DE69600407T2

DE69600407T2 - Stabilisierende lösungen für troponin

Info

Publication number: DE69600407T2
Application number: DE69600407T
Authority: DE
Inventors: Roger Ft. Lauderdale Fl 33326 Bauer; Bruce Miami Fl 33176 Chin; Cathy Norfolk Va 23507 Flaa; Alberto Miami Fl 33174 Sabucedo
Original assignee: Dade Behring Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1996-03-06
Publication date: 1999-04-29
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: JP3740644B2; EP0759074B1; CA2189737A1; AU698790B2; DE69600407D1; AU5092996A; WO1996027661A1; ES2121479T3; US6165981A; EP0759074A1; JPH10500704A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf wäßrige Standardlösungen für diagnostische Analysen für Troponin und Troponinfragmente einschließlich synthetischer und rekombinanter Peptide von Troponin.

Hintergrund der Erfindung

Eine Anzahl von physiologischen Konditionen und Zuständen sind mit erhöhten Pegeln von Troponin verbunden. Erhöhte Pegel stehen in der Regel zu einem Herzinfarkt und anderen Beschwerden im Zusammenhang, die zu einer Herzmuskelverletzung führen.
Hauptsächlich aufgrund der Beziehung von erhöhten Pegeln dieser Proteine mit einem akuten Herzinfarkt sind Tests für einen akuten Herzinfarkt (AHI) erdacht worden und werden erdacht, um den Pegel dieser Proteine in Flüssigkeiten zu bestimmen. Aus diesem Grund sind diese Proteine als Kardialmarker bekannt geworden.
Ein akuter Herzinfarkt ist nach wie vor, insbesondere in den Vereinigten Staaten, ein Hauptgrund für Krankheit und Tod. Geschätzte 1,5 Mio. Aufnahmen in Krankenhäusern können einem vermuteten Herzinfarkt oder einer verwandten Herzerkrankung zugeschrieben werden. Von diesen Patienten leiden nur ungefähr 25% aktuell an einem AHI, während weitere 30% mit einer wechselnden Angina eingeliefert werden, 20% haben eine dauerhafte Herzerkrankung (DHE) und die verbleibenden 25% haben keine DHE. Eine Unterscheidung von solchen Patienten, die eine unmittelbare Behandlung und eine Einweisung ins Krankenhaus erfordern, von denjenigen, die nicht in Gefahr sind, ist von großem Wert für die zur Verfügungstellung einer effektiven medizinischen Behandlung, sowie für die Reduzierung von Krankenhausaufenthaltskosten und die effektive Verwaltung von Krankenhauseinrichtungen. Gegenwärtige Studien zeigen, daß eine frühzeitige Intervention entscheidend für optimale therapeutische Maßnahmen ist.
Diese therapeutischen Maßnahmen haben das Potenzial, die Durchblutung zu dem beschädigten Herzmuskel wieder herzustellen, die Größe des Infarkts zu begrenzen und folglich eine Herzfunktion zu erhalten. Neue therapeutische Interventionsmechanismen, spezifische thrombolytische Agenzien, wie z. B. Streptokinase und ein Gewebe Plasminogen Aktivator sind verfügbar, um eine Koronararteriendurchblutung wieder herzustellen und die Häufigkeit von Todesfällen zu reduzieren. Die meisten Kliniker glauben, daß eine Intervention sobald wie möglich, zumindest jedoch innerhalb der ersten vier Stunden nach dem Beginn von Schmerzen im Brustkorb, stattfinden sollte.
Entsprechend sollte ein idealer Kardialmarker oder eine Kombination von Markern herzgewebespezifisch sein; er sollte innerhalb von vier Stunden nach dem Beginn von AHI diagnostisch sein; er sollte für wenigstens sieben Tage nach einem AHI etwas erhöht verbleiben; aber er sollte einen Reinfarkt selbst während der ersten paar Tage nach dem ersten AHI feststellen.
Eine Diagnose eines AHI basiert heute auf einem annormalen Elektrokardiogramm (EKG), klinischen Symptomen und einer Vorgeschichte und auf erhöhten kardialen Enzympegeln. Gegenwärtig wird CK-MB oft als der "definitive" Serummarker für einen AHI verwendet.
Oft ergeben jedoch das EKG und die klinische Präsentation nicht überzeugende oder widersprüchliche Vorhersagen eines kardialen Traumas. Ein CK-MB-Test hat einige Einschränkungen beim Beitrag zu einer Abschlußdiagnose. Ein Skelettmuskelschaden und eine anstrengende Übung kann den CK-MB-Pegel künstlich erhöhen und das klinische Bild verwischen machen. Zusätzlich erhöht sich CK-MB erst vier bis sechs Stunden nach einem AHI in diagnostizierbarer Weise. Darüber hinaus werden CK-MB-Pegel 48 bis 72 Stunden nach einem AHI nicht diagnostizierbar.
CK-MB ist in einer Kontrollösung hergestellt worden, um diagnostische Messungen dieses Analyten zu überwachen, jedoch ist CK- MB ein Enzym, das in Humanserum und in herkömmlichen gepufferten wässrigen Lösungen eine begrenzte Stabilität hat. Das US Patent Nr. 4,994,375 offenbart eine stabile wieder hergestellte Kontroll-Lösung auf Wasserbasis. Gegenwärtig sind Immunoassay Kits, wie z. B. das fluorometrische Dade® Stratus® CK-MB fluorometrische Enzym Immunoassay Kit für die Bestimmung von CK-MB-Pegeln, auf dem Markt verfügbar. Viele dieser Kits umfassen Standardlösungen. Kontroll-Lösungen, die CK-MB enthalten, wie z. B. die Dade® CK-MB/Myoglobin Immunoassay Control, sind auch erhältlich.
Myoglobin ist ein Marker, der sowohl in der skelettalen als auch in der kardialen Muskulatur vorhanden ist. Myoglobin-Pegel sind innerhalb von zwei Stunden nach einem AHI erhöht. Der Serum Pegel hat in sechs bis acht Stunden einen Höchstwert, kehrt jedoch nach 24 bis 36 Stunden auf einen nicht diagnostizierbaren Pegel zurück. Serum Myoglobin-Pegel sind jedoch auch nach einer Skelettmuskelverletzung erhöht. Es gibt wenige Immunoassay Kits, wie z. B. das Dade® Stratus® Myoglobin fluorometrische Enzym Immunoassay Kit für die Bestimmung von Myoglobin Pegeln, die kommerziell erhältlich sind. Myoglobin enthaltende Kontrollösun gen wurden hergestellt und sind aus solchen Quellen wie die Dade® CK-MB/Myoglobin Immunoassay Control kommerziell erhältlich.
Troponin ist ein Proteinkomplex mit einem Molekulargewicht von etwa 85 kD, der die Regulationsfunktion des Kontraktionsmechanismus des Muskelgewebes ausführt. Die Aminosäuresequenzen von Untereinheiten, die den Troponinkomplex umfassen, wurden bestimmt. Siehe z. B. Vallins W. J. u. a., Molecular cloning of human cardiac troponin I using polymerase drain reaction, FEBS LETTERS: Band 270, Nummer 1, z. September 1990. Troponin ist aus drei Untereinheiten von ähnlichem Molekulargewicht zusammengesetzt, die in der Anwesenheit von Kalzium zusammenwirken, um die Kontraktion oder Relaxation des Muskels zu steuern. Die drei Untereinheiten werden als Troponin T, C und I bezeichnet. Sowohl die T- als auch die I-Moleküle, die im Herzmuskel enthalten sind, haben Aminosäuresequenzen, die kardialspezifisch sind. Demgemäß haben sowohl Troponin T als auch Troponin I ein Potenzial für eine überdurchschnittliche Spezifität beim Testen von Schäden myokardialen Ursprungs. Schäden am kardialen Gewebe bewirken, daß diese kontraktilen Proteine nach einer Verletzung ziemlich rasch in den Kreislauf freigesetzt werden und dabei zugleich ein Potenzial für eine Empfindlichkeit zur Verfügung gestellt wird. Troponin ist vier bis sechs Stunden nach einem AHI diagnostisch und verbleibt für vier bis 14 Tage erhöht.
Proteine des Kontraktionsapparates, wie z. B. Toponin sind Teil eines unlöslichen Proteinkomplexes. Wenn gereinigtes Troponin in Serum gegeben wird, ist es demzufolge schwierig, es aufzulösen. Zusätzlich neigen gereinigte Zubereitungen von Troponin dazu, sehr labil zu sein und sichtbare Änderungen seiner Konformation und/oder Adhesion an Behälteroberflächen neigen dazu, eine quantitativen Bestimmung des Moleküls zu komplizieren. Folglich ist es sehr schwierig, eine wässrige Lösung zu entwickeln, die Tro ponin stabilisiert. Gegenwärtig haben kommerziell erhältliche Standardlösungen und Kontrollösungen, die für diagnostische Analysen für Troponin verwendet werden, in flüssiger Form eine sehr begrenzte Stabilität.
Infolgedessen gibt es einen Bedarf für wässrige Lösungen, die brauchbar zum Lösen und Stabilisieren von Troponin sind. Solche Lösungen können als diagnostische Kontrollösungs- oder Standardlösungsmatrix für Troponin und andere Kardialmarker oder andere Proteine dienen, die schwierig aufzulösen und/oder zu stabilisieren sind. Darüber hinaus ist die Matrix zum Lagern des (der) Proteins(e) brauchbar.
