase als ein teigverbesserndes Agens.
Im Gegensatz dazu ist der Gehalt an Maltose in Getreidemehlen im allgemeinen bedeutend höher als der von Glucose, und dementsprechend enthält frisch hergestellter Teig normalerweise mehr Maltose als Glucose. Dementsprechend wurde in einem Experiment, wo der Gehalt der Zucker in den Überständen von Suspensionen von Weizenmehl und von einem Teig, der aus diesem Mehl hergestellt wurde und des weiteren Wasser, Hefe, Salz und Sucrose (wie im folgenden Beispiel 2.3 beschrieben) enthielt, analysiert; die folgenden Werte (Gew.%, bezogen auf das Mehl) wurden gefunden:

Mehl Teig

Sucrose 0,3 < 0,01

Galactose 0,001 0,01

Glucose 0,25 0,72

Maltose 2,6 1,4

Fructose 0,08 0,67

Lactose < 0,01 < 0,01
Zusätzlich verbleibt der Gehalt an Maltose auf einem relativ hohen Niveau in einem Teig, der mit Hefe aufgegangen ist, da die Hefe primär Glucose verwendet, oder er kann sogar in dem Teig erhöht sein, z. B. während der Reifung aufgrund der Aktivität von Stärke abbauenden Enzymen, wie z. B. β-Amylase, welche inhärent in dem Mehl vorhanden ist oder zu dem Teig gegeben wird.
Während im Stand der Technik die nützlichen verbessernden Effekte der Glucoseoxidase auf die rheologischen Eigenschaften von Brotteigen und auf die Qualität der entsprechenden Backprodukte erkannt wurde, wurde allerdings auch erkannt, daß die Verwendung dieser Enzyme verschiedene Nachteile hat. So mag es notwendig sein, Sucrose oder Glucose als Substrat zu dem Teig zu geben, um einen ausreichenden Effekt zu erhalten, und die Glucoseoxidase stellt nicht konstant einen gewünschten teig- oder brotverbessernden Effekt zur Verfügung, wenn sie allein ohne Zugabe von weiteren Enzymen verwendet wird.
Es wurde allerdings jetzt gefunden, daß die Zugabe einer Oxidoreduktase, die in der Lage ist, Maltose zu oxidieren, einschließlich einer Hexoseoxidase, als alleiniges teigkonditionierendes Mittel, d. h. ohne gleichzeitiger Zugabe von Substrat für das zugegebene Enzym oder anderen Enzymen zu einem mehlhaltigen Teig in einem erhöhten Brechwiderstand, wenn der Teig gedehnt wird, resultiert, d. h. dieses Enzym überträgt durch sich selbst eine erhöhte Stärke auf den Teig, wobei der Teig weniger zu einer mechanischen Deformation neigt. Es wird damit gerechnet, daß dieser Effekt der Zugabe einer Hexoseoxidase zu einem Teig das Ergebnis einer Bildung von Vernetzungen zwischen Thiolgruppen von schwefelenthaltenden Aminosäuren im Weizengluten ist, die entstehen, wenn das durch das Enzym hergestellte H₂O₂ im Teig mit den Thiolgruppen reagiert, die dadurch oxidiert werden.
Hexoseoxidase (D-Hexose:O₂-Oxidoreduktase, EC 1.1.3.5) ist ein Enzym, welches bei Anwesenheit von Sauerstoff in der Lage ist, D-Glucose und ver schiedene andere reduzierte Zucker, einschließlich Maltose, Glucose, Lactose, Galactose, Xylose, Arabinose und Cellobiose, in ihre korrespondierenden Lactone zu oxidieren mit einer anschließenden Hydrolyse zu ihrer jeweiligen Aldonsäure. Entsprechend unterscheiden sich Hexoseoxidasen von der Glucoseoxidase, welche nur D-Glucose umwandeln kann, dadurch, daß Hexoseoxidasen einen breiteren Bereich an Zuckersubstraten verwenden können. Die Oxidation, die durch das Enzym katalysiert wird, kann wie folgt dargestellt werden: D-Glucose + O₂ → δ-D-Gluconolacton + H₂O₂ oder D-Galactose + O₂ → γ-D-Galactogalacton + H₂O₂
Hexoseoxidase (im folgenden als HOX bezeichnet) wurde von verschiedenen Rotalgenarten wie Iridophycus flaccidum (Bean und Hassid, 1956, J. Biol. Chem., 218:425–436) und Chondrus crispus (Iwaka 1982, Methods Enzymol., 89:145–149) isoliert. Des weiteren wurde gezeigt, daß die Algenart Euthora cristata (Sullivan et al. 1973, Biochemia et Biophysica Acta, 309:11–22) HOX produziert.
Andere mögliche erfindungsgemäße Quellen der Hexoseoxidase schließen mikrobielle Arten oder am Land wachsende Pflanzenarten ein. Als ein Beispiel einer solchen pflanzlichen Quelle haben Bean et al., Journal of Biological Chemistry (1961) 236:1235–1240, eine Oxidoreduktase aus Zitrusfrüchten offenbart, die in der Lage ist, einen weiten Bereich von Zuckern einschließlich D-Glucose, D-Galactose, Cellobiose, Lactose, Maltose, D-2-Deoxyglucose, D-Mannose, D-Glucosamin und D-Xylose zu oxidieren. Ein weiteres Beispiel für ein Enzym mit einer Hexoseoxidaseaktivität ist das Enzymsystem von Malleomyces mallei, offenbart von Dowling et al., Journal of Bacteriology (1956) 72:555–560.
Es wurde berichtet, daß die Hexoseoxidase, die aus den obengenannten natürlichen Quellen isoliert wurde, eine mögliche Verwendung bei der Herstellung von bestimmten Nahrungsmitteln haben könnte. So wurde gezeigt, daß aus Iridophycus flaccidum isolierte Hexoseoxidase in der Lage ist, Lactose in der Milch durch Herstellung der entsprechenden Aldonsäure umzuwandeln und wurde als möglicherweise interessantes Säuerungsmittel in der Milch angesehen, um z. B. säuernde mikrobiologische Kulturen für diesen Zweck zu ersetzen (Rand, 1972, Journal of Food Science, 37:698–701). Hierfür wurde Hexoseoxidase als ein interessanteres Enzym als Glucoseoxidase genannt, da das letztere Enzym nur enzymatisch in Milch oder anderen Lebensmittelprodukten wirksam sein kann, die keine Glucose oder nur einen geringen Gehalt an Glucose aufweisen, wenn Glucose oder das Lactose abbauende Enzym Lactase, welches die Lactose zu Glucose und Galactose umwandelt, ebenfalls hinzugegeben wird.
Die Fähigkeit der Oxidoreduktasen einschließlich der der Hexoseoxidase, Wasserstoffperoxid zu erzeugen, wurde ebenfalls zur Verbesserung der Lagerstabilität von bestimmten Lebensmittelprodukten einschließlich Käse, Butter und Fruchtsaft verwendet, wie in JP-B-73/016612 offenbart. Es wurde des weiteren angeregt, daß Oxidoreduktasen eine mögliche Verwendung als Antioxidans in Lebensmittelprodukten haben können.
Die vorliegende Erfindung hat allerdings gezeigt, daß Hexoseoxidase als ein teigkonditionierendes Mittel bei der Herstellung von Mehlteigprodukten, einschließlich nicht nur Brotprodukten sondern auch Produkten aus Mehlteigen wie Nudeln und Teigwaren, sehr nützlich sein kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Entsprechend betrifft die Erfindung im ersten Aspekt ein Verfahren zur Verbesserung der rheologischen Eigenschaften des Mehlteigs und der Qualtität des Fertigprodukts hergestellt aus diesem Teig, umfassend das Hinzufügen einer wirksamen Menge an Oxidoreduktase, die wenigstens in der Lage ist, Maltose zu oxidieren, wie z. B. eine Hexoseoxidase, zu den Teigbestandteilen, Teigzusatzstoffen oder dem Teig.
In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Backprodukts, umfassend die Herstellung eines Mehlteigs einschließlich dem Zusatz einer wirksamen Menge einer Oxidoreduktase, die wenigstens in der Lage ist, Maltose zu oxidieren, und Backen des Teigs, und ein Verfahren zur Herstellung eines auf Teig basierenden Lebensmittelprodukts umfassend das Hinzufügen einer wirksamen Menge einer Maltose oxidierenden Oxidoreduktase.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In einem Aspekt erörtert das vorliegende Verfahren ein Verfahren zur Verbesserung der rheologischen Eigenschaften von Mehlteigen. Das Verfahren umfaßt, wie bereits oben erwähnt, das Hinzufügen einer effektiven Menge an Maltose oxidierender Oxidoreduktase entweder zu einer Komponente des Teigrezepts oder zu dem Teig, wie er durch das Mischen von allen Komponenten des Teigs entsteht. In diesem Zusammenhang wird "eine wirksame Menge" verwendet um zu zeigen, daß die Menge ausreichend ist, um die verbesserten Eigenschaften, wie sie hierin definiert sind, auf den Teig und/oder das Fertigprodukt zu übertragen.
In einer nützlichen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Oxidoreduktase eine Hexoseoxidase. Die Hexoseoxidase kann, wie hierin detailliert beschrieben wird, aus Meeresalgenarten isoliert werden, die natürlicherweise dieses Protein herstellen. Solche Arten werden in der Familie Gigartinaceae, die zu der Ordnung Gigartinales gehören, gefunden werden. Beispiele für Hexoseoxidase produzierende Algenarten, die zu Gigartinaceae gehören, sind Chondrus crispus und Iridophycus flaccidum. Ebenso sind Algenarten der Ordnung der Cryptomeniales einschließlich der Arten Euthora cristata mögliche Quellen für die Hexoseoxidase.
Wenn solche natürlichen Quellen für die Hexoseoxidase verwendet werden, wird das Enzym normalerweise aus dem Ausgangsmaterial der Algen durch Extraktion unter Verwendung eines wäßrigen Extraktionsmediums isoliert. Als Ausgangsmaterial können Algen im frischen Zustand, wie sie aus ihrer marinen Umgebung, wo sie wachsen, geerntet werden, verwendet werden oder das Algenmaterial zur Extraktion der Hexoseoxidase kann nach Trocknen der Wedel z. B. durch Lufttrocknung bei Umgebungstemperaturen oder durch irgendein geeignetes industrielles Trocknungsverfahren, wie Trocknen mit zirkulierender heißer Luft oder durch Gefriertrocknung, verwendet werden. Um den folgenden Extraktionsschritt zu erleichtern, kann das frische oder getrocknete Ausgangsmaterial vorteilhafterweise fein zerkleinert werden, z. B. durch Mahlen oder Vermischen.
Als wäßriges Extraktionsmedium sind Pufferlösungen, z. B. solche die einen pH-Wert im Bereich von 5–8 haben, wie ein 0,1 M Natriumphosphatpuffer, 20 mM Triethanolaminpuffer oder 20 mM Tris-HCl Puffer geeignet. Die Hexoseoxidase wird normalerweise aus dem Algenmaterial durch Suspension des Ausgangsmaterial in dem Puffer und dem Aufbewahren der Suspension bei einer Temperatur im Bereich von 0–20°C, wie z. B. 5°C, für 1 bis 5 Tage, bevorzugt bei Agitation, extrahiert.
Das suspendierte Algenmaterial wird dann von dem wäßrigen Medium durch geeignete Trennverfahren, wie Filtration, Sieben oder Zentrifugation getrennt und die Hexoseoxidase anschließend aus dem Filtrat oder Überstand gewonnen. Fakultativ kann das abgetrennte Algenmaterial einem oder mehreren weiteren Extraktionsschritten unterworfen werden.
Da verschiedene Meeresalgen farbige Pigmente wie Phycocyanine enthalten, kann es notwendig sein, das Filtrat oder den Überstand weiteren Reinigungsschritten zu unterwerfen, so daß diese Pigmente entfernt werden. Die Pigmente können z. B. durch Behandlung des Filtrats oder Überstands mit einem organischen Lösungsmittel, in dem die Pigmente löslich sind, und durch anschließendes Abtrennen des Lösungsmittel enthaltend die gelösten Pigmente von dem wäßrigen Medium entfernt werden. Alternativ können die Pigmente durch die Behandlung des Filtrats oder Überstands in einem hydrophoben Wechselwirkungs-Chromatographieschritt entfernt werden.
Die Gewinnung der Hexoseoxidase aus dem wäßrigen Extraktionsmedium kann durch geeignete herkömmliche Verfahren, die es erlauben, Proteine aus wäßrigen Medien zu isolieren, durchgeführt werden. Solche Verfahren schließen herkömmliche Verfahren zur Isolierung von Proteinen, wie Ionenaustausch-Chromatographie, optional gefolgt von einem Konzentrationsschritt wie einer Ultrafiltration ein; Beispiele dafür werden im folgenden genauer beschrieben. Es ist auch möglich, die Enzyme durch Zugabe von Substanzen, wie z. B. (NH₄)₂SO₄ oder Polyethylenglycol (PEG) zu gewinnen, die ein Präzipitieren des Proteins bewirken, gefolgt von einem Abtrennen des Präzipitats und optional dem Unterwerfen von Bedingungen, die ein Auflösen des Proteins erlauben.
Für bestimmte Anwendungen der Hexoseoxidase ist es wünschenwert, das Enzym in einer im wesentlichen reinen Form, z. B. als eine Präparation, die im hohen Maße ohne andere Protein- oder Nichtproteinverschmutzungen ist, bereitzustellen und entsprechend kann die relativ rohe Enzympräparation, die aus den obigen Extraktions- und Isolationsschritten hervorgeht, weiteren Reinigungsschritten, wie weiteren Chromatographieschritten, Gelfiltrationsschritten oder chromatographischer Fokussierung unterworfen werden, wie es auch im weiteren durch Beispiele beschrieben wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Mehlteig durch Mischen des Mehls mit Wasser, einem Backtriebmittel wie Hefe oder herkömmlichen chemischen Backtriebmitteln und einer wirksamen Menge an Hexoseoxidase bei teigbildenden Bedingungen gemischt. Es ist allerdings auch im Umfang der Erfindung, daß weitere Komponenten zu der Teigmischung hinzugegeben werden können.
Solche weiteren Teigkomponenten schließen herkömmlich verwendete Teigkomponenten wie Salz, Süßmittel wie Zucker, Sirup oder künstliche Süßmittel, fettige Substanzen einschließlich Backfett, Margarine, Butter oder ein pflanzliches oder tierisches Öl, und ein oder mehrere Teigzusätze wie Emulgationsmittel, Stärke abbauende Enzyme, Zellulose oder Hemizellulose abbauende Enzyme, Proteasen, Lipasen, unspezifische Oxidationsmittel wie solche wie oben erwähnt, Aromastoffe, Milchsäurebakterienkulturen, Vitamine, Mineralien, Hydrokolloide wie Alginate, Carrageenate, Pectine, Pflanzenschleime, einschließlich z. B. Guarkernmehl und Johannisbrotkernmehl, und Ballaststoffsubstanzen ein.
Herkömmliche Emulgatoren, wie sie bei der Herstellung von Mehlteigprodukten verwendet werden, schließen als Beispiele Monoglyceride, Diacetyltartarsäureester der Mono- und Diglyceride von Fettsäuren und Lectine, z. B. erhältlich aus Soja, ein. Unter den die Stärke abbauenden Enzymen ist die Amylase als teigverbessernder Zusatz besonders nützlich. α-Amylase zerkleinert die Stärke in Dextrine, welche weiter durch β-Amylase in Maltose zerkleinert werden. Andere nützliche Stärke abbauende Enzyme, die zu der Teigzusammensetzung hinzugefügt werden können, schließen Glucoamylasen und Pullulanasen mit ein. In diesem Zusammenhang sind weitere interessante Enzyme Xylanasen und andere Oxidoreduktasen wie Glucoseoxidase, Pyranoseoxidase und Sulfhydryloxidase.
Ein bevorzugtes Mehl ist Weizenmehl, aber Teige können auch Mehl von anderen Getreidearten wie Reis, Mais, Gerste, Roggen und Sorghum umfassen.
Der Teig wird erfindungsgemäß durch Mischen von Mehl, Wasser, Oxidoreduktase und anderen möglichen Inhaltsstoffen und Zusätzen hergestellt. Die Oxidoreduktase kann zusammen mit irgendeinem Teigbestandteil, einschließlich dem Wasser, oder mit einer Mischung der Teigbestandteile oder mit irgendeinem Zusatz oder einer Zusatzmischung hinzugegeben werden. Der Teig kann durch ein herkömmliches Teigherstellungsverfahren, wie es in der Backindustrie oder irgendeiner anderen Industrie bei der Herstellung von auf Mehlteig basierenden Produkten üblich ist, hergestellt werden.
Die Oxidoreduktase kann als eine flüssige Präparation oder in Form einer Trockenpulverzusammensetzung hinzugegeben werden, entweder umfassend das Enzym als einzige aktive Komponente oder in einer Mischung mit einem oder mehreren anderen Teigbestandteilen oder Zusätzen. Die Menge der normalerweise zugesetzten Enzymkomponente ergibt eine Menge im fertigen Teig von 1 bis 10.000 Einheiten pro kg Mehl, bevorzugt 5 bis 5.000 Einheiten, wie 10 bis 1.000 Einheiten. In nützlichen Ausführungsformen ist die Menge im Bereich von 20 bis 500 Einheiten pro kg Mehl. In diesem Zusammenhang entspricht eine Oxidoreduktaseeinheit der Menge an Enzym, die unter speziellen Bedingungen in einer Umwandlung von 1 μMol Glucose pro Minute resultiert. Die Aktivität wird als Einheit pro g der Enzympräparation angegeben.
Der Effekt der Oxidoreduktase auf die rheologischen Eigenschaften des Teigs kann durch Standardverfahren gemäß der Internationalen Vereinigung der Getreidechemie (ICC) und der Amerikanischen Vereinigung der Getreidechemie (AACC) einschließlich des Amylographverfahrens (ICC 126), des Farinographverfahrens (AAC 54–21) und des Extensigraphverfahrens (AAC 54–10) bestimmt werden. Das Extensigraphverfahren bestimmt z. B. die Fähigkeit des Teigs, Gas, welches durch die Hefe gebildet wird, zurückzuhalten und die Fähigkeit der Reifung zu widerstehen. Eigentlich bestimmt das Extensigraphverfahren die relative Stärke des Teigs. Ein starker Teig weist eine höhere und in einigen Fällen eine längere Extensigraphkurve auf als ein weicher Teig. AACC-Verfahren 54–10 definiert den Extensigraph in folgender Weise: "Der Extensigraph zeichnet die Last-Dehnungskurve eines Testteigstückes auf, bis es bricht. Charakteristika der Last-Dehnungskurven oder Extensigramme werden verwendet, um die allgemeinen Qualitäten des Mehls und dessen Verhalten gegenüber verbessernden Mitteln zu beurteilen." In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Widerstand der Ausdehnung des Teigs als Ausdruck des Verhältnisses zwischen dem Ausdehnungswiderstand (Höhe der Kurve, B) und der Ausdehnbarkeit (Länge der Kurve, C), d. h. das Verhältnis von B/C gemessen durch das AACC-Verfahren 54–10 um mindestens 10% erhöht, relativ zu dem ansonsten ähnlichen Teig, der keine Oxidoreduktase enthält. In bevorzugteren Ausführungsformen erhöht sich der Ausdehnungswiderstand auf mindestens 20%, mindestens 50% und insbesondere mindestens 100%.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann für irgendeine Mehlteigart mit dem Ziel der Verbesserung der rheologischen Eigenschaften davon und der Qualtität der Fertigprodukte, hergestellt aus diesem bestimmten Teigtyp, verwendet werden. Somit ist das Verfahren sehr geeignet für die Herstellung von herkömmlichen, durch Hefe getriebenen Arten von Brotprodukten, einschließlich Brotprodukten auf Weizenmehlbasis, wie Laibe und Brötchen. Es ist allerdings auch eingeschlossen, daß das Verfahren auch die Eigenschaften von Teigen, in denen das Gehenlassen durch Zugabe von chemischen Backtriebmitteln, einschließlich süssen Backwaren wie Kuchen, einschließlich als Beispiel Topfkuchen, Muffins oder Scones, hervorgerufen wird, verbessern kann.
In einem interessanten Aspekt wird die Erfindung zur Verbesserung der rheologischen Eigenschaften von Teigen, die für Nudelprodukte einschließlich "weißen Nudeln" und "chinesischen Nudeln" vorgesehen sind, verwendet und zur Verbesserung der texturisierten Qualitäten des Nudelfertigprodukts. Ein typisches Grundrezept für die Herstellung von Nudeln umfaßt die folgenden Bestandteile: Weizenmehl 100 Teile, Salz 0,5 Teile und Wasser 33 Teile. Die Nudeln werden typischerweise durch Mischen der Bestandteile in einem geeigneten Mixapparat hergestellt, gefolgt von dem Ausrollen des Nudelteigs unter Verwendung einer geeigneten Nudelmaschine, um Fäden zu bilden, die anschließend luftgetrocknet werden.
Die Qualtität der fertigen Nudeln wird u. a. durch ihre Farbe, Kochqualität und Struktur beurteilt. Die Nudeln sollen so schnell wie möglich kochen, sollen nach dem Kochen bißfest bleiben und sollen bevorzugt keine festen Bestandteile im Kochwasser verlieren. Beim Servieren der Nudeln sollen diese bevorzugt eine glatte und knackige Oberfläche haben, ohne daß sie eine Klebrigkeit aufweisen und eine "Bißfestigkeit" und ein gutes Mundgefühl zur Verfügung stellen. Des weiteren ist es wichtig, daß die Nudeln eine leichte Färbung haben.
Da die Nützlichkeit des Weizenmehls für die Bereitstellung von Nudeln, die die gewünschten texturisierten und Eßeigenschaften haben, von dem Jahr und dem Anbaugebiet abhängen kann, ist es üblich, Nudelverbesserer zu dem Teig zu geben, um suboptimale Qualtitäten des Mehls zu kompensieren. Typischerweise umfassen solche Verbesserer Ballaststoffsubstanzen, pflanzliche Proteine, Emulgatoren und Hydrokolloide, wie z. B. Alginate, Carrageenate, Pectine, Pflanzenschleime einschließlich Guarkernmehl und Johannisbrotkernmehl, und Amylasen.
Es wurde versucht, Glucoseoxidase als ein Mittel zur Verbesserung der Nudeln einzusetzen. Wie allerdings oben erwähnt, kann der Gehalt an Glucose im Weizenmehl niedrig sein, so daß das Enzym nicht wirksam ist.
Es ist daher ein wichtiger Aspekt der Erfindung, daß die erfindungsgemäße Oxidoreduktase als ein Mittel zur Verbesserung von Nudeln nützlich ist, optional in Verbindung mit anderen Komponenten, wie sie zur Zeit zur Verbesserung der Qualität von Nudeln verwendet werden. Daher ist mit einbezogen, daß Nudeln, die gemäß dem obigen Verfahren hergestellt wurden, verbesserte Eigenschaften hinsichtlich der Färbung, Koch- und Eßqualitäten, einschließlich der Knackigkeit, Elastizität und nichtklebrigen Struktur und Konsistenz haben.
In einer weiteren nützlichen Ausführungsform ist der Teig, der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, ein Teig für die Herstellung von Teigwaren. Solche Produkte, welche als Beispiele Spaghetti und Makkaroni mit einschließen, werden normalerweise aus einem Teig, umfassend als Hauptbestandteil Mehl und Eier, hergestellt. Nach dem Mischen der Bestandteile wird der Teig zu der bestimmten Art des Nudelprodukts geformt und luftgetrocknet. Es wird erörtert, daß die Zugabe zu einem Nudelteig einen signifikanten Verbesserungseffekt auf die Ausdehnbarkeit und Stabili tät davon haben wird, was zu einem Fertignudelprodukt mit verbesserten texturisierten und Eßqualitäten führt.
Die teigverbessernde Zusammensetzung kann die Oxidoreduktase gemäß der vorliegenden Erfindung und wenigstens einen weiteren Teiginhaltsstoff oder Teigzusatzstoff umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oxidoreduktase eine Hexoseoxidase. Der weitere Bestandteil oder Zusatz kann irgendein oben beschriebener Zusatz oder Bestandteil sein. Die Zusammensetzung kann geeigneterweise eine flüssige Präparation umfassend die Oxidoreduktase sein. Die Zusammensetzung ist aber geeigneterweise in der Form einer Trockenzusammensetzung. Es erscheint klar zu sein, daß die Menge der Oxidoreduktaseaktivität in der Zusammensetzung abhängig von den Arten und den Mengen der weiteren Bestandteile und Zusätze ist. Die Menge an Oxidoreduktaseaktivität ist allerdings bevorzugt im Bereich von 10 bis 100.000 Einheiten, bevorzugter im Bereich von 100 bis 50.000 Einheiten wie 1.000 bis 10.000 Einheiten, einschließlich 2.000 bis 5.000 Einheiten.
Die Zusammensetzung kann optional in Form einer kompletten Teigzusatzmischung oder -vormischung zur Herstellung eines bestimmten Fertigprodukts sein und alle trockenen Bestandteile und Zusätze für solch einen Teig enthalten. In speziellen Ausführungsformen kann die Zusammensetzung eine zur Herstellung von Backwaren oder zur Herstellung von Nudelprodukten oder Teigwaren besonders nützliche sein.
Wie bereits oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Backprodukten einschließlich dem Hinzufügen von Oxidoreduktase, wie z. B. Hexoseoxidase, zu dem Teig zur Verfügung. Insbesondere ergibt dieses Verfahren Backwaren wie die oben erwähnten Produkte, bei denen das spezifische Volumen relativ zu dem ansonsten ähnlichen Backprodukt erhöht ist, hergestellt aus einem Teig, der keine Oxidoreduktase enthält. In diesem Zusammenhang wird der Begriff "spezifisches Volumen" verwendet, um das Verhältnis zwischen Volumen und Gewicht des Produkts anzugeben. Es wurde überraschend gefunden, daß gemäß dem obigen Verfahren das spezifische Volumen signifikant um mindestens 10%, bevorzugt mindestens 20%, einschließlich mindestens 30%, bevorzugt mindestens 40% und am meisten bevorzugt um mindestens 50% erhöht werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der obigen Methode wird mindestens ein weiteres Enzym zu dem Teig gegeben. Geeignete Beispiele hiervon schließen eine Zellulase, eine Hemizellulase, eine Xylanase, ein Stärke abbauendes Enzym, eine Glucoseoxidase, eine Lipase und eine Protease ein.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
1.1 Aufreinigung der Hexoseoxidase aus Chondrus crispus
Eine aufgereinigte Hexoseoxidasepräparation wurde durch Verwendung der unten genannten Extraktions- und Aufreinigungsverfahren erhalten. Während der Verfahren und der folgenden Charakterisierung des aufgereinigten Enzyms wurde die folgende Analyse zur Bestimmung der Hexoseoxidaseaktivität verwendet:
1.1.1 Analyse der Hexoseoxidaseaktivität
Die Analyse basiert auf dem von Sullivan und Ikawa (Biochemica et Biophysica Acta, 1973, 309:11–22) beschriebenen Verfahren, wurde aber für Mikrotiterplatten modifiziert. Eine Analysenmischung enthaltend 150 μl β-D-Glucose (0,1 M in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,3), 120 μl 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,3, 10 μl o-Dianisidin-dihydrochlorid (Sigma D-3252, 3,0 mg/ml in H₂O), 10 μl Peroxidase (POD) (Sigma P-8125, 0,1 ml in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,3) und 10 μl Enzym-(HOX)-Lösung. Leerwerte wurden durch Zugabe von Puffer anstatt der Enzymlösung hergestellt.
Die Inkubation wurde durch die Zugabe von Glucose gestartet. Nach 15 minütiger Inkubation bei 25°C wurde die Extinktion bei 405 nm mit einem ELISA Lesegerät abgelesen. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung verschiedener Konzentrationen an H₂O₂ anstatt der Enzymlösung erstellt.
Die Reaktion kann in folgender Weise beschrieben werden:
Oxidiertes o-Dianisidin hat eine gelbe Farbe, die bei 405 nm absorbiert.
1.1.2 Extraktion
Frische Chondrus crispus Wedel wurden an der Küste von Brittany, Frankreich geerntet. Dieses Frischmaterial wurde mit einer Stiftmühle (Alpine) homogenisiert. Zu einer Probe von 100 g des entstandenen homogenisierten Materials aus den Wedeln wurden 300 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, gegeben. Die Mischung wurde anschließend in einem Beschallungsbad für 5 Minuten beschallt und dann unter konstanter Rotation für 4 Tage bei 5°C extrahiert, gefolgt von einer Zentrifugation der Mischung bei 47.000 × g für 20 Minuten.
300 ml des daraus entstandenen klaren, pinken Überstandes wurden durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit, ausgestattet mit einer Omega-Ultrafiltrationsmembran (10 kD Ausschluß, Filtron), entsalzt.
1.1.3 Anionenaustauschschritt
Das in 1.1.2 Verbliebene wurde auf eine 5 × 10 cm Säule mit 200 ml Q-Sepharose FF, die mit 20 mM Triethanolamin, pH 7,3, equilibriert wurde, gegeben. Die Säule wurde mit Equilibrierungspuffer gewaschen und die Hexoseoxidase mit 450 ml eines Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in Equilibrierungspuffer eluiert. Die Säule wurde mit 6 ml/Min. eluiert und 14 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen 9–17 (insgesamt 125 ml) wurden zusammengegeben und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon 4800 Einheit, ausgestattet mit einer Omega-Ultrafiltrationsmembran (10 kD Ausschluß, Filtron) auf 7,5 ml einkonzentriert.
1.1.4 Gelfiltration
Die erhaltenen 7,5 ml wurden auf eine Superdex 200 2,6 × 60 cm Gelfiltrationssäule, die mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,4, equilibriert wurde, gegeben und mit einer Flußrate von 1 ml/Min. eluiert. Fraktionen von 4 ml wurden gesammelt. Die Fraktionen 17–28 (Gesamtvolumen 50 ml), die die Hexoseoxidaseaktivität enthalten, wurden zusammengegeben.
1.1.5 Hydrophobe Interaktions-Chromatographie
Zu dem Pool aus dem Gelfiltrationsschritt 1.1.4 wurde Ammoniumsulfat in einer Endkonzentration von 2 M hinzugegeben. Diese Mischung wurde dann auf eine 1,6 × 16 cm Säule mit 32 ml Phenylsepharose, die mit 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,3, und 2 M (NH₄)₂SO₄ equilibriert wurde, gegeben. Die Säule wurde mit Equilibrierungspuffer gewaschen und anschließend die Hexoseoxidase mit einer Flußrate von 2 ml/Min. unter Verwendung eines 140 Lineargradienten von 2 M bis 0 M (NH₄)₂SO₄ in 20 mM Natriumphosphatpuffer eluiert. Fraktionen von 4 ml Volumen wurden gesammelt und die Fraktionen 24–33, die die Hexoseoxidaseaktivität enthalten, wurden zusammengegeben.
Die obengenannte pinke Farbe begleitete das Enzym, wurde in diesem Aufreinigungsschritt aber von der Hexoseoxidase abgetrennt.
1.1.6 Mono-Q-Anionenaustausch
Der oben erhaltene Pool von dem obigen Phenylsepharose-Chromatographieschritt wurde durch Ultrafiltration wie oben entsalzt. 2 ml des Pools wurden auf eine Mono-Q-HR 5/5 Säule, die mit 20 mM Triethanolamin, pH 7,3, equilibriert wurde, gegeben. Die Säule wurde anschließend mit 45 ml eines linearen Gradienten von 0 bis 0,65 M NaCl in Equilibrierungspuffer mit einer Flußrate von 1,5 ml/Min. eluiert. Fraktionen von 1,5 ml Volumen wurden gesammelt und die Fraktionen 14–24 wurden zusammengegeben.
1.1.7 Mono-P-Anionenaustausch
Der Hexoseoxidase enthaltende Pool aus dem obigen Schritt 1.1.6 wurde auf eine Mono-P-HR 5/5 Säule, die mit 20 mM bis-Trispuffer, pH 6,5, equilibriert wurde, gegeben. Das Enzym wurde mit 45 ml eines linearen Gradienten von 0 bis 0,65 M NaCl in Equilibrierungspuffer bei einer Durchflußrate von 1,5 ml/Min. eluiert und Fraktionen von 0,75 ml Volumen wurden gesammelt. Die höchste Hexoseoxidaseaktivität wurde in der Fraktion 12 gefunden.
1.2 Charakterisierung der aufgereinigten Hexoseoxidase
Die Hexoseoxidase enthaltenden Pools der obigen Schritte 1.1.6 und 1.1.7 wurden in den folgenden Charakterisierungsexperimenten verwendet:
1.2.1 Bestimmung des Molekulargewichts
Die Größe der aufgereinigten nativen Hexoseoxidase wurde durch Gelpermeations-Chromatographie unter Verwendung einer Superose 6 HR 10/30 Säule mit einer Druckflußrate von 0,5 ml/Min. in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,4, bestimmt. Ferritin (440 kD), Katalase (232 kD), Aldolase (158 kD), Rinderserumalbumin (67 kD) und Chymotrypsinogen (25 kD) wurden als Größenstandard verwendet. Das Molekulargewicht der aufgereinigten Hexoseoxidase wurde mit 120 ± kD bestimmt.
1.2.2 Bestimmung des pH-Optimums
Analysemischungen zur Bestimmung des pH-Optimums (Endvolumen 300 μl) enthielten 120 μl einer 0,1 M Stammlösung von Natriumphosphat/Citratpuffer mit verschiedenen pH-Werten. Alle anderen Komponenten der Analysemischung wurden in H₂O gelöst. Der pH wurde in der verdünnten Stammpufferlösung bei 25°C bestimmt.
Die Hexoseoxidase wies eine enzymatische Aktivität von pH 3 bis pH 8 auf, mit einem Optimum im Bereich von 3,5 bis 5,5.
1.2.3 K_m der Hexoseoxidase für Glucose bzw. Maltose
Kinetische Daten wurden an v = V_maxS/(K_m + S), worin V_max die maximale Geschwindigkeit, S die Substratkonzentration und K_m die Konzentration, die 50% der Maximalrate ergibt (Michaelis-Konstante) unter Verwendung des EZ-FIT Kurvenanpassungsprogramms (Perrella, F. W., 1988, Analytical Biochemistry, 174:437–447) angepaßt.
Eine typische hyperbolische Sättigungskurve wurde für die Enzymaktivität als eine Funktion von Glucose bzw. Maltose erhalten. K_m für Glucose wurde mit 2,7 mM ± 0,7 mM berechnet und für Maltose wurde ein K_m von 43,7 ± 5,6 mM gefunden.
Beispiel 2
Teigverbessernder Effekt von Hexoseoxidase extrahiert aus Chondrus crispus
2.1 Aufreinigung der Hexoseoxidase aus Chondrus crispus
Für dieses Experiment wurde Hexoseoxidase in der folgenden Art und Weise präpariert:
Frisches Chondrus crispus Material wurde an der Küste von Brittany, Frankreich gesammelt. Das Material wurde gefriergetrocknet und anschließend gemahlen. 40 g dieses gemahlenen Materials wurden in 1.000 ml 20 mM Triethanolamin (TEA) Puffer, pH 7,3, suspendiert und für 64 Stunden unter leichtem Schütteln bei 5°C stehengelassen und anschließend mit 2.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde durch GF/A und GF/C Glasfilter filtriert, gefolgt von einem Filtern mit einem Filter von 45 μm Porengröße, um eine Filtratpräparation von 800 ml mit einer Hexoseoxidaseaktivität, die einer Glucoseoxidaseaktivität von 0,44 Einheiten pro g der Präparation entspricht, zu erhalten. Die Aktivität wurde unter Verwendung des unten genannten Verfahrens bestimmt.
Der Überstand wurde auf eine 330 ml Austauschvolumen-Chromatographiesäule mit Anionenaustausch-Q-Sepharose Big Beads (Totvolumen 120 ml) gegeben. Gebundene Proteine wurden über 180 Minuten unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in 20 mM TEA Puffer, pH 7,3, eluiert, gefolgt von 1 M NaCl in 20 mM TEA Puffer, und Fraktionen von 9 ml wurden gesammelt und auf eine Hexoseoxidaseaktivität unter Verwendung der unten genannten analytischen Verfahren analysiert.
Hexoseoxidaseaktivität enthaltende Fraktionen 60–83 wurden zusammengefügt (ungefähr 250 ml) und durch Ultrafiltration auf ungefähr 25 ml einkonzentriert und entsalzt. Dieser Schritt wurde zweimal mit dem Verbliebenen wiederholt, zu dem 100 ml 0,05 mM TEA zugegeben wurde. Der erhaltene Rückstand von 25 ml enthielt 0,95 Glucoseoxidaseaktivitäts-Einheiten pro g.
2.2 Bestimmung der Glucoseoxidaseaktivität
Definition: 1 Glucoseoxidase(GOD)-Einheit entspricht der Menge an Enzym, die unter spezifischen Bedingungen eine Umwandlung von 1 μmol Glucose pro Minute schafft. Die Aktivität wird als Einheiten pro g der Enzympräparation angegeben.
Reagenzien: (i) Puffer: 20 g Na₂HPO₄-2H₂O ist in 900 ml destilliertem Wasser gelöst, der pH ist auf 6,5 eingestellt; (ii) Farbstoffreagens (Stammlösung): 200 mg 2,6-Dichloro-phenol-indophenol, Sigma Nr. D-1878 ist in 1.000 ml destilliertem Wasser unter starkem Rühren für 1 Stunde gelöst; (iii) Peroxidase (Stammlösung): Boehringer Mannheim Nr. 127 361, 10.000 Einheiten sind in 10 ml destilliertem Wasser gelöst und 4,2 g Ammoniumsulphat wurden zugegeben; (iv) Substrat: 10% W/V D-Glucoselösung in Puffer; (v) Standardenzym: Hydrase Nr. 1423 von Amano.
Analytisches Prinzip und Verfahren: Glucose wird in Gluconsäure und H₂O₂ umgewandelt, welches anschließend durch die Peroxidase zu H₂O und O₂ umgewandelt wird. Der hergestellte Sauerstoff oxidiert den blauen Farbstoff 2,6-Dichloro-phenol-indophenol, welcher dabei seine Farbe in purpurrot ändert. Der oxidierte Farbstoff wird spektrophotometrisch bei 590 nm gemessen und die Werte der enzymatischen Aktivität wurden relativ zu einem Standard bestimmt.
2.3 Der Effekt der Hexoseoxidasepräparation auf ein Vernetzen zwischen Thiolgruppen in einem Teig auf Weizenmehlbasis
Der Effekt der Hexoseoxidase auf die Bildung von vernetzten Thiolgruppen wurde untersucht, indem der Gehalt an freien Thiolgruppen in dem Teig, der aus 1.500 g Weizenmehl, 400 Grabender Units (BU) Wasser, 90 g Hefe, 20 g Sucrose und 20 g Salz hergestellt wurde, zu der 0, 100, 250, 875 bzw. 1.250 Einheiten pro kg Mehl der obigen Hexoseoxidasepräparation zugegeben wurden. Die Messung wurde im wesentlichen gemäß dem kolorimetrischen Verfahren von Ellmann (1958), auch in Cerial Chemistry, 1983, 70:22–26 beschrieben, durchgeführt. Dieses Verfahren basiert auf dem Prinzip, daß 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) mit den Thiolgruppen im Teig reagiert, um ein stark gefärbtes Anion der 2-Nitro-5-mercapto-benzoesäure zu bilden, welches spektrophotometrisch bei 412 nm gemessen wird.
Angenommen, daß die relative Änderung der Menge an Thiolgruppen im Teig durch die Änderung der optischen Dichte (OD) widergespiegelt wird, wie sie sich aus der Reaktion zwischen den Thiolgruppen und DTNB im Teig ergibt, wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Hexoseoxidase

GOD-Einheiten/kg Mehl OD₄₁₂

0 0,297

100 0,285

250 0,265

875 0,187

1.250 0,138
Dieses Experiment weist einen signifikanten Abfall in der OD auf, was eine Reduktion des Gehalts an freien Thiolgruppen anzeigt, welche proportional zu der zugegebenen Menge an Hexoseoxidaseaktivität war.
2.4 Verbesserung der rheologischen Eigenschaften des Teigs durch Hinzufügen von Hexoseoxidase
Der obengenannte Teig wurde extensigraphischen Messungen gemäß dem AACC-Verfahren 54–10 mit oder ohne der Zugabe einer Menge der Hexoseoxidasepräparation, welche 100 Einheiten/kg Mehl der Hexoseoxidaseaktivität entspricht, unterworfen. Der Teig ohne Zugabe des Enzyms diente als Kontrolle.
Das Prinzip des obigen Verfahrens ist, daß der Teig nach der Bildung einem Last-Dehnungstest nach dem Ruhenlassen bei 30°C für 45, 90, 135 bzw. 180 Minuten unter Verwendung eines Extensigraphen, der in der Lage ist, eine Last-Dehnungskurve (Extensigramm) aufzunehmen, unterworfen, welche ein Hinweis ist für den Widerstand des Teigs bezüglich physikalischer Deformation, wenn er gedehnt wird. Aus dieser Kurve kann der Ausdehnungswiderstand B (Höhe der Kurve) und die Ausdehnbarkeit C (Gesamtlänge der Kurve) berechnet werden. Das B/C-Verhältnis (D) ist ein Hinweis auf die Backstärke des Mehlteigs.

Die Ergebnisse des Experiments werden in Tabelle 2.1 unten zusammengefaßt. Tabelle 2.1 Extensigraphmessungen von Teig, der mit 100 GOD-Einheiten/kg Mehl Hexoseoxidase (HOX) versetzt wurde

Probe	Zeit, Min.	B	C	D = B/C
Kontrolle	45	230	180	1,3
HOX	45	320	180	1,8
Kontrolle	90	290	161	1,8
HOX	90	450	148	3,0
Kontrolle	135	290	167	1,7
HOX	135	490	146	3,4
Kontrolle	180	300	168	1,8
HOX	180	500	154	3,2

Es wird aus dieser Tabelle deutlich, daß die Zugabe von Hexoseoxidase (HOX) einen verbessernden Effekt auf den Ausdehnungswiderstand der Teige, wie es durch die Zunahme der B-Werte dargestellt wird, hat. Dies zeigt sich darin, daß das B/C-Verhältnis fast verdoppelt ist und zeigt deutlich, daß die Backstärke des Teigs signifikant durch die Zugabe von Hexoseoxidase erhöht ist.
In einem ähnlichen Experiment wurden 100 Einheiten/kg Mehl eines kommerziellen Glucoseoxidaseprodukts hinzugegeben und die obengenannten Parameter unter Verwendung eines Teigs ohne Enzymzugabe als Kontrolle bestimmt.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 2.2 unten dargestellt: Tabelle 2.2 Extensigraphmessungen von Teig, der mit 100 GOD-Einheiten/kg Mehl Glucoseoxidase (GOX) versetzt wurde

Probe Zeit, Min. B C D = B/C

Kontrolle 45 240 180 1,3

GOX 45 290 170 1,7

Kontrolle 90 260 175 1,5

GOX 90 360 156 2,3

Kontrolle 135 270 171 1,6

GOX 135 420 141 3,0
Wenn die Ergebnisse der beiden Experimente hinsichtlich der Unterschiede zwischen dem Kontrollteig und der mit Hexoseoxidase oder Glucoseoxidase versetzten Teige verglichen werden, wird es deutlich, daß Hexoseoxidase einen besseren Stärkungseffekt als Glucoseoxidase aufweist. Des weiteren erhöht sich das B/C-Verhältnis bei der Hexoseoxidase relativ zu der Glucoseoxidase schneller, was ein deutlicher Hinweis darauf ist, daß die Verbesserung der Backstärke durch Hexoseoxidase wirksamer übertragen werden kann als durch Glucoseoxidase (1).
Beispiel 3
Teigverbessernder Effekt der Hexoseoxidase extrahiert aus Chondrus crispus
Für dieses Experiment wurden Chondrus crispus Seegraswedel an der Küste von Hirsholmen, Dänemark geerntet. Hexoseoxidase wurde mit zwei verschiedenen Extraktionsverfahren isoliert und die Materialien von beiden wurden für das teigverbessernde Experiment unten zusammengegeben.
3.1 Aufreinigung der Hexoseoxidase aus Chondrus crispus I
954 g der frischen Wedel wurden mit destilliertem Wasser gewaschen, mit einem Tuch getrocknet und in flüssigem Stickstoff gelagert. Das Seegras wurde mit einem Waring-Blender gemischt und 1.908 ml 0,1 M Natriumphosphat- Puffer, 1 M NaCl, pH 6,8, wurden zu dem vermischten Seegras hinzugegeben. Die Mischung wurde unter konstantem Rühren bei 5°C für 4 Tage extrahiert, gefolgt von einer Zentrifugation der Mischung bei 20.000 × g für 30 Minuten.
Der erhaltene Überstand von 1.910 ml (351,1 U/ml) wurde auf 440 ml bei 40°C in einem Büchi-Rotavapor R110 einkonzentriert. Das Konzentrat wurde mit Ammoniumsulphat auf 25% fraktioniert. Die Mischung wurde 30 Minuten gerührt und für 20 Minuten bei 47.000 × g zentrifugiert. Der Überstand (395 ml) wurde über Nacht gegen 20 l 10 mM Triethanolamin (TEA) Puffer, pH 7,3, auf ein Endvolumen von 610 ml (367,1 U/ml) dialysiert.
Diese 610 ml wurden in zwei Läufen auf eine 2,6 × 25 cm Säule mit 130 ml Q-Sepharose FF, die mit 20 mM TEA Puffer, pH 7,3, equilibriert war, gegeben. Die Säule wurde mit dem Equilibrierungspuffer gewaschen und gebundenes Protein wurde unter Verwendung von 800 ml eines Gradienten von 0 bis 0,8 M NaCl in Equilibrierungspuffer eluiert. Die Säule wurde mit 4 ml/Min. eluiert und Fraktionen von 12 ml wurden gesammelt. Fraktionen, die eine Hexoseoxidaseaktivität enthalten, wurden gesammelt und auf ein Endvolumen von 545 ml (241,4 U/ml) zusammengegeben.
3.2 Aufreinigung der Hexoseoxidase aus Chondrus crispus II
1.250 g der frischen Wedel wurden mit destilliertem Wasser gewaschen, mit einem Tuch getrocknet und in flüssigem Stickstoff gelagert. Das Seegras wurde in einem Waring-Blender gemischt, gefolgt von einer Zugabe von 2.500 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl, pH 6,8. Die Mischung wurde unter ständigem Rühren für 4 Tage bei 5°C extrahiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 Minuten.
Der erhaltene Überstand von 2.220 ml (332,8 U/ml) wurde auf 445 ml bei 40°C in einem Büchi-Rotavapor R110 einkonzentriert. Das erhaltene Konzentrat wurde mit Ammoniumsulphat auf 25% fraktioniert. Die Mischung wurde für 30 Minuten gerührt und 20 Minuten bei 47.000 × g zentrifugiert. Das Präzipitat wurde verworfen. Der Überstand von 380 ml wurde über Nacht gegen 20 l 10 mM TEA Puffer, pH 7,3, dialysiert, um ein Endvolumen von 850 ml (319,2 U/ml) zu ergeben.
Diese 850 ml wurden auf eine 2,6 × 25 cm Säule mit 130 ml Q-Sepharose FF, equilibriert mit 20 mM TEA Puffer, pH 7,3, gegeben. Die Säule wurde mit Equilibrierungspuffer gewaschen und gebundene Proteine wurden mit 800 ml eines Gradienten von 0 bis 0,8 M NaCl in Equilibrierungspuffer eluiert. Die Säule wurde mit 4 ml/Min. eluiert und Fraktionen von 12 ml wurden gesam melt. Fraktionen, die eine Hexoseoxidaseaktivität enthalten, wurden gesammelt und zusammengegeben, um ein Endvolumen von 288 ml zu ergeben.
Das aus dem obigem Schritt Erhaltene wurde auf eine 2,6 × 31 cm Säule mit 185 ml metallchelatierender Sepharose FF, geladen mit Ni²⁺ und equilibriert mit 50 mM Natriumphosphat, 1 M NaCl, pH 7,4, gegeben. Gebundene Proteine wurden mit 740 ml eines Gradienten von 0 bis 35 mM Imidazol, pH 4,7, in Equilibrierungspuffer eluiert. Die Säule wurde mit 2 ml/Min. eluiert und Fraktionen von 11 ml wurden gesammelt. Fraktionen 41–54 (140 ml, 352,3 U/ml) wurden zusammengegeben. Einiges der Hexoseoxidase lief durch die Säule.
3.3 Zusammengeben und Konzentrieren der Extrakte
Der Durchlauf und die 140 ml von der Aufreinigung II und die 545 ml von der Aufreinigung I wurden zu einem Gesamtvolumen von 1.120 ml (303,6 U/ml) zusammengefügt. Die 1.120 ml wurden mit einem Rotationsevaporator auf ein Volumen von 210 ml gebracht, gefolgt von einer Dialyse gegen 20 l 10 mM TEA Puffer, pH 7,3, über Nacht, um ein Endvolumen von 207 ml (1.200,4 U/ml) zu ergeben.
3.3.1 Anionenaustauschschritt
Das aus dem obigen Schritt Erhaltene wurde auf eine 2,6 × 25 cm Säule mit 130 ml Q-Sepharose FF, equilibriert mit 20 mM Triethanolamin, pH 7,3, gegeben. Die Säule wurde mit Equilibrierungspuffer gewaschen und die gebundenen Proteine wurden mit 800 ml eines Gradienten von 0 bis 0,8 M NaCl in Equilibrierungspuffer eluiert. Die Säule wurde mit 4 ml/Min. eluiert und Fraktionen von 12 ml gesammelt. Fraktionen 30–50, die eine Hexoseoxidaseaktivität enthalten (260 ml, 764,1 U/ml), wurden gesammelt und zusammengefügt.
3.3.2 Andere Enzymaktivität
Die obige, zusammengegebene Lösung wurde auf weitere enzymatische Nebenaktivitäten durch Katalase, Protease, Xylanase, α- und β-Amylase und Lipase getestet. Keine dieser Aktivitäten wurde in der Lösung gefunden.
3.4 Verbesserung der rheologischen Eigenschaften des Teigs durch Zugabe von Hexoseoxidase
Ein Teig wurde aus Weizenmehl, Wasser und Salz hergestellt und 0, 72, 216 bzw. 360 Einheiten pro kg Mehl der obigen Hexoseoxidasepräparation wurden dazu hinzugefügt. Der Teig ohne Zugabe des Enzyms diente als Kontrolle. Zusätzlich wurden zwei Teige hergestellt, zu denen 216 bzw. 360 Einheiten pro kg Mehl an Gluzym, einer Glucoseoxidase erhältlich von Novo Nordisk A/S, Dänemark, hinzugegeben.

Die Teige wurden extensigraphischen Messungen gemäß einer Modifikation des obigen AACC-Verfahrens 54–10 unterworfen. Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle 3.1 unten zusammengefaßt. Tabelle 3.1 Extensigraphmessungen von Teig, der mit Hexoseoxidase (HOX) oder Glucoseoxidase (Einheiten pro kg Mehl) ergänzt wurde

Probe	Zeit, Min.	B	C	D = B/C
Kontrolle	45	250	158	1,6
HOX 72 U/kg	45	330	156	2,1
HOX 216 U/kg	45	460	153	3,0
HOX 360 U/kg	45	580	130	4,5
Gluzym 72 U/kg	45	350	159	2,2
Gluzym 216 U/kg	45	340	148	2,3
Gluzym 360 U/kg	45	480	157	3,1
Kontrolle	90	290	164	1,8
HOX 72 U/kg	90	470	145	3,2
HOX 216 U/kg	90	650	142	4,6
HOX 360 U/kg	90	870	116	7,5
Gluzym 72 U/kg	90	450	147	3,1
Gluzym 216 U/kg	90	480	138	3,5
Gluzym 360 U/kg	90	500	152	3,2
Kontrolle	135	330	156	2,1
HOX 72 U/kg	135	540	129	4,2
HOX 216 U/kg	135	750	125	6,0
HOX 360 U/kg	135	880	117	7,5
Gluzym 72 U/kg	135	510	136	3,8
Gluzym 216 U/kg	135	550	122	4,5
Gluzym 360 U/kg	135	560	121	4,6

Es wird aus der obigen Tabelle deutlich, daß die Zugabe von Hexoseoxidase (HOX) oder Glucoseoxidase einen verbessernden Effekt auf den Ausdehnungswiderstand der Teige hat, wie er durch die Zunahme der B-Werte dargestellt wird. Dieses zeigt sich in der Zunahme des B/C-Verhältnisses als einem deutlichen Hinweis, daß die Backstärke des Mehls signifikant durch die Zugabe der Enzyme verbessert wurde.
Es ist des weiteren klar, daß die Hexoseoxidase einen besseren Stärkungseffekt als Glucoseoxidase aufweist. Des weiteren nimmt das B/C-Verhältnis schneller mit der Hexoseoxidase relativ zu der Glucoseoxidase zu, was ein deutlicher Hinweis ist, daß die Verbesserung der Backstärke wirksamer durch Hexoseoxidase als durch Glucoseoxidase übertragen wird.
Beispiel 4
Teigverbessernder Effekt durch Hexoseoxidase extrahiert aus Chondrus crispus
4.1 Aufreinigung der Hexoseoxidase aus Chondrus crispus
Frische Chondrus crispus Wedel wurden an der Küste von Brittany, Frankreich geerntet. 2.285 g des frischen Materials wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, mit einem Tuch getrocknet und in flüssigem Stickstoff gelagert. Das Seegras wurde mit einem Waring-Blender gemixt, gefolgt von der Zugabe von 4.570 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl, pH 6,8. Die Mischung wurde unter ständigem Magnetrühren bei 5°C für 4 Tage extrahiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 Minuten.
Der erhaltene Überstand von 4.930 ml (624,4 U/ml) wurde auf 1.508 ml unter Verwendung einem Büchi-Rotavapor R110 bei 40°C einkonzentriert. Das erhaltene Konzentrat wurde mit Polyethylenglycol auf 3% (W/V) fraktioniert. Die Mischung wurde für 30 Minuten gerührt und für 30 Minuten bei 47.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen. Der Überstand von 1.470 ml (2.118,7 U/ml) wurde mit PEG auf 24% fraktioniert. Die Mischung wurde für 30 Minuten gerührt und für 30 Minuten bei 47.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die 414,15 g Präzipitat wurden in 200 ml 20 mM TEA Puffer, pH 7,3, resuspendiert, gefolgt von einer Dialyse gegen 20 l 10 mM TEA Puffer, pH 7,3, bei 5°C über Nacht.
Nach der Dialyse war das Volumen 650 ml (2.968,6 U/ml). Die Suspension wurde für 30 Minuten bei 20.000 × g zentrifugiert. Das Präzipitat wurde verworfen und der Überstand wurde auf 3.200 ml mit destilliertem Wasser verdünnt.
Diese 3.200 ml (829,9 U/ml) wurden auf eine 10 × 14 cm Säule mit 1.100 ml Q-Sepharose FF, die mit 20 mM TEA Puffer, pH 7,3, equilibriert wurde, gegeben. Die Säule wurde mit Equilibrierungspuffer gewaschen und die gebundenen Proteine wurden unter Verwendung von 15.000 ml eines Gradienten von 0 bis 0,8 M NaCl in Equilibrierungspuffer eluiert. Die Säule wurde mit 50 ml/Min. eluiert. Hexoseoxidase lief durch die Säule und 840 ml davon wurden gesammelt.
Die Suspension von 840 ml wurde mit Kieselgur behandelt und auf 335 ml (2.963,3 U/ml) einkonzentriert.
Diese 335 ml wurden auf eine 3 l Sephadex G25C 10 × 40 cm Entsalzungssäule gegeben. Die Säule war mit 20 mM TEA Puffer, pH 7,3, equilibriert und wurde mit einer Flußrate von 100 ml/Min. eluiert und 970 ml Eluat wurden gesammelt. Dieses Eluat wurde auf eine 10 × 14 cm Säule mit 1.100 ml Q-Sepharose FF, equilibriert mit 20 mM TEA, pH 7,3, gegeben. Die Säule wurde mit Equilibrierungspuffer gewaschen und gebundene Proteine wurden mit 15.000 ml eines Gradienten von 0 bis 0,8 M NaCl in Equilibrierungspuffer eluiert. Die Säule wurde mit 50 ml/Min. eluiert. Hexoseoxidase läuft durch die Säule und 1.035 ml davon wurden gesammelt.
Zu diesem Eluat (1.035 ml) wurde Ammoniumsulphat in einer Endkonzentration von 2 M gegeben. Die Mischung wurde dann in zwei Läufen auf eine 5 × 10 cm Säule mit 200 ml Phenylsepharose HP, die mit 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,3 und 2 M (NH₄)₂SO₄ equilibriert war, gegeben. Die Säule wurde mit Equilibrierungspuffer gewaschen, gefolgt von einer Flution der gebundenen Proteine mit einer Flußrate von 50 ml/Min. unter Verwendung von 5.000 ml eines Gradienten von 2 M bis 0 M (NH₄)₂SO₄ in 25 mM Natriumphosphatpuffer. Fraktionen von 500 bzw. 29 ml wurden vom Lauf 1 und 2 gesammelt. Fraktion 5 in Lauf 1 und Fraktionen 27–42 in Lauf 2 enthalten eine Hexoseoxidaseaktivität und wurden auf ein Gesamtvolumen von 1.050 ml (563,9 U/ml) zusammengegeben.
Dieser Pool wurde durch eine 3 l Sephadex G25C Gelfiltrationssäule entsalzt. Die Säule wurde mit 20 mM TEA Puffer, pH 7,3, equilibriert, mit einer Flußrate von 100 ml/Min. eluiert und 1.000 ml Eluat wurden gesammelt.
Das Eluat von 1.000 ml wurde auf 202 ml (2.310,2 U/ml) einkonzentriert und diese Präparation wurde für die folgenden rheologischen Tests verwendet.
4.2 Verbesserung der rheologischen Eigenschaften des Teigs durch Zugabe von Hexoseoxidase
Ein Teig wurde aus Weizenmehl, Wasser und Salz hergestellt und 0, 288, 504 bzw. 720 Oxidoreduktase-Einheiten pro kg Mehl der obigen Hexoseoxidasepräparation wurden dazu hinzugegeben. Der Teig ohne Zugabe des Enzyms diente als Kontrolle. Des weiteren wurden zwei Teige hergestellt, zu denen 288 bzw. 504 Oxidoreduktase-Einheiten pro kg Mehl an Gluzym, eine Glucoseoxidase erhältlich von Novo Nordisk A/S, Dänemark, zugegeben wurden.
Diese Teige wurden extensigraphischen Messungen gemäß einer Modifikation des AACC-Verfahrens 54–10 unterworfen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.1 unten zusammengefaßt. Tabelle 4.1 Extensigraphmessungen von Teig, zu dem Hexoseoxidase (HOX) oder Glucoseoxidase (Einheiten pro kg Mehl) hinzugegeben wurden

Probe	Zeit, Min.	B	C	D = B/C
Kontrolle	45	210	171	1,2
HOX 288 U/kg	45	490	139	3,5
HOX 504 U/kg	45	640	122	5,2
HOX 720 U/kg	45	730	109	6,7
Gluzym 288 U/kg	45	350	165	2,1
Gluzym 504 U/kg	45	385	153	2,5
Gluzym 720 U/kg	45	435	148	2,9
Kontrolle	90	275	182	1,5
HOX 288 U/kg	90	710	130	5,5
HOX 504 U/kg	90	825	106	7,8
HOX 720 U/kg	90	905	107	8,5
Gluzym 288 U/kg	90	465	153	3,0
Gluzym 504 U/kg	90	515	135	3,8
Gluzym 720 U/kg	90	540	140	3,9
Kontrolle	135	280	175	1,6
HOX 288 U/kg	135	745	102	7,3
HOX 504 U/kg	135	920	94	9,8
HOX 720 U/kg	135	-	80	-
Gluzym 288 U/kg	135	525	129	4,1
Gluzym 504 U/kg	135	595	129	4,6
Gluzym 720 U/kg	135	630	121	5,2

Es wird aus den obigen Ergebnissen deutlich, daß die Zugabe von Hexoseoxidase (HOX) oder Glucoseoxidase einen verbessernden Effekt auf den Ausdehnungswiderstand des Teigs, wie er durch die Zunahme der B-Werte dargestellt ist, aufweist. Dies ist in einer Zunahme des B/C-Verhältnisses erkennbar.
Es wird des weiteren deutlich, daß Hexoseoxidase einen besseren Starkungseffekt aufweist als Glucoseoxidase, der Stärkungseffekt beider Enzyme ist proportional zur zugegebenen Enzymmenge. Des weiteren nimmt das B/C-Verhältnis bei der Hexoseoxidase relativ zu der Glucoseoxidase schneller zu, was ein deutlicher Hinweis ist, daß die Verbesserung der Backstärke wirksamer durch Hexoseoxidase als durch Glucoseoxidase übertragen werden kann.
Beispiel 5
Verbessernder Effekt der Hexoseoxidase extrahiert aus Chondrus crispus auf das spezifische Volumen von Brot
5.1 Aufreinigung der Hexoseoxidase aus Chondrus crispus
Frische Chondrus crispus Wedel wurden entlang der Küste von Brittany, Frankreich geerntet. 2.191 g dieses Frischmaterials wurden mit destilliertem Wasser gewaschen, mit einem Tuch getrocknet und in flüssigem Stickstoff gelagert. Das Seegras wurde mit einem Waring-Blender gemixt, gefolgt von einer Zugabe von 4.382 ml 0.1 M Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl, pH 6,8. Die Mischung wurde unter kontinuierlichem Magnetrühren bei 5°C für 4 Tage extrahiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 20.000 × g für 20 Minuten.
Der erhaltene Überstand von 4.600 ml (746,1 U/ml) wurde auf 850 ml in einem Büchi-Rotavapor R110 bei 40°C einkonzentriert. Dieses Konzentrat (3.626,9 U/ml) wurde auf 3% (W/V) Polyethylenglycol fraktioniert. Die Mischung wurde 30 Minuten gerührt und 30 Minuten bei 20.000 × g zentrifugiert. Das Präzipitat wurde verworfen. Der Überstand von 705 ml (2.489,8 U/ml) wurde auf 25% PEG fraktioniert. Die Mischung wurde für 30 Minuten gerührt und für 30 Minuten bei 20.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Präzipitat von 341 g wurde in 225 ml 20 mM TEA Puffer, pH 7,3, resuspendiert. Die Suspension (500 ml) wurde mit einer 3 l Sephadex G25C 10 × 40 cm Entsalzungssäule entsalzt. Die Säule war mit 20 mM TEA Puffer, pH 7,3 equilibriert worden und wurde mit einer Flußrate von 100 ml/Min. eluiert. 1.605 ml Eluat wurden gesammelt.
Zu diesem Eluat (687,5 U/ml) wurde Ammoniumsulphat in einer Endkonzentration von 2 M hinzugegeben. Diese Mischung wurde dann in zwei Läufen auf eine 5 × 10 cm Säule mit 200 ml Phenylsepharose HP, equilibriert mit 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,3, und 2 M (NH₄)₂SO₄ gegeben. Die Säule wurde mit Equilibrierungspuffer gewaschen, gefolgt von einer Flution der gebundenen Proteine bei einer Flußrate von 50 ml/Min. unter Verwendung von 5.000 ml eines Gradienten von 2 M bis 0 M (NH₄)₂SO₄ in 25 mM Natriumphosphatpuffer. Fraktionen von 29 ml wurden gesammelt. Fraktionen 85–105 im Lauf 1 und Fraktionen 36–69 im Lauf 2 enthielten eine Hexoseoxidaseaktivität und wurden gesammelt, was ein Gesamtvolumen von 1.485 ml (194,7 U/ml) ergab.
Dieser Pool wurde mit einer 3 l Sephadex G25C Gelfiltrationssäule, die gleiche wie in 4.1 verwendet, entsalzt. Die Säule war mit 20 mM TEA Puffer, pH 7,3, equilibriert worden und wurde mit einer Flußrate von 100 ml/Min. eluiert. 1.200 ml Eluat wurden gesammelt.
Das Eluat von 1.200 ml wurde auf 685 ml (726,2 U/ml) einkonzentriert und für die Backexperimente verwendet.
5.2 Verbesserung des spezifischen Volumens von Brot durch Zugabe von Hexoseoxidase zu dem Teig
Ein Teig wurde aus 1.500 g Mehl, 90 g Hefe, 24 g Salz, 24 g Zucker und 400 BU Wasser hergestellt und 0 oder 108 Einheiten der oben aufgereinigten Hexoseoxidase bzw. 108 Einheiten von Gluzym (Glucoseoxidase erhältlich von Novo Nordisk, Dänemark) pro kg Mehl wurden dazugegeben. Der Teig wurde mit einem Hobart-Mixer für 2 + 9 Minuten bei 26°C gemischt und in zwei Teile geteilt, gefolgt von einem 10 minütigen Ruhenlassen bei 30°C in einem Heizraum, Formen mit einer Fortuna 3/17/7 und einem Gehenlassen für 45 Minuten bei 34°C und 85% RH. Der so reifengelassene Teig wurde bei 220°C für 17 Minuten mit 12 Sek. Dampf in einem Bago-Ofen gebacken.
Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle 5.1 unten zusammengefaßt. Tabelle 5.1 Verbesserung des spezifischen Volumens von Brot, hergestellt aus Teig, der mit Hexoseoxidase oder Glucoseoxidase versetzt wurde (Einheiten pro kg Mehl)

Gesamtvolumen Gesamtgewicht spezifisches Volumen

Kontrolle 5.325 1.027 5,18

Hexoseoxidase 108 U/kg 6.650 1.036 6,41

Gluzym 108 U/kg 6.075 1.030 5,89
Es wird aus der obigen Tabelle deutlich, daß das Hinzufügen von Hexoseoxidase oder Glucoseoxidase einen erhöhten Effekt auf das Gesamtvolumen hat, während das Gewicht im wesentlichen gleich bleibt. Dies zeigt sich in einer Zunahme des spezifischen Volumens im Vergleich mit dem Brot, welches ohne Zugabe von Enzymen gebacken wurde.
Es wird des weiteren deutlich, daß Hexoseoxidase einen signifikant größeren Effekt auf die Zunahme des spezifischen Volumens als eine Glucoseoxidase bei der gleichen Dosierung hat.
Beispiel 6
Charakterisierung der aufgereinigten Hexoseoxidase
Präparationen der vorherigen Aufreinigungen wurden für die Charakterisierung der Hexoseoxidase verwendet.
6.1 Färbung einer Hexoseaktivität nach einer nichtnaturierenden PAGE
Hexoseoxidaseaktivität wurde durch eine native PAGE unter Verwendung von vorgegossenen 8–16% Tris-glycin Novel Gelen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Novex, San Diego, USA) analysiert. Nach der Elektrophorese wurden die Gele auf eine Hexoseoxidaseaktivität gefärbt, indem das Gel mit einer Lösung enthaltend 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, 100 mM Glucose, 50 mg/l Phenazinmethosulphat (Sigma P9625) und 250 mg/l Nitroblue Tetrazolium (Sigma N6876), wie in der Doktorarbeit von Witteveen, C. F. B. (1993) "Gluconate formation and polyol metabolism in Aspergillus niger" beschrieben, gefärbt. Nach ungefähr 30 Minuten wurde die Hexoseoxidaseaktivität als eine sehr eng beinanderliegende Doppelbande sichtbar. Die gleiche Doppelbande konnte ebenfalls gesehen werden, wenn eine native PAGE einer Hexoseoxidase mit Silber gefärbt wurde. Das Molekulargewicht der aufgereinigten Hexoseoxidase wurde mit 144 kD mit Hilfe der nativen PAGE bestimmt. Die eine Hälfte des Gels wurde mit Silber gefärbt, die andere Hälfte wurde auf eine Aktivität hin gefärbt. Als Standards wurden Rinderserumalbumin (67 kD), Lactatdehydrogenase (140 kD), Catalase (232 kD), Ferritin (440 kD) und Thyroglobulin (669 kD) verwendet.
6.2 Bestimmung des Molekulargewichts durch SDS-PAGE
Das Molekulargewicht wurde ebenfalls bestimmt für ein Material, welches zuerst einer nativen PAGE, wie oben beschrieben, unterzogen wird, nach dem Färben der Aktivität wurde die Hexoseoxidasebande aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung eines Elektroelutriators (Modell 422, Bio-Rad, CA, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers elektroeluiert. Das elektroeluierte Protein wurde einer SDS-PAGE und einer Silberfärbung unterworfen. Dieses Material ergab "eine" Doppelbande bei ungefähr 70 kD in SDS-PAGE Gelen. Die elektroeluierte Hexoseoxidase ist damit ein Dimer aus zwei Untereinheiten.
6.3 Bestimmung des pI der Hexoseoxidase
Proben enthaltend ein Hexoseoxidaseaktivität wurden mit einer isoelektrischen Fokussierung (IEF) unter Verwendung eines vorgegossenen 3–10 IEF Gels gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Novex, San Diego, USA) analysiert. Nach der Elektrophorese wurde die Hälfte des Gels silbergefärbt und die andere Hälfte mit Nitroblue Tetrazolium, wie in 6.1 beschrieben, gefärbt.
Hexoseoxidase wurde als eine Doppelbande gefärbt. Der pI der ersten Bande lag bei 4,79, der pI der zweiten Bande bei 4,64. Als Standards wurden Trypsinogen (9,30), Linsenlectin saure Bande (8,65), Linsenlectin mittlere Bande (8,45), Linsenlectin Säurebande (8,15), Pferdmyoglobin saure Bande (6,85), humane Carbonsäureanhydrase B (5,85), β-Lactoglobulin A (5,20), Sojabohnen Tripsininhibitor (4,55) und Amyloglucosidase (3,50) verwendet.
6.4 Bestimmung des K_m der Hexoseoxidase für verschiedene Zucker
K_m der Hexoseoxidase wurden mit 6 verschiedenen Zuckern, wie in 1.2.3 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6.1 unten zusammengefaßt. Tabelle 6.1 Bestimmung des Km der Hexoseoxidase für verschiedene Zucker

Substrat K_m (mM) CV (mM)

D-Glucose 2,7 0,7

D-Galactose 3,6 1

Cellobiose 20,2 7,8

Maltose 43,7 5,6

Lactose 90,3 20,6

Xylose 102 26

Arabinose 531 158

(CV = Variationskoeffizient)

6.5 Bestimmung der Peptidsequenz der Hexoseoxidase
50 μl der elektroeluierten Mischung aus 6.2 wurden in 450 μl 0,1%iger Trifluoressigsäure (TFA) suspendiert.
Um das Tris, Glycin und SDS zu entfernen, wurde die obige Mischung einer Chromatographie auf einer Umkehr-HPLC unterworfen. Die erhaltene Lösung wurde in 9 Läufen auf eine 4,6 × 30 cm Brownlee C2 Säule, die mit 0,1% TFA equilibriert wurde, gegeben. Die Säule wurde mit Equilibrierungspuffer gewaschen und gebundene Peptide mit 14 ml eines Gradienten von 10 bis 80% Acetonitril in 0,1% TFA mit einer Fließrate von 0,7 ml/Min. eluiert. Fraktionen mit dem größten Peak, enthaltend das Enzym, wurden gesammelt und gefriergetrocknet.
6.5.1 Endoproteinase Lys-CV Verdau
Das erhaltene gefriergetrocknete Enzym wurde in 50 μl 8 M Harnstoff, 0,4 M NH₄HCO₃, pH 8,4, gelöst. Denaturierung und Reduktion des Proteins wurden durch Zugabe von 5 μl 45 mM Dithiothreitol unter einer Schicht von N₂ bei 50°C für 15 Minuten durchgeführt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 5 μl 100 mM Jodacetamid wurden hinzugegeben, die Cysteine wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln unter N₂ derivatisiert. Anschließend wurde die Lösung in 135 μl Wasser suspendiert und der Verdau wurde bei 37°C unter N₂ für 24 Stunden durch Zugabe von 5 μg Endoproteinase Lys-C, gelöst in 5 μl Wasser, durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Frieren der Reaktionsmischung bei –20°C beendet.
6.5.2 Umkehr-HPLC-Trennung der Peptide
Die erhaltenen Peptide wurden durch Umkehr-HPLC auf einer 0,46 × 15 cm VYDAC C18 Säule (The Separation Group, CA, USA) unter Verwendung als Lösungsmittel A 0,1% TFA in Wasser und als Lösungsmittel B 0,1% TFA in Acetonitril getrennt.
6.5.3 Peptidsequenzierung
Die Sequenzierung wurde mit einem Applied Biosystems 476 A Sequenzierer (Applied Biosystems, CA, USA) unter Verwendung von gepulsten-flüssigen Schnellzyklen gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Ein Peptid mit der unten genannten Aminosäuresequenz wurde identifiziert:
DPGYIVIDVNAGTPDKPDP.

Claims

Verfahren zur Verbesserung der rheologischen Eigenschaften von Mehlteig und der Qualität des aus dem Teig hergestellten Fertigprodukts, umfassend das Hinzufügen einer effektiven Menge einer Oxidoreduktase, die wenigstens in der Lage ist, Maltose zu oxidieren, zu den Teigbestandteilen, Teigzusatzstoffen oder dem Teig.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oxidoreduktase eine Hexoseoxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Hexoseoxidase von einem Ausgangsmaterial stammt ausgewählt aus einer Algenart, einer Pflanzenart und einer Mikrobenart.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Hexoseoxidase von Chondrus crispus ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Hexoseoxidase in einer Menge im Bereich von 1–10.000 Einheiten pro kg Mehl zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei Hexoseoxidase in einer Menge im Bereich von 10–1.000 Einheiten pro kg Mehl zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Ausdehnungswiderstand des Teigs als Ausdruck des Verhältnisses zwischen dem Ausdehnungswiderstand (Höhe der Kurve, B) und der Ausdehnbarkeit (Länge der Kurve, C), d. h. das Verhältnis von B/C, gemessen durch das AACC-Verfahren 54–10, um mindestens 10% erhöht ist, relativ zu dem ansonsten ähnlichen Teig, der keine Oxidoreduktase enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Fertigprodukt Brot ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Fertigprodukt ein Nudelprodukt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Fertigprodukt eine Teigware ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin mindestens ein weiteres Enzym den Teigbestandteilen, Teigzusatzstoffen oder dem Teig zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das weitere Enzym aus der Gruppe bestehend aus einer Zellulase, Hemizellulase, Xylanase, Stärke abbauendem Enzym, Glucoseoxidase, Lipase oder einer Protease ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Backerzeugnisses, umfassend die Herstellung eines Mehlteigs zu dem eine effektive Menge einer Oxidoreduktase, die zumindest in der Lage ist, Maltose zu oxidieren, zugegeben wird und backen des Teigs.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das spezifische Volumen des Backerzeugnisses relativ zu einem ansonsten ähnlichen Backerzeugnis, welches mit einem Teig, der keine Oxidoreduktase enthält, hergestellt wurde, erhöht ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das spezifische Volumen um mindestens 20% erhöht ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin mindestens ein weiteres Enzym dem Teig zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das weitere Enzym aus der Gruppe bestehend aus Zellulase, Hemizellulase, Xylanase, Stärke abbauendem Enzym, Glucoseoxidase, Lipase und Protease ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die Oxidoreduktase eine Hexoseoxidase ist.
Verfahren zur Herstellung eines Nahrungserzeugnisses auf Mehlteigbasis, umfassend das Hinzufügen einer effektiven Menge einer Maltose oxidierenden Oxidoreduktase zum Teig.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Oxidoreduktase eine Hexoseoxidase ist.