DE69533623T2

DE69533623T2 - Verfahren zur unterstützung der diagnose der alzheimerschen krankheit durch messung der amyloid-beta-peptide(x groesser als oder gleich 41) und tau

Info

Publication number: DE69533623T2
Application number: DE69533623T
Authority: DE
Inventors: A. Peter SEUBERT; Carmen Vigo-Pelfrey; B. Dale SCHENK; Robin Barbour
Original assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1994-11-14
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2015-11-14
Also published as: EP0792458B1; WO1996015452A1; US7700309B2; US7811769B2; JPH10509797A; ATE278957T1; EP0792458A4; JP2004077499A; JP3634375B2; CA2205359C; CA2205359A1; ES2230551T3; EP0792458A1; PT792458E; US20040265920A1; EP1491889A3; US20040253643A1; AU705907B2; DK0792458T3; DE69533623D1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Diagnose und Überwachung der Alzheimer-Erkrankung. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung das Messen der Menge des Tau-Proteins und/oder der Menge von β-amyloidem Peptid (x– ≥ 41) in Flüssigkeitsproben von Patienten, sowie die Verwendung dieser Mengen als diagnostischen Indikator.
Die Alzheimer-Erkrankung (Alzheimer's disease, AD) ist in eine degenerative Hirnerkrankung charakterisiert klinisch durch den fortschreitenden Verlust des Gedächtnisses, des Erkennungsvermögens, des logischen Denkens, des Urteilsvermögens sowie der emotionalen Stabilität, was allmählich zu schweren geistigen Schäden und letztendlich zum Tod führt. AD ist eine sehr häufige Ursache für voranschreitende geistige Fehlfunktion (Demenz) in Menschen vorangeschrittenen Alters und man glaubt, dass sie die am vierthäufigste allgemeine medizinische Ursache für Tod in den Vereinigten Staaten darstellt. AD wurde in allen Rassen und ethnischen Gruppen weltweit beobachtet und stellt eines der bedeuteten derzeitigen wie zukünftigen öffentlichen Gesundheitsproblemen dar. Diese Erkrankung – so schätzt man – betrifft derzeit etwa zwei bis drei Millionen Individuen in den Vereinigten Staaten. AD ist derzeit unheilbar. Man kennt derzeit keine Behandlung, welche effektiv AD verhindert oder ihre Symptome zurückdrängt.
Die Gehirne der Individuen mit AD zeigen charakteristische Läsionen, die man senile Plaques nennt und neurofibrilläre Tangles. Eine Vielzahl dieser Läsionen finden sich im Allgemeinen in mehreren Regionen des menschlichen Hirns, wichtig für das Gedächtnis und die Erkennungsfunktion, für Patienten mit AD. Eine kleinere Anzahl dieser Läsionen findet sich in einer begrenzten anatomischen Verteilung oftmals in den Gehirnen von im Alter vorangeschrittenen Personen, die keine klinischen AD-Anzeichen aufweisen. Senile Plaques und amyloide Angiopathie charakterisieren auch die Gehirne von Individu en überhalb eines gewissen Alters mit Trisomie 21 (Down-Syndrom) und heriditärer cerebraler Hämorrhagie mit Amyloidose des Dutch-Typs (HCHWA-D, Hereditary Cerebral Hemorrhage with Amyloidosis of the Dutch-Type). Derzeit verlangt eine definitive Diagnose von Alzheimer üblicherweise die Beobachtung der oben genannten Läsionen im Gehirngewebe der Patienten, die mit der Erkrankung gestorben sind oder – in selteneren Fällen – in kleinen Biopsie-Proben von Gehirngewebe genommen während einer eingreifenden neurochirurgischen Prozedur. Das prinzipielle chemische Bestandteil der senilen Plaques und der vaskulären amyloiden Ablagerungen (amyloide Angiopathie), die charakteristisch für AD und die anderen oben genannten Erkrankungen sind, ist ein etwa 4,2 Kilodalton (kD) großes Protein von etwa 39–43 Aminosäuren, genannt, das Amyloid-β-Peptid (Aβ) oder manchmal βAP, AβP oder β/A4. Die erste Aufreinigung Aβ sowie der erste Bericht einer partiellen Aminosäuresequenz stammt von Glenner und Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 885–890. Die Isolationsprozedur und die Sequenzdaten für die ersten 28 Aminosäuren werden in US-Patent Nr. 4,666,829 beschrieben. Formen von Aβ mit Aminosäuren von weniger als 40 wurden zuerst berichtet von Kang et al. (1987) Nature 325: 733–736.
Roher et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10836–840 zeigten, dass Aβ (1–42) der Hauptbestandteil in neuritischen (= Nerven-)Plaques (90%) ist und zwar mit signifikanten Mengen von isomerisierten und racemisierten Aspartylresten. Die Autoren haben auch gezeigt, dass Aβ (17–42) auch in diffusen Plaques (70%) vorherrscht, wohingegen Aβ (1–40) der Hauptbestandteil in den meningo-vaskulären Plaques ist, umfassend 60% am gesamten Aβ und in parenchymalen Gefäßen Ablagerungen von Aβ (1–42) 75% am gesamten Aβ repräsentieren. Iwatsubo et al. (1994) Neuron 13: 45–53 zeigten, dass Aβ42 (43) positive senile Plaques die hauptsächliche Spezies in sporadischen AD-Gehirnen ist.
Molekularbiologische und Protein-chemische Analysen, durchgeführt während der letzten Jahre haben gezeigt, dass Aβ ein kleines Fragment eines viel größeren Vorläuferproteins ist, das man als das β-Amyloid-Vorläufer-Protein (β-amyloid precursor protein, APP) bezeichnet, welches normalerweise von Zellen in vielen Geweben von verschiedenen Tieren, einschließend Menschen, produziert wird. Die Kenntnis der Struktur des Gens, welches APP codiert, hat demonstriert, dass Aβ als ein Peptidfragment in Erscheinung tritt, das von Carboxylterminusende von APP von bislang unbekannten Enzymen (Protease) abgeschnitten wird. Der präzise biochemische Mechanismus, durch welchen das Aβ-Fragment vom APP abgeschnitten wird, und nachfolgend als Amyloid-Plaques in den cerebralen Geweben und in den Wänden der cerebralen und meningealen Blutgefäßen abgeschieden wird, ist derzeit unbekannt.
Verschiedene Linien des Nachweises zeigen an, dass das Voranschreitender cerebralen Abscheidung von Aβ eine grundlegende Rolle in der Pathogenese von AD spielt und kognitiven Symptomen um Jahre oder Jahrzehnte vorausgeht (für einen Review, siehe Selkoe (1994) J. Neuropath. and Exp. Neurol. 53: 438–447 und Selkoe (1991) Neuron 6: 487). Die am meisten hervorzuhebende, wichtigste Nachweiskette ist die Entdeckung aus 1991, dass Missense-DNA-Mutationen an Aminosäure 717 der 770-Aminosäure-Isoform von APP in betroffenen Mitgliedern, jedoch nicht in nichtbetroffenen Mitgliedern mehrerer Familien mit einer genetisch bestimmten (familiären) Form von AD gefunden werden können (Goate et al. (1991) Nature 349: 704–706; Chartier Harlan et al. (1991) Nature 353: 844–846; und Murrell et al. (1991) Science 254: 97–– 99). Suzuki et al. (1994) Science 264: 1336–1340 zeigten, dass in Personen mit der 717-Mutation ein höherer Prozentsatz an Aβ (1–42) als an Aβ (1–40) auftritt.
Darüber hinaus wurde 1992 von einer Doppel-Mutation, verändernd Lysin⁵⁹⁵-Methionin⁵⁹⁶ zu Asparagin⁵⁹⁵-Leucin⁵⁹⁶ (bezogen auf die 695-Isoform), gefunden in schwedischen Familien, berichtet (Mullan et al. (1992) Nature Genet 1: 345–347), und diese wird als die schwedische Variante bezeichnet. Genetische Verknüpfungsanalysen haben demonstriert, dass diese Mutationen, wie auch bestimmte andere Mutationen des APP-Gens, die spezifische molekulare Ursache von AD in den betroffenen Mitgliedern solcher Familien darstellen. Darüber hinaus wurde eine Mutation von der Aminosäure 693 der 770-Aminosäure-Isoform von APP als Ursache für Aβ-Ablagerungserkrankung HCHWA-D identifiziert und eine Veränderung von Alanin zu Glycin an Aminosäure 692 scheint einen Phenotyp zu erzeugen, der AD in einigen Patienten ähnelt, jedoch HCHWA-D in anderen. Die Entdeckung dieser und anderer Mutationen in APP in genetisch basierten Fällen von AD spricht dafür, dass die Veränderung von APP und die nachfolgende Ablagerungen des Aβ-Fragments AD verursachen können.
Neurofibrilläre Tangles bestehen in erster Linie aus dem Mikrotubulin-Protein, Tau. Z. S. Khachaturian (1985) Arch. Neurol. 42: 1097–1105. Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass Tau erhöht in der CSF von an Alzheimer erkrankten Patienten vorliegt. M. Vandermeeren et al. (1993) J. Neurochem. 61: 1828–1834.
Trotz des Fortschritts, der im Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen von AD erzielt wurde, besteht weiterhin das Bedürfnis, Verfahren zur Anwendung in der Diagnose dieser Erkrankungen zu entwickeln. Während der Grad von Tau eine gewisse Hilfe in der Diagnose von Alzheimer darstellt (M. Vandermeeren et al., supra), wären mehr Marker und mehr spezifische Marker hilfreich. Es wäre fernerhin wünschenswert, Verfahren zur Verwendung in der Diagnose zu von Aβ-verwandten Konditionen bereitzustellen, wobei die Diagnose zumindest teilweise auf der Detektion von Aβ und verwandten Fragmenten in Flüssigkeitsproben von Patienten basiert. Spezifische Assays für die Aβ-Detektion sollten in der Lage sein, Aβ und verwandte Fragmente in Flüssigkeitsproben in sehr geringen Konzentrationen nachzuweisen, wie auch zwischen Aβ und anderen von APP zu unterscheiden, die in einer Probe vorliegen können.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Glenner und Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 885–890 und US-Patent Nr. 4,666,829 werden oben diskutiert. Das '829-Patent legt die Verwendung eines Antikörpers gegen das 28-Aminosäure-Aβ-Fragment nahe, um das "Alzheimer-Amyloid-Polypeptid" in einer Probe eines Patienten zu Detektierung und Alzheimer zu diagnostizieren. Keine Daten, welche die Detektion oder Diagnose demonstrieren, werden vorgestellt.
Verschiedene biochemische elektronenmikroskopische und immunochemische Studien haben berichtet, dass Aβ höchst unlöslich in physiologischen Lösungen bei normalem pH ist. Siehe beispielsweise Glenner und Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 122: 1131–1135; Masters et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4245–4249; Selkoe et al. (1986) J. Neurochem. 46: 1820–1834; Joachim et al. (1988) Brain Research 474: 100–111; Hilbich et al. (1991) J. Mol. Biol. 218: 149–163; Barrow und Zagorski (1991) Science 253: 179–182; und Burdick et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 546–554. Des Weiteren wurde diese Unlöslichkeit vorhergesagt durch und ist konsistent mit der Aminosäuresequenz Aβ, die ein Stück von hydrophoben Aminosäuren einschließt, das einen Teil der Region konstituiert, der das Stammprotein (APP) in den Lipid-Membranen von Zellen verankert. Hydrophobe, lipid-verankernde Proteine, wie z. B. Aβ, werden vermutungsgemäß mit zellulären Membranen oder Membranfragmenten assoziiert bleiben und folglich nicht in physiologisch extrazellulären Flüssigkeiten vorliegen. Die oben erwähnten Untersuchungen und viele andere haben die Unlöslichkeit in physiologischer Lösung des nativen Aβ, aufgereinigt aus AD-Gehirn-amyloiden Ablagerungen, oder von synthetischen Peptiden enthaltend die Aβ-Sequenz berichtet. Die Extraktion von Aβ aus cerebralen amyloiden Ablagerungen und ihre nachfolgende Löslichmachung hat die Verwendungen von nicht physiologischen Lösungsmitteln und denaturierenden Agenzien verlangt. Physiologische, gepufferte Salzlösungen, welche die extrazellulären Flüssigkeiten der menschlichen Gewebe nachstellen, haben einheitlich nicht ausgereicht, Aβ in Lösung zu bringen.
Weitere Versuche, APP oder Fragmente davon in Plasma oder in CSF zu detektieren, wurden auch unternommen. Ein großes sekrentiertes Fragment von APP, das keine intakte Aβ-Region enthält, wurde in menschlicher cerebrospinaler Flüssigkeit gefunden. (Palmert et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6338–6342; Weidemann et al. (1989) Cell 57: 115–126; Henriksson et al. (1991) J. Neurochem. 56: 1037–1042; Palmert et al. (1990) Neurology 40: 1028–1034; und Seubert et al. (1993) Nature 361: 260–263) sowie im Plasma (Podlisny et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 167: 1094–1101). Die Detektion von Fragmenten des carboxyendständigen Abschnitts von APP im Plasma wurde auch berichtet (Rumble et al. (1989) N. Engl. J. Ned. 320: 1446–1452), ebenso wie das Scheitern des Nachweises dieser Fragmente (Schlossmacher et al. (1992) Neurobiol. Aging 13: 421–434).
Trotz der offensichtlichen Unlöslichkeit von nativem und synthetischem Aβ wurde spekuliert, dass das Aβ unter Umständen in Körperflüssigkeiten vorkommt, wie z. B. der cerebrospinalen Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF) oder im Plasma (Wong et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8729–8732; Selkoe (1986) Neurobiol. Aging 7: 425–432; Pardridge et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 145: 241–248; Joachim et al. (1989) Nature 341: 226–230; Selkoe et al. (1989) Neurobiol. Aging 10: 387–395).
Von mehreren Versuchen, Aβ in CSF und Plasma zu messen, wurden berichtet, sowohl durch Radioimmunoassayverfahren (WO90/12870, publiziert am 1. November 1990) wie auch durch Sandwich-ELISAs (Wisniewski in Alzheimer's Disease, Hrsg. Becker und Giacobini, Taylor und Francas, N.Y. S. 206, 1990; Kim und Wisniewski in Techniques in Diagnostic Pathology, Hrsg. Bullock et al., Academic Press, Boston S. 106; und WO90/12871, publiziert am 1. November 1990). Während diese Berichte sehr geringe Spiegel von Aβ-Immunoreaktivität in Körperflüssigkeiten nachgewiesen haben, wurden keine Versuche der direkten Aufreinigung und weiteren Charakterisierung dieser Immunoreaktivität wie auch der Bestimmung, ob sie Aβ repräsentierte, durchgeführt, und die Bemühungen wurden eingestellt. Die Möglichkeit der Aβ-Produktion durch kultivierte Zellen wurde nie in Betracht gezogen, noch je gezeigt.
Retrospektiv war die Unfähigkeit, Aβ leicht in Körperflüssigkeiten nachzuweisen, wahrscheinlich auf die Gegenwart von amyloiden Vorläuferfragmenten zurückzuführen, mit überlappenden Regionen oder auf Fragmente von Aβ, welche die Messungen verschleierten sowie auf das Nichtvorhandensein von Antikörpern, die vollständig spezifisch für intaktes Aβ sind. Dies liegt vermutlich daran, dass die Antikörper, verwendet von beiden Gruppen, mit anderen APP-Fragmenten überkreuz reagieren würden, welche Teile von Aβ enthalten, von denen bekannt ist, dass sie in CSF vorliegen, wodurch eine Wechselwirkung mit der Messung erzielt würde, falls überhaupt eine von intaktem Aβ gelingt. Diese Schwierigkeiten wurden ausgeräumt durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, spezifisch für ein Epitop in der zentralen Verbindungsregion von intaktem Aβ (Seubert et al. (1992) Nature 359: 325–327).
Seubert et al. (1992) Nature 359: 325–327 und Shoji et al. Science (1992) 258: 126–129 stellten den ersten biochemischen Nachweis für das Vorliegen von diskretem Aβ in Körperflüssigkeiten zur Verfügung. Vigo-Pelfrey et al. (1993) J. Neurochem. 61: 1965–1968 berichteten von der Identifikation von vielen Aβ-Spezies in cerebrospinaler Flüssigkeit.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, verwendbar zur Unterstützung in der Diagnose sowie im Überwachen von Aβ-verwandten Konditionen in Patienten zur Verfügung, wobei die Verfahren sich auf die spezifische Detektion von Flüssigkeitsproben in Patienten von einem oder mehreren löslichen Aβ oder löslichen Aβ-Fragmenten verlassen, die Aminosäurereste oberhalb der Nr. 40 in ihrem Carboxy-Terminus aufweisen. Diese Peptide werden als "Aβ (x– ≥ 41)" bezeichnet (Aβ von der Aminosäure Nr. "x" zu einer Aminosäure größer oder gleich der Aminosäure Nr. 41). In einer Ausführungsform gehören die gemessenen Peptide zur Klasse von Aβ (x– ≥ 41), welche zumindest die Aminosäuren 13–41 enthalten.
Für die Diagnose und Überwachung von Aβ-verwandten Konditionen wird die Menge der oben genannten Peptide in einer Flüssigkeitsprobe eines Patienten, speziell in der cerebrospinalen Flüssigkeit (CSF) gemessen und mit einem vorbestimmten Wert verglichen, wie z. B. einem Indikatorwert (im Fall der Diagnose) oder einem früheren Patientenwert (im Fall der Überwachung). Im Fall der Diagnose werden die gemessenen Werte von Aβ (x– ≥ 41), die oberhalb des Indikatorwertes liegen, als starken Hinweis darauf betrachtet, dass der Patient nicht unter AD oder anderen Aβ-verwandten Zuständen leidet. Jedoch kann diese Information auch zusammen mit weiteren Faktoren bei der Erstellung einer bestimmenden Diagnose berücksichtigt werden. Gemessene Werte von Aβ (x– ≥ 41), die bei oder unterhalb des Indikatorwertes liegen, werden als positive Indikation bewertet, dass der Patient unter AD oder anderen Aβ-verwandten Beziehungen leidet. Der niedrige Aβ (x– ≥ 41)-Status des getesteten Individuums wird üblicherweise nicht per se als diagnostisch bestimmend für einen Aβ-verwandten Zustand gelten, sondern wird zusammen mit anderen akzeptierten klinischen Symptomen von Aβ-verwandten Zuständen beim Erstellen der Diagnose berücksichtigt werden. In cerebrospinaler Flüssigkeit ist ein Indikatorwert von etwa 0,5 ng/ml bedeutsam.
In einem speziellen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung spezifische Bindungsassays bereit, die für den Nachweis von löslichem Aβ (x– ≥ 41) in Flüssigkeitsproben bedeutsam sind, und die in für Patienten diagnostischen und überwachenden Verfahren, wie gerade beschrieben, eingesetzt werden können.
Spezifische Bindungsassays gemäß der vorliegenden Erfindung setzten zwei bindende Substanzen ein, die spezifisch für unterschiedliche Epitope oder bestimmte Stellen auf dem Aβ (x– ≥ 41) Molekül sind. Ein Epitop oder eine Stelle befindet sich üblicherweise nicht auf anderen Fragmenten oder Abbauprodukten des amyloiden β-Vorläuferproteins (APP), um Kreuzreaktionen mit diesen Fragmenten zu vermeiden. Insbesondere bedeutsam sind Antikörper, welche eine Verbindungsregion innerhalb von Aβ erkennen, wobei die Verbindungsregion um die Stelle der normalen proteolytischen Schnittstelle von APP zwischen den Resten Lys16 und Leu17 liegt (Esch et al. (1990) Science 248: 492–495 und Anderson et al. (1991) Neuro. Science Lett. 128: 126–128), und typischerweise durch die Aminosäurereste 13 bis 26 aufgespannt wird. Das andere Epitop oder die andere Stelle enthalten zumindest eine Aminosäure über Aminosäure Nr. 40 von Aβ hinaus, die essentiell für die Erkennung ist, jedoch nicht kreuzreagiert mit Aβ oder Aβ-Fragmenten, deren carboxyterminales Aminosäure Nr. 40 oder niedriger ist. Exemplarische spezifische Bindungsassays schließen Zwei-Stellen (Sandwich)-Assays ein, in welchen der einfangende Antikörper spezifisch für die Verbindungsregion von Aβ ist, wie bereits beschrieben, und ein zweiter nachweisbarer Antikörper spezifisch für ein Epitop oder eine Stelle, enthaltend zumindest eine Aβ-Aminosäure über der Nr. 40 hinaus ist. Insbesondere kann der zweite Antikörper durch Immunisation mit einem Hapten, enthaltend Aβ-Aminosäuren 33–42 erzeugt werden.
Diese Erfindung stellt auch Verfahren zum Unterstützen in der Diagnose oder Überwachung von Alzheimer-Erkrankung in einem Patienten bereit, welche Messungen sowohl von Aβ (x– ≥ 41) und des Mikrotubulus-Proteins Tau einschließen. Die Verfahren schließen die Messung der Menge von einem oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) in der Probe eines Patienten ein; den Vergleich der gemessenen Menge mit einer vorbestimmten Menge von löslichem Aβ (x– ≥ 41); das Messen der Menge von Tau in der Probe eines Patienten; den Vergleich der gemessenen Menge mit einer vorbestimmten Menge von besagtem Tau; sowie die Bewertung des Status des Patienten, basierend auf einem Unterschied zwischen den gemessenen und vorbestimmten Werten von Aβ (x– ≥ 41) und Tau. Wiederum kann eine vorbestimmte Menge ein Indikatorwert oder ein früherer Patientenwert sein. Eine gemessene Menge bei oder unterhalb des Aβ (x– ≥ 41)-Indikatorwerts und bei oder oberhalb des Tauindikatorwerts liefert einen positiven Hinweis in der Diagnose der Alzheimer-Erkrankung, wobei eine gemessene Menge oberhalb des des Aβ (x– ≥ 41)-Indikatorwerts und unterhalb des Tauindikatorwerts eine negative Indikation der Diagnose der Alzheimer-Erkrankung zur Verfügung stellt. Indikatorwerte in der CSF von ungefähr 0,5 ng/ml für Aβ (x– ≥ 41) und ungefähr 0,3 ng/ml für Tau sind bedeutsam.
Diese Erfindung stellt auch Kits zum Unterstützen in der Diagnose der Alzheimer-Erkrankung bereit. Die Kits schließen eine bindende Substanz ein, welche Aβ (x– ≥ 41) bindet, jedoch nicht an Aβ (≥ 40) bindet, sowie eine bindende Substanz, welche Tau bindet. In einer Ausführungsform enthält der Kit vier Antikörper:

a) einen ungelabelten Antikörper, welcher an die Verbindungsregion von Aβ bindet;
b) einen nachweisbar gelabelten Antikörper, welcher ein Epitop enthaltend eine Aminosäure oberhalb Nr. 40 in Aβ bindet;
c) einen ungelabelten Antikörper, welcher an Tau bindet; und
d) einen nachweisbar gelabelten Antikörper, der an Tau bindet.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein System zum Nachweis von einem der mehreren Aβ (x– ≥ 41) in einer Flüssigkeitsprobe bereit. Das System schließt eine erste bindende Substanz ein, typischerweise ein Antikörper, spezifisch für ein Epitop in einer Bindungsregion von Aβ, wie oben beschrieben, sowie eine zweite bindende Substanz, typischerweise einen Antikörper, spezifisch für ein Epitop von Aβ, enthaltend eine Aminosäure oberhalb Aminosäure Nr. 40 von Aβ am Carboxy-Terminus hinaus, essentiell für die Erkennung. Die erste bindende Substanz ist ein Anti-Aβ-Antikörper, gebunden an eine feste Phase, während die andere ein Reporter-Antikörper gegen den Aβ-Carboxy-Terminus ist. Der Reporter-Antikörper kann selbst gelabelt sein oder kann durch einen weiteren Antikörper nachweisbar sein (beispielsweise ein Kaninchen-Antikörper, erkennbar durch gelabelte oder Enzym-konjugierte Anti-Kaninchen-Antikörper). Das System kann des Weiteren ein Substrat für einen Enzymlabel enthalten. Das System ist bedeutsam im Durchführen von Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA), welche eine hohe Spezifizität und Sensitivität für den Nachweis von A (x– ≥ 41) in Flüssigkeitsproben aufweisen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Screenen einer Verbindung bereit, um ihre Fähigkeit zu stimmen, die Menge von Aβ (x– ≥ 41) in der CSF zu verändern. Die Verfahren involvieren das Messen einer ersten Menge an löslichem Aβ (x– ≥ 41) in der CSF eines nicht-menschlichen Tiers, verwendet als Modell der Alzheimer-Erkrankung; die Verabreichung der Verbindung an ein nicht-menschliches Tier; das Messen einer zweiten Menge eines löslichen Aβ (x– ≥ 41) in der CSF des nicht-menschlichen Tieres; und das Vergleichen der ersten Menge mit der zweiten Menge. Der Unterschied zeigt an, ob die Verbindung Aβ (x– ≥ 41) in der CSF vergrößert, wobei sie in diesem Fall bedeutsam in der Behandlung von Alzheimer sein kann; oder die Menge verringert, wobei in diesem Fall die Verbindung Alzheimer verstärken oder beschleunigen könnte. Das nicht-menschliche Tier ist vorzugsweise ein Säugetier, mehr bevorzugt ein Nager und am meisten bevorzugt eine Maus.
In einem weiteren Aspekt stellt diese Erfindung Verfahren zum Screenen einer Verbindung bereit, um ihre Fähigkeit zu bestimmen, die Menge sowohl von Aβ (x– ≥ 41) als auch Tau in der CSF zu verändern, involvierend das Messen einer ersten Menge von einem oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) eines nicht-menschlichen Tieres, verwendet als Modell der Alzheimer-Erkrankung; Messen einer ersten Menge von Tau in der CSF des nicht-menschlichen Tieres; Verabreichen der Verbindung an ein nicht-menschliches Tier; Messen einer zweiten Menge von besagtem einen oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) in der CSF des nicht-menschlichen Tieres; Messen einer zweiten Menge von Tau in der CSF eines nicht-menschlichen Tieres; und Vergleichen der ersten Menge mit den jeweiligen zweiten Mengen, wobei der Unterschied andeutet, ob die Verbindung die Menge an löslichem Aβ (x– ≥ 41) verstärkt, vermindert oder unverändert lässt bzw. die Menge an Tau in der CSF verstärkt, vermindert oder unverändert lässt. Die Information ist bedeutsam, wie oben erwähnt, um Verbindungen zu identifizieren, die bedeutsam in der Behandlung von Alzheimer sein können oder welche Alzheimer verstärken oder beschleunigen könnten. Das nicht-menschliche Tier ist vorzugsweise ein Säugetier, mehr bevorzugt ein Nager und am meisten bevorzugt eine Maus.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Ergebnisse eines EILISA-Assays unter Verwendung von Antikörper 266 (gerichtet auf die Aβ-Verknüpfungsregion) sowie Antikörper 277/2 (gerichtet auf Aβ-Aminosäure 33–42), um Aβ (42) zu detektieren, aber nicht Aβ (28), Aβ (38) oder Aβ (40).
2 zeigt die Mengen von Aβ (x– ≥ 41) in CSF von Kontroll-Patienten (C) und AD-Patienten (AD) in Gruppe A, wie sie durch ELISA detektiert werden.
3 zeigt die Menge von Aβ (x– ≥ 41) in CSF von AD-Patienten (AD) nicht-Alzheimer-neurologischen Kontrollen (NC) und Kontrollen (C) in Gruppe B, wie durch ELISA detektiert.
4 zeigt die Mengen von Aβ (x– ≥ 41) in CSF von AD-Patienten (AD), nicht-Alzheimer-neurologischen Kontrollen (ND) und Nicht-Demenz-Kontrollen (NC), wie durch ELISA detektiert.
5 zeigt die Mengen von Tau in CSF von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD), nicht-Alzheimer-neurologischen Kontrollen (ND) und Nicht-Demenz-Kontroll-Patienten (NC).
6 zeigt die Mengen von Aβ (x– ≥ 41) und Tau in CSF von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD), nicht-Alzheimer-neurologischen Kontrollen (ND) und Nicht-Demenz-Kontrollen (NC). Daten der 4 und 5 werden kombiniert, um den Effekt der gleichzeitigen Betrachtung der beiden Messungen beim Diskriminieren der AD-Gruppe zu illustrieren. Die Linien deuten optimierte Cupoffs an. Der hohe Tau/niedrige Aβ (x– ≥ 41)-Quadrant enthält AD-Patienten mit nur einer einzigen Ausnahme (21 von 22 Patienten), wobei der niedrige Tau/hoch-Aβ (x– ≥ 41)-Quadrant nur Kontroll-Individuen enthält.
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung rührt zumindest teilweise von der Entdeckung her, dass die cerebrospinale Flüssigkeit ("CSF") von Individuen, die unter Alzheimer-Erkrankung leiden, im Allgemeinen Aβ (x– ≥ 41) in Mengen enthält, die am äußersten unteren Ende des normalen Bereichs liegen; der in CSF von Nicht-Alzheimer-Individuen vorliegt und insbesondere unterhalb von 0,5 ng/ml. Diese Entdeckung ist überraschend, da die Mehrheit der Aβ-Ablagerung in Gehirngewebe von Patienten, die unter Alzheimer-Erkrankung leiden, Aβ (1–42) darstellt und signifikant erhöht, im Vergleich zu den Mengen von Aβ (1–42) in Nicht-Alzheimer-Individuen ist.
Basierend auf dieser Entdeckung stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Diagnose und zur Überwachung der Alzheimer-Erkrankung zur Verfügung. Gemäß eines Verfahrens wird eine Patientenprobe zuerst erhalten. Die Patientenprobe ist üblicherweise eine Flüssigkeitsprobe und vorzugsweise eine cerebrospinale Flüssigkeit. Anschließend wird die Menge des löslichen Aβ (x– ≥ 41) in der Probe des Patienten gemessen. Ein bevorzugtes Verfahren zum Messen der Menge erfolgt durch Anwendung des Sandwichassays, wie hier beschrieben. Die gemessene Menge wird dann verglichen mit einem vorbestimmten Wert, wie z. B. einem Indikatorwert im Falle der Diagnose oder einem früheren Patientenwert im Falle der Überwachung.
Der Status des Patienten wird bewertet basierend auf dem Unterschied zwischen beiden Mengen.
Wie in größerem Detail unten beschrieben, wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung bedeutsam sowohl als positiver wie auch als negativer Indikator für AD und andere Aβ-verwandte Bedingungen in getesteten Individuen sein. Die Daten im experimentellen Abschnitt zeigen, dass Individuen, die nicht unter Alzheimer-Erkrankung leiden, CSF-Konzentrationen von löslichem Aβ (x– ≥ 41) aufweisen, die von 0,2 ng/ml bis etwa 1,0 ng/ml reichen. Jedoch Patienten mit Alzheimer-Erkrankung weisen CSF-Konzentrationen von löslichem Aβ (x– ≥ 41) im Allgemeinen unterhalb von 0,5 ng/ml auf. Folglich ist die gemessene Menge oberhalb des Indikatorwerts etwa 0,5 ng/ml eine sehr starke negative Indikation der Alzheimer-Erkrankung. Das heißt, dass Individuen mit solchen Spiegeln als weniger wahrscheinlich unter einer Aβ-verwandten Erkrankung, insbesondere unter Alzheimer-Erkrankung, leidend betrachtet werden müssen.
Ein Indikatorwert von 0,7 ng/ml wird die Anzahl der falsch-negativen gemessenen Werte reduzieren und ist auch bedeutsam als vorbestimmte Menge. Im Gegensatz dazu wird dann eine gemessene Menge unterhalb des Indikatorwerts 0,5 ng/ml ein positiver Indikatorwert der Alzheimer-Erkrankung sein und Individuen, die diese Spiegel aufweisen, werden als höher wahrscheinlich an Alzheimer-Erkrankung leidend betrachtet. Ein Indikatorwert von 0,45 ng/ml reduziert die Anzahl der falsch-positiven Werte und ist auch bedeutsam als ein vorbestimmter Wert. Da jedoch Werte unter 0,5 ng/ml und 0,45 ng/ml am unteren Ende des normalen Bereichs gefundenen in Nicht-Alzheimer-Individuen liegen, reicht jedoch ein gemessener Wert unterhalb des Indikatorspiegels nicht aus, um selbst eine Diagnose der Alzheimer-Krankheit zur Verfügung zu stellen. Folglich werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung bedeutsam als Teil einer diagnostischen Prozedur sein, die auch andere bekannte AD-Symptome berücksichtigen wird, wie z. B. diejenigen, beschrieben in den NINCDS-ADRDA-Kriterien (beispielsweise klinische Demenz und Gedächtnisbeeinträchtigungen).
Die Erfindung rührt auch teilweise von der Entdeckung her, dass das Auffinden von Aβ (x– ≥ 41) am unteren Ende des Normalbereichs zusammen mit dem Auffinden von höheren als normalen Mengen an Tau in dem CSF eines Individuums ein stärker positiven Indikator der Alzheimer-Erkrankung darstellt, verglichen mit dem jeweiligen Einzelbefund und ein Finden von hohen Leveln Aβ (x– ≥ 41) und niedrigen Leveln an Tau in dem CSF eines Individuums ein sehr stark negativer Indikator der Alzheimer-Erkrankung ist. Folglich scheint die kombinierte Verwendung dieser beiden Marker eine signifikant komplementäre diagnostische Information zu liefern.
Die Daten, präsentiert in 6, zeigen, dass Patienten, die hohe Tauwerte zeigen (oberhalb von etwa 0,3 ng/ml) und niedrige Aβ (x– ≥ 41) (unterhalb von etwa 0,5 ng/ml) eine 96%ige Wahrscheinlichkeit aufwiesen, an Alzheimer-Erkrankung zu leiden (22/23). 59% der an Alzheimer erkrankten Patienten wiesen in dieser Untersuchung (22/37) fallen in diese Kategorie. Im Gegensatz dazu wiesen Patienten, die geringe Tauwerte zeigten (unterhalb von etwa 300 pg/ml) sowie erhöhte Aβ (x– ≥ 41)-Werte eine 100%ige Wahrscheinlichkeit auf, nicht unter Alzheimer-Erkrankung zu leiden (28/28, 6). Etwas über die Hälfte der nicht an Alzheimer erkrankten Subjekte (28/52, 54%) fielen in die Kategorie. Zusammengenommen war die kombinierte Analyse von CSF-Tau und -Aβ (x– ≥ 41) von hoher Vorhersagekraft entweder für das Vor handensein oder die Abwesenheit der Alzheimer-Erkrankung in etwas mehr als der Hälfte der Individuen, die in dieser Studie untersucht wurden. Die kombinierten CSF Tau- und Aβ (x– ≥ 41)-Messungen waren nicht informativ in denjenigen Patienten, welche in die Niedrig-Aβ (x– ≥ 41)/Niedrig-Tau-Gruppe fielen. Nichtsdestoweniger ist die Fähigkeit irgendeines Tests, für den Einschluss oder den Ausschluss der Alzheimer-Erkrankung mit hoher Spezifizität und sogar moderater Sensivität Hilfestellung zu leisten, von größter Bedeutung.
Gemäß eines zweiten Verfahrens dieser Erfindung wird die Menge sowohl von löslichem Aβ (x– ≥ 41) als auch Tau in einer Patientenprobe gemessen. Ein bedeutsames Verfahren zum Bestimmen der Menge des Tau ist per ELISA wie im genaueren Detail unten beschrieben wird. Die gemessenen Mengen von Aβ (x– ≥ 41) und Tau werden dann verglichen mit vorbestimmten Werten für die jeweilige Größe. Der Status des Patienten wird, basierend auf dem Unterschied zwischen den vorbestimmten Werten und den gemessenen Werten, bewertet.
Wie unten diskutiert, kann der Indikatorwert kalibriert werden, basierend auf der speziellen bindenden Substanz, die verwendet wird, und dem speziellen Aβ (x– ≥ 41)- und Tau-Protein, das nachgewiesen werden soll. Die Kalibration schließt den Nachweis der bindenden Substanz gegenüber Standards von Individuen ein, die eine Aβ-verwandte Erkrankung aufweisen, sowie gegenüber Kontrollstandards von Individuen, die keine solche Erkrankung aufweisen. Indikatorwerte werden aus diesen Ergebnissen ausgewählt, basierend auf der Anzahl der falsch-positiven oder falsch-negativen Werte, die der Anwender zu tolerieren bereit ist. Man erwartet, dass Indikatorwerte, welche unterschiedliche Bindungssubstanzen verwenden, welche gerichtet gegen Targets, wie hier beschrieben, grob gleich zu den Indikatorwerten, wie hier beschrieben, sein werden. Indikatorwerte unterhalb 0,4 ng/ml für Aβ (x– ≥ 41) und oberhalb 0,4 ng/ml für Tau senken die Anzahl der falsch-positiven Ergebnisse; während Indikatorwerte oberhalb 0,7 ng/ml für Aβ (x– ≥ 41) und unterhalb 0,2 ng/ml für Tau das Potenzial für eine falsche Indikation für das Nichtvorhandensein von Alzheimer-Erkrankung senken.
Falls der Grund für die reduzierten CSF-Aβ (x– ≥ 41) Werte in AD tatsächlich sekundär für die voranschreitende Plaquesabscheidung ist, könnte erklärt werden, warum eine substanzielle Anzahl von neurologisch erkrankten Subjekten und wenigen Kontrollsubjekte sich mit niedrigen Aβ (x– ≥ 41)-Spiegeln in CSF zeigten. Es besteht die Hypothese, dass die Plaquesabscheidung kognitiven Störungen vorausgeht und ein signifikanter Anteil dieser zuvor Nicht-AD-Subjekt dürfte wohl AD innerhalb der nächsten wenigen Jahre entwickeln (DMA Mann et al. (1992) Neurodegeneration 1: 201215 und DL Price et al. (1991) Neurobiol Aging 12: 295–312). Langzeitstudien sind offensichtlich vonnöten, um die Möglichkeit zu adressieren, dass Aβ (x– ≥ 41)-Spiegel prognostischen Charakter für AD aufweisen.
Man hat auch gefunden, dass Spiegel an Tau in AD-CSF nicht mit dem Alter, MMSE, dem gesamten Aβ, Aβ₄₂ oder ApoE_E4 korrelieren. Obwohl der genaue Grund für den Anstieg von Tau in AD unklar bleibt, ist er wahrscheinlich aufgrund des erhöhten Tauspiegels im AD-Gehirngewebe (S. Khatoon et. al. (1992) J Neurochem 59: 750–753) kombiniert mit der voranschreitenden Degeneration von Neuronen in dieser Erkrankung.
Der Sandwich-Assay beschrieben im experimentellen Abschnitt, verwendete Antikörper erzeugt gegen Verknüpfungsregion von Aβ und gegen Reste 33–42 von Aβ. In diesem Assay zeigten die Alzheimer Patienten im Allgemeinen Spiegel von Aβ (x– ≥ 41) unterhalb von 0,5 ng/ml, wie durch Antikörper nachgewiesen wurde. Der Indikatorwert von 0,5 ng/ml ist teilweise eine Funktion der speziellen Peptide, erkannt durch die verwendeten Antikörper, wie auch der Peptidcharge verwendet zum Durchführen der Kalibrierung. Folglich kann der Anwender die vorbestimmte Menge auf eine Rekalibrierung gründen unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen, die verwendet werden müssen, um Aβ (x– ≥ 41) in dem Test nachzuweisen. Zusätzlich zur anfänglichen Diagnose des Aβ-verwandten Zustandes können die gemessen Konzentrationen von Aβ überwacht werden, um das Voranschreiten der Erkrankung zu verfolgen und möglicherweise die Effektivität der Behandlung zu verfolgen (wenn solche Behandlungen verfügbar werden). Man würde erwarten, dass Spiegel von Aβ (x– ≥ 41) mit voranschreitender Erkrankung absinken würden.
Die Bezeichnung "Amyloid-Aβ-Peptid" oder "Aβ", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein etwa 4,2 kD-Protein, welches in den Gehirnen von AD, Down-Syndrom oder HCHWA-D und einigen normal gealterten Subjekten eine Untereinheit der amyloiden Filamente ausbildet, umfassend die senilen (amyloiden) Plaques und die amyloiden Ablagerungen in kleinen cerebralen und menigealen Blutgefäßen (amyloide Angiopathie). Aβ kann in einer filamentösen polymeren Form auftreten (in dieser Form zeigt es die Congorot und Thioflavin-S-Farbstoff-bindenden Charakteristika von Amyloid, die in Verknüpfung damit beschrieben werden). Aβ kann auch in nicht-filamentöser Form auftreten ("präamyloide" oder "amorphe" oder "diffuse" Ablagerungen) und zwar in Gewebe, wobei in dieser Form keine nachweisbare doppelbrechende Färbung durch Congorot auftritt. Ein Teil dieses Proteins in der unlöslichen Form, erhalten aus menigealen Blutgefäßen wird in US-Patent Nr. 4,666,829 beschrieben. Aβ ist ein etwa 39–43 Aminosäurefragment eines großen membranumspannenden Glycoproteins, das als das Aβ-amyloide Vorläuferprotein (amyloid precursor protein, APP) bezeichnet wird, und durch ein Gen auf dem langen Arm des menschlichen Chromosoms codiert wird. Formen von Aβ, welche länger als 43 Aminosäuren sind, sind hier auch eingeschlossen. Aβ ist des Weiteren charakterisiert durch seine relative Beweglichkeit in der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese oder in der High-performance-liquidchromatography (HPLC). Eine Sequenz für eine 43-Aminosäure-Version von Aβ ist die Folgende:
1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
11
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe
21
Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
31
Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
41
Ile Ala Thr [SEQ ID NR: 1).
Wie hier verwendet, bezieht sich Aβ auch auf verwandte polymorphe Formen von Aβ, einschließend diejenigen, die aus Mutationen in der Aβ-Region des APP-normalen Gens resultieren.
Der Begriff "Aβ-Fragment", wie hier verwendet, bezieht sich auf Fragmente und Abbauprodukte von Aβ, welche in niedrigen Konzentrationen der Säugetierzellen erzeugt werden. Spezielle Aβ-Fragmente haben ein Molekulargewicht von etwa 3 kD und man glaubt derzeit, dass sie Peptide einschließen mit beispielsweise den Aminosäureresten 3–34, 6–27, 6–34, 6–35, 6–42, 11–34, 11–40, 17–40, 1143 und 12–43 von Aβ.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Aβ (x– ≥ 41)" auf Aβ, dessen Aminoterminus mit der Aminosäure Nr. 1 von Aβ beginnt oder welches trunkiert ist, wobei dessen Carboxyterminus über die Aminosäure Nr. 40 hinausgeht. Diese Peptide und Fragmente umfassen heterogene Gruppen. Beispielsweise wurden Aβ (6–52), Aβ (11–42) und Aβ (12–43) alle in der CSF gefunden. Jedoch ist diese Liste nicht als exklusive Liste gedacht. Andere Peptide, welche unter die Gruppe fallen, existieren vermutlich in der CSF und sind mit den Verfahren, wie hier beschrieben, nachweisbar.
Die speziellen Peptide, gemessen von innerhalb der Gruppe von allen Aβ (x– ≥ 41) hängen von dem speziellen Messverfahren, das eingesetzt wird, ab. Im Falle der Verwendung von bindenden Substanzen, wie z. B. Antikörpern, kann die bindenden Substanz auf eines oder mehrere innerhalb der Gruppe von Peptiden gerichtet sein. Beispielsweise wird ein Antikörper erzeugt gegen Aminosäure 33–42 von Aβ, der nicht mit Aβ (1–40) kreuzreagiert an Aβ (x– 42) binden. Er kann auch an Aβ (x– 41) und Aβ (x– 43) binden. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung schließt das Verfahren das Bestimmen der Menge von Aβ (x– ≥ 41) mit mindestens den Aminosäuren 13–41 von Aβ ein. Diese Spezies kann gemessen werden unter Verwendung eines Sandwichassays, der Antikörper einsetzt, welche die Verknüpfungsregion (Aminosäuren 13–26) erkennen und Antikörper erzeugt durch Immunisierung mit einem Hapten mit den Aminosäuren 33–42, wie im Beispiel beschrieben.
Die Bezeichnung "Aβ-Verknüpfungsregion", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Region von Aβ, deren Mittelpunkt an der Stelle von Aminosäureresten 16 und 17 (Lys¹⁶ und Leu¹⁷) liegt, was ein Target für die proteolytische Verarbeitung von APP ist. Solche Verarbeitung resultiert in einer Vielzahl von APP-Fragmenten, welche beispielsweise an Aminosäure 16 von Aβ enden, und welche folglich potenziell immunologisch kreuzreaktiv mit Antikörpern gegen das intakte Aβ-Molekül sind, das im Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert werden soll. Antikörper erzeugt gegen ein synthetisches Peptid, einschließend Aminosäurereste 19–29, konnten als die notwendige Spezifität zeigend gefunden werden.
Der Begriff "Amyloid-β-Vorläuferprotein" (APP), wie hier verwendet, ist als ein Polypeptid definiert, das durch ein Gen des gleichen Namens codiert wird und in Menschen auf dem langen Arm von Chromosom 21 lokalisiert ist und welches Aβ innerhalb seines Carboxyldrittels einschließt. APP ist ein glycosyliertes, eine einzelne Membran aufspannendes Protein, exprimiert in einer großen Vielzahl von Zellen in vielen Säugetiergeweben. Beispiele spezifischer Isotypen von APP, von denen man derzeit weiß, dass sie in Menschen existieren, sind das 695-Aminosäurepolypeptid beschrieben von Kang et al. (1987) Nature 325: 733–736, hier als das "normale" APP bezeichnet; das 751-Aminosäurepolypeptid, beschrieben von Ponte et al. (1988) Nature 331: 525–527 (1988) und Tanzi et al. (1988) Nature 331: 528–530; und das 770-Aminosäurepolypeptid, beschrieben von Kitaguchi et al. (1988) Nature 331: 530–532.
Beispiele spezifischer Varianten von APP schließen Punktmutationen ein, die sowohl in Position als auch Phenotyp unterscheiden können (für einen Review betreffend bekannte Varianten-Mutationen siehe Hardy (1992) Nature Genet. 1: 233234).
Die Bezeichnung "Aβ-verwandter Zustand", wie hier verwendet, ist definiert als einschließend die Alzheimer-Erkrankung (was familiäre Alzheimer-Erkrankung einschließt), Down-Syndrom, HCHWA-D und vorangeschrittene Alterung des Gehirns.
Wie hier verwendet, bezieht sich "Tau" auf die Familie von Mikrotubulus-assoziierten Proteinen. Die gepaarten helikalen Filamente der neurofübrillären Tangles im Gehirn eines an Alzheimer-Erkrankung leidenden Patienten bestehen aus dem Tauprotein. (Siehe beispielsweise M. Goedert et al. (1989) Neuron 3: 519–526 und M. Goedert (1993) TINS 16: 460–465) Goedert et al. (1989) präsentiert auch eine DNA und eine Aminosäuresequenz mit Tau.
Der Begriff "Körperflüssigkeit", wie hier verwendet, betrifft diejenigen Flüssigkeiten eines Säugetier-Wirts, von denen man erwarten wird, dass sie nachweisbare Mengen von Aβ, Aβ-Fragmente oder Tauprotein enthalten, spezifisch einschließend cerebrospinale Flüssigkeit (CSF), Blut, Urin und peritoneale Flüssigkeit. Die Bezeichnung "Blut" bezieht sich sowohl auf Blut im Ganzen als auch auf Blutplasma und Serum.
Die Verfahren und Systeme dieser Erfindung schließen die Fähigkeit ein, Spezies von Aβ zu detektieren, welche über Aminosäure Nr. 40 am carboxy-terminalen Ende hinausgehen und folglich, die Fähigkeit, sie von kürzeren Spezies, wie z. B. Aβ (40) zu unterscheiden. Während der Nachweis von Aβ (x– ≥ 41) durch irgendwelche Verfahren, bekannt im Stand der Technik, zum Nachweis von Peptiden realisiert werden kann, ist die Anwendung von immunologischen Nachweistechniken, welche bindende Substanzen, wie Antikörpern, Antikörperfragmente, rekombinante Antikörper und dergleichen, einschließen, bevorzugt. Besonders geeignete Nachweistechniken schließen ELISA, Westernblotting, Radioimmunoassay und dergleichen ein. Geeignete immunologische Verfahren, die einen einzelnen Antikörper einschließen, werden auch betrachtet, beispielsweise ein Radioimmunoassay unter Verwendung einer spezifischen Antikörpers gegen ≥ 41-Formen von Aβ; oder Einzel-Antikörper-ELISA-Verfahren.
Folglich stellt diese Erfindung auch Antikörper bereit, die spezifisch für Aβ (x– ≥ 41) sind, die nicht mit Aβ (≥ 40) kreuzreagieren.
Diese Antikörper können hergestellt werden durch Immunisieren von Tieren mit synthetischen Peptiden, welche Aminosäuren oberhalb Nr. 40 von Aβ enthalten. Beispielsweise kann das synthetische Peptid Aminosäuren 33–42 einschließen. Ein spezifisches Beispiel für die Produktion eines solchen Antikörpers wird im experimentellen Abschnitt zur Verfügung gestellt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung involviert die Detektion und die Messung von Aβ (x– ≥ 41)-Peptiden die Verwendung von zwei Antikörpern, einer spezifisch für ein Epitop, enthaltend Aminosäuren über Nr. 40 in Aβ hinaus und ein anderer Antikörper, der in der Lage ist, Aβ und Aβ-Fragmente von anderen APP-Fragmenten zu unter scheiden, die sich möglicherweise in einer Probe finden. Insbesondere wurde festgestellt, dass Antikörper, die monospezifisch für die Verknüpfungsregion von Aβ sind, in der Lage sind, Aβ von anderen APP-Fragmenten zu unterscheiden. Die Verknüpfungsregion von Aβ weist ihre Mitte bei den Aminosäureresten 16 und 17 auf, typischerweise aufspannend Aminosäurereste 13–26, und solche Verknüpfungs-spezifischen Antikörper können hergestellt werden unter Verwendung von synthetischen Peptiden mit der Sequenz als ein Immunogen.
Eine bevorzugte Immunoassaytechnik ist ein Zwei-Stellen- oder "Sandwich"-Assay, der einen verknüpfungsspezifischen Antikörper als den einfangenden Antikörper (gebunden an eine feste Phase) und einen zweiten Antikörper, der ein Epitop bindet, das die Aminosäuren über Nr. 40 in Aβ enthält, einsetzt. Spezielle Verfahren zum Herstellen solcher Antikörper und zur Verwendung solcher Antikörper in einem exemplarischen ELISA werden in einem experimentellen Abschnitt im Folgenden dargestellt sowie in der verwandten US-Patentanmeldung 07/965,972, supra.
Antikörper spezifisch für Aβ können hergestellt werden gegen ein geeignetes Antigen oder Hapten, umfassend das erwünschte Targetepitop, wie z. B. die Verknüpfungsregion, bestehend aus Aminosäureresten 13–29 und den Carboxyterminus, bestehend aus den Aminosäureresten 33–42. Günstigerweise können die synthetischen Peptide durch konventionelle Festphasentechniken hergestellt werden, gekoppelt an ein geeignetes Immunogen und verwendet werden, um Antiseren und monoklonale Antikörper durch konventionale Techniken herzustellen. Geeignete Peptidhaptene werden üblicherweise zumindest fünf benachbarte Reste von Aβ umfassen und können mehr als sechs Reste einschließen.
Synthetische Polypeptidhaptene können hergestellt werden durch die wohl bekannte Merrifield-Festphasen-Synthesetechnik, in welcher Aminosäuren sequenziell zu einer wachsenden Kette gegeben werden (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2156). Die Aminosäuresequenz kann auf der Sequenz von Aβ, wie oben dargestellt, basieren.
Sobald eine hinreichende Menge an Polypeptidhapten erhalten wurde, kann es an einen geeigneten immunogenen Träger konjugiert werden, wie z. B. Serumalbumin, Keyhole- Limpet-Hämocyanin oder andere geeignete Proteinträger, wie sie allgemein beschrieben werden in Hudson und Hay, Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Kapitel 1.3, 1980. Ein exemplarischer immunogener Träger, eingesetzt in den Beispielen wie unten bereitgestellt, ist der α-CD3_E-Antikörper (Boehringer-Mannheim, Klon-Nr. 145-2C11).
Sobald eine hinreichende Menge des Immunogens erhalten worden ist, können Antikörper spezifisch für gewünschte Epitop durch in vitro- oder in vivo-Techniken erzeugt werden. in vitro-Techniken schließen das Aussetzen der Lymphozyten gegen Immunogene ein, während in vivo-Techniken die Injektion der Immunogene in geeignete Wirbeltierwirte verlangen. Geeignete Wirbeltierwirte sind nicht menschlicher Natur, einschließlich Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe, Ziegen und dergleichen. Immunogene werden in die Tiere injiziert gemäß einem vorbestimmten Schema und die Tiere werden periodisch zur Ader gelassen, wobei die Abfolge der Blutfraktionen verbesserte Titer und Spezifität aufweisen. Die Injektionen können intramuskulär, intraperitoneal, subkutan oder dergleichen erfolgen und ein Adjuvans, wie z. B. das unvollständige Freund-Adjuvans kann eingesetzt werden.
Falls gewünscht können monoklonale Antikörper erhalten werden durch Präparieren von immortalisierten Zelllinien, die in der Lage sind, Antikörper mit gewünschter Spezifität zu erzeugen. Solche immortalisierten Zelllinien können erzeugt werden auf verschiedene Art und Weise. Günstigerweise wird ein kleines Wirbeltier, wie z. B. eine Maus, hyperimmunisiert mit dem gewünschten Immunogen durch das gerade beschriebene Verfahren. Das Wirbeltier wird dann getötet, üblicherweise einige Tage nach der letzten Immunisierung. Die Zellen der Milz werden entfernt und die Zellen der Milz werden immortalisiert. Die Art und Weise der Immortalisierung ist nicht kritisch. Derzeit ist die am meisten übliche Technik die Fusion mit einem Myelom-Zell-Fusions-Partner, wie zuerst beschrieben von Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495–497. Andere Techniken schließen die EBV-Transformation, Transformation mit nackter DNA, beispielsweise durch Onkogene, Retroviren, etc. ein oder irgendwelche anderen Verfahren, die zum stabilen Erhalt der Zelllinie und zur Produktion monoklonaler Antikörper beitragen. Spezifische Techniken zum Herstellen monoklonaler Antikörper werden beschrieben in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Zusätzlich zu den monoklonalen Antikörpern und den polyklonalen Antikörpern (Antiseren) werden die Detektionstechniken der vorliegenden Erfindung auch in der Lage sein, Antikörperfragmente einzusetzen, wie z. B. F (ab), Fv, V_L, V_H und andere Fragmente. Bei der Verwendung von polyklonalen Antikörpern kann es jedoch notwendig sein, die Antiseren gegen Targetepitope zu adsorbieren, um eine monospezifische Antikörperpopulation zu erzeugen. Es wird auch möglich sein, rekombinant erzeugte Antikörper einzusetzen (Immunoglobuline) sowie Varianten davon, wie sie nun gut in der Patent- und wissenschaftlichen Literatur beschrieben werden. Siehe beispielsweise EPO 8430268.0; EPO 85102665.8; EPO 85305604.2; PCT/GB 85/00392; EPO 85115311.4; PCT/US86/002269; und die japanische Anmeldung Nr. 85239543. Es wäre auch möglich, andere rekombinante Proteine zu erzeugen, welche die Bindungsspezifität von Antikörpern, hergestellt wie gerade beschrieben, mimen würden.
Die Detektion von Tau kann auch realisiert werden durch irgendwelche Verfahren, die im Stand der Technik zum Detektieren von Peptiden bekannt sind. Die Verwendung von immunologischen Detektionstechniken, welche Bindungssubstanzen einsetzt, ist jedoch bevorzugt. Bedeutsame Detektionstechniken schließen alle der oben genannten ein. ELISA-Assays, involvierend einen einfangenden Antikörper und einen gelabelten Detektionsantikörper, beide gegen Tau, sind insbesondere bedeutsam.
Antikörper gegen Tau können erzeugt werden durch Impfen der Tiere mit Tau, aufgereinigt aus AD-Gehirnen oder aus rekombinanten Quellen. Rekominantes Tau kann erzeugt werden durch Expression in Insektenzellen aus einem Baculovirus-Vektor, enthaltend die pVL941-Tau-4-Repeat-Isoform, wie beschrieben von J. Knops et al. (1991) J. Cell Biol 1991: 114: 725–733. Aufgereinigtes Tau ist auch verfügbar von Immogenetics (Zwijndrecht, Belgien). Antikörper gegen Tau sind auch verfügbar von Sigma (St. Louis, MO). Weiter Quellen können identifiziert werden in dem Lindscott-Lexikon.
Tau kann erzeugt werden aus AD-Gehirn durch das Verfahren von Mercken et al. (1992) J Neurochem 58: 548. Typischerweise werden 50 g frischen Gehirns mit Scheren in kleine Stücke geschnitten und 1 : 1 (Gew./Vol.) in Puffer A (20 mM 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure, 80 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,1, mM EGTA, 1 mM MgCl₂ und 1 mM β-Mercaptoethanol, pH 6,75) mit einem Potter-Homogenisator, ausgestattet mit einem Teflonkolben homogenisiert. Das Homogenat wird 1 Stunde bei 150 000 g at 4°C zentrifugiert und der Überstand wird für 5 Minuten in kochendem Wasser erhitzt und erneut auf Eis für 10 Minuten gekühlt. Die Aufschlämmung wird für 2 Stunden bei 150 000 g bei 4°C zentrifugiert und der Überstand wird anschließend gesammelt. Der hitzestabile zytosolische Extrakt wird mit 2,5% Perchlorsäure angesäuert und für 1 Stunde bei 150 000 g bei 4°C zentrifugiert, wonach der Überstand mit 3 M Tris neutralisiert wird. Der Überstand wird dann dialysiert und konzentriert in Wasser in einem Centiprep-Konzentrator (Amicon, Lausanne, Schweiz). Das Endprodukt kann auf einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli-Verfahren) ausgewertet werden. Dieses Verfahren ist bedeutsam zum Immunisieren von Tieren, um Anti-Tau-Antikörper herzustellen.
Tau kann auch immunoaufgereinigt werden aus dieser Herstellung. Zehn Milligramm des anti-Tau-monoklonalen Antikörpers werden an 1 g von Cyanogenbromidaktivierter Sepharose (Pharmacia) durch das Verfahren, wie vom Hersteller beschrieben, gekoppelt. Fünfzig Milliliter des hitzestabilen zytosolischen Extrakts, wie oben beschrieben, werden 1 : 2 in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,5) verdünnt und auf die Säule aufgetragen. Die Säule wird mit 0,1 M Phosphat gewaschen und Tau wird mit 0,1 M Citronensäure (pH 2,5) eluiert und sofort mit 1 M NaOH neutralisiert. Die Fraktionen können per SDS-PAGE ausgewertet werden auf 10% Gelen und per Immunoblotting mit Anti-Tau-Antikörpern.
Diese Erfindung stellt auch Kits zum Durchführen der Assays bereit, welche in der Diagnose der Alzheimer-Krankheit hilfreich sind. Die Kits schließen Mittel zum Nachweisen von Aβ (x– ≥ 41) ein und Mittel zum Detektieren von Tau. Diese Mittel können irgendwelche Mittel einschließen, die bekannt sind oder oben beschrieben werden, beispielsweise bindende Substanzen. Bedeutsame bindende Substanzen schließen Moleküle ein, welche den bindenden Anteil eines Antikörpers aufweisen, wie z. B. einen ganzen Antikörper oder Antikörperfragmente. Die bindenden Substanzen können monoklonale Antikörper sein. In einer Ausführungsform schließt der Kit eine bindende Substanz ein, welche Aβ (x– ≥ 41) bindet, jedoch nicht an Aβ (≥ 40) bindet, und eine bindende Substanz, die an Tau bindet.
In einer Ausführungsform schließt der Kit Antikörper oder dergleichen, zum Durchführen von Sandwich-ELISAs ein, um jede Verbindung, beispielsweise wie oben beschrieben, nachzuweisen. In einer Ausführungsform können die Mittel zum Detektieren von Aβ (x– ≥ 41) eine bindende Substanz einschließen, welche an ein Epitop bindet, das Aminosäuren oberhalb der Nr. 40 in Aβ enthält, sowie eine bindende Substanz, welche Aβ oder ein Fragment von Aβ bindet, das jedoch nicht andere Fragmente von APP bindet. Die Mittel zum Detektieren von Tau können auch einen Sandwich-ELISA einschließen. Beispielsweise kann der Kit a) eine ungelabelte Bindesubstanz, die an eine Verknüpfungsregion von Aβ bindet, einschließen; b) eine nachweisbare gelabelte Bindesubstanz, die an ein Epitop bindet, das die Aminosäuren oberhalb der Nr. 40 in Aβ enthält; c) eine ungelabelte bindende Substanz, die an Tau bindet; und d) eine nachweisbar gelabelte bindende Substanz, die an Tau bindet.
Die nachweisbaren Labels können irgendwelche bekannten und im Stand der Technik verwendeten sein, einschließend beispielsweise Biotinylierung, radioaktive Label, Enzyme, fluoreszente Label und dergleichen.
Tiermodelle werden derzeit verwendet, um die Alzheimer-Erkrankung zu untersuchen. (siehe beispielsweise internationale Patentanmeldung WO 93/14200, US-Patentanmeldung 08/143,697, eingereicht am 27. Oktober 1993 und US-Patent 5,387,742.) Diese Modelle sind bedeutsam zum Screenen von Verbindungen auf ihre Fähigkeit, den Verlauf der Alzheimer-Erkrankung zu beeinflussen, und zwar sowohl in Bezug auf Verbesserungen als auch Verschlechterung des Zustands. Da AD charakterisiert ist durch die Abnahme in der Menge an Aβ (x– ≥ 41) in der CSF, erwartet man, dass effektive Behandlungen für Alzheimer-Erkrankung in einem Anstieg der Menge an Aβ (x– ≥ 41) in der CSF resultieren, wohingegen Agenzien, die den Verlauf der Erkrankung beschleunigen, in der Abnahme der Menge von Aβ (x– ≥ 41) in der CSF resultieren werden.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen von Verbindungen zur Verfügung, welche die Menge von Aβ (x– ≥ 41) in einer Flüssigkeitsprobe vergrößern oder verringern und zwar insbesondere in CSF, und welche daher Kandidaten zur Anwendung in der Behandlung der Erkrankung sind oder welche die Erkrankung beschleunigen und daher von Menschen gemieden werden sollten. Die Verfahren schließen das Messen einer ersten Menge von besagtem einen oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) in einer Probe eines nicht-menschlichen Tieres, verwendet als Modell für Alzheimer-Erkrankung ein; das Verabreichen der Verbindung an das Tier; das Messen einer zweiten Menge von einem oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) in einer Probe des Tieres; und den Vergleich der ersten Menge mit der zweiten Menge, wobei die Unterschiede andeuten, ob die Verbindung die Menge des löslichen Aβ (x– ≥ 41) in der Probe vergrößert, vermindert oder unverändert lässt. Der Grad der Dosierung, verabreicht an das Tier und die Menge der Zeit, die vergeht, bevor die zweite Menge gemessen werden wird, werden natürlicherweise vom Modellsystem abhängen.
Diese Erfindung stellt auch Verfahren zur Verfügung zum Screenen von Verbindungen, welche die Menge von Aβ (x– ≥ 41) erhöhen und die Menge an Tau in einer Flüssigkeitsprobe absenken, insbesondere in CSF, und welche folglich Kandidaten zur Anwendung in der Behandlung der Erkrankung sind; oder welche die Spiegel von Aβ (x– ≥ 41) vermindern und welche die Spiegel von Tau vergrößern und folglich die Krankheit beschleunigen und von Menschen gemieden werden sollen. Die Verfahren involvieren das Messen einer ersten Menge von besagtem einen oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) und Tau in einer Flüssigkeitsprobe eines nicht-menschlichen Tieres verwendet als ein Modell für Alzheimer-Krankheit; Verabreichen der Verbindung an das Tier; Messen einer zweiten Menge von einem oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) und Tau in einer Flüssigkeitsprobe des Tieres; und Vergleichen der ersten Mengen mit den zweiten Mengen, wobei der Unterschied andeutet, ob die Verbindung die Menge von löslichem Aβ (x– ≥ 41) und Tau in der flüssigen Probe erhöht, vermindert oder unverändert lässt. Der Grad der Dosierung, verabreicht an ein Tier und die Menge der Zeit, die vergeht, bevor die zweite Messmenge gemessen werden wird, werden natürlicherweise vom Modellsystem abhängen.
Ein bedeutsames nicht-menschliches Tiermodell beherbergt eine Kopie einer exprimierenden baren Transgensequenz, welche die schwedische Mutation von APP (Asparagin⁵⁹⁵-leucin⁵⁹⁶) codiert. Die Sequenz wird allgemein in Zellen exprimiert, die normalerweise das natürlich vorkommende endogene APP-Gen (falls vorrätig) exprimieren. Säugetiermodelle, genauer gesagt, Nagermodelle und insbesondere Maus- und Hamstermodelle, sind für diese Anwendung geeignet. Solche Transgene umfassen typischerweise eine schwedische Mutations-APP Expressions-Kassette, in welcher ein verknüpfter Promotor und vorzugsweise ein Enhancer die Expression von strukturellen Sequenzen; codierend ein heterologes APP-Polypeptid umfassend die schwedische Mutation, vorantreiben.
Die transgenen Tiere, die das Transgen beherbergen, welches ein schwedisches Mutations-APP-Polypeptid codieren, werden üblicherweise durch Einfügen des Transgens oder Targetingkonstruktes in ein befruchtetes Ei oder embryonale Stamm-(ES) Zell, typischerweise durch Mikroinjektion, Elektroporation, Lipofektion oder Biolistik, erzeugt. Die transgenen Tiere exprimieren das schwedische Mutations-APP-Gen des Transgens (oder das homolog rekombinante Targetkonstrukt), typischerweise in Gehirngewebe. Vorzugsweise sind ein oder beide endogene APP-Allele inaktiviert und nicht in der Lage, das Wildtyp-APP zu exprimieren.
Die folgenden Beispiele werden zur Illustration angeboten, nicht zur Begrenzung.
Beispiele
I. Aβ (x– ≥ 41) ist in Alzheimer-Patienten vermindert
Materialien und Methoden
1. Antikörperherstellung
a. Monoklonale Antikörper gegen die Aβ-Verknüpfungsregion
Monoklonale Antikörper gegen die Verknüpfungsregion von Aβ wurden hergestellt unter Verwendung eines synthetischen Peptides aufspannend die Aminosäurereste 13–31, außer dass AI, die Aminosäuren 30 und 31, mit GC substituiert waren. Dieses Peptid wurde Aβ_13–28 genannt. Aβ_13–28 wurde an ein Immunogen geknüpft (α-CD3_E-Antikörper; Klon Nr. 145-2C11, Boehringer-Mannheim) und zwar unter Verwendung von m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) gemäß den Instruktionen des Herstellers (Pierce).
A/J-Mäuse wurden ursprünglich intraperitoneal (IP) mit dem Aβ-Konjugat vermischt mit vollständigen Freund-Adjuvans immunisiert. Vierzehn Tage später wurde die Immunisierung in den Mäusen verstärkt IP mit dem Aβ-Konjugat vermischt mit Phosphatpuffersalzlösung (PBS) in 14-Tage-Intervallen. Nach sechs vollständigen Verstärkungen (boosts) wurde die Immunisierung in den Mäusen letztendlich intravenös mit dem Aβ-Konjugat vermischt mit dem unvollständigen Freund-Adjuvans verstärkt und die Mäuse wurden 3 Tage später fusioniert. Die Fusion von Milzzellen mit P3.653-Myelomazellen wurde durchgeführt, wie in Oi und Herzenberg, Selective Methods in Cellular Immunology, Mishell and Shigii, Hrsg., W. H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 17 (1980) beschrieben. Einige Titer und ursprüngliches Screens wurden durchgeführt durch die RIA-Methode, wie unten beschrieben. Einige Klone wurden ausgedehnt auf eine 24-Well-Platte und weiteren Analyse, wie unten beschrieben, unterzogen. Klone von Interesse wurden in Maus-Aszites hergestellt.
Die RIA-Methode verwendet, um Serumblutfraktionen und Fusionshybridom-Überstände zu screenen, basierte auf einer Methode, entwickelt von Wang et al. (1977) J. Immunol. Methods 18: 157–164. Kurz gesprochen wurde der Überstand (oder das Serum) über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Rotator mit ¹²⁵I gelabelten Aβ_1–28 und Sepharose 4B-Beads inkubiert, an welche Schaf-Anti-Maus-IgG über Cyanobromid gekoppelt worden war. Die Beads eines jeden Wells wurden auf Glasfaser-Filter-Scheiben mit einem Zellernter geerntet und mehrmals mit PBS gewaschen. Die Filterscheiben wurden dann auf Gamma-Reaktionsgefäße überführt, und die gebundene Radioaktivität wurde mit einem Gammazähler gezählt.
Alle Hybridome wurden hinsichtlich Bindung an Aβ_1–28 getestet unter Verwendung des Verfahrens wie oben in dem anfänglichen Screen beschrieben, und dann erneut 3 Tage später getestet. Die Aβ_1–28 positiven Klone wurden des Weiteren hinsichtlich Reaktivität mit ¹²⁵I-gelabeltem Aβ_1–16 unter Verwendung des RIA-Verfahrens, wie oben beschrieben, charakterisiert. Kein Klon wurde an Aβ_1–16 bindend identifiziert. In einem Peptideinfang-ELISA zeigte sich, dass alle Klone mit Aβ_13–28 reagierten, wohingegen kein Klon mit Aβ_17–28 reagierte. Folglich wurde bestimmt, dass alle Klone ein Epitop aufwiesen innerhalb der Verknüpfungsregion aufspannend Aminosäuren 16 und 17.
Basierend auf den Ergebnissen der oben genannten Assays wurden weitere Klone auf die 24-Well-Platten ausgedehnt. Diese Klone wurden des Weiteren durch Sättigungsanalyse charakterisiert. Die Überstände am 50%-Titerpunkt (wie durch das RIA-Verfahren, wie oben beschrieben, bestimmt wurde) wurden zu den Wells hinzugegeben, welche Sepharose^®-Schaf-Anti-Maus-IgG-Beads, eine konstante Menge von ¹²⁵I-gelabeltem Aβ_1–28 sowie variierende Mengen von ungelabeltem Aβ_13–28 oder Aβ_17–28 enthielten. Die Konzentration von kaltem Peptid zur 50%-Inhibierung wurde für jeden Antikörper bestimmt. Für den Aβ_17–28 konnte keine Inhibition bei 100 ng/Well für irgendeinen Klon festgestellt werden. Der 50% Inhibitions-Punkt für Aβ_13–28 lag in der Größenordnung von 10–80 ng/Well. Die Klone wurden auch charakterisiert, basierend auf der Reaktivität in Westernblots. Basierend auf dem Titerpunkt, der Sensitivität (wie durch den 50%-Inhibitionspunkt bestimmt) und der Reaktivität auf Westernblot wurden einige Klone in Aszites erzeugt. Antikörper aus Hybridoma, genannt 266, wurden ausgewählt als einfangende Antikörper in den unten beschriebenen Assays.
b. Polyklonale Antikörper gegen das C-terminale Epitop, enthaltend Aminosäuren 33–42 von Aβ
Polyklonale Antikörper wurden erzeugt gegen Aβ (33–42) wie folgt. Peptid 277-2 (C-aminoheptanoides-GLMVGGVVIA [SEQ ID NR: 2]) wurde an kationisiertes BSA (Pierce aktiviertes "Supercarrier") konjugiert, und zwar in einem Verhältnis von 5 mg von 277-2 Peptid an 10 mg von kationisiertem BSA wie folgt. Eine Phiole von Pierce Supercarrier (10 mg) wurde in 1 ml an deonisiertem Wasser resuspendiert. 5 mg des 277-2 Peptids wurde in 5 ml an 10 mM PO₄, pH 8,0, aufgelöst. Das 277-2 Peptid wurde zum Supercarrier hinzugefügt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Dies wurde dann aufkonzentriert und das EDTA entfernt.
Das Immunogen (500 mg an Peptidäquivalent) wurde subkutan in vollständigen Freund-Adjuvans injiziert. Kaninchen erhielten eine Verstärkung von 0,2 bis 0,5 mg nach drei Wochen und 0,2 bis 0,5 mg nach zwei bis vier Wochenintervallen anschlie ßend. Die Verstärkungen wurden subkutan in unvollständigem Freund-Adjuvans verabreicht. Fünfundzwanzig ml an Serum wurden eine Woche nach jeder Verstärkung gesammelt. Blutfraktionen wurden wie folgt gescreent. Die Blutfraktionen der Woche 7 der Kaninchen wurden durch serielle Verdünnung getitert. Die ELISA-Platten wurden mit Aβ 1–42 über Nacht beschichtet und dann blockiert mit 3% Gelatine. Serielle Verdünnungen der Kaninchenblutfraktionen von 1/100–1/200 000 wurden auf den Platten für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann gewaschen und das Anti-Kaninchen-HRP wurde zu jedem Well hinzugegeben. Dies inkubierte für 1 Stunde. Die Platte wurde gewaschen und das TMB-Substrat wurde verwendet. Der ELISA-Titer der Kaninchen war 1/20 000–1/200 000.
Die ELISA-positiven Kaninchenblutfraktionen wurden dann in einem Einfang-RIA getitert, um ihre Fähigkeit, ¹²⁵I Aβ (1–42) gegenüber ¹²⁵I Aβ (1–40) zu binden, zu vergleichen. Verdünnungen des Kaninchen-Anti-Serums aus 1/25–1/675 wurden mit etwa der gleichen Anzahl von cpm von beiden Tracern inkubiert. Protein A-Sepharose wurde verwendet, um die Immunkomplexe auszufällen und diese wurden dann auf einem Microbeta-Szintillationszähler gezählt. 277-2 Kaninchen-D zeigt den höchsten Titer gegen Aβ (1–42)-Tracer und keine Kreuzreaktion mit Aβ (1–40)-Tracer. Die höchsten Titerblutfraktionen wurden dann einer Affinitätsaufreinigung von Antikörpern unterzogen.
Um die Anit-277-2-Antikörperaffinität aufzureinigen, wurde eine 277-2-Affinitätsmatrix wie folgt hergestellt: drei ml an Sulfo-verknüpftem Gel (Pierce) wurden mit sechs Volumina an 50 mmol Tris, 5 mmol EDTA, pH 8,5, gewaschen. Drei mg von 277-2 Peptid, aufgelöst in 0,3 ml DMSO wurden auf 3 ml mit 50 mM Tris, 5 mM EDTA bei pH 8,5 gebracht und zu dem Gel gegeben. Nach mildem Vermischen für 15 Minuten wurde das Säulenharz mit sechs Volumina an 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 0,5 M NaCl bei pH 8 gewaschen. Das Säulenharz wurde dann mit 16 Volumina an PBS/0,05% NaN₃ gewaschen.
Um die Antikörper einer Affinitäts-Aufreinigung zu unterziehen, wurden 20 ml an Hochtiterserum auf 40 ml mit PBS verdünnt und ein gleiches Volumen an gesättigtem (NH₄)₂SO₄ wurde langsam unter Rühren bei 4°C hinzugegeben. Man lies die Mischung weitere 30 Minuten rühren und dann für 15 Minuten bei 10 000 rpm in einem Beckman JA17-Rotor schleudern. Die Niederschläge wurden in PBS resuspendiert, auf ein Volu men von 40 ml mit PBS gebracht, und der (NH₄)₂SO₄-Niederschlag wurde erneut wie oben ausgefällt. Die Niederschläge wurden in insgesamt 20 ml an PBS resuspendiert und über Nacht gegen PBS bei 4°C dialysiert.
Die 277-2-Säule wurde mit 10 ml an PBS gewaschen. Anschließend ließ man das Dialysat über die Säule laufen. Die Säule wurde dann mit 50 ml an PBS gewaschen. 0,1 M Glycin, 0,5 M NaCl, pH 2,5 wurden zu 1 ml zu einer Zeit hinzugegeben und die Fraktionen wurden eingesammelt. Die ersten vier Fraktionen enthaltend die Mehrheit des eluierten Proteins wurden gepoolt und mit 0,4 ml an 1 M Tris bei pH 8,0 neutralisiert. Der Pool wurde aufkonzentriert durch Membranfiltration auf etwas weniger als 2 ml. Der ursprüngliche Säulendurchfluss wurde einem zweiten chromatografischen Schritt unterzogen (nachdem zuerst die Säule neutralisiert worden war und in PBS reäquilibriert worden war). Das zweite affinitätsaufgereinigte Material wurde in ähnlicher Weise neutralisiert und konzentriert, mit dem ersten Material vereinigt und dann gegen PBS bei 4°C dialysiert. Der Proteinanteil wurde bestimmt (Pierce BCA-Verfahren) und diese Antikörper wurden in ELISA-Experimenten verwendet.
2. ELISA-Assay
a. Binden von einfangenden Antikörpern an Mikrotiterwells
Der monoklonale Antikörper 266 wurde auf eine Konzentration von 10 μg/ml in einem Puffer verdünnt, welcher 0,23 g/l NaH₂PO₄H₂O, 26,2 g/l Na₂HPO₄; 7H₂O, 1 g/l NaN₃, pH 8,5, enthielt. Einhundert μl/Well dieser Lösung wurden dann in einer 96-Well weißen Dynatech Microlite 2, 96-Well-Platte mit flachem Boden verteilt. Die Platten wurden versiegelt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Coating wurde die verbleibende Lösung aspiriert und die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden mit 200 μl pro Well an (NaH₂PO₄H₂O) 0,2 g/l, Na₂HPO₄·7H₂O 0,8 g/l, menschlichem Serumalbumin (human serum albumin, NSA) kristallisiert und lyophilisiert, 2,5 g/l, pH 7,4. Diese Platten wurden blockiert durch Inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur in der Blockierungslösung.
b. Assayprotokoll
Die Kalibratoren wurden hergestellt aus einer Stammlösung von Aβ_1–42, 1 μg/ml in DMSO. In der Probenverdünnung ((NaH₂PO₄H₂O) 0,2 g/l, Na₂HPO₄·7H₂O 2,16 g/l, NaN₃ 0,5 g/l, Bovinserumalbumin (BSA) (globulinfrei) 6 g/l, Triton x-405 0,5 ml/l NaCl 8,5 g/l, pH 7,4) wurde der höchste Kalibrator, 1 000 pg/ml (10 μl Aβ_1–42-Stamm (1 μg/ml DMSO) in 10 ml Casein-Proben-Verdünnung) hergestellt. Nachfolgende Verdünnungen wurden in der Probenverdünnung durchgeführt, um 500, 250, 125, 62,5 und 31,25 pg/ml Konzentrationen von Aβ_1–42 zu erhalten.
CSF-Proben wurden wie folgt hergestellt. Die CSF-Proben (100–500 μl) wurden für 3 Minuten gekocht. Die gekochten Proben wurden bei 4°C für 10–14 Stunden vor der Durchführung des Assays platziert. CSF-Proben wurden unverdünnt geassayt. Verdünnungen wurden nur gemacht, falls der ursprünglich kalkulierte Wert oberhalb des höchsten Kalibrators lag (1000 pg/ml).
Einhundert μl pro Well an Kalibratoren oder Proben wurden auf die Mikrotiterplatte aufgetragen. Die Platten wurden versiegelt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit Waschlösung gewaschen (NaCl 80 g/l, KCl 3,85 g/l, Tris-HCl 31,75 g/l, Tween-20 0,5 ml/l, pH 7,5).
Anti-Aβ (33–42) (Antikörper 277-2) wurde in Probenverdünnung auf 1 μg/ml verdünnt und 100 μl wurden pro Well hinzugegeben. Die Platte wurde bedeckt und inkubiert für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Platte wurde dreimal mit Waschlösung gewaschen. Das durch alkalische Phosphatase affinitäts-aufgereinigte F(ab')₂-Fragment des Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) (Jackson) wurden 1 : 1 000 in Probenverdünnung verdünnt. Einhundert μl/Well wurden hinzugegeben. Die Platte wurde bedeckt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dreimal mit Waschlösung gewaschen und dann wurden 100 μl/Well eines chemilumineszenten Substrats hinzugegeben. Das chemilumineszente Substrat wurde durch Verdünnen des chemilumineszenten Reagens, AMPPD (Tropix) und eines Enhancers, Emerald green (Tropix), 1 : 1000 bzw. 1 : 100 in 1 M Diethanolaminpuffer, pH 10, enthaltend 1 mM MgCl₂ und 0,2% NaN₃ hergestellt. Die Platten wurden versiegelt und für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde nicht aspiriert. Diese Zeit kann der Optimierung bedürfen, was andere Antikörperchargen betrifft.
Chemilumineszenz wurde ausgelesen und als in Form von relativen Chemilumineszenzeinheiten (chemiluminescence units, CLU) nach 15 Minuten unter Verwendung eines Dynatech ML 1000 exprimiert.
Ergebnisse
1. Aβ (x– ≥ 41)-Assayspezifizität
Aβ (x– ≥ 41)-ELISA reagiert nicht kreuzweise mit Aβ (1–28), (1–38) bzw. (1–40) (1).
2. Aβ (x– ≥ 41)-Assaysensitivität
Das untere Sensitivitätslimit für diesen Assay ist 31 pg/ml oder 3,1 pg/Well ((1,7 fmol/Well (1).
3. Aβ (x– ≥ 41)-Spiegel in CSF
Aβ (x– ≥ 41) wurde in CSF verifiziert unter Verwendung des Aβ (x– ≥ 41)-ELISAs. Von Zeit zu Zeit wurden zwei unterschiedliche Gruppen von CSF-Proben, genannt Gruppe A und Gruppe B von verschiedenen Quellen erhalten. Manchmal wurden zweihundert μl der CSF-Proben für 3 Minuten vor dem Assay gekocht (wobei herausgefunden wurde, dass Kochen die Aβ (x– ≥ 41)-Immunoreaktivität in einigen Fällen erhöhte). Die Ergebnisse dieses Assays können in 2 und 3 gesehen werden. Tabelle 1 fasst diese Ergebnisse zusammen.
4. Aβ (x– ≥ 41) in CSF von Nagern und Hunden
Aβ (x– ≥ 41)-Immunoreaktivität wurde auch in CSF von Mehrschweinchen und Hunden nachgewiesen. (Tabelle II).
Diese Sandwich-ELISA demonstriert die Gegenwart von Aβ (x– ≥ 41) in CSF. Aβ (x– ≥ 41) ist nur eine kleinere Komponente des Gesamtanteils an Aβ in CSF. Die Spiegel von Aβ (x– ≥ 41) in CSF sind signifikant niedriger in AD als in Normal- und neurologischen Kontrollen. Nimmt einen 50%-Sensitivitäts-Grenzwert an, ist die Spezifizität 93,8 für Gruppe A und 97,4% für Gruppe B. Diese beiden unabhängigen Gruppen zeigen eine merkliche Ähnlichkeit, was demonstriert, dass die Messung von Aβ (x– ≥ 41) in CSF diagnostische Bedeutung aufweist.
II. Kombinierte Messungen von Aβ (x– ≥ 41) und Tau sind hochsensitiv für die Alzheimer-Krankheit
Materialien und Methoden
1. Subjekte
Alle Subjekte, die in dieser Untersuchung eingeschlossen sind, wurden einer detaillierten klinischen und neurologischen Untersuchung an medizinischen Zentren von Universitäten durch Experten auf dem Gebiet der Neurologie für die Diagnose von Demenz unterzogen. Einverständniserklärungen wurden von den Subjekten oder, falls angebracht, vom Vormund erhalten. Die Beurteilung schloss die medizinische Historie, physi kalische und neurologische Untersuchungen, Labor-Blut-Tests, um metabolische Ursachen der Demenz auszuschließen, bildgebende Neuro-Untersuchungen (Kopf-CT oder MR innerhalb der vergangenen 3 Jahre für Patienten mit Demenz und neurologische Kontrollen) und detaillierte psychometrische Tests (diese variierten zwischen den Institutionen) ein. Darüber hinaus empfingen alle Subjekte die folgenden Beurteilungsinstrumente: Mini-Mental-Zustands-Überprüfung (Mini-Mental State Examination, MMSE) (American Psychiatric Association, Committee on Nomenclature and Statistics: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders: Revised Third Edition, Washington D. C. Am. Psych. Associ. (1987) ), the Hamilton Depression Inventory (V. C. Hachiniski et al. (1975) Ann. Neurol. 32: 632–637) und der Hachinski Ischemic Index (G. McKann et al. (1984) Neurology 34: 939–944). Patienten mit mehr als einer Demenzdiagnose, kürzlichem Schlaganfall, Schädeltrauma oder signifikanten Störungen des peripheren Nervensystems wurden ausgeschlossen. Die folgenden Diagnosekriterien wurden verwendet:

i. AD (n = 37): Die Patienten erfüllten die NINCDS-ADRDA-Guidelines für wahrscheinliches AD; diejenigen, welche Kriterien für mögliches AD erfüllten, wurden ausgeschlossen (The Lund and Manchester Groups (1994) J Neurol. Neurosurg Psychiatr 57: 416–418). Alle Patienten wohnten in Gemeinschaftsunterkünften und zeigten milde bis moderate Demenz.
ii. Neurologisch erkrankte Kontrollen (ND; n = 32): Patienten mit Nicht-AD-Demenz oder degenerativen Erkrankungen, welche das zentrale Nervensystem betreffen. Für neurologische Kontrollen wurde eine Zusammenfassung von klinischen Aufzeichnungen durch einen zweiten Neurologen (DG) überprüft, um die Diagnose zu bestätigen, und sicherzustellen, dass gleichzeitig existierendes AD unwahrscheinlich war. Patienten mit Stirnhirndemenz wurden gemäß den Kriterien, wie dargestellt von der Lund- und der Manchestergruppe diagnostiziert (Kawasaki E. S., in: PCR Protocols: A guide to methods and applications. Academic Press, Inc., New York 1990, S. 146–152).
iii. Nicht-Demenz-Kontrollen (NC; n = 20): Die Subjekte waren 50 Jahre oder älter und wiesen keine signifikanten kognitiven Beschwerden auf, zeigten keine funktionellen Ausfälle, hatten normale Befunde bei der neurologischen Überprüfung und erreichten 28–30 auf dem MMSE. Eine Subgruppe dieser Kontrollen zeigte Symptome der Depression, die nicht in signifikantem kognitiven oder funktionellen Schädigungen resultierte und wurde als Nicht-AD oder irgendeine andere organische neurologische Erkrankung aufweisend eingestuft. Rückenmarkspunkturen wurden am Morgen nach Übernacht-Abstinenz genommen. Alle CSF-Proben wurden in Probenröhrchen, verteilt an alle Stellen, eingesammelt. Die ersten 2–3 ml der CSF wurden hinsichtlich Protein, Glucose und Zellen am örtlichen Laboratorium des medizinischen Zentrums analysiert und 4,5 ml wurden von ursprünglich gesammelten Röhrchen entfernt und zu 8 ml Sarstedt-Röhrchen, enthaltend 500 μl Puffer gegeben (enthaltend Additive, wie z. B. der letztendlichen CSF-Lösungs-Zusammensetzung mit folgenden Bestandteilen: 20 mM Natriumphosphat, 20 mM Triethanolamin, 0,05% Triton X-100, 100 mM NaCl, 0,05% NaN₃, 1 mM Diethylentriaminpentaessigsäure, 1 mM EGTA, pH 7,4) und wurden bei –20°C bis zur Analyse eingefroren. Die Assayoperatoren kannten die Diagnosen des jeweiligen Subjektes nicht.

2. ApoE-Genotypisierung
Die ApoE-Genotypisierung wurde durchgeführt mit verfügbaren Blutproben, die in ED-TA-Vacutainerröhren gesammelt wurden. Die Proben wurden hergestellt durch das Verfahren von Kawasaki beschrieben (Kawasaki ES, in: PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press, Inc., New York 1990 S. 146–152) und die PCR-Analyse wurde durchgeführt wie beschrieben von Wenham (P. R. Wenham et al. (1991) Lancet 337: 1158–1159).
3. Gesamt-Aβ-ELISA
Die Gesamtmenge an Aβ wurde in einem sequenziellen doppelten monoklonalen Antikörper-Sandwich-ELISA gemessen, wie in Seubert et al. (1992) Nature 359: 325–327 beschrieben. Kurz gesagt wurde Aβ in CSF durch die monoklonalen Antikörper 266 eingefangen (spezifisch für Aβ-Peptidreste 13–28), die zuvor in Mikrotiterplattenwells gecoatet worden waren. Der Nachweis setzte einen zweiten Aβ-spezifischen, biotinylierten monoklonalen Antikörper 6C6 ein (welcher Aβ-Reste 1–16 erkannte), gefolgt von Reaktionen mit einem alkalischen Phosphatase-Avidinkonjugat. Nach Inkubation mit dem fluorogenen Substrat 4-Methyl-Umbellipherylphosphat (MUP) wurde das fluoreszierende Produkt unter Verwendung eines Millipore Cytofluor 2350-Fluorometers gemessen.
4. Aβ (x– ≥ 41)-ELISA
Aβ (x– ≥ 41) wurde in einem ähnlich formatierten Assay unter Verwendung von 266 als einfangendem Antikörper gemessen. Der polyklonale Reporter-Antikörper 277-2 wurde gegen ein synthetisches Peptid erzeugt, welches Aβ-Reste 33–42 (GLMVGGVVIA) [SEQ ID NR: 2] enthielt, mit Cystein-Aminoheptan-Säure an ihrem Aminoterminus. Sie wurde durch das konjugierte Cystein an kationisiertes BSA (Pierce) konjugiert. Der Antikörper 277-2 wurde affinitätsaufgereinigt unter Verwendung des synthetischen Peptids konjugiert an eine Sulfo-verknüpfte Säure (Pierce) und reagierte stark mit ¹²⁵I-Aβ_1–42 wie durch Ausfällung des Tracers detektiert wurde. Er zeigte keine nachweisbare Kreuzreaktivität mit Aβ_1–40 und zwar weder in der Immunopräzipitation noch in den ELISA-Formaten, was darauf hindeutet, dass zumindest eine 1 000-fach verminderte Sensitivität gegen dem Aβ_1–40-Peptid vorliegt. Synthetisches Aβ_1–42 wurde als Standard eingesetzt. Der Nachweis des 277-2-Reporterantikörpers wurde erzielt unter Verwendung eines Esel Anti-Kaninchen-IgG-alkalischen-Phosphatase-Konjugats und des AMPPD-chemilumineszenten Substrats mit dem Emerald-Enhancer (Tropix) (C. Vigo-Pelfrey et al. (1994) J Neurochem 61: 1965–1968).
Um die Inter-Assay-Varibilität als einen Faktor in der Aβ (x– ≥ 41)-Analyse auszuschließen, wurden alle Proben doppelt am gleichen Tage mit der gleichen Charge an Standards gefahren. Die Intraassayvaribilität war weniger als 10%. Vor der Messung wurden Aliquots von CSF-Proben auf 100°C für 3 Minuten erhitzt und anschließend bei 4°C über Nacht vor dem Assay gelagert. Es stellte sich heraus, dass der Erhitzungsschritt im Allgemeinen die Immunoreaktivität in CSF-Proben erhöhte und zwar unabhängig von der Diagnose und folglich wurde er eingeschlossen. Es sollte festgehalten werden, dass verschiedene Chargen von synthetischem Aβ (x– ≥ 41) leicht unterschiedliche Standardwerte erzeugen, obwohl sie durch Aminosäureanalyse normalisiert wurden. Die aufgeführten Werte basieren auf einem einzigen Standard, der für die gesamte Untersuchung verwendet wurde. Untersuchungen, welche die Zugabe von syntheti schem Aβ (x– ≥ 41) zu CSF einschlossen, demonstrierten, dass die gemessene Wiedererkennung 80 ± 50% betrug.
5. Nachweis von Tau durch ELISA
a. Aufgereinigtes Tau
Tau, aufgereinigt von menschlichem AD-Gehirngewebe und von rekombinanten Quellen wurden verwendet zur Charakterisierung des Assays und der Antikörper. Rekombinantes menschliches Tau wurde erzeugt unter Verwendung des zuvor beschriebenen Baculovirusvektors, enthalten die pVL941-Tau-4-Repeat-Isoform (J. Knops et al. (1991) J Cell Biol 1991: 114: 725–733). Hohe Spiegel von Tau wurden exprimiert und aufgereinigt sowohl aus SF9 und high five Insektenzellen. Maximal exprimierende Zellkulturen wurden geerntet, einmal in PBS gewaschen und auf Eis gekühlt. Die Zellen wurden dann per Ultraschal aufgebrochen in 0,1 M MES pH 6,5, 1 mM EGTA, 18 μM EDTA, 0,5 mM MgCl₂, 5 μg/ml Leupeptin, 1 mM PMSF. Die Zellablagerung wurde durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit entfernt und der Überstand auf 0,75 M NaCl, 2% β-Mercaptoethanol eingestellt. Die Proben wurden 10 Minuten in verschlossenen Röhrchen gekocht, auf Eis gekühlt und durch Zentrifugation bei 100 000 × g für 30 Minuten geklärt. Die Überstände wurden dann auf 2,5% Perchlorsäure eingestellt und für 15 Minuten bei 13 000 × g geschleudert. Die Niederschläge wurden einem zweiten Zyklus von Kochen/Säureausfällen unterzogen und die gepoolten Überstände wurden gegen 100 mM KH₂PO₄ pH 6,9, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 2 mM β-Mercaptoethanol, 0,3 mM PMSF dialysiert.
Das rekombinante Tau wurde als zumindest 85% rein per SDS-PAGE eingeschätzt, angefärbt mit Coomassieblau, und wurde ohne weitere Aufreinigung verwendet. Die Konzentration von allen Taustandards wurden durch Aminosäureanalysen abgeschätzt. Um Tau zu dephosphorylieren, wurde ein Aliquot in 20 mM Tris-HCl pH 8,6, 2 mM HgCl₂, 1 mM DTT, 10 μM ZnCl₂-Puffer dialysiert. Zur Hälfte der Probe wurden 0,1 Einheiten von alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) pro μg Tau hinzugegeben; die andere Hälfte wurde in ähnlicher Weise mit dem Puffer allein verdünnt und die beiden Proben wurden für 5 Stunden bei 37°C inkubiert.
b. Monoklonaler Antikörper gegen Tau
Monoklonale Antikörper wurden hergestellt gemäß einer Modifizierung des Verfahrens von Kohler und Milstein (G. Kohler und C. Milstein (1975) Nature 256: 495–497). Tau verwendet in allen Injektionen und Screening-Assays wurde aus SF9-Zellen aufgereinigt, die infiziert mit dem Tau enthaltenen Baculoviruskonstrukt waren. Sechs Wochen alte A/J-Mäuse wurden mit 100 μg an aufgereinigtem Tau in Zwei-Wochen-Intervallen injiziert. Tau wurde in vollständigem Freund-Adjuvans involviert für die erste Immunisierung und in unvollständigem Freund-Adjuvans für alle weiteren Immunisierungen. Die Serumproben wurden drei Tage nach der dritten Injektion genommen, um den Titer dieser Tiere zu bewerten. Die Maus mit dem höchsten Titer wurde intravenös mit 100 μg an Tau in 500 μl an PBS zwei Wochen nach Empfang der dritten Injektion injiziert. Die Myelomfusion trat drei Tage später auf unter Verwendung von SP2/0 als dem Fusionspartner. Antikörper 16G7 und SC11 wurden aus dieser Fusion erhalten, wohingegen Antikörper 16B5 und 16C5 aus einer nachfolgenden Fusion isoliert wurden.
Überstände aus Wells, enthaltend Hybridomazellen, wurden auf ihre Fähigkeit gescreent, ¹²⁵I-gelabeltes Tau auszufällen. Tau wurde radio-iodiert unter Verwendung immobilisierter Glycoseoxidase und Lactoperoxidase gemäß den Instruktionen des Herstellers (Bio-Rad). Kurz gesagt wurden 10 μg an aufgereinigtem rekombinantem Tau radio-gelabelt mit 1 mCi an Na¹²⁵I, auf eine spezifische Aktivität von 20 μCi/μg Protein. 16G7, 8C11, 16B5 und 16C5 wurden identifiziert als die vier monoklonalen Antikörper mit der höchsten Affinität spezifisch für Tau und wurden durch Begrenzung der Verdünnung kloniert. Die Isotypen aus allen vier monoklonalen Antikörpern spezifisch für Tau wurden als Gamma-1-Kappa bestimmt.
c. Tau-ELISA
Der anti-Tau-monoklonale Antikörper 16G7 wurde zu 5 μg/ml in TBS suspendiert und zu 100 μl/Well in Mikrotiterplatten gecoatet (Dynatec Microlite 2). Das Coating wurde über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Lösung wurde dann aspiriert und die Platten mit 0,25% Casein (Gew./vol.) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) blockiert. Der Anti-Tau-Antikörper 16B5 wurde biotinyliert mit dem N-Hydroxysuccinimidester von Biotin entsprechend den Angaben des Herstellers (Pierce). Proben von entweder 50 μl CSF oder Kalibratoren (50 μl an 3–1000 pg/ ml menschlichem Tau) wurden mit 50 μl des biotinylierten Anti-Tau-Antikörpers (0,75 μg/ml in PBS-Casein, 0,05% Tween 20) in den 16G7 gecoateten Wells kombiniert und bei Raumtemperatur unter konstantem Schütteln über Nacht inkubiert. Die Lösung wurde dann aspiriert und die Platten wurden dreimal mit TTBS gewaschen. Streptavidinalkalische Phosphatase (Boehringer-Mannheim) wurde 1 : 1000 in PBS-Casein, 0,05% Tween 20 verdünnt und 100 μl wurden zu jedem Well gegeben. Nach Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde die Flüssigkeit aspiriert und die Wells wurden dreimal gewaschen. Das chemilumineszente Reagens, Dinatrium-3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetan-3,2¹-tricyclo[3.3.1.1^3,7]tdecan}-4-yL)phenylphosphat (AMPPD, Tropix) und ein Enhancer, Emerald Green (Tropix), wurden 1 : 1 000 verdünnt bzw. 1 : 100, und zwar in 1 M Diethanolaminpuffer, enthaltend 1 mM MgCl₂, 0,02% NaN₃, pH 10. 100 μl wurden pro Well hinzugegeben und die Platten wurden nach 30 Minuten ausgelesen und zwar in einem Dynatech ML 1 000-Chemiluminometer. Die hier dargestellten Daten verwendeten menschliches Tau, isoliert aus Gehirn als den Kalibrator.
6. Statistische Analyse
Die statistische Analyse der Daten wurde durchgeführt durch Ein-Wege-Analyse der Varianz (ANOVA) unter Verwendung von InStat, Version 1.21.
Ergebnisse
Der Vergleich der drei Patientengruppen (Tabelle III) zeigte, dass sie gut hinsichtlich Alter und Geschlecht abgeglichen waren. Die AD-Gruppe wies einen durchschnittlichen MMSE von 17,5 ± 7,1 auf, was darauf hindeutete, dass eine milde bis moderate kognitive Schädigung vorlag. Die neurologisch erkrankte Kontrollgruppe bestand aus einer Vielzahl von Erkrankungen, einschließend vaskuläre Demenz (4), Stirnhirn-Demenz (7), Depression (6), Parkinson-Erkrankung (3), Cortico-basale Gangliendegeneration (2), cerebrale Ataxie (2), progressive supranucleare Palsie (1), Normal-Druck-Hydrocephalus (1), Grand-mal-Anfall (1), Bell-Palsie (1), alters-assoziierte Gedächtnisschädigung (1), Demenz mit extrapyramidalen Anzeichen (1), amnetisches Syndrom (1), cerebrale Degeneration (1). Die Kontrollgruppe bestand aus Individuen, die keine neurologische Erkrankung zeigten und die kognitiv normal waren (Table III).
Die Analyse der gesamten CSF-Aβ-Spiegel förderte keine signifikanten Unterschiede unter den verschiedenen Patientengruppen (Tabelle III) zutage. Die Mittelwerte rangierten zwischen 19,0 ng/ml in der AD-Gruppe bis 17,9 ng/ml in the NC-Gruppe. Es gab signifikanten Überlapp mit keinerlei statistisch signifikanten Unterschieden unter den Gruppen (p > 0,05). Die Analysen der Aβ (x– ≥ 41)-Form des Peptids zeigte jedoch eine Verminderung im Mittelwert in der AD-Gruppe, relativ sowohl zu den ND- als auch den NC-Subjekten (383 versus 543 und 632 pg/ml), der signifikant auf dem p < 0,0001-Level (4) war. Die relativ kleine Standardabweichungen (76 pg/ml) der AD-Gruppe war insbesondere auffällig. Im Gegensatz dazu zeigte einige ND-Patienten vermindertes Aβ (x– ≥ 41) in ihrer CSF. Wenn ein Cutoff bei 505 pg/ml eingestellt wur de, fielen 15 von 37 ND-Patienten und nur vier von 23 NC-Patienten unterhalb dieses Levels. Alternativ war unter den 35 Individuen, welche Grade von Aβ (x– ≥ 41) von mehr als 505 pg/ml aufwiesen, keiner dabei, bei dem AD diagnostiziert worden war, was nahe legt, dass der Test hochspezifisch für das Nichtvorliegen der Erkrankung ist. Aβ (x– ≥ 41) wurde gemessen wie im Text beschrieben. Alle Messungen sind Durchschnittswerte von Doppelwertbestimmungen, die Variation war ≤ 10%. Die Proben wurden zufällig auf Platten ausgewertet und der Operator kannte die Diagnose des Subjekts nicht. Die Referenzstandards, vorliegend auf jeder Mikrotiterplatte waren nicht signifikant unterschiedlich zwischen den Platten.
Tau-Spiegel in den CSF-Proben des gleichen Subjekts wurden auch untersucht. Die Taumessung wurde doppelt durchgeführt. Um die Konsistenz sicherzustellen, wurden einige Proben der früheren Assays auf nachfolgenden Platten eingeschlossen und alle Proben wurden zumindest einer Wiederholungsmessung ausgewertet. Wiederholungsmessungen lagen innerhalb von 15% im Vergleich zu Originalwerten. Ein signifikanter Unterschied existiert zwischen der AD-Gruppe und jeder Kontrollgruppe (p < 0,001). Von menschlichen Gehirnen abgeleitetes Tau wurde als Referenzstandard verwendet. AD-Patienten hatten einen Mittelwert von 407 pg/ml versus 168 und 212 pg/ml in neurologischen bzw. normalen Kontrollen (5). Dieser Unterschied zwischen der AD-Gruppe und den anderen Gruppen ist signifikant bei p < 0,001. Setzt man einen Cutoff von 312 pg/ml, zeigten Individuen mit Werten oberhalb diese Spiegels eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit für Alzheimer-Erkrankungen (22/24 = 92%). Nur ein NC- und ein ND-Subjekt wurde oberhalb dieses Cutoffs registriert. Separate Analyse von durchschnittlichem CSF Aβ-, Aβ (x– ≥ 41)- oder Tauspiegeln erhalten von jedem Zentrum zeigten keine Unterschiede zwischen den Zentren, die statistisch signifikant für irgendeine der Erkrankungskategorien waren, wie durch eine Ein-Wege-Analyse-Varianz deutlich gemacht wurde. Von speziellem Interesse war die gleichzeitige Analyse von Aβ (x– ≥ 41) und Taumessungen in den gleichen CSF-Proben (6). 6 wird in Figur dann aufgeteilt unter Verwendung der Cutoffs für Aβ (x– ≥ 41) und Tau, wie sie zuvor beschrieben wurden. Das Vorliegen von sowohl erhöhtem Tau als auch von vermindertem Aβ (x– ≥ 41) (unterer rechter Quadrant) war von höchster prognostischer Bedeutung für AD (22/23 = 96%). Auf der anderen Seite wurde hohes Aβ (x– ≥ 41) und niedriges Tau (unterer linker Quadrant) vollständig von Kontrollpatienten repräsen tiert (6). Mehr als die Hälfte (48,7%) aller Individuen dieser Studie fielen in einen dieser beiden Quadranten.
Die verbleibenden Patienten zeigten niedrige Aβ (x– ≥ 41) und niedrige Tau-Spiegel (unterer linker Quadrant).
Obwohl die voranstehende Erfindung im Detail zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses beschrieben wurde, wird es offensichtlich sein, dass bestimmte Modifikationen innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche praktiziert werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren verwendbar als ein Teil einer diagnostischen Prozedur für Alzheimers Krankheit an einem Patienten, besagtes Verfahren umfassend: Messen der Menge von einem oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) in einer Probe von Körperflüssigkeit eines Patienten; Vergleich der gemessenen Menge mit einem vorbestimmten Indikatorwert, von besagtem einen oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41), worin optional der vorbestimmte Indikatorwert vom gleichen Patienten zu einer früheren Zeit gemessen wurde und das Verfahren Überwachung gewährleistet; Bewerten des Zustandes des Patienten basierend auf dem Unterschied zwischen der gemessenen Menge und dem vorbestimmten Indikatorwert; und worin eine gemessene Menge oberhalb des Indikatorwertes eine negative Indikation in der Diagnose von Alzheimers Erkrankung bereitstellt und ein gemessener Wert von oder unter dem Indikatorwert eine positive Indikation in der Diagnose von Alzheimers Erkrankung bereitstellt.
Ein Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die Patientenprobe eine cerebrospinale Flüssigkeit ist und der Indikatorwert zwischen ungefähr 0,45 ng/ml und ungefähr 0,7 ng/ml, vorzugsweise ungefähr bei 0,5 ng/ml liegt und worin optional der Aβ (x– ≥ 41) der gemessen wurde, zumindest die Aβ Aminosäuren 33–41 enthält.
Ein Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die Patientenprobe Plasma ist.
Ein Verfahren wie in Anspruch 1 bis 3 beansprucht, worin die Menge an löslichem Aβ (x– ≥ 41) gemessen wird durch Exponieren der Patientenprobe gegen erste Antikörper oder ein Fragment davon, spezifisch für die Bindungsregion auf Aβ oder Aβ Fragment aufspannenden Aminosäurenresten 13 bis 26, und Detektieren der Bindung zwischen dem ersten Antikörper oder Fragment davon und dem löslichen Aβ (x– ≥ 41) durch Exponieren der Patientenprobe gegen einen zweiten Antikörper oder ein Fragment davon, spezifisch für Aβ (x– ≥ 41), worin vorzugsweise (a) der zweite Antikörper oder Fragment davon ein Epitop von Aβ erkennt, das Aminosäurereste 33–42 aufweist, und/oder (b) der erste Antikörper oder Fragment davon eine Epitop auf Aβ erkennt, das die Aminosäurereste 13–26 aufweist.
Ein Verfahren wie in Anspruch 4 beansprucht, worin das Binden des ersten Antikörpers oder Fragment davon und des löslichen Aβ (x– ≥ 41) detektiert wird durch Separieren von gebundenen Komplexe des ersten Antikörpers oder Fragments davon und von Aβs oder Aβ-Fragmenten, wobei diese separat gebundenen Komplexe einem gelabelten zweiten Antikörper oder Fragment davon ausgesetzt werden, spezifisch für Aβ (x– ≥ 41), und durch Detektieren der Gegenwart des Labels auf den gebundenen Komplexen.
Ein Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die Menge des löslichen Amyloid-β Peptids (x– ≥ 41) (Aβ (x– ≥ 41)) in der Patientenprobe, optional der cerebrospinalen Flüssigkeit, gemessen wird durch Einfangen des löslichen Aβ (x– ≥ 41) aus der Probe unter Verwendung eines ersten Antikörpers oder Fragments davon, spezifisch für eine Bindungsregion auf Aβ aufspannenden Aminosäureresten 13 bis 26; und Detektieren des Einfangens von löslichen Aβ (x– ≥ 41) unter Verwendung eines gelabelten zweiten Antikörpers oder Fragments davon spezifisch für Aβ (x– ≥ 41).
Ein Verfahren wie in Anspruch 6 beansprucht, worin das lösliche Aβ (x– ≥ 41) auf einer festen Phase eingefangen wird und das Einfangen detektiert wird durch Exposition der festen Phase gegenüber einem zweiten Antikörper oder Fragment davon und durch anschließendes Detektieren der Gegenwart des Labels auf der festen Phase.
Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung, um deren Fähigkeit zu bestimmen, die Menge von Aβ (x– ≥ 41) in der CSF zu verändern; das Verfahren umfassend: Messen einer ersten Menge von einem oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) in der CSF eines nicht-menschlichen Tieres, das als Modell für Alzheimers Erkrankung verwendet wird; Verabreichen der Verbindung an das nicht-menschliche Tier; Messen einer zweiten Menge von besagtem einem oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) in der CSF des nicht-menschlichen Tieres; und Vergleich der ersten Menge mit der zweiten Menge, wobei der Unterschied anzeigt, ob die Verbindung die Menge an löslichen Aβ (x– ≥ 41) in der CSF vergrößert, vermindert oder unverändert lässt, wobei eine Verbindung, die die Menge von Aβ (x– > 41) in der CSF vergrößert, verwendbar in der Behandlung von Alzheimer's Erkrankung sein kann und eine Verbindung, die die Menge von Aβ (x– > 41) verwendert, Alzheimer's Erkrankung verschärfen oder beschleunigen kann.
Ein Verfahren verwendbar als ein Teil eines diagnostischen Verfahrens für Alzheimers Erkrankung in einem Patienten, wobei besagtes Verfahren folgendes umfasst: Messen der Menge von einem oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) in einer Probe einer Körperflüssigkeit in einem Patienten; Vergleich der gemessen Menge des löslichen Aβ (x– ≥ 41) mit einer vorbestimmten Indikatormenge des löslichen Aβ (x– ≥ 41), Messen der Menge von Tau der Patientenprobe; Vergleich der gemessenen Menge von Tau mit einem vorbestimmten Indikatorwert von Tau; und Bewerten des Patientenstatus basierend auf dem Unterschied zwischen den gemessenen Mengen und den vorbestimmten Indikatorwerten von Aβ (x– ≥ 41) und Tau, wobei eine gemessene Menge von oder unter dem Aβ (x– > 41) und von oder über den Tau-Indikatorwert eine positive Indikation in der Diagnose von Alzheimer's Erkrankung liefert, und wobei die gemessene Menge oberhalb des Aβ (x– > 41) Indikatorwertes und unterhalb des Tau Indikatorwertes eine negative Indikation in der Diagnose von Alzheimers Erkrankung liefert.
Ein Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, worin die Patientenprobe eine cerebrospinale Flüssigkeit ist, der Indikatorwert für Aβ (x– ≥ 41) zwischen ungefähr 0,45 ng/ml und ungefähr 0,7 ng/ml, vorzugsweise ungefähr bei 0,5 ng/ml liegt und der Indikatorwert für Tau zwischen ungefähr 0,25 ng/ml und ungefähr 0,4 ng/ml, vorzugsweise ungefähr bei 0,3 ng/ml liegt, wobei optional der gemessene Aβ (x– ≥ 41) zumindest die Aβ Aminosäuren 33–41 enthält.
Ein Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, worin die Patientenprobe Plasma ist.
Ein Verfahren wie in den Ansprüchen 9 und 11 beansprucht, worin die Menge an löslichem Aβ (x– ≥ 41) gemessen wird durch Exponieren der Patientenprobe gegen einen ersten Antikörper oder ein Fragment davon, das spezifisch für die Bindungsregion auf Aβ oder Aβ Fragment aufspannenden Aminosäurenresten 13 bis 26 ist, und Detektieren der Bindung zwischen dem ersten Antikörper oder Fragment davon und dem löslichen Aβ (x– ≥ 41) durch Exponieren der Patientenprobe gegen einen zweiten Antikörper oder einem Fragment davon, spezifisch für Aβ (x– ≥ 41).
Ein Verfahren wie in Anspruch 12 beansprucht, wobei a. der zweite Antikörper oder Fragment davon ein Antikörper ist, der ein Epitop von Aβ erkennt, das Aminosäurereste 33–42 aufweist, und/oder b. der erste Antikörper oder Fragment davon ein Antikörper ist, der ein Epitop von Aβ erkennt, das die Aminosäurereste 13–26 aufweist.
Ein Verfahren wie in Anspruch 12 oder 13 beansprucht, das Binden des ersten Antikörpers oder Fragments davon und des löslichen Aβ (x– ≥ 41) detektiert wird durch Separieren gebundener Komplexe des ersten Antikörpers oder Fragments davon und Aβ oder Aβ-Fragmenten, wobei diese separat gebundenen Komplexe einem gelabelten zweiten Antikörper oder Fragment davon ausgesetzt werden, spezifisch für Aβ (x– ≥ 41), und Detektieren der Gegenwart des Labels auf den gebundenen Komplexen.
Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung, um deren Fähigkeit zu bestimmen, die Menge sowohl von Aβ (x– ≥ 41) als auch Tau in der CSF zu verändern, das Verfahren umfassend: Messen einer ersten Menge von einem oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) in der CSF eines nicht-menschlichen Tieres, verwendet als Modell für Alzheimers Erkrankung; Messen einer ersten Menge von Tau in der CSF eines nicht-menschlichen Tieres; Verabreichen der Verbindung an ein nicht-menschliches Tier; Messen einer zweiten Menge von besagtem einen oder mehreren löslichen Aβ (x– ≥ 41) in der CSF des nicht-menschlichen Tieres; Messen einer zweiten Menge von Tau in der CSF des nicht-menschlichen Tieres; und Vergleichen der ersten Menge mit der zweiten Menge, wobei der Unterschied anzeigt, ob die Verbindung die Menge an löslichem Aβ (x– ≥ 41) vergrößert, vermindert oder unverändert lässt und ob sie die Menge von Tau in der CSF vergrößert, vermindert oder unverändert lässt, wobei eine Verbindung, die die Menge an Aβ (x– > 41) vergrößert und die Menge von Tau in einem CSF vermindert, verwendbar in der Behandlung von Alzheimers Erkrankung sein kann, und eine Verbindung, die die Menge von Aβ (x– > 41) vermindert und die Menge von Tau vergrößert, Alzheimers Erkrankung verschlimmern oder beschleunigen kann.
Ein Verfahren wie in Anspruch 8 oder Anspruch 15 beansprucht, wobei das nicht-menschliche Tier ein Nager ist, vorzugsweise eine Maus.
Ein Kit umfassend einen Antikörper oder Fragment davon, welcher Aβ (x– ≥ 41) bindet, jedoch nicht Aβ (≤ 40) bindet und einen Antikörper oder Fragment davon, welcher Tau bindet, optional weiter umfassend einen Antikörper oder Fragment davon, welcher Aβ oder ein Fragment von Aβ bindet, jedoch nicht andere Fragmente von APP bindet.
Ein Kit wie in Anspruch 17 beansprucht, wobei der Antikörper oder Fragment davon, welcher Aβ (x– ≥ 41) bindet, jedoch nicht an A (≤ 40) bindet, an ein Epitop, welches Aminosäuren über Nummer 40 in Aβ hinaus enthält, bindet, und der Antikörper oder Fragment davon, welcher Aβ oder ein Fragment von Aβ bindet, jedoch nicht andere Fragmente von APP bindet, an eine Bindungsregion von Aβ aufspannenden Aminosäurenresten 13 bis 26 bindet.
Ein Kit wie in Anspruch 18 beansprucht, umfassend (a) einen ungelabelten Antikörper oder Fragment davon, welcher eine Bindungsregion von Aβ aufspannenden Aminosäurenresten 13 bis 26 bindet; (b) einen nachweisbar gelabelten Antikörper oder Fragment davon, welcher ein Epitop bindet, das Aminosäuren über Nummer 40 in Aβ hinausgehend enthält; (c) einen ungelabelten Antikörper oder Fragment davon, welcher an Tau bindet; und (d) einen nachweisbar gelabelten Antikörper oder Fragment davon, welcher an Tau bindet; vorzugsweise sind die Antikörper monoklonale Antikörper oder Fragmente davon.