Zahlreiche Kriterien müssen erfüllt werden, wenn eine Basis- einer Standard- oder -Kontroll-Lösung für Troponin oder andere Proteine zubereitet wird, die Stabilitäts- oder Löslichkeitseigenschaften haben, die denjenigen von Troponin ähnlich sind. Stabilitätseigenschaften sind von vorrangigem Interesse. Flüssige Produkte werden wegen ihrer Reproduzierbarkeit und leichten Verwendbarkeit bevorzugt und und sollten stabil sein. Wenn das Produkt lyophillisiert wird, sollte es jedoch nach der Wiederherstellung stabil sein. Frühere Troponin Standardlösungen basieren auf Produkten, die von Humanserum abgeleitet sind und tragen sehr wenig zur Stabilität der Zusammensetzung bei. Zum Beispiel beträgt die publizierte "Zeitangabe" von lyophillisierten Troponin T-Standard- und Kontroll-Lösungen auf Humanserumbasis des Boehringer Mannheim Troponin T Elisa-Tests® nach der Wiederherstellung nur sechs Stunden bei 2ºC bis 8ºC und drei Monate, wenn sie aliquotisiert und bei -20ºC gelagert sind. Außerdem hat die DE-A-44 05 249 auch eine stabilisierte Troponin I Zubereitung offenbart, die Humanserum zusätzlich zu einem Puffer, einem Stabilisierungsprotein und einem Salz umfaßt. Eine Matrix, die die Stabilität des Produktes erhöht, ist äußerst wünschenswert.
Darüber hinaus birgt die Verwendung von normalem oder verarbeitetem Humanserum sowohl für Kliniker als auch für Hersteller Gesundheitsrisiken. Folglich ist eine Matrix, die Gesundheitsrisiken vermindert, äußerst wünschenswert.
Die Standardlösungen in einer synthetischen Matrix müssen die Form einer Antwortkurve unter Verwendung von normalem Humanserum nachahmen. Dies ist wichtig, um sicherzustellen, daß Ergebnisse, die aus einer mit der Matrix erzeugten Standardkurve abgelesen werden, zuverlässig sind, wenn die Ergebnisse mit dem aktuellen biologischen Milieu verglichen werden.
In einer diagnostischen Analyse muß eine nicht spezifische Bindung des Analyten an die Testoberfläche (zum Beispiel einen festen Träger wie Teströhrchen, Papier, Objektträger u. s. w.) minimiert werden, um eine Kalibrierung zuverlässig zu halten und jedes Risiko von "widersprüchlichen" Ergebnissen zu eliminieren. Folglich muß die nicht spezifische Bindung des Analyten in einer Matrix minimiert werden und der nicht spezifischen Bindung von Proben ähnlich sein. Es ist auch wichtig, daß das Protein oder Proteinfragmente während einer Lagerung nicht merklich an den Lagerungsbehälter binden.
Es gibt Fälle, in denen ein Analyt-Analogon erwünschter sein kann, als der eigentliche Analyt. Wenn anstelle des Analyten ein Analyt-Analogon verwendet wird, muß die Bindung des Analogons die Bindung des Analyten nachahmen. Besondere Sorgfalt muß angewandt werden, wenn Analogas für Proteine ausgewählt werden, weil die Immunbindung des Analogons die des Proteins nachahmen muß. Dementsprechend muß jede Konformationsabhängigkeit des Proteins für die Bindungsstelle in dem Analogon beibehalten werden. Zusätzlich sollte die Stabilität des Analogons gleich groß oder größer sein, als die des Analyten. Die Stabilität des Proteinanalyten kann wiederum in Beziehung zu seiner Konformation stehen. Falls ein Analogon stellvertretend für einen Analyten verwendet wird, ist letztendlich gewünscht, daß das Analogon besser verfügbar ist als der Analyt.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung stellt eine diagnostische Standardlösung einschließlich einer Matrix gemäß dem Anspruch 1 und die Verwendung einer solchen Matrix gemäß dem Anspruch 14 zur Verfügung.
Die Matrix verwendet eine Mischung von Bestandteilen, um dem Analyten eine Stabilität zu verleihen, die wenigstens äquivalent oder vorzugsweise besser ist als die Stabilität von Troponin in normalem Humanserum. Insbesondere wird eine Mischung auf Wasserbasis aus einem Puffer, Albumin, Gelatine, einem Chelatbildner, einem Reduktionsmittel und Salzen verwendet, um das Troponin oder Fragmente davon zu stabilisieren und zu lösen, wobei die Mischung einen leicht sauren bis leicht alkalischen pH-Wert hat.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt einen Vergleich der Stabilität bei 2ºC bis 8ºC von rekombinantem Troponin I voller Länge in unterschiedlichen Matrizen.
Fig. 2 zeigt einen Vergleich der Stabilität bei 2ºC bis 8ºC eines in rekombinanter Weise hergestellten Peptides aus 80 Aminosäuren in unterschiedlichen Matrizen.
Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Stabilität bei 2ºC bis 8ºC einer Standardlösung von einem synthetischen Peptid von Troponin I mit einer Konzentration von 10 ng/ml in unterschiedlichen Matrizen.
Fig. 4 zeigt einen Vergleich der Stabilität bei 2ºC bis 8ºC einer Standardlösung von einem synthetischen Peptid von Troponin I mit einer Konzentration von 50 ng/ml in unterschiedlichen Matrizen.
Fig. 5 zeigt einen Vergleich der Stabilität bei 37ºC eines synthetischen Peptides von Troponin I in unterschiedlichen Matrizen.
Fig. 6 zeigt einen Vergleich der Stabilität bei 37ºC eines synthetischen Peptides von Troponin I in unterschiedlichen Matrizen, wobei alle Matrizen einen Protease Inhibitor umfassen.
Fig. 7 zeigt eine Kalibrationskurve von verschiedenen Pegeln eines synthetischen Peptids von Troponin I in einer Matrix der vorliegenden Erfindung.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die stabilisierte, klinische, nicht von Humanserum abgeleitete Kontroll- und/oder Standardlösungs- Labormatrix umfaßt eine wässrige Lösung eines Puffers, ein stabilisierendes Protein, wie z. B. Albumin, Ovalbumin, Casein und dgl., einen Chelatbildner, ein Reduktionsmittel und ein Salz, wobei die wässrige Lösung einen leicht sauren bis leicht alkalischen pH-Wert aufweist.
Die Matrix kann eine blockierende Substanz, wie z. b. Gelatine, Detergentien und Proteaseinhibitoren enthalten. Ein Konservierungsmittel kann hinzugegeben werden, um ein mikrobielles Wachstum zu vermeiden. Ein Analyt oder Analytanalogon, wie z. B. Kardialmarker oder andere instabile oder relativ unlösliche Proteine oder Fragmente davon werden ebenfalls hinzugegeben. Falls die Standard- oder Kontrollösung lyophillisiert oder eingefroren wird, werden Zucker oder andere Füllmittel hinzugegeben.
Die bevorzugten Puffer umfassen Puffer, wie z. B. TRIS-Puffer und und Phosphatpuffer. Andere Puffer umfassen: 3-(N-Morpholin)- propansulfonsäure (MOPS), N-Tris-hydroxymethyl-methyl-2- aminoethansulfonsäure (TES), 3-[N-bis (hydroxyethyl)-amino]-2- hydroxypropansulfonsäure (DIPSO), Piperazin-N, N'-bis 2- hydroxypropansulfonsäure (HEPPSO), Tris-(hydroxymethyl)- aminoethan, N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Aminoethansulfonsäure (HEPES), 3-[N-(Tris-hydroxymethyl)-methylamino]-2-Hydroxypropansulfonsäure (TAPSO) und 2 p-(2-Amino-2-oxoethyl)-aminoethansulfonsäure (ACES). Der am häufigsten bevorzugte Puffer ist ein Phosphat, wie z. B. Natriumphosphat.
Die Konzentration des Puffers kann von etwa 10 mmol bis 200 mmol reichen. Vorzugsweise ist die Konzentration etwa 25 mmol bis 100 mmol. Am bevorzugtesten ist die Konzentration von etwa 50 mmol.
Das stabilisierende Protein kann Albumin, Ovalbumin, Casein oder dgl. sein. Das stabilisierende Protein sollte, wie auch die anderen Inhaltsstoffe, frei von Verunreinigungen sein, welche die Stabilität des Analyten in der Matrix beeinträchtigen. Substanzen, die die Proteinstruktur destabilisieren oder zerstören können, wie z. B. Proteasen, sind Beispiele solcher Verunreinigungen. Albumin ist ein bevorzugtes stabilisierendes Protein. Die Herkunft des Albumins ist nicht kritisch. Das Albumin kann nativer oder rekombinanter Herkunft sein. Die am besten verfügbare Quelle nativen Albumins stammt vom Rind. Bevorzugterweise sollte das Albumin im wesentlichen proteasefrei sein, falls der Proteinanalyt oder das -analogon empfindlich gegen einen Proteaseabbau ist. Alternativ können Proteaseinhibitoren zugegeben werden. Die bevorzugte Konzentration von Albumin liegt zwischen 5 bis 20%, 8 bis 12% und am bevorzugtesten bei etwa 10%.
Obgleich nicht erwünscht ist, sich an eine bestimmte Theorie zu binden, wird angenommen, daß der Proteinstabilisator dazu dient, eine Schutzwirkung für den Analyten oder das Analytanalogon zur Verfügung zu stellen.
Eine blockierende Substanz (d. h. eine Substanz zur Minimierung der nicht spezifischen Bindung des Analyten oder des Analytanalogons an Oberflächen), wie z. B. Gelatine, Casein, Ovalbumin und dgl. kann hinzugegeben werden. Gelatine ist die bevorzugte blockierende Substanz. Die Gelatine wird, falls sie vom Rind stammt, mit einer Konzentration von etwa 0,01% bis 0,15%, am meisten bevorzugt mit 0,1% hinzugegeben. Falls die Gelatine anderer Herkunft ist (z. B. Fisch), wird die Konzentration entsprechend angepaßt.
Ein Chelatbildner wird ebenfalls hinzugegeben. Die bevorzugten Chelatbildner sind Ethylenbis-(oxyethylen nitrilo)-tetra-essigsäure (EGTA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Natriumcitrat, oder Oxalatsalze, wie z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium- oder Lithiumoxalat. Der am meisten bevorzugte Chelatbildner ist EDTA. Die Konzentration von Chelatbildnern kann von 1 mmol bis 15 mmol und vorzugsweise von 5 mmol bis 10 mmol reichen.
Das bevorzugte Reduktionsmittel ist N-Acetylcystein (NAC). Beispiele für andere Reduktionsmittel, die verwendet werden können, umfassen 2-Aminoethantiol, 2-Mercaptoethanol, 2-Mercaptoethylamin und Dithiothreitol.
Die Konzentration des Reduktionsmittels kann von etwa 0 mmol bis 5 mmol reichen, vorzugsweise ist die Konzentration des Reduktionsmittels etwa 2 mmol bis 3,5 mmol und am bevorzugtesten etwa 2,6 mmol.
Der pH-Wert kann im Bereich von etwa 5,0 bis 8,0 liegen. Leicht saure pH-Werte verringern die nicht spezifische Bindung des Troponins. Der bevorzugte pH-Wertbereich liegt bei etwa 5 bis 7,5 und am bevorzugtestens bei etwa 7,0.
Das bevorzugte Salz ist Natriumchlorid. Viele andere Salze können ersatzweise eingesetzt werden. Beispiele anderer Salze umfassen Kaliumsalze, Ammoniumsalze und Lithiumsalze.
Falls ein Proteaseinhibitor hinzugegeben wird, sind Aprotinin und "Protease Inhibitor" (Sigma) wirksam und können in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration verwendet werden. Beispiele für andere Proteaseinhibitoren umfassen (2S,3R)-3-Amino-2- hydroxy-5-methylhexanoyl-Val-Val-Asp (Amastatin-Sigma), [2S,3R]- 3-Amino-2-hydroxy-4-[4-nitrophenyl]-butanoyl-L-Leucin, Antipain, [2S,3R]-3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexanol]-Val-Val-Asp (Epiamastatin-Sigma), ([2R,3R]-3-Amino-2-hydroxy-4- phenylbutanoyl)-L-Leucin (Epibestatin-Sigma), Foroxymithin, Acetyl-Leu-Leu-llrg-al (Leupeptin-Sigma), 4-Amino-3-hydroxy-6- methylheptansäure, 4-Amino-3-hydroxy-methylheptansäure, N-(a- Rhamnopyranosyloxy-hydroxyphospinyl)-Leu-Trp und Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF).
Falls sie zugesetzt werden, sind SDS und Triton X-100, die bevorzugten Detergentien. Andere Detergentien umfassen Tween-20, Brij, Sorbitin, Tergital und Nonidet. Die Konzentration der Detergentien kann zwischen 0,05% und 0,3% liegen. Der bevorzugte Bereich ist von etwa 0,05% bis 0,2%. Die am meisten bevorzugte Konzentration ist 0,1%.
Das Konservierungsmittel kann hinzugegeben werden, um ein mikrobielles Wachstum und ein Pilzwachstum zu vermeiden. Die Konservierungsmittel können Clotrimazol mit wenigstens 0,03%, Chloramphenicol mit wenigstens 0,017% oder Natriumazid mit wenigstens 0,05% sein. Andere Konservierungsmittel umfassen Gentamicin, Mycostatin, Thimerasol und Kathon in einer wirksamen Konzentration.
Um die Matrix herzustellen, sollten Kunststoffe, wie z. B. Polypropylen verwendet werden. Dies minimiert den Verlust von Proteinen an Glas aufgrund der nicht spezifischen Bindung an Glas. Alternativ können Laborgeräte auf Glasbasis verwendet werden; sie sollten jedoch vor dem Gebrauch mit Silikon behandelt werden.
Fall die Standard- oder Kontroll-Lösungsmatrix lyophilisiert oder eingefroren wird, werden Füllmittel hinzugegeben. Die bevorzugten Füllmittel sind Trehalose mit 3% bis 10% und Sucrose mit etwa 100 mmol. Die am meisten bevorzugte Konzentration von Trehalose ist etwa 5% bis 10%. Andere Füllmittel umfassen Glucose, Sucrose, Galactose, Mannose, Maltose, Lactose, Isomaltose, Cellobiose, Mannobiose, Melibiose, Maltotriose, Nystose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose und Maltoheptaose.
Ein Liter der Matrix kann durch Auflösen von
- etwa 30 g Rinderserumalbumin (RSA),
- etwa 1 g Gelatine,
- etwa 15 g Natriumchlorid,
- 3 g EDTA,
- etwa 50 g Trehalose,
- ein Konservierungsmittel, und
- eine klinisch geeignete Menge des Analyten oder Analytanalogons
in 700 ml eines 0,50 millimolaren Phospatpuffers hergestellt werden. Nachdem alle Inhaltsstoffe aufgelöst sind, wird der pH- Wert auf 7,0 eingestellt und anschließend wird ein ausreichendes Volumen eines Puffers, wie z. B. Natriumphosphat hinzugegeben, um das Volumen auf 1,0 l zu ergänzen. Die Lösung wird steril in geeignete Behälter gefüllt und lyophilisiert. Die Matrix, die die lyophilisierten Analyten enthält, wird durch Hinzugabe von einem Liter eines Verdünnungsmittels wieder hergestellt, das 65 g RSA, 25 g NaCl, einen Proteaseinhibitor und etwa 0,4 g NAC enthält.
Alternativ kann ein Liter der Matrix durch auflösen von
- etwa 100 g RSA,
- etwa 1 g Gelatine,
- etwa 40 g Natriumchlorid,
- 3 g E DTA,
- einem Konservierungsmittel,
- 0,4 g NAC, und
- einer klinisch geeigneten Menge des Analyten oder Analytanalogons
in 700 ml eines 0,50 millimolaren Natriumphosphatpuffers hergestellt werden. Nachdem alle Inhaltsstoffe aufgelöst sind, wird der pH-Wert auf 7,0 eingestellt, und anschließend wird ein ausreichendes Volumen eines Puffers, wie z. B. Natriumphosphat hinzugegeben, um das Volumen auf 1,0 l zu ergänzen. Die Flüssigkeit kann aliquotisiert und gekühlt oder eingefroren gelagert werden. Falls die Flüssigkeit eingefroren wird, werden auch Füllmittel hinzugegeben.
Überraschenderweise für den Troponin-I Analyten haben Troponin- I-Fragmente auch eine erhöhte Stabilität. Dies ist überraschend, weil sich herausgestellt hat, daß die Stabilität von Troponin-I- Fragmenten geringer ist, als die des Troponins-I der vollen Länge, wenn die Matrix normales Humanserum ist. Zusätzlich weisen bestimmte Troponin-I-Fragmente eine ähnliche Bindung an die Anti-Troponinantikörper auf, die in der Analyse verwendet wurden, wenn diese mit dem Troponin-I-Molekül der vollen Länge verglichen werden.
Infolgedessen hat die vorliegende Erfindung viele Vorteile gegenüber dem Stand der Technik. Die Matrix ist von nicht-menschlichem Serum abgeleitet, was den Anwender (und das Herstellungspersonal) davor bewahrt, vielen der Krankheiten ausgesetzt zu werden, die durch einen Kontakt mit menschlichem Blutprodukten verbreitet werden. Die Matrix ist auch in der Lage, den Analyten in flüssiger Form für eine ausgedehnte Zeitperiode stabil zu halten. Gegenwärtige Zubereitungen können auch lyophilisiert oder eingefroren werden und können in einem Zeitraum von bis zu mindestens 9 Monaten Regal-Lagerung mit sehr kleinen Variationen hinsichtlich einer Kalibrierung wieder hergestellt oder aufgetaut werden. Nach dem Wiederherstellen oder Auftauen ist der Analyt bei 2ºC bis 8ºC für bis zu drei Wochen stabil. Ein Spiken des Analyten in die Matrix führt zu einer Kalibrationskurve, die nahezu parallel zu einer Humanserumkurve ist. Nicht spezifische Bindungspegel in der "synthetischen" Matrix sind auch nahezu parallel zu den Pegeln, die in normalem Serum beobachtet werden. Darüber hinaus können Fragmente wie z. B. in rekombinanter oder synthetischer Weise hergestellte Peptidfragmente von Troponin anstelle der Proteine voller Länge verwendet werden. In der Tat werden diese Fragmente aufgrund ihrer Stabilität in der Matrix in Kombination mit der Verfügbarkeit und der Reproduzierbarkeit der in rekombinanter oder synthetischer Weise hergestellten Fragmente bevorzugt. Das Analytanalogon (z. B. das Fragment) sollte Bindungscharakteristiken aufweisen, die denen der Vollängen-Marker ähnlich sind. Verfahren zum Bestimmen und Mappen von Epitop Bindungsstellen sind, wie auch die Fertigkeit zum Herstellen von Antikörpern gegen ein spezifisches Antigen, bei Fachleuten bekannt.

Beispiel 1

Herstellung einer Standard-/Kontroll-Lösungs-Matrix

Zu etwa 700 ml gereinigten Wassers wurde folgendes unter Rühren hinzugegeben:
- etwa 3 g EDTA (bis zum Auflösen gerührt), und anschließend
- 40,0 g Natriumchlorid,
- etwa 6,9 g einbasisches Natriumphosphat,
- etwa 0,424 mg NAC,
- etwa 50 g Trehalose,
- etwa 3,3 ml einer Stammlösung von Chloramphenicol, um eine Endkonzentration von 165 mg/ml zur Verfügung zu stellen,
- etwa 0,75 ml einer Stammlösung von Chlortrimazol, um eine Endkonzentration von 3 ppm zur Verfügung zu stellen,
- etwa 10 ml einer 1%-igen wässrigen Lösung von Gelatine, und anschließend unter langsamen Rühren
- etwa 95 g von proteasefreiem Rinderserumalbumin bis dieses gelöst ist, und
- 2 ml einer 25%-igen Lösung von Natriumazid.
Der pH-Wert wurde auf 7,3 eingestellt und das Gesamtvolumen wurde mit gereinigtem Wasser auf 1 l eingestellt. Die Endmatrix kann steril gefiltert werden.

Beispiel 2

Herstellung einer lyophilisierten Standardlösungs-/Kontrollösungs-Matrix

Zu etwa 700 ml gereinigten Wassers wird folgendes hinzugegeben:
- etwa 3 g EDTA,
- etwa 15 g Natriumchlorid,
- etwa 7 g einbasisches Natriumphosphat,
- etwa 50 g Trehalose,
- etwa 3,3 ml einer Stammlösung von Chloramphenicol, um eine Endkonzentration von 65 mg/ml zur Verfügung zu stellen,
- etwa 0,75 ml einer Stammlösung von Chlortrimazol, um eine Endkonzentration von 3 ppm zur Verfügung zu stellen,
- etwa 10 ml einer 1%-igen wässrigen Lösung von Gelatine, und
- etwa 30 g Rinderserumalbumin.
Der pH-Wert wird auf 5,5 eingestellt und das Gesamtvolumen wird mit gereinigtem Wasser auf 1 l eingestellt. Die Endmatrix wird steril gefiltert und lyophilisiert. 1 l eines Wiederherstellungs-Verdünnungsmittels wird hergestellt, indem in einer wäßrigen Lösung folgendes vereinigt wird:
- etwa 65 g Albumin,
- 25 g Natriumchlorid und
- 0,4 g NAC,
- 1 Proteaseinhibitor und
- etwa 2 ml einer 25%-igen Lösung von Natriumazid.

Beispiel 3

Herstellung einer Standardlösungs-/Kontrollösungs-Matrix

Zu etwa 700 ml gereinigten Wassers wird folgendes hinzugegeben:
- etwa 5 g EDTA,
- etwa 50 g Natriumchlorid,
- etwa 7 g einbasisches Natriumphosphat,
- etwa 0,4 mg NAC,
- etwa 3,3 ml einer Stammlösung von Chloramphenicol, um eine Endkonzentration von 165 mg/ml zur Verfügung zu stellen,
- etwa 0,75 ml einer Stammlösung von Chlortrimazol, um eine Endkonzentration von 3 ppm zur Verfügung zustellen,
- etwa 10 ml einer 1%-igen wässrigen Lösung von Gelatine, und
- etwa 95 g proteasefreies Rinderserumablumin.
Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt, und das Gesamtvolumen wird mit gereinigtem Wasser auf 1 l eingestellt. Die Endmatrix kann steril gefiltert werden.

Beispiel 4

Herstellung von Standardlösungen unter Verwendung eines rekombinanten Proteins

Eine Stammlösung von menschlichem rekombinanten Troponin I wurde in Laborgeräten aus Polypropylen durch Zugabe einer ausreichenden Menge von rekombinantem Troponin I hergestellt, so daß Standardlösungen oder Kontrollösungen hergestellt werden können, die Konzentrationen im Bereich von etwa 0 ng/ml bis 100 ng/ml von Troponin I aufweisen.
In einem Experiment wurden Lösungen von Troponin I durch Zugabe einer ausreichenden Menge einer ungereinigten Lösung von rekombinantem Troponin I mit 100 ug/ml für die folgenden Matrizen hergestellt:
Normales Humanserum, Plasma und eine Matrix, die ähnlich der in Beispiel 1 beschriebenen ist. Für jede Matrix war die Endkonzentration 15 ml von einer 100 ng/ml-Lösung von rekombinatem Troponin I. Das rekombinante Troponin I hatte die folgende Sequenz: MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAKQELERE AEERRGEKGRALSTRCQPLELTGLGFAELQDLCRQLHARVDKVDEERYDIEAKVTKNITEIADL TQKIFDLRGKFKRPTLRRVRISADAMMQALLGARAKESLDLRAHLKQVKKEDTEKENREVGDWR KNIDALSGMEGRKKKKFEES (SEQ ID Nr. 1) und umfaßt einen 6 His- Carboxy-Endschwanz und eine Sequenz aus 7 Aminosäuren von der Leitsequenz des zehnten Gens des Phagen T7 am Aminoende. Siehe auch Vallins W. J. u. a., Molecular cloning of human cardiac troponin I using polymerase drain reaction, FEBS LETTERS: Band 270, Nr. 1, 2. September 1990.
Aliquote einer jeden der drei Troponin I-Lösungen wurden bei 2ºC bis 8ºC gelagert und auf Stabilität untersucht. An jedem Tag der Untersuchung wurde ein Aliquot jeder Troponin I-Lösung an einem Stratus II Fluorometric Analyzer analysiert. Der Stratus II Fluorometric Analyzer wird von Dade International Inc. verkauft. Für Grundsätze des Betriebs des Analysators und eines Immunoassays siehe z. B. das U. S. Patent Nr. 4 517 288, auf das hier durch Bezugnahme verwiesen wird und Giegle u. a. Clinical Chemistry 28 : 1894-1898 (1982). Der Analysator mißt die Änderungsgeschwindigkeit von einem Fluoreszenz Signal. Im allgemeinen ist ein Antikörper für einen Analyten, wie z. B. Troponin I, an einer festen Phase eines Glasfaserfilterpapiers vorimmobilisiert. Für Troponin I wird ein Aliquot einer jeden Troponin I-Lösung auf den Antikörper aufgebracht und bindet immunologisch an den Antikörper, um eine Reaktionszone zu bilden. Als nächstes wird ein Konjugat eines alkalischen Phosphatase-Anti-Troponin- I-Antikörpers zu der Reaktionszone hinzugegeben. Das Konjugat bindet an das Troponin I. Eine Substratwaschlösung, die 4-Methylumbelliferylphosphat enthält, wird auf die Reaktionszone aufgebracht. Ein Frontflächenfluorometer mißt die Änderungsgeschwindigkeit der Fluoreszenz in Geschwindigkeitseinheiten, die als Millivolt pro Minute (mV/min) ausgedrückt werden.
Die Ergebnisse der Untersuchung können in Fig. 1 gesehen werden. Wie in Fig. 1 gesehen werden kann, liefert die Matrix der vorliegenden Erfindung dem Troponin-I Analyten mehr Stabilität, als normales Humanserum oder Plasma.

Beispiel 5

Herstellung von Standardlösungen unter Verwendung eines in rekombinanter Weise hergestellten Peptids

Eine Stammlösung eines menschlichen rekombinanten Troponin I-Peptids wird in Laborgeräten aus Polypropylen durch Zugabe einer ausreichenden Menge eines rekombinanten Troponin I-Peptids hergestellt, so daß Standardlösungen oder Kontrollösungen hergestellt werden können, die Konzentrationen im Bereich von etwa 0 ng/ml bis 100 ng/ml Troponin I aufweisen.
In einem Experiment wurden Lösungen von Troponin I durch Zugabe einer ausreichenden Menge eines rekombinanten Peptids von rekombinantem Troponin I aus 80 Aminosäuren mit der Sequenz ADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAKQELEREA EERRGEKGRALSTRCQ (SEQ ID Nr. 2) mit einer Konzentration von 7500 ng/ml, wobei das Peptid auch einen 6-Histidin-Schwanz am Carboxyende und 7 Aminosäuren aus der Leitsequenz des Gens 10 des Phagen T7 am Aminoende aufweist (siehe auch Vallins W. J. u. a., Molecular cloning of human cardiac troponin I using polymerase chain reaction, FEBS LETTERS: Band 270, Nr. l, z. September 1990), zu den im nachfolgenden genannten Matrizen hergestellt:
Normales Humanserum, verarbeitetes Humanplasma, Plasma und eine Matrix, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, um eine 100 ng/ml-Lösung von rekombinantem Troponin I-Peptid in jeder Matrix zur Verfügung zu stellen.
Aliquote einer jeden der 4 Troponin I-Lösungen wurden bei 2ºC bis 8ºC gelagert und auf Stabilität untersucht. An jedem Tag der Untersuchung wurde ein Aliquot einer jeder Troponin I-Lösung an einem Stratus II Fluorometric Analyzer analysiert. Der Stratus II Fluorometric Analyzer wird von Dade International Inc. verkauft. Für Grundsätze des Betriebs des Analysators und eines Immunoassays siehe z. B. das U. S. Patent Nr. 4,517,288, auf das hier Bezug genommen wird und Giegle u. a. Clinical Chemistry 28: 1894-1898 (1982). Der Analysator mißt die Änderungsgeschwindigkeit eines Fluoreszenzsignals. Im allgemeinen wird ein Antikörper für einen Analyten, wie z. B. Troponin I; an einer festen Phase eines Glasfaserfilterpapiers vorimmobilisiert. Für Troponin I wird ein Aliquot einer jeden Troponin I-Lösung auf den Antikörper aufgebracht und bindet immunologisch an den Antikörper, um eine Reaktionszone zu bilden. Als nächstes wird ein Konjugat eines alkalischen Phosphatase-Anti-Troponin I-Antikörpers zu der Reaktionszone hinzugegeben. Das Konjugat bindet an das Troponin I. Eine Substratwaschlösung, die 4 Methyl Umbelliferylphosphat enthält wird auf die Reaktionszone aufgebracht. Ein Frontflächenfluorometer misst die Änderungsgeschwindigkeit der Fluoreszenz in Geschwindigkeitseinheiten, die als Millivolt pro Minute (mV/min) ausgedrückt werden.
Die Ergebnisse der Untersuchung können aus Fig. 2 entnommen werden. Wie aus Fig. 2 gesehen werden kann, liefert die Matrix der vorliegenden Erfindung dem Troponin-I Analyten mehr Stabilität als normales Humanserum, verarbeitetes Humanplasma (VHP) oder Plasma.

Beispiel 6

Herstellung von Standardlösungen unter Verwendung eines synthetischen Peptids

Eine Stammlösung eines synthetischen Peptids von Troponin I wird in Laborgeräten aus Polypropylen unter Zugabe einer ausreichenden Menge des Peptids hergestellt, so daß Standardlösungen oder Kontrollösungen hergestellt werden können, die Konzentrationen im Bereich von etwa 0 ng/ml bis 50 ng/ml Troponin I aufweisen.
In einem Experiment wurden Lösungen von Troponin I durch Zugabe einer ausreichenden Menge eines synthetischen Peptids von Troponin I mit der Sequenz RAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAKQEL (SEQ ID Nr.: 3) mit einer Stammkonzentration (in gereinigtem Wasser) von 1,4 mg/ml zu den folgenden Matrizen hergestellt:
Normales Humanserum, Plasma, verarbeitetes Humanplasma, eine synthetische Matrix mit einem pH-Wert von 7,6, die folgendes enthält: 100 mmol Tris, 150 mmol NaCl, 0,1% Gelatine, 2% RSA, 0,1% Natriumazid und 0,1% Zonyl-Fluor-Tensid (DXMC) und eine Matrix, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, um eine 50 ng/ml-Lösung von Troponin I in jeder Matrix und eine 10 ng/ml-Lösung von Troponin I zur Verfügung zu stellen.
Aliquote einer jeden der vier Troponin I-Lösungen wurden bei 2ºC bis 8ºC gelagert und auf Stabilität untersucht. An jedem Tag der Untersuchung wurde ein Aliquot einer jeden Troponin I-Lösung an einem Stratus II Fluorometric Analyzer analysiert. Der Stratus II Fluorometric Analyzer wird von Dade International Inc. verkauft. Für Grundsätze des Betriebs des Analysators und eines Immunoassays siehe zum Beispiel das US Patent Nr. 4,517,288, auf das hiermit Bezug genommen wird und Giegle u. a. Clinical Chemistry 28 : 1894-1898 (1982). Der Analysator mißt die Änderungsgeschwindigkeit eines Fluoreszenzsignals. Im allgemeinen wird ein Antikörper für einen Analyten wie zum Beispiel Troponin I an einer festen Phase eines Glasfaserfilterpapiers vorimmobilisiert. Für Troponin I wird ein Aliquot einer jeden Troponin I-Lösung auf den Antikörper aufgebracht und bindet immunologisch an den Antikörper, um eine Reaktionszone zu bilden. Als nächstes wird ein Konjugat eines alkalischen Phosphatase-Anti-Troponin I-Antikörpers zu der Reaktionszone gegeben. Das Konjugat bindet an das Troponin I. Eine Substratwaschlösung, die 4 Methylumbelliferylphosphat enthält, wird auf die Reaktionszone aufgebracht. Ein Frontflächenfluorometer mißt die Änderungsgeschwindigkeit der Fluoreszenz.
Die Ergebnisse der Untersuchung können in Fig. 3 und 4 gesehen werden. Wie in den Fig. 3 und 4 gesehen werden kann, liefert die Matrix der vorliegenden Erfindung dem Troponin-I Analytanalogon mehr Stabilität als normales Humanserum, verarbeitetes Humanplasma (VHP), die synthetische Base DXMC oder Plasma.

Beispiel 7

Herstellung von Standardlösungen unter Verwendung eines synthetischen Peptids

Eine Stammlösung eines synthetischen Peptids von Troponin I wird in Laborgeräten aus Polypropylen durch Zugabe einer ausreichenden Menge des Peptids hergestellt, so daß Standardlösungen oder Kontrollösungen hergestellt werden können, die Konzentrationen im Bereich von 0 ng/ml bis 100 ng/ml von Troponin I aufweisen.
In einem Experiment wurden Lösungen mit einer Konzentration von 40 ug/ml Troponin I durch Zugabe einer ausreichenden Menge des synthetischen Peptids von Troponin I mit der Sequenz RAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAKQEL (SEQ ID Nr.: 4) zu den folgenden Matrizen hergestellt:
Normales Humanserum, Plasma und eine Matrix, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist (außer, daß der pH-Wert der synthetischen Matrix auf 5, 5 eingestellt war), um 3,0 ml einer 100 ng/ml-Lösung von Troponin I in jeder Matrix zur Verfügung zu stellen. Zusätzlich wurde EDTA mit etwa 3,5 mg/ml zu jeder Matrix hinzugegeben.
Ein zweiter Satz von Lösungen wurde wie oben hergestellt, außer, daß die Lösungen auch einen Proteaseinhibitorcocktail von PEPSTATIN mit 680 ng/ml und Aminoethylbenzolsulphonylfluorid mit 208 mg/ml enthielten.
Aliquote einer jeden der sechs Troponin I-Lösungen wurden bei 37ºC gelagert und auf Stabilität untersucht. An jedem Tag der Untersuchung wurde ein Aliquot einer jeden Troponin I Lösung an einem Stratus II Fluorometric Analyzer analysiert. Der Stratus II Fluorometric Analyzer wird von Dade International Inc. ver kauft. Für Grundsätze des Betriebs des Analysators und eines Immunoassays siehe zum Beispiel das U. S. Patent Nr. 4,517,288, auf das hiermit Bezug genommen wird und Giegle u. a. Clinical Chemistry 28: 1894-1898 (1982). Der Analysator mißt die Änderungsgeschwindigkeit eines Fluoreszenzsignals. Im allgemeinen wird ein Antikörper für einen Analyten, wie zum Beispiel Troponin I, an einer festen Phase eines Glasfaserfilterpapiers vorimmobilisiert. Für Troponin I wird ein Aliquot einer jeden Troponin I-Lösung auf den Antikörper aufgebracht und bindet immunologisch an den Antikörper, um eine Reaktionszone zu bilden. Als nächstes wird ein Konjugat eines alkalischen Phosphatase-Anti-Troponin-I-Antikörpers zu der Reaktionszone gegeben. Das Konjugat bindet an das Troponin I. Eine Substratwaschlösung, die 4-Methylumbelliferylphosphat enthält, wird auf die Reaktionszone aufgebracht. Ein Frontflächenfluorometer mißt die Änderungsgeschwindigkeit der Fluoreszenz in Geschwindigkeitseinheiten, die als Millivolt pro Minute (mV/min)bezeichnet werden.
Die Ergebnisse der Untersuchung können entsprechend in den Fig. 5 und 6 gesehen werden. Wie in den Fig. 5 und 6 gesehen werden kann, verleiht die Matrix der vorliegenden Erfindung dem Troponin-I Analytanalogon mehr Stabilität als normales Humanserum oder Plasma mit oder ohne den Proteaseinhibitoren.

Beispiel 8

Durchführen eines Immunoassays unter Verwendung von Troponin I Standardlösungen und Kontrollösungen

Eine Stammlösung eines synthetischen Peptids von Troponin I wird in Laborgeräten aus Polypropylen durch Zugabe einer ausreichenden Menge des Peptids hergestellt, so daß Standardlösungen oder Kontrollösungen hergestellt werden können, die Konzentrationen im Bereich von 0 ng/ml bis 5.0 ng/ml von Troponin I aufweisen. In einem Experiment wurden Lösungen von Troponin I durch Zugabe einer ausreichenden Menge eines synthetischen Peptids von Troponin I mit der Sequenz RAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAKQEL (SEQ ID Nr.: 5) mit einer Stammkonzentration von 1,4 mg/ml zu einer Matrix hergestellt, die ähnlich der in Beispiel 1 beschriebenen ist, um Standardlösungen von Troponin I mit den folgenden Konzentrationen zur Verfügung zu stellen: 0 ng/ml, 2 ng/ml, 8 ng/ml, 15 ng/ml, 25 ng/ml und 50 ng/ml. Kontrollösungen wurden in einer ähnlichen Weise hergestellt, um Kontrollösungen mit etwa 4 ng/ml, 20 ng/ml und 35 ng/ml herzustellen.
Aliquote einer jeden der Troponin I-Lösungen wurden eingefroren gelagert. Gefrorene Lösungen wurden aufgetaut und eine Kalibrationskurve wurde erstellt. Die Kontrollösungen, die so wie oben besprochen hergestellt wurden, und Kontroll-Lösungen, die aus normalem Humanserum hergestellt wurden, wurden ebenfalls untersucht. Der Bereich für die Kontrollproben mit normalem Humanserum war 2,1 ng/ml bis 2,9 ng/ml für die niedere Kontrollösung und 15,9 ng/ml bis 21,5 ng/ml für die hohe Kontrollösung. Doppelte Proben einer jeden Troponin I-Lösung wurden an einem Stratus II Fluorometric Analyzer analysiert und eine Kalibrationskurve wurde erstellt. Der Stratus II Fluorometric Analyzer wird von Dade International Inc. verkauft. Für Grundsätze des Betriebs des Analysators und eines Immunoassays siehe zum Beispiel das U. S. Patent Nr. 4,517,288, auf das hiermit Bezug genommen wird und Giegle u. a. Clinical Chemistry 28: 1894-1898 (1982). Der Analysator mißt die Änderungsgeschwindigkeit eines Fluoreszenzsignals. Ein Antikörper für einen Analyten, wie zum Beispiel Troponin I wird an einer festen Phase eines Glasfaserfilterpapiers vorimmobilisiert. Ein Aliquot einer jeden Troponin I-Lösung wird auf den Antikörper aufgebracht und bindet immunologisch an den Antikörper, um eine Reaktionszone zu bilden. Als nächstes wird ein Konjugat eines alkalischen Phosphatase-Anti-Troponin I-Antikörpers zu der Reaktionszone gegeben. Das Konjugat bindet an das Troponin I. Eine Substratwaschlösung, die 4-Methylumbelli-ferylphosphat enthält, wird auf die Reaktionszone aufgebracht. Ein Frontflächenfluorometer mißt die Änderungsgeschwindigkeit der Fluoreszenz in Geschwindigkeitseinheiten, die als Millivolt pro Minute (mV/min) ausgedrückt werden.
Die Ergebnisse der Kalibrierung in Millivolt pro Minute (mV/min) können in Tabelle 1 abgelesen werden und die Kalibrationskurve wird graphisch in Fig. 6 gezeigt. Tabelle 1
Kontrollwiederfindungsraten sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

Beispiel 9

Herstellen von CK-MB Standardlösungen

Eine Stammlösung von CK-MB wird durch Zugabe einer ausreichenden Menge von CK-MB hergestellt, so daß Standardlösungen oder Kontrollösungen hergestellt werden können, die Konzentrationen im Bereich von etwa 0 ng/ml bis 125 ng/ml von CK-MB aufweisen.
Lösungen von CK-MB werden durch Zugabe einer ausreichenden Menge von CK-MB zu einer Matrix, die ähnlich der in Beispiel 1 beschriebenen ist, hergestellt, um Standardlösungen von CK-MB mit den folgenden Konzentrationen zur Verfügung zu stellen: 0 ng/ml, 4 ng/ml, 10 ng/ml, 25 ng/ml, 60 ng/ml und 125 ng/ml. Kontrollösungen werden in ähnlicher Weise hergestellt.

Beispiel 10

Herstellen von Troponin T Standard-/Kontroll-Lösungen

Eine Stammlösung von Troponin T wird durch Zugabe einer ausreichenden Menge des Troponin T hergestellt, so daß Standardlösungen oder Kontrollösungen hergestellt werden können, die Konzentrationen im Bereich von etwa 0 ng/ml bis 12 ng/ml von Troponin T aufweisen.
Lösungen von Troponin T werden durch Zugabe einer ausreichenden Menge von Troponin T zu einer Matrix, die ähnlich der in Beispiel 1 beschriebenen ist hergestellt, um Standardlösungen von Troponin T mit den folgenden Konzentrationen herzustellen 0 ng/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 4 ng/ml, 8 ng/ml und 12 ng/ml. Kontrollösungen werden in ähnlicher Weise hergestellt.

Beispiel 11

Stabilität von Standardlösungen bei 4ºC

Es wurde eine Studie durchgeführt, um die Stabilität von Standardlösungen zu bestimmen, die in ähnlicher Weise hergestellt wurden, wie die Standardlösungen in Beispiel 6. Es wurden Immunoassay-Kits, die Standardlösungen umfassen, hergestellt und bei etwa 4ºC gelagert und an einem Stratus II Fluorometric Analyzer untersucht. An jedem Tag der Untersuchung wurden Kalibrationskurven unter Verwendung ungeöffneter Glasfläschchen von Standardlösungen und Kontrollösungen und eines Patientenpools erzeugt, um festzustellen, ob die Kontrollösungen und der Patientenpool (beide bei -70ºC gelagert und vor dem Gebrauch frisch aufgetaut) innerhalb der erwarteten Bereiche wiedergefunden werden. Die Bereiche der Kontrollösungen und des Patientenpools waren zuvor festgestellt worden, indem wenigstens 80 Wiederholungen eines jeden Kontrollösungspegels und Patientenpools erzeugt wurden. Die Kontrollgrenzen wurden auf ±2 Standardabweichungen oder 15% des Mittelwerts geschätzt, je nachdem was größer war. Es wurde festgestellt, daß alle Analysekomponenten und folglich die Standardlösungen annehmbar sind, wenn die Duplikate einer jeden Kontrollösung und des Patientenpools innerhalb von 12% liegen und wenn der Mittelwert der Duplikate in den berechneten Bereich fällt. Es hat sich herausgestellt, daß das Analyse-Kit, und folglich die Standardlösungen, für wenigstens 60 Tage annehmbar sind. Eine zweite in ähnlicher Weise durchgeführte Studie bestätigte die Ergebnisse.

Beispiel 12

Stabilität von Standardlösungen bei 25ºC

Es wurden zwei Studien in ähnlicher Weise zu der in Beispiel 11 beschreibenen durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Kit- Reagenzien bei 25ºC anstatt bei 4ºC gelagert wurden. Es stellte sich heraus, daß die Kits und folglich die Standardlösungen für mindestens etwa 7 Tage bis 14 Tage stabil sind.

Beispiel 13

Stabilität von Standardlösungen bei 2ºC bis 8ºC/-70ºC

Es wurde eine Studie in ähnlicher Weise zu der in Beispiel 11 beschriebenen durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Standardlösungen mit 2 ng/ml und 25 ng/ml auch bei -70ºC gelagert wurden. Die Wiederfindung der gefrorenen Standardlösungen wurde bestimmt und mit Standardlösungen, die bei 4ºC gelagert worden waren, verglichen. Ein Verhältnis der (2ºC bis 8ºC)/-70ºC wurde bestimmt. Es hat sich herausgestellt, daß die Standardlösungen bei -70ºC für wenigstens 60 Tage stabil sind. Eine zweite in ähnlicher Weise durchgeführte Studie bestätigte die Ergebnisse.
In einer anderen Studie wurde die Wiederfindung eines Patientenpools (gelagert und verwendet wie oben in Beispiel 11 beschrieben, mit einem festgestellten Wiederfindungsbereich, wie er ebenfalls oben in Beispiel 11 beschrieben ist) gegenüber einer Kalibrationskurve bestimmt, die von Standardlösungen, die bei - 70ºC gelagert worden waren, erzeugt wurde. Es hat sich herausgestellt, daß die Standardlösungen für wenigstens 100 Tage stabil sind.

Sequenzlisten

(1) Allgemeine Information:

(i) Anmelder: Flaa, Cathy Sabudeco, Alberto Chin, Bruce Bauer, Roger
(ii) Titel der Erfindung: Zusammensetzung zum Stabilisieren von Proteinen und Proteinfragmenten
(iii) Anzahl der Sequenzen: 7
(iv) Korrespondenzadresse: (A) Adressat: Dade International Inc.
(B) Straße: 1717 Deerfield Road
(C) Stadt: Deerfield
(D) Staat: Illinois
(E) Land: USA
(F) PLZ: 60015
(v) Computerlesbare Form: (A) Medium: Diskette
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: Microsoft Word 2.0
(vi) Gegenwärtige Anmeldedaten: (A) Anmeldenummer: US 08/400, 158
(B) Einreichungsdatum: 07. März 1995
(C) Klassifizierung:
(vii) Frühere Anmeldedaten: (A) Anmeldenummer:
(B) Einreichungsdatum:
(viii) Anwalt/Vertreter: (A) Name: Tymeson, Cynthia G.
(B) Registrierungsnummer: 34,745
(C) Reference/Docket Nr.: DA-9000
(ix) Telekommunikationsinformation: (A) Telefon: (305) 222-6423
(B) Telefax: (305) 222-6686
(C) Telex:

(2) Information für SEQ ID Nr. 1:

(i) Sequenzcharakteristiken: (A) Länge: 210
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strängigkeit: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: (A) Beschreibung
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Gegensinnig: Nein
(v) Fragmenttyp:
(vi) Originalquelle: (A) Organismus:
(B) Stamm:
(C) Einzelisolat:
(vii) Unmittelbare Quelle: (A) Bibliothek:
(B) Klon:
(viii) Position im Genom: (A) Chromosom/Segment
(ix) Eigenschaft: (A) Name/Schlüssel:
(x) Veröffentlichungsinformation:
(A) Autoren: Vallins W. J. et al.
(B) Titel: Molecular Cloning of Human Cardiac Troponin I Using Polymerase Chain Reaction
(C) Zeitschrift: FEBS Letters
(D) Band: 270
(E) Ausgabe: 1,2
(F) Seiten: 57-61
(G) Datum: September 1990
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 1:

(2) Information für SEQ ID Nr. 2:

(i) Sequenzcharakteristiken: (A) Länge: 80
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strängigkeit: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: (A) Beschreibung:
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Gegensinnig: Nein
(v) Fragmenttyp:
(vi) Originalquelle: (A) Organismus:
(B) Stamm:
(C) Einzelisolat:
(vii) Unmittelbare Quelle: (A) Bibliothek:
(B) Klon:
(viii) Position im Genom: (A) Chromosom/Segment
(ix) Eigenschaft: (A) Name/Schlüssel:
(x) Veröffentlichungsinformation:
(A) Autoren: Vallins W. J. et al.
(B) Titel: Molecular Cloning of Human Cardiac Troponin I Using Polymerase Chain Reaction
(C) Zeitschrift: FEBS Letters
(D) Band: 270
(E) Ausgabe: 1,2
(F) Seiten: 57-61
(G) Datum: September 1990
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 2:

(2) Information für SEQ ID Nr. 3:

(i) Sequenzcharakteristiken: (A) Länge: 35
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strängigkeit: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: (A) Beschreibung
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Gegensinnig: Nein
(v) Fragmenttyp:
(vi) Originalquelle: (A) Organismus:
(B) Stamm:
(C) Einzelisolat:
(vii) Unmittelbare Quelle: (A) Bibliothek:
(B) Klon:
(viii) Position im Genom: (A) Chromosom/Segment
(ix) Eigenschaft: (A) Name/Schlüssel:
(x) Veröffentlichungsinformation:
(A) Autoren: Titel:
(B) Zeitschrift:
(C) Band:
(D) Ausgabe:
(E) Seiten:
(F) Datum:
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 3:

(2) Information für SEQ ID Nr. 4:

(i) Sequenzcharakteristiken: (A) Länge: 35
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strängigkeit: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: (A) Beschreibung
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Gegensinnig: Nein
(v) Fragmenttyp:
(vi) Originalquelle: (A) Organismus:
(B) Stamm:
(C) Einzelisolat:
(vii) Unmittelbare Quelle: (A) Bibliothek:
(B) Klon:
(viii) Position im Genom: (A) Chromosom/Segment
(ix) Eigenschaft: (A) Name/Schlüssel:
(x) Veröffentlichungsinformation:
(A) Autoren:
(B) Titel:
(C) Zeitschrift:
(D) Band:
(E) Ausgabe:
(F) Seiten:
(G) Datum:
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 4:

(2) Information für SEQ ID Nr. 5:

(i) Sequenzcharakteristiken: (A) Länge: 35
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strängigkeit: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: (A) Beschreibung
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Gegensinnig: Nein
(v) Fragmenttyp:
(vi) Originalquelle: (A) Organismus:
(B) Stamm:
(C) Einzelisolat:
(vii) Unmittelbare Quelle: (A) Bibliothek:
(B) Klon:
(viii) Position im Genom: (A) Chromosom/Segment
(ix) Eigenschaft: (A) Name/Schlüssel:
(x) Veröffentlichungsinformation:
(A) Autoren:
(8) Titel:
(C) Zeitschrift:
(D) Band:
(E) Ausgabe:
(F) Seiten:
(G) Datum:
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 5:

(2) Information für SEQ ID Nr. 6

(1) Sequenzcharakteristiken: (A) Länge: 35
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strängigkeit: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: (A) Beschreibung
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Gegensinnig: Nein
(v) Fragmenttyp:
(vi) Originalquelle: (A) Organismus:
(B) Stamm:
(C) Einzelisolat:
(vii) Unmittelbare Quelle: (A) Bibliothek:
(B) Klon:
(viii) Position im Genom: (A) Chromosom/Segment
(ix) Eigenschaft: (A) Name/Schlüssel:
(x) Veröffentlichungsinformation:
(A) Autoren:
(B) Titel:
(C) Zeitschrift:
(D) Band:
(E) Ausgabe:
(F) Seiten:
(G) Datum:
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 6:

(2) Information für SEQ ID Nr. 7

(1) Sequenzcharakteristiken: (A) Länge: 80
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strängigkeit: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: (A) Beschreibung
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Gegensinnig: Nein
(v) Fragmenttyp:
(viii) Originalquelle: (A) Organismus:
(B) Stamm:
(C) Einzelisolat:
(ix) Unmittelbare Quelle: (A) Bibliothek:
(B) Klon:
(viii) Position im Genom: (A) Chromosom/Segment
(ix) Eigenschaft: (A) Name/Schlüssel:
(x) Veröffentlichungsinformation:
(A) Autoren:
(B) Titel:
(C) Zeitschrift:
(D) Band:
(E) Ausgabe:
(F) Seiten:
(G) Datum:
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 7:

Claims

1. Diagnostische Standardlösung, die im wesentlichen aus einer aus einem nicht-menschlichen Serum abgeleiteten Matrix besteht, die zum Stabilisieren von Troponin oder einem Fragment davon verwendbar ist, die folgendes aufweist:

- einen Puffer,

- ein Reduktionsmittel,

- ein stabilisierendes Protein,

- einen Chelatbildner und

- ein Salz,

wobei die Matrix eine Antwort liefert, die die Antwort unter Verwendung von menschlichem Serum nachahmt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1 zum Stabilisieren von Troponin I oder einem Fragment davon.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Analayt RAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAKQEL (SEQ ID NR. 6) ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Analyt ADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRK LQLKTLLLQIAKQELEREAEERRGEKGRALSTRCQ (SEQ ID NR. 7) ist.

5. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei

- das Reduktionsmittel aus N-Acetylcystein, 2-Aminoethanthiol, 2-Mercaptoethanol, 2-Mercaptoethylamin und Dithiothreitol ausgewählt ist;

- das stabilisierende Protein aus Albumin, Ovalbumin und Casein ausgewählt ist; und

- der Chelatbildner aus Ethylenbis-(oxyethylen-nitrilo)- Tetraessigsäure (EGTA), Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA), Citraten oder Oxalaten ausgewählt ist.

6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die weiterhin eine blockierende Substanz enthält.

7. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein Füllmittel enthält.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung gefriergetrocknet ist.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zusammensetzung gefroren ist.

10. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Proteinstabilisator Albumin ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Albumin proteasefrei ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die blockierende Substanz Gelatine ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Füllmittel aus Trehalose, Glucose, Sucrose, Galactose, Mannose, Maltose, Lactose, Isomaltose, Cellobiose, Mannobiose, Melibiose, Maltotriose, Nystose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose und Maltoheptaose ausgewählt ist.

14. Verwendung bei der Herstellung einer diagnostischen Standardlösungs-Matrix aus einem Puffer, einem Reduktionsmittel, einem stabilisierenden Protein, einem Chelatbildner und aus einem Salz, die frei von menschlichen Serum ist, zum Zweck des Stabilisierens von Troponin oder einem Fragment davon.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zusammengesetzt ist